KR20230120436A - 현장용 진단 기기 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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KR20230120436A
KR20230120436A KR1020220017002A KR20220017002A KR20230120436A KR 20230120436 A KR20230120436 A KR 20230120436A KR 1020220017002 A KR1020220017002 A KR 1020220017002A KR 20220017002 A KR20220017002 A KR 20220017002A KR 20230120436 A KR20230120436 A KR 20230120436A
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Abstract

본 개시는 현장용 진단 기기로서, 복수의 전극 및 절연부를 포함하는 프로브; 및 플레이트를 포함하며, 플레이트는 복수의 웰을 포함하며, 각 웰은 상면 방향으로 개방된 홀을 가지며, 각 웰은 반응 인자를 포함하며, 반응 인자는 미리 결정된 표적(target) 바이오마커와 반응하고, 반응 인자는 각 웰의 내부 표면 중 적어도 일부에 고정되는, 현장용 진단 기기 및 이를 이용하여 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법을 제공한다.

Description

현장용 진단 기기 및 이의 사용 방법{An Apparatus for field diagnosis and Using method thereof}
본 개시는 현장용 진단 기기 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
현장용 진단 기기의 사용은 전문 설비가 갖춰진 연구실을 벗어나, 원하는 시간, 상황, 및 장소에서 누구나 필요한 진단, 분석을 수행하는 것을 가능하게 한다.
바이오마커란 단백질이나 DNA, RNA, 대사물질 등의 생체물질로서 정상 또는 병리적인 상태, 약물에 대한 반응 정도 등을 객관적 기준에서 측정해 줄 수 있는 표지자를 의미한다.
바이오센서는 바이오마커의 특이적 인식 반응을 이용하여 특정 대상을 정성적 또는 정량적으로 측정하는 분석도구이다. 항원은 대표적인 바이오마커 중 하나이다. 바이오센서 중에서 항원-항체의 결합 반응을 이용하는 바이오센서를 면역 센서라 한다.
KR 10-0624012 B1
본 개시는 현장용 진단 기기를 제공하고자 한다. 또한, 본 개시는 상기 현장용 진단 기기를 이용하여, 대상의 표적 바이오마커의 농도를 측정하는 방법을 제공하고자 한다.
본 개시의 제1 관점(aspect)은 현장용 진단 기기에 관한 것으로서, 복수의 전극 및 절연부를 포함하는 프로브; 및 플레이트를 포함하며, 플레이트는 복수의 웰을 포함하며, 각 웰은 상면 방향으로 개방된 홀을 가지며, 각 웰은 반응 인자를 포함하며, 반응 인자는 미리 결정된 표적(target) 바이오마커와 반응하고, 반응 인자는 각 웰의 내부 표면 중 적어도 일부에 고정될 수 있다.
일 구현예(embodiment)에 따르면, 복수의 전극은 작동 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 절연부 및 플레이트는 폴리스티렌, 폴리카보네이트, PMMA, 폴리프로필렌, PET, 폴리에틸렌, 테플론, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 플레이트는 2 내지 2000개의 웰을 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 반응 인자는 각 웰의 내부 표면 중 적어도 일부에 링커 화합물을 통해 고정될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 각 웰은 전기적 산화환원 반응 효소를 더욱 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 현장용 진단 기기는 가열부 및 측정부를 더욱 포함할 수 있다.
본 개시의 제2 관점은 본 개시의 현장용 진단 기기를 이용하여, 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법에 관한 것으로서, (a) 플레이트의 웰에 시료를 제공하는 단계; (b) 플레이트를 미리 결정된 온도로 미리 결정된 시간동안 유지하는 단계; (c) 플레이트를 세척하는 단계; (d) 플레이트의 웰에 산화환원반응 기질을 포함하는 용액을 제공하는 단계; (e) 프로브의 적어도 일부를 웰에 침지하는 단계; 및 (f) 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, (b) 단계는 30분 내지 3 시간 동안, 35 내지 40℃의 온도로 수행될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 방법은 침지된 프로브의 적어도 일부를 세척한 후, 프로브가 침지되지 않은 플레이트의 다른 웰에서 (e) 및 (f)를 반복하여 수행하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 개시는 장소에 구애 받지 않고, 다양한 장소에서 대상의 진단이 가능한 현장용 진단 기기 및 이의 사용 방법을 제공한다.
