WO2016167580A1 - 3차원 세포 배양 실시간 모니터링 바이오센서 - Google Patents

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WO2016167580A1
WO2016167580A1 PCT/KR2016/003907 KR2016003907W WO2016167580A1 WO 2016167580 A1 WO2016167580 A1 WO 2016167580A1 KR 2016003907 W KR2016003907 W KR 2016003907W WO 2016167580 A1 WO2016167580 A1 WO 2016167580A1
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WO
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electrode
substrate
biosensor
container
height direction
Prior art date
Application number
PCT/KR2016/003907
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English (en)
French (fr)
Inventor
유경화
한날애
이선미
Original Assignee
연세대학교 산학협력단
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Filing date
Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/34—Measuring or testing with condition measuring or sensing means, e.g. colony counters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B32/00—Carbon; Compounds thereof
    • C01B32/05—Preparation or purification of carbon not covered by groups C01B32/15, C01B32/20, C01B32/25, C01B32/30
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance

Definitions

  • the present invention relates to a three-dimensional cell culture real-time monitoring biosensor.
  • Three-dimensional cell culture is a cell culture method that induces three-dimensional interaction between cells by creating a multi-layer layer of cells in the body and creates an environment similar to the cell environment in the body. Responses can be used to study tissue or organ responses (Alison Abbott, Cell culture: Biology's new dimension Nature 424 (2003) 870-872).
  • two-dimensional cell culture which has been widely used until now, the state of the cells being cultured has been mainly observed using an optical microscope.
  • there is a limit in observing the state of cells with an optical microscope so the state of cells cannot be monitored in real time.
  • the present inventors include one or more pairs of electrodes to be erected vertically along a height direction in a container capable of monitoring the state of cells in real time in three-dimensional cell culture, and acquires electrical signals from the cells to monitor real-time three-dimensional cell culture.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention is a biosensor electrode unit that can monitor the state of the cells in real time in the three-dimensional cell culture, a biosensor comprising the same, a manufacturing method thereof, a cell culture monitoring system and cell culture morning-turning using the biosensor It is an object to provide a method.
  • the present invention As a means for solving the above problems, the present invention
  • Electrodes unit for real-time three-dimensional cell culture monitoring biosensor.
  • the present invention is a measuring unit provided to obtain an electrical signal from the cells inside the container.
  • a control unit for outputting an electrical signal obtained from the measuring unit to the outside and supplying power to the measuring unit
  • the measuring unit includes first and second electrode portions provided to be spaced vertically in the container in a vertical direction, respectively, at a predetermined interval inside the container,
  • the first electrode unit may include a first substrate provided to stand vertically along the height direction H in the container, and along the height direction H of the substrate below the first substrate to acquire electrical signals from cells in the container.
  • the second electrode part may be spaced apart from the first substrate at a predetermined interval so as to stand vertically along the height direction H in the container, and the second substrate below the second substrate to acquire an electrical signal from the cells inside the container.
  • a real-time three-dimensional cell culture monitoring biosensor comprising a plurality of second working electrodes arranged in pairs with the working electrodes of the first substrate along the height direction H of the two substrates.
  • the present invention is a measuring unit provided to obtain an electrical signal from the cells inside the container.
  • a sensor module including a control unit for outputting an electrical signal obtained from the measuring unit to the outside and supplying power to the measuring unit;
  • It provides a real-time three-dimensional cell culture monitoring system comprising a processing module electrically connected to the control unit of the sensor module for processing an electrical signal output from the control unit.
  • It provides a method for monitoring in real time the state of the cell cultured in three dimensions comprising the step of performing an electrical signal between the working electrodes in the measuring unit using the biosensor.
  • It provides a method for manufacturing a real-time three-dimensional cell culture monitoring biosensor comprising a.
  • the three-dimensional cell culture monitoring biosensor measures the state of cells (growth, killing and three-dimensional) by measuring changes in electrical signal values in real time during a three-dimensional cell culture experiment that can create an environment similar to an in vivo state.
  • a variety of information can be obtained, such as changes in cell movement and growth rate due to changes in the surrounding environment within the structure.
  • the biosensor of the present invention can measure a wide range within a three-dimensional hydrogel by adjusting the number of electrodes and the distance between the electrode portions, and also a general pair of electrodes, which is a measuring range of the cross section, in the height direction of the container. It is possible to measure the vertical direction by fabricating the electrode, so that the cell state in accordance with the three-dimensional cell culture can be monitored in real time.
  • FIG. 1 is a front view of an electrode unit for a three-dimensional cell culture real-time monitoring biosensor according to the present invention.
  • Figure 2 shows the substrate and electrode types used as the electrode portion of the three-dimensional cell culture real-time monitoring biosensor according to the present invention.
  • Figure 3 shows an alginate hydrogel for three-dimensional cell culture.
  • FIG 4 shows the measurement unit and the electrode unit (a) of the three-dimensional cell culture biosensor according to an embodiment of the present invention and the produced biosensor [control unit + measurement unit] (b).
  • 5 shows fluorescence images of fluorescent breast cancer cells cultured in two-dimensional cells.
  • Figure 6 shows the fluorescent breast cancer cells of the cells cultured in three-dimensional cells in an optical image.
  • FIG. 7 shows four electrodes arranged on one substrate used in a three-dimensional cell culture monitoring biosensor (bottom to top) in the height direction of the substrate.
  • FIG. 9 is an optical image showing three-dimensional cultured fluorescent cells in a hydrogel before and after 24 hours of cell culture in a hydrogel in which cells are uniformly contained.
  • Figure 10 shows the capacitance results according to the cell growth time in the hydrogel (E1, E2) containing cells only in the lower half.
  • FIG. 11 is a fluorescence image of a cell state of three-dimensional cell culture before and after 24 hours of cell culture in a hydrogel (E1, E2) containing only cells in the lower half.
  • FIG. 12 shows two methods of applying an anticancer agent in a three-dimensional cell culture ((a) applying an anticancer agent as a solution from below, (b) applying an anticancer agent from above using a hydrogel loaded with an anticancer agent).
  • FIG. 13 is a graph showing a real-time capacitance change amount after treating an anticancer agent solution from below in three-dimensional cell culture.
  • Figure 14 shows the fluorescence image of the cell death state in the hydrogel 8 hours after treatment with the anticancer agent solution from below.
  • 15 is a graph showing the amount of capacitance change in real time after the anticancer agent is treated from the top using an anticancer agent-supported hydrogel in three-dimensional cell culture.
  • FIG. 16 shows a fluorescence image of the cell death state in the hydrogel after 8 hours of treatment with the anticancer agent from the top using an anticancer drug loaded hydrogel.
  • FIG. 17 shows a three-dimensional cell culture monitoring biosensor and a three-dimensional cell culture system [dotted line: measuring unit] according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 18 illustrates a connector corresponding to a housing and a connection corresponding to a control unit for fixing an electrode unit of the 3D cell culture monitoring biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • 19 is a photograph taken by inverting the three-dimensional cell culture monitoring biosensor according to the present invention and is an enlarged photograph of the first electrode part and the second electrode part.
  • FIG. 20 shows an electrode pattern of a three-dimensional cell culture biosensor according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 21 shows a three-dimensional cell culture real-time monitoring system according to an embodiment of the present invention.
  • 22a shows real-time capacitance measured with electrodes 1-4 (E1-E4) in hMSC-encapsulated hydrogels cultured with or without SDF-1 ⁇ ,
  • FIG. 22B shows fluorescence optical images of hMSC-encapsulated hydrogel sliced horizontally and stained with DAPI [before culture (sin column), presence of SDF-1 ⁇ (right column) after 32 h incubation (right column) without SDF-1 ⁇ (middle) column); scalebar: 200 ⁇ m],
  • FIG. 22C shows hMSC numbers in seven layers of hydrogels and cell numbers were countered from fluorescence optical images of hMSC-encapsulated hydrogels sliced horizontally and stained with DAPI after 48 hours of incubation with or without SDF-1 ⁇ . .
  • the present invention relates to an electrode unit for real-time three-dimensional cell culture monitoring biosensor comprising a substrate and a plurality of working electrodes arranged along the height direction (H) of the substrate below the substrate to obtain an electrical signal.
  • the electrode unit for real-time three-dimensional cell culture monitoring biosensor according to the present invention; A plurality of working electrodes arranged along a height direction H of the substrate below the substrate to obtain an electrical signal; And a plurality of connection electrodes electrically connecting the operation electrode and the control unit and electrically connected to the operation electrode, respectively.
