一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药化合物技术领域,具体涉及一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸及其制备方法和用途。
背景技术
纤维素是一类聚合度为3000~5000,通过β1→4糖苷键结合的直链葡聚糖,分子结构呈直线状,具有一定的强度和刚性,不易被稀酸或碱水解,是植物细胞壁的主要组成成分。因为人类以及食肉类动物体内很少含有β糖苷酶,故无法消化利用纤维素。微晶纤维素(MCC)是一种纯化的、部分解聚的纤维素,主要成分以β-1,4-葡萄糖苷键结合的直链式多糖类物质,白色、无臭、无味,由多孔微粒组成的结晶粉末,提高了纤维素的使用效率,由于具有较低聚合度和较大的比表面积等特殊性质,被广泛的应用于制药、化妆品、食品、轻化工等行业。
葡萄糖醛酸是一种常见的糖类分子,在体内作为糖胺聚糖糖基组成的一部分,如硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素等;也出现在小分子糖苷的糖基部分,但是自然界中没有多聚或寡聚葡萄糖醛酸。
近年来,随着生活水平的提高以及人口结构日益老龄化,脑血管疾病的发病率和死亡率正呈上升趋势,已成为其中一大死因。其中,缺血性脑血管病在脑血管疾病种类中占主要部分。目前具有良好治疗抗脑缺血疾病的药物种类有中药组合物、中药等,但是临床疗效有待确证,因此研究新的抗脑缺血疾病药物具有重要意义。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷,本发明提供一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸及其制备方法和用途。本发明中利用自然界中含量丰富的纤维素,通过溴化钠(NaBr)-2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)-次氯酸钠(NaClO)氧化体系作用,将羟基氧化成葡萄糖醛酸,同时通过控
制反应条件制备出末端开环的氧化型寡聚葡萄糖醛酸。发明人已经证明,该化合物在1μM的浓度下已经显著性提高了缺氧缺糖海马细胞的增值率,并且有着明显的剂量依赖关系,该类化合物有显著的抗脑缺血活性,可以成为一种抗脑缺血的潜在药物。
本发明的目的将通过以下技术方案得以实现:
本发明的一个方面提供一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸,其聚合度为1-20糖,具有通式I的结构:
其中,n=0-19;m=0、1或2。
本发明的另一个方面提供上述的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸的混合物,其由具有通式I’的结构的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸组成:
其中,n’和m’分别为混合物中各寡聚葡萄糖醛酸的n和m的平均值,n’选自0-19.0;m’选自0-2.0。n’和m’可以是整数,也可以是非整数,它们是混合物中各寡聚葡萄糖醛酸的n和m的基于摩尔量计的算术平均值。
本发明的再一方面涉及上述的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸或其混合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)称取微晶纤维素(MCC)粉末,丝光化处理制得丝光化后的MCC溶液,浓度为10-20mg/ml;
(2)向步骤(1)中制得的丝光化后的MCC溶液中依次加入2,2,6,6-
四甲基哌啶氧化物(TEMPO)和溴化钠,再使用碱性pH调节剂调节pH至10~11,之后加入次氯酸钠溶液于40~80℃条件下反应5~10小时,最后加入有机溶剂终止反应;
(3)置于500Da的透析袋中透析,浓缩、冻干,由此得到氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸的混合物,或者任选地经色谱分离得到单独的所述氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸。
本发明还涉及一种组合物,包含本发明的通式I的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸其混合物,以及药学上可接受的赋形剂或载体。
本发明的另一个方面还提供了根据本发明的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸其混合物在制备抗脑缺血药物或脑神经保护药物中的用途。它们可以用于治疗或预防中风、心肌梗塞、脑休克、新生儿窒息和脑外伤引起的神经元的缺血性损害。
本发明的另一个方面还提供了治疗或预防受试者的神经元缺血性损害或者保护受试者的脑神经的方法,包括给予有需要的受试者有效量的所述的通式I的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸或其混合物。
本发明的还提供了作为治疗或预防神经元缺血性损害的药剂或作为脑神经保护的药剂的通式I的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸或其混合物。
在上述方案中,所述神经元缺血性损害由中风、心肌梗塞、脑休克、新生儿窒息和脑外伤引起。