도 1은 일 구현예에 따른 현장용 진단 기기의 개략적인 구성을 나타낸 것이다.
도 2는 일 구현예에 따른 웰의 내부 표면 상에 반응 인자를 고정하는 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 본 개시의 현장용 진단 기기를 이용한 일 실시예의 소의 임신 여부를 진단한 결과를 나타낸 것이다.
본 개시의 목적, 장점들 및 특징들은 첨부된 도면들과 연관되는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이나, 본 개시가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 개시를 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 개시의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.
현장용 진단 기기
본 개시는 현장용 진단 기기를 제공한다. 본 개시에서 '현장'이란 특정 장소를 지칭하는 것이 아니며, 전문적인 진단 설비를 갖춘 연구실을 벗어난, 임의의 모든 장소를 포함할 수 있다.
본 개시에 있어서 진단의 대상은 인간을 포함하는 동물일 수 있다. 본 개시의 일 구현예에 따르면, 진단의 대상은 소, 닭, 돼지 등과 같은 가축일 수 있다. 본 개시에서 '진단'은 진단 대상으로부터 채취된 체액 내에 표적으로 결정된 바이오마커의 존재 여부, 상기 체액 내 바이오마커의 농도 등을 분석하고, 이를 공지의 기준 농도와 비교하여 질병, 또는 현재 상태를 판단하는 것을 의미한다. 예시적으로, 동물의 체액 내 하나의 바이오마커의 농도가 공지의 기준 농도를 초과하는 경우, 해당 동물은 특정 질병을 보유하고 있는 상태로 판단될 수 있다. 본 개시의 '진단'은 위와 같은 수치의 단순 비교를 통해 달성될 수 있는바, 의사의 임상적 판단을 필수적으로 수반하지 않는다는 점에 유의해야 한다.
본 개시에서 상기 체액은 진단 대상으로부터 얻어지면서, 표적 바이오마커가 존재할 가능성이 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 혈액, 땀, 소변, 침 등일 수 있다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 본 개시의 용어 '진단'은 '면역 진단'을 의미할 수 있다. 본 개시의 '면역 진단'은 항원-항체의 면역 반응을 이용한 진단 방법을 의미한다. 이에, 본 개시에서 언급되는 바이오마커는 항원을 의미할 수 있다.
도 1은 본 개시의 일 구현예에 따른 현장용 진단 기기의 개략적인 구성을 나타낸 것이다. 이하에서 본 개시의 현장용 진단 기기를 도 1을 참조하여 설명한다.
본 개시의 진단 기기는 프로브 및 플레이트를 포함할 수 있다. 상기 프로브는 복수의 전극 및 절연부를 포함할 수 있다. 프로브는 전극을 통해 측정부로 전기적 신호를 전달하는 기능을 수행한다.
본 개시의 진단 기기는 전기화학적 방식을 사용함으로써, 다른 방식을 이용하는 진단 기기에 비하여 가격 경쟁력이 우수하다. 또한, 발색 등을 통한 정성적 진단만이 가능한 기기에 비해 측정된 전기적 신호를 수치화하여 정량적 진단이 가능함에 보다 우수한 정밀성을 갖는다. 또한, 후술하는 바와 같은 본 개시의 진단 기기를 이용하는 경우, 우수한 민감도를 가져, 예컨대 시료 내 표적 바이오마커의 함량이 낮은 경우, 다시 말해 전기적 신호가 낮은 경우에도 진단이 가능하다. 예컨대, 가축의 임신 여부를 진단하는 경우, 임신일로부터 기간이 경과할수록 표적 바이오마커의 농도는 증가할 수 있으며, 본 개시의 진단 기기를 이용하는 경우, 다른 진단 기기에 비해 더 빠른 시일 내에 임신 여부를 판단하는 것이 가능하다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 상기 복수의 전극은 작동 전극(Work Electrode, WE), 상대 전극(Counter Electrode, CE), 및 기준 전극(Reference Electrode, RE)을 포함할 수 있다. 본 개시의 다른 구현 예에 따르면, 상기 복수의 전극은 작동 전극 및 기준 전극을 포함할 수 있다. 측정 시 발생할 수 있는 오류의 최소화의 관점에서, 작동 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 모두 사용하는 3 전극 시스템의 경우가 작동 전극 및 기준 전극만을 사용하는 2 전극 시스템의 경우보다 바람직할 수 있다.
