WO2016178519A1 - 근육 노화 억제용 또는 근육 노화 관련 질환 치료용 조성물 - Google Patents

근육 노화 억제용 또는 근육 노화 관련 질환 치료용 조성물 Download PDF

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이광표
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권은수
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle aging-related diseases comprising miR-431 or an analog thereof as an active ingredient.
  • the present invention also relates to a cell therapeutic agent for treating muscle aging-related diseases comprising the miR-431 or an analog thereof, and myoblasts or myoblasts with increased differentiation capacity as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for aging muscle regeneration, a composition for inhibiting muscle aging, and a composition for promoting in vitro myocyte differentiation of aged muscle, comprising the miR-431 or an analog thereof as an active ingredient.
  • the muscle differentiation capacity of the senescent myoblasts comprising a method for measuring the muscle differentiation capacity of the senescent myoblasts comprising the step of measuring the expression level of the miR-431, and the agent for measuring the expression level of miR-431. It relates to a kit for measurement.
  • Skeletal muscles show a decrease in muscle volume and function during aging of muscles, also called age-related sarcopenia (Narici and Maffulli 2010).
  • adult muscle stem cells also known as satellite cells, are known to gradually decrease in number and differentiation ability as they age (Brack et al. 2005; Shefer et al. 2006; Collins et al. 2007).
  • MRFs myogenic regulatory factors
  • MyoD myogenic regulatory factors
  • Mef2 myogenin
  • Myogenin myogenic regulatory factors
  • miRNA-mRNA regulatory network of skeletal muscle involved in aging which shows that miRNA is involved in the aging process of muscles (Kim et al. 2014b).
  • aging myotropenia seen in aging individuals due to myoblasts whose differentiation ability is reduced by aging is a disease distinguished from neuromuscular diseases caused by nerve cell damage that regulates autonomic muscles.
  • neuromuscular diseases include muscle dystrophy, neuromuscular junction disease, and motor neuropathy, and there are differences in aging myopathy and pathogenesis and treatment methods.
  • the present inventors have conducted extensive research to inhibit muscle aging and treat muscle aging-related diseases.
  • miRNA expression is analyzed between neoplastic and aging myoblasts to induce delayed muscle differentiation and regeneration of aging muscle.
  • Novel miRNAs were identified to complete the present invention.
  • One object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating muscle aging-related diseases comprising miR-431 or an analog thereof (mimic) as an active ingredient.
  • Another object of the invention is miR-431 or an analog thereof, and myoblasts; Or it provides a cell therapy for the treatment of muscle aging-related diseases comprising myoblasts with differentiation ability increased miR-431 or an analog thereof as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide an aged muscle regeneration composition comprising miR-431 or an analog thereof as an active ingredient.
  • Another object of the present invention to provide a composition for inhibiting muscle aging comprising miR-431 or an analog thereof as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a composition for improving aging extracorporeal myoblasts comprising miR-431 or an analog thereof as an active ingredient.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for measuring muscle differentiation ability of aged myoblasts, including measuring miR-431 expression level of myoblasts.
  • Still another object of the present invention is to provide a kit for measuring muscle differentiation capacity of senescent myoblasts comprising an agent for measuring the expression level of miR-431.
  • the present invention confirms that miR-431 enhances the differentiation potential of senescent cells, and miR-431 or an analog thereof has the effect of preventing or treating muscle aging-related diseases, regenerating effect of aging muscle, and inhibiting muscle aging.
  • Figure 1 is a diagram showing the miRNA expression profile (profile) of neoplastic and senescent stem cells.
  • B After infection with the indicated miRNA analogs, senescent stem cells were induced to differentiate in differentiation medium.
  • FIG. 2 is a diagram showing the muscle differentiation of senescent stem cells promoted by miR-431.
  • A Neoplastic cells infected with miR-431 inhibitors (top panel) or aging myocytes infected with miR-431 analogs (bottom panel) as measured by immunofluorescence staining with MyHC (green) and DAPI (blue). ) Shows a decreased or increased number of differentiated root canal cells, respectively, compared to the control. Scale bar represents 200 um.
  • Fusion index was measured as the percentage of MyHC positive cells with two or more nuclei relative to the total MyHC positive cells. Six different views were randomly selected to measure the fusion index.
  • Figure 3 shows the differentiation of senescent stem cells promoted by knockdown of Smad4.
  • A stomach
  • the lysates of four independently isolated neoplastic and senescent stem cells were subjected to immunoblot analysis with antibodies to the indicated proteins.
  • ⁇ -actin was used as loading control (below). Quantification of Western bands is expressed as mean ⁇ standard deviation. * P ⁇ 0.05.
  • B After aging myoblasts were infected with si control, siSmad3 or siSmad4, the cells induced differentiation in differentiation medium. Knockdown of Smad4 promoted differentiation, leading to upregulation of differentiation marker genes such as myogenin and MyHC (bottom). In contrast, there was no change in knockdown of Smad3 (above).
  • FIG. 4 shows miR-431 that directly binds to the 3'UTR of Smad4 regulates the expression of Smad4.
  • A In the luciferase activity assay, miR-431 inhibited WT 3'UTR of Smad4, and the inhibition was eliminated when the miR-431 binding site in Smad4 3'UTR was deleted. WT means wild type and MT means variant.
  • B The miR-431 binding site (position 1067-1073) in mouse Smad4 3'UTR is conserved in human Smad4 3'UTR (position 1121-1127).
  • C Neomyocytes infected with miR-431 inhibitors showed elevated Smad4 protein levels (left).
  • senescent stem cells infected with miR-431 analogues showed reduced levels of Smad4.
  • D Lysates of newborn or aged muscle tissue (300 ug) were incubated with biotinylated (Bi) miR431-5p or Bi-cel-miR-67 (control) at 4 ° C. After 4 hours, RNA was isolated from pulldown material using streptavidin beads and Smad4 mRNA content was analyzed by qRT-PCR. Normalization was performed using GADPH mRNA for neonatal or aging muscle tissue. Data is presented as mean ⁇ standard deviation of 3 independent experiments. * P ⁇ 0.05.
  • E was cultured from lysed myoblasts with antisense oligo (ASO) or negative control RNA (Gm14635 lincRNA) complementary to Smad4 mRNA.
  • ASO antisense oligo
  • Gm14635 lincRNA negative control RNA
  • the RNA isolated by pulldown using streptavidin beads was analyzed using qRT-PCR for Smad4 mRNA (standardized to GADPH mRNA) (left) or miR431-5p (standardized to RNU6B) (right).
  • Figure 5 shows rapidly increasing Smad4 and low expression levels of miR-431 in regenerative muscle tissue of old mice after muscle injury.
  • A Stomach
  • the expression pattern of Smad4 was analyzed for 14 days in neonatal TA muscle tissue and aged TA muscle tissue damaged with CTX using Western blot analysis. GADPH was used as loading control (below).
  • Quantification RT-PCR analysis was used to analyze miR-431 of neonatal TA muscle tissue damaged by CTX and senescent TA muscle tissue. Expression was measured three times, and the data were normalized to the amount of U6 snoRNA and expressed relative to the normalized value of neoplastic TA muscle tissue on the day of measurement.
  • FIG. 6 is a diagram showing the enhanced regenerative capacity of aging muscles treated with siSmad4 or miR-431.
  • A is a schematic diagram showing an experimental procedure. Cardiotoxin (CTX, 20 uM) was injected into TA muscle tissue of aged mice on day 0. After 2 and 5 days, injured muscle tissue was injected with siSmad4 or miR-431 analogues, and control siRNA or miRNA analogs were injected into contralateral muscle tissues.
  • CTR cardiotoxin
  • Cross section (CSA) was measured using ImageJ software. Six perspectives were randomly selected for CSA measurements.
  • Scale bar is 100 um.
  • Cross section (CSA) was measured using ImageJ software. Six perspectives were randomly selected for CSA measurements. * P ⁇ 0.05. Scale bar is 100 um.
  • FIG. 7 shows muscle differentiation of human skeletal muscle myoblasts (HSMM) reduced by inhibition of miR-431.
  • A is a diagram showing that Smad4 protein levels increased or decreased, respectively, as a result of infection with HSMM with an inhibitor or miR-431 inhibitor. The protein levels were analyzed by Western blot analysis and ⁇ -actin was used as loading control.
  • B Infection of HSMM with inhibitor-control or inhibitor-miR-431 induced differentiation of the cells in differentiation medium. Inhibitor-miR-431 infected HSMMs analyzed by immunofluorescence staining with MyHC (green) and DAPI (blue) reduced the number of differentiated root canal cells compared to control cells. Scale bar represents 200 um.
  • Neonatal primordial and aging myoblasts were isolated from hind limb muscles of 3 and 27 month old mice. The isolated cells were subjected to immunofluorescence using antibodies against Pax7 (red) and MyoD (green), and nuclei stained with DAPI (blue). Scale bar is 200 um.
  • FIG. 9 shows delayed differentiation of senescent progenitor cells.
  • A DIC image and
  • B Immunostaining results of staining neomyocytes and aging myoblasts with MyHC (green) and DAPI (blue) during initial differentiation in differentiation medium (DM, 36 h). Scale bar is 200 um. Fusion index is the percentage of MyHC-positive cells with two or more nuclei relative to the total MHC-positive cells. Six different views were randomly selected to measure the fusion index. * P ⁇ 0.05
  • C After culturing in differentiation medium for 36 hours, the protein levels of MyHCs of four independently isolated neoplastic and aging myoblasts were determined by immunoblot analysis (left). ⁇ -actin was used as loading control.
  • the figure shown on the right is a graph of quantification of bands specific for MyHC. * P ⁇ 0.05.
  • FIG. 10 is a diagram showing the fact that the differentiation capacity does not change in neoplastic cells infected with miR-431 analogues or aged senescent cells treated with miR-431 inhibitors.
  • Neoplastic cells infected with control-analogues or miR-431 analogs were induced to differentiate in differentiation media and mRNA levels of differentiation marker genes such as myogenin and MyHC were analyzed. Aging myoblasts infected with miR-431 inhibitors showed mRNA levels of similar differentiation marker genes. Results were normalized to the mean of ⁇ -actin mRNA.
  • M is an analog; I represents an inhibitor. Data are expressed as mean ⁇ standard deviation.
  • FIG. 11 shows that miR-431 is assumed to be a miRNA that regulates Smad4.
  • A Of the downregulated miRNAs negatively correlated with increased Smad4 protein, four miRNAs including miR-431 (red) were assumed to be regulatory miRNAs of the 3'UTR of Smad4 mRNA.
  • B Only miR-431 inhibited WT Smad4 3'UTR in luciferase assay. ** P ⁇ 0.01
  • FIG. 12 shows the fact that miR-431 regulates Smad4 expression in C2C12 cells.
  • A C2C12 cells infected with miR-431 analogs had reduced protein levels of Smad4 compared to controls (left), whereas cells infected with inhibitors of miR-431 had increased levels of Smad4 compared to controls.
  • B C2C12 cells were infected with biotinylated (Bi) -miR431-5p or Bi-cel-miR-67 (small control RNAs without known mammalian targets), and after 24 hours, streptavidin beads RNA was isolated by pull down, and Smad4 mRNA content was analyzed using RT-qPCR. Normalization was performed using GADPH mRNA.
  • the graph shows the results of three independent experiments as mean ⁇ standard deviation (SEM) (C, left).
  • C2C12 cell lysates were incubated with antisense oligomers (ASO) or negative control RNA (Gm14635 lincRNA) complementary to Smad4 mRNA.
  • ASO antisense oligomers
  • Gm14635 lincRNA negative control RNA
  • the RNA was isolated from streptavidin pulldown and analyzed by RT-qPCR to detect Smad4 mRNA (standardized to GADPH mRNA) or miR431-5p (standardized to RNU6B) (right).
  • the graph shows the results of three independent experiments as mean ⁇ standard deviation (SEM).
  • Figure 13 shows neoplastic TA muscle tissue and senescent TA muscle tissue damaged with CTX.
  • A Representative images of CTX injury on Day 7 or Day 14 of neoplastic regeneration TA muscle tissue and aging regeneration TA muscle tissue.
  • B The expression pattern of Smad4 in CTX damaged neonatal TA muscle tissue and aging muscle tissue was determined using 14 days Western blot analysis. GADPH was used as a loading control.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of muscle aging-related diseases comprising miR-431 or an analog thereof (mimic) as an active ingredient.
  • miRNA refers to an untranslated small RNA molecule consisting of about 22 nucleotides, and has a function of finely regulating the expression of a gene in an individual through inhibition of mRNA degradation or translation.
  • miR-431 is a miRNA present in a large number of young myocytes, and may target Smad4, and specifically, may target Smad4 mRNA, particularly 3′UTR, but is not limited thereto.
  • MiR-431 of the present invention may have a sequence of SEQ ID NO: 1 (5 ⁇ -UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCA-3 ⁇ ), but is not limited thereto.
  • next generation sequencing NGS
  • the difference in the amount of expression of 118 miRNA was particularly large, aging While the expression levels of 47 miRNAs were up-regulated in myoblasts, 71 miRNAs were confirmed to be down-regulated, and in particular, it was confirmed that the differentiation potentiating activity of miR-431 was the strongest (Experimental Example 1).
  • miR-431 analog may function similar to miR-431 in the body and may be single-stranded RNA identical to the miR-431 sequence, but is not limited thereto .
  • analogs of miR-431 can specifically increase the muscle differentiation capacity of aged myoblasts.
  • miR-431 may be SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the miR-431 analogues enhance the levels of MyHC and Myogenin mRNA in senescent stem cells (Experimental Example 2).
  • muscle aging means that the density and function of muscles gradually decreases with aging, and "muscle aging-related diseases” are caused by the above-described state changes and abnormalities of muscles due to aging. Refers to a disease, in particular muscle loss due to aging is also called age-related sarcopenia. It is common for people who experience muscle aging to easily fall or fracture.
  • the muscle aging-related disease may be age related sarcopenia, motor neuron disease, metabolic muscle disease, inflammatory myopathy, neuromuscular junction disease, endocrine myopathy, but not limited thereto. It doesn't work.
