WO2016175309A1 - 免疫誘導剤 - Google Patents

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immunity
cell
antigen
cancer
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祥 栗原
文義 岡野
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東レ株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a novel immunity-inducing agent useful as an agent for treating and / or preventing cancer.
  • the present invention also relates to an antigen-presenting cell or cytotoxic T cell for use in cancer immunotherapy, or a method for producing the cell.
  • Cancer is a disease that occupies the top cause of all deaths, and the current treatment is a combination of radiation therapy and chemotherapy, mainly surgery. Despite the recent development of new surgical methods and the discovery of new anti-cancer drugs, the therapeutic results of cancer have not improved much except for some cancers. In recent years, with the advancement of molecular biology and cancer immunology, the identification of cancer antigens recognized by cytotoxic T cells that react with cancer and genes encoding cancer antigens have led to expectations for antigen-specific immunotherapy. It is growing.
  • dogs and cats are known to have many tumors such as breast tumors and squamous cell carcinomas, and are ranked high in the disease statistics of dogs and cats.
  • tumors such as breast tumors and squamous cell carcinomas
  • human drugs such as anticancer drugs
  • CSPG5 Chondroitin Sulfate Proteoglycan 5
  • CSPG5 Chondroitin Sulfate Proteoglycan 5
  • An object of the present invention is to find a novel polypeptide useful as an agent for treating and / or preventing cancer, and to provide use of the polypeptide as an immunity-inducing agent.
  • CSPG5 canine Chondroitin Sulfate Proteoglycan 5
  • human, cat and mouse CSPG5 polypeptides having the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 16 based on the human, cat and mouse homologous genes of the obtained genes are obtained. Produced. These CSPG5 polypeptides are specifically expressed in tissues or cells of breast cancer, lung cancer, brain tumor, ovarian cancer, leukemia, malignant lymphoma, adenocarcinoma, mastocytoma, squamous cell carcinoma, melanoma or neuroblastoma. I found it.
  • CSPG5 immune cells against CSPG5 can be induced in the living body and tumors in the living body expressing CSPG5 can be regressed.
  • a recombinant vector capable of expressing a polynucleotide encoding CSPG5 polypeptide or a fragment thereof induces an antitumor effect in vivo against cancers expressing CSPG5.
  • the CSPG5 polypeptide has the ability (immunity-inducing activity) to be presented by antigen-presenting cells to activate and proliferate cytotoxic T cells specific for the polypeptide.
  • the peptide is useful for the treatment and / or prevention of cancer, and the antigen-presenting cells in contact with the polypeptide and the T cells in contact with the antigen-presenting cells are useful for the treatment and / or prevention of cancer.
  • the headline and the present invention were completed.
  • the present invention has the following features. (1) (i) at least one polypeptide selected from the following polypeptides (a), (b) and (c) and having immunity-inducing activity, or (ii) a polypeptide encoding the polypeptide A immunity-inducing agent comprising, as an active ingredient, a recombinant vector comprising nucleotides and capable of expressing the polypeptide in vivo.
  • A a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14 and a polypeptide (b) consisting of 7 or more consecutive amino acids in the amino acid sequence
  • a polypeptide comprising (c) a polypeptide comprising the polypeptide of (a) or (b) as a partial sequence
  • the polypeptide having the immunity-inducing activity is SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 Or the immunity-inducing agent according to (1), which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence represented by 14.
  • the immunity-inducing agent according to (1) or (2) which is for treatment of antigen-presenting cells.
  • the immunity-inducing agent according to (1) or (2) which is used for treatment and / or prevention of cancer.
  • the immunity-inducing agent according to (4), wherein the cancer is a cancer that expresses CSPG5.
  • the immunity-inducing agent according to (4) or (5), wherein the cancer is a brain tumor, leukemia, malignant lymphoma, or neuroblastoma.
  • the immunopotentiator is Freund's incomplete adjuvant, Montanide, poly IC and derivatives thereof, CpG oligonucleotide, interleukin 12, interleukin 18, interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , and Flt3 ligand
  • the immunity-inducing agent according to (7) which is at least one selected from the group consisting of: (9) Production of an antigen-presenting cell containing a complex of the polypeptide and an MHC molecule, which comprises contacting the polypeptide defined in (1) above with a subject-derived antigen-presenting cell ex vivo or in vitro. Method.
  • the antigen-presenting cell is a dendritic cell or B cell carrying MHC class I molecules.
  • (11) comprising activating the T cell by contacting the antigen-presenting cell obtained by the method according to (9) or (10) above with a T cell derived from a subject ex vivo or in vitro, A method for producing cytotoxic T cells specific for the polypeptide defined in (1).
  • (12) An antigen-presenting cell obtained by the method according to (9) or (10) and comprising a complex of the polypeptide defined in (1) and an MHC molecule.
  • a cytotoxic T cell obtained by the method according to (11) above and specific for the polypeptide defined in (1) above.
  • the present invention provides a novel immunity-inducing agent useful for cancer treatment and / or prevention.
  • a polypeptide used in the present invention or a vector encoding the polypeptide is administered to a subject, immune cells can be induced in the living body of the subject, Furthermore, cancer that has already occurred can be reduced or regressed. Therefore, the polypeptide or the vector is useful for treatment or prevention of cancer.
  • Polypeptides having immunity-inducing activity which are included as active ingredients in the immunity-inducing agent of the present invention, include the following (a) to (c).
  • A a polypeptide comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14 or a polypeptide comprising seven or more consecutive amino acids in the amino acid sequence
  • B a sequence A polypeptide having a sequence identity of 85% or more with the amino acid sequence represented by the number 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14, or seven or more consecutive amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide
  • C A polypeptide comprising the polypeptide of (a) or (b) as a partial sequence.
  • polypeptide refers to a molecule formed by peptide bonding of a plurality of amino acids, and not only a polypeptide molecule having a large number of amino acids but also a low molecular weight molecule (oligosaccharide) having a small number of amino acids.
  • Peptide and full-length protein and the present invention also includes CSPG5 full-length protein having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14.
  • “having an amino acid sequence” means that amino acid residues are arranged in the order shown in the amino acid sequence unless otherwise specified.
  • a polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 refers to the amino acids Met Gly Arg Ala, Gly... (Omitted) shown in SEQ ID NO: 8, Asn, Asn, Leu, Thr. By means of a polypeptide having the sequence a size of 566 amino acid residues.
  • “polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8” may be abbreviated as “polypeptide of SEQ ID NO: 8”. The same applies to the expression “having a base sequence”. In these cases, the term “having” in “having an amino acid sequence” or “having a base sequence” may be replaced with the expression “consisting of” unless otherwise specified.
  • immuno-inducing activity refers to the ability to induce immune cells that secrete cytokines such as interferon in the body of a subject.
  • subject refers to an animal, preferably a mammal, that requires immunity induction with the immunity-inducing agent of the present invention for the treatment or prevention of cancer (or tumor), such as a human or a dog.
  • pet animals such as cats, animals such as pandas bred at zoos, domestic animals such as cattle, and competition animals such as horses.
  • Whether or not the above polypeptide has immunity-inducing activity can be confirmed using, for example, a known ELISpot Assay (Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay).
  • ELISpot Assay Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay
  • cells such as peripheral blood mononuclear cells are obtained from an animal to which a polypeptide whose immunity-inducing activity is to be evaluated is administered, and the cells are obtained from the polypeptide.
  • the number of immune cells in the cells can be measured by measuring the amount of cytokine production from the cells using a specific antibody, so that the immune induction activity can be evaluated. .
  • the tumor is regressed due to its immunity-inducing activity. be able to. Therefore, the immunity-inducing activity can also be evaluated as the ability to suppress the growth of cancer cells or to reduce or eliminate cancer tissue (tumor) (hereinafter referred to as “anti-tumor activity”).
  • anti-tumor activity The antitumor activity of a polypeptide is confirmed, for example, by actually administering the polypeptide to a cancer-bearing animal and examining whether the tumor is reduced or the like, as specifically described in Examples below. can do.
  • cytotoxic T cells induced by administering the polypeptide to cancer-bearing animals exhibit cytotoxic activity against tumors can.
  • Measurement of the cytotoxic activity of T cells in vivo can be confirmed by, for example, administering an antibody that removes T cells from the body to a cancer-bearing animal and examining whether the tumor is reduced or the like. It is not limited to this.
  • T cells stimulated with the polypeptide that is, T cells brought into contact with antigen-presenting cells presenting the polypeptide
  • the antitumor activity of the polypeptide can also be evaluated.
  • the T cell and the antigen-presenting cell can be contacted by co-culturing both in a liquid medium.
  • the cytotoxic activity is measured by, for example, D.C. D. Kharkevich et al. , Int. J. et al. Cancer, 58: 317-323, 1994, and can be performed by a known method called 51 Cr release assay.
  • the polypeptide is used for cancer treatment and / or prevention, it is not particularly limited, but it is preferable to evaluate immunity induction activity using antitumor activity as an index.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14 in the sequence listing disclosed by the present invention is obtained by the SEREX method using a dog testis-derived cDNA library and the serum of a cancer-bearing dog, It is the amino acid sequence of CSPG5 isolated as a polypeptide that binds to a specific antibody present in serum derived from a cancer-bearing dog and its human, cat, and mouse homologous factors (see Example 1).
  • human CSPG5 which is a human homologous factor of canine CSPG5
  • sequence identity is 87% base sequence and amino acid sequence 87%
  • cat CSPG5 which is a feline homologous factor
  • sequence identity is 92% base sequence and 91% amino acid sequence.
  • mouse CSPG5 which is a mouse homologous factor
  • the sequence identity is 84% of the base sequence and 85% of the amino acid sequence.
  • the polypeptide of the above (a) is 7 or more, preferably 8, 9, or consecutive in the polypeptide having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14.
  • the polypeptide is a polypeptide consisting of an amino acid sequence having a sequence identity of 85% or more with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, and particularly preferably the polypeptide is SEQ ID NO: 8, 4 , 6, 10, 12, 2 or 14.
  • a polypeptide having about 7 amino acid residues or more can exhibit antigenicity and immunogenicity. Therefore, any polypeptide having 7 or more consecutive amino acid residues in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14 can have immunity induction activity, so that the immunity induction of the present invention It can be used for the preparation of agents.
  • the polypeptide is taken up by antigen-presenting cells and then decomposed by peptidase in the cells to become smaller fragments and presented on the surface of the cells. It is known that immune cells such as cytotoxic T cells recognize it and selectively kill cells presenting the antigen.
  • the size of the polypeptide presented on the surface of the antigen-presenting cell is relatively small, and is about 7 to 30 amino acids. Therefore, from the viewpoint of presentation on antigen-presenting cells, the polypeptide (a) is a continuous 7 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14.
  • polypeptides may be presented directly on the cell surface on antigen-presenting cells without being taken up into antigen-presenting cells.
  • Polypeptides taken up by antigen-presenting cells are cleaved at random positions by peptidases in the cells to generate various polypeptide fragments, and these polypeptide fragments are presented on the surface of antigen-presenting cells. Therefore, if a polypeptide having a large size such as the full length region of SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14 is administered, immunity induction via antigen-presenting cells is caused by degradation in the antigen-presenting cells. Effective polypeptide fragments are inevitably produced. Therefore, a polypeptide having a large size can be preferably used for immunity induction via antigen-presenting cells, and the number of amino acids is 30 or more, more preferably 100 or more, more preferably 200 or more, more preferably 250 or more, and still more preferably. May be a polypeptide of the full length region of SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14.
  • the polypeptide of the above (b) is a small number of the polypeptides having the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14 in the sequence listing described in the above (a) ( Preferably, one or several amino acid residues are substituted, deleted and / or added or inserted, and have an immune-inducing activity, or 85% or more of the original unmodified sequence, It is a polypeptide having a sequence identity of 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more or 99.5% or more, and has immunity-inducing activity.
  • a protein antigen may have almost the same antigenicity as the original protein even if a small number of amino acid residues in the amino acid sequence of the protein are substituted, deleted, added or inserted. It is well known to those skilled in the art. Therefore, since the polypeptide (b) can also exert immunity-inducing activity, it can be used for the preparation of the immunity-inducing agent of the present invention. In the polypeptide (b), one or several amino acid residues in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8, 4, 6, 10, 12, 2 or 14 are substituted, deleted, And / or an added or inserted polypeptide is also preferred. “Several” in the present specification represents an integer of 2 to 10, preferably an integer of 2 to 6, and more preferably an integer of 2 to 4.
  • sequence identity of amino acid sequences (or base sequences) means that both amino acids are matched so that the amino acid residues (or bases) of two amino acid sequences (or base sequences) to be compared match as much as possible.
  • the sequence (or base sequence) is aligned, and the number of matched amino acid residues (or the number of matched bases) divided by the total number of amino acid residues (or the total number of bases) is expressed as a percentage.
  • a gap is appropriately inserted in one or both of the two sequences to be compared as necessary.
  • Such alignment of sequences can be performed using a known algorithm such as BLAST, FASTA, or CLUSTALW.
  • the total number of amino acid residues is the number of residues obtained by counting one gap as one amino acid residue.
  • the sequence identity (%) is the total number of amino acid residues in the longer sequence, and the amino acid residues that match. Calculated by dividing the number.
  • the 20 kinds of amino acids constituting the natural protein are neutral amino acids having low polarity side chains (Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro), neutral amino acids having hydrophilic side chains (Asn). , Gln, Thr, Ser, Tyr, Cys), acidic amino acids (Asp, Glu), basic amino acids (Arg, Lys, His), and aromatic amino acids (Phe, Tyr, Trp)
  • neutral amino acids having low polarity side chains Gly, Ile, Val, Leu, Ala, Met, Pro
  • neutral amino acids having hydrophilic side chains Asn).