  • the substrate has an electrode formed thereon, serves as a support for connecting the electrode and the external output, and may include a flexible substrate.
  • the substrate is preferably at least one selected from the group consisting of silicon, a printed circuit board (PCB), polyethylene terephthalate (PET), polyether sulfone (PES), and polyimide, but is not limited thereto.
  • the lower portion of the substrate is a portion that should contact the cell culture support, the size and shape of the lower substrate may vary depending on the area of the cell support.
  • the electrical signal may be one or more selected from the group consisting of capacitance, conductance, and impedance.
  • the working electrode is formed under the substrate in the height direction H of the substrate, and acquires an electrical signal from the cell to be monitored.
  • the three-dimensional cell culture monitoring is possible because the working electrodes are formed in the height direction H of the substrate and in the vertical arrangement of the containers.
  • connection electrode is formed on the substrate, and electrically connects the operation electrode and the control unit, and is electrically connected to each of the plurality of operation electrodes, thereby forming the same number of operation electrodes.
  • the electrode has at least one material selected from the group consisting of a metal, a conductive polymer, a multi-walled carbon nanotube (MWCNT), and graphene. It is not limited.
  • the metal may be one or more selected from the group consisting of gold, platinum and aluminum.
  • the conductive polymer may be at least one selected from the group consisting of PEDOT (Poly (3,4-ethylenedioxythiophene) and Ppy (Polypyrrole)).
  • the electrode may be manufactured in a flexible form by patterning the electrode part through a photolithography process using polyethylene terephthalate (PET), polyether sulfone (PES), or polyimide (polyimide) as a flexible substrate [see FIG. 2]. .
  • PET polyethylene terephthalate
  • PES polyether sulfone
  • polyimide polyimide
  • the electrode unit is preferably sterilized with autoclave and / or ethanol in order to prevent contamination of cells when acquiring an electrical signal.
  • the working electrode size of the electrode portion is 0.1 to 2.5 mm in width w and length of 0.5 to 1.5 mm. If the size is outside the above range, there is a problem in the resolution within the measurement range, there is a problem such as interference of the output electrical signal.
  • the spacing d between the electrodes may be 0.1 to 1.5 mm or 0.1 to 1.0 mm because it is suitable for the measurable range corresponding to the manufactured height and size of the 3D gel.
  • the electrode unit may be fixed to stand vertically along the height direction of the container to be used as a biosensor to produce a fixing groove between the connecting electrodes as shown in Figure 1 to output the electrical signal to the control unit.
  • the fixing protrusion may be manufactured instead of the fixing groove, or the substrate may be used as it is without a groove or the protrusion, and may be used as long as it can be fixed.
  • the electrode part is manufactured by connecting the working electrode of the lower substrate with the connection electrode of the upper substrate. As shown in FIG. 7, in one embodiment, the bottommost working electrode E1 is connected to the rightmost connection electrode C1, and the working electrode E2 above E1 is directly connected to the fixing electrode C2 of the fixing groove.
  • the working electrode E3 above E2 may be manufactured to be connected to the connecting electrode C3 on the left side of C2 and the uppermost working electrode E4 above E3 to be connected to the leftmost connecting electrode C4.
  • the connection electrode is fixed to the control unit and connected to the connection unit (connector).
  • the manufacturing method of the said electrode part is as follows.
  • an electrical circuit of an electrode is patterned on each of two plates.
  • the connection part is a combination of two PCB plates, and the front PCB plate is the part that actually contacts the hydrogel.
  • the part of the electrode that is exposed but leads to the housing is constructed on the back PCB plate.
  • Patterning of the electrical circuit allows the working electrode and the connecting electrode to be connected. That is, the bottommost working electrode E1 is the rightmost connecting electrode C1, the working electrode E2 above the E1 is the connection electrode C2 next to the fixing groove, and the working electrode E3 above the E2 is The connecting electrode C3 on the left side of C2 and the uppermost working electrode E4 above E3 can be patterned to be connected to the leftmost connecting electrode C4.
  • the patterned portion is plated with an electrode of a suitable material, two plates are compressed at high pressure to produce an electrode portion.
  • the present invention also includes a measuring unit provided to obtain an electrical signal from the cells inside the container;
  • a control unit for outputting an electrical signal obtained from the measuring unit to the outside and supplying power to the measuring unit
  • the measuring unit includes first and second electrode portions provided to be spaced vertically in the container in a vertical direction, respectively, at a predetermined interval inside the container,
  • the first electrode unit may include a first substrate provided to stand vertically along the height direction H in the container, and along the height direction H of the substrate below the first substrate to acquire electrical signals from cells in the container.
  • the second electrode part may be spaced apart from the first substrate at a predetermined interval so as to stand vertically along the height direction H in the container, and the second substrate below the second substrate to acquire an electrical signal from the cells inside the container.
  • a real-time three-dimensional cell culture monitoring biosensor including a plurality of second working electrodes arranged in pairs with the working electrodes of the first electrode part along the height direction H of the two substrates.
  • the measuring unit is provided to obtain an electrical signal from the cells inside the container, a pair (first electrode portion, second electrode portion provided to stand vertically along the height direction in each container spaced apart at a predetermined interval inside the container) ) Or more electrode parts.
  • the vessel may be a three dimensional cell culture system, the cell culture system comprising cells and culture medium.
  • the culture medium may be a liquid medium or a cell culture support, and the support may be a hydrogel having a multi-layered form most similar to the tissue state in vivo, but any three-dimensional cell culture may be used. .
  • Three-dimensional cell culture using natural biocompatible hydrogels such as alginate, collagen, and agarose is not only suitable for culturing various types of cells such as immune cells, stem cells, and cancer cells, but also anticancer agents, cell growth factors, and signal transduction agents in the hydrogels. It has the advantage that can be applied freely.
  • the embodiment of the present invention can be used to observe the cell state in real time in three-dimensional cell culture in the hydrogel using alginate hydrogel, a biomaterial widely used for a long time in tissue engineering.
  • the first electrode unit electrically connecting the first operation electrode and the control unit, and includes a plurality of first connection electrodes electrically connected to the first operation electrode, respectively,
  • the second electrode unit may electrically connect the second operation electrode and the control unit, and may include a plurality of second connection electrodes electrically connected to the second operation electrode, respectively.
  • the plurality of first working electrodes are arranged in the height direction of the first substrate below the first substrate,
  • a plurality of second working electrodes is arranged below the second substrate along the height direction of the second substrate.
  • the plurality of first connection electrodes are arranged on the first substrate in the same width as the number of first working electrodes along the width direction W of the first substrate,
  • the plurality of second connection electrodes are arranged on the second substrate in the same width as the number of second working electrodes along the width direction W of the second substrate.
  • first working electrode and the first connecting electrode are electrically connected in the first substrate, and the second working electrode and the second connecting electrode are electrically connected in the second substrate.
  • the first working electrode of the first electrode part and the second working electrode of the second electrode part are each paired in turn along the height direction, that is, each of the plurality of first working electrodes and the plurality of second working electrodes It may be provided to be paired at the same height.
  • the first working electrodes 1 to 4 and the first working electrodes 1 to 4 are paired with 1-1, 2-2, 3-3, and 4-4, respectively.
  • the first working electrode of the first electrode portion and the second working electrode of the second electrode portion are formed in pairs to cross each other along the height direction, that is, each of the plurality of first working electrodes and the plurality of second working electrodes It may be provided to be paired at different heights.
  • the first working electrodes 1 to 4 and the first working electrodes 1 to 4 are 1-2, 2-1, 3-4, 4-3, 1-3, and 2-4, respectively. , 3-1, 4-2, etc. may be provided in pairs in the cross direction.
  • the LCR meter can be used to change the order of the individual working electrodes that are output so that the state of the hydrogel can be measured electronically at different angles in addition to the parallel cross section of the hydrogel. Other planes can be measured in addition to the cross section).
  • control unit serves to output the electrical signal obtained from the cell to the outside, it can be fixed so that the electrode unit is upright to obtain the electrical signal from the measuring unit.
  • control unit includes a connection (see Fig. 18) that can be connected to the input terminal of the processing module capable of processing electrical signals.
  • the connection unit may be located at the top of the control unit, and means a connector.
  • the present invention is a.