本发明的突出效果包括:将自然界中丰富的纤维素作为原料用于制备氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸,制备方法简单,条件温和,成本较低,易于产业化。同时该类化合物有显著的抗脑缺血活性,在1μM下已经显著性提高了缺氧缺糖海马细胞的增值率,并且有着明显的剂量依赖关系,可成为一种抗脑缺血,例如由中风、心肌梗塞、脑休克、新生儿窒息和脑外伤引起的神经元的缺血性损害的潜在药物。
以下便结合实施例附图,对本发明的具体实施方式作进一步的详述,以使本发明技术方案更易于理解、掌握。
附图说明
图1是实施例5中氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸总离子流图(TIC)和在210nm下的紫外色谱图;
图2为实施例5中峰0的一级质谱图即氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸11和10糖质谱图;
图3为实施例5中峰1的一级质谱图即氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸9糖质谱图;
图4为实施例5中峰2的一级质谱图即氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸8糖质谱图;
图5为实施例5中峰3的一级质谱图即氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸7糖质谱图;
图6为实施例5中峰4的一级质谱图即氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸6糖质谱图;
图7为实施例5中峰5的一级质谱图即氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸5糖质谱图;
图8为实施例5中峰6的一级质谱图即氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸4糖质谱图;
图9为实施例5中峰7的一级质谱图即氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸3糖质谱图;
图10为实施例5中峰8的一级质谱图即氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸2糖质谱图;
图11为实施例5中峰8的一级质谱图即氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸1糖质谱图;
图12为实施例5中氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸12糖至20糖(即dp12-dp20)质谱图;
图13为实施例6中氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸核磁共振氢谱图;
图14为实施例6中氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸核磁共振碳谱图;
图15为实施例7中氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸对正常小鼠海马细胞的作用;
图16为实施例7中氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸对缺糖缺氧小鼠海马细胞的作用。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明,但本发明并不局限于此。
本发明的第一方面涉及一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸,其特征在于,聚合度为1-20糖,其具有通式I的结构:
其中,n选自0-19;m选自0、1或2。
其中m=0时,代表末端的葡萄糖分子经氧化脱除两个-CH(OH)-单元,当m=1时,代表末端的葡萄糖分子经氧化脱除一个-CH(OH)-单元,当m=2时,代表末端的葡萄糖分子未脱除-CH(OH)-,仅发生羟基的氧化。在一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸,即n为某一数值的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸中,m为0、1和2的产物可以混合存在,也可以单独存在。不同m值的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸具有相似的生物活性。
在本发明的一个优选实施方案中,n为1-9,也即对应于氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸的二糖至十糖,它们的每一种均在本发明中被分离并表征。更具体地,在式I的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸中,n为0时对应于氧化一糖,n为1时对应于氧化二糖,n为2时对应于氧化三糖,n为3时对应于氧化四糖,n为4时对应于氧化五糖,n为5时对应于氧化六糖,n为6时对应于氧化七糖,n为7时对应于氧化八糖,n为8时对应于氧化九糖,n为9时对应于氧化十糖,n为10时对应于氧化十一糖。这些氧化的寡聚糖可以以一种或多种混合的形式使用。