  • Muscle aging-related diseases including aging muscular dystrophy, is a disease that is distinguished from muscle dystrophy or muscle atrophy.
  • muscular dystrophy includes Becker muscular dystrophy and Duchenne muscular dystrophy. , Congenital muscular dystrophy, and Emery-Dreifuss muscular dystrophy are known to be representative (Alan EH Emery, Lancet. 2002 Feb 23; 359 (9307): 687-95).
  • the muscular dystrophy is caused by a deficiency or mutation of certain genes such as DMD and EMD, and a genetic factor is known as the cause.
  • muscular dystrophy means that the muscles of the extremities are contracted, and muscular atrophy lateral sclerosis and spinal cord progressive muscular dystrophy are known, which is known as a disease due to progressive degeneration of motor neuron fibers and cells in the spinal cord.
  • the spinal muscular atrophy is a genetic disorder caused by the degeneration of motor neuron cells of the spinal cord and is known as a neuromuscular disease in infants and children.
  • atrophic lateral sclerosis is characterized by refractory and irreversible neurodegenerative changes caused by the death of upper motor neurons and lower motor neurons in the cerebrum and spinal cord. The causes and symptoms of onset are different from aging myopathy, which is a symptom of muscle loss.
  • miR-431 or an analog thereof can effectively increase the differentiation ability of aged myoblasts, and thereby miR-431 or an analog thereof for the prevention or treatment of the above-described muscle aging-related diseases. was found to be effective.
  • miR-431 of the present invention is particularly effective in the treatment of aging muscle regeneration and aging muscle-related diseases.
  • myoblast is a muscle cell in an undifferentiated state, and proliferates to a progenitor cell when a satellite cell, which is a mononuclear cell, is activated. As the differentiation of myoblasts progresses, they fuse with other cells to form multinucleated, long myotubes, creating muscle fibers. Aged myoblasts are reduced in differentiation according to aging, inhibiting the formation of muscle fibers as described above, resulting in symptoms of muscle loss.
  • progenitor cell differentiation refers to a process in which myoblasts, which are mononuclear, form a multinuclear myotube through fusion.
  • Myoblasts corresponding to muscle precursor cells show Pax7 + markers when self-renewaling and Pax7 + / MyoD + when proliferating.
  • the cells of the differentiation stage forming the root canal can be distinguished using Pax7 - MyoD + MyoG + markers.
  • myogenic transcription factors such as myosin D (MyoD) is increased, and myosin G (MyoG) is increased in the middle stage.
  • MyoG myosin heavy chain is increased.
  • myoblasts as described above may be induced in skeletal muscle, myocardium and smooth muscle, and most preferably may be induced in skeletal muscle, but is not limited thereto.
  • MiR-431 or derivatives thereof of the present invention can increase the differentiation capacity of myoblasts, especially aged myoblasts, to form myotubes and muscle fibers to increase muscle mass reduced by aging.
  • miR-431 or an analog thereof may target mRNA of Smad4, and more specifically, target 3′UTR (untranslated region) of Smad4 mRNA. Can be.
  • miR-431 or an analog thereof may inhibit the expression of Smad4.
  • miR-431 inhibits the expression of Smad4 through the 3'UTR of Smad4, it was confirmed that the muscle differentiation capacity of myoblasts through the inhibition of Smad4 (Experimental Example 3 to Experimental Example 4).
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of muscle aging-related diseases by administration of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • treatment means any action that improves or advantageously changes the symptoms of muscle aging-related diseases by administration of the pharmaceutical composition of the present invention.
  • the miR-431 or an analog thereof included in the pharmaceutical composition of the present invention may be included in the form of a recombinant plasmid or viral vector expressing the same or together with a non-viral carrier. It is not limited.
  • miR-431 As the expression level of miR-431 in the individual is increased by miR-431 or an analog thereof delivered and expressed by the recombinant plasmid, viral vector, or non-viral transporter, it is possible to increase the differentiation ability of the senescent myoblast.
  • Inventive miR-431 or an analog thereof used in the various embodiments provided by the present invention may be included in complex form with various nucleic acid carriers (viral or non-viral carriers) known in the art for enhancing in vivo delivery efficiency.
  • nucleic acid carriers viral or non-viral carriers
  • it may be included as a recombinant plasmid or viral vector expressing miR-431.
  • Plasmids that can be used for this purpose are, for example, pSilencer (Ambion), pSiEx (Novagen), siXpress (Takara Bio), pBLOCK-iT TM (Invitrogen), pcDNA3.1 (Invitrogen), pCEP4 (Invitrogen), SilenCircle TM ( Allele), etc., but is not limited thereto.
  • viral carriers retroviral vectors, adenovirus vectors, adeno-associated virus vectors, vaccinia virus vectors, lentivirus vectors, herpes virus vectors, alphavirus vectors, EB virus vectors, papillomavirus vectors, pomivirus vectors can be used.
  • lipid affinity reagent for example lipids present in micelles, insoluble monolayers, liquid crystals, or lamellar layers present in aqueous solutions.
  • Lipids for liposome formulations include, but are not limited to, monoglycerides, diglycerides, sulfides, lysocithins, lecithin phospholipids, saponins, bile acids, lipofectin, and the like.
  • ribonucleic acid intracellular delivery technique known in the art, such as to increase the intracellular uptake by conjugating a biocompatible polymer such as polyethylene glycol to increase the stability in the body of miR-431.
  • It also includes a method in which cells are suspended in a solution containing microRNA by electroporation and introduced into cells by passing a pulse of DC high voltage.
  • a solution containing a microRNA can be administered to a desired site, and a DC voltage can be pulsed through an electrode to be introduced into a cell.
  • the term "individual” means any animal including a human who may have a disease related to muscle aging, and on the other hand may be an animal except a human, but is not limited thereto.
  • a composition comprising a miR-431 or an analog thereof of the present invention
  • the composition of the present invention can be administered in parallel with a therapeutic agent for existing muscle-related diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, but is not limited thereto.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” refers to a carrier or diluent that does not interfere with the biological activity and properties of the compound to be administered without stimulating the organism.
  • the kind of the carrier usable in the present invention is not particularly limited, and any carrier can be used as long as it is a conventionally used and pharmaceutically acceptable carrier in the art.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and the like. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • compositions of the present invention may be prepared in various formulations depending on whether the desired mode of administration is oral or parenteral.
  • Non-limiting examples of formulations for oral administration include troches, lozenges, tablets, aqueous suspensions, oily suspensions, prepared powders, granules, emulsions, hard capsules, soft capsules, syrups or elixirs, and the like. Can be mentioned.
  • oral dosage forms such as tablets or capsules, such as lactose, Saccharose, Sorbitol, Mannitol, starch, Amylopectin, Cellulose or Gelatin, etc.
  • Binders such as dicalcium phosphate and the like; Disintegrants such as corn starch or sweet potato starch; Lubricants such as magnesium stearate, calcium stearate, sodium stearyl fumarate, polyethylene glycol wax, and the like.
  • the capsule formulation may further contain a liquid carrier such as fatty oil in addition to the above-mentioned materials.
  • Formulations for parenteral administration include, for example, injectable forms such as subcutaneous injection, intravenous injection or intramuscular injection; Suppository injection mode; Or it may be formulated for spraying, such as aerosols to enable inhalation through the respiratory tract, but is not limited thereto.
  • injectable formulations the compositions of the present invention may be mixed in water with stabilizers or buffers to prepare solutions or suspensions and formulated for unit administration of ampoules or vials.
  • a propellant or the like may be combined with the additives to disperse the dispersed concentrate or wet powder.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount, the term "pharmaceutically effective amount" of the present invention to treat or prevent a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment or prevention
  • Effective dose level means the severity of the disease, the activity of the drug, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, the time of administration of the composition of the invention used, the route of administration and the rate of excretion
  • the duration of treatment, factors including drugs used in combination or coincidental with the composition of the invention used, and other factors well known in the medical art can be determined.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect in a minimum amount without side effects.
  • the present invention provides miR-431 or an analog thereof, and myogenic cells; Or it provides a cell therapy for the treatment of muscle aging-related diseases comprising myocells with differentiation ability increased by the miR-431 or an analog thereof as an active ingredient.
  • miR-431 analogue of miR-431
  • progenitor cells progenitor cells
  • muscle aging-related diseases of the present invention
  • the term "cell therapeutic agent” is a medicine (US FDA regulation) used for the purpose of treatment, diagnosis, and prevention of cells and tissues prepared through isolation, culture, and special manipulation from humans. To restore function, these cells are used for the treatment, diagnosis, and prevention of diseases through a series of actions such as proliferating, screening, or otherwise altering the biological properties of living autologous, allogeneic, or heterologous cells in vitro. Means medicines.
  • Preferred dosages of the cell therapy of the present invention vary depending on the condition and weight of the individual, the extent of the disease, the form of the drug, the route of administration and the duration, and may be appropriately selected by those skilled in the art. Administration may be administered once a day, may be administered several times, the dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the cell therapeutic agent of the present invention may include miR-431 or miR-431 analogues, and myoblasts or myoblasts whose differentiation ability is increased by the miR-431, thereby promoting regeneration of aged muscles and treating aging-related diseases. It is characterized by being.
  • the present invention provides a composition for aging muscle regeneration comprising miR-431 or an analog thereof as an active ingredient.
  • miR-431 and “analogue of miR-431” of the present invention are as described above.
  • Aged muscle regeneration composition comprising miR-431 of the present invention is characterized by being able to effectively regenerate and recover aging muscle tissue by maintaining the stem properties of the aging myoblasts and increasing the differentiation ability.
  • the present invention provides a composition for inhibiting muscle aging comprising miR-431 or an analog thereof as an active ingredient.
  • miR-431 and “analogue of miR-431” of the present invention are as described above.
  • composition for inhibiting muscle aging comprising miR-431 of the present invention is characterized by being able to effectively inhibit muscle aging by maintaining the stem cell stem cell stem.
  • the present invention provides a composition for improving aging in vitro myoblast differentiation comprising an miR-431 or an analog thereof as an active ingredient.
  • miR-431 and “analogue of miR-431” of the present invention are as described above.
  • Aged ex vivo myoblast differentiation composition comprising miR-431 of the present invention is characterized in that it can increase the differentiation ability of the aging myoblasts.
  • measuring the miR-431 expression level of myoblasts relates to a method for measuring the muscle differentiation capacity of senescent myoblasts, comprising the step of comparing the expression level of miR-431 and the miR-431 expression of control myoblasts measured in the step.
  • Measuring the expression amount may be to measure the mRNA expression level of miR-431, but is not limited thereto.
  • Measuring the mRNA expression level of the miR-431 may use antisense oligonucleotides, primer pairs, probes or a combination thereof that specifically binds to mRNA of the gene, which is reverse transcriptase polymerase reaction, competitive reverse transcriptase polymerization Enzymatic reactions, real-time reverse transcriptase polymerase reactions, RNase protection assays, northern blotting and DNA microarray chips can be performed using an assay selected from the group consisting of, but not limited to.
  • the control myoblasts are myoblasts that have not been impaired in differentiation capacity, and may be myoblasts or source cells obtained from young mammals for the purposes of the present invention, particularly in humans, myoblasts of young donors under 20 years of age. May be, but is not limited thereto.
  • Comparing the expression level of miR-431 may be determined that the differentiation capacity of myoblasts when the expression level of miR-431 is less than the expression level of miR-431 of the control myoblasts.
  • Comparing the expression level of miR-431 may further comprise the step of measuring the expression level of myosin heavy chain (MyHC) or Myogenin.
  • MyHC myosin heavy chain
  • the expression level of MyHC or Myogenin may be to measure the mRNA expression level or protein expression level of the gene encoding MyHC or Myogenin.
  • Measuring the mRNA expression level is as described above.
  • Measuring the protein expression level may use an antibody, aptamer, or a combination thereof that specifically binds to MyHC or Myogenin protein, which may include Western blotting, ELISA, radioimmunoassay, radioimmunoassay, ocroroni ( Ouchterlony) immunodiffusion, rocket immunoelectrophoresis, immunohistochemical staining, immunoprecipitation analysis, complement fixation analysis, assays selected from the group consisting of FACS and protein chips can be performed using, but not limited to.
  • the present invention relates to a kit for measuring muscle differentiation capacity of aged myoblasts comprising an agent for measuring the expression level of miR-431 of myoblasts.
  • the agent for measuring the expression level of miR-431 is an antisense oligonucleotide that specifically binds to mRNA of a gene encoding miR-431, a primer pair, a probe, an antibody that specifically binds to miR-431, aptamer and
  • the combination may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the kit may further include an agent for measuring the expression level of myosin heavy chain (MyHC) or Myogenin.
  • MyHC myosin heavy chain
  • the agent measuring the expression level is as described above.
  • the kit for measuring muscle differentiation may further include instructions for describing an optimal reaction performance condition.
  • Instructions include brochures in the form of pamphlets or leaflets, labels affixed to the kit, and instructions on the surface of the package containing the kit.
  • the guide may include information disclosed or provided through an electronic medium such as the Internet.
  • the dissociation buffer comprises dispase II (2.4 U / ml, Roche), collagenase D (1%, Roche) and 2.5 uM calcium chloride.
  • the slurry was powdered using a serum pipette and passed through a 70-uM nylon mesh (BD Bioscience) to remove debris.
  • Cells were harvested by centrifugation at 1,000 rpm for 3 minutes and resuspended in growth medium containing Ham's F-10 (HyClone), antibiotics and 5 ng / ml bFGF supplemented with 20% FBS. To remove fibroblasts, the cells were plated on uncoated plates for 1 hour and the floating cells were transferred to collagen-coated culture dishes. To maintain primitive myoblasts, growth medium was changed every two days. Differentiation of the myoblasts was induced by culturing the cells in differentiation medium containing DMEM (HyClone) supplemented with antibiotics and 5% horse serum for 5 days.
  • DMEM HyClone
  • Human skeletal muscle myoblasts obtained from a 17-year-old donor were basal skeleton supplemented with antibiotics, human epidermal growth factor (hEGF), dexamethasone, L-glutamine, and 10% fetal bovine serum medium) 2 was grown in a growth medium. Differentiation started 24 to 48 hours after seeding by replacing with differentiation medium containing DMEM / F12 (Gibco), antibiotics and 2% horse serum.