  • a measuring unit provided to acquire an electrical signal from a cell inside the container
  • a sensor module including a control unit for outputting an electrical signal obtained from the measuring unit to the outside and supplying power to the measuring unit;
  • a processing module electrically connected to a control unit of the sensor module and processing an electrical signal output from the control unit;
  • the measuring unit includes a first electrode and a second electrode unit provided to stand vertically along the height direction in the container, each spaced apart at a predetermined interval inside the container,
  • the first electrode unit may include a first substrate provided to stand vertically along the height direction H in the container, and along the height direction H of the substrate below the first substrate to acquire electrical signals from cells in the container.
  • the second electrode part may be spaced apart from the first substrate at a predetermined interval so as to stand vertically along the height direction H in the container, and the second substrate below the second substrate to acquire an electrical signal from the cells inside the container. It relates to a real-time three-dimensional cell culture monitoring system, characterized in that it comprises a plurality of second working electrodes arranged in pairs with the working electrodes of the first electrode portion along the height direction (H) of the two substrates.
  • the processing module is a portion for processing one or more electrical signals selected from the group consisting of inductance, resistance, and capacitance output from the control unit.
  • LCR Inductance (L) / Capacitance (C) / Resistance (R)
  • LCR Inductance (L) / Capacitance (C) / Resistance (R)
  • R Resistance
  • the present invention also includes a method for real-time monitoring of a three-dimensional cultured cell state including the step of real-time measuring the electrical signal between the working electrodes in the measurement unit using the biosensor.
  • the processing module and the control unit are connected to each other so that the electrical signal can be processed and can be monitored through a computer.
  • the present invention also provides
  • It includes a method of manufacturing a real-time three-dimensional cell culture monitoring biosensor comprising a.
  • Alginic acid sodium salt (low viscosity, Sigma, USA) was added to a three-dimensional cell culture medium solution (10% fetal bovin serum.PAA, Somerset, UL), 1% penicillin-streptomycin, Alginate solutions were prepared by dissolving at 1% 5% (w / w) at 4 ° C. using 1% Hungizone (Fungizone, Gibco, UK), 2.25% HEPES, MEM with 2% L-glutamine.
  • a three-dimensional cell culture medium solution (10% fetal bovin serum.PAA, Somerset, UL), 1% penicillin-streptomycin, Alginate solutions were prepared by dissolving at 1% 5% (w / w) at 4 ° C. using 1% Hungizone (Fungizone, Gibco, UK), 2.25% HEPES, MEM with 2% L-glutamine.
  • Alginate solution containing fluorescent breast cancer cells (Fluorescent MCF-7) (obtained from Yonsei University College of Medicine, Department of Microbiology, 5 X 10 5 pcs / ml) was placed in 700 ⁇ l of millicell ® and gelated in 100 mM CaCl 2 MEM. I was. After incubation for 3 hours at 37 °C, while moving the culture millicell ® in a three-dimensional cell culture MEM solution was measured image. The gel containing the cells is shown in FIG. 3.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the electrode used in the present embodiment.
  • the electrode was fabricated by conducting gold plating on the bottom of the PCB substrate with a 0.5 mm spacing therebetween (connecting electrodes were 4 electrodes having a size of 1 mm x 8 mm).
  • Capacitance biosensors for three-dimensional cell culture observation consist of four pairs of multi-electrodes [E1-E4].
  • the manufacturing process of the electrode unit is described in detail as follows.
  • E-cad program AutoCAD, download from autodesk site, OrCAD, By using the download from orcad.com
  • the electrical circuits of the electrode unit were patterned on the plate A and plate B as shown in FIG.
  • the connecting part is not patterned on one side of each of plate A and plate B (because it is an electrode made by joining two PCBs as described above) to insulate the part where the electrode and the control unit (housing) are connected.
  • the prepared two electrode parts are sterilized using autoclave equipment and ethanol to prevent the growth of bacteria other than the cells to be measured.
  • the housing manufacturing process corresponding to the control unit connecting the electrode unit and the output unit is as follows.
  • the housing consists of a top plate and three parts on both sides of the metal plate to support the top plate.
  • the supporting side portion was prepared by cutting an aluminum substrate having a thickness of 2 mm, two substrates 6.8 cm long and 2 cm long, and two substrates 6.8 cm long and 1.5 cm long.
  • the top plate of the housing was 8.6 cm in width and 4.5 cm in length, and a PCB substrate to which the four electrode parts could be fitted and a connector (connecting part) for connecting the measuring equipment (processing module) were attached [FIG. 18].
  • Cell culture was carried out in an incubator maintaining a constant temperature and constant humidity carbon dioxide 5% at 37 °C in the usual way, the capacitance was measured in real time during cell culture.
  • the measurement process is as follows.
  • the cells used in this experiment were cultured by adjusting the number of 5 X 10 5 cell / ml cells and the concentration of 1-30% of the hydrogel so that 5% of carbon dioxide was dissolved on the three-dimensional cell culture system cultured in the hydrogel.
  • the capacitance was measured.
  • the fabricated biosensor for three-dimensional cell culture was measured using an LCR meter.
  • a scanner (Agilent 34970A) was used for the measurement.
  • the hydrogel was made into slices of the thinnest thickness (100 ⁇ m) as easily as possible for microscopic observation, and the location of the cells and the state of the cells were confirmed by a fluorescence microscope.
  • Fluorescent breast cancer cells were cultured for 24 hours at 37 DEG C for 24 hours using 24 wells, and cell morphology was observed under a fluorescence microscope. When grown on a two-dimensional plate, the cells were observed to grow in a long stretch of one or two layers.
  • Fluorescent breast cancer cells were cultured for 3 hours at 37 ° C. using alginate hydrogel for 24 hours, and then cell morphology was observed under a fluorescence microscope. Cells cultured in the 3D alginate hydrogel were observed to grow in the form of rounded cells, unlike the cell shapes cultured in the 2D cell.
  • Hydrogels containing 5 ⁇ 10 5 cells / ml of fluorescent breast cancer cells (MCF-7) were measured for capacitance at 37 ° C. for 12 hours, and the state of cells in the hydrogels was confirmed.
  • the cell growth rate in the hydrogel was measured by dividing the working electrode capable of measuring capacitance into four positions (E1 to E4) as shown in FIG. 7.
  • the cell-containing hydrogel showed higher capacitance values than the cell-free hydrogel (grey dotted line) at each electrode during cell growth.
  • a hydrogel containing 5 ⁇ 10 5 cells / ml of fluorescent breast cancer cells (MCF-7) is placed only in 50% of the hydrogel, and a hydrogel containing no cells is disposed thereon, and then at 37 ° C.
  • Capacitor values were measured in real time while incubating for 24 hours. As shown in Figure 10, after the initiation of the culture, after 8 hours, the capacitance value at the E1 electrode and E2 electrode measuring the hydrogel containing the cells was shown to be constant. In addition, the capacitance values of the E3 electrode and the E4 electrode, which measured the hydrogel, which did not contain the cells, increased significantly, and after 24 hours of measurement, almost similar values were obtained. This confirms that the growth of the cells in the hydrogel has been propagated upward over time.
  • anticancer drug doxorubicin
  • the DOX loaded hydrogel was placed on the hydrogel containing the cells.
  • hydrogel 100 ng / ml loaded with an anticancer agent was placed on the hydrogel in which the cells were cultured so that the anticancer agent slowly penetrated into the hydrogel in which the cells were cultured.
  • FIG. 12 (a) In the case of using the anticancer agent (FIG. 12 (a)), it was confirmed that the anticancer agent affected the cells in the E1 and E2 electrodes under the hydrogel to rapidly kill the cells [FIG. 13].
  • the gel used in Figure 13 is divided into two parts. Hydrogels containing cells and hydrogels carrying anticancer drugs were prepared. Before the measurement, the measurement was started after the hydrogel containing the anticancer agent was placed on the hydrogel containing the cells. Relatively, cell death in the E3 and E4 electrodes on the hydrogel did not significantly affect the anticancer drugs, and the cell death was observed slowly after 8 hours.
  • the concentration of the anticancer agent appeared differently depending on the height of the hydrogel according to the time, and thus The cell death rate was different according to the exposure time and concentration [FIG. 15].
  • the E4 and E3 electrodes showed the greatest decrease in the capacitance value after 8 hours of 3D cell culture after treatment with the anticancer drug at the highest concentration and the longest time compared to the other parts. This means that cell death was shown in a short time.
  • the cells were observed in all the electrode parts before applying the hydrogel containing the anticancer agent, but 8 hours after applying the anticancer agent, the hydrogel containing the anticancer agent was placed on top of the hydrogel containing the cell. Almost no cell was identified at the top of the E4 electrode and relatively many cells were observed at the E1 electrode [FIG. 16].