본 개시의 복수의 전극은 전기가 잘 통하는 전도성 물질을 포함할 수 있다. 특정 물질이 분석 대상이 되는 시료와 반응하는 문제가 없으면서, 전기 전도성도 우수하다면, 상기 전도성 물질로서 특별히 제한되지 않는다. 현장에서의 사용 및 휴대의 용이성을 고려할 때, 상대적으로 가벼운 전도성 물질이 바람직할 수 있다. 본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 전도성 물질은 금, 탄소, 백금, 은, 니켈, 팔라듐, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 구현예에 있어서, 상기 복수의 전극은 서로 동일한 전도성 물질을 포함할 수 있고, 다른 구현예에 있어서, 복수의 전극은 서로 상이한 전도성 물질을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 개시의 프로브는 절연부를 포함할 수 있다. 상기 절연부는 본 개시의 기기를 사용하는 사용자의 감전을 방지한다. 상기 절연부를 구성하는 물질은 시료와의 반응성이 없으면서, 전기가 통하지 않는다면 특별히 제한되지 않는다. 현장에서의 사용 및 휴대의 용이성을 고려할 때, 절연부는 상대적으로 가벼운 물질로 구성되는 것이 바람직할 수 있다. 본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 절연부는 폴리스티렌, 폴리카보네이트, PMMA, 폴리프로필렌, PET, 폴리에틸렌, 테플론, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 개시의 프로브는 시료와 직접 접촉하여 전기적 신호를 측정부로 전달한다. 일반적으로 대상으로부터 채취되는 소량의 시료를 이용하여 진단을 하기 위해서, 바람직하게는 프로브의 일부가 시료와 직접 접촉한다. 구체적으로 프로브의 일 말단에서 외부로 노출된 복수의 전극은 시료와 직접 접촉할 수 있다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 프로브는 상면, 하면, 및 옆면을 포함하는 기둥형 구조일 수 있고, 복수의 전극은 프로브의 하면 또는 하면에 인접한 옆면의 하단부를 통해 외부에 노출되어, 시료와 직접 접촉할 수 있다. 여기서 프로브의 상면 및 하면과 평행한 프로브의 단면의 최대 길이는 후술하는 웰의 홀의 직경보다 작아야 한다. 이에, 프로브의 일부가 웰의 홀에 삽입되는 것이 가능하다.
본 개시의 다른 구현 예에 따르면, 프로브는 서로 직교하는 장축 및 단축을 포함하고, 상기 장축:단축의 비는 약 2:1 내지 약 10:1일 수 있다. 여기서 단축은 프로브의 상면 및 하면과 평행한 가상의 선이며, 장축은 상면 및 하면과 수직인 가상의 선이다.
본 개시의 일 구현 예에 따르면, 작동 전극은 프로브의 상면 및 하면에서 외부에 노출되며, 프로브의 장축을 따라 연장하는 기둥형 전극일 수 있다. 여기서 프로브의 하면에서 노출된 작동 전극은 시료와 직접 접촉하고, 상면에서 노출된 전극은 측정부와 유선으로 연결될 수 있다.
한편, 상대 전극 및 기준 전극은 프로브의 하면, 또는 하면에 인접한 옆면의 하단부에서 외부에 노출될 수 있다. 상대 전극 및 기준 전극은 프로브의 내부에서 상면을 향해 장축을 따라 연장하는 전선을 통해 측정부와 유선으로 연결될 수 있다.