  • C2C12 cells were purchased from ATCC and cultured in growth medium containing DMEM (Gibco) with antibiotics and 10% fetal bovine serum. Differentiation started 24 to 48 hours after seeding by replacing with differentiation medium containing DMEM / F12 (Gibco), antibiotics and 5% horse serum.
  • DMEM fetal bovine serum
  • Quantification RT-PCR was performed to determine the expression level of miRNA. RNA preparation and cDNA synthesis were performed according to standard protocols. Quantification RT-PCR analysis was performed using 20-ul reaction volume StepOnePlus TM (Applied Biosystems) containing cDNA, primers, SYBR Master Mix (Applied Biosystems). Data was normalized to the abundance of ⁇ -actin mRNA in each response. The sequence of the primer is shown in SEQ ID NO: 2 to 15 and summarized in Table 1.
  • each reverse transcriptase (RT) reaction includes a total of 10 ng of RNA, 50 nM stem-loop RT primers, 0.25 mM each dNTP, 3.33 units / ul MultiScribe RT enzyme isolated using the mirVana miRNA separation kit.
  • the reactions included 0.25 units / ul RNase inhibitor and 1 RT buffer (all purchased from Applied Biosystems).
  • the qRT-PCR reaction was performed by repeating 40 seconds of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute after incubation in a 96-well plate of Applied Biosystem at 95 ° C. for 10 minutes.
  • the threshold period Ct is defined as the number of partial cycles through which fluorescence passes a fixed threshold.
  • U6 snRNA was used as an endogenous control of normalization.
  • siRNA, miRNA analogs, and miRNA-inhibitors were infected with primitive myoblasts, C2C12 or human musculoskeletal myoblasts using RNAiMax (Invitrogen) according to the manufacturer's recommended protocol.
  • miRNA-analogs and miRNA-suppressors used mir Vana (Invitrogen) or AccuTarget TM Human miRNA analogues (Bioneer) and siRNAs were purchased from Dhamacon (Thermo Scientific). The analogs and inhibitors are summarized in Tables 2 to 4 and siRNAs in Table 5.
  • 3'UTR fragment of Smad4 containing miR-431 binding site (0-1,265 bp position) is cloned into pcDNA3-luc vector, where the sequence encoding luc is located between HindIII and BamHI in the multiple cloning site It was.
  • the resulting plasmid constructs contain luc-3'UTR driven by a strong CMV promoter, which allows for the analysis of miRNA's ability to regulate mRNA into translation.
  • Smad4 3′UTR variants with deletions of the miR-431 binding site (1067-1073 bp position) were replicated in the same pcDNA 3-luc vector for the luciferase assay.
  • C2C12 cells were infected with biotinylated (Bi) miR431-5p or control Bi-cel-miR-67 (IDT, 60 nM each) in 100-mm plates. 24 hours after infection, the cells were washed with PBS and inhibited with 1 ml lysis buffer [20 mM Tris (pH 7.5), 100 mM potassium chloride, 5 mM magnesium chloride, 0.3% NP-40, RNase OUT (Invitrogen), 100 U, protease inhibition Roche]. As already known (Lal et al. 2011), incubation on ice for 10 minutes. Cellular lysates were removed by centrifugation at 12,000 g for 10 minutes.
  • Dynabead 100 ul was added and incubated for 4 hours at 4 °C while rotating. The beads were washed four times with 1 ml ice-cold lysis buffer, RNA was isolated using TRIzol, and the content of Smad4 mRNA was measured by qRT-PCR and normalized to Gapdh mRNA. Prior to pulldown by the method above, 300 ug of lysate in neonatal and aging muscle samples was biotinylated (Bi) -miR431-5p or Bi-cel-miR for 4 hours in 1 ml lysis buffer at 4 ° C. Rotated at 100 pmol -67 (control, ctrl).
  • Antisense oligos complementary to Smad4 were used to lyse C2C12 cells (4 100-mm plates of ⁇ 70% confluence) with PEB containing protease inhibitors (Roche) and RNase inhibitors (Thermo Fisher). Lysates were described in previous studies (Yoon et al.
  • 1X TENT buffer (10 mM Tris-hydrogen chloride [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0], 250 mM sodium chloride, 0.5% [v / v] Triton X-100) was incubated for 1 hour at room temperature with biotin-labeled oligomer 100 pmole, protease and RNase inhibitor complementary to Smad4 mRNA or lncRNA Gm14635. Dynabead (50 ul) was added and further incubated for 30 minutes at room temperature. The beads were washed three times with cold PBS buffer, RNA was isolated using TRIzol, and the enrichment of Smad4 mRNA was analyzed by qRT-PCR standardized on GAPDH mRNA.
  • RNA was used to analyze the increased abundance of miR431-5p in samples enriched with Smad4 mRNA using the QuantiMir kit (SBI). For neonatal and aging muscles, 600 ug of lysate was used for pulldown using the method described above.
  • Muscle tissue and isolated myocytes were homogenized in PRO-PREP lysis buffer (Intron Biotech) including protease and phosphatase inhibitors.
  • the lysate was centrifuged at 15,000 g at 4 ° C. for 20 minutes.
  • the resulting supernatant was subjected to SDS-PAGE followed by immunoblot analysis.
  • Antibodies to MyHC Santa Cruz Biotechnology
  • Myogenin Santa Cruz Biotechnology
  • ⁇ -actin Santa Cruz Biotechnology
  • Smad2 / 3 Cell Signaling Technology
  • Smad4 Santa Cruz Biotechnology
  • GADPH Sura Cruz Biotechnology
  • CTX tibialis anterior muscle
  • TA muscle was injected with 50 ul of 20 uM CTX
  • miRNA-analog or siSmad4 was prepared in the TA muscle to prepare miRNA-analog or a mixture of siRNA and RNAiMAX reagent (Dey et al. 2014).
  • 3 ul of 1 mM miRNA-like or siRNA and 37 ul of Nuclease depleted water were mixed with 40 ul RNAiMAX reagent (Invitrogen) and incubated for 30 minutes.
  • 50 ul of the mixture was injected into TA muscles on Day 3 and Day 5 after CTX injection.
  • Skeletal muscle tissue was fixed in 4% paraformaldehyde and frozen section samples or paraffin-embedded section samples were prepared. Frozen sections (10 um) were stained with DAPI and antibodies according to standard protocols. Antibodies for immunohistochemical analysis include Laminin (Sigma-Aldrich) Pax7 (Developmental Studies Hybridoma Bank), Smad4 (Abcam) antibodies. The paraffin section samples were stained according to standard protocols with H & E. Cross section (CSA) measurements were performed with NIH ImageJ software (http://rsb.info.nih.gov/ij/). For immunofluorescence, primordial myoblasts were grown in growth medium or differentiation medium on Laminin (Invitrogen) -coated cover slips.
  • the cells were fixed in 4% paraformaldehyde, washed with PBS buffer and permeabilized 0.3% Triton X-100 in PBS buffer. Cells were blocked with 3% bovine serum albumin in PBS buffer and once again with primary antibody diluted in blocking solution. The cells were washed with PBS buffer and incubated with secondary antibody. After washing with PBS buffer, cover slips were mounted on glass slides using VectoLab Mounting Medium. Antibodies for immunofluorescence include Santa Cruz Biotechnology (MyHC), Santa Cruz Biotechnology (MyoD), and Developmental Studies Hybridoma Bank (Pax7). Fusion index was calculated as the ratio of MyHC positive cell number of multiple nuclei to total MyHC positive cell number.
  • Quantification data is expressed as mean ⁇ standard deviation, unless otherwise noted. The difference between means was assessed by student's unpaired t test. A p value ⁇ 0.05 was considered statistically significant.
  • next-generation sequencing NGS
  • mice Primary myoblasts were isolated and cultured from the hind limb muscles of 3-month-old (hereinafter referred to as 'neo') and 27-month-old (hereinafter referred to as 'aging') mice. Two proteins, Pax7 and MyoD, were used as specific markers of primitive myoblasts (Wang and Rudnicki 2012). In immunostaining analysis, about 99% of isolated myocytes expressed both Pax7 and MyoD proteins (FIG. 8).
  • senescent stem cells showed reduced differentiation capacity, which is consistent with previous reports (Schultz and Lipton 1982; Fulle et al. 2005; Wagers and Conboy 2005).
  • MyHC myosin heavy chain
  • senescent myoblasts decreased the number of myosin heavy chain (MyHC) positive differentiated myotubes (FIGS. 9A, 9B).
  • MyHC myosin heavy chain
  • Protein levels of MyHC in senescent stem cells also decreased.
  • MRNA levels of differentiation marker genes, such as MyHC and Myogenin were also significantly down-regulated (FIG. 9D).
  • miRNA located in the genomic region may play an important role in the aging of muscle tissue and myoblasts. Therefore, the present inventors selected 13 miRNAs located in the genomic region and infected with senescent stem cells to analyze mRNA levels of two differentiation markers (MyHC and Myogenin). miR-431 showed the most potent activity in enhancing the differentiation capacity of senescent progenitor cells (FIG. 1B).
  • exogenous miR-431 increased the differentiation of senescent progenitor cells as shown in the morphology and numbers of MyHC-positive differentiated root canal cells.
  • inhibition of miR-431 decreased the differentiation capacity of neomyeloid cells (FIGS. 2A and B).
  • MRNA levels of MyHC and Myogenin in senescent myoblasts increased when infected with miR-431 analogs ( Figure 2C), while mRNA levels of both MyHC and Myogenin decreased when infected with miR-431 inhibitors in neoplastic cells. (FIG. 2D).
  • miR-431 one of the miRNAs decreased in senescent cells, plays an important role in the regulation of differentiation according to aging.
  • TargetScan www.targetscan.org
  • miRanda www.microRNA.org
  • TGF- ⁇ signaling inhibits muscle differentiation, whereby older mice show delayed muscle regeneration (Carlson et al. 2008; Carlson et al. 2009).
  • TGF- ⁇ receptors activated in the TGF- ⁇ signaling pathway first phosphorylate Smad2 or Smad3. Phosphorylated Smad2 / 3 then forms a heterotrimeric complex with the common Smad protein Smad4 and moves to the nucleus to turn on the target gene (Schmierer and Hill 2007).
  • siRNA To determine whether upregulation of Smad3 and Smad4 is associated with reduced differentiation in senescent stem cells, we used siRNA to knock down Smad3 or Smad4 in senescent stem cells and then infected with control siRNA. Aging myoblasts and muscle differentiation were compared.
  • Smad4 3′UTR site to which miR-431 binds is conserved between human and mouse (FIG. 4B).
  • Smad4 protein was downregulated by overexpression of miR-431 in senescent stem cells, while upregulated in neoplastic cells infected with miR-431 inhibitors (FIG. 4C). Similar results were obtained in C2C12 cells treated with miR-431 analogs or inhibitors (FIG. 12A).
  • Smad4 mRNA was also abundant in pull-down experiments of Bi-miR-431 after culturing lysates of neoplastic and aging muscle tissues (FIG. 4D).
  • biotinylated antisense oligos were used to determine whether miR-431 was abundant in the pull-down experiments of endogenous Smad4 mRNA.
  • miR-431 was significantly enriched in lysates of Bi-Smad4 ASO cultured myoblasts and C2C12 cells (FIG. 4E; FIG. 12C). Taken together, it can be seen from these results that miR-431 acts directly on 3'UTR to inhibit the expression of Smad4.
  • CTX was injected into TA muscles of young and old mice to induce muscle damage and its regeneration. Thereafter, Smad4 protein and miR-431 expression were compared 14 days after CTX injection.
  • miR-431 As a therapeutic agent for restoring aging muscle regeneration, we tested whether miR-431 or siSmad4 could improve the damaged muscle regeneration of aged mice in vivo.
  • RNAiMAX mixtures were injected 2, 2 and 5 days after CTX injury as described in previous studies (Dey et al. 2014) (FIG. 6A). After 2 weeks, the cross section of control muscle tissue was compared with the cross section of regenerating fiber.
  • miR-431 can restore delayed or damaged muscle regeneration in older mice.
  • hSmad4 protein levels were downregulated in HSMM overexpressing miR-431, whereas inhibitors of miR-431 increased Smad4 protein levels (FIG. 7A). This is consistent with the results obtained from mouse myoblasts.
  • HSMM was infected with a miR-431 inhibitor and the differentiation index was analyzed.
  • miR-431 inhibitors reduced the differentiation of HSMM as in the case of mouse myoblasts (FIGS. 7B and 7C).

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Abstract

본 발명은 miR-431 또는 이의 유사체(mimic)를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 miR-431 또는 이의 유사체, 및 근원세포를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 관련 질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 본 발명은 근육의 노화를 억제하고 근육 노화 관련 질환을 치료할 수 있다.

Description

근육 노화 억제용 또는 근육 노화 관련 질환 치료용 조성물
본 발명은 miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 miR-431 또는 이의 유사체, 및 근원세포 또는 분화능이 증대된 근원세포를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 관련 질환 치료용 세포치료제에 관한 것이다. 더 나아가, 본 발명은 상기 miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 노화된 근육 재생용 조성물, 근육 노화 억제용 조성물, 및 노화된 근육의 체외 근원세포 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다. 또한, 근원세포의 miR-431 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 노화된 근원세포의 근육 분화능을 측정하는 방법, 및 miR-431의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 노화된 근원세포의 근육 분화능 측정용 키트에 관한 것이다.
골격근은 근육의 노화 과정에서 근육의 부피와 기능이 감퇴하는 현상을 보이며, 이는 노화성 근감소증(age-related sarcopenia)이라고도 부른다(Narici and Maffulli 2010). 특히, 위성세포라고도 알려진 성인 근육 줄기 세포가 나이가 들어감에 따라 그 수가 점차 감소하며 분화능 역시 감소하는 것으로 알려져 있다(Brack et al. 2005; Shefer et al. 2006; Collins et al. 2007).
