KR101777509B1 - ３차원 세포 배양 실시간 모니터링 바이오센서 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 3차원 세포 배양 시 세포의 상태를 실시간으로 모니터링할 수 있는 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 한 쌍 이상의 전극부를 이용하여 3차원 세포 배양 시 전극 간 전기적 신호 변화를 측정함으로써 세포 존재 여부 및/또는 상태를 3차원적으로 실시간으로 모니터링할 수 있는 바이오센서, 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

３차원 세포 배양 실시간 모니터링 바이오센서{Biosensor for real-time monitoring 3D cell culture}
본 발명은 3차원 세포 배양 실시간 모니터링 바이오센서에 관한 것이다.
조직 재생 공학 및 의약품 개발이 활발해짐에 따라 생체 조직과 유사한 조건으로 in vitro 3차원 세포 배양에 대한 관심이 높아지고 있다. 3차원 세포 배양은 체내의 세포간의 다중 층(layer)을 만들어줌으로써 세포간의 3차원 상호작용(interaction)을 유도하여 체내 세포환경과 유사한 환경을 만들어 주는 세포 배양방법으로 약물이나 환경 변화에 따른 세포의 반응이 조직이나 장기의 반응 연구에 활용될 수 있다[비특허문헌 1]. 지금까지 널리 사용되어 온 2차원 세포 배양의 경우는 주로 광학현미경을 이용하여 배양되고 있는 세포의 상태를 관찰해왔다. 하지만 3차원 세포 배양의 경우는 광학현미경으로 세포의 상태를 관찰하는 데는 한계가 있기 때문에 실시간으로 세포의 상태를 모니터링할 수 없다.
이로서, 3차원 세포 배양 시 세포의 상태를 실시간으로 모니터링할 수 있는 새로운 바이오센서가 필요한 실정이다.
Alison Abbott, Cell culture: Biology's new dimension Nature 424 (2003) 870-872
이에, 본 발명자들은 3차원 세포 배양 시 세포의 상태를 실시간으로 모니터링할 수 있는 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 한 쌍 이상의 전극부를 포함하며 세포로부터 전기적 신호를 획득하여 실시간 3차원 세포 배양 모니터링이 가능한 바이오센서를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 3차원 세포 배양 시 세포의 상태를 실시간으로 모니터링할 수 있는 바이오센서용 전극부, 이를 포함하는 바이오센서, 이의 제조방법, 상기 바이오센서를 이용한 세포 배양 모니터링 시스템 및 세포 배양 모닝터링 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 과제를 해결하기 위한 수단으로서, 본 발명은
기판과, 전기적 신호를 획득하도록 상기 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 작동 전극을 포함하는
실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서용 전극부를 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 다른 수단으로서, 본 발명은 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하며,
측정부는, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 및 제2 전극부를 포함하고,
제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며,
제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 기판의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오 센서를 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하는 센서 모듈, 및
상기 센서 모듈의 제어부와 전기적으로 연결되어 제어부로부터 출력되는 전기적 신호를 처리하는 처리 모듈을 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 시스템을 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은
상기 바이오센서를 이용하여 상기 측정부 내 작동 전극들 간의 전기적 신호를 실시한 측정하는 단계를 포함하는 3차원으로 배양된 세포 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법을 제공한다.
또한, 상기 과제를 해결하기 위한 또 다른 수단으로서, 본 발명은
세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 제1 및 제2 전극부를 포함하는 측정부를 형성하는 단계;
상기 측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 형성하는 단계; 및
상기 제1 및 제2 전극부를 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 고정시키고, 상기 제어부와 연결시키는 단계
를 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서는 생체 내 상태와 유사한 환경을 만들어 줄 수 있는 3차원 세포배양 실험 중, 실시간으로 전기적 신호 값의 변화를 측정함으로써 세포의 상태(성장, 사멸 그리고 3차원 구조 내에서의 주변 환경의 변화에 의한 세포의 이동 및 성장 속도의 변화) 등의 다양한 정보를 얻을 수 있다.
특히, 본 발명의 바이오센서는 다양한 전극의 수 및 전극부 간의 거리 조절로 3차원 형태의 하이드로젤 내의 넓은 범위를 측정할 수 있으며 단면의 측정 범위였던 일반적인 한 쌍의 전극부를 용기의 높이 방향으로도 전극을 제작하여 수직 방향의 측정이 가능하여 3차원 세포 배양에 따른 세포 상태를 실시간으로 모니터링 할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 실시간 모니터링 바이오센서용 전극부의 정면도이다.
도 2는 본 발명에 따른 3차원 세포 배양 실시간 모니터링 바이오센서의 전극부로 사용되는 기판 및 전극 종류를 나타낸 것이다.
도 3은 3차원 세포 배양을 위한 알지네이트 하이드로젤을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 바이오센서 중 측정부와 전극부(a) 및 제작된 바이오센서[제어부+측정부](b)를 나타낸 것이다.
도 5는 2차원 세포 배양한 형광 유방암 세포를 형광이미지로 나타낸 것이다.
도 6은 3차원 세포 배양한 세포의 형광 유방암 세포를 광학이미지로 나타낸 것이다.
도 7은 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서에 사용되는 하나의 기판에 4개의 전극이 기판의 높이 방향에 따라 배열(하부에서 상부 방향)되어 형성된 것이다.
도 8은 세포가 균일하게 포함되어 있는 하이드로젤 내의 세포 성장 시간에 따른 커패시턴스 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 세포가 균일하게 포함되어 있는 하이드로젤 내의 세포 배양 전과 24 시간 후의 하이드로젤 내의 3차원 배양된 형광 세포를 광학이미지로 나타낸 것이다.