  • acidic amino acids Asp, Glu
  • basic amino acids Arg, Lys, His
  • aromatic amino acids Phe, Tyr, Trp
  • the polypeptide (c) is a polypeptide having the immunity-inducing activity, containing the polypeptide (a) or (b) as a partial sequence. That is, the polypeptide of (a) or (b) is added with at least one other amino acid residue or other (single or plural) polypeptide at one or both ends, and has an immunity-inducing activity. It is polypeptide which has. Such a polypeptide can also be used for the preparation of the immunity-inducing agent of the present invention.
  • the polypeptide can be synthesized according to a chemical synthesis method such as a known peptide synthesis method such as the Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or the tBoc method (t-butyloxycarbonyl method). Moreover, it can also synthesize
  • a polynucleotide encoding the above polypeptide is prepared, the polynucleotide is incorporated into an expression vector and introduced into a host cell, and the polypeptide is produced in the host cell. Thus, the desired polypeptide can be obtained.
  • the polynucleotide encoding the above polypeptide can be easily prepared by a known genetic engineering technique or a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer.
  • DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 is subjected to PCR using a canine chromosomal DNA or cDNA library as a template and a pair of primers designed to amplify the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • Any DNA having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 can be similarly prepared by using human chromosomal DNA or cDNA library as the template. PCR reaction conditions can be set as appropriate.
  • one cycle of a reaction step consisting of 94 ° C. for 30 seconds (denaturation), 55 ° C. for 30 seconds to 1 minute (annealing), and 72 ° C. for 2 minutes (extension)
  • the conditions include, but are not limited to, conditions of reacting at 72 ° C. for 7 minutes after 30 cycles.
  • appropriate probes and primers are prepared based on the nucleotide sequence and amino acid sequence information shown in SEQ ID NOs: 1 and 3 of the sequence listing in this specification, respectively, and cDNAs such as dogs and humans are used for the preparation. By screening the rally, the desired DNA can be isolated.
  • the cDNA library is preferably prepared from cells, organs or tissues expressing the proteins of SEQ ID NOs: 2, 4.
  • nucleotide sequence of the polynucleotide encoding the polypeptide (b) or (c) described above can be easily specified, such a polynucleotide can also be obtained by a conventional method using a commercially available nucleic acid synthesizer. It can be easily synthesized.
  • the host cell may be any cell that can express the polypeptide.
  • prokaryotic cells include Escherichia coli, and examples of eukaryotic cells include monkey kidney cells COS1, Chinese hamster ovary cells. Examples include, but are not limited to, cultured mammalian cells such as CHO, budding yeast, fission yeast, silkworm cells, and Xenopus egg cells.
  • an expression vector having an origin, promoter, Shine-Dalgarno sequence (or ribosome binding site), DNA cloning site, terminator, etc. that can be replicated in the prokaryotic cell is used.
  • Examples of the expression vector for E. coli include pUC system, pBluescript II, pET expression system, pGEX expression system and the like.
  • an expression vector for a eukaryotic cell having a promoter, a splicing region, a poly (A) addition site and the like is used as an expression vector.
  • expression vectors include pKA1, pCDM8, pSVK3, pMSG, pSVL, pBK-CMV, pBK-RSV, EBV vector, pRS, pcDNA3, pMSG, pYES2, and the like.
  • a DNA encoding the above polypeptide is incorporated into such an expression vector, and after transforming a eukaryotic host cell with the vector, the resulting transformant is cultured, and the DNA encodes. Can be expressed in eukaryotic host cells.
  • pIND / V5-His, pFLAG-CMV-2, pEGFP-N1, pEGFP-C1, etc. are used as an expression vector, a fusion protein to which various tags such as His tag, FLAG tag, myc tag HA tag, and GFP are added.
  • the polypeptide can be expressed.
  • a known method such as an electroporation method, a calcium phosphate method, a liposome method, or a DEAE dextran method can be used.
  • Polypeptides obtained by the above methods include those in the form of fusion proteins with other arbitrary proteins as described above.
  • a fusion protein with glutathione-S-transferase (GST) or His tag can be exemplified.
  • GST glutathione-S-transferase
  • His tag Such a polypeptide in the form of a fusion protein is also included in the scope of the present invention as the polypeptide (c).
  • the polypeptide expressed in the transformed cell may be subjected to various modifications in the cell after being translated.
  • Such post-translationally modified polypeptides are also included in the scope of the present invention as long as they have immunity-inducing activity.
  • Immunity-inducing agent As specifically described in the examples below, when a polypeptide having the above-described immunity-inducing activity is administered to a cancer-bearing animal, the tumor that has already occurred can be regressed. Therefore, the immunity-inducing agent of the present invention can be used for the treatment and / or prevention of cancer. Moreover, the above-mentioned polypeptide having immunity-inducing activity can be used in a method for treating and / or preventing cancer by immunity induction.
  • tumor and cancer refer to malignant neoplasms and are used interchangeably.
  • the target cancer is preferably a cancer expressing CSPG5, more preferably breast cancer, lung cancer, brain tumor, ovarian cancer, leukemia, malignant lymphoma, adenocarcinoma, mastocytoma, squamous cell carcinoma Melanoma or neuroblastoma, particularly preferably breast cancer, lung cancer, brain tumor, leukemia, malignant lymphoma, mastocytoma, melanoma or neuroblastoma.
  • CSPG5 cancer expressing CSPG5
  • breast cancer, lung cancer, brain tumor, ovarian cancer, leukemia, malignant lymphoma, adenocarcinoma, mastocytoma, squamous cell carcinoma Melanoma or neuroblastoma particularly preferably breast cancer, lung cancer, brain tumor, leukemia, malignant lymphoma, mastocytoma, melanoma or neuroblastoma.
  • the target animals are preferably mammals as described above, and more preferably include primates, pet animals, animals raised in zoos, livestock, sport animals, and the like. Mammals, particularly preferably humans, dogs or cats.
  • the administration route to the living body of the immunity-inducing agent of the present invention may be oral administration or parenteral administration, but parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration and intraarterial administration is preferred.
  • parenteral administration such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration and intraarterial administration is preferred.
  • the immunity-inducing agent When used for the purpose of treating cancer, it can be administered to a regional lymph node in the vicinity of the tumor to be treated, as described in Examples below, in order to enhance the anticancer effect.
  • the dose may be an amount effective for inducing immunity.
  • it may be an amount effective for the treatment and / or prevention of cancer.
  • the amount effective for the treatment and / or prevention of cancer is appropriately selected according to the size, symptoms, etc. of the tumor.
  • the effective amount per day for the subject animal is 0.0001 to 1000 ⁇ g, preferably 0.
  • the dose is 001 to 1000 ⁇ g and can be administered once or divided into several times. Preferably, it is divided into several times and administered every few days to several months.
  • the immunity-inducing agent of the present invention can regress an already formed tumor. Therefore, since anticancer activity can be exerted on a small number of cancer cells at the early stage of development, onset and recurrence of cancer can be prevented if used before onset of cancer or after treatment of cancer. That is, the immunity-inducing agent of the present invention is useful for both treatment and prevention of cancer.
  • the immunity-inducing agent of the present invention may consist of a polypeptide alone, and is formulated by appropriately mixing additives such as pharmaceutically acceptable carriers, diluents and excipients suitable for each administration form. You can also.
  • additives such as pharmaceutically acceptable carriers, diluents and excipients suitable for each administration form. You can also.
  • “formulation” may be used interchangeably with “composition for immunity induction” and “pharmaceutical for immunity induction”.
  • Formulation methods and usable additives are well known in the field of pharmaceutical formulations, and any method and additive can be used.
  • additives include diluents such as physiological buffers; excipients such as sugar, lactose, corn starch, calcium phosphate, sorbitol, glycine; syrup, gelatin, gum arabic, sorbitol, polyvinyl chloride, tragacanth, etc. Binders such as magnesium stearate, polyethylene glycol, talc, silica and the like, but are not limited thereto.
  • the dosage form include oral preparations such as tablets, capsules, granules, powders, and syrups, and parenteral preparations such as inhalants, injections, suppositories, and liquids. These preparations can be made by generally known production methods.
  • the immunity-inducing agent of the present invention can be used in combination with an immunity enhancing agent capable of enhancing the immunological response in vivo.
  • the immunopotentiator may be contained in the immunity-inducing agent of the present invention, or may be administered to a patient in combination with the immunity-inducing agent of the present invention as a separate composition.
  • the above immunopotentiator examples include an adjuvant.
  • Adjuvants provide a reservoir of antigen (extracellular or within macrophages) and can enhance immunological responses by activating macrophages and stimulating specific sets of lymphocytes, thus enhancing anticancer effects be able to. Therefore, in particular, when the immunity-inducing agent of the present invention is used for the treatment and / or prevention of cancer, it is preferable that the immunity-inducing agent further contains an adjuvant in addition to the above polypeptide as an active ingredient. Many types of adjuvants are well known in the art, and any adjuvant can be used.
  • adjuvants include MPL (SmithKline Beecham), Salmonella minnesota Re 595 lipopolysaccharide of the genus Salmonella and similar products obtained after acid hydrolysis; QA-21 saponins; DQS21 described in PCT application WO 96/33739 (SmithKline Beecham); QS-7, QS-17, QS-18 and QS-L1 (So et al., “Molecules and Cells and cells) ”, 1997, Vol. 7, p.
  • Freund's incomplete adjuvant Freund's complete adjuvant; vitamin E Montanide; alum or aluminum hydroxide (Alum); CpG oligonucleotides (see, eg, Kreig et al., “Nature”, Vol. 374, pages 546-549); poly IC and its derivatives (poly ICLC, etc.) and various water-in-oil emulsions prepared from biodegradable oils such as squalene and / or tocopherol; ⁇ -galactosylceramide and the like. Of these, Freund's incomplete adjuvant, montanide, poly IC and derivatives thereof, and CpG oligonucleotides are preferred.
  • the mixing ratio of the adjuvant to the polypeptide is typically about 1:10 to 10: 1, preferably about 1: 5 to 5: 1, more preferably about 1: 1.
  • the adjuvant is not limited to the above examples, and other adjuvants known in the art may be used when administering the immunity-inducing agent of the present invention (for example, “Goding”, “Monoclonal antibodies: Principles and Practices (see Monoclonal Antibodies: Principles and Practices, 2nd edition, 1986). Methods for preparing polypeptide and adjuvant mixtures or emulsions are well known to those skilled in vaccination.
  • factors that stimulate the immune response of the subject can also be used as the immune enhancer.
  • various cytokines having the property of stimulating lymphocytes and antigen-presenting cells can be used in combination with the immune inducer of the present invention as an immune enhancer.
  • Numerous cytokines capable of enhancing such immunological responses are known to those skilled in the art, such as interleukin-12 (IL-12), which has been shown to enhance the protective effects of vaccines, Examples include, but are not limited to, GM-CSF, IL-18, interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , interferon ⁇ , and Flt3 ligand.
  • IL-12 interleukin-12
  • Such a factor can also be used as the above-described immunity enhancing agent, and can be administered to a patient by being included in the immunity-inducing agent of the present invention or in combination with the immunity-inducing agent of the present invention as a separate composition.
  • the polypeptide can be presented to the antigen-presenting cell by contacting the polypeptide and the antigen-presenting cell (from the subject) ex vivo or in vitro. That is, the above-mentioned polypeptide (a), (b) or (c) can be used for treatment of antigen-presenting cells.
  • dendritic cells or B cells carrying MHC class I molecules can be preferably used as antigen-presenting cells.
  • MHC class I molecules have been identified and are well known. MHC molecules in humans are called HLA. Examples of HLA class I molecules include HLA-A, HLA-B, and HLA-C.
  • HLA-A1 HLA-A0201, HLA-A0204, HLA-A0205, HLA-A0206, HLA-A0207, HLA-A11, HLA-A24, HLA-A31, HLA-A6801, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B2705, HLA-B37, HLA-Cw0401, HLA-Cw0602 and the like.
  • the following 3 To produce antigen-presenting cells comprising a complex of the polypeptide and an MHC molecule, and to produce cytotoxic T cells specific for the polypeptide, etc. The use can be mentioned.
  • Dendritic cells or B cells carrying MHC class I molecules can be prepared from peripheral blood by well-known methods. For example, dendritic cells are induced from bone marrow, umbilical cord blood or patient peripheral blood using granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and IL-3 (or IL-4), and tumor-related peptides are introduced into the culture system. Can be added to induce tumor-specific dendritic cells.
  • GM-CSF granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • IL-3 or IL-4
  • the cells used can be bone marrow and umbilical cord blood provided by healthy people, the patient's own bone marrow and peripheral blood, etc., but when using the patient's own autologous cells, it is highly safe and has serious side effects. It can also be expected to avoid it.
  • Peripheral blood or bone marrow may be a fresh sample, a cryopreserved sample, or a cryopreserved sample.
  • whole blood may be cultured, or only the leukocyte component may be separated and cultured, but the latter is more efficient and preferable.
  • mononuclear cells may be separated among the leukocyte components.
  • the whole cells constituting the bone marrow may be cultured, or mononuclear cells may be separated and cultured from this.
  • Peripheral blood, its white blood cell components, and bone marrow cells include mononuclear cells, hematopoietic stem cells, immature dendritic cells, CD4 positive cells, and the like that are the origin of dendritic cells.
  • the cytokine used has a property that has been confirmed to be safe and physiologically active, it does not matter whether it is a natural type or a genetically engineered type, and its production method is preferably ensured. Are used in the minimum amount required.
  • the concentration of the cytokine to be added is not particularly limited as long as it is a concentration at which dendritic cells are induced, and is usually preferably about 10 to 1000 ng / mL, more preferably about 20 to 500 ng / mL as the total concentration of cytokines.