지금까지의 근육 분화 및 재생에 관한 연구는 주로 MyoD, Mef2, Myogenin과 같은 근원성 조절 인자(myogenic regulatory factors, MRFs)의 조절에 관해 이루어졌다(Sabourin and Rudnicki 2000; Sartorelli and Caretti 2005; Wang and Rudnicki 2012). 최근 들어, 마이크로 RNA(microRNA)가 근분화 뿐 아니라, 골격근 비대를 포함하는 근육 질환에 관여되어있다는 다수의 연구가 발표되었다 (Eisenberg et al. 2007; Thum et al. 2007; Dey et al. 2012; Liu et al. 2012). 본 발명자들은 최근 노화에 관여하는 골격근의 miRNA-mRNA 조절 네트워크를 발견하였고, 이는 miRNA가 근육의 노화 과정에 관여하는 사실을 보여준다(Kim et al. 2014b).
한편, 노화에 의해 분화능이 감소된 근원세포로 인하여 노화 개체에서 나타나는 노화성 근감소증은 자율 근육을 조절하는 신경세포의 손상에 의한 신경 근육 질환과 구별되는 질환이다. 구체적으로, 상기 신경 근육 질환의 대표적인 예로서 근이영양증(muscle dystrophy), 신경 근육 접합 질환, 운동 신경 질환 등이 있으며, 노화성 근감소증과 발병 기전 및 치료 방법에 있어서 차이가 있다.
본 발명자들은 근육의 노화를 억제하고, 근육 노화 관련 질환을 치료하고자 예의 연구 노력한 결과, miRNA 발현을 신생 근원세포 및 노화 근원세포간 비교하여 분석함으로써, 지연된 근육 분화 및 노화된 근육의 재생을 유도하는 신규한 miRNA를 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 miR-431 또는 이의 유사체(mimic)를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 miR-431 또는 이의 유사체, 및 근원세포; 또는 miR-431 또는 이의 유사체로 분화능이 증대된 근원세포를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 관련 질환 치료용 세포치료제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 노화된 근육 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 노화된 체외 근원세포 분화능 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 근원세포의 miR-431 발현량을 측정하는 단계를 포함하는 노화된 근원세포의 근육 분화능을 측정하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 miR-431의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 노화된 근원세포의 근육 분화능 측정용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 miR-431이 노화 근원세포의 분화능을 증대시키는 것을 확인하고, 상기 miR-431 또는 이의 유사체가 근육 노화 관련 질환의 예방 또는 치료 효과를 가지며, 노화된 근육의 재생 효과 및 근육 노화 억제 효과를 가진다.
도 1은 신생 근원세포 및 노화 근원세포의 miRNA 발현 양태(profile)를 나타낸 도이다. (A) 노화에 따른 118개의 다르게 조절되는 miRNA의 통제하지 않은 계층적 군집화(hierachical clustering)를 보인다; 47개의 miRNA는 상향 조절(up-regulated) 되었고, 71개의 miRNA는 하향 조절(down-regulated) 되었다. 각 칼럼은 3개월령의 어린 마우스(n=3) 및 27개월령의 늙은 마우스(n=3) 각각으로부터 분리된 근원세포에서 miRNA 발현을 나타낸다. 강도는 서로 다른 정도를 나타낸다. 빨간색 및 녹색은 각각 높고 낮은 발현을 표시한다. (B) 표시된 miRNA 유사체로 감염시킨 후, 노화 근원세포는 분화 배지 내에서 분화하도록 유도되었다. MyHC(흰 bar, 각 그룹마다 n=3) 및 myogenin(검은색 bar, 각 그룹마다 n=3) 같은 분화 마커 유전자의 상대적인 발현은 qRT-PCR로 결정하였다. 상기 결과는 β-액틴 mRNA의 양에 표준화되었다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. **P < 0.01.
도 2는 miR-431에 의해 촉진된 노화 근원세포의 근육 분화를 나타낸 도이다. (A) MyHC(녹색) 및 DAPI(청색)으로 염색한 면역형광법으로 측정한 결과, miR-431 억제자로 감염시킨 신생 근원세포(위 패널) 또는 miR-431 유사체로 감염시킨 노화 근원세포(아래 패널)은 각각 대조군에 비해 감소된 또는 증가된 수의 분화된 근관세포를 보인다. 스케일바는 200 um을 나타낸다. (B) 융합 인덱스는 전체 MyHC 양성 세포에 대한 두 개 이상의 핵을 가진 MyHC 양성 세포의 백분율로 측정하였다. 여섯 개의 다른 관점이 무작위로 선택되어 융합 인덱스를 측정하였다. *P < 0.05 (C) 대조군-유사체 또는 miR-431 유사체로 감염시킨 후, 노화 근원세포는 분화 배지에서 분화하도록 유도하였고 myogenin이나 MyHC 같은 분화 마커 유전자의 mRNA 수준을 분석하였다. (D) miR-431 억제자로 감염시킨 신생 근원세포는 표시된 분화 마커 유전자의 감소된 mRNA 수준을 보였다. 상기 결과는 β-액틴 mRNA의 평균에 의해 표준화되었다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 표시하였다. **P < 0.01
도 3은 Smad4의 녹다운으로 촉진된 노화 근원세포의 분화를 나타낸 도이다. (A, 위) 4개의 독립적으로 분리된 신생 근원세포 및 노화 근원세포의 용해물을 표시된 단백질에 대한 항체로 면역블랏 분석을 수행하였다. β-액틴은 로딩 대조군으로 사용하였다(아래). 웨스턴 밴드의 정량화는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P < 0.05. (B) 노화 근원세포를 si 대조군, siSmad3 또는 siSmad4로 감염시킨 후, 상기 세포는 분화배지에서 분화를 유도하였다. Smad4의 녹다운은 분화를 촉진하였고, 이는 myogenin이나 MyHC같은 분화 마커 유전자의 상향 조절을 유도하였다(아래). 반면, Smad3의 녹다운으로는 아무런 변화가 없었다(위). (C) MyHC(녹색) 및 DAPI(청색)의 면역형광 염색으로 확인한 결과, Smad4가 녹다운 된 노화 근원세포는 대조군 세포에 비해 분화된 근관세포(myotube)의 수가 증가하였다. 스케일 바는 200 um이다. (D) 융합 인덱스는 전체 MHC-양성 세포에 대한 2 이상의 핵을 가진 MHC-양성 세포의 백분율로 계산하였다. 여섯 개의 다른 관점이 무작위로 선택되어 융합 인덱스를 측정하였다. *P<0.05 (E) 최대 3일간(up to 3 days) 분화 배지에서 배양한 신생 근원세포 및 노화 근원세포에서 표시된 단백질의 발현 패턴은 웨스턴 블랏 분석으로 나타내었다. β-액틴이 로딩 대조군으로 사용되었다. GM은 배양 배지; DM은 분화 배지이다. (F)는 분화 동안 상기 세포 내의 상대적인 miR-431의 발현을 나타낸 도이다. 상기 데이터는 β-액틴 mRNA의 양에 표준화하였고, 성장 배지의 신생 근원세포에 대한 상대적인 표준화된 값으로 나타내었다.
도 4는 Smad4의 3'UTR에 직접 결합하여 Smad4의 발현을 조절하는 miR-431을 나타낸 도이다. (A) 루시퍼라제 활성 어세이에서, miR-431은 Smad4의 WT 3'UTR을 억제하였고, Smad4 3'UTR 내 miR-431 결합 부위가 결실되었을 때, 상기 억제는 제거되었다. WT는 야생형을, MT는 변이체를 의미한다. (B) 마우스 Smad4 3'UTR 내 miR-431 결합 부위(1067 내지 1073 위치)는 인간 Smad4 3'UTR(1121 내지 1127 위치)에 보존되어있다. (C) miR-431 억제자가 감염된 신생 근원세포는 증가한 Smad4 단백질 수준을 나타내었다(왼쪽). 반면, miR-431 유사체로 감염된 노화 근원세포는 Smad4의 수준이 감소되었다. (D) 신생 근 조직 또는 노화 근 조직의 용해물(300 ug)을 비오티닐화된(Bi) miR431-5p 또는 Bi-cel-miR-67(대조군)으로 4℃에서 회전배양하였다. 4시간 후, RNA를 스트렙타비딘 비드를 이용하여 풀다운 물질(pulldown material)로부터 분리하였고, Smad4 mRNA 함량(enrichment)을 qRT-PCR로 분석하였다. 표준화는 신생 근 조직 또는 노화 근 조직에 대해 GADPH mRNA를 이용하여 수행되었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05. (E)는 신생 근원세포로부터 얻은 용해물을 Smad4 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고(ASO) 또는 음성 대조군 RNA(Gm14635 lincRNA)로 배양하였다. 스트렙타비딘 비드를 이용한 풀다운으로 분리된 상기 RNA를 Smad4 mRNA(GADPH mRNA에 표준화)(왼쪽) 또는 miR431-5p(RNU6B에 표준화)(오른쪽)에 대해 qRT-PCR을 이용하여 분석하였다.
도 5는 근 손상 후, 늙은 마우스의 재생하는 근조직의 급격히 증가한 Smad4 및 낮은 발현 수준의 miR-431을 나타낸 도이다. (A, 위) Smad4의 발현 패턴은 웨스턴 블랏 분석을 이용하여 CTX로 손상된 신생 TA 근 조직 및 노화 TA 근 조직에서 14일간 분석하였다. GADPH는 로딩 대조군으로 사용하였다(아래). 정량화 RT-PCR 분석을 이용하여, CTX로 손상된 신생 TA 근 조직 및 노화 TA 근 조직의 miR-431을 분석하였다. 발현은 세 차례 측정하였고, 데이터는 U6 snoRNA의 양에 표준화하여 측정 당일의 신생 TA 근 조직의 표준화 된 값에 상대값으로 표현하였다. (B) CTX 손상 후 14일차에 신생 TA 근 조직 섹션 및 노화 TA 근 조직 섹션을 Pax7(녹색) 및 Smad4(적색)에 대한 항체로 염색하여, 노화 근 조직에 있는 근원세포의 두 항원의 동일위치(colocalization)를 나타내었다. 스케일바는 20 um이다. 흰색 점선은 근 섬유를 나타낸다. Smad4 단백질을 발현하는 Pax7+ 근원세포의 비율은 CTX로 손상된 노화 TA 근 조직 내에서 상당히 증가하였다. ***P<0.001
도 6은 siSmad4 또는 miR-431 처리된 노화 근육은 강화된 재생능을 나타낸 도이다. (A)는 실험 절차를 나타낸 개략도이다. 카디오톡신(Cardiotoxin,, CTX, 20 uM)을 0일차에 노화 마우스의 TA 근 조직에 주사하였다. 2일 및 5일이 지난 후, 손상된 근 조직에 siSmad4 또는 miR-431 유사체를 주사하였고, 대조군 siRNA 또는 miRNA 유사체를 대측성 근 조직에 주사하였다. (B)는 14일차에 라미닌(적색) 및 DAPI(청색)으로 siSmad4 처리된 재생하는 섬유(n=4)를 염색한 대표적인 IHC 이미지(왼쪽 패널)이다. 횡단면(CSA)는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. 6개의 관점을 CSA 측정을 위해 임의로 선택하였다. *P < 0.05. 스케일바는 100 um이다. (C)는 14일차에 라미닌(적색) 및 DAPI(청색)으로 miR-431 처리된 재생하는 섬유(n=4)를 염색한 대표적인 IHC 이미지(왼쪽 패널)이다. 횡단면(CSA)는 ImageJ 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. 6개의 관점을 CSA 측정을 위해 임의로 선택하였다. *P < 0.05. 스케일바는 100 um이다.
도 7은 miR-431의 억제로 감소된 인간 골격근 근원세포(HSMM)의 근육 분화를 나타낸 도이다. (A)는 HSMM를 miR-431의 억제자 또는 유사체로 감염 시킨 결과, 각각 Smad4 단백질 수준이 대조군에 비해 증가 또는 감소하였음을 나타낸 도이다. 상기 단백질 수준은 웨스턴 블랏 분석으로 분석하였고 β-액틴을 로딩 대조군으로 사용하였다. (B) 억제자-대조군 또는 억제자-miR-431로 HSMM을 감염 시킨 후, 분화 배지 내에서 상기 세포의 분화를 유도하였다. MyHC(녹색) 및 DAPI(청색)을 염색한 면역형광법으로 분석한 억제자-miR-431 감염된 HSMM은 대조군 세포에 비해 분화된 근관세포의 수가 감소하였다. 스케일 바는 200 um을 나타낸다. (C) 억제자-miR-431 감염된 HSMM의 미오게닌 및 MyHC와 같은 분화 마커 유전자의 mRNA 수준은 감소하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. **P<0.01 (D)는 miR-431에 의한 근원세포의 노화에 따른 조절을 개략적으로 나타낸 도이다. 노화 Pax7+MyoD+ 근원세포 내 miR-431의 감소는 TGF-β 또는 BMP 신호 전달의 하류 인자(downstream effector)인 Smad4의 증가를 유발하여 정상적인 근육 분화를 방해한다.
도 8은 신생 근원세포 및 노화 근원세포의 분리를 나타낸 도이다. (A) 신생 원시 근원세포 및 노화 근원세포를 3개월령 및 27개월령의 마우스의 뒷다리 근육으로부터 분리하였다. 상기 분리된 세포에 대해 Pax7(적색) 및 MyoD(녹색)에 대한 항체를 이용한 면역형광법을 수행하였고, DAPI(청색)로 핵을 염색하였다. 스케일 바는 200 um이다. (B) 염색된 신생 근원세포 및 노화 근원세포를 확대한 대표적인 이미지이다. 스케일 바는 20 um이다.