  • hMSCs Human mesenchymal stem cells
  • Sodium algiate salt was dissolved in MEM culture medium at a concentration of 3% (w / w) to make an alginate solution.
  • SDF-1 ⁇ (200 ⁇ L, 100 ng / mL) was loaded into the hydrogel and placed on top of the alginate hydrogel containing hMSC for slow release (inset of FIG. 22A). SDF-1 ⁇ binds to the CXCR4 receptor and regulates MSC migration and cytokine secretion. Initially, because most of the cells were in the bottom layer, the capacitance of the lower layer measured using E1 was higher than that of the upper layer measured using E2, E3, or E4.
  • the capacitance of the top layer showed little change until 20 hours after loading, and then slowly increased with slow spontaneous migration of hMSCs.
  • the capacitance of the top layer increased sharply from about 24 hours after loading [Fig. 22A].
  • the capacitance of the underlying layer increased faster in the presence than in the absence of SDF-1 ⁇ . Since SDF-1 ⁇ is known to promote proliferation and migration, this result means that the information about the vertical movement of cells can obtain real-time capacitance with the biosensor of the present invention.
  • FIG. 22B shows fluorescence optical images of hMSC encapsulated hydrogel sliced horizontally with the stained nuclei after 32 hours of culture, depending on the presence of SDF-1 ⁇ . No cells were observed in the top layer before incubation. However, after 32 hours of incubation, live cells were observed in the upper layer, showing the cells moving upwards.

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Abstract

본 발명은 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 3차원 세포 배양 시 세포의 상태를 실시간으로 모니터링할 수 있는 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 한 쌍 이상의 전극부를 이용하여 3차원 세포 배양 시 전극 간 전기적 신호 변화를 측정함으로써 세포 존재 여부 및/또는 상태를 3차원적으로 실시간으로 모니터링할 수 있는 바이오센서, 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

3차원 세포 배양 실시간 모니터링 바이오센서
본 발명은 3차원 세포 배양 실시간 모니터링 바이오센서에 관한 것이다.
조직 재생 공학 및 의약품 개발이 활발해짐에 따라 생체 조직과 유사한 조건으로 in vitro 3차원 세포 배양에 대한 관심이 높아지고 있다. 3차원 세포 배양은 체내의 세포간의 다중 층(layer)을 만들어줌으로써 세포간의 3차원 상호작용(interaction)을 유도하여 체내 세포환경과 유사한 환경을 만들어 주는 세포 배양방법으로 약물이나 환경 변화에 따른 세포의 반응이 조직이나 장기의 반응 연구에 활용될 수 있다[Alison Abbott, Cell culture: Biology's new dimension Nature 424 (2003) 870-872]. 지금까지 널리 사용되어 온 2차원 세포 배양의 경우는 주로 광학현미경을 이용하여 배양되고 있는 세포의 상태를 관찰해왔다. 하지만 3차원 세포 배양의 경우는 광학현미경으로 세포의 상태를 관찰하는 데는 한계가 있기 때문에 실시간으로 세포의 상태를 모니터링할 수 없다.
이로서, 3차원 세포 배양 시 세포의 상태를 실시간으로 모니터링할 수 있는 새로운 바이오센서가 필요한 실정이다.
이에, 본 발명자들은 3차원 세포 배양 시 세포의 상태를 실시간으로 모니터링할 수 있는 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 한 쌍 이상의 전극부를 포함하며 세포로부터 전기적 신호를 획득하여 실시간 3차원 세포 배양 모니터링이 가능한 바이오센서를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 3차원 세포 배양 시 세포의 상태를 실시간으로 모니터링할 수 있는 바이오센서용 전극부, 이를 포함하는 바이오센서, 이의 제조방법, 상기 바이오센서를 이용한 세포 배양 모니터링 시스템 및 세포 배양 모닝터링 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은
기판과, 전기적 신호를 획득하도록 상기 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 작동 전극을 포함하는
실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서용 전극부를 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하며,
측정부는, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 및 제2 전극부를 포함하고,
제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며,
제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 기판의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오 센서를 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하는 센서 모듈, 및
상기 센서 모듈의 제어부와 전기적으로 연결되어 제어부로부터 출력되는 전기적 신호를 처리하는 처리 모듈을 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 시스템을 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은
상기 바이오센서를 이용하여 상기 측정부 내 작동 전극들 간의 전기적 신호를 실시한 측정하는 단계를 포함하는 3차원으로 배양된 세포 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은
세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 제1 및 제2 전극부를 포함하는 측정부를 형성하는 단계;
상기 측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 형성하는 단계; 및
상기 제1 및 제2 전극부를 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 고정시키고, 상기 제어부와 연결시키는 단계
를 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서는 생체 내 상태와 유사한 환경을 만들어 줄 수 있는 3차원 세포배양 실험 중, 실시간으로 전기적 신호 값의 변화를 측정함으로써 세포의 상태(성장, 사멸 그리고 3차원 구조 내에서의 주변 환경의 변화에 의한 세포의 이동 및 성장 속도의 변화) 등의 다양한 정보를 얻을 수 있다.
특히, 본 발명의 바이오센서는 다양한 전극의 수 및 전극부 간의 거리 조절로 3차원 형태의 하이드로젤 내의 넓은 범위를 측정할 수 있으며 단면의 측정 범위였던 일반적인 한 쌍의 전극부를 용기의 높이 방향으로도 전극을 제작하여 수직 방향의 측정이 가능하여 3차원 세포 배양에 따른 세포 상태를 실시간으로 모니터링 할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 실시간 모니터링 바이오센서용 전극부의 정면도이다.
도 2는 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 실시간 모니터링 바이오센서의 전극부로 사용되는 기판 및 전극 종류를 나타낸 것이다.
도 3은 3차원 세포 배양을 위한 알지네이트 하이드로젤을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 바이오센서 중 측정부와 전극부(a) 및 제작된 바이오센서[제어부+측정부](b)를 나타낸 것이다.
도 5는 2차원 세포 배양한 형광 유방암 세포를 형광이미지로 나타낸 것이다.
도 6은 3차원 세포 배양한 세포의 형광 유방암 세포를 광학이미지로 나타낸 것이다.
도 7은 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서에 사용되는 하나의 기판에 4개의 전극이 기판의 높이 방향에 따라 배열(하부에서 상부 방향)되어 형성된 것이다.
도 8은 세포가 균일하게 포함되어 있는 하이드로젤 내의 세포 성장 시간에 따른 커패시턴스 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 세포가 균일하게 포함되어 있는 하이드로젤 내의 세포 배양 전과 24 시간 후의 하이드로젤 내의 3차원 배양된 형광 세포를 광학이미지로 나타낸 것이다.
도 10은 아래쪽 반에만 세포가 포함되어 있는 하이드로젤(E1, E2) 내의 세포 성장 시간에 따른 커패시턴스 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 아래쪽 반에만 세포가 포함되어 있는 하이드로젤(E1, E2) 내의 세포 배양 전과 24시간 후의 3차원 세포 배양한 세포 상태를 형광이미지로 나타낸 것이다.
도 12는 3차원 세포 배양 중 항암제를 적용하는 2가지 방법을 나타낸 것이다[(a) 아래에서부터 용액으로 항암제 적용, (b) 항암제가 담지 된 하이드로젤을 이용하여 위에서부터 항암제 적용].
도 13은 3차원 세포 배양 중 아래에서부터 항암제 용액을 처리한 후, 실시간 커패시턴스 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 14는 아래에서부터 항암제 용액을 처리하고 8시간 뒤, 하이드로젤 내의 세포 사멸 상태를 형광이미지로 나타낸 것이다.
도 15는 3차원 세포 배양 중 항암제 담지 하이드로젤을 이용하여 항암제를 위에서부터 처리한 후, 실시간 커패시턴스 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 16은 항암제 담지 하이드로젤을 이용하여 항암제를 위에서부터 처리하고 8시간 뒤, 하이드로젤 내의 세포 사멸 상태를 형광이미지로 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서 및 3차원 세포 배양 시스템[점선 부위:측정부]을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서 중 전극부를 고정하는 제어부에 해당하는 하우징과 연결부에 해당하는 커넥터(connector)를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서를 거꾸로 놓아 찍은 사진으로, 제 1 전극부 및 제 2 전극부를 확대한 사진이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 바이오센서의 전극 패턴을 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 실시간 모니터링 시스템을 나타낸 것이다.