本发明的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸的特征在于具有末端开环的不同碳原子数的寡聚糖醛酸结构。在一个实施方案中,末端不同碳原子
数的寡聚糖醛酸可以以混合物的形式存在,不同聚合度的寡聚糖醛酸也以混合物形式存在。
本发明的另一个方面涉及氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸混合物,其具有通式I’的结构:
其中,n’和m’分别为混合物中各寡聚葡萄糖醛酸的n和m的平均值,n’选自0-19.0;m’选自0-2.0。优选地,n’选自0-10.0,m’选自0.5-1.8,更优选地,n’选自0-10.0,m’选自0.8-1.5。
在另一个优选的实施方案中,本发明的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸混合物中包含80%以上、优选90%以上,更优选95%以上的末端开环的一至十一聚β-1,4-葡萄糖醛酸(对应于n为0-10),其中m’为0.8-1.5。
本发明的氧化方法包括如下步骤:丝光化纤维素、氧化纤维素溶液、以及后处理氧化产物形成氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸。
1.纤维素的丝光化
为制备本发明的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸,将原料微晶纤维素进行丝光化处理,形成溶液,溶液的浓度为约10-20mg/mL。申请人发现,溶液的浓度过高,则氧化过程不易进行完全,溶液的浓度过低,易造成氧化产物不均匀。
2.纤维素溶液的氧化
本发明采用了如下氧化体系:溴化钠(NaBr)-2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)-次氯酸钠(NaClO)氧化体系。经反应条件的调整,该氧化体系的氧化性尤其适用于获得本发明的β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸。相比于常规氧化剂,本发明的氧化体系能够使得氧化反应更完全地进行,获得
末端开环的反应产物,但不会破坏反应体系的均匀性。另外,以摩尔量计的氧化体系中各物质的比例可以是,例如,TEMPO∶NaBr=1∶5到1∶50;纤维素中葡萄糖单元∶活性NaClO=1∶0.5到1∶5;TEMPO∶纤维素中葡萄糖单元=1∶1到1∶5。在本发明的一个实施方案中,次氯酸钠溶液中活性次氯酸钠的重量百分比为1至20%,优选2至15%,更优选3-12%。
氧化反应在碱性条件下进行,研究发现,最适合的pH值范围为10-11,反应体系的pH值过高,则氧化效率低下,pH值过低,则不利于氧化发生。反应的pH值通过碱性化合物控制,最优选的碱性化合物为NaOH溶液。对NaOH的溶液没有特别的限制。
适用于本发明的氧化反应的氧化温度为40至80℃,优选50-70℃,更优选52-68℃,此温度范围内进行氧化有利于除去不期望存在的残留的酶,同时获得末端开环的糖醛酸。不囿于任何理论,发明人发现,反应温度低于40℃不利于获得末端开环的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛。反应温度过高会破坏原料的生物学活性,不利于反应产物的利用。
加入有机溶液终止反应以后,对氧化所获得的产物溶液进行纯化,获得氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸。作为一种优选纯化的方式,可以通过透析法纯化所获得的寡聚葡萄糖醛酸,特别地,透析所使用的材料需截留分子量为500Da的物质,由此纯化本发明的低聚寡糖。纯化也可以采用其他本领域中已知的方式,只要确保透析所获得的寡聚葡萄糖醛酸的纯度高于99%、更优选高于99.5%以上即可。
本发明还涉及将氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸或其混合物作为活性化合物成分用于制备抗脑缺血药物的用途。
脑血管疾病是导致我国中老年人死亡的第一大病因,也是世界卫生战略研究重点之一。在脑血管疾病中以缺血性疾病的发病率占据首位,通常在轻度缺血/缺氧的情况,脑的补偿机制保护着中枢神经系统免受损伤,但当缺血程度加重时,便会发生不可逆的神经损害,导致一系列的临床症状,甚至死亡。临床上,脑血管意外(例如中风)、心肌梗塞、休克、新生儿窒息和脑外伤都可引起神经元的缺血性损害。因此,开发出一种缓解脑缺血症状,提高脑细胞存活率的天然来源物质是很有意义
的。
本发明中使用的测定脑缺血症状的细胞模型是HT-22细胞在缺氧缺糖条件下产生的细胞(OGD模型)。HT-22细胞是一种小鼠海马神经元细胞系,是小鼠T4细胞系的一种亚克隆,具有海马神经元的特性。相关的内容可参见,例如,Jeney Ramírez-Sánchez et al.,Neurochemistry International 90(2015)215-223,“Neuroprotection by JM-20against oxygen-glucose deprivation in rat hippocampal slices:Involvement of the Akt/GSK-3βpathway”;Xiao-Jing Li et al.,Journal of Ethnopharmacology141(2012)927-933,Neuroprotective effects of TongLuoJiuNao in neurons exposed to oxygen and glucose deprivation;TIAN-ZHI ZHAO et al.,Neuroscience 328(2016)117-126,“GPER1Mediates Estrogen-Induced Neuroprotection Against Oxygen-Glucose Deprivation In The Primary Hippocampal Neurons”;等等。