도 9는 노화 근원세포의 지연된 분화를 나타낸 도이다. (A) DIC 이미지 및 (B) 분화 배지(DM, 36시간)에서 초기 분화동안 신생 근원세포 및 노화 근원세포를 MyHC(녹색) 및 DAPI(청색)로 염색한 면역염색 결과이다. 스케일바는 200 um이다. 융합 인덱스는 전체 MHC-양성 세포에 대한 두 개 이상의 핵을 가진 MyHC-양성 세포의 백분율이다. 여섯개의 다른 관점을 융합 인덱스를 측정하기 위해 임의로 선택하였다. *P<0.05 (C) 36시간 동안 분화 배지에서 배양한 후, 네 개의 독립적으로 분리된 신생 근원세포 및 노화 근원세포의 MyHC의 단백질 수준을 면역블랏분석으로 결정하였다(왼쪽). β-액틴이 로딩 대조군으로 사용되었다. 오른쪽에 나타난 도는 MyHC에 특이적인 밴드의 정량화 그래프이다. *P<0.05. (D) 노화 근원세포는 myogenin이나 MyHC같은 분화 마커 유전자의 mRNA 수준이 감소하였다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. *P<0.05, ***P<0.001
도 10은 miR-431 유사체로 감염된 신생 근원세포 또는 miR-431 억제자 처리된 노화 근원세포에서는 분화능이 변하지 않는다는 사실을 보여주는 도이다. 대조군-유사체 또는 miR-431 유사체로 감염시킨 신생 근원세포는 분화배지에서 분화하도록 유도하였고 myogenin 및 MyHC와 같은 분화 마커 유전자의 mRNA 수준을 분석하였다. miR-431 억제자로 감염된 노화 근원세포는 비슷한 분화 마커 유전자의 mRNA 수준을 나타내었다. 결과는 β-액틴 mRNA의 평균에 표준화하였다. M은 유사체; I는 억제자를 나타낸다. 데이터는 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 11은 miR-431이 Smad4를 조절하는 miRNA로 추정된다는 사실을 보여주는 도이다. (A) 증가한 Smad4 단백질과 음의 상관관계를 보이는 하향 조절된 miRNA 중에서 miR-431(적색)을 포함한 4개의 miRNA가 Smad4 mRNA의 3'UTR의 조절 miRNA로 추정되었다. (B) 오직 miR-431만이 루시퍼라제 어세이에서 WT Smad4 3'UTR을 억제하였다. **P<0.01
도 12는 miR-431이 C2C12 세포에서 Smad4 발현을 조절하는 사실을 보여주는 도이다. (A) miR-431 유사체로 감염된 C2C12 세포는 대조군에 비해 Smad4의 단백질 수준이 감소한 반면(왼쪽), miR-431의 억제자로 감염된 세포는 대조군에 비해 Smad4의 수준이 증가하였다. (B) 비오티닐화된(Bi)-miR431-5p 또는 Bi-cel-miR-67(공지된 포유류 타겟을 가지지 않은 작은 대조군 RNA)으로 C2C12 세포를 감염시키고, 24시간 후, 스트렙타비딘 비드를 이용한 풀다운에 의해 RNA를 분리하였고, Smad4 mRNA 함량을 RT-qPCR을 이용하여 분석하였다. GADPH mRNA를 이용하여 표준화를 수행하였다. 그래프는 3개의 독립적인 실험 결과를 평균 ± 표준편차(SEM)로 나타내었다(C, 왼쪽). C2C12 세포 용해물은 Smad4 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고머(ASO) 또는 음성 대조군 RNA(Gm14635 lincRNA)와 함께 배양하였다. 상기 RNA는 스트렙타비딘 풀다운으로부터 분리되었고 Smad4 mRNA(GADPH mRNA에 표준화) 또는 miR431-5p(RNU6B에 표준화)(오른쪽)를 탐지하기 위해 RT-qPCR로 분석하였다. 그래프는 3개의 독립적인 실험 결과를 평균 ± 표준편차(SEM)로 나타내었다.
도 13은 CTX로 손상된 신생 TA 근육 조직 및 노화 TA 근육 조직을 나타낸 도이다. (A) 신생 재생 TA 근육 조직 및 노화 재생 TA 근육 조직의 CTX 손상 7일차 또는 14일차의 대표적 이미지이다. (B) CTX 손상된 신생 TA 근육 조직 및 노화 근육 조직의 Smad4의 발현 패턴은 14일간 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 결정하였다. GADPH을 로딩 대조군으로 사용하였다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 miR-431 또는 이의 유사체(mimic)을 유효성분으로 포함하는 근육 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "마이크로 RNA(microRNA, miRNA)"는, 약 22개 뉴클레오티드로 이루어진 번역되지 않는 소형 RNA 분자로서, mRNA 분해 또는 번역의 억제를 통해 개체의 유전자의 발현을 미세하게 조절하는 기능을 가진다. 본 발명에서는 miRAN가 근육의 노화 과정에 관여하는 사실에 주목하여, 근육 노화를 억제하고 근육 손상을 치료하는데 사용할 수 있는 miRNA를 찾고자 노력하였다.
본 발명의 용어, "miR-431"은, 어린 근원세포에 다수 존재하는 miRNA로서, Smad4를 타겟으로 할 수 있으며, 구체적으로 Smad4 mRNA, 특히 3'UTR을 타겟으로 할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 miR-431은 서열번호 1의 서열(5`-UGUCUUGCAGGCCGUCAUGCA-3`)을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 차세대 시퀀싱(NGS)을 이용하여 신생 근원세포 및 노화 근원세포 간 miRNA의 발현 양상을 비교 분석한 결과, 그 중 특히 118개의 miRNA의 발현량의 차이가 컸으며, 노화 근원세포에서 47개 miRNA의 발현량이 상향 조절된 반면, 71개 miRNA는 하향 조절되는 것을 확인하였고, 특히, miR-431의 분화능 강화 활성이 가장 강한 것을 확인하였다(실험예 1).
본 발명의 용어, "miR-431 유사체"는 체내에서 miR-431과 유사한 기능을 할 수 있으며, miR-431 시퀀스와 동일한 단일가닥 RNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 목적상, miR-431의 유사체는 노화된 근원세포의 근육 분화능을 특이적으로 증대시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 양태에 의하면 miR-431은 서열번호 1 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는 miR-431의 유사체가 노화 근원세포의 MyHC 및 Myogenin mRNA의 수준을 향상시키는 것을 확인하였다(실험예 2).
본 발명의 용어, "근육 노화"는, 노화에 따라 근육의 밀도와 기능이 점차적으로 약화되는 것을 의미하며, "근육 노화 관련 질환"은 노화에 의한 상기와 같은 근육의 상태 변화 및 이상으로 유발되는 질환을 의미 하는데, 특히, 노화로 인한 근육 감소를 노화성 근육감소증(age-related sarcopenia)이라고도 한다. 근육 노화를 경험하는 사람들은 낙상이나 골절이 쉽게 일어나는 것이 일반적이다.
본 발명의 구체적인 일 양태에 의하면, 상기 근육 노화 관련 질환은, 노화성 근감소증(age related sarcopenia), 동작 뉴런 질병, 대사성 근육 질병, 염증성 근병증, 신경근 접합부 질병, 내분비성 근병증일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기와 같은 노화성 근감소증을 비롯한 근육 노화 관련 질환은 근이영양증(muscle dystrophy)이나 근위축증(muscle atrophy)과는 구별되는 질환이다.
구체적으로, 근이영양증 환자는 근육 조직 검사에서 근육의 괴사를 보이며, 근섬유의 크기가 고르지 않고 다양하며 근섬유가 괴사된 자리에 지방 및 섬유화 조직으로 대치되는 증상을 보이며, 상기 근이영양증으로는 베커 근이영양증, 뒤셴 근이영양증, 선천성 근이영양증(Congenital muscular dystrophy), 에머리 드라이푸스 근이영양증(Emery-Dreifuss muscular dystrophy) 등이 대표적인 것으로 알려져 있다(Alan E H Emery, Lancet. 2002 Feb 23;359(9307):687-95). 특히 상기 근이영양증은 DMD, EMD 등 특정 유전자의 결핍 또는 변이에 의해 유발되는 것으로서, 유전적 요인이 그 원인으로 알려져 있다.
또한, 근위축증은 사지의 근육이 위축되는 것을 의미하며, 근위축성 측삭경화증과 척수성 진행성 근위축증이 대표적이며, 이는 척수에 있는 운동신경섬유 및 세포의 진행성 변성에 의한 질환으로 알려져 있다.
구체적으로, 상기 척수성 근위축증은 척수의 운동신경 세포의 변성에 의한 유전적 장애로서, 영유아 및 소아에게 나타나는 신경 근육 질환으로 알려져 있다. 또한, 근위축성 측삭경화증은 대뇌와 척수의 상위 운동신경세포와 하위 운동신경 세포의 사멸에 의한 난치성, 비가역 신경퇴행성 변화가 특징이며, 신경성장인자의 부족 및 신경염증이 주원인인 것으로 알려져 있어, 노화에 따른 근감소를 증상으로 하는 노화성 근감소증과는 발병 원인 및 증상이 다르다.
현재, 노화에 따른 근감소증의 치료 방법으로는 유로코르틴 Ⅱ(urocortinⅡ)를 이용하는 방법, 호르몬 대체 치료법(hormone replacement therapy) 등이 있으나, 몇 가지 부작용이 보고되어 있어 근육 노화 관련 질환에 대한 근본적인 치료로서는 부족한 측면이 있다.
그러나, 본 발명자들은 miR-431 또는 이의 유사체가 노화된 근원세포의 분화능을 특히 효과적으로 증대시킬 수 있음을 확인하였고, 이를 통해, 상기와 같은 근육 노화 관련 질환의 예방 또는 치료에 miR-431 또는 이의 유사체가 효과적임을 발견하였다.
본 발명의 일 실시예에서는 신생 근원세포에서는 miR-431의 과발현이 근원세포의 분화능을 증대시키지 않고, 노화 근원세포에서는 miR-431의 억제가 근원세포의 분화능을 감소시키지 않는 것을 확인하였다(실험예 2). 이는, 신생 근원세포에서는 miR-431의 기저수준이 포화되어 있으며, 노화 근원세포에서는 mR-431의 수준히 충분히 감소되어 있음을 시사한다.
상기와 같은 실시예로부터, 본원발명의 miR-431은 노화된 근육의 재생 및 노화된 근육 관련 질환의 치료에 특히 효과가 있음을 확인하였다.
본 발명의 용어, "근원세포(myoblast)"는 분화되지 않은 상태에 있는 근육 세포이며, 단핵 세포인 위성 세포(satellite cell)가 활성화되면 근원세포로 증식한다. 근원세포의 분화가 진행되면 다른 세포와 융합하여 다핵의 가늘고 긴 근관 (myotube)을 형성하여 근섬유 (muscle fiber)를 만든다. 노화된 근원세포는 노화에 따라 분화능이 감소되어 상기와 같은 근섬유의 형성이 저해되며, 결과적으로 근감소의 증상이 나타나게 된다.
본 발명의 용어, "근원세포 분화"란 단핵인 근원세포(myoblast)가 융합을 통해 다핵의 근관(myotube)를 형성하는 과정이다. 근육 전구체 세포에 해당하는 근원세포는 자기복제 (self-renewal) 하는 경우에는 Pax7+ 마커를 나타내며, 증식하는 경우 Pax7+/MyoD+를 나타낸다. 근관을 형성하는 분화단계의 세포는 Pax7-MyoD+MyoG+마커를 이용하여 구분할 수 있다. 상기 근관을 형성하는 분화 초기단계의 세포는 마이오신 D(MyoD)와 같은 근원성 전사인자(myogenic transcription factor)의 발현이 증가하며, 중기에는 마이오신 G(MyoG)가 증가한다. 분화가 거의 끝나는 후기에는 마이오신 중쇄(Myosin Heavy Chain)의 발현이 증가한다.
상기와 같은 근원세포의 분화는 골격근, 심근 및 평활근 내 에서 유도될 수 있고, 가장 바람직하게는 골격근에서 유도될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 miR-431 또는 이의 유도체는 근원세포, 특히 노화된 근원세포의 분화능을 증대시킴으로써 근관 및 근섬유를 형성하여 노화에 의해 감소된 근육량을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 일 양태에 의하면, miR-431 또는 이의 유사체는 Smad4의 mRNA를 타겟으로 할 수 있고, 더욱 구체적으로는 Smad4의 mRNA의 3'UTR (untranslated region, 비번역부위) 을 타겟으로 할 수 있다.
본 발명의 구체적인 다른 양태에 의하면, miR-431 또는 이의 유사체는 Smad4의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 miR-431이 Smad4의 3'UTR을 통해 Smad4의 발현을 억제하는 것을 확인하였으며, 상기 Smad4의 억제를 통해 근원세포의 근육 분화능이 증대되는 것을 확인하였다 (실험예 3 내지 실험예 4).
본 발명의 다른 실시예에서는 Smad4가 근육의 재생능이 낮은 노화 근원세포에서 발현량이 증대되는 것을 확인하였으며, 상기 Smad4를 저해하는 miR-431 또는 siSmad4에 의해 근원세포의 근육 분화능이 회복되는 것을 확인하였다(실험예 5 내지 실험예 6).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 인간 골격근 근원세포(HSMM)에서 miR-431 억제자가 근육의 분화를 감소시키는지 여부를 확인한 결과, miR-431 억제자로 감염시켜 HSMM에서 miR-431을 발현 저해시켰을 때, HSMM의 분화가 감소되는 것을 확인하였다(실험예 7).
본 발명의 용어, "예방"은, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여로 근육 노화 관련 질환의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 용어, "치료"는, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여로 근육 노화 관련 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 구체적인 일 양태에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 상기 miR-431 또는 이의 유사체는 이를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터의 형태로 포함되거나 비바이러스성 전달체와 함께 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 재조합 플라스미드, 바이러스 벡터, 또는 비바이러스성 전달체에 의해 전달되고 발현되는 miR-431 또는 이의 유사체로 인해 개체의 miR-431의 발현량이 증대됨에 따라, 노화된 근원세포의 분화능을 증대시킬 수 있다.