도 10은 아래쪽 반에만 세포가 포함되어 있는 하이드로젤(E1, E2) 내의 세포 성장 시간에 따른 커패시턴스 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 아래쪽 반에만 세포가 포함되어 있는 하이드로젤(E1, E2) 내의 세포 배양 전과 24시간 후의 3차원 세포 배양한 세포 상태를 형광이미지로 나타낸 것이다.
도 12는 3차원 세포 배양 중 항암제를 적용하는 2가지 방법을 나타낸 것이다[(a) 아래에서부터 용액으로 항암제 적용, (b) 항암제가 담지 된 하이드로젤을 이용하여 위에서부터 항암제 적용].
도 13은 3차원 세포 배양 중 아래에서부터 항암제 용액을 처리한 후, 실시간 커패시턴스 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 14는 아래에서부터 항암제 용액을 처리하고 8시간 뒤, 하이드로젤 내의 세포 사멸 상태를 형광이미지로 나타낸 것이다.
도 15는 3차원 세포 배양 중 항암제 담지 하이드로젤을 이용하여 항암제를 위에서부터 처리한 후, 실시간 커패시턴스 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 16은 항암제 담지 하이드로젤을 이용하여 항암제를 위에서부터 처리하고 8시간 뒤, 하이드로젤 내의 세포 사멸 상태를 형광이미지로 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서 및 3차원 세포 배양 시스템[점선 부위:측정부]을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서 중 전극부를 고정하는 제어부에 해당하는 하우징과 연결부에 해당하는 커넥터(connector)를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서를 거꾸로 놓아 찍은 사진으로, 제 1 전극부 및 제 2 전극부를 확대한 사진이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 바이오센서의 전극 패턴을 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 3차원 세포 배양 실시간 모니터링 시스템을 나타낸 것이다.
도 22의 (a)는 SDF-1α 존재 여부에 따라 배양된 hMSC-캡슐화된 하이드로젤에서 전극 1-4 (E1-E4)로 측정된 실시간 커패시턴스를 나타낸 것이고, (b)는 수평으로 슬라이스되고 DAPI로 염색된 hMSC-캡슐화된 하이드로겔의 형광 광학 이미지를 나타낸 것이며[배양 전(죄측 컬럼), 32시간 배양 후 SDF-1α 존재(우측 컬럼) SDF-1α 부재(중간 컬럼); scalebar: 200 μm], (c) 하이드로젤의 7개 층에 hMSC 수를 나타내며, 세포 수는 SDF-1α 존재 여부에 따라 48시간 배양 후 수평으로 슬라이스되고 DAPI로 염색된 hMSC-캡슐화된 하이드로겔의 형광 광학 이미지로부터 카운터되었다.
본 발명은 기판과, 전기적 신호를 획득하도록 상기 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 작동 전극을 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서용 전극부에 관한 것이다.
첨부도면 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서용 전극부는 기판; 전기적 신호를 획득하도록 상기 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 작동 전극; 및 상기 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 연결 전극;을 포함할 수 있다.
상기 기판은 전극이 형성되어 있으며, 전극과 외부 출력부를 연결해 줄 수 있는 지지체 역할을 하며, 플렉시블한 기판을 포함할 수 있다. 상기 기판은 구체적으로 실리콘, PCB(printed circuit board), PET(polyethylene terephthalate), PES(polyether sulfone) 및 폴리이미드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 기판의 하부는 세포 배양 지지체에 닿아야 하는 부분으로, 하부 기판의 크기와 형태는 세포 지지체의 면적에 따라 달라질 수 있다.
상기 전기적 신호는 커패시턴스(capacitance), 컨덕턴스 (conductance) 및 임피던스(impedence)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 작동 전극은 기판 하부에 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열되어 형성되며, 모니터링하고자 하는 세포로부터 전기적 신호를 획득한다. 작동 전극이 기판의 높이 방향(H), 용기의 수직 배열로 형성됨으로써 3차원 세포 배양 모니터링이 가능하다.
상기 연결 전극은 기판 상부에 형성되며, 상기 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 복수 개의 작동 전극 각각과 전기적으로 연결되므로 작동 전극의 수와 동일하게 형성된다.
상기 전극(작동 전극 및 연결 전극)은 금속, 전도성 고분자, 다중벽탄소나노튜브(multi-walled carbon nanotube, MWCNT) 및 그래핀(grapheme)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 재질을 갖는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 금속은 금, 백금 및 알루미늄로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다. 상기 전도성 고분자는 PEDOT(Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) 및 Ppy(Polypyrrole)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 전극을 플렉시블 기판인 PET(polyethylene terephthalate), PES(polyether sulfone) 또는 폴리이미드(polyimide)를 사용하여 상기 전극부를 포토리쏘 공정을 통해 패터닝하여 플렉시블 형태로도 제작할 수 있다[도 2 참조].
상기 전극부는 전기적 신호 획득 시 세포의 오염을 막기 위하여, 오토클레이브 및/또는 에탄올로 살균하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 전극부의 작동 전극 크기는 폭(w)이 0.1 내지 2.5 mm이며, 길이(l)가 0.5 내지 1.5 mm이다. 크기가 상기 범위를 벗어나면 측정범위 내 분해능에 문제가 있고, 출력되는 전기신호의 간섭현상 등의 문제점이 있다. 또한, 3D 젤의 제작한 높이와 크기에 상응하는 측정 가능범위에 적절하기 때문에 전극 간의 간격(d)은 0.1 내지 1.5 mm 또는 0.1 내지 1.0 mm일 수 있다.