도 1을 참조하면, 본 개시의 일 구현예에 따른 프로브는 긴 막대형의 구조를 가지며, 프로브의 일 말단 표면에서 복수의 전극은 외부로 노출될 수 있다. 상기 외부로 노출된 전극을 제외한 프로브의 나머지 표면은 절연부에 포함된다. 작동 전극은 프로브의 내부를 관통하여 삽입된 형태로 존재할 수 있고, 상면 및 하면에서 외부에 노출된다. 상대 전극 및 기준 전극은 옆면의 하단부에서 외부에 노출되며, 내부에서 장축을 따라 상면까지 연장하는 전선과 연결되어 있다. 상대 전극 및 기준 전극 또한 작동 전극과 함께 프로브의 상면을 통해 측정부와 유선으로 연결될 수 있다.
프로브의 일부, 바람직하게는 외부에 노출되는 복수의 전극의 표면들은 시료에 침지된다. 프로브의 옆면에서 상대 전극 및 기준 전극이 외부에 노출되는 구현예에 있어서, 적은 시료에 대한 분석의 용이성의 관점에서, 프로브의 하면과 가장 인접한 위치에서 상대 전극 및 기준 전극이 외부에 노출되는 것이 바람직하다.
본 개시의 진단 기기는 플레이트를 포함할 수 있다. 상기 플레이트는 복수의 웰을 포함하며, 각 웰은 상면 방향으로 개방된 홀을 가진다. 본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 웰은 플레이트와 일체형으로 구성될 수 있다.
상기 웰에는 진단 대상으로부터 채취된 시료가 담기므로, 플레이트는 시료와 반응성이 없는 물질로 구성되어야 한다. 또한, 상기 홀에 삽입될 프로브를 통해 흐르는 전류가 플레이트 전체를 넘어 사용자에게까지 흐르지 않도록, 플레이트는 절연성 물질인 것이 바람직하다. 또한, 후술하는 바와 같이, 반응의 활성화를 위해 플레이트를 일정 온도로 가열해야할 수 있는바, 플레이트는 내열성을 갖는 물질인 것이 바람직하다. 본 개시의 일 구현예에 있어서, 플레이트는 폴리스티렌, 폴리카보네이트, PMMA, 폴리프로필렌, PET, 폴리에틸렌, 테플론, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 플레이트는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 플레이트는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 또는 이들의 조합으로 이루어질 수 있다. 극성 분자와의 결합력의 관점에서, 상기 플레이트가 폴리스티렌으로 이루어지는 것이 특히 바람직할 수 있다.
본 개시의 일 구현예에 있어서, 플레이트는 2 내지 2000개의 웰을 포함할 수 있다. 예컨대, 본 개시의 플레이트는 96개의 웰, 384개의 웰, 1536개의 웰을 포함할 수 있다. 현장에서의 사용 및 휴대의 편리성을 고려할 때, 플레이트가 상기 범위를 초과하는 웰을 포함하는 것은 바람직하지 않다.
웰은 상면 방향으로 개방된 홀을 포함하며, 상기 홀에 진단 대상으로부터 채취된 시료가 웰 내에 담겨질 수 있다. 또한, 본 개시의 프로브의 일부도 상면 방향으로 개방된 홀을 통해 시료에 침지될 수 있다.
본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 홀의 직경은 약 0.3 내지 2 cm일 수 있다. 현장에서의 사용 및 휴대의 편리성을 고려할 때, 홀의 직경은 약 0.3 내지 1 cm일 수 있다. 본 개시에서 '홀의 직경'은 웰의 최상단의 내부 직경을 의미한다. 본 개시의 다른 구현예에 있어서, 홀의 깊이는 약 0.3 내지 2 cm일 수 있다. 현장에서의 사용 및 휴대의 편리성을 고려할 때, 홀의 깊이는 약 0.3 내지 1 cm일 수 있다. 본 개시에서 '홀의 깊이'는 상면이 개방된 웰에서, 웰의 상면에서 하면까지의 최단 거리를 의미한다.
본 개시에 있어서, 복수의 웰 각각은 반응 인자를 포함한다. 본 개시에서, '반응 인자'는 미리 결정된 표적 바이오마커와 반응하는 물질을 의미한다. 본 개시의 일 구현예에서, 표적 바이오마커가 특정 항원인 경우, 반응 인자는 상기 항원과 특이적으로 반응하는 항체 중 하나일 수 있다.