  • the culture can be performed using a well-known medium usually used for culturing leukocytes.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as leukocyte growth is possible, but is most preferably about 37 ° C. which is the human body temperature.
  • the gas environment during the culture is not particularly limited as long as leukocytes can grow, but it is preferable to aerate 5% CO 2 .
  • the culture period is not particularly limited as long as a necessary number of cells are induced, but it is usually performed for 3 days to 2 weeks.
  • an appropriate device can be used as appropriate, but it is preferable that safety is confirmed for medical use and that the operation is stable and simple.
  • laminated containers, multistage containers, roller bottles, spinner bottles, bag-type incubators, hollow fiber columns, etc. can be used regardless of general containers such as petri dishes, flasks, and bottles. .
  • the immunity-inducing agent of the present invention contains a polynucleotide encoding the polypeptide of (a), (b) or (c) above, and a recombinant vector capable of expressing the polypeptide in vivo is used as an active ingredient. It may be included. As shown in the Examples described below, a recombinant vector capable of expressing such an antigen polypeptide is also called a gene vaccine.
  • the vector used for producing the gene vaccine is not particularly limited as long as it can be expressed in the target animal cell (preferably in the mammalian cell), and may be a plasmid vector or a virus vector, and is known in the field of gene vaccines. Any of these vectors may be used.
  • a polynucleotide such as DNA or RNA encoding the polypeptide can be easily prepared by a conventional method.
  • the polynucleotide can be incorporated into a vector by a method well known to those skilled in the art.
  • the administration route of the gene vaccine is preferably a parenteral administration route such as intramuscular administration, subcutaneous administration, intravenous administration or intraarterial administration, and the dosage can be appropriately selected according to the type of antigen and the like.
  • the weight of the gene vaccine per kg of body weight is about 0.1 ⁇ g to 100 mg, preferably about 1 ⁇ g to 10 mg.
  • the above polypeptide is encoded in RNA virus or DNA virus such as retrovirus, Sendai virus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus, vaccinia virus, poxvirus, poliovirus, Sindbis virus and the like. And a method of infecting a subject animal with the polynucleotide.
  • retroviruses, adenoviruses, adeno-associated viruses, vaccinia viruses and the like are particularly preferred.
  • Examples of other methods include a method in which an expression plasmid is directly administered into muscle (DNA vaccine method), a liposome method, a lipofectin method, a microinjection method, a calcium phosphate method, an electroporation method, and the like. The method is preferred.
  • an in vivo method for directly introducing the gene into the body, and collecting a certain cell from the target animal and transferring the gene to the cell outside the body There is an ex vivo method for introducing the cells into the body and returning them to the body (Nikkei Science (Japan), April 1994, p20-45, Monthly Pharmaceutical Affairs (Japan), 1994, Vol. 36, No. 1, p. 50). 23-48, Experimental Medicine Extra Number (Japan), 1994, Vol. 12, No. 15, and references cited therein), in vivo method is more preferable.
  • an in vivo method When administered by an in vivo method, it can be administered by an appropriate administration route according to the disease or symptom or the like for the purpose of treatment. For example, it can be administered intravenously, artery, subcutaneous, intramuscularly. In the case of administration by an in vivo method, for example, it can be in the form of a preparation such as a liquid, but is generally an injection containing the DNA encoding the peptide of the present invention, which is an active ingredient. Accordingly, a pharmaceutically acceptable carrier (eg, physiological saline, buffer solution, etc.) may be added.
  • a pharmaceutically acceptable carrier eg, physiological saline, buffer solution, etc.
  • the liposome or membrane-fused liposome containing the DNA can be in the form of a liposome preparation such as a suspension, a freezing agent, or a centrifugal concentrated freezing agent.
  • base sequence shown in SEQ ID NO: 1 includes the base sequence actually shown in SEQ ID NO: 1 as well as a complementary sequence thereto. Therefore, when saying “polynucleotide having the base sequence shown in SEQ ID NO: 1”, the single-stranded polynucleotide having the base sequence actually shown in SEQ ID NO: 1, its complementary base sequence Single-stranded polynucleotides having and double-stranded polynucleotides comprising these are included. When preparing a polynucleotide encoding the polypeptide used in the present invention, any base sequence is appropriately selected, but those skilled in the art can easily select it. 3.
  • Antigen-presenting cell or cytotoxic T cell further comprises contacting the polypeptide and an antigen-presenting cell derived from a subject ex vivo or in vitro, and the MHC molecule A method for producing an antigen-presenting cell containing the complex of the present invention is provided.
  • the present invention also provides an antigen-presenting cell obtained by this method and comprising a complex of the above polypeptide and MHC molecule.
  • the method of contacting the polypeptide and the antigen-presenting cell ex vivo or in vitro can be performed by a well-known method. For example, it can be performed by culturing antigen-presenting cells in a culture solution containing the polypeptide.
  • a culture solution containing the polypeptide a commercially available antigen-presenting cell culture medium can be used.
  • the peptide concentration in the medium is not particularly limited, but is usually about 1 to 100 ⁇ g / ml, preferably about 5 to 20 ⁇ g / ml.
  • the cell density at the time of culture is not particularly limited, but is usually about 10 3 to 10 7 cells / ml, preferably about 5 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • Cultivation is preferably performed according to a conventional method in an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the length of the peptide that can be presented on the surface by antigen-presenting cells is usually about 30 amino acid residues at the maximum. Therefore, although not particularly limited, when the antigen-presenting cell is contacted with the polypeptide ex vivo or in vitro, the polypeptide may be prepared to a length of about 30 amino acid residues or less.
  • an isolated antigen-presenting cell containing a complex of the polypeptide and MHC molecule can be prepared using the polypeptide.
  • Such antigen-presenting cells can present the polypeptide to T cells in vivo, ex vivo or in vitro, and induce and proliferate cytotoxic T cells specific for the polypeptide. it can.
  • the present invention further comprises contacting the antigen-presenting cell with a T cell derived from a subject ex vivo or in vitro to activate the T cell, wherein the cytotoxic T specific to the polypeptide described above is activated.
  • a method for producing a cell is provided.
  • the present invention also provides a cytotoxic T cell obtained by this method and characterized by being specific for the above-mentioned polypeptide.
  • a cytotoxic T specific to the polypeptide is obtained.
  • Cells can be induced and grown. This can be done by co-culturing the antigen-presenting cells and T cells in a liquid medium. For example, it can be carried out by suspending antigen-presenting cells in a liquid medium, placing them in a container such as a well of a microplate, adding T cells thereto, and culturing.
  • the mixing ratio of antigen-presenting cells and T cells during co-culture is not particularly limited, but is usually about 1: 1 to about 1: 100, preferably about 1: 5 to about 1:20 in terms of the number of cells. .
  • the density of the antigen-presenting cells suspended in the liquid medium is not particularly limited, but is usually about 1 to 10 million cells / ml, preferably about 10,000 to 1 million cells / ml.
  • the co-culture is preferably performed according to a conventional method in an atmosphere of 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • As the medium a commercially available antigen-presenting cell / T cell culture medium can be used.
  • the culture time is not particularly limited, but is usually about 2 days to 3 weeks, preferably about 4 days to 2 weeks.
  • the coculture is preferably performed in the presence of one or more interleukins such as IL-2, IL-6, IL-7 and IL-12.
  • the concentration of IL-2 and IL-7 is usually about 5 to 20 U / ml
  • the concentration of IL-6 is usually about 500 to 2000 U / ml
  • the concentration of IL-12 is usually about 5 to 20 ng / ml.
  • the above co-culture may be repeated once to several times by adding fresh antigen-presenting cells. For example, the operation of discarding the culture supernatant after co-culture, adding a fresh antigen-presenting cell suspension, and further co-culturing may be repeated once to several times.
  • the conditions for each co-culture may be the same as described above.
  • cytotoxic T cells specific for the polypeptide are induced and proliferated. Therefore, an isolated T cell that selectively binds the complex of the polypeptide and the MHC molecule can be prepared using the polypeptide.
  • CSPG5 gene is a breast cancer cell, breast cancer tissue, lung cancer cell, lung cancer tissue, liver cancer cell, liver cancer tissue, brain tumor cell, brain tumor tissue, ovarian cancer cell, ovarian cancer tissue, leukemia, It is specifically expressed in malignant lymphoma, adenocarcinoma cells, adenocarcinoma tissue, mastocytoma, squamous cell carcinoma cell, melanoma cell or neuroblastoma cell. Therefore, it is considered that CSPG5 is significantly more present than normal cells in these carcinomas.
  • cytotoxic T cells when the cytotoxic T cell prepared as described above is administered in vivo so that a part of the polypeptide of CSPG5 present in the cancer cell is presented to the MHC molecule on the surface of the cancer cell, Using this as a landmark, cytotoxic T cells can damage cancer cells.
  • an antigen-presenting cell presenting a part of the polypeptide of CSPG5 can induce and proliferate a cytotoxic T cell specific for the polypeptide in vivo, so that the antigen-presenting cell is alive.
  • Cancer cells can also be damaged by administration into the body. That is, the cytotoxic T cell and the antigen-presenting cell prepared using the polypeptide are also useful for the treatment and / or prevention of cancer, like the immunity-inducing agent of the present invention.
  • Cells or T cells are preferably prepared using the polypeptide (a), (b) or (c) as described above.
  • the administration route of the therapeutic and / or prophylactic agent for cancer containing antigen-presenting cells or isolated T cells as an active ingredient is preferably parenteral administration such as intravenous administration or intraarterial administration.
  • the dose is appropriately selected according to symptoms, administration purposes, etc., but is usually 1 to 10 trillion, preferably 1 million to 1 billion, and this is once every few days to several months. Administration is preferred.
  • the preparation may be, for example, one in which cells are suspended in physiological buffer saline, and can be used in combination with other anticancer agents, cytokines, and the like.
  • one or two or more additives well known in the pharmaceutical field can be added.
  • Example 1 ⁇ Acquisition of novel cancer antigen protein by SEREX method> (1) Preparation of cDNA library Total RNA was extracted from dog testis by the acid guanidinium-phenol-chloroform method (Acid guanidinium-Phenol-Chloroform method), and Oligotex-dT30 mRNA purification kit (Takara Shuzo Co., Ltd., Kyoto, Japan) ) was used to purify polyA RNA according to the protocol attached to the kit.
  • a cDNA phage library was synthesized using the obtained mRNA (5 ⁇ g).
  • the cDNA phage library was prepared by using cDNA Synthesis kit, Zap-cDNA Synthesis Kit, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (Stratagene) according to the protocol attached to the kit.
  • the size of the prepared cDNA phage library was 1 ⁇ 10 6 pfu / ml.
  • the membrane was recovered, immersed in TBS (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5) containing 0.5% nonfat dry milk, and shaken at 4 ° C. overnight to suppress nonspecific reaction.
  • TBS 10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl pH 7.5
  • This filter was reacted with serum of a patient dog diluted 500 times at room temperature for 2 to 3 hours.
  • the serum pretreatment method is as follows. That is, ⁇ ZAP Express phage into which no foreign gene was inserted was infected with host E. coli (XL1-BLue MRF ′), and then cultured overnight at 37 ° C. on NZY plate medium. Next, a buffer of 0.2 M NaHCO 3 pH 8.3 containing 0.5 M NaCl was added to the plate and allowed to stand at 4 ° C. for 15 hours, and then the supernatant was recovered as an E. coli / phage extract. Next, the recovered E.
  • coli / phage extract was passed through an NHS-column (GE Healthcare Bio-Science) to immobilize the E. coli / phage derived protein.
  • Serum dog serum was passed through and reacted with this protein-immobilized column, and antibodies adsorbed to E. coli and phage were removed from the serum.
  • the serum fraction passed through the column was diluted 500 times with TBS containing 0.5% nonfat dry milk, and this was used as an immunoscreening material.
  • phagemid host Escherichia coli prepared to have an absorbance OD 600 of 1.0 and 10 ⁇ l of the purified phage solution were mixed and reacted at 37 ° C. for 15 minutes, and 50 ⁇ l was treated with ampicillin (final concentration 50 ⁇ g / ml).
  • SOLR phagemid host Escherichia coli
  • the purified plasmid was analyzed for the full length sequence of the insert by the primer walking method using the T3 primer set forth in SEQ ID NO: 17 and the T7 primer set forth in SEQ ID NO: 18.
  • the gene sequence described in SEQ ID NO: 1 was obtained.
  • a sequence identity search program BLAST search http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ was used to perform sequence identity searches with known genes. As a result, it was found that the obtained gene was CSPG5 gene.
  • human CSPG5 which is a human homologous factor of canine CSPG5, sequence identity is 87% base sequence and amino acid sequence 87%, and in cat CSPG5, sequence identity is 92% base sequence and 91% amino acid sequence.
  • mouse CSPG5 which is a factor, the sequence identity was 84% nucleotide sequence and 85% amino acid sequence.
  • the base sequence of human CSPG5 is SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9 or 11, the amino acid sequence is SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10 or 12, the base sequence of cat CSPG5 is SEQ ID NO: 13, and the amino acid sequence is SEQ ID NO: 14.
  • the nucleotide sequence of mouse CSPG5 is shown in SEQ ID NO: 15, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 16, respectively.
  • RNA was extracted from 50 to 100 mg of each tissue and 5 to 10 ⁇ 10 6 cells of each cell line using TRIZOL reagent (Invitrogen) according to the attached protocol. Using this total RNA, cDNA was synthesized by Superscript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen) according to the attached protocol.
  • Gene pool cDNA (Invitrogen), QUICK-Clone cDNA (Clontech) and Large-Insert cDNA Library (Clontech) were used as cDNAs for normal human tissues (brain, hippocampus, testis, colon, placenta).
  • the PCR reaction was performed using the obtained gene-specific primers (SEQ ID NOs: 19 and 20 for dog primers, SEQ ID NOs: 21 and 22 for human primers, and SEQ ID NOs: 23 and 24 for mouse primers) as follows.