또한, 상기 전극부는 바이오센서로 활용되기 위하여 용기의 높이 방향에 따라 수직으로 세워지도록 고정하여 전기적 신호를 제어부로 출력하기 위해 도 1과 같이 연결 전극 사이에 고정용 홈을 제작할 수 있다. 또한, 상기 고정용 홈 대신 고정용 돌출부를 제작할 수도 있고 홈 또는 돌출부 없이 평탄한 기판 그대로 사용할 수도 있으며, 고정할 수 있는 형태라면 모두 사용 가능하다.
상기 전극부는 하부 기판의 작동 전극이 상부 기판의 연결 전극과 연결되어 제작된다. 첨부도면 도 7과 같이, 일 구현예로 제일 하단 작동 전극(E1)은 가장 오른쪽 연결 전극(C1)과, E1 위쪽의 작동 전극(E2)은 고정용 홈의 바로 옆 연결 전극(C2)과, E2 위쪽의 작동 전극(E3)은 C2 좌측 옆의 연결 전극(C3)과, E3 위쪽의 최상단 작동 전극(E4)는 가장 왼쪽 연결 전극(C4)와 연결되도록 제작할 수 있다. 상기 연결 전극이 제어부에 고정되면서 연결부(컨넥터)에 연결된다.
상기 전극부의 제조 방법은 다음과 같다.
첨부도면 도 7과 같이, 두 개의 판 각각에 전극의 전기회로를 패턴화한다. 전극과 하우징이 연결되는 부분을 절연시키기 위해 두 판 각각의 한쪽 면은 연결 부분을 패턴화하지 않는다[전극부는 두 개의 PCB 판의 결합으로 되어 있으며, 앞 PCB 판은 실제 하이드로젤에 접촉되는 부분으로 노출되어 있으나 하우징까지 연결되는 전극 부분은 뒷 PCB 판에 구성되어 있음.].
전기 회로의 패턴화는 작동 전극과 연결 전극이 연결되도록 한다. 즉, 제일 하단 작동 전극(E1)은 가장 오른쪽 연결 전극(C1)과, E1 위쪽의 작동 전극(E2)은 고정용 홈의 바로 옆 연결 전극(C2)과, E2 위쪽의 작동 전극(E3)은 C2 좌측 옆의 연결 전극(C3)과, E3 위쪽의 최상단 작동 전극(E4)는 가장 왼쪽 연결 전극(C4)와 연결되도록 패턴화할 수 있다.
상기 패턴한 부분을 적합한 재질의 전극으로 도금한 후, 고압으로 두 개의 판을 압축시켜 전극부를 제작한다.
본 발명은 또한, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하며,
측정부는, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 및 제2 전극부를 포함하고,
제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며,
제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 전극부의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서를 포함한다.
상기에서 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서용 전극부와 관련하여 기술한 모든 내용이 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서에 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.
본 발명에서, 측정부는 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 것으로, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 한 쌍(제1 전극부, 제2 전극부) 이상의 전극부를 포함할 수 있다.
상기 용기는 3차원 세포 배양 시스템일 수 있으며, 상기 세포 배양 시스템은 세포 및 배양 배지를 포함한다. 상기 배양 배지는 액상 배지 또는 세포 배양용 지지체일 수 있으며, 상기 지지체로는 생체 내 조직 상태와 가장 유사한 다중 층 형태를 가질 수 있는 하이드로젤이 바람직하나, 3차원 세포 배양이 가능한 것이라면 모두 사용 가능하다.
알지네이트, 콜라젠, 아가로스 등의 천연 생체 적합성 하이드로젤을 이용한 3차원 세포 배양은 면역세포, 줄기세포, 암세포 등 다양한 종류의 세포 배양에 적합할 뿐만 아니라 하이드로젤 내에 항암제, 세포 성장 인자, 신호 전달 물질 등을 자유롭게 적용할 수 있는 장점을 지니고 있다. 특히, 본 발명의 실시예에서는 조직공학 등에서 상당히 오랜 기간 동안 널리 사용되고 있는 생체재료인 알지네이트 하이드로젤을 이용하여 하이드로젤 내에서 3차원 세포 배양 시 세포 상태를 실시간 관찰할 수 있다.
일 구현예로, 상기 제1 전극부는, 상기 제1 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제1 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제1 연결 전극을 포함하며,
제2 전극부는, 상기 제2 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제2 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제2 연결 전극을 포함할 수 있다.
일 구현예로, 복수 개의 제1 작동 전극은, 상기 제1 기판 하부에 상기 제1 기판의 높이 방향을 따라 배열되고,
복수 개의 제2 작동 전극은, 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향을 따라 배열된다.
일 구현예로, 복수 개의 제1 연결 전극은, 상기 제1 기판 상부에 상기 제1 기판의 폭 방향(W)을 따라 제 1 작동 전극 수와 동일하게 배열되고,
복수 개의 제2 연결 전극은, 상기 제2 기판 상부에 상기 제2 기판의 폭 방향(W)을 따라 제 2 작동 전극 수와 동일하게 배열된다.
일 구현예로, 제1 작동 전극과 제 1 연결 전극은 제1 기판 내에서 전기적으로 연결되며, 제2 작동 전극과 제2 연결 전극은 제2 기판 내에서 전기적으로 연결된다.