본 발명에서 제공하는 다양한 실시형태에서 사용되는 발명 miR-431 또는 이의 유사체는 생체 내 전달 효율을 높이기 위하여 당업계에 알려진 다양한 핵산 전달체(바이러스성 또는 비바이러스성 전달체)와 복합체 형태로 포함될 수 있다. 예컨대, miR-431을 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터로서 포함될 수 있다. 이를 위하여 사용 가능한 플라스미드로는 예를 들어, pSilencer (Ambion), pSiEx (Novagen), siXpress (Takara Bio), pBLOCK-iT™(Invitrogen), pcDNA3.1(Invitrogen), pCEP4(Invitrogen), SilenCircle™ (Allele), 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바이러스성 전달체로 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 관련 바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, EB 바이러스 벡터, 파필로마바이러스 벡터, 포오미바이러스 벡터가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 비바이러스성 전달체로서, 전달 시약으로 Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), G-fectin, 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 마이셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀, 리간드-DNA 복합체, 유전자총(genegun)이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 리포좀의 형태로서는 양친매성 제제(amphipathic agent), 예를 들어 마이셀, 불용성 단일층, 액정, 또는 수용액에 존재하는 라멜라층으로 존재하는 지질과 조합된다. 리포좀 제형을 위한 지질은 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파타이드, 리소레시틴, 레시틴 인지질, 사포닌, 담즙산, 리포펙틴 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, miR-431의 체내 안정성을 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 세포 내 흡수를 증가시키는 등 당업계에 알려진 일반적인 리보핵산 세포 내 전달 기술을 이용하도록 제제화될 수 있다.
또한 전기천공법(electroporation)에 의해 세포를 microRNA가 든 용액에 현탁하여 직류 고전압의 펄스를 통과시켜 세포내로 도입되게 하는 방법도 포함한다. 생체에는 microRNA가 든 용액을 원하는 부위에 투여하고 전극을 통해 직류전압을 펄스로 주어 세포로 도입되게 할 수 있다.
본 발명의 용어, "개체"는 근육 노화 관련 질환을 가질 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 한편으로 인간을 제외한 동물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 miR-431 또는 이의 유사체를 포함하는 조성물을 개체에 투여함으로써, 상기 근육 노화 관련 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다. 본 발명의 조성물은 기존의 근육 관련 질환의 치료제와 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일 양태에 의하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약제학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 투여되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미한다.
본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제 및/또는 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 투여 방식이 경구 투여 방식인지 또는 비경구 투여 방식인지에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
경구 투여용 제형의 비제한적인 예로는, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 정제, 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등을 들 수 있다.
상기 정제 또는 캡슐 등과 같은 경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여, 락토오스, 사카로오스 (Saccharose), 솔비톨 (Sorbitol), 만니톨(Mannitol), 전분, 아밀로펙틴 (Amylopectin), 셀룰로오스 (Cellulose) 또는 젤라틴 (Gelatin) 등과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트 (dicalcium phosphate) 등과 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분 등과 같은 붕괴제; 스테아르산 마그네슘 (magnesium stearate), 스테아르산 칼슘 (calcium stearate), 스테아릴 푸마르 산 나트륨(sodium stearyl fumarate) 또는 폴리에틸렌 글리콜 왁스 (polyethylene glycol wax) 등과 같은 윤활유 등을 포함할 수 있다. 나아가 캡슐 제형의 경우 상기 언급한 물질 외에도 지방유와 같은 액체 담체 등을 추가로 함유할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제형으로는, 예를 들어 피하 주사, 정맥 주사 또는 근육내 주사 등의 주사용 형태; 좌제 주입 방식; 또는 호흡기를 통하여 흡입이 가능하도록 하는 에어로졸제 등 스프레이용으로 제제화할 수 있으나 이에 제한되지 아니한다. 상기 주사용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 조성물을 안정제또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플(ampoule) 또는 바이알 (vial)의 단위 투여용으로 제제화할 수 있다. 상기 에어로졸제 등의 스프레이용으로 제형화하는 경우, 수분산된 농축물 또는 습윤 분말이 분산되도록 추진제 등이 첨가제와 함께 배합될 수 있다.
상기 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 miR-431 또는 이의 유사체, 및 근원세포; 또는 상기 miR-431 또는 이의 유사체에 의해 분화능이 증대된 근원세포를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 관련 질환 치료용 세포치료제를 제공한다.
본 발명의 용어, "miR-431", "miR-431의 유사체", "근원세포", 및 "근육 노화 관련 질환"은 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 용어, "세포치료제""는, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위해 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
본 발명의 세포치료제의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있으며, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 세포치료제는 miR-431 또는 miR-431 유사체, 및 근원세포 또는 상기 miR-431에 의해 분화능이 증대된 근원세포를 포함함으로써, 노화된 근육의 재생을 촉진하고, 노화 관련 질환을 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 노화된 근육 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "miR-431", 및 "miR-431의 유사체"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 miR-431을 포함하는 노화된 근육 재생용 조성물은 노화된 근원세포의 줄기성을 유지하고 분화능을 증대시킴으로써 효과적으로 노화된 근육 조직을 재생?회복시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 억제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "miR-431", 및 "miR-431의 유사체"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 miR-431을 포함하는 근육 노화 억제용 조성물은 근원세포의 줄기성을 유지함으로써 효과적으로 근육의 노화를 억제할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 본 발명은 miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 노화된 체외 근원세포 분화능 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어, "miR-431", 및 "miR-431의 유사체"는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 miR-431을 포함하는 노화된 체외 근원세포 분화능 개선용 조성물은 노화된 근원세포의 분화능을 증대시킬 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 근원세포의 miR-431 발현량을 측정하는 단계; 및 상기 단계에서 측정한 miR-431의 발현량과 대조 근원세포의 miR-431 발현량을 비교하는 단계를 포함하는, 노화된 근원세포의 근육 분화능을 측정하는 방법에 관한 것이다.
상기 발현량을 측정하는 단계는, miR-431의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 miR-431의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것은 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브 또는 이들의 조합을 이용할 수 있고, 이는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 및 DNA 마이크로어레이 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 대조 근원세포는 분화능이 손상되지 않은 근원세포로, 본 발명의 목적상 어린 포유류로부터 채취한 근원세포 또는 구입한 근원세포일 수 있으며, 특히 인간의 경우 만 20세 미만의 젊은 공여자의 근원세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 miR-431의 발현량을 비교하는 단계는 miR-431의 발현량이 대조 근원세포의 miR-431의 발현량 보다 감소하는 경우, 근원세포의 분화능이 감소한 것으로 판단할 수 있다.
상기 miR-431의 발현량을 비교하는 단계는 미오신 중쇄(MyHC) 또는 Myogenin의 발현량을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 MyHC 또는 Myogenin의 발현량은 MyHC 또는 Myogenin을 암호화하는 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 단백질 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다.
상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 설명된 바와 같다.
상기 단백질 발현 수준을 측정하는 것은 MyHC 또는 Myogenin 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머 또는 이들의 조합을 이용할 수 있고, 이는 웨스턴 블랏팅, ELISA, 방사선면역분석법, 방사면역확산법, 오우크레로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 면역전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전분석, 보체고정분석, FACS 및 단백질 칩으로 구성된 군으로부터 선택되는 분석법을 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 의하면, 근원세포의 miR-431의 발현량을 측정하는 제제를 포함하는 노화된 근원세포의 근육 분화능 측정용 키트에 관한 것이다.
상기 miR-431의 발현량을 측정하는 제제는 miR-431을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브, miR-431에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 키트는 미오신 중쇄(MyHC) 또는 Myogenin의 발현량을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.
상기 발현량을 측정하는 제제는 상기 설명한 바와 같다.
상기 근육 분화능 측정용 키트는 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용설명서를 추가로 포함할 수 있다. 사용설명서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함할 수 있다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다
실시예 1. 마우스의 준비
어린 (3개월령) C57BL/6 마우스 및 늙은 (27개월령) C57BL/6 마우스를 Laboratory Animal Resource Center(한국생명공학연구원, KRIBB)에서 구입하였다. 모든 동물 실험은 한국생명공학연구원(KRIBB)의 동물의 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었다.
실시예 2. 원시 근원세포의 분리 및 세포 배양
이전의 연구에서 개시된 바대로(Rando and Blau 1994), 원시 근원세포(primary myoblast)를 야생형 및 Prx3 KO 마우스의 뒷다리 근육으로부터 분리하였다. 간략히 말하면, 상기 근육을 가위를 이용하여 얇게 다지고 20분간 37℃에서 해리 버퍼(dissociation buffer)로 배양하였다. 상기 해리 버퍼는 디스파아제 II(2.4 U/ml, Roche), 콜라게나제 D(1%, Roche) 및 2.5 uM 염화칼슘을 포함한다. 슬러리(slurry)는 혈청 피펫을 이용하여 분말화하였고, 잔해를 제거하기 위해 70-uM 나일론 메쉬(BD Bioscience)을 통과시켰다. 세포는 3분간 1,000 rpm으로 원심분리하여 회수하였고, 20% FBS로 보충된 Ham's F-10(HyClone), 항생제 및 5 ng/ml bFGF를 포함하는 성장 배지에 재현탁하였다. 섬유아세포(fibroblast)를 제거하기 위해, 상기 세포를 코팅 되지 않은 플레이트 위에 1시간 동안 플레이팅하였고, 부유하는 세포는 콜라겐-코팅된 배양 접시로 옮겼다. 원시 근원세포를 유지하기 위해, 성장 배지는 이틀마다 교체하였다. 상기 근원세포의 분화는 5일간 항생제 및 5 % 말 혈청으로 보충된 DMEM(HyClone)이 포함된 분화 배지에서 세포를 배양함으로써 유도하였다.
17세 기증자로부터 얻은 인간 골격근 근원세포(Lonza)를 항생제, 인간 표피 생장 인자(human epidermal Growth Factor, hEGF), 덱사메타손(Dexamethasone), L-글루타민 및 10 % 소 태아 혈청으로 보충된 골격근 기본 배지 (basal medium) 2를 포함하는 성장 배지에서 배양하였다. DMEM/F12(Gibco), 항생제 및 2% 말 혈청을 함유한 분화 배지로 교체하여 시딩하고(seeding) 24 내지 48시간 후에 분화가 시작되었다.
C2C12 세포는 ATCC에서 구입하였고 항생제 및 10% 소 태아 혈청과 함께 상기 세포를 DMEM(Gibco)을 포함하는 성장 배지에서 배양하였다. DMEM/F12(Gibco), 항생제 및 5% 말 혈청을 함유한 분화 배지로 교체하여 시딩하고(seeding) 24 내지 48시간 후에 분화가 시작되었다.
실시예 3. miRNA 시퀀싱 및 데이터 분석
소형 RNA가 풍부한 전체 RNA를 근원세포(n=12)로부터 제작자의 프로토콜을 따라 mirVana miRNA 분리 키트(Ambion, Austin, TX)를 이용하여 추출하였다. miRNA 라이브러리는 Illumina 라이브러리 제작 프로토콜(Illumina Inc, San Diego, Ca, USA)을 따라 준비하였다. 각 라이브러리는 Illumina 어댑터를 이용하여 색인하였고, 소형 RNA 라이브러리를 6 % TBE 요소 폴리아크릴아미드 겔 상에서 크기대로 분류하였다. 이로부터 140-160 염기쌍(bp) 크기의 단편을 겔로부터 절단하였다. 정제된 miRNA 라이브러리를 Agilent DNA 1000 칩 상에서 정량화하였다. 색인된 모든 샘플들을 Illumina GAIIx(50 염기쌍 리드(read))의 한 레인에 모아서 시퀀싱하였다. 가공하지 않은 소형 RNA 시퀀싱 리드를 참조 게놈에 매핑(mapping)하기 전, FastQC(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)를 이용하여 리드의 염기의 질을 평가하였고, 인-하우스(in-house) PERL 스크립트를 이용하여 3'말단에 부착된 어댑터 시퀀스를 제거하였다. 어댑터로 다듬어진 소형 RNA 리드를 아무런 옵션 없는 bwa 소프트웨어(http://bio-bwa.sourceforge.net)를 이용하여 UCSC 게놈(http://genome.ucsc.edu)에서 다운로드한 참조 게놈 mm10 상에 매핑하였다. 공지된 miRNA(mirbase ver 20)에 대하여, 구입한(custom) 파이썬(python) 스크립트를 이용하여, 매핑 된 리드로부터 얻은 각 전구체 및 성숙한 miRNA의 FPKM을 계산하였다. Mirbase는 이미 공지된 miRNA를 필터링하기 위해 사용하였고, Rattus norvegicus는 연관된 종으로써 사용하였다. 상술한 분석의 결과로 얻은 데이터는 GSE66267의 번호로 Gene Expression Omnibus(GEO)에 저장하였다.
실시예 4. 정량화 RT-PCR 및 성숙한 miRNA 발현 분석
miRNA의 발현 수준을 알아보기 위해 정량화 RT-PCR을 수행하였다. RNA 준비 및 cDNA 합성은 표준 프로토콜대로 수행하였다. 정량화 RT-PCR 분석은 cDNA, 프라이머, SYBR 마스터 믹스(Master Mix, Applied Biosystems)를 함유한 20-ul 반응 부피의 StepOnePlusTM(Applied Biosystems)을 이용하여 수행하였다. 데이터는 각 반응에서 β-액틴 mRNA의 풍부한 정도(abundance)에 표준화되었다. 프라이머의 서열은 서열번호 2 내지 15로 나타내었고 표 1에 정리하였다.
Figure PCTKR2016004718-appb-T000001
성숙한 miRNA의 발현 분석을 위해 TaqMan MicroRNA 어세이를 제작자가 추천한 프로토콜(Applied Biosystems)에 따라 수행하였다. 간략히 말하면, 각 역전사 효소(RT) 반응에는 mirVana miRNA 분리 키트를 사용하여 분리한 총 10 ng의 RNA, 50 nM 스템 루프(stem-loop) RT 프라이머, 0.25 mM 각 dNTP, 3.33 units/ul MultiScribe RT 효소, 0.25 units/ul RNase 억제자 및 1 RT 버퍼(모두 Applied Biosystems 사에서 구입)가 포함되어 반응이 이루어진다. 상기 qRT-PCR 반응은 10분간 95℃에서 Applied Biosystem 사의 96-웰 플레이트에서 배양 후 95℃ 15초, 60℃ 1분을 40번 반복하는 것으로 수행되었다. 역치 주기(Ct)는 고정된 역치를 형광(fluorescence)이 통과하는 부분적인 주기 횟수로 정의된다. U6 snRNA는 표준화의 내생적 대조군으로 사용하였다.