本发明的发明人发现,通式I的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸或其混合物可以改善脑缺血症状,增加缺血缺氧脑细胞的存活率。另外,本发明的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸来自于天然产物,易于吸收和利用。
本发明提供了这样的组合药物,其中包含如上所述的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸,和任选的药学上可以接受的赋形剂。
制备各种含有各种比例活性成分的组合药物的方法是已知的,或根据本发明的公开内容对于本领域技术人员是显而易见的。如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Martin,E.W.,ed.,Mack Publishing Company,19th ed.(1995)所述。制备所述药物组合物的方法包括掺入适当的药学赋形剂、载体、稀释剂等。
以已知的方法制造本发明的药物制剂,包括常规的混合、溶解或冻干方法。
本发明的药物组合物,并向患者以适于选定的施用方式的各种途径施用,例如口服或肠胃外(通过静脉内、肌内、局部或皮下途径)。
因此,本发明的组合药物结合药学上可以接受的载体(如惰性稀释剂或可食用的载体)可以全身施用,例如,口服。它们可以封闭在硬或软壳的明胶胶囊中,可以压为片剂。对于口服治疗施用,本发明的活性化合物可以结合一种或多种赋形剂,并以可吞咽的片剂、颊含片剂、含片、胶囊剂、酏剂、悬浮剂、糖浆、圆片等的形式使用。这种组合物和制剂应该包含至少0.1%的活性化合物。这种组合物和制剂的比例当然可以变化,可以占给定的单位剂型重量的大约1%至大约99%。在这种治疗有用的组合物中,活性化合物的量使得能够获得有效剂量水平。
片剂、含片、丸剂、胶囊剂等也可以包含:粘合剂,如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶;赋形剂,如磷酸氢二钙;崩解剂,如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等;润滑剂,如硬脂酸镁;和甜味剂,如蔗糖、果糖、乳糖或阿司帕坦;或调味剂,如薄荷、冬青油或樱桃香味。当单位剂型是胶囊时,除了上面类型的材料,它还可以包含液体载体,如植物油或聚乙二醇。各种其他材料可以存在,作为包衣,或以其他方式改变固体单位剂型的物理形式。例如,片剂、丸剂或胶囊剂可以用明胶、蜡、虫胶或糖等包衣。糖浆或酏剂可以包含活性化合物,蔗糖或果糖作为甜味剂,对羟苯甲酸甲酯或对羟苯甲酸丙酯作为防腐剂,染料和调味剂(如樱桃香料或桔子香料)。当然,用于制备任何单位剂型的任何材料应该是药学上可以接受的且以应用的量为无毒。此外,活性化合物可以掺入缓释制剂和缓释装置中。
活性化合物也可以通过输注或注射到静脉内或腹膜内施用。可以制备活性化合物或其盐的水溶液,任选的可混和的无毒的表面活性剂。也可以制备在甘油、液体聚乙二醇、甘油三乙酸酯及其混合物以及油中的分散剂。在普通的储存和使用条件下,这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。
适于注射或输注的药物剂型可以包括包含适于无菌的可注射或可输注的溶液或分散剂的即时制剂的活性成分(任选封装在脂质体中)的无菌水溶液或分散剂或无菌粉末。在所有情况下,最终的剂型在生产和储存条件下必须是无菌的、液体的和稳定的。液体载体可以是溶剂或液
体分散介质,包括,例如水、乙醇、多元醇(例如,甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油、无毒的甘油酯及其合适的混合物。可以维持合适的流动性,例如,通过脂质体的形成,通过在分散剂的情况下维持所需的粒子大小,或通过表面活性剂的使用。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(如对羟苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)产生预防微生物的作用。在许多情况下,优选包括等渗剂,如糖、缓冲剂或氯化钠。通过使用延缓吸收剂的组合物(例如,单硬脂酸铝和明胶)可以产生可注射的组合物的延长吸收。
通过将合适的溶剂中的需要量的活性化合物与需要的上面列举的各种其他成分结合,然后进行过滤灭菌,制备无菌可注射溶液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下,优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术,这会产生活性成分加上任何另外需要的以前无菌过滤溶液中存在的成分的粉末。