  • GAPDH-specific primers canine and human GAPDH primers are described in SEQ ID NOs: 25 and 26 and mouse GAPDH primers are described in SEQ ID NOs: 27 and 28
  • canine CSPG5 gene was not expressed in most tissues in healthy dog tissues, whereas strong expression was observed in dog tumor tissues.
  • the expression of human and mouse CSPG5 genes is hardly detectable in human and mouse normal tissues, and in cancer cells, it is expressed in breast cancer, lung cancer, brain tumor, ovarian cancer, leukemia, and malignant lymphoma cell lines. Detected (FIGS. 2 and 3).
  • Example 2 ⁇ Analysis of cancer antigenicity of CSPG5 in vivo> (1) Preparation of recombinant vector expressing CSPG5 in vivo Based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15, a recombinant vector expressing CSPG5 in vivo was prepared by the following method. PCR was prepared from mouse neuroblastoma cell line 1 (N2a: purchased from ATCC) in which expression was observed in Example 1.
  • the purified DNA fragment was ligated to the cloning vector pCR-Blunt (Invitrogen). After transforming this into E. coli, the plasmid was recovered, and it was confirmed by sequencing that the amplified gene fragment matched the target sequence.
  • a plasmid corresponding to the target sequence was treated with HindIII and XbaI restriction enzymes, purified with QIAquick Gel Extraction Kit, and then inserted into a mammalian expression vector PCDNA3.1 (Invitrogen) treated with HindIII and XbaI restriction enzymes. .
  • PCDNA3.1 Invitrogen
  • the use of this vector produces CSPG5 protein in mammalian cells.
  • Gold-DNA particles 50 ⁇ g of gold particles (Bio Rad), 100 ⁇ l of spermidine (SIGMA) and 100 ⁇ l of 1M CaCl 2 (SIGMA) were added to 100 ⁇ g of the plasmid DNA prepared above, stirred by vortexing and allowed to stand at room temperature for 10 minutes (hereinafter “Gold-DNA particles ”). After centrifugation at 3000 rpm for 1 minute, the supernatant was discarded and washed 3 times with 100% ethanol (WAKO). After 6 ml of 100% ethanol was added to the gold-DNA particles and sufficiently stirred by vortexing, the gold-DNA particles were poured into Tefzel Tubing (Bio Rad) and precipitated on the wall surface. Tefzel Tubing ethanol with gold-DNA particles attached was air-dried and cut to a length suitable for a gene gun.
  • the present invention is useful for the treatment and / or prevention of cancer because it provides an immunity-inducing agent containing a polypeptide that exhibits antitumor activity against various cancers.
  • SEQ ID NO: 17 T3 primer
  • SEQ ID NO: 18 T7 primer
  • SEQ ID NO: 19 Canine RT primer sense SEQ ID NO: 20: Canine RT primer antisense SEQ ID NO: 21: Human RT primer sense SEQ ID NO: 22: Human RT primer antisense SEQ ID NO: 23: Mouse RT primer sense SEQ ID NO: 24: Mouse RT primer antisense SEQ ID NO: 25 and 26: GAPDH primer SEQ ID NO: 27 and 28: GAPDH primer SEQ ID NO: 29: mus-fullCSPG5 primer sense SEQ ID NO: 30: mus-fullCSPG5 primer antisense All publications, patents and patent applications cited in the book are incorporated herein by reference in their entirety.

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Abstract

この出願は、（ａ）配列表の配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び該アミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、（ｂ）上記配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、及び該ポリペプチドのアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド、及び（ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド、から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、あるいは上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクター、を有効成分として含む免疫誘導剤を提供する。

Description

免疫誘導剤
　本発明は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規な免疫誘導剤に関する。
　本発明はまた、癌免疫療法に使用するための抗原提示細胞又は細胞障害性Ｔ細胞、或いは該細胞の作製方法に関する。
　癌は全死亡原因の第一位を占める疾患であり、現在行われている治療は手術療法を主体に放射線療法と化学療法を組み合わせたものである。近年の新しい手術法の開発や新たな抗癌剤の発見にも関わらず、一部の癌を除いて、癌の治療成績はあまり向上していないのが現状である。近年、分子生物学や癌免疫学の進歩で癌に反応する細胞障害性Ｔ細胞により認識される癌抗原や癌抗原をコードする遺伝子が同定されたことにより、抗原特異性免疫療法への期待が高まっている。
　免疫療法においては、副作用を軽減するため、その抗原として認識されるペプチド又はタンパク質は、正常細胞にはほとんど存在せず、癌細胞に特異的に存在していることが必要とされる。１９９１年、ベルギーＬｕｄｗｉｇ研究所のＢｏｏｎらは自己癌細胞株と癌反応性Ｔ細胞を用いたｃＤＮＡ発現クローニング法によりＣＤ８陽性Ｔ細胞が認識するヒトメラノーマ抗原ＭＡＧＥ１を単離した（非特許文献１）。その後、癌患者の生体内で自己の癌に反応して産生される抗体が認識する腫瘍抗原を遺伝子の発現クローニングの手法を取り入れて同定する、ＳＥＲＥＸ（ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｎｔｉｇｅｎｓ　ｂｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｃｌｏｎｉｎｇ）法が報告され（特許文献１、非特許文献２）、この方法により、いくつかの癌抗原が単離されている。さらに、その一部をターゲットにして癌免疫療法の臨床試験が開始されている。
　一方、ヒトと同様、イヌやネコにも乳腺腫瘍、扁平上皮癌など多数の腫瘍が知られており、イヌやネコの疾病統計でも上位にランクされている。しかしながらイヌやネコの癌に対する有効な治療薬、予防薬及び診断薬は現在のところ存在しない。大部分のイヌやネコの腫瘍は、進行して腫瘤が大きくなってから飼い主が気付くケースがほとんどで、来院して外科的手術により切除したり、人体薬（抗癌剤など）を投与したりしても、すでに手遅れで処置後まもなく死亡することが多い。このような現状の中で、イヌやネコに有効な癌の治療薬及び予防薬が入手可能になれば、イヌの癌に対する用途が開かれると期待される。
　Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ　Ｓｕｌｆａｔｅ　Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ　５（ＣＳＰＧ５）は１型の膜貫通タンパク質であり、ニューレグリンファミリータンパク質の１つである。また、ＥｒｂＢ３に結合し増殖因子として作用すること、ＢＲＣＡ１に変異がある卵巣癌において発現が上昇していることが報告されている（非特許文献３，４）。また、ＣＳＰＧ５は網膜神経節細胞やプルキンエ細胞、海馬等の神経系の組織で高発現し、神経細胞の増殖・分化因子として作用することで神経軸索突起の伸長に関与することが知られる（非特許文献５，６，７）。しかし、ＣＳＰＧ５タンパク質が癌細胞に対する免疫誘導活性を有し、それによって該タンパク質が癌の治療や予防に有用であるという報告はない。
米国特許第５６９８３９６号
Bruggen, P. et al., Science, 254:1643-1647（1991） Sahin, U et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:11810-11813（1995） Kinugasa, Y. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun 321:1045（2004） Press, JZ. et al., Neoplasia. Dec;12（12）:993-1002.（2010） Yasuda, Y. et al., Neurosci. Res. 32:313（1998） Aono, S. et al., J. Neurosci. Res.83:110（2006） Nakanishi, K. et al., J. Biol. Chem. 281:24970（2006）
　本発明の目的は、癌の治療及び／又は予防剤等として有用な新規なポリペプチドを見出し、該ポリペプチドの免疫誘導剤への使用を提供することである。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌生体由来の血清中に存在する抗体と結合するタンパク質をコードするｃＤＮＡを取得し、そのｃＤＮＡを基にして、配列番号２で示されるアミノ酸配列を有するイヌＣｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ　Ｓｕｌｆａｔｅ　Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ　５（以下、「ＣＳＰＧ５」と記載する）のポリペプチドを作製した。また、取得した遺伝子のヒト、ネコ及びマウス相同性遺伝子を基にして、配列番号４，６，８，１０、１２、１４及び１６で示されるアミノ酸配列を有するヒト、ネコ及びマウスＣＳＰＧ５ポリペプチドを作製した。そしてこれらＣＳＰＧ５ポリペプチドが乳癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、白血病、悪性リンパ腫、腺癌、肥満細胞腫、扁平上皮癌、メラノーマ又は神経芽腫の組織又は細胞に特異的に発現していることを見出した。さらにまた、これらＣＳＰＧ５を生体に投与することによって、生体内にＣＳＰＧ５に対する免疫細胞を誘導することができること、及びＣＳＰＧ５を発現する生体内の腫瘍を退縮させることができることを見出した。さらにまた、ＣＳＰＧ５のポリペプチド又はその断片をコードするポリヌクレオチドを発現可能な組換えベクターが、ＣＳＰＧ５を発現する癌に対し生体内で抗腫瘍効果を誘導することを見出した。
　さらにまた、ＣＳＰＧ５のポリペプチドが、抗原提示細胞により提示されて、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を活性化及び増殖させる能力（免疫誘導活性）を有すること、このため、該ポリペプチドが癌の治療及び／又は予防に有用であり、また、該ポリペプチドと接触した抗原提示細胞や、該抗原提示細胞と接触したＴ細胞が癌の治療及び／又は予防に有用であることを見出し、本発明を完成した。
　従って、本発明は、以下の特徴を有する。
（１）（ｉ）以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチド類から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能にする組換えベクター、を有効成分として含む免疫誘導剤。
（ａ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び該アミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｂ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、及び該ポリペプチドのアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
（ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
（２）前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、前記（１）に記載の免疫誘導剤。
（３）抗原提示細胞の処理用である、前記（１）又は（２）に記載の免疫誘導剤。
（４）癌の治療及び／又は予防用である、前記（１）又は（２）に記載の免疫誘導剤。
（５）前記癌がＣＳＰＧ５を発現する癌である、前記（４）に記載の免疫誘導剤。
（６）前記癌が脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、又は神経芽腫である、前記（４）又は（５）に記載の免疫誘導剤。
（７）免疫増強剤をさらに含む、前記（１）～（６）のいずれかに記載の免疫誘導剤。
（８）前記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、並びにＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、前記（７）に記載の免疫誘導剤。
（９）前記（１）に定義するポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法。
（１０）前記抗原提示細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞である、前記（９）に記載の方法。
（１１）前記（９）又は（１０）に記載の方法によって得られる抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、前記（１）に定義するポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法。
（１２）前記（９）又は（１０）に記載の方法によって得られる、かつ前記（１）に定義するポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含むことを特徴とする、抗原提示細胞。
（１３）前記（１１）に記載の方法によって得られる、かつ前記（１）に定義するポリペプチドに特異的であることを特徴とする、細胞障害性Ｔ細胞。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-093354号の開示内容を包含する。
　本発明により、癌の治療及び／又は予防等に有用な新規な免疫誘導剤が提供される。後述の実施例において具体的に示されるように、本発明で用いられるポリペプチド又は該ポリペプチドをコードするベクターを被験体に投与すると、被験体の生体内において免疫細胞を誘導することができ、さらに、既に生じている癌を縮小もしくは退縮させることができる。従って、該ポリペプチド又は該ベクターは癌の治療や予防に有用である。