일 구현예로, 제1 전극부의 제1 작동 전극과 제2 전극부의 제2 작동 전극은, 높이방향을 따라 각각 차례로 쌍으로 이루도록, 즉 복수 개의 제 1 작동 전극과 복수 개의 제 2 작동 전극 각각이 동일 높이에서 쌍을 이루도록 마련될 수 있다. 예를 들면, 첨부도면 도 20에서 제1 작동 전극 1~4와 제 2 작동 전극의 1~4가 각각 1-1, 2-2, 3-3, 4-4로 쌍을 이루도록 한다.
일 구현예로, 제1 전극부의 제1 작동전극과 제2 전극부의 제2 작동전극은, 높이방향을 따라 교차하여 쌍으로 이루도록, 즉 복수 개의 제 1 작동 전극과 복수 개의 제 2 작동 전극 각각이 서로 다른 높이에서 쌍을 이루도록 마련될 수 있다. 예를 들면, 첨부도면 도 20에서 제1 작동 전극 1~4와 제 2 작동 전극의 1~4가 각각 1-2, 2-1, 3-4, 4-3, 1-3, 2-4, 3-1, 4-2 등의 크로스 방향으로 쌍을 이루도록 마련될 수 있다.
LCR 미터기를 이용하여 출력되는 각각의 작동 전극의 순서를 변화하여 하이드로겔의 평행한 단면 외에 다른 각도에서의 하이드로겔 안의 상태를 전기적으로 측정할 수 있다(측정 쌍을 변화시켜 각도를 변형하듯 평행한 단면 외에 다른 면을 측정할 수 있다).
본 발명에서, 제어부는 세포에서 얻은 전기적 신호를 외부로 출력하는 역할을 하며, 전극부가 측정부에서 전기적 신호를 획득하기 위해 수직을 세워지도록 고정할 수 있다. 또한, 전기적 신호를 처리할 수 있는 처리 모듈의 입력 단자와 연결할 수 있는 연결부(도 18 참조)를 포함한다. 상기 연결부는 제어부의 상단에 위치할 수 있으며, 컨넥터를 의미한다.
본 발명은
용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하는 센서 모듈, 및
상기 센서 모듈의 제어부와 전기적으로 연결되어 제어부로부터 출력되는 전기적 신호를 처리하는 처리 모듈을 포함하며;
상기 측정부는, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 및 제2 전극부를 포함하고,
제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며,
제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 전극부의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하는 것을 특징으로 하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 시스템에 관한 것이다.
상기 3차원 세포 배양 바이오센서용 전극부 및/또는 바이오센서와 관련하여 기술한 모든 내용은 3차원 세포 배양 모니터링 시스템에 적용 또는 준용될 수 있다.
상기 처리 모듈은 제어부로부터 출력된, 인덕턴스, 저항 및 캐퍼시턴스로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 전기적 신호를 처리하는 부위로, 예를 들면, LCR(Inductance(L)/Capacitance(C)/Resistance(R) 미터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 바이오센서를 이용하여 상기 측정부 내 작동 전극들 간의 전기적 신호를 실시간 측정하는 단계를 포함하는 3차원으로 배양된 세포 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법을 포함한다.
상기에서 3차원 세포 배양 모니터링 시스템과 관련하여 기술한 모든 내용은 3차원 세포 배양 모니터링 방법에 적용 또는 준용될 수 있다.
연결부에 의해 처리 모듈과 제어부가 연결되어 있어 전기적 신호를 처리할 수 있으므로 컴퓨터를 통해 모니터링 가능하다.
본 발명은 또한,
세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 제1 및 제2 전극부를 포함하는 측정부를 형성하는 단계;
상기 측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 형성하는 단계; 및
상기 제1 및 제2 전극부를 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 고정시키고, 상기 제어부와 연결시키는 단계
를 포함하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서의 제조방법을 포함한다.
상기에서 바이오센서와 관련하여 기술한 모든 내용이 바이오센서의 제조방법에 그대로 적용 또는 준용될 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
1. 실험 방법
1-1. 3차원 세포 배양을 위한 하이드로젤 준비
알진산 나트륨염(Alginic acid sodium salt, low viscosity, Sigma, USA)을 3차원 세포 배양 배지 용액(10% fetal bovin serum. PAA, Somerset, UL), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin), 1% 훈기존(Fungizone, Gibco, UK), 2.25% HEPES, 2% L-글루타민이 포함된 MEM)을 이용하여 4 ℃에서 5%(w/w) 농도로 용해시켜 알지네이트 용액을 만들었다.
형광 유방암 세포(Fluorescent MCF-7)(연세대학교 의과대학 미생물학교실 면역학센터에서 입수, 5 X 105 개/ml)가 포함한 알지네이트 용액을 millicell® 안에 700 ㎕에 넣은 후, 100 mM CaCl2 MEM에 젤화시켰다. 37 ℃에서 3시간을 배양시킨 후, millicell® 을 3차원 세포 배양 MEM 용액으로 옮겨서 배양하면서 이미지를 측정하였다. 세포가 포함된 젤의 형태는 도 3과 같다.
1-2. 3차원 세포배양 바이오센서 제작 및 측정
도 4는 본 실시예에 사용된 전극의 모식도이다. PCB 기판 하부에 0.5 mm 간격의 작동 전극을 패턴한 후 전도성 금 도금을 하여 전극을 제작하였다(연결 전극은 1mm x 8mm 크기의 전극 4개임).
본 실험에 사용된 3차원 세포 배양 바이오센서의 전극 패턴의 치수는 도 4의 (a)와 같다. 3차원 세포 배양 관찰을 위한 커패시턴스 바이오센서는 4쌍의 다중 전극(multi-electrode[E1~E4])으로 구성되어 있다.
전극부의 제작 과정을 상세히 설명하면 다음과 같다.