실시예 5. 세포의 감염 및 루시퍼라제 어세이 수행
30 nM의 siRNA, miRNA 유사체, 및 miRNA-억제자를 제작자의 추천 프로토콜에 따라 RNAiMax(Invitrogen)을 사용하여 원시 근원세포, C2C12 또는 인간 근골격 근원세포에 감염시켰다. miRNA-유사체 및 miRNA-억제자는 mirVana(Invitrogen) 또는 AccuTarget™ Human miRNA 유사체(Bioneer)를 사용하였고, siRNA는 Dhamacon(Thermo Scientific)에서 구입하였다. 상기 유사체 및 억제자는 표 2부터 4에, siRNA는 표 5에 정리하였다.
Figure PCTKR2016004718-appb-T000002
Figure PCTKR2016004718-appb-T000003
Figure PCTKR2016004718-appb-T000004
Figure PCTKR2016004718-appb-T000005
miR-431 결합 부위를 포함한 Smad4의 3'UTR 단편(0 내지 1,265 bp 위치)을 다중 제한효소 클로닝 부위(multi cloning site) 내 HindIII 및 BamHI 사이에 luc를 코딩하는 서열이 위치한 pcDNA3-luc 벡터내로 복제하였다. 상기로부터 생성된 플라스미드 구성물은 강한 CMV 프로모터에 의해 구동되는 luc-3'UTR을 포함하고, 이는 mRNA을 번역으로 조절하는 miRNA의 기능을 분석할 수 있게 한다. 또한, 루시퍼라제 어세이를 위해 miR-431 결합 부위(1067 내지 1073 bp 위치)의 결실을 가진 Smad4 3'UTR 변이체(mutant)를 동일한 pcDNA 3-luc 벡터에 복제하였다.
실시예 6. 비오티닐화된 miR431-5p 또는 안티센스 올리고를 베이트로 사용한 풀다운(pulldown) 어세이
C2C12 세포를 100-mm 플레이트에서 비오티닐화(Bi)된 miR431-5p 또는 대조군 Bi-cel-miR-67(IDT, 각각 60 nM)으로 감염시켰다. 감염 24시간 후, 상기 세포를 PBS로 세척하였고 1 ml 용해 버퍼[20 mM 트리스(pH 7.5), 100 mM 염화칼륨, 5mM 염화마그네슘, 0.3 % NP-40, RNase OUT(Invitrogen)의 100 U, 프로테아제 억제자(Roche)]에서 용해시켰다. 이미 공지된 바 처럼(Lal et al. 2011), 10 분간 얼음에서 배양하였다. 세포질 용해물은 10분간 12,000g으로 원심분리하여 제거하였다. Dynabead(100 ul)을 첨가하여 회전시키면서 4℃ 에서 4시간 동안 배양하였다. 상기 비드를 1 ml 냉각된(ice-cold) 용해 버퍼로 4차례 세척하였고, RNA를 TRIzol을 이용하여 분리하였으며, Smad4 mRNA의 함량(enrichment)을 qRT-PCR로 측정하여 Gapdh mRNA에 표준화하였다. 상기의 방법에 의한 풀다운 전에, 신생 근육 샘플 및 노화 근육 샘플에서 300 ug의 용해물을 4℃ 에서 1ml 용해 버퍼 내에서 4시간 동안 비오티닐화된(Bi)-miR431-5p 또는 Bi-cel-miR-67(대조군, ctrl) 100 pmol로 회전 배양하였다.
베이트로 Smad4에 상보적인 안티센스 올리고를 사용하여, C2C12 세포(~70 % confluence 4개의 100-mm 플레이트)를 프로테아제 억제자(Roche) 및 RNase 억제자(Thermo Fisher)를 함유한 PEB로 용해시켰다. 용해물은 예전의 연구에서 설명한대로(Yoon et al. 2012), 1X TENT 버퍼(10 mM 트리스-염화수소[pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0], 250 mM 염화나트륨, 0.5% [v/v] 트리톤 X-100) 내 Smad4 mRNA 또는 lncRNA Gm14635에 상보적인 비오틴-표지된 올리고머 100 pmole, 프로테아제 및 RNase 억제자와 함께 1시간 동안 실온에서 회전 배양하였다. Dynabead(50 ul)를 첨가하고 실온에서 30분간 더 회전 배양하였다. 상기 비드는 냉각된 PBS 버퍼로 3차례 세척하였고, TRIzol을 이용하여 RNA를 분리하였으며, Smad4 mRNA의 함량(enrichment)은 GAPDH mRNA에 표준화된 qRT-PCR에 의해 분석하였다. Smad4 mRNA가 풍부해진 샘플 내 miR431-5p의 증가된 함량(abundance)을 QuantiMir 키트(SBI)를 이용하여 분석하기 위해 상기와 동일한 RNA를 사용하였다. 신생 근육 및 노화 근육에 대해, 상술한 방법을 이용한 풀다운에 600 ug의 용해물이 사용되었다.
실시예 7. 면역 블랏(immunoblot) 분석
근육 조직 및 분리된 근원세포는 프로테아제 및 포스파타제 억제자를 포함한 PRO-PREP 용해 버퍼(Intron Biotech) 내에서 균질화하였다. 용해물은 15,000 g으로 4℃ 에서 20분간 원심분리하였다. 생성된 상층액으로 SDS-PAGE, 이어서 면역 블랏 분석을 수행하였다. MyHC(Santa Cruz Biotechnology), Myogenin(Santa Cruz Biotechnology), β-액틴(Santa Cruz Biotechnology), Smad2/3(Cell Signaling Technology), Smad4(Santa Cruz Biotechnology), GADPH(Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체가 면역 블랏팅에 포함되었다.
실시예 8. CTX 주사로 유도된 근육의 재생
이전에 개시된 대로(Conboy and Rando 2012), CTX(Sigma)를 3개월령 및 27개월령 마우스의 전경골근(TA)에 주사하여 근육 재생을 유도하였다. 간략히 말하면, TA 근육에 50 ul의 20 uM CTX를 주사하였고, miR-431 또는 siSmad4를 TA 근육에서 과발현 시키기 위해, miRNA-유사체 또는 siRNA와 RNAiMAX 시약의 혼합물을 제조하였다(Dey et al. 2014). 3 ul의 1 mM miRNA-유사체 또는 siRNA 및 37 ul의 Nuclease 제거된 물을 40 ul RNAiMAX 시약(Invitrogen)과 혼합하고, 30분간 배양하였다. 최종적으로, 50 ul의 혼합물을 TA 근육에 CTX 주사 후 3일차 및 5일차에 주사하였다.
실시예 9. 면역조직화학(immunohistochemical analysis) 검사 및 면역형광법 (immunofluorescence)
골격근 조직을 4 % 파라포름알데하이드에서 고정하고, 동결 섹션 샘플 또는 파라핀이 심어진 섹션 샘플을 준비하였다. 동결 섹션(10 um)을 표준 프로토콜대로 DAPI 및 항체로 염색하였다. 면역조직화학 분석을 위한 항체로는, Laminin(Sigma-Aldrich) Pax7(Developmental Studies Hybridoma Bank), Smad4(Abcam) 항체가 포함된다. 상기 파라핀 섹션 샘플은 H&E로 표준 프로토콜을 따라 염색하였다. 횡단면(CSA) 측정은 NIH ImageJ 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/)로 수행하였다. 면역형광법을 위해, 원시 근원세포를 Laminin(Invitrogen)-코팅된 커버 슬립 상에서 생장 배지 또는 분화 배지로 생장시켰다. 상기 세포는 4 % 파라포름알데하이드에서 고정하였고, PBS 버퍼로 세척하였으며, PBS 버퍼 내 0.3 % 트리톤(Triton) X-100을 투과시켰다. 세포들은 PBS 버퍼 내 3 % 소 혈청 알부민으로 블라킹(block)하였고, 블라킹 용액에 희석된 1차 항체로 한 번 더 블라킹하였다. 상기 세포를 PBS 버퍼로 세척하고, 2차 항체와 배양하였다. PBS 버퍼로 세척 후, 커버 슬립을 VectoLab Mounting Medium을 사용하여 유리 슬라이드위에 올렸다(mount). 면역형광법을 위한 항체로는, MyHC(Santa Cruz Biotechnology), MyoD(Santa Cruz Biotechnology), 및 Pax7(Developmental Studies hybridoma Bank)를 포함한다. 융합 인덱스는 총 MyHC 양성 세포 수에 대한 다중 핵의 MyHC 양성 세포 수의 비율로 계산하였다.
실시예 10. 통계적 분석
정량화 데이터는 달리 설명이 없는 한, 평균 ± 표준편차로 표기하였다. 평균간의 차이는 student's unpaired t test로 평가하였다. p 값 < 0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다.
상기 실시예 실험에 따른 결과는 하기 실험예와 같이 분석하였다.
실험예 1. 차세대 시퀀싱(NGS)를 이용한 신생 근원세포 및 노화 근원세포간 miRNA 발현 양상(profile)의 비교 분석
노화 근원세포의 감소된 분화능(myogenic capability)에 관여하는 miRNA의 역할을 규명하기 위해 차세대 시퀀싱(next-generation sequencing, NGS)을 이용하여 신생 근원세포 및 노화 근원세포에서 miRNA 발현 프로파일을 분석하였다.
3개월령(이하 '신생'이라고 한다) 및 27개월령(이하 '노화'라고 한다) 마우스의 뒷다리 근육으로부터 원시 근원세포(primary myoblast)를 분리하여 배양하였다. Pax7 및 MyoD의 두 단백질을 원시 근원세포의 특이적 마커로서 사용하였다(Wang and Rudnicki 2012). 면역염색 분석(immunostaining analysis)에서, 약 99%의 분리된 근원세포가 Pax7 및 MyoD 두 단백질을 모두 발현하였다(도 8).
신생 근원세포 및 노화 근원세포에서 분화능을 비교하였다. 그 결과, 노화 근원세포는 감소된 분화능을 보였고, 이는 이전의 보고(Schultz and Lipton 1982; Fulle et al. 2005; Wagers and Conboy 2005)와 일치하였다. 신생 근원세포와 비교하여, 노화 근원세포는 미오신 중쇄(Myosin heavy chain, MyHC) 양성의 분화된 근관세포의 수가 감소하였다(도 9A, 9B). 노화 근원세포 내 MyHC의 단백질 수준 역시 감소하였다. MyHC 및 미오게닌(Myogenin)과 같은 분화 마커 유전자의 mRNA 수준 역시 상당히 하향-조절(down-regulated)되었다(도 9D).
신생 근원세포 및 노화 근원세포 간 상당한 차이(>2배)를 보인 성숙한 118개의 miRNA중에서(도 1A), 노화 근원세포에서 47개 miRNA가 상당히(P<0.05) 상향 조절(upregulated)되었고(표 6), 71개 miRNA는 하향 조절되었다(표 7).
Figure PCTKR2016004718-appb-T000006
Figure PCTKR2016004718-appb-T000007
본 발명자들은 노화 근육 조직에서 57%의 하향 조절된 miRNA가 염색체 12번상에 존재하는 Dlk-Dio3 지역에 위치하는 것을 보고한 바 있다(Kim et al. 2014a). 흥미롭게도, 71개의 하향 조절된 miRNA 중에서 63개(89%) 역시 노화 근원세포의 Dlk-Dio3 지역에 위치하였다.
이러한 결과는 상기 게놈 지역에 위치한 miRNA가 근육 조직 및 근원세포의 노화에 있어서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사한다. 이에, 본 발명자들은 상기 게놈 지역에 위치한 13 miRNA를 선별하여, 노화 근원세포에 감염시켜 두 분화 마커(MyHC 및 Myogenin)의 mRNA 수준을 분석하였다. miR-431이 노화 근원세포의 분화능을 강화시키는 데 있어서 가장 강력한 활성을 나타내었다(도 1B).
실험예 2. miR-431의 노화 근원세포의 근원성 분화 증대
분화 마커 유전자의 증가 외에도, MyHC-양성의 분화된 근관세포의 형태학 및 숫자에서 보여지듯이 외인성의 miR-431은 노화 근원세포의 분화를 증가시켰다. 반대로, miR-431의 억제는 신생 근원세포의 분화능을 감소시켰다(도 2A 및 B). 노화 근원세포에서 MyHC 및 Myogenin의 mRNA 수준이 miR-431 유사체(mimic)로 감염하였을 때 모두 증가한 반면(도 2C), 신생 근원세포에서 miR-431 억제자로 감염하였을 때는 MyHC 및 Myogenin 모두 mRNA 수준이 감소하였다(도 2D).
이러한 결과는, 노화 근원세포 내에서 감소하는 miRNA 중 하나인 miR-431이 노화에 따른 분화능의 조절에 있어서 중요한 역할을 한다는 사실을 시사한다.
반면, 신생 근원세포에서 miR-431을 과발현 시켜도 분화능은 증가하지 않았고, 노화 근원세포에서 miR-431 억제자로 감염하더라도 분화능은 감소하지 않았다(도 10).
이러한 결과는, 신생 근원세포 내 miR-431의 기저 수준은 정상의 분화 과정(program)에서 포화되어 있음을 시사한다. 반대로, 노화 근원세포에서는 miR-431은 지연된 분화를 유발하기에 충분할 정도로 감소되어 있음을 시사한다.
실험예 3. 노화 근원세포 내 Smad4의 녹다운(knockdown)에 의한 분화 증대
근육의 노화 동안 일어나는 miR-431에 의한 손상된 분화의 매커니즘을 이해하고자, miR-431의 추정되는 타겟을 TargetScan(www.targetscan.org) 및 miRanda(www.microRNA.org)을 이용하여 검색하였다. 그 결과, Smad4가 miR-431의 타겟 유전자로 추정되는 유전자 중 하나였다.
기존의 여러 연구에 따르면, TGF-β 신호가 근육 분화를 억제시키는 사실을 보고하고 있으며, 이로 인해, 늙은 마우스는 지연된 근육 재생을 보인다(Carlson et al. 2008; Carlson et al.2009). TGF-β 신호 경로에서 활성화된 TGF-β 수용체는 먼저 Smad2 또는 Smad3을 인산화한다. 이후, 인산화된 Smad2/3은 흔한 Smad 단백질인 Smad4와 이종삼량체 복합체(heterotrimeric complex)를 형성하여 타겟 유전자를 발현(turn on)시키기 위해 핵으로 이동한다(Schmierer and Hill 2007).