同定したＣＳＰＧ５遺伝子の、図示したイヌ腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号１；イヌＣＳＰＧ５遺伝子のイヌの各組織及び細胞株での発現パターン、参照番号２；イヌＧＡＰＤＨ遺伝子のイヌの各組織及び細胞株での発現パターン。 同定したＣＳＰＧ５遺伝子の、図示したヒト腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。ヒトＧＡＰＤＨ遺伝子のヒトの各組織及び細胞株での発現はすべて認められた。 同定したＣＳＰＧ５遺伝子の、図示したマウス腫瘍組織あるいは癌細胞株での発現パターンを示す図である。参照番号３；マウスＣＳＰＧ５遺伝子のマウスの各組織及び細胞株での発現パターン、参照番号４；マウスＧＡＰＤＨ遺伝子のマウスの各組織及び細胞株での発現パターンを示す。
　本発明をさらに詳細に説明する。
１．ポリペプチド
　本発明の免疫誘導剤に有効成分として含まれる、免疫誘導活性を有するポリペプチドとしては、以下の（ａ）～（ｃ）のものが挙げられる。
　（ａ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は該アミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
　（ｂ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、又は該ポリペプチドのアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
　（ｃ）（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド。
　本明細書において「ポリペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合することによって形成される分子をいい、構成するアミノ酸数が多いポリペプチド分子のみならず、アミノ酸数が少ない低分子量の分子（オリゴペプチド）や、全長タンパク質も包含され、本発明では配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列を有するＣＳＰＧ５の全長タンパク質も包含される。
　本明細書において、「アミノ酸配列を有する」とは、特に断らない限り、アミノ酸配列に示された順序でアミノ酸残基が配列していることを意味する。従って、例えば、「配列番号８によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」とは、配列番号８に示されるＭｅｔ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｌａ，Ｇｌｙ・・（中略）・・Ａｓｎ，Ａｓｎ，Ｌｅｕ，Ｔｈｒのアミノ酸配列をもつ、５６６アミノ酸残基のサイズのポリペプチドを意味する。また、例えば、「配列番号８によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド」を「配列番号８のポリペプチド」と略記することがある。「塩基配列を有する」という表現についても同様である。これらの場合、「アミノ酸配列を有する」又は「塩基配列を有する」における「有する」という用語は、特に断らない限り、「からなる」という表現で置き換えてもよい。
　本明細書において、「免疫誘導活性」とは、被験体の生体内でインターフェロン等のサイトカインを分泌する免疫細胞を誘導する能力を意味する。
　本明細書において、「被験体」とは、癌（もしくは腫瘍）の治療又は予防のために本発明の免疫誘導剤による免疫誘導を必要とする動物、好ましくは哺乳動物を指し、例えばヒト、イヌやネコなどのペット動物、動物園等で飼育されるパンダなどの動物、ウシなどの家畜動物、ウマなどの競技用動物などを含む。
　上記ポリペプチドが免疫誘導活性を有するか否かは、例えば公知のエリスポットアッセイ（ＥＬＩＳｐｏｔ　Ａｓｓａｙ；Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔ　Ａｓｓａｙ）等を用いて確認することができる。具体的には、例えば後述の実施例に記載されるように、免疫誘導活性を評価すべきポリペプチドが投与された動物から末梢血単核球等の細胞を得て、該細胞を該ポリペプチドと共存培養し、該細胞からのサイトカイン産生量を、特異抗体を用いて測定することにより、該細胞中の免疫細胞数を測定することができるので、これにより免疫誘導活性を評価することができる。
　また、後述の実施例に記載されるように、上記（ａ）～（ｃ）のポリペプチド（好ましくは、組換えポリペプチド）を担癌生体に投与すると、その免疫誘導活性により腫瘍を退縮させることができる。よって、上記免疫誘導活性は、癌細胞の増殖を抑制し又は癌組織（腫瘍）を縮小若しくは消滅させる能力（以下、「抗腫瘍活性」という）として評価することもできる。ポリペプチドの抗腫瘍活性は、例えば後述の実施例に具体的に記載されるように、実際に該ポリペプチドを担癌動物に投与して腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができる。また、該ポリペプチドを担癌動物に投与して誘導された細胞障害性Ｔ細胞が、腫瘍に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによってポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。生体内におけるＴ細胞の細胞障害活性の測定は、例えばＴ細胞を生体内から除去する抗体を担癌動物に投与し、腫瘍が縮小等されるか否かを調べることよって確認することができるがこれに限定されない。
　あるいは、上記ポリペプチドで刺激したＴ細胞（すなわち、該ポリペプチドを提示する抗原提示細胞と接触させたＴ細胞）が、生体外で腫瘍細胞に対して細胞障害活性を示すか否かを調べることによって、ポリペプチドの抗腫瘍活性を評価することもできる。Ｔ細胞と抗原提示細胞との接触は、後述するように、両者を液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。細胞障害活性の測定は、例えばＤ．Ｄ．　Ｋｈａｒｋｅｖｉｔｃｈ　ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：３１７－３２３，１９９４に記載された５１Ｃｒリリースアッセイと呼ばれる公知の方法により行なうことができる。上記ポリペプチドを癌の治療及び／又は予防用途に用いる場合には、特に限定されないが、抗腫瘍活性を指標として免疫誘導活性を評価することが好ましい。
　本発明が開示する配列表の配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列は、イヌ精巣由来ｃＤＮＡライブラリーと担癌犬の血清を用いたＳＥＲＥＸ法により、担癌犬由来の血清中に存在する特異的な抗体と結合するポリペプチド及びそのヒト、ネコ、およびマウス相同因子として単離された、ＣＳＰＧ５のアミノ酸配列である（実施例１参照）。イヌＣＳＰＧ５のヒト相同因子であるヒトＣＳＰＧ５では、配列同一性が塩基配列８７％、アミノ酸配列８７％であり、ネコ相同因子であるネコＣＳＰＧ５では配列同一性は塩基配列９２％、アミノ酸配列９１％であり、マウス相同因子であるマウスＣＳＰＧ５では配列同一性は塩基配列８４％、アミノ酸配列８５％である。
　上記（ａ）のポリペプチドは、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド中の連続する７個以上、好ましくは連続する８、９又は１０個以上のアミノ酸からなるポリペプチドであって、免疫誘導活性を有するものである。より好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号８で示されるアミノ酸配列と配列同一性が８５％以上であるアミノ酸配列からなるポリペプチドであり、特に好ましくは、該ポリペプチドは、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列を有する。なお、この分野で公知の通り、約７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば抗原性及び免疫原性を発揮できる。従って、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４のアミノ酸配列中の連続する７アミノ酸残基以上のポリペプチドであれば、免疫誘導活性を有し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
　また、癌抗原ポリペプチドを投与することによる免疫誘導の原理として、ポリペプチドが抗原提示細胞に取り込まれ、その後該細胞内でペプチダーゼによる分解を受けてより小さな断片となり、該細胞の表面上に提示され、それを細胞障害性Ｔ細胞等の免疫細胞が認識し、その抗原を提示している細胞を選択的に死滅させることが知られている。抗原提示細胞の表面上に提示されるポリペプチドのサイズは比較的小さく、アミノ酸数で７～３０程度である。従って、抗原提示細胞上に提示させるという観点からは、上記（ａ）のポリペプチドとしては、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列中の連続する７～３０程度であることが好ましい態様のひとつであり、より好ましくは８～３０もしくは９～３０程度のアミノ酸からなるものであれば十分である。これら比較的小さなサイズのポリペプチドは、抗原提示細胞内に取り込まれることなく、直接抗原提示細胞上の細胞表面に提示される場合もある。
　また、抗原提示細胞に取り込まれたポリペプチドは、該細胞内のペプチダーゼによりランダムな位置で切断を受けて、種々のポリペプチド断片が生じ、これらのポリペプチド断片が抗原提示細胞表面上に提示されるので、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４の全長領域のように大きなサイズのポリペプチドを投与すれば、抗原提示細胞内での分解によって、抗原提示細胞を介する免疫誘導に有効なポリペプチド断片が必然的に生じる。従って、抗原提示細胞を介する免疫誘導にとっても、サイズの大きなポリペプチドを好ましく用いることができ、アミノ酸数を３０以上、さらに好ましくは１００以上、さらに好ましくは２００以上、さらに好ましくは２５０以上、さらに好ましくは配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４の全長領域のポリペプチドとしてもよい。
　上記（ｂ）のポリペプチドは、上記（ａ）に記載の配列表の配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドのうちの少数の（好ましくは、１個もしくは数個の）アミノ酸残基が置換、欠失及び／又は付加もしくは挿入された、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチド、あるいは、未改変の元の配列と８５％以上、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有し、かつ、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。一般に、タンパク質抗原において、該タンパク質のアミノ酸配列のうち少数のアミノ酸残基が置換、欠失又は付加もしくは挿入された場合であっても、元のタンパク質とほぼ同じ抗原性を有している場合があることは当業者において広く知られている。従って、上記（ｂ）のポリペプチドも免疫誘導活性を発揮し得るので、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。また、上記（ｂ）のポリペプチドは、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列のうち、１個もしくは数個のアミノ酸残基が置換、欠失、及び／又は付加もしくは挿入されたポリペプチドであることも好ましい。本明細書中の「数個」とは、２～１０の整数、好ましくは２～６の整数、さらに好ましくは２～４の整数を表す。
　本明細書において、アミノ酸配列（又は塩基配列）の「配列同一性」とは、比較すべき２つのアミノ酸配列（又は塩基配列）のアミノ酸残基（又は塩基）ができるだけ多く一致するように両アミノ酸配列（又は塩基配列）を整列させ、一致したアミノ酸残基数（又は一致した塩基数）を全アミノ酸残基数（又は全塩基数）で除したものを百分率で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬＷ等の周知のアルゴリズムを用いて行なうことができる。ギャップが挿入される場合、上記全アミノ酸残基数は、１つのギャップを１つのアミノ酸残基として数えた残基数となる。このようにして数えた全アミノ酸残基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、配列同一性（％）は、長い方の配列の全アミノ酸残基数で、一致したアミノ酸残基数を除して算出される。
　なお、天然のタンパク質を構成する２０種類のアミノ酸は、低極性側鎖を有する中性アミノ酸（Ｇｌｙ，Ｉｌｅ，Ｖａｌ，Ｌｅｕ，Ａｌａ，Ｍｅｔ，Ｐｒｏ）、親水性側鎖を有する中性アミノ酸（Ａｓｎ，Ｇｌｎ，Ｔｈｒ，Ｓｅｒ，Ｔｙｒ，Ｃｙｓ）、酸性アミノ酸（Ａｓｐ，Ｇｌｕ）、塩基性アミノ酸（Ａｒｇ，Ｌｙｓ，Ｈｉｓ）、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ，Ｔｙｒ，Ｔｒｐ）のように類似の性質を有するものにグループ分けが可能であり、グループ内のアミノ酸間での置換であればポリペプチドの性質が変化しない場合が多いことが知られている。従って、上記（ａ）のポリペプチド中のアミノ酸残基を置換する場合には、これらの各グループ内のアミノ酸間で置換することにより、免疫誘導活性を維持できる可能性が高くなるため、好ましい。
　上記（ｃ）のポリペプチドは、上記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含み、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。すなわち、（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドの一端又は両端に他の少なくとも１個のアミノ酸残基又は他の（単数若しくは複数の）ポリペプチドが付加されたものであって、免疫誘導活性を有するポリペプチドである。このようなポリペプチドも、本発明の免疫誘導剤の調製に用いることができる。
　上記ポリペプチドは、例えば、Ｆｍｏｃ法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、ｔＢｏｃ法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の公知のペプチド合成法などの化学合成法に従って合成することができる。また、各種の市販のペプチド合成機を利用して常法により合成することもできる。また、公知の遺伝子工学的手法を用いて、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製し、該ポリヌクレオチドを発現ベクターに組み込んで宿主細胞に導入し、該宿主細胞中でポリペプチドを生産させることにより、目的とするポリペプチドを得ることができる。
　上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、公知の遺伝子工学的手法や市販の核酸合成機を用いた常法により、容易に調製することができる。例えば、配列番号１の塩基配列を有するＤＮＡは、イヌ染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを鋳型として使用し、配列番号１に記載した塩基配列を増幅できるように設計した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより調製することができる。配列番号３の塩基配列を有するＤＮＡであれば、上記鋳型としてヒト染色体ＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーを使用することにより同様に調製できる。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができ、例えば、９４℃で３０秒間（変性）、５５℃で３０秒～１分間（アニーリング）、７２℃で２分間（伸長）からなる反応工程を１サイクルとして、例えば３０サイクル行った後、７２℃で７分間反応させる条件などを挙げることができるが、これに限定されない。また、本明細書中の配列表のそれぞれ配列番号１及び３に示される塩基配列及びアミノ酸配列の情報に基づいて、適当なプローブやプライマーを調製し、それを用いてイヌやヒトなどのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、所望のＤＮＡを単離することができる。ｃＤＮＡライブラリーは、配列番号２、４のタンパク質を発現している細胞、器官又は組織から作製することが好ましい。上記したプローブ又はプライマーの調製、ｃＤＮＡライブラリーの構築、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、ならびに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知であり、例えば、モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル第２版（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス）、カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラバイオロジー（ジョン・ウイリィ・アンド・サンズ）等に記載された方法に準じて行うことができる。このようにして得られたＤＮＡから、上記（ａ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを得ることができる。また、各アミノ酸をコードするコドンは公知であるから、特定のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの塩基配列は容易に特定することができる。従って、上記した（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列も容易に特定することができるので、そのようなポリヌクレオチドも、市販の核酸合成機を用いて常法により容易に合成することができる。