有用的固体载体包括粉碎的固体(如滑石、粘土、微晶纤维素、二氧化硅、氧化铝等)。有用的液体载体包括水、乙醇或乙二醇或水-乙醇/乙二醇混合物,本发明的组合药物可以任选在无毒的表面活性剂的帮助下以有效含量溶解或分散在其中。可以加入佐剂(如香味)和另外的抗微生物剂来优化对于给定用途的性质。
增稠剂(如合成的聚合物、脂肪酸、脂肪酸盐和酯、脂肪醇、改性纤维素或改性无机材料)也可和液体载体用于形成可涂覆的糊剂、凝胶、软膏、肥皂等,直接用于使用者的皮肤上。
化合物或其混合物的治疗需要量,不仅取决于化合物本身,而且取决于施药方式、待治疗的疾病的本质和患者的年龄和状态,最终取决于在场医师或临床医生的决定。
上述制剂可以以单位剂型存在,该单位剂型是含有单位剂量的物理分散单元,适于向人体和其它哺乳动物体给药。单位剂型可以是胶囊或片剂,或是很多胶囊或片剂。根据所涉及的具体治疗,活性成分的单位剂量的量可以在大约0.1到大约1000毫克或更多之间进行变化或调整。
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸的制备方法
(1)称取1g MCC粉末,以50ml 10%NaOH溶液进行丝光化处理制得丝光化后的MCC溶液;
(2)向步骤(1)中制得的丝光化后的MCC溶液中依次加入5mg TEMPO和50mg溴化钠,使用10%NaOH溶液调节pH至10,加入5ml次氯酸钠溶液,其以活性次氯酸计的浓度为5%重量,于55℃条件下反应5小时,加入无水乙醇终止反应;
(3)置于500Da的透析袋中透析,浓缩、冻干得到氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸。
实施例2一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸的制备方法
(1)称取1g MCC粉末,以50ml 10%NaOH溶液进行丝光化反应制得丝光化后的MCC溶液;
(2)向步骤(1)中制得的丝光化后的MCC溶液中依次加入20mg TEMPO和250mg溴化钠,使用10%NaOH溶液调节pH至10,加入10ml次氯酸钠溶液,其以活性次氯酸计的浓度为5%重量,于40℃条件下反应8小时,加入无水乙醇终止反应;
(3)置于500Da的透析袋中透析,浓缩、冻干得到氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸。
实施例3一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸的制备方法
(1)称取1g MCC粉末,以100ml10%NaOH溶液进行丝光化反应制得丝光化后的MCC溶液;
(2)向步骤(1)中制得的丝光化后的MCC溶液中依次加入50mg TEMPO和500mg溴化钠,使用30%NaOH溶液调节pH至11,加入15ml次氯酸钠溶液,其以活性次氯酸计的浓度为5%重量,于70℃条件下反应3小时,加入甲醇终止反应;
(3)置于500Da的透析袋中透析,浓缩、冻干得到氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸。
实施例4一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸的制备方法
(1)称取1g MCC粉末,以100ml 10%NaOH溶液进行丝光化反应制得丝光化后的MCC溶液;
(2)向步骤(1)中制得的丝光化的MCC中依次加入50mg TEMPO和600mg溴化钠,使用50%NaOH溶液调节pH至11,加入15ml次氯酸钠溶液,于60℃条件下反应8小时,加入甲醇终止反应;
(3)置于500Da的透析袋中透析,浓缩、冻干得到氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸。
实施例5一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸质谱检测
5.1方法
称取实施例1中获得的2mg的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸用1ml的纯水溶解后,用0.22μm的微孔滤膜过滤后,进行超高效液相串联四级杆飞行时间质谱(UHPLC/Q-TOF-MS)分析。
UHPLC/Q-TOF-MS分析使用Agilent 6540UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS(安捷伦公司,美国)系统。其色谱条件如下:ACQUITY UPLC BEH125分子排阻色谱柱(4.6×300mm,Waters);检测波长:210nm;流动相:A为50mM乙酸铵水溶液,B为甲醇,比例为80%A;流速:0.1ml/min。质谱条件如下:负离子模式;扫描范围:100~3000;干燥气温度:350℃;干燥气流速:8L/min;毛细管电压:3500V;碎裂电压:80V。
5.2结果
氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸通过UHPLC/Q-TOF-MS分析后,得到如下的TIC图和紫外色谱图(见图1)。从图1中可以看出,各峰呈规则的波浪状分布,因为使用的是分子排阻色谱柱,推测波浪峰应是按照聚合度由大到小分布。进一步通过各色谱峰对应的一级质谱图(图2~11)推测其结构:图2为峰0的一级质谱图,其中m/z 655.7744、645.7753和635.7728都带3个电荷,经计算后得到这三个信号代表的化合物分子量分别为1970、1940和1910Da,对应的结构为氧化型糖醛酸寡糖11糖,如式I(n=10,m=0、1或2)。此外,该质谱图中还有带3