도 22a는 SDF-1α 존재 여부에 따라 배양된 hMSC-캡슐화된 하이드로젤에서 전극 1-4 (E1-E4)로 측정된 실시간 커패시턴스를 나타낸 것이고,
도 22b는 수평으로 슬라이스되고 DAPI로 염색된 hMSC-캡슐화된 하이드로겔의 형광 광학 이미지를 나타낸 것이며[배양 전(죄측 컬럼), 32시간 배양 후 SDF-1α 존재(우측 컬럼) SDF-1α 부재(중간 컬럼); scalebar: 200 μm],
도 22c는 하이드로젤의 7개 층에 hMSC 수를 나타내며, 세포 수는 SDF-1α 존재 여부에 따라 48시간 배양 후 수평으로 슬라이스되고 DAPI로 염색된 hMSC-캡슐화된 하이드로겔의 형광 광학 이미지로부터 카운터되었다.
본 발명은 기판과, 전기적 신호를 획득하도록 상기 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 작동 전극을 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서용 전극부에 관한 것이다.
첨부도면 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서용 전극부는 기판; 전기적 신호를 획득하도록 상기 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 작동 전극; 및 상기 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 연결 전극;을 포함할 수 있다.
상기 기판은 전극이 형성되어 있으며, 전극과 외부 출력부를 연결해 줄 수 있는 지지체 역할을 하며, 플렉시블한 기판을 포함할 수 있다. 상기 기판은 구체적으로 실리콘, PCB(printed circuit board), PET(polyethylene terephthalate), PES(polyether sulfone) 및 폴리이미드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 기판의 하부는 세포 배양 지지체에 닿아야 하는 부분으로, 하부 기판의 크기와 형태는 세포 지지체의 면적에 따라 달라질 수 있다.
상기 전기적 신호는 커패시턴스(capacitance), 컨덕턴스 (conductance) 및 임피던스(impedence)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 작동 전극은 기판 하부에 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열되어 형성되며, 모니터링하고자 하는 세포로부터 전기적 신호를 획득한다. 작동 전극이 기판의 높이 방향(H), 용기의 수직 배열로 형성됨으로써 3차원 세포 배양 모니터링이 가능하다.
상기 연결 전극은 기판 상부에 형성되며, 상기 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 복수 개의 작동 전극 각각과 전기적으로 연결되므로 작동 전극의 수와 동일하게 형성된다.
상기 전극(작동 전극 및 연결 전극)은 금속, 전도성 고분자, 다중벽탄소나노튜브(multi-walled carbon nanotube, MWCNT) 및 그래핀(grapheme)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 재질을 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 금속은 금, 백금 및 알루미늄로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 전도성 고분자는 PEDOT(Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) 및 Ppy(Polypyrrole)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 전극을 플렉시블 기판인 PET(polyethylene terephthalate), PES(polyether sulfone) 또는 폴리이미드(polyimide)를 사용하여 상기 전극부를 포토리쏘 공정을 통해 패터닝하여 플렉시블 형태로도 제작할 수 있다[도 2 참조].
상기 전극부는 전기적 신호 획득 시 세포의 오염을 막기 위하여, 오토클레이브 및/또는 에탄올로 살균하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 전극부의 작동 전극 크기는 폭(w)이 0.1 내지 2.5 mm이며, 길이(l)가 0.5 내지 1.5 mm이다. 크기가 상기 범위를 벗어나면 측정범위 내 분해능에 문제가 있고, 출력되는 전기신호의 간섭현상 등의 문제점이 있다. 또한, 3D 젤의 제작한 높이와 크기에 상응하는 측정 가능범위에 적절하기 때문에 전극 간의 간격(d)은 0.1 내지 1.5 mm 또는 0.1 내지 1.0 mm일 수 있다.
또한, 상기 전극부는 바이오센서로 활용되기 위하여 용기의 높이 방향에 따라 수직으로 세워지도록 고정하여 전기적 신호를 제어부로 출력하기 위해 도 1과 같이 연결 전극 사이에 고정용 홈을 제작할 수 있다. 또한, 상기 고정용 홈 대신 고정용 돌출부를 제작할 수도 있고 홈 또는 돌출부 없이 평탄한 기판 그대로 사용할 수도 있으며, 고정할 수 있는 형태라면 모두 사용 가능하다.
상기 전극부는 하부 기판의 작동 전극이 상부 기판의 연결 전극과 연결되어 제작된다. 첨부도면 도 7과 같이, 일 구현예로 제일 하단 작동 전극(E1)은 가장 오른쪽 연결 전극(C1)과, E1 위쪽의 작동 전극(E2)은 고정용 홈의 바로 옆 연결 전극(C2)과, E2 위쪽의 작동 전극(E3)은 C2 좌측 옆의 연결 전극(C3)과, E3 위쪽의 최상단 작동 전극(E4)는 가장 왼쪽 연결 전극(C4)와 연결되도록 제작할 수 있다. 상기 연결 전극이 제어부에 고정되면서 연결부(컨넥터)에 연결된다.
상기 전극부의 제조 방법은 다음과 같다.
첨부도면 도 7과 같이, 두 개의 판 각각에 전극의 전기회로를 패턴화한다. 전극과 하우징이 연결되는 부분을 절연시키기 위해 두 판 각각의 한쪽 면은 연결 부분을 패턴화하지 않는다[전극부는 두 개의 PCB 판의 결합으로 되어 있으며, 앞 PCB 판은 실제 하이드로젤에 접촉되는 부분으로 노출되어 있으나 하우징까지 연결되는 전극 부분은 뒷 PCB 판에 구성되어 있음.].
전기 회로의 패턴화는 작동 전극과 연결 전극이 연결되도록 한다. 즉, 제일 하단 작동 전극(E1)은 가장 오른쪽 연결 전극(C1)과, E1 위쪽의 작동 전극(E2)은 고정용 홈의 바로 옆 연결 전극(C2)과, E2 위쪽의 작동 전극(E3)은 C2 좌측 옆의 연결 전극(C3)과, E3 위쪽의 최상단 작동 전극(E4)는 가장 왼쪽 연결 전극(C4)와 연결되도록 패턴화할 수 있다.
상기 패턴한 부분을 적합한 재질의 전극으로 도금한 후, 고압으로 두 개의 판을 압축시켜 전극부를 제작한다.
본 발명은 또한, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하며,
측정부는, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 및 제2 전극부를 포함하고,
제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며,
제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 전극부의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서를 포함한다.
상기에서 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서용 전극부와 관련하여 기술한 모든 내용이 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서에 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.
본 발명에서, 측정부는 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 것으로, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 한 쌍(제1 전극부, 제2 전극부) 이상의 전극부를 포함할 수 있다.
상기 용기는 3차원 세포 배양 시스템일 수 있으며, 상기 세포 배양 시스템은 세포 및 배양 배지를 포함한다. 상기 배양 배지는 액상 배지 또는 세포 배양용 지지체일 수 있으며, 상기 지지체로는 생체 내 조직 상태와 가장 유사한 다중 층 형태를 가질 수 있는 하이드로젤이 바람직하나, 3차원 세포 배양이 가능한 것이라면 모두 사용 가능하다.
알지네이트, 콜라젠, 아가로스 등의 천연 생체 적합성 하이드로젤을 이용한 3차원 세포 배양은 면역세포, 줄기세포, 암세포 등 다양한 종류의 세포 배양에 적합할 뿐만 아니라 하이드로젤 내에 항암제, 세포 성장 인자, 신호 전달 물질 등을 자유롭게 적용할 수 있는 장점을 지니고 있다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 조직공학 등에서 상당히 오랜 기간 동안 널리 사용되고 있는 생체재료인 알지네이트 하이드로젤을 이용하여 하이드로젤 내에서 3차원 세포 배양 시 세포 상태를 실시간 관찰할 수 있다.
일 구현예로, 상기 제1 전극부는, 상기 제1 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제1 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제1 연결 전극을 포함하며,
제2 전극부는, 상기 제2 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제2 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제2 연결 전극을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 복수 개의 제1 작동 전극은, 상기 제1 기판 하부에 상기 제1 기판의 높이 방향을 따라 배열되고,
복수 개의 제2 작동 전극은, 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향을 따라 배열된다.
일 구현예로, 복수 개의 제1 연결 전극은, 상기 제1 기판 상부에 상기 제1 기판의 폭 방향(W)을 따라 제 1 작동 전극 수와 동일하게 배열되고,
복수 개의 제2 연결 전극은, 상기 제2 기판 상부에 상기 제2 기판의 폭 방향(W)을 따라 제 2 작동 전극 수와 동일하게 배열된다.