　上記宿主細胞としては、上記ポリペプチドを発現可能な細胞であればいかなるものであってもよく、原核細胞の例としては大腸菌など、真核細胞の例としてはサル腎臓細胞ＣＯＳ１、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ等の哺乳動物培養細胞、出芽酵母、分裂酵母、カイコ細胞、アフリカツメガエル卵細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
　宿主細胞として原核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、原核細胞中で複製可能なオリジン、プロモーター、シャイン－ダルガルノ配列（もしくは、リボソーム結合部位）、ＤＮＡクローニング部位、ターミネーター等を有する発現ベクターを用いる。大腸菌用発現ベクターとしては、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システムなどが例示できる。上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで原核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを原核宿主細胞中で発現させることができる。この際、該ポリペプチドを、他のタンパク質との融合タンパク質として発現させることもできる。
　宿主細胞として真核細胞を用いる場合、発現ベクターとしては、プロモーター、スプライシング領域、ポリ（Ａ）付加部位等を有する真核細胞用発現ベクターを用いる。そのような発現ベクターとしては、ｐＫＡ１、ｐＣＤＭ８、ｐＳＶＫ３、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ、ｐＢＫ－ＣＭＶ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、ＥＢＶベクター、ｐＲＳ、ｐｃＤＮＡ３、ｐＭＳＧ、ｐＹＥＳ２等が例示できる。上記と同様に、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡをこのような発現ベクターに組み込み、該ベクターで真核宿主細胞を形質転換したのち、得られた形質転換体を培養すれば、前記ＤＮＡがコードしているポリペプチドを真核宿主細胞中で発現させることができる。発現ベクターとしてｐＩＮＤ／Ｖ５－Ｈｉｓ、ｐＦＬＡＧ－ＣＭＶ－２、ｐＥＧＦＰ－Ｎ１、ｐＥＧＦＰ－Ｃ１等を用いた場合には、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグＨＡタグ、ＧＦＰなど各種タグを付加した融合タンパク質として、上記ポリペプチドを発現させることができる。
　発現ベクターの宿主細胞への導入は、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の周知の方法を用いることができる。
　宿主細胞から目的のポリペプチドを単離精製するためには、公知の分離操作を組み合わせて行うことができる。例えば尿素などの変性剤や界面活性剤による処理、超音波処理、酵素消化、塩析や溶媒分別沈殿法、透析、遠心分離、限外ろ過、ゲルろ過、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、アフニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー等が挙げられるが、これらに限定されない。
　以上の方法によって得られるポリペプチドには、上述した通り、他の任意のタンパク質との融合タンパク質の形態にあるものも含まれる。例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）又はＨｉｓタグとの融合タンパク質などが例示できる。このような融合タンパク質の形態のポリペプチドも、上記（ｃ）のポリペプチドとして本発明の範囲に含まれる。さらに、形質転換細胞で発現されたポリペプチドは、翻訳された後、細胞内で各種修飾を受ける場合がある。このような翻訳後修飾されたポリペプチドも、免疫誘導活性を有する限り、本発明の範囲に含まれる。この様な翻訳修飾としては、Ｎ末端メチオニンの脱離、Ｎ末端アセチル化、糖鎖付加、細胞内プロテアーゼによる限定分解、ミリストイル化、イソプレニル化、リン酸化などが例示できる。
２．免疫誘導剤
　後述の実施例に具体的に記載される通り、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドを担癌動物に投与すると、既に生じている腫瘍を退縮させることができる。従って、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療及び／又は予防用として用いることができる。また、上記した免疫誘導活性を有するポリペプチドは、免疫誘導による癌の治療及び／又は予防方法に用いることができる。
　本明細書において、「腫瘍」及び「癌」という用語は、悪性新生物を意味し、互換的に使用される。
　この場合、対象となる癌としては、ＣＳＰＧ５を発現している癌であることが好ましく、より好ましくは乳癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、白血病、悪性リンパ腫、腺癌、肥満細胞腫、扁平上皮癌、メラノーマ又は神経芽腫であり、特に好ましくは乳癌、肺癌、脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、肥満細胞腫、メラノーマ又は神経芽腫である。
　また、対象となる動物（被験体）は、上記のとおり、好ましくは哺乳動物であり、より好ましくは霊長類、ペット動物、動物園等で飼育されている動物、家畜類、競技用動物などを含む哺乳動物であり、特に好ましくはヒト、イヌ又はネコである。
　本発明の免疫誘導剤の生体への投与経路は、経口投与でも非経口投与でもよいが、筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与が好ましい。癌の治療目的で該免疫誘導剤を用いる場合には、抗癌作用を高めるため、後述の実施例に記載するように、治療対象となる腫瘍の近傍の所属リンパ節に投与することもできる。投与量は、免疫誘導するのに有効な量であればよく、例えば癌の治療及び／又は予防に用いるのであれば、癌の治療及び／又は予防に有効な量であればよい。癌の治療及び／又は予防に有効な量は、腫瘍の大きさや症状等に応じて適宜選択されるが、通常、対象動物に対し１日当りの有効量として０．０００１～１０００μｇ、好ましくは０．００１～１０００μｇであり、１回又は数回に分けて投与することができる。好ましくは、数回に分け、数日ないし数月おきに投与する。後述の実施例に具体的に示されるとおり、本発明の免疫誘導剤は、既に形成されている腫瘍を退縮させることができる。従って、発生初期の少数の癌細胞にも抗癌作用を発揮し得るので、癌の発症前や癌の治療後に用いれば、癌の発症や再発を防止することができる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、癌の治療と予防の双方に有用である。
　本発明の免疫誘導剤は、ポリペプチドのみから成っていてもよいし、各投与形態に適した、製薬上許容可能な担体、希釈剤、賦形剤等の添加剤を適宜混合させて製剤することもできる。ここで「製剤」は、「免疫誘導用組成物」及び「免疫誘導用医薬品」と互換的に使用してもよい。製剤方法及び使用可能な添加剤は、医薬製剤の分野において周知であり、いずれの方法及び添加剤をも用いることができる。添加剤の具体例としては、生理緩衝液のような希釈剤；砂糖、乳糖、コーンスターチ、リン酸カルシウム、ソルビトール、グリシン等のような賦形剤；シロップ、ゼラチン、アラビアゴム、ソルビトール、ポリビニルクロリド、トラガント等のような結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、タルク、シリカ等の滑沢剤等が挙げられるが、これらに限定されない。製剤形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤などの経口剤、吸入剤、注射剤、座剤、液剤などの非経口剤などを挙げることができる。これらの製剤は一般的に知られている製法によって作ることができる。
　本発明の免疫誘導剤は、生体内での免疫学的応答を強化することができる免疫増強剤と組み合わせて用いることができる。免疫増強剤は、本発明の免疫誘導剤に含まれていてもよいし、別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与してもよい。
　上記免疫増強剤としては、例えばアジュバントを挙げることができる。アジュバントは、抗原の貯蔵所（細胞外又はマクロファージ内）を提供し、マクロファージを活性化し、かつ特定組のリンパ球を刺激することにより、免疫学的応答を強化し得るので、抗癌作用を高めることができる。従って、特に、本発明の免疫誘導剤を癌の治療及び／又は予防に用いる場合、免疫誘導剤は、有効成分たる上記ポリペプチドに加えてさらにアジュバントを含むことが好ましい。多数の種類のアジュバントが当業界で周知であり、いずれのアジュバントでも用いることができる。アジュバントの具体例としては、ＭＰＬ（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ）、サルモネラ属のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｍｉｎｎｅｓｏｔａ　Ｒｅ　５９５リポ多糖類の精製及び酸加水分解後に得られる同類物；ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｑｕｉｌｌｊａ　ｓａｐｏｎａｒｉａ抽出物から精製される純ＱＡ－２１サポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ９６／３３７３９（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ　Ｂｅｅｃｈａｍ）に記載されたＤＱＳ２１；ＱＳ－７、ＱＳ－１７、ＱＳ－１８及びＱＳ－Ｌ１（ソ（Ｓｏ）ら、「モレキュルズ・アンド・セル（Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　ａｎｄ　ｃｅｌｌｓ）」、１９９７年、第７巻、ｐ．１７８－１８６）；フロイントの不完全アジュバント；フロイントの完全アジュバント；ビタミンＥ；モンタニド；ミョウバン若しくは水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、クレイグ（Ｋｒｅｉｇ）ら、「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）」、第３７４巻、ｐ．５４６－５４９を参照）；ポリＩＣ及びその誘導体（ポリＩＣＬＣ等）ならびにスクアレン及び／又はトコフェロールのような生分解性油から調製される種々の油中水エマルション；αガラクトシルセラミドなどが挙げられる。中でも、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体並びにＣｐＧオリゴヌクレオチドが好ましい。上記アジュバントとポリペプチドの混合比は、典型的には約１：１０～１０：１、好ましくは約１：５～５：１、より好ましくは約１：１である。ただし、アジュバントは上記例示に限定されず、当業界で公知の上記以外のアジュバントも本発明の免疫誘導剤を投与する際に用いられ得る（例えば、ゴッディング（Ｇｏｄｉｎｇ）著，「モノクローナル・アンチボディーズ：プリンシプル・アンド・プラクティス（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」、第２版、１９８６年を参照）。ポリペプチド及びアジュバントの混合物又はエマルションの調製方法は、予防接種の当業者には周知である。
　また、上記免疫増強剤としては、上記アジュバント以外にも、対象の免疫応答を刺激する因子を用いることもできる。例えば、リンパ球や抗原提示細胞を刺激する特性を有する各種サイトカインを免疫増強剤として本発明の免疫誘導剤と組み合わせて用いることができる。そのような免疫学的応答を増強可能な多数のサイトカインが当業者に公知であり、その例としては、ワクチンの防御作用を強化することが示されているインターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ及びＦｌｔ３リガンドが挙げられるが、これらに限定されない。このような因子も上記免疫増強剤として用いることができ、本発明の免疫誘導剤に含ませて、又は別個の組成物として本発明の免疫誘導剤と併用して患者に投与することができる。
　また、上記ポリペプチドと（被験体由来の）抗原提示細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドを抗原提示細胞に提示させることができる。すなわち、上記した（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドは、抗原提示細胞の処理用として使用し得る。ここで、抗原提示細胞としては、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞を好ましく用いることができる。種々のＭＨＣクラスＩ分子が同定されており、周知である。ヒトにおけるＭＨＣ分子はＨＬＡと呼ぶ。ＨＬＡクラスＩ分子としては、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃを挙げることができ、より具体的には、ＨＬＡ－Ａ１、ＨＬＡ－Ａ０２０１、ＨＬＡ－Ａ０２０４、ＨＬＡ－Ａ０２０５、ＨＬＡ－Ａ０２０６、ＨＬＡ－Ａ０２０７、ＨＬＡ－Ａ１１、ＨＬＡ－Ａ２４、ＨＬＡ－Ａ３１、ＨＬＡ－Ａ６８０１、ＨＬＡ－Ｂ７、ＨＬＡ－Ｂ８、ＨＬＡ－Ｂ２７０５、ＨＬＡ－Ｂ３７、ＨＬＡ－Ｃｗ０４０１、ＨＬＡ－Ｃｗ０６０２などを挙げることができる。
　上記ポリペプチドを抗原提示細胞の処理用として使用する例として、下記３．で説明するように、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞を作製すること、及び、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を作製することなどへのポリペプチドの使用を挙げることができる。
　ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞は、周知の方法により末梢血から調製することができる。例えば、骨髄、臍帯血あるいは患者末梢血から、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）とＩＬ－３（あるいはＩＬ－４）を用いて樹状細胞を誘導し、その培養系に腫瘍関連ペプチドを加えることにより、腫瘍特異的な樹状細胞を誘導することができる。
　この樹状細胞を有効量投与することで、癌の治療に望ましい応答を誘導できる。用いる細胞は、健康人から提供された骨髄や臍帯血、患者本人の骨髄や末梢血等を用いることができるが、患者本来の自家細胞を使う場合は、安全性が高く、重篤な副作用を回避することも期待できる。末梢血又は骨髄は新鮮試料、低温保存試料及び凍結保存試料のいずれでもよい。末梢血は、全血を培養してもよいし、白血球成分だけを分離して培養してもよいが、後者の方が効率的で好ましい。さらに白血球成分の中でも単核球を分離してもよい。また、骨髄や臍帯血を起源とする場合には、骨髄を構成する細胞全体を培養してもよいし、これから単核球を分離して培養してもよい。末梢血やその白血球成分、骨髄細胞には、樹状細胞の起源となる単核球、造血幹細胞又は未成熟樹状細胞やＣＤ４陽性細胞等が含まれている。用いられるサイトカインは、安全性と生理活性が確認された特性のものであれば、天然型、あるいは遺伝子組み換え型等、その生産手法については問わないが、好ましくは医療用に用いられる品質が確保された標品が必要最低量で用いられる。添加するサイトカインの濃度は、樹状細胞が誘導される濃度であれば特に限定されず、通常サイトカインの合計濃度で１０～１０００ｎｇ／ｍＬ程度が好ましく、より好ましくは２０～５００ｎｇ／ｍＬ程度である。培養は、白血球の培養に通常用いられている周知の培地を用いて行うことができる。培養温度は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、ヒトの体温である３７℃程度が最も好ましい。また、培養中の気体環境は白血球の増殖が可能であれば特に限定されないが、５％ＣＯ２を通気することが好ましい。さらに培養期間は、必要数の細胞が誘導される期間であれば特に限定されないが、通常３日～２週間の間で行われる。細胞の分離や培養に供される機器は、適宜適当なものを用いることができるが、医療用に安全性が確認され、かつ操作が安定して簡便であることが好ましい。特に細胞培養装置については、シャーレ、フラスコ、ボトル等の一般的容器に拘わらず、積層型容器や多段式容器、ローラーボトル、スピナー式ボトル、バッグ式培養器、中空糸カラム等も用いることができる。
　さらにまた、本発明によれば、上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを対象動物の体内で発現させることによっても、該生体内で抗体生産や細胞障害性Ｔ細胞を誘導することができ、該ポリペプチドを投与するのと同等の癌に対する上記治療及び予防等の効果が得られる。すなわち、本発明の免疫誘導剤は、上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、生体内で該ポリペプチドを発現可能な組換えベクターを有効成分として含むものであってもよい。後述の実施例に示されるように、このような抗原ポリペプチドを発現可能な組換えベクターは、遺伝子ワクチンとも呼ばれる。
　遺伝子ワクチンを製造するために用いるベクターは、対象動物細胞内（好ましくは哺乳動物細胞内）で発現可能なベクターであれば特に限定されず、プラスミドベクターでもウイルスベクターでもよく、遺伝子ワクチンの分野で公知のいかなるベクターを用いてもよい。なお、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡやＲＮＡ等のポリヌクレオチドは、上述した通り、常法により容易に調製することができる。また、ベクターへの該ポリヌクレオチドの組み込みは、当業者に周知の方法を用いて行なうことができる。