(1) 하단 가로 3 mm, 상단 가로 8 mm, 세로 26 mm 크기의 PCB 기판에 전자캐드 프로그램[AutoCAD, autodesk사이트에서 다운로드, OrCAD, orcad.com에서 다운로드]을 이용하여 도 7과 같이 판 A와 판 B에 각각 전극부의 전기회로를 패턴화하였다. 전극과 제어부(하우징)가 연결되는 부분을 절연시키기 위해 (앞서 설명한 바와 같이 PCB 두 판을 접합시켜 만든 전극이기 때문에) 판 A 및 판 B 각각의 한쪽 면에 연결 부분은 패턴화하지 않는다.
(2) 패턴한 부분을 금으로 도금한 후, 가열압착기(핫 프레서)로 판 A와 판 B를 압축시켜 전극부를 제작하였다(제 1 전극부 제작). 동일한 방법으로 전극부를 하나 더 제작하였다(제 2 전극부 제작).
(3) 제작된 2개의 전극부는 오토클레이브(autoclave) 장비 및 에탄올을 이용하여 살균하고 사용하여 측정하고자 하는 세포 이외의 균이 자라지 못하게 한다.
전극부와 출력부를 연결해주는 제어부에 해당하는 하우징 제작 과정은 다음과 같다.
(1) 하우징은 상판과 상판을 지지해 줄 수 있는 양 측면 금속판 세 부분으로 구성된다. 지지해주는 측면 부분은 두께 2 mm인 알루미늄 기판을 가로 6.8 cm, 세로 2 cm 길이로 2개와 가로 6.8cm, 세로 1.5 cm 길이의 기판 2개를 절단하여 준비하였다.
(2) 하우징의 상판은 크기가 가로 8.6 cm, 세로 4.5 cm이며, 4개의 전극부를 끼울 수 있는 PCB 기판과 측정장비(처리 모듈)를 연결할 수 있는 컨넥터(연결부)를 부착하였다[도 18].
(3) (1)에서 제작한 금속판과 (2)의 상판을 나사로 각각 연결하여 3면(윗면과 양 옆면)으로 이루어진 하우징을 조립하였다.
세포 배양은 일반적인 방법으로 37 ℃ 항온 및 항습 이산화탄소 5%를 유지해주는 인큐베이터 안에서 이루어지며, 세포 배양 동안 실시간으로 커패시턴스를 측정하였다.
측정과정은 다음과 같다.
(1) 세포가 포함된 하이드로젤의 형태는 도 3과 같다. 하우징의 상판에 제작한 전극부를 연결하였다.
(2) LAB-TEK well에 DMEM 배지를 2 ml을 준비하고 도 3의 젤을 놓아 준비하였다.
(3) 하우징에 연결된 전극부를 well에 놓여있는 젤 위에 수직으로 놓고 아래로 눌러 고정시켰다(도 4의 (b)).
(4) 인큐베이터에 하우징과 젤을 포함한 웰(측정부)를 넣고 하우징 상판에 위치한 컨넥터에 라인을 연결하고 LCR 미터에 나머지 부분을 연결하였다(도 21 참조).
본 실험에서 사용된 세포는 하이드로젤 안에서 배양되는 3차원 세포 배양 시스템 상에서 5%의 이산화탄소가 용존되어 있을 수 있게 5 X 105 cell/ml 세포 수와 하이드로젤의 1~30% 농도를 조절하여 배양하면서 커패시턴스를 측정하였다. 제작된 3차원 세포 배양용 바이오센서는 LCR 미터를 이용하여 측정하였다. 측정을 위해서는 스캐너(Agilent 34970A)를 사용하였다.
3차원 세포 배양을 마치고 난 뒤, 하이드로젤을 현미경 관찰이 용이하게 최대한 얇은 두께(100 ㎛)의 슬라이스로 만들어 형광현미경으로 세포의 위치 및 세포의 상태를 확인하였다.
1-3. 2차원 세포 배양과 3차원 세포 배양
형광 유방암 세포를 24 웰을 이용해서 37 ℃에서 24시간 2차원 세포 배양 후, 세포 모양을 형광현미경으로 관찰하였다. 2차원 플레이트 위에서 성장하였을 경우, 세포들이 한층 또는 2층의 layer로 길게 뻗으면서 성장하는 것을 관찰하였다.
형광 유방암 세포를 알지네이트 하이드로젤을 이용하여 37 ℃에서 24시간 3차원 세포 배양 후, 세포 모양을 형광현미경으로 관찰하였다. 3차원 알지네이트 하이드로젤 내에서 배양된 세포는 2차원 세포 배양된 세포 모양과는 다르게 둥근 모양으로 세포들이 뭉쳐서 자라는 것을 관찰하였다.
2. 실험 결과
2-1. 하이드로젤을 이용한 3차원 배양 조건의 세포 성장 측정
형광 유방암 세포(MCF-7) 5x105 cell/ml을 포함한 하이드로젤을 37 ℃에서 12시간 동안 커패시턴스를 측정하고 하이드로젤 내의 세포의 상태를 확인하였다. 또한, 커패시턴스를 측정할 수 있는 작동 전극을 도 7에서 보여주듯이 4개의 위치(E1~E4)로 나누어서 하이드로젤 내의 세포 성장 속도를 측정해 보았다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 세포가 포함된 하이드로젤에서는 세포들이 성장하는 동안 각 전극들에서 세포가 포함되지 않은 하이드로젤(회색 점선)보다 더 높은 커패시턴스 값을 보였다. 또한, 각 위부터 아래의 4개의 전극들 사이 유사한 커패시턴스 값을 보여 하이드로젤 내에서 세포들이 일정의 양으로 성장하는 것 또한 유추할 수 있었다.