일 구현예로, 제1 작동 전극과 제 1 연결 전극은 제1 기판 내에서 전기적으로 연결되며, 제2 작동 전극과 제2 연결 전극은 제2 기판 내에서 전기적으로 연결된다.
일 구현예로, 제1 전극부의 제1 작동 전극과 제2 전극부의 제2 작동 전극은, 높이방향을 따라 각각 차례로 쌍으로 이루도록, 즉 복수 개의 제 1 작동 전극과 복수 개의 제 2 작동 전극 각각이 동일 높이에서 쌍을 이루도록 마련될 수 있다. 예를 들면, 첨부도면 도 20에서 제1 작동 전극 1~4와 제 2 작동 전극의 1~4가 각각 1-1, 2-2, 3-3, 4-4로 쌍을 이루도록 한다.
일 구현예로, 제1 전극부의 제1 작동전극과 제2 전극부의 제2 작동전극은, 높이방향을 따라 교차하여 쌍으로 이루도록, 즉 복수 개의 제 1 작동 전극과 복수 개의 제 2 작동 전극 각각이 서로 다른 높이에서 쌍을 이루도록 마련될 수 있다. 예를 들면, 첨부도면 도 20에서 제1 작동 전극 1~4와 제 2 작동 전극의 1~4가 각각 1-2, 2-1, 3-4, 4-3, 1-3, 2-4, 3-1, 4-2 등의 크로스 방향으로 쌍을 이루도록 마련될 수 있다.
LCR 미터기를 이용하여 출력되는 각각의 작동 전극의 순서를 변화하여 하이드로겔의 평행한 단면 외에 다른 각도에서의 하이드로겔 안의 상태를 전기적으로 측정할 수 있다(측정 쌍을 변화시켜 각도를 변형하듯 평행한 단면 외에 다른 면을 측정할 수 있다).
본 발명에서, 제어부는 세포에서 얻은 전기적 신호를 외부로 출력하는 역할을 하며, 전극부가 측정부에서 전기적 신호를 획득하기 위해 수직을 세워지도록 고정할 수 있다. 또한, 전기적 신호를 처리할 수 있는 처리 모듈의 입력 단자와 연결할 수 있는 연결부(도 18 참조)를 포함한다. 상기 연결부는 제어부의 상단에 위치할 수 있으며, 컨넥터를 의미한다.
본 발명은
용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하는 센서 모듈, 및
상기 센서 모듈의 제어부와 전기적으로 연결되어 제어부로부터 출력되는 전기적 신호를 처리하는 처리 모듈을 포함하며;
상기 측정부는, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 및 제2 전극부를 포함하고,
제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며,
제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 전극부의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 시스템에 관한 것이다.
상기 3차원 세포 배양 바이오센서용 전극부 및/또는 바이오센서와 관련하여 기술한 모든 내용은 3차원 세포 배양 모니터링 시스템에 적용 또는 준용될 수 있다.
상기 처리 모듈은 제어부로부터 출력된, 인덕턴스, 저항 및 캐퍼시턴스로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 전기적 신호를 처리하는 부위로, 예를 들면, LCR(Inductance(L)/Capacitance(C)/Resistance(R) 미터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 바이오센서를 이용하여 상기 측정부 내 작동 전극들 간의 전기적 신호를 실시간 측정하는 단계를 포함하는 3차원으로 배양된 세포 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법을 포함한다.
상기에서 3차원 세포 배양 모니터링 시스템과 관련하여 기술한 모든 내용은 3차원 세포 배양 모니터링 방법에 적용 또는 준용될 수 있다.
연결부에 의해 처리 모듈과 제어부가 연결되어 있어 전기적 신호를 처리할 수 있으므로 컴퓨터를 통해 모니터링 가능하다.
본 발명은 또한,
세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 제1 및 제2 전극부를 포함하는 측정부를 형성하는 단계;
상기 측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 형성하는 단계; 및
상기 제1 및 제2 전극부를 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 고정시키고, 상기 제어부와 연결시키는 단계
를 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서의 제조방법을 포함한다.
상기에서 바이오센서와 관련하여 기술한 모든 내용이 바이오센서의 제조방법에 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
1. 실험 방법
1-1. 3차원 세포 배양을 위한 하이드로젤 준비
알진산 나트륨염(Alginic acid sodium salt, low viscosity, Sigma, USA)을 3차원 세포 배양 배지 용액(10% fetal bovin serum. PAA, Somerset, UL), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 1% 훈기존(Fungizone, Gibco, UK), 2.25% HEPES, 2% L-글루타민이 포함된 MEM)을 이용하여 4 ℃에서 5%(w/w) 농도로 용해시켜 알지네이트 용액을 만들었다.
형광 유방암 세포(Fluorescent MCF-7)(연세대학교 의과대학 미생물학교실 면역학센터에서 입수, 5 X 105 개/ml)가 포함한 알지네이트 용액을 millicell® 안에 700 ㎕에 넣은 후, 100 mM CaCl2 MEM에 젤화시켰다. 37 ℃에서 3시간을 배양시킨 후, millicell® 을 3차원 세포 배양 MEM 용액으로 옮겨서 배양하면서 이미지를 측정하였다. 세포가 포함된 젤의 형태는 도 3과 같다.
1-2. 3차원 세포배양 바이오센서 제작 및 측정
도 4는 본 실시예에 사용된 전극의 모식도이다. PCB 기판 하부에 0.5 mm 간격의 작동 전극을 패턴한 후 전도성 금 도금을 하여 전극을 제작하였다(연결 전극은 1mm x 8mm 크기의 전극 4개임).
본 실험에 사용된 3차원 세포 배양 바이오센서의 전극 패턴의 치수는 도 4의 (a)와 같다. 3차원 세포 배양 관찰을 위한 커패시턴스 바이오센서는 4쌍의 다중 전극(multi-electrode[E1~E4])으로 구성되어 있다.
전극부의 제작 과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.
(1) 하단 가로 3 mm, 상단 가로 8 mm, 세로 26 mm 크기의 PCB 기판에 전자캐드 프로그램[AutoCAD, autodesk사이트에서 다운로드, OrCAD, orcad.com에서 다운로드]을 이용하여 도 7과 같이 판 A와 판 B에 각각 전극부의 전기회로를 패턴화하였다. 전극과 제어부(하우징)가 연결되는 부분을 절연시키기 위해 (앞서 설명한 바와 같이 PCB 두 판을 접합시켜 만든 전극이기 때문에) 판 A 및 판 B 각각의 한쪽 면에 연결 부분은 패턴화하지 않는다.
(2) 패턴한 부분을 금으로 도금한 후, 가열압착기(핫 프레서)로 판 A와 판 B를 압축시켜 전극부를 제작하였다(제 1 전극부 제작). 동일한 방법으로 전극부를 하나 더 제작하였다(제 2 전극부 제작).
(3) 제작된 2개의 전극부는 오토클레이브(autoclave) 장비 및 에탄올을 이용하여 살균하고 사용하여 측정하고자 하는 세포 이외의 균이 자라지 못하게 한다.
전극부와 출력부를 연결해주는 제어부에 해당하는 하우징 제작 과정은 다음과 같다.
(1) 하우징은 상판과 상판을 지지해 줄 수 있는 양 측면 금속판 세 부분으로 구성된다. 지지해주는 측면 부분은 두께 2 mm인 알루미늄 기판을 가로 6.8 cm, 세로 2 cm 길이로 2개와 가로 6.8cm, 세로 1.5 cm 길이의 기판 2개를 절단하여 준비하였다.
(2) 하우징의 상판은 크기가 가로 8.6 cm, 세로 4.5 cm이며, 4개의 전극부를 끼울 수 있는 PCB 기판과 측정장비(처리 모듈)를 연결할 수 있는 컨넥터(연결부)를 부착하였다[도 18].
(3) (1)에서 제작한 금속판과 (2)의 상판을 나사로 각각 연결하여 3면(윗면과 양 옆면)으로 이루어진 하우징을 조립하였다.
세포 배양은 일반적인 방법으로 37 ℃ 항온 및 항습 이산화탄소 5%를 유지해주는 인큐베이터 안에서 이루어지며, 세포 배양 동안 실시간으로 커패시턴스를 측정하였다.
측정과정은 다음과 같다.
(1) 세포가 포함된 하이드로젤의 형태는 도 3과 같다. 하우징의 상판에 제작한 전극부를 연결하였다.
(2) LAB-TEK well에 DMEM 배지를 2 ml을 준비하고 도 3의 젤을 놓아 준비하였다.
(3) 하우징에 연결된 전극부를 well에 놓여있는 젤 위에 수직으로 놓고 아래로 눌러 고정시켰다(도 4의 (b)).