　遺伝子ワクチンの投与経路は、好ましくは筋肉内投与、皮下投与、静脈内投与、動脈内投与等の非経口投与経路であり、投与量は、抗原の種類等に応じて適宜選択することができるが、通常、体重１ｋｇ当たり、遺伝子ワクチンの重量で０．１μｇ～１００ｍｇ程度、好ましくは１μｇ～１０ｍｇ程度である。
　ウイルスベクターによる方法としては、例えばレトロウイルス、センダイウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス等のＲＮＡウイルス又はＤＮＡウイルスに、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを組み込み、これを対象動物に感染させる方法が挙げられる。この中で、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス等を用いた方法が特に好ましい。
　その他の方法としては、発現プラスミドを直接筋肉内に投与する方法（ＤＮＡワクチン法）、リポソーム法、リポフェクチン法、マイクロインジェクション法、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法等が挙げられ、特にＤＮＡワクチン法、リポソーム法が好ましい。
　本発明で用いられる上記ポリペプチドをコードする遺伝子を実際に医薬として作用させるには、遺伝子を直接体内に導入するｉｎ　ｖｉｖｏ方法、及び対象動物からある種の細胞を採取し体外で遺伝子を該細胞に導入しその細胞を体内に戻すｅｘ　ｖｉｖｏ方法があるが（日経サイエンス（日本），１９９４年４月，ｐ２０－４５、月刊薬事（日本），１９９４年，第３６巻，第１号，ｐ．２３－４８、実験医学増刊（日本），１９９４年，第１２巻，第１５号、及びこれらの引用文献等）、ｉｎ　ｖｉｖｏ方法がより好ましい。
　ｉｎ　ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、治療目的の疾患、症状等に応じた適当な投与経路により投与され得る。例えば、静脈、動脈、皮下、筋肉内などに投与することができる。ｉｎ　ｖｉｖｏ方法により投与する場合は、例えば、液剤等の製剤形態をとりうるが、一般的には、有効成分である本発明の上記ペプチドをコードするＤＮＡを含有する注射剤等とされ、必要に応じて、製薬上許容可能な担体（例えば、生理食塩水、緩衝液、等）を加えてもよい。また、該ＤＮＡを含有するリポソーム又は膜融合リポソーム（センダイウイルス（ＨＶＪ）－リポソーム等）においては、懸濁剤、凍結剤、遠心分離濃縮凍結剤等のリポソーム製剤の形態とすることができる。
　なお、本発明において、「配列番号１に示される塩基配列」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列の他、これと相補的な配列も包含する。従って、「配列番号１に示される塩基配列を有するポリヌクレオチド」と言った場合には、配列番号１に実際に示されている塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、その相補的な塩基配列を有する一本鎖ポリヌクレオチド、及びこれらから成る二本鎖ポリヌクレオチドが包含される。本発明で用いられるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する場合には、適宜いずれかの塩基配列を選択することとなるが、当業者であれば容易にその選択をすることができる。
３．抗原提示細胞又は細胞障害性Ｔ細胞
　本発明はさらに、上記のポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）で接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法を提供する。
　本発明はまた、この方法によって得られる、かつ上記のポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含むことを特徴とする、抗原提示細胞を提供する。
　上記ポリペプチドと抗原提示細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させる方法自体は、周知の方法により行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を、上記ポリペプチドを含む培養液中で培養することにより行なうことができる。培地については、市販の抗原提示細胞培養培地を使用することができる。培地中のペプチド濃度は、特に限定されないが、通常１～１００μｇ／ｍｌ程度、好ましくは５～２０μｇ／ｍｌ程度である。培養時の細胞密度は特に限定されないが、通常１０３～１０７細胞／ｍｌ程度、好ましくは５×１０４～５×１０６細胞／ｍｌ程度である。培養は、常法に従い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。なお、抗原提示細胞が表面上に提示できるペプチドの長さは、通常、最大で３０アミノ酸残基程度である。従って、特に限定されないが、抗原提示細胞とポリペプチドをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させる場合、該ポリペプチドをおよそ３０アミノ酸残基以下の長さに調製してもよい。
　上記したポリペプチドの共存下において抗原提示細胞を培養することにより、該ポリペプチドが抗原提示細胞のＭＨＣ分子に取り込まれ、抗原提示細胞の表面に提示される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を含む、単離抗原提示細胞を調製することができる。このような抗原提示細胞は、生体内又は、ｅｘ　ｖｉｖｏもしくはインビトロにおいて、Ｔ細胞に対して該ポリペプチドを提示し、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。
　本発明はさらに、上記の抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、上記のポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法を提供する。
　本発明はまた、この方法によって得られる、かつ上記のポリペプチドに特異的であることを特徴とする、細胞障害性Ｔ細胞を提供する。
　上記のようにして調製される、上記ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体とを含む抗原提示細胞を、Ｔ細胞とｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることにより、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができる。これは、上記抗原提示細胞とＴ細胞とを液体培地中で共存培養することにより行なうことができる。例えば、抗原提示細胞を液体培地に懸濁して、マイクロプレートのウェル等の容器に入れ、これにＴ細胞を添加して培養することにより行なうことができる。共存培養時の抗原提示細胞とＴ細胞の混合比率は、特に限定されないが、通常、細胞数の比率で約１：１～約１：１００、好ましくは約１：５～約１：２０である。また、液体培地中に懸濁する抗原提示細胞の密度は、特に限定されないが、通常、約１００～１０００万細胞／ｍｌ、好ましくは約１００００～１００万細胞／ｍｌである。共存培養は、常法に従い、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で行なうことが好ましい。培地については、市販の抗原提示細胞／Ｔ細胞培養培地を使用することができる。培養時間は、特に限定されないが、通常、約２日～３週間、好ましくは約４日～２週間程度である。また、共存培養は、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７及びＩＬ－１２のようなインターロイキンの１種又は複数の存在下で行なうことが好ましい。この場合、ＩＬ－２及びＩＬ－７の濃度は、通常約５～２０Ｕ／ｍｌ、ＩＬ－６の濃度は通常約５００～２０００Ｕ／ｍｌ、ＩＬ－１２の濃度は通常約５～２０ｎｇ／ｍｌであるが、これらに限定されるものではない。上記の共存培養は、新鮮な抗原提示細胞を追加して１回ないし数回繰り返してもよい。例えば、共存培養後の培養上清を捨て、新鮮な抗原提示細胞の懸濁液を添加してさらに共存培養を行なうという操作を、１回ないし数回繰り返してもよい。各共存培養の条件は、上記と同様でよい。
　上記の共存培養により、該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞が誘導され、増殖される。従って、上記ポリペプチドを用いて、該ポリペプチドとＭＨＣ分子の複合体を選択的に結合する、単離Ｔ細胞を調製することができる。
　後述の実施例に記載される通り、ＣＳＰＧ５遺伝子は、乳癌細胞、乳癌組織、肺癌細胞、肺癌組織、肝臓癌細胞、肝臓癌組織、脳腫瘍細胞、脳腫瘍組織、卵巣癌細胞、卵巣癌組織、白血病、悪性リンパ腫、腺癌細胞、腺癌組織、肥満細胞腫、扁平上皮癌細胞、メラノーマ細胞又は神経芽腫細胞に特異的に発現している。従って、これらの癌腫においては、ＣＳＰＧ５が正常細胞よりも有意に多く存在していると考えられる。したがって、癌細胞内に存在するＣＳＰＧ５のポリペプチドの一部が癌細胞表面上のＭＨＣ分子に提示されるよう、上記のようにして調製した細胞障害性Ｔ細胞が生体内に投与されると、これを目印として細胞障害性Ｔ細胞が癌細胞を障害することができる。また、ＣＳＰＧ５のポリペプチドの一部を提示する抗原提示細胞は、生体内においても該ポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞を誘導し、増殖させることができるので、該抗原提示細胞を生体内に投与することによっても、癌細胞を障害することができる。すなわち、上記ポリペプチドを用いて調製された上記細胞障害性Ｔ細胞や上記抗原提示細胞もまた、本発明の免疫誘導剤と同様に、癌の治療及び／又は予防用として有用である。
　上記した単離抗原提示細胞や単離Ｔ細胞を生体に投与する場合には、これらの細胞を異物として攻撃する生体内での免疫応答を回避するために、治療を受ける患者から採取した抗原提示細胞又はＴ細胞を、上記のように上記（ａ）、（ｂ）又は（ｃ）のポリペプチドを用いて調製したものであることが好ましい。
　抗原提示細胞又は単離Ｔ細胞を有効成分として含む癌の治療及び／又は予防剤の投与経路は、静脈内投与や動脈内投与のような非経口投与が好ましい。また、投与量は、症状や投与目的等に応じて適宜選択されるが、通常１個～１０兆個、好ましくは１００万個～１０億個であり、これを数日ないし数月に１回投与するのが好ましい。製剤は、例えば、細胞を生理緩衝食塩水に懸濁したもの等であってよく、他の抗癌剤やサイトカイン等と併用することもできる。また、製剤分野において周知の１又は２以上の添加剤を添加することもできる。
　以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明するが、本発明の範囲は、該実施例によって制限されないものとする。
［実施例１］
＜ＳＥＲＥＸ法による新規癌抗原タンパクの取得＞
　（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製
　犬の精巣から酸グアニジウム－フェノール－クロロフォルム法（Ａｃｉｄ　ｇｕａｎｉｄｉｕｍ－Ｐｈｅｎｏｌ－Ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ法）により全ＲＮＡを抽出し、Ｏｌｉｇｏｔｅｘ－ｄＴ３０　ｍＲＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（宝酒造株式会社、京都、日本国）を用いてキット添付のプロトコールに従ってポリＡ　ＲＮＡを精製した。
　この得られたｍＲＮＡ（５μｇ）を用いてｃＤＮＡファージライブラリーを合成した。ｃＤＮＡファージライブラリーの作製にはｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｋｉｔ，Ｚａｐ－ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ，ＺＡＰ－ｃＤＮＡ　ＧｉｇａｐａｃｋＩＩＩ　Ｇｏｌｄ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）を用い、キット添付のプロトコールに従ってライブラリーを作製した。作製したｃＤＮＡファージライブラリーのサイズは１×１０６ｐｆｕ／ｍｌであった。
　（２）血清によるｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング
　上記作製したｃＤＮＡファージライブラリーを用いて、イムノスクリーニングを行った。具体的にはΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレートに２３４０クローンとなるように宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ'）に感染させ、４２℃、３～４時間培養し、溶菌斑（プラーク）を作らせ、ＩＰＴＧ（イソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシド）を浸透させたニトロセルロースメンブレン（Ｈｙｂｏｎｄ　Ｃ　Ｅｘｔｒａ：ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ　Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｃｅ社）でプレートを３７℃で４時間覆うことによりタンパク質を誘導・発現させ、メンブレンにタンパク質を転写した。その後メンブレンを回収し０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ　ｐＨ７．５）に浸し４℃で一晩振盪することによって非特異反応を抑制した。このフィルターを５００倍希釈した患犬血清と室温で２～３時間反応させた。
　上記患犬血清としては、乳癌の患犬より採取した血清を用いた。これらの血清は－８０℃で保存し、使用直前に前処理を行った。血清の前処理方法は、以下の方法による。すなわち、外来遺伝子を挿入していないλ　ＺＡＰ　Ｅｘｐｒｅｓｓファージを宿主大腸菌（ＸＬ１－ＢＬｕｅ　ＭＲＦ'）に感染させた後、ＮＺＹプレート培地上で３７℃、一晩培養した。次で０．５Ｍ　ＮａＣｌを含む０．２Ｍ　ＮａＨＣＯ３　ｐＨ８．３のバッファーをプレートに加え、４℃で１５時間静置後、上清を大腸菌／ファージ抽出液として回収した。次に、回収した大腸菌／ファージ抽出液をＮＨＳ－カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ　Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅ社）に通液して、大腸菌・ファージ由来のタンパク質を固定化した。このタンパク固定化カラムに患犬血清を通液・反応させ、大腸菌及びファージに吸着する抗体を血清から取り除いた。カラムを素通りした血清画分は、０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳにて５００倍希釈し、これをイムノスクリーニング材料とした。
　かかる処理血清と上記融合タンパク質をブロットしたメンブレンをＴＢＳ－Ｔ（０．０５％　Ｔｗｅｅｎ２０／ＴＢＳ）にて４回洗浄を行った後、二次抗体として０．５％脱脂粉乳を含ＴＢＳにて５０００倍希釈を行ったヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ　Ｄｏｇ　ＩｇＧ－ｈ＋Ｉ　ＨＲＰ　ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ：ＢＥＴＨＹＬ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を、室温１時間反応させ、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ反応液（Ｒｏｃｈｅ社）を用いた酵素発色反応により検出し、発色反応陽性部位に一致するコロニーをΦ９０×１５ｍｍのＮＺＹアガロースプレート上から採取し、ＳＭ緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌＳＯ４、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０１％　ゼラチン　ｐＨ７．５）５００μｌに溶解させた。発色反応陽性コロニーが単一化するまで上記と同様の方法で、二次、三次スクリーニングを繰り返し、血清中のＩｇＧと反応する９１１０個のファージクローンをスクリーニングして、１個の陽性クローンを単離した。
　（３）単離抗原遺伝子の配列同一性検索
　上記方法により単離した１個の陽性クローンを塩基配列解析に供するため、ファージベクターからプラスミドベクターに転換する操作を行った。具体的には宿主大腸菌（ＸＬ１－Ｂｌｕｅ　ＭＲＦ'）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１００μｌさらにＥｘＡｓｓｉｓｔ　ｈｅｌｐｅｒ　ｐｈａｇｅ　（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ社）１μｌを混合した後３７℃で１５分間反応後、ＬＢ培地を３ｍｌ添加し３７℃で２．５～３時間培養を行い、直ちに７０℃の水浴にて２０分間保温した後、４℃、１０００×ｇ、１５分間遠心を行い、上清をファージミド溶液として回収した。次いでファージミド宿主大腸菌（ＳＯＬＲ）を吸光度ＯＤ６００が１．０となるよう調製した溶液２００μｌと、精製したファージ溶液１０μｌを混合した後３７℃で１５分間反応させ、５０μｌをアンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ寒天培地に播き３７℃一晩培養した。トランスフォームしたＳＯＬＲのシングルコロニーを採取し、アンピシリン（終濃度５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢ培地３７℃にて培養後、ＱＩＡＧＥＮ　ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（キアゲン社）を使って目的のインサートを持つプラスミドＤＮＡを精製した。