个电荷的质谱信号m/z 597.0981、587.0991和577.0951与2电荷的896.1517、881.1502和866.1462,经计算后确认它们分别为三种分子量为1794、1764和1734Da的氧化型糖醛酸寡糖10糖,对应式I(n=9,m=0、1或2)。同理,图3~11为峰1~9的质谱图,经解析结构分别为氧化型糖醛酸寡糖9到1糖,如式I(n=8→0,m=0、1或2)。在色谱图中12到20糖没有得到有效的分离,但是质谱中较清晰的信号,如图12所示。
实施例6一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸核磁结构确认
6.1方法
准确称取实施例1中获得的样品25mg用0.5ml重水(D≥99.96%)溶解,内标三甲基硅烷基丙酸钠(TSP)浓度为0.2μg/ml,用600MHz核磁共振仪(Agilent,美国)分析。氢谱扫描时间1h,试验温度为室温。碳谱扫描时间12h以上,试验温度为室温。
6.2结果
核磁结果如图13(1H-NMR)、图14(13C-NMR)所示。从氢谱中可以看出,a(4.70~4.71ppm)表示与开环糖醛酸直接相连或邻近的闭环的β构型葡萄糖醛酸1位H。区域b(4.47~4.60ppm)表示与开环糖醛酸相隔较远的闭环的β构型葡萄糖醛酸1位H和葡萄糖醛酸还原端开环脱2个-CH2O-后的羧基α位H。从碳谱中可以进一步看出区域1为羧基碳峰,而区域2为不同化学环境下的闭环糖醛酸1位C。结合氢谱、碳谱分析可以得出,β葡萄糖结构单元中的6位被成功氧化成羧基,且葡萄糖醛酸寡糖的还原端发生开环并伴随着一定程度的降解,进一步验证了质谱分析结果。
实施例7一种氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸在缺氧缺糖(OGD)条件下对HT-22细胞的影响
7.1OGD模型的建立及实验分组
取正常培养的HT-22细胞,调整细胞数目至2×104个/ml,按100μl/孔接种在96孔培养板上,每组设4个平行(n=4)。预培养12h后,给药组分别加入10μL的实施例1中获得的产物用培养基配制的不同浓度
的样品(1、10、100μM),正常组加入相同体积的培养基。将培养板置于5%CO2、37℃恒温培养箱中培养12h,观察并测定细胞存活率以确定样品对正常培养的HT-22细胞的影响。
取正常培养的HT-22细胞,吸去原培养液,细胞用无糖DMEM培养液洗涤2次,加入DMEM无糖培养液调整细胞数目至2×104个/ml。按100μl/孔接种在96孔培养板上。给药组分别加入10μl的实施例1中获得的产物用培养基配制的不同浓度的样品(1、10、100μM),模型组加入相同体积的培养液。将培养板置于缺氧罐中(冲入95%N2、5%CO2)、37℃恒温培养12h,观察并测定细胞存活率以确定样品在OGD下对HT-22细胞的影响。
7.2MTT法测定细胞存活率
待上述各组细胞培养完毕后,每孔加入10μL MTT(5mg/ml)溶液,继续培养4h,加入100μl10%SDS,待紫色结晶完全溶解后,测定其在570nm的OD值,并计算出细胞存活率。
7.3结果
通过MTT法计算出各组细胞存活率如表1、2和图15、16所示。从表1和图15中可以看出,加入低、中、高剂量的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸后细胞的存活率与正常组相比,无显著性差异,表明氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸对HT-22细胞无毒性。
从表2中可以看出,模型组与对照组相比HT-22细胞的存活率显著降低(p<0.001),表明OGD对细胞的存活有明显的抑制作用。而加入氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸后细胞存活率与模型组相比显著升高(p<0.01),并伴随着较好的剂量依赖关系,表明氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸有促进HT-22细胞生长存活的作用。
表1氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸对正常HT-22细胞存活率的影响
数据以mean±SEM表示
与对照组比较:p<0.05有显著性差异(LSD test)
表2氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸对OGD下HT-22细胞存活率的影响
数据以mean±SEM表示
###表示与对照组比较p<0.001(LSD test)
**表示与模型组比较p<0.01(LSD test)
***表示与模型组比较p<0.001(LSD test)
由上可见,本发明中的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸混合物具有良好的抗脑缺血作用。实验表明,各分离的氧化型β-1,4-寡聚葡萄糖醛酸在类似的实验中也具有类似的结果,它们在制备抗脑缺血药物中的可以得到应用。
本发明尚有多种实施方式,凡采用等同变换或者等效变换而形成的所有技术方案,均落在本发明的保护范围之内。