(4) 인큐베이터에 하우징과 젤을 포함한 웰(측정부)를 넣고 하우징 상판에 위치한 컨넥터에 라인을 연결하고 LCR 미터에 나머지 부분을 연결하였다(도 21 참조).
본 실험에서 사용된 세포는 하이드로젤 안에서 배양되는 3차원 세포 배양 시스템 상에서 5%의 이산화탄소가 용존되어 있을 수 있게 5 X 105 cell/ml 세포 수와 하이드로젤의 1~30% 농도를 조절하여 배양하면서 커패시턴스를 측정하였다. 제작된 3차원 세포 배양용 바이오센서는 LCR 미터를 이용하여 측정하였다. 측정을 위해서는 스캐너(Agilent 34970A)를 사용하였다.
3차원 세포 배양을 마치고 난 뒤, 하이드로젤을 현미경 관찰이 용이하게 최대한 얇은 두께(100 ㎛)의 슬라이스로 만들어 형광현미경으로 세포의 위치 및 세포의 상태를 확인하였다.
1-3. 2차원 세포 배양과 3차원 세포 배양
형광 유방암 세포를 24 웰을 이용해서 37 ℃에서 24시간 2차원 세포 배양 후, 세포 모양을 형광현미경으로 관찰하였다. 2차원 플레이트 위에서 성장하였을 경우, 세포들이 한층 또는 2층의 layer로 길게 뻗으면서 성장하는 것을 관찰하였다.
형광 유방암 세포를 알지네이트 하이드로젤을 이용하여 37 ℃에서 24시간 3차원 세포 배양 후, 세포 모양을 형광현미경으로 관찰하였다. 3차원 알지네이트 하이드로젤 내에서 배양된 세포는 2차원 세포 배양된 세포 모양과는 다르게 둥근 모양으로 세포들이 뭉쳐서 자라는 것을 관찰하였다.
2. 실험 결과
2-1. 하이드로젤을 이용한 3차원 배양 조건의 세포 성장 측정
형광 유방암 세포(MCF-7) 5x105 cell/ml을 포함한 하이드로젤을 37 ℃에서 12시간 동안 커패시턴스를 측정하고 하이드로젤 내의 세포의 상태를 확인하였다. 또한, 커패시턴스를 측정할 수 있는 작동 전극을 도 7에서 보여주듯이 4개의 위치(E1~E4)로 나누어서 하이드로젤 내의 세포 성장 속도를 측정해 보았다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 세포가 포함된 하이드로젤에서는 세포들이 성장하는 동안 각 전극들에서 세포가 포함되지 않은 하이드로젤(회색 점선)보다 더 높은 커패시턴스 값을 보였다. 또한, 각 위부터 아래의 4개의 전극들 사이 유사한 커패시턴스 값을 보여 하이드로젤 내에서 세포들이 일정의 양으로 성장하는 것 또한 유추할 수 있었다.
형광 현미경으로 확인한 결과, 3차원 세포 배양하기 전에는 하이드로젤 내에 작은 양의 세포가 관찰되었으나, 24시간 후 세포 성장에 따른 많은 세포들이 하이드로젤 전체에서 관찰되었다[도 9]. 위의 커패시턴스 변화 결과랑 비교하였을 때, 24시간 후, 모든 전극에서의 커패시턴스의 유사한 레벨 및 변화 경향과 일치하였다.
2-2. 3차원 세포 배양 중 세포들의 증식에 따른 세포 분포 측정
본 실시예에서는 하이드로젤의 50% 부분에만 형광 유방암세포(MCF-7) 5x105 cell/ml을 포함된 하이드로젤을 배치하고, 세포가 포함되지 않은 하이드로젤을 그 위에 배치한 후, 37 ℃에서 24시간 동안 배양하면서 실시간으로 커패시턴트의 값을 측정하였다. 도 10에서 보여주듯이, 배양을 시작한 후, 8시간이 지난 다음, 세포가 포함되어 있는 하이드로로젤을 측정하는 E1 전극 및 E2 전극에서 커패시턴스 값이 일정해짐을 보였다. 그리고 세포를 포함하고 있지 않던 하이드로젤을 측정하고 있던 E3 전극 및 E4 전극의 커패시턴스 값이 크게 증가하면서 24시간 측정 후, 거의 유사한 값을 보였다. 이는 하이드로젤 내에서 시간에 따라 세포의 성장이 위로 향해 증식했다는 것을 확인할 수 있었다.
형광 현미경으로 확인한 결과, 커패시턴스를 측정하기 전에는 하이드로젤 아래 부분(E1 전극과 E2 전극)에서만 세포가 관찰되었지만, 24시간 3차원 세포 배양 후에는 하이드로젤 위 부분(E3 전극와 E4 전극)에서도 세포가 관찰되었다[도 11].
2-3. 3차원 세포 배양에서의 항암제에 의한 세포사멸
3차원 유방암 세포 배양 과정 중 항암제(doxorubicin)을 처리하여 세포의 사멸을 유도한 후, 커패시턴스 값의 변화를 실시간으로 관찰하였다. 항암제는 2가지 방법으로 처리하였다.
1) 항암제 용액으로 하이드로젤에 침투시키는 방법 (도 12의 (a))
DOX 100 ug을 1ml 배지 용액에 용해시켰다.
세포가 포함된 하이드로젤을 배양 후, 여기에 상기 항암제가 포함된 배지 용액 1 ml을 보충하였다.
2) 항암제가 담지된 하이드로젤을 세포가 포함된 하이드로젤의 위에 배치하여 항암제가 하이드로젤의 윗부분부터 시간에 따라 농도의 차이가 생기게 침투시키는 방법 (도 12의 (b))
DOX 100 ug을 1ml 알지네이트 용액(alginate solution)에 4 ℃에서 24시간 용해시킨 후, 100 mM CaCl2 용액에 떨어뜨려 DOX가 담지된 하이드로젤을 만들었다
상기 DOX가 담지된 하이드로젤을 세포가 포함된 하이드록젤 위에 얹어주었다.
즉, 항암제가 담지된 하이드로젤(100ng/ml)를 세포가 배양되고 있는 하이드로젤 위에 두어, 항암제가 세포가 배양되고 있는 하이드로젤로 서서히 침투하도록 하였다.
항암제 용액을 이용한 경우(도 12의 (a)), 하이드로젤 아래 E1 및 E2 전극에 있는 세포들에게 항암제가 영향을 미쳐 세포들이 빠른 속도로 사멸해가는 것을 확인할 수 있었다[도 13]. 도 13에서 사용한 젤은 두 부분으로 나누어진다. 세포를 넣은 하이드로젤과 항암제를 담지하고 있는 하이드로젤을 준비하였다. 측정 전 세포가 포함되어 있는 하이드로젤에 항암제가 담지되어 있는 하이드로젤을 얹은 후 측정을 시작하였다. 상대적으로 하이드로젤 위 E3 및 E4 전극에 있는 세포들에게는 항암제가 크게 영향을 미치지 못하여 8시간 이후 서서히 세포 사멸이 진행됨을 관찰할 수 있었다.
형광 현미경으로 확인한 결과, 항암제 용액을 처리하기 전에는 모든 전극 부분에서 세포들이 관찰되었지만, 항암제 용액을 처리하고 난 뒤에는 하이드로젤 아랫 부분(E1 및 E2 전극)에서의 세포사멸이 관찰되었다[도 14]. 그리고 하이드로젤 윗 부분(E3 및 E4 전극)에서는 살아있는 세포의 형광이 유지됨을 알 수 있었다.
항암제가 담지된 하이드로젤을 이용하여 세포가 배양 중인 하이드로젤에 항암제를 적용하였을 경우[도 12의 (b)], 시간에 따라서 하이드로젤의 높이에 따라 항암제의 농도가 다르게 나타나고, 그에 따라 항암제의 노출시간 및 농도에 따라서 세포 사멸 속도의 차이를 보였다[도 15]. 하이드로젤의 윗부분인 E4 및 E3 전극의 경우, 다른 부분에 비해 가장 높은 농도와 가장 오랜 시간 동안 항암제에 노출되어 항암제를 처리하고 난 뒤 3차원 세포 배양 8시간쯤 가장 큰 커패시턴스 값의 감소를 보였고, 이는 빠른 시간에 세포 사멸을 보인 것을 의미한다.