　精製したプラスミドは、配列番号１７に記載のＴ３プライマーと配列番号１８に記載のＴ７プライマーを用いて、プライマーウォーキング法によるインサート全長配列の解析を行った。このシークエンス解析により配列番号１に記載の遺伝子配列を取得した。この遺伝子の塩基配列及びアミノ酸配列を用いて、配列同一性検索プログラムＢＬＡＳＴサーチ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を行い既知遺伝子との配列同一性検索を行った結果、得られた遺伝子はＣＳＰＧ５遺伝子であることが判明した。イヌＣＳＰＧ５のヒト相同因子であるヒトＣＳＰＧ５では、配列同一性が塩基配列８７％、アミノ酸配列８７％であり、ネコＣＳＰＧ５では、配列同一性が塩基配列９２％、アミノ酸配列９１％であり、マウス相同因子であるマウスＣＳＰＧ５では、配列同一性が塩基配列８４％、アミノ酸配列８５％であった。ヒトＣＳＰＧ５の塩基配列を配列番号３、５、７、９又は１１、アミノ酸配列を配列番号４、６、８、１０又は１２に、ネコＣＳＰＧ５の塩基配列を配列番号１３、アミノ酸配列を配列番号１４に、マウスＣＳＰＧ５の塩基配列を配列番号１５、アミノ酸配列を配列番号１６にそれぞれ示す。
　（４）各組織での発現解析
　上記方法により得られた遺伝子に対しイヌ、ヒト及びマウスの各種ヒト正常組織及び各種癌組織および癌細胞株における発現をＲＴ－ＰＣＲ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－ＰＣＲ）法により調べた。逆転写反応は以下の通り行なった。すなわち、各組織５０～１００ｍｇ及び各細胞株５～１０×１０６個の細胞からＴＲＩＺＯＬ試薬（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて添付のプロトコールに従い全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを用いてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　ＲＴ－ＰＣＲ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）により添付のプロトコールに従いｃＤＮＡを合成した。ヒト正常組織（脳、海馬、精巣、結腸、胎盤）のｃＤＮＡは、ジーンプールｃＤＮＡ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、ＱＵＩＣＫ－Ｃｌｏｎｅ　ｃＤＮＡ（クロンテック社）及びＬａｒｇｅ－Ｉｎｓｅｒｔ　ｃＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ（クロンテック社）を用いた。ＰＣＲ反応は、取得した遺伝子特異的なプライマー（イヌプライマーは配列番号１９及び２０、ヒトプライマーは配列番号２１及び２２、マウスプライマーは配列番号２３及び２４に記載）を用いて以下の通り行った。すなわち、逆転写反応により調製したサンプル０．２５μｌ、上記プライマーを各２μＭ、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．６５ＵのＥｘＴａｑポリメラーゼ（宝酒造社）となるように各試薬と添付バッファーを加え全量を２５μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ　ＲＡＤ社）を用いて、９４℃－３０秒、５５℃－３０秒、７２℃－１分のサイクルを３０回繰り返して行った。比較対照のため、ＧＡＰＤＨ特異的なプライマー（イヌ及びヒトＧＡＰＤＨプライマーは配列番号２５及び２６、マウスＧＡＰＤＨプライマーは配列番号２７及び２８に記載）も同時に用いた。その結果、図１に示すように、イヌＣＳＰＧ５遺伝子は、健常なイヌ組織ではほとんどの組織で発現が見られず、一方イヌ腫瘍組織では強い発現が見られた。ヒト及びマウスＣＳＰＧ５遺伝子の発現も、イヌＣＳＰＧ５遺伝子と同様、ヒト及びマウス正常組織ではほとんど発現が確認できず、癌細胞では乳癌、肺癌、脳腫瘍、卵巣癌、白血病、悪性リンパ腫の細胞株で発現が検出された（図２、図３）。
［実施例２］
＜ＣＳＰＧ５の生体内での癌抗原性の解析＞
　（１）生体内でＣＳＰＧ５を発現する組換えベクターの作製
　配列番号１５の塩基配列を基に、以下の方法にて、生体内でＣＳＰＧ５を発現する組換えベクターを作製した。ＰＣＲは、実施例１において発現の見られたマウス神経芽腫細胞株１（Ｎ２ａ：ＡＴＣＣより購入）より調製した。ｃＤＮＡを１μｌ、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素切断配列を含む２種類のプライマー（配列番号２９及び３０に記載）を各０．４μＭ、０．２ｍＭ　ｄＮＴＰ、１．２５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＨＳポリメラーゼ（宝酒造社）となるように各試薬と添付バッファーを加えて全量を５０μｌとし、Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ（ＢＩＯ　ＲＡＤ社）を用いて、９８℃－１０秒、５５℃－１５秒、７２℃－４分のサイクルを３０回繰り返すことにより行った。なお、上記２種類のプライマーは、配列番号１５のアミノ酸配列全長をコードする領域を増幅するものであった。ＰＣＲ後、増幅されたＤＮＡを１％アガロースゲルにて電気泳動し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて約１０００ｂｐのＤＮＡ断片を精製した。
　精製したＤＮＡ断片をクローニングベクターｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）にライゲーションした。これを大腸菌に形質転換後プラスミドを回収し、増幅された遺伝子断片が目的配列と一致することをシークエンスで確認した。目的配列と一致したプラスミドをＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素で処理し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔで精製後、目的遺伝子配列を、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＸｂａＩ制限酵素で処理した哺乳類発現ベクターＰＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。このベクターの使用により哺乳類の細胞内でＣＳＰＧ５タンパクが産生される。
　上記で作製したプラスミドＤＮＡ１００μｇに５０μｇの金粒子（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社）、スペルミジン１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社）、１Ｍ　ＣａＣｌ２　１００μｌ（ＳＩＧＭＡ社）を添加し、ボルテックスによって攪拌し１０分室温で静置した（以後「金－ＤＮＡ粒子」と記載する）。３０００ｒｐｍで１分遠心した後、上清を捨て１００％エタノール（ＷＡＫＯ社）によって３回洗浄した。金－ＤＮＡ粒子に１００％エタノール６ｍｌを加えボルテックスによって十分に攪拌した後、金－ＤＮＡ粒子をＴｅｆｚｅｌ　Ｔｕｂｉｎｇ（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社）に流し込み、壁面に沈殿させた。金－ＤＮＡ粒子が付着したＴｅｆｚｅｌ　Ｔｕｂｉｎｇのエタノールを風乾し、遺伝子銃に適した長さにカットした。
　（２）ＤＮＡワクチン法によるＣＳＰＧ５の抗腫瘍効果
　１０匹のＡ／Ｊマウス（７週齢、雄、日本ＳＬＣ社から購入）に対して、上記で作製したチューブを遺伝子銃に固定し、純ヘリウムガスを用いて４００ｐｓｉの圧力で、剃毛したマウスの腹腔にＤＮＡワクチンを７日ごとに計３回、経皮投与した後に（プラスミドＤＮＡ接種量は２μｇ／匹になる）マウス神経芽腫細胞株Ｎ２ａ細胞を移植して抗腫瘍効果を評価した（予防モデル）。なお、コントロールとして、ＣＳＰＧ５遺伝子が挿入されていないプラスミドＤＮＡを各モデルで１０匹ずつ投与した。
　抗腫瘍効果は、腫瘍の大きさ（長径×短径２／２）及び生存マウスの割合で評価した。本検討の結果、予防モデルにおいて、２１日後には、コントロール群及びＣＳＰＧ５プラスミド投与群で、それぞれ、１８６６ｍｍ３、４５９ｍｍ３となり、ＣＳＰＧ５プラスミド投与群では腫瘍の顕著な退縮が観察された。また、生存の経過を観察した結果、予防モデルにおいて、コントロール群では投与後５４日で全例死亡したのに対し、ＣＳＰＧ５プラスミド投与群では、６０％のマウスが生存していた。以上の結果から、ＣＳＰＧ５プラスミド投与群はコントロール群に比べて有意な抗腫瘍効果が認められた。
　本発明は、各種癌に対して抗腫瘍活性を発揮するポリペプチドを含む免疫誘導剤を提供するため、癌の治療及び／又は予防に有用である。
配列番号１７：Ｔ３プライマー
配列番号１８：Ｔ７プライマー
配列番号１９：イヌＲＴプライマーセンス
配列番号２０：イヌＲＴプライマーアンチセンス
配列番号２１：ヒトＲＴプライマーセンス
配列番号２２：ヒトＲＴプライマーアンチセンス
配列番号２３：マウスＲＴプライマーセンス
配列番号２４：マウスＲＴプライマーアンチセンス
配列番号２５及び２６：ＧＡＰＤＨプライマー
配列番号２７及び２８：ＧＡＰＤＨプライマー
配列番号２９：ｍｕｓ－ｆｕｌｌＣＳＰＧ５プライマーセンス
配列番号３０：ｍｕｓ－ｆｕｌｌＣＳＰＧ５プライマーアンチセンス
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (13)

  1. 　（ｉ）以下の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）のポリペプチド類から選択され、かつ免疫誘導活性を有する少なくとも１つのポリペプチド、又は（ｉｉ）該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、かつ生体内で該ポリペプチドを発現可能にする組換えベクター、を有効成分として含む免疫誘導剤。
    （ａ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、及び該アミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
    （ｂ）配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するポリペプチド、及び該ポリペプチドのアミノ酸配列中の連続する７個以上のアミノ酸からなるポリペプチド
    （ｃ）前記（ａ）又は（ｂ）のポリペプチドを部分配列として含むポリペプチド
  2. 　前記免疫誘導活性を有するポリペプチドが、配列番号８、４、６、１０、１２、２又は１４によって表されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の免疫誘導剤。
  3. 　抗原提示細胞の処理用である、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。
  4. 　癌の治療及び／又は予防用である、請求項１又は２に記載の免疫誘導剤。
  5. 　前記癌がＣＳＰＧ５を発現する癌である、請求項４に記載の免疫誘導剤。
  6. 　前記癌が脳腫瘍、白血病、悪性リンパ腫、又は神経芽腫である、請求項４又は５に記載の免疫誘導剤。
  7. 　免疫増強剤をさらに含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の免疫誘導剤。
  8. 　前記免疫増強剤が、フロイントの不完全アジュバント、モンタニド、ポリＩＣ及びその誘導体、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、インターロイキン１２、インターロイキン１８、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンω、インターフェロンγ、並びにＦｌｔ３リガンドから成る群より選ばれる少なくとも一つである、請求項７に記載の免疫誘導剤。
  9. 　請求項１に定義するポリペプチドと被験体由来の抗原提示細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させることを含む、該ポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含む抗原提示細胞の作製方法。
  10. 　前記抗原提示細胞が、ＭＨＣクラスＩ分子を保有する樹状細胞又はＢ細胞である、請求項９に記載の方法。
  11. 　請求項９又は１０に記載の方法によって得られる抗原提示細胞と被験体由来のＴ細胞とをｅｘ　ｖｉｖｏ又はインビトロで接触させて該Ｔ細胞を活性化することを含む、請求項１に定義するポリペプチドに特異的な細胞障害性Ｔ細胞の作製方法。
  12. 　請求項９又は１０に記載の方法によって得られる、かつ請求項１に定義するポリペプチドとＭＨＣ分子との複合体を含むことを特徴とする、抗原提示細胞。
  13. 　請求項１１記載の方法によって得られる、かつ請求項１に定義するポリペプチドに特異的であることを特徴とする、細胞障害性Ｔ細胞。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09194502A (ja) * 1995-11-13 1997-07-29 Seikagaku Kogyo Co Ltd 新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするｄｎａおよびそれに対する抗体
WO2010016525A1 (ja) * 2008-08-05 2010-02-11 東レ株式会社 免疫誘導剤
WO2011027807A1 (ja) * 2009-09-03 2011-03-10 東レ株式会社 免疫誘導剤
WO2012157736A1 (ja) * 2011-05-19 2012-11-22 東レ株式会社 免疫誘導剤
WO2012157737A1 (ja) * 2011-05-19 2012-11-22 東レ株式会社 免疫誘導剤

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5698396A (en) 1995-06-07 1997-12-16 Ludwig Institute For Cancer Research Method for identifying auto-immunoreactive substances from a subject
JP2000095795A (ja) * 1998-09-18 2000-04-04 Seikagaku Kogyo Co Ltd プロテオグリカンのコアタンパク質のポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ
JP2001187799A (ja) 1999-12-28 2001-07-10 Yasuki Kojima アポトーシスを誘導するペプチドおよびその用途
JP2003079374A (ja) * 2001-09-07 2003-03-18 Seikagaku Kogyo Co Ltd プロテオグリカンのコアタンパク質のポリペプチド、それをコードするｄｎａおよびそのプロモーターｄｎａ
WO2006091861A2 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Ppd Biomarker Discovery Sciences, Llc Compositions and methods relating to cns lymphoma
RU2622077C2 (ru) 2011-09-05 2017-06-09 Ханми Сайенс Ко., Лтд. Фармацевтическая композиция для лечения рака, содержащая конъюгат интерферона-альфа

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09194502A (ja) * 1995-11-13 1997-07-29 Seikagaku Kogyo Co Ltd 新規コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、そのコア蛋白質、それをコードするｄｎａおよびそれに対する抗体
WO2010016525A1 (ja) * 2008-08-05 2010-02-11 東レ株式会社 免疫誘導剤
WO2011027807A1 (ja) * 2009-09-03 2011-03-10 東レ株式会社 免疫誘導剤
WO2012157736A1 (ja) * 2011-05-19 2012-11-22 東レ株式会社 免疫誘導剤
WO2012157737A1 (ja) * 2011-05-19 2012-11-22 東レ株式会社 免疫誘導剤

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3290048A4 *
SHIN'ICHIRO FUJII ET AL.: "1. Gan Kogen Vaccines", EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 31, no. 12, 1966, pages 1966 - 1971, XP009507030, ISSN: 0288-5514, [retrieved on 20130000] *
WATANABE E ET AL.: "Neuroglycan C, a novel membrane-spanning chondroitin sulfate proteoglycan that is restricted to the brain", THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 270, no. 45, 1995, pages 26876 - 26882, XP055326580, ISSN: 0021-9258 *
WU WK ET AL.: "Expression of ErbB receptors and their cognate ligands in gastric and colon cancer cell lines", ANTICANCER RESEARCH, vol. 29, no. 1, 2009, pages 229 - 234, XP055326578, ISSN: 0250-7005 *

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