형광 현미경으로 확인한 결과, 3차원 세포 배양하기 전에는 하이드로젤 내에 작은 양의 세포가 관찰되었으나, 24시간 후 세포 성장에 따른 많은 세포들이 하이드로젤 전체에서 관찰되었다[도 9]. 위의 커패시턴스 변화 결과랑 비교하였을 때, 24시간 후, 모든 전극에서의 커패시턴스의 유사한 레벨 및 변화 경향과 일치하였다.
2-2. 3차원 세포 배양 중 세포들의 증식에 따른 세포 분포 측정
본 실시예에서는 하이드로젤의 50% 부분에만 형광 유방암세포(MCF-7) 5x105 cell/ml을 포함된 하이드로젤을 배치하고, 세포가 포함되지 않은 하이드로젤을 그 위에 배치한 후, 37 ℃에서 24시간 동안 배양하면서 실시간으로 커패시턴트의 값을 측정하였다. 도 10에서 보여주듯이, 배양을 시작한 후, 8시간이 지난 다음, 세포가 포함되어 있는 하이드로로젤을 측정하는 E1 전극 및 E2 전극에서 커패시턴스 값이 일정해짐을 보였다. 그리고 세포를 포함하고 있지 않던 하이드로젤을 측정하고 있던 E3 전극 및 E4 전극의 커패시턴스 값이 크게 증가하면서 24시간 측정 후, 거의 유사한 값을 보였다. 이는 하이드로젤 내에서 시간에 따라 세포의 성장이 위로 향해 증식했다는 것을 확인할 수 있었다.
형광 현미경으로 확인한 결과, 커패시턴스를 측정하기 전에는 하이드로젤 아래 부분(E1 전극과 E2 전극)에서만 세포가 관찰되었지만, 24시간 3차원 세포 배양 후에는 하이드로젤 위 부분(E3 전극와 E4 전극)에서도 세포가 관찰되었다[도 11].
2-3. 3차원 세포 배양에서의 항암제에 의한 세포사멸
3차원 유방암 세포 배양 과정 중 항암제(doxorubicin)을 처리하여 세포의 사멸을 유도한 후, 커패시턴스 값의 변화를 실시간으로 관찰하였다. 항암제는 2가지 방법으로 처리하였다.
1) 항암제 용액으로 하이드로젤에 침투시키는 방법 (도 12의 (a))
DOX 100 ug을 1ml 배지 용액에 용해시켰다.
세포가 포함된 하이드로젤을 배양 후, 여기에 상기 항암제가 포함된 배지 용액 1 ml을 보충하였다.
2) 항암제가 담지된 하이드로젤을 세포가 포함된 하이드로젤의 위에 배치하여 항암제가 하이드로젤의 윗부분부터 시간에 따라 농도의 차이가 생기게 침투시키는 방법 (도 12의 (b))
DOX 100 ug을 1ml 알지네이트 용액(alginate solution)에 4 ℃에서 24시간 용해시킨 후, 100 mM CaCl2 용액에 떨어뜨려 DOX가 담지된 하이드로젤을 만들었다
상기 DOX가 담지된 하이드로젤을 세포가 포함된 하이드록젤 위에 얹어주었다.
즉, 항암제가 담지된 하이드로젤(100ng/ml)를 세포가 배양되고 있는 하이드로젤 위에 두어, 항암제가 세포가 배양되고 있는 하이드로젤로 서서히 침투하도록 하였다.
항암제 용액을 이용한 경우(도 12의 (a)), 하이드로젤 아래 E1 및 E2 전극에 있는 세포들에게 항암제가 영향을 미쳐 세포들이 빠른 속도로 사멸해가는 것을 확인할 수 있었다[도 13]. 도 13에서 사용한 젤은 두 부분으로 나누어진다. 세포를 넣은 하이드로젤과 항암제를 담지하고 있는 하이드로젤을 준비하였다. 측정 전 세포가 포함되어 있는 하이드로젤에 항암제가 담지되어 있는 하이드로젤을 얹은 후 측정을 시작하였다. 상대적으로 하이드로젤 위 E3 및 E4 전극에 있는 세포들에게는 항암제가 크게 영향을 미치지 못하여 8시간 이후 서서히 세포 사멸이 진행됨을 관찰할 수 있었다.
형광 현미경으로 확인한 결과, 항암제 용액을 처리하기 전에는 모든 전극 부분에서 세포들이 관찰되었지만, 항암제 용액을 처리하고 난 뒤에는 하이드로젤 아랫 부분(E1 및 E2 전극)에서의 세포사멸이 관찰되었다[도 14]. 그리고 하이드로젤 윗 부분(E3 및 E4 전극)에서는 살아있는 세포의 형광이 유지됨을 알 수 있었다.
항암제가 담지된 하이드로젤을 이용하여 세포가 배양 중인 하이드로젤에 항암제를 적용하였을 경우[도 12의 (b)], 시간에 따라서 하이드로젤의 높이에 따라 항암제의 농도가 다르게 나타나고, 그에 따라 항암제의 노출시간 및 농도에 따라서 세포 사멸 속도의 차이를 보였다[도 15]. 하이드로젤의 윗부분인 E4 및 E3 전극의 경우, 다른 부분에 비해 가장 높은 농도와 가장 오랜 시간 동안 항암제에 노출되어 항암제를 처리하고 난 뒤 3차원 세포 배양 8시간쯤 가장 큰 커패시턴스 값의 감소를 보였고, 이는 빠른 시간에 세포 사멸을 보인 것을 의미한다.