반응 인자는 각 웰의 내부 표면 중 적어도 일부에 직접적으로 및/또는 간접적으로 고정된다. 반응 인자가 각 웰의 내부 표면 중 적어도 일부에 간접적으로 고정되는 구현예에 있어서, 반응 인자는 웰의 내부 표면 상에 링커 화합물을 통해 고정될 수 있다. 또한, 이들 구현예 중 일부에서, 반응 인자는 링커 화합물 및 보조 항체를 통해 고정될 수 있다. 여기서 보조 항체는 반응 인자와 링커 화합물 사이에 위치하여 반응 인자를 고정하는 기능을 수행한다.
본 개시에 있어서, 상기 링커 화합물은 웰의 내부 표면에 반응 인자를 고정할 수 있으면서, 본 개시의 목적을 저해하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는 상기 링커 화합물은 아비딘일 수 있다. 본 개시의 일 구현예에 따르면 상기 아비딘은 뉴트라아비딘(neutravidin), 내츄럴 아비딘, 스트렙트아비딘(streptavidin), 캡트아비딘(captavidin), 또는 이들의 임의의 조합일 수 있다.
링커 화합물을 사용하는 본 개시의 구현예에서, 반응 인자는 링커 화합물과 결합하는 화합물과의 컨쥬게이트(conjugates)일 수 있다. 예컨대, 링커 화합물이 아비딘인 경우, 반응 인자는 비오틴-컨쥬게이트된 반응 인자일 수 있다.
도 2는 본 개시의 일 구현예에 따른 웰의 내부 표면 상에 반응 인자를 고정하는 방법의 모식도이다. 도 2에서 링커 화합물은 아비딘이고, 반응 인자는 비오틴-컨쥬게이트된 항체이다. 표면 상에 아비딘의 고정 및 아비딘-비오틴의 결합은 통상적인 공지의 방법을 통해 수행될 수 있으며, 본 개시에서 특별히 제한되지 않는다.
작동 전극의 표면 상에 간접적 및/또는 직접적으로 반응 인자가 고정되는 것과 달리, 본 개시의 진단 기기에서 반응 인자는 작동 전극의 표면에 고정되지 않고, 웰의 내부 표면에 고정된다. 반응 인자가 고정된 작동 전극이 1회 사용 이후 폐기되어야 하는 것과 달리, 본 개시의 작동 전극은 세척하여 재사용이 가능하다는 이점이 있다. 통상적으로 복수의 웰을 포함하는 플레이트의 비용이 작동 전극을 포함하는 프로브보다 저렴한바, 이는 가격 경쟁성에서의 이점으로도 작용할 수 있다.
본 개시의 일 구현예에 따르면, 각 웰은 전기적 산화환원 반응 효소를 더욱 포함할 수 있다. 전술한 바와 같이 반응 인자가 고정된 웰 내에 진단 대상으로부터 채취된 체액 시료를 공급하면, 시료 내 바이오마커와 반응 인자간의 결합 반응이 수행된다. 상기 바이오마커는 일반적으로 자체적으로 산화 반응 또는 환원 반응이 불가능한 물질일 수 있다. 이러한 바이오마커의 존부 판단을 위하여 전기적 산화환원 반응 효소 및 기질의 사용이 고려될 수 있다.
본 개시에서 전기적 산화환원 반응 효소란 전기적 산화환원 반응 기질이 산화환원 반응이 가능하도록 활성화시키는 물질을 의미한다. 또한, 본 개시에서 전기적 산화환원 반응 기질이란 활성화된 후, 작업 전극을 통해 전압이 인가되었을 때, 상기 인가된 전압에 의해 산화환원 반응이 진행되어 전자를 흡수 또는 방출함으로써 전류를 발생시키는 물질을 의미한다.