형광 현미경으로 확인한 결과, 항암제가 포함된 하이드로젤을 적용하기 전에는 모든 전극 부분에서 세포가 관찰되었지만, 항암제가 포함된 하이드로젤을 세포가 포함된 하이드로젤의 윗부분에 놓고 항암제를 적용시키고 8시간 후에는 가장 윗부분인 E4 전극에서는 세포를 거의 확인할 수 없었고 E1 전극에서는 비교적 많은 세포들을 관찰할 수 있었다[도 16].
2-4. 3차원 세포 배양 중 실시간 세포의 이동 측정
인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)는 연세 세포 치료 센터로부터 입수하였으며, 2% B27(Life Technologies, Grand Island, NY, USA), EGF(20 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MNUSA), 및 FGF-2(20 ng/mL; R&D Systems)이 보충된 MEM-F12 포함 MEM에서 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다.
알지산 나트륨염은 MEM 배양 배지로 3%(w/w) 농도로 용해시켜 알지네이트 용액을 만들었다.
세포 이동을 3D 바이오센서로 모니터링하기 위해, 용기 하부층에는 5 X 104 cell/mL hMSC가 있고 상부 층에는 거의 세포가 있지 않은 3%(w/w)의 알지네이트 하이드로겔을 준비하였다[도 22a의 삽입도]. 재조합 인간 SDF-1α(Prospec-Tany Techno Gene Ltd., Ness-Ziona, Israel) 존재 여부에 따라 세포를 배양하면서 E1-E4의 실시간 커패시턴스를 측정하였다.
SDF-1α(200 μL, 100 ng/mL)는 하이드로젤 내로 로딩하고 hMSC가 포함된 알지네이트 하이드로젤 상단에 놓아 서서히 방출되도록 하였다 [도 22a의 삽입도]. SDF-1α는 CXCR4 수용체에 결합하고, MSC 이동 및 사이토카인 분비를 조절한다. 초기에는 대부분의 세포가 바닥층에 존재하므로 E1을 사용하여 측정된 하부층의 커패시턴스가 E2, E3, 또는 E4를 사용하여 측정된 상부층의 커패시턴스 보다 높았다.
SDF-1α의 부재 하에서 배양된 hMSCs에 대해, 상부층의 커패시턴스는 로딩 후 20시간까지 거의 변화가 없었으며, 이후 hMSCs의 저속 자발적인 이동으로 서서히 증가하였다. 그러나, SDF-1α의 존재 하에서, 상부층의 커패시턴스는 로딩 후 약 24시간부터 급격히 증가하였다[도 22a]. 또한, 하부층의 커패시턴스는 SDF-1α의 부재 시 보다 존재 시 더 빠르게 증가하였다. SDF-1α가 증식과 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 결과는 세포의 수직 이동에 대한 정보는 본 발명의 바이오센서로 실시간 커패시턴스를 얻을 수 있음을 의미한다.
도 22b는 SDF-1α 존재 여부에 따라 배양 32시간 후, 염색된 핵과 수평으로 슬라이스된 hMSC 캡슐화된 하이드로겔의 형광 광학 이미지를 나타낸 것이다. 배양 전에 어떠한 세포도 상부층에서 관찰되지 않았다. 그러나 배양 32시간 후, 세포가 위쪽으로 이동하는 것이 나타나면서 살아있는 세포가 상부층에서 관찰되었다.
또한, SDF-1α에 의한 세포 증식 및 이동의 증가로 인해 SDF-1α의 존재 하에서 모든 층에서 높은 세포 밀도를 확인하였다[도 22c].
이러한 결과는 도 22a에 나타낸 실시간 커패시턴스 데이터와 일치하며, 그 세포 이동이 본 발명의 바이오센서로 실시간 모니터링할 수 있음을 보여준다.
[부호의 설명]
10: 전극부
1: 기판 2: 작동 전극 3: 연결 전극
H: 기판의 높이 방향 W: 기판의 폭 방향
d: 작동 전극 간의 간격
ℓ: 작동 전극의 길이 w: 작동 전극의 폭

Claims (26)

  1. 기판과, 전기적 신호를 획득하도록 상기 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 작동 전극을 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서용 전극부.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 연결 전극을 포함하는 바이오센서용 전극부.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 기판은 실리콘, PCB(printed circuit board), PET(polyethylene terephthalate), PES(polyether sulfone) 및 폴리이미드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 바이오센서용 전극부.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 전극은 금속, 전도성 고분자, 다중벽탄소나노튜브(multi-walled carbon nanotube, MWCNT) 및 그래핀(graphene)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 재질을 갖는 바이오센서용 전극부.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 작동 전극 크기는 폭(w)이 0.1 내지 2.5 mm이며, 길이(l)가 0.5 내지 1.5 mm인 바이오센서용 전극부.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 작동 전극 간의 간격(d)은 0.1 내지 1.5 mm인 바이오센서용 전극부.
  7. 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
    측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하며,
    측정부는, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 전극부 및 제2 전극부를 포함하고,
    제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며,
    제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 기판의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오 센서.
  8. 제 7 항에 있어서,
    제1 전극부는, 상기 제1 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제1 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제1 연결 전극을 포함하며,
    제2 전극부는, 상기 제2 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제2 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제2 연결 전극을 포함하는 바이오 센서,
  9. 제 7 항에 있어서,
    복수 개의 제1 연결 전극은, 상기 제1 기판 상부에 상기 제1 기판의 폭 방향(W)을 따라 제 1 작동 전극 수와 동일하게 배열되고,
    복수 개의 제2 연결 전극은, 상기 제2 기판 상부에 상기 제2 기판의 폭 방향(W)을 따라 제 2 작동 전극 수와 동일하게 배열되는 바이오 센서.
  10. 제 7 항에 있어서,
    제1 및 제2 작동 전극과 제1 및 제2 연결 전극은 각각 제1 및 제2 기판 내에서 전기적으로 연결되는 바이오 센서.
  11. 제 7 항에 있어서,
    제1 전극부의 제1 작동전극과 제2 전극부의 제2 작동전극은, 높이방향을 따라 각각 차례로 쌍으로 이루도록 마련된 바이오 센서.
  12. 제 7 항에 있어서,
    제1 전극부의 제1 작동전극과 제2 전극부의 제2 작동전극은, 높이방향을 따라 교차하여 쌍으로 이루도록 마련된 바이오 센서.
  13. 제 7 항에 있어서,
    상기 전기적 신호는 커패시턴스(capacitance), 컨덕턴스(conductance) 및 임피던스(impedence)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 바이오센서.
  14. 제 7 항에 있어서,
    상기 기판은 실리콘, PCB(printed circuit board), PET(polyethylene terephthalate), PES(polyether sulfone) 및 폴리이미드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 바이오센서.
  15. 제 7 항에 있어서,
    상기 전극은 금속, 전도성 고분자, 다중벽탄소나노튜브(multi-walled carbon nanotube, MWCNT) 및 그래핀(graphene)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 재질을 갖는 바이오센서.
  16. 제 7 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 작동 전극 크기는 폭(w)이 0.1 내지 2.5 mm이며, 길이(l)가 0.5 내지 1.5 mm인 바이오센서.
  17. 제 7 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 작동 전극 간의 간격(d)은 0.1 내지 1.5 mm인 바이오센서.
  18. 제 7 항에 있어서,
    상기 용기는 세포 및 배양 배지를 포함하는 바이오센서.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 배양 배지는 세포 배양용 지지체인 바이오센서
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 지지체는 하이드로 젤인 바이오센서.
  21. 제 7 항에 있어서,
    상기 측정부는 한 쌍 이상의 전극부를 포함하는 바이오센서.
  22. 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
    측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하는 센서 모듈, 및
    상기 센서 모듈의 제어부와 전기적으로 연결되어 제어부로부터 출력되는 전기적 신호를 처리하는 처리 모듈을 포함하며;
    상기 측정부는, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 및 제2 전극부를 포함하고,
    제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며,
    제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 기판의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 시스템.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 처리 모듈은 인덕턴스, 저항 및 캐퍼시턴스로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 전기적 신호를 처리하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 시스템.
  24. 제 7 항의 바이오센서를 이용하여 상기 측정부 내 작동 전극들 간의 전기적 신호를 실시간 측정하는 단계를 포함하는 3차원으로 배양된 세포 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  25. 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 제1 및 제2 전극부를 포함하는 측정부를 형성하는 단계;
    상기 측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 형성하는 단계; 및
    상기 제1 및 제2 전극부를 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 고정시키고, 상기 제어부와 연결시키는 단계
    를 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서의 제조방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며,
    상기 제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 기판의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하는 바이오센서의 제조방법.
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