형광 현미경으로 확인한 결과, 항암제가 포함된 하이드로젤을 적용하기 전에는 모든 전극 부분에서 세포가 관찰되었지만, 항암제가 포함된 하이드로젤을 세포가 포함된 하이드로젤의 윗부분에 놓고 항암제를 적용시키고 8시간 후에는 가장 윗부분인 E4 전극에서는 세포를 거의 확인할 수 없었고 E1 전극에서는 비교적 많은 세포들을 관찰할 수 있었다[도 16].
2-4. 3차원 세포 배양 중 실시간 세포의 이동 측정
인간 중간엽 줄기세포(hMSCs)는 연세 세포 치료 센터로부터 입수하였으며, 2% B27(Life Technologies, Grand Island, NY, USA), EGF(20 ng/mL; R&D Systems, Minneapolis, MNUSA), 및 FGF-2(20 ng/mL; R&D Systems)이 보충된 MEM-F12 포함 MEM에서 37 ℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다.
알지산 나트륨염은 MEM 배양 배지로 3%(w/w) 농도로 용해시켜 알지네이트 용액을 만들었다.
세포 이동을 3D 바이오센서로 모니터링하기 위해, 용기 하부층에는 5 X 104 cell/mL hMSC가 있고 상부 층에는 거의 세포가 있지 않은 3%(w/w)의 알지네이트 하이드로겔을 준비하였다[도 22a의 삽입도]. 재조합 인간 SDF-1α(Prospec-Tany Techno Gene Ltd., Ness-Ziona, Israel) 존재 여부에 따라 세포를 배양하면서 E1-E4의 실시간 커패시턴스를 측정하였다.
SDF-1α(200 μL, 100 ng/mL)는 하이드로젤 내로 로딩하고 hMSC가 포함된 알지네이트 하이드로젤 상단에 놓아 서서히 방출되도록 하였다 [도 22의 (a)의 삽입도]. SDF-1α는 CXCR4 수용체에 결합하고, MSC 이동 및 사이토카인 분비를 조절한다. 초기에는 대부분의 세포가 바닥층에 존재하므로 E1을 사용하여 측정된 하부층의 커패시턴스가 E2, E3, 또는 E4를 사용하여 측정된 상부층의 커패시턴스 보다 높았다.
SDF-1α의 부재 하에서 배양된 hMSCs에 대해, 상부층의 커패시턴스는 로딩 후 20시간까지 거의 변화가 없었으며, 이후 hMSCs의 저속 자발적인 이동으로 서서히 증가하였다. 그러나, SDF-1α의 존재 하에서, 상부층의 커패시턴스는 로딩 후 약 24시간부터 급격히 증가하였다[도 22의 (a)]. 또한, 하부층의 커패시턴스는 SDF-1α의 부재 시 보다 존재 시 더 빠르게 증가하였다. SDF-1α가 증식과 이동을 촉진하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 결과는 세포의 수직 이동에 대한 정보는 본 발명의 바이오센서로 실시간 커패시턴스를 얻을 수 있음을 의미한다.
도 22의 (b)는 SDF-1α 존재 여부에 따라 배양 32시간 후, 염색된 핵과 수평으로 슬라이스된 hMSC 캡슐화된 하이드로겔의 형광 광학 이미지를 나타낸 것이다. 배양 전에 어떠한 세포도 상부층에서 관찰되지 않았다. 그러나 배양 32시간 후, 세포가 위쪽으로 이동하는 것이 나타나면서 살아있는 세포가 상부층에서 관찰되었다.
또한, SDF-1α에 의한 세포 증식 및 이동의 증가로 인해 SDF-1α의 존재 하에서 모든 층에서 높은 세포 밀도를 확인하였다[도 22의 (c)].
이러한 결과는 도 22의 (a)에 나타낸 실시간 커패시턴스 데이터와 일치하며, 그 세포 이동이 본 발명의 바이오센서로 실시간 모니터링할 수 있음을 보여준다.
10: 전극부
1: 기판 2: 작동 전극 3: 연결 전극
H: 기판의 높이 방향 W: 기판의 폭 방향
d: 작동 전극 간의 간격
ℓ: 작동 전극의 길이 w: 작동 전극의 폭

Claims (26)

  1. 기판과, 전기적 신호를 획득하도록 상기 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 작동 전극; 및
    상기 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 연결 전극;을 포함하며,
    작동 전극과 연결 전극의 연결 부분이 노출되지 않도록 2개의 기판이 결합되고, 세포 배양 용기 내 기판의 높이 방향에 따라 수직으로 세워지도록 마련된 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서용 전극부.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 기판은 실리콘, PCB(printed circuit board), PET(polyethylene terephthalate), PES(polyether sulfone) 및 폴리이미드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 바이오센서용 전극부.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 전극은 금속, 전도성 고분자, 다중벽탄소나노튜브(multi-walled carbon nanotube, MWCNT) 및 그래핀(graphene)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 재질을 갖는 바이오센서용 전극부.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 작동 전극 크기는 폭(w)이 0.1 내지 2.5 mm이며, 길이(l)가 0.5 내지 1.5 mm인 바이오센서용 전극부.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 작동 전극 간의 간격(d)은 0.1 내지 1.5 mm인 바이오센서용 전극부.