이러한 보고들에 따라, 본 발명자들은 신생 근원세포 및 노화 근원세포에서 상기 세 가지 Smad 단백질(Smad2, 3, 및 4)의 발현을 조사하였다. TGF-β신호 경로의 하류 인자(downstream effector)인 Smad3 및 Smad4의 단백질 수준은 노화 근원세포에서 상향 조절된 반면, Smad2의 단백질 수준은 변화하지 않았다(도 3A).
Smad3 및 Smad4의 상향 조절이 노화 근원세포에서 감소된 분화능과 연관있는지 여부를 확인하기 위해, 본 발명자들은 siRNA를 이용하여 노화 근원세포에서 Smad3 또는 Smad4를 녹다운(knockdown)시킨 후, 대조군 siRNA를 감염시킨 노화 근원세포와 근육 분화를 비교하였다.
흥미롭게도, Smad4의 녹다운은 MyHC 및 Myogenin의 mRNA 수준을 증가시켰으며, 노화 근원세포의 지연된 근육 분화를 상당한 수준으로 회복(reverse)시켰다. 반면, Smad3의 녹다운은 그렇지 않았다(도 3B). 노화 근원세포의 MyHC-양성의 분화된 근관세포의 수는 대조군 siRNA 감염된 경우와 비교했을 때, siSmad4 감염된 근원세포에서 상당히 증가하였다(도 3C, D).
신생 근원세포 및 노화 근원세포의 분화 동안, Smad4의 조절 miRNA로 추정되는 miR-431 및 Smad4의 발현 수준을 분석하였다. 분화하는 동안 노화 근원세포 내 Smad4의 단백질 수준은 신생 근원세포의 발현수준보다 높았으나, Smad4 단백질은 근육 분화가 유도되고 3일후까지 점진적으로 감소하였다(도 3E). 반면, miR-431의 발현수준은 노화 근원세포에서 낮은 수준에 머물렀음에도 불구하고, 분화하는 동안 miR-431은 신생 근원세포 및 노화 근원세포 모두에서 점진적으로 상향 조절되었다(도 3F). 이러한 결과는 Smad4 단백질 및 miR-431간 발현 수준은 음의 상관관계를 가진다는 것을 시사하였고, 이에 본 발명자들은 miR-431이 실제로 Smad4의 발현을 조절하는지 여부를 확인하였다.
실험예 4. miR-431의 3'UTR을 통한 Smad4 발현 조절
Smad4 mRNA의 3'UTR에서 본 발명자들은 노화 과정에서 Smad4의 증가된 단백질 수준과 음의 상관관계를 보이는, miR-431을 포함한 네 개의 하향 조절된 miRNA를 발견하였다. 그 중에서, 오직 miR-431만이 Smad4 3'UTR의 루시페라아제(luciferase) 활성을 억제하였다(도 11). 변이 Smad4 3'UTR은 miR-431에 의해 억제되지 않았고, 이는 miR-431에 의한 Smad4의 억제는 특이적이라는 사실을 의미한다(도 4A).
중요한 것은, miR-431이 결합하는 Smad4 3'UTR 부위는 인간과 마우스 사이에 보존되어 있다는 사실이다(도 4B). 예상한 것처럼, Smad4 단백질은 노화 근원세포에서 miR-431의 과발현으로 하향 조절된 반면, miR-431 억제자로 감염된 신생 근원세포에서는 상향 조절되었다(도 4C). miR-431 유사체 또는 억제자를 처리한 C2C12 세포에서도 비슷한 결과를 얻었다(도 12A).
miR-431과 내생의 Smad4 mRNA의 직접적인 상호작용은 바이오티닐화된(Bi) miR-431 또는 Smad4 안티센스 올리고(antisense oligo)를 베이트로 이용한 풀다운(pull-down) 실험에 의해 확인하였다. C2C12 세포를 먼저 Bi-miR-431 또는 Bi-cel-miR-67(대조군)으로 감염시킨 후, 스트렙타비딘(streptavidin) 커플링된 비드(bead)에 의해 RNA를 분리하였다. qRT-PCR을 사용하여 확인한 결과, Bi-miR-431 감염된 세포로부터 분리된 RNA 중 Smad4 mRNA가 풍부한 것을 확인하였다(도 12B).
신생 근육 조직 및 노화 근육 조직의 용해물을 배양한 후의 Bi-miR-431의 풀다운 실험에서도 Smad4 mRNA는 풍부하였다(도 4D). 또한, 바이오티닐화된 안티센스 올리고를 이용하여 내생적 Smad4 mRNA의 풀다운 실험에서도 miR-431이 풍부한지 여부를 확인하였다.
그 결과, miR-431은 Bi-Smad4 ASO 배양된 근원세포 및 C2C12 세포의 용해물에서 상당히 풍부하였다(도 4E; 도 12C). 종합하면, 이러한 결과들로부터 miR-431은 3'UTR에 직접적으로 작용하여 Smad4의 발현을 억제한다는 사실을 알 수 있다.
실험예 5. 노화된 근육 조직 재생에 있어서 Smad4 단백질의 급격한 증가
카디오톡신(cadiotoxin, CTX)을 전경골근(tibialis anterior, TA) 근육에 주사하여 유도한 골격근 조직 재생(Charge and Rudnicki 2004; Liu et al. 2012)에서 Smad4 및 miR-431의 발현수준을 조사하였다.
먼저, CTX를 어린 마우스 및 늙은 마우스의 TA 근육에 주사함으로써, 근육 손상 및 이의 재생을 유도하였다. 그 후, CTX 주사 후 14일 간 Smad4 단백질 및 miR-431 발현을 비교하였다.
그 결과, 이전의 연구대로(Conboy and Rando 2012), 노화 TA 근육은 CTX 주사 후, 손상된 재생능을 보인 반면, 신생 TA 근육은 재생에 문제가 없었다(도 13A). Smad4 단백질의 수준은 CTX 주사한 첫 날 이후, 노화 TA 근육 및 신생 TA 근육 모두에서 상향 조절되었음에도 불구하고, 노화 TA 근육은 Smad4 단백질이 급격히 증가하였고, 이는 14일간 지속되었다(도 5A). 이와는 반대로, miR-431의 발현은 신생 TA 근육에서보다 노화 TA 근육에서 낮은 수준으로 유지되었다(도 5A; 도 13B).
다음으로, CTX 주사 후 14일차에 조직을 면역조직화학염색 분석하여 Smad4가 상향 조절된 지역을 밝히고자 하였다. 흥미로운 것은, Smad4가 Pax7 양성의 근원세포에서 강하게 착색된다는 사실이다(도 5B).
종합적으로 상기와 같은 시험관 내 데이터는 상향 조절된 Smad4가 노화 근육에서 나타나는 손상된 재생의 원인 중 하나일 수 있다는 사실을 암시한다.
실험예 6. miR-431에 의한 TA 근육의 재생능 회복
miR-431이 가지는 노화된 근육 재생능 회복을 위한 치료물질로서의 잠재력을 확인하고자, miR-431 또는 siSmad4가 생체 내에서 늙은 마우스의 손상된 근육 재생능을 개선시킬 수 있는지 실험하였다.
CTX에 의해 손상된 노화 TA 근육에서 miR-431 또는 siSmad4를 과발현시키기 위해, 이전의 연구에 개시된 대로(Dey et al. 2014) RNAiMAX 혼합물을 CTX 손상 후 2차례, 2일차 및 5일차에 주사하였다(도 6A). 2주 후, 대조군 근육 조직의 횡단면과 재생하는 섬유의 횡단면을 비교하였다.
그 결과, 예측한대로, 중심핵을 가지는 새로 생성된 근섬유가 대조군 근육 조직에서 보다 Smad4가 녹다운된 TA 근육 조직에서 상당히 큰 것을 발견하였다(도 6B). 나아가, miR-431은 늙은 마우스에서 근육 재생능을 강화하였고, 그 결과로 대조군 근육에 비해 상당히 큰 재생 섬유가 생성되었다(도 6C).
종합하면, miR-431가 늙은 마우스에서 지연되거나 손상된 근육의 재생을 회복시킬 수 있다.
실험예 7. miR-431에 의한 인간 골격근 근원세포(HSMM)의 근육 분화 증가
Smad4의 3'UTR 시드 서열(seed sequence)은 인간과 마우스 간 보존되어 있으므로(도 4B), miR-431이 인간 Smad4 단백질의 수준도 조절할 수 있을 것으로 기대하였다. 이를 확인하고자, miR-431 유사체 또는 억제제로 감염된 인간 골격근 근원세포(HSMM)의 Smad4 단백질 수준을 분석하였다.
그 결과, miR-431을 과발현하는 HSMM에서는 hSmad4 단백질 수준이 하향조절 된 반면, miR-431의 억제자는 Smad4 단백질 수준을 증가시켰다(도 7A). 이는 마우스 근원세포로부터 얻은 결과와 일치하였다.
miR-431이 HSMM의 분화를 증대시킬 수 있는지 여부를 확인하고자 miR-431 억제자로 HSMM을 감염시키고, 분화 정도(differentiation index)를 분석하였다.
그 결과, 마우스 근원세포의 경우와 동일하게, miR-431 억제자는 HSMM의 분화를 감소시켰다(도 7B 및 7C).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (16)

  1. miR-431 또는 이의 유사체(mimic)를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 근육 노화 관련 질환은 노화성 근감소증(age related sarcopenia), 동작 뉴런 질병, 대사성 근육 질병, 염증성 근병증, 신경근 접합부 질병, 및 내분비성 근병증으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 miR-431의 서열은 서열번호 1 인 것인, 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 miR-431 또는 이의 유사체는 Smad4 mRNA를 타겟으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 miR-431 또는 이의 유사체는 상기 Smad4 mRNA의 3'UTR (untranslated region, 비번역부위)을 타겟으로 하는 것인, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 miR-431 또는 이의 유사체는 Smad4를 억제하는 것인, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 miR-431 또는 이의 유사체를 발현하는 재조합 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함하거나, 비바이러스성 전달체를 추가적으로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것인, 약제학적 조성물.
  9. (a) miR-431 또는 이의 유사체, 및 근원세포; 또는
    (b) miR-431 또는 이의 유사체에 의해 분화능이 증대된 근원세포를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 관련 질환 치료용 세포치료제.
  10. miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 노화된 근육 재생용 조성물.
  11. miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 근육 노화 억제용 조성물.
  12. miR-431 또는 이의 유사체를 유효성분으로 포함하는 노화된 체외 근원세포 분화능 개선용 조성물.
  13. (a) 근원세포의 miR-431의 발현량을 측정하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 측정한 miR-431의 발현량과 대조 근원세포의 miR-431 발현량을 비교하는 단계를 포함하는, 노화된 근원세포의 근육 분화능을 측정하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 (b) 단계는 miR-431의 발현량이 대조 근원세포의 miR-431의 발현량 보다 감소하는 경우, 노화된 근원세포의 분화능이 감소한 것으로 판단하는 것인, 근육 분화능을 측정하는 방법.
  15. 근원세포의 miR-431 발현량을 측정하는 제제를 포함하는, 노화된 근원세포의 근육 분화능 측정용 키트.
  16. 제15항에 있어서, 상기 miR-431의 발현량을 측정하는 제제는 miR-431을 암호화하는 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍, 프로브, miR-431에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 노화된 근원세포의 근육 분화능 측정용 키트.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3476950A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-01 Centrum Onkologii - Instytut Im. Marii Sklodowskiej-Curie Microrna-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of vulvar carcinoma and vulvar intraepithelial lesions
EP3737763A4 (en) * 2018-01-09 2021-12-08 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MUSCLE DISEASE OR CACHEXIA, INCLUDING, AS ACTIVE PRINCIPLE, A MICRORNA LOCATED IN A DLK1-DIO3 GROUP OR A VARIANT THEREOF

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140115865A (ko) * 2013-03-22 2014-10-01 한국생명공학연구원 근육 노화 탐지 마커 및 이의 용도
CN104306988A (zh) * 2014-09-25 2015-01-28 中国医学科学院基础医学研究所 miR-431在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20140115865A (ko) * 2013-03-22 2014-10-01 한국생명공학연구원 근육 노화 탐지 마커 및 이의 용도
CN104306988A (zh) * 2014-09-25 2015-01-28 中国医学科学院基础医学研究所 miR-431在制备治疗肌肉疾病的药物中的用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEANSON-LEH, LAURENCE ET AL.: "Serum Profiling identifies Novel Muscle miRNA and Cardiomyopathy-related miRNA Biomarkers in Golden Retriever Muscular Dystrophy Dogs and Duchenne Muscular Dystrophy Patients", THE AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY, vol. 184, no. 11, 3 September 2014 (2014-09-03), pages 2885 - 2898, XP055326971 *
LEE, KWANG - PYO ET AL.: "miR-431 promotes Differentiation and Regeneration of Old Skeletal Muscle by Targeting Smad4", GENES & DEVELOPMENT, vol. 29, no. 15, 27 July 2015 (2015-07-27), pages 1605 - 1617, XP055326975 *
WU, RIMAO ET AL.: "Myostatin regulates miR-431 Expression via the Ras-Mek-Erk Signaling Pathway", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 461, no. 2, 11 April 2015 (2015-04-11), pages 224 - 229, XP029157698 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3476950A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-01 Centrum Onkologii - Instytut Im. Marii Sklodowskiej-Curie Microrna-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of vulvar carcinoma and vulvar intraepithelial lesions
EP3476951A1 (en) * 2017-10-31 2019-05-01 Centrum Onkologii - Instytut Im. Marii Sklodowskiej-Curie Microrna-based methods and compositions for the diagnosis and prognosis of vulvar carcinoma and vulvar intraepithelial lesions
EP3737763A4 (en) * 2018-01-09 2021-12-08 Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING MUSCLE DISEASE OR CACHEXIA, INCLUDING, AS ACTIVE PRINCIPLE, A MICRORNA LOCATED IN A DLK1-DIO3 GROUP OR A VARIANT THEREOF

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