  7. 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
    측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하며,
    측정부는, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 전극부 및 제2 전극부를 포함하고,
    제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며, 상기 제1 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제1 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제1 연결 전극을 포함하고,
    제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 기판의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하며, 상기 제2 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제2 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제2 연결 전극을 포함하되,
    상기 제1 전극부 및 제2 전극부 각각은 작동 전극과 연결 전극의 연결부분이 노출되지 않도록 2개의 기판으로 결합되는 것을 특징으로 하는
    실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오 센서.
  8. 삭제
  9. 제 7 항에 있어서,
    복수 개의 제1 연결 전극은, 상기 제1 기판 상부에 상기 제1 기판의 폭 방향(W)을 따라 제 1 작동 전극 수와 동일하게 배열되고,
    복수 개의 제2 연결 전극은, 상기 제2 기판 상부에 상기 제2 기판의 폭 방향(W)을 따라 제 2 작동 전극 수와 동일하게 배열되는 바이오 센서.
  10. 제 7 항에 있어서,
    제1 및 제2 작동 전극과 제1 및 제2 연결 전극은 각각 제1 및 제2 기판 내에서 전기적으로 연결되는 바이오 센서.
  11. 제 7 항에 있어서,
    제1 전극부의 제1 작동전극과 제2 전극부의 제2 작동전극은, 높이방향을 따라 각각 차례로 쌍으로 이루도록 마련된 바이오 센서.
  12. 제 7 항에 있어서,
    제1 전극부의 제1 작동전극과 제2 전극부의 제2 작동전극은, 높이방향을 따라 교차하여 쌍으로 이루도록 마련된 바이오 센서.
  13. 제 7 항에 있어서,
    상기 전기적 신호는 커패시턴스(capacitance), 컨덕턴스(conductance) 및 임피던스(impedence)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 바이오센서.
  14. 제 7 항에 있어서,
    상기 기판은 실리콘, PCB(printed circuit board), PET(polyethylene terephthalate), PES(polyether sulfone) 및 폴리이미드로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인 바이오센서.
  15. 제 7 항에 있어서,
    상기 전극은 금속, 전도성 고분자, 다중벽탄소나노튜브(multi-walled carbon nanotube, MWCNT) 및 그래핀(graphene)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 재질을 갖는 바이오센서.
  16. 제 7 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 작동 전극 크기는 폭(w)이 0.1 내지 2.5 mm이며, 길이(l)가 0.5 내지 1.5 mm인 바이오센서.
  17. 제 7 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 작동 전극 간의 간격(d)은 0.1 내지 1.5 mm인 바이오센서.
  18. 제 7 항에 있어서,
    상기 용기는 세포 및 배양 배지를 포함하는 바이오센서.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 배양 배지는 세포 배양용 지지체인 바이오센서
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 지지체는 하이드로 젤인 바이오센서.
  21. 제 7 항에 있어서,
    상기 측정부는 한 쌍 이상의 전극부를 포함하는 바이오센서.
  22. 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 마련된 측정부; 및
    측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 포함하는 센서 모듈, 및
    상기 센서 모듈의 제어부와 전기적으로 연결되어 제어부로부터 출력되는 전기적 신호를 처리하는 처리 모듈을 포함하며;
    상기 측정부는, 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 및 제2 전극부를 포함하고,
    제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며, 상기 제1 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제1 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제1 연결 전극을 포함하고;
    제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 기판의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하며, 상기 제2 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제2 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제2 연결 전극을 포함하되;
    상기 제1 전극부 및 제2 전극부 각각은 작동 전극과 연결 전극의 연결부분이 노출되지 않도록 2개의 기판으로 결합되는 것을 특징으로 하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 시스템.
  23. 제 22 항에 있어서,
    상기 처리 모듈은 인덕턴스, 저항 및 캐퍼시턴스로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 전기적 신호를 처리하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 시스템.
  24. 제 7 항의 바이오센서를 이용하여 상기 측정부 내 작동 전극들 간의 전기적 신호를 실시간 측정하는 단계를 포함하는 3차원으로 배양된 세포 상태를 실시간으로 모니터링하는 방법.
  25. 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 제1 및 제2 전극부를 포함하는 측정부를 형성하는 단계;
    상기 측정부로부터 획득한 전기적 신호를 외부로 출력하고, 측정부로 전원을 공급하기 위한 제어부를 형성하는 단계; 및
    상기 제1 및 제2 전극부를 용기 내부에 소정 간격으로 떨어져 각각 용기에 높이 방향을 따라 수직으로 세워지도록 고정시키고, 상기 제어부와 연결시키는 단계
    를 포함하되,
    상기 제1 전극부는, 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제1 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제1 기판 하부에 상기 기판의 높이 방향(H)을 따라 배열된 복수 개의 제1 작동 전극을 포함하며, 상기 제1 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제1 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제1 연결 전극을 포함하고;
    상기 제2 전극부는, 제1 기판과 소정 간격으로 떨어져 용기에 높이 방향(H)을 따라 수직으로 세워지도록 마련된 제2 기판과, 용기 내부의 세포로부터 전기적 신호를 획득하도록 상기 제2 기판 하부에 상기 제2 기판의 높이 방향(H)을 따라 제1 기판의 작동 전극과 각각 쌍을 이루도록 배열된 복수 개의 제2 작동 전극을 포함하며, 상기 제2 작동 전극과 제어부를 전기적으로 연결하며, 제2 작동 전극과 각각 전기적으로 연결된 복수 개의 제2 연결 전극을 포함하되;
    상기 제1 전극부 및 제2 전극부 각각은 작동 전극과 연결 전극의 연결부분이 노출되지 않도록 2개의 기판으로 결합되는 것을 특징으로 하는 실시간 3차원 세포 배양 모니터링 바이오센서의 제조방법.
  26. 삭제
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