본 개시에 있어서, 상기 산화환원 반응 효소는 본 개시의 목적을 제한하지 않는다면 특별히 제한되지 않는다. 예시적으로 상기 효소는 ALP, HRP(Horseradish peroxidase), 글루코스옥시다제(Glucose Oxidase), 루시퍼라제(luciferase), 베타-디-갈락토시다제(β말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase), 푸트레신(putrescine), 알코올옥시다제(alcohol oxidase, AOX), 우리카아제(uricase) 등일 수 있다. 본 개시의 일 구현예에서, 상기 산화환원 반응 효소는 ALP(alkaline phosphatase) 또는 HRP(horseradish peroxidase)일 수 있다. ALP 및 HRP는 매우 민감한 반응성을 갖는 이점이 있으며, 특히 HRP의 경우 저렴하여 비용 측면에서 이점이 있다. 또한, ALP의 경우 약 24 내지 48시간의 긴 시그널 유지 시간을 갖는 점에서 유리한 이점이 있다. 또한, 산화환원 반응 효소로 HRP가 사용되는 경우, 산화환원 반응 기질로는 과산화수소(H2O2), 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS), 3,3′-Diaminobenzidine??(DAB), Amplex Red, Luminol, AEC (3-Amino-9-ethylcarbazole), OPD (o-phenylenediamine dihydrochloride) 등이 사용될 수 있다.
일반적으로 연구소에서는 반응 인자와 시료 내 바이오마커의 결합 반응 후에, 웰 내로 산화환원 반응 효소를 공급하여 바이오마커와 상기 효소를 결합시킨다. 본 개시의 현장용 진단 기기의 경우는, 이러한 효소 공급 시간을 최소화하기 위해, 웰 내에 반응 인자와 함께 미리 산화환원 반응 효소를 포함시킬 수 있다. 이 때, 본 개시의 일 구현예에 따른 산화환원 반응 효소는 반응 인자와 상이하고, 바이오마커의 다른 사이트에 특이적인, 2차 반응 인자(예컨대, 2차 항체)와 직접적 또는 간접적으로 컨쥬게이트된 산화환원 반응 효소일 수 있다.
본 개시의 현장용 진단 기기는 가열부 및/또는 측정부를 더욱 포함할 수 있다. 가열부는 플레이트 및 웰을 원하는 시간 동안 원하는 온도로 유지하는 것을 가능하게 한다. 이러한 온도 제어는 바이오마커와 반응 인자 간의 결합 및 효소와 기질 간의 반응을 활발하게 하여, 보다 신뢰성이 높은 결과를 얻는 것을 가능하게 한다.
측정부는 프로브의 전극을 통해 시료에 전압을 인가하고, 전달되는 전기적 신호를 측정하는 기능을 수행한다. 예컨대 전류값 또는 전하값과 같은 전기적 신호는 측정부에서 측정되어, 미리 저장된 데이터에 기초하여 바이오마커의 농도값으로 환산되어 분석에 활용되거나, 전기적 신호값 그 자체로 분석에 활용될 수 있다.
이상과 같이, 본 개시는 현장에서의 편리한 사용, 저렴한 측정 비용, 우수한 민감도 및 정밀도를 모두 만족하는 진단 기기를 제공 가능할 것으로 예상된다.
본 개시의 현장용 진단 기기를 이용한 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법
본 개시는 전술한 본 개시의 현장용 진단 기기를 이용하여, 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법을 제공한다. 이하에서, '현장용 진단 기기'와 관련하여 전술한 내용과 공통되는 내용의 기재는 생략될 수 있다. 또한, 특별히 달리 언급되지 않는한, 전술한 진단 기기에 관련된 기술적 특징은 본 개시의 방법에서도 동일하게 적용될 수 있다.
본 개시의 측정 방법은 (a) 플레이트의 웰에 시료를 제공하는 단계; (b) 플레이트를 미리 결정된 온도로 미리 결정된 시간동안 유지하는 단계; (c) 플레이트를 세척하는 단계; (d) 플레이트의 웰에 산화환원 반응 기질을 포함하는 용액을 제공하는 단계; (e) 프로브의 적어도 일부를 웰에 침지하는 단계; 및 (f) 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.
여기서 상기 시료는 진단 대상으로부터 채취된 체액일 수 있다. 신뢰성 높은 진단 결과를 위하여, 시료의 양은 적어도 약 50 ㎕ 이상일 수 있다.
본 개시의 측정 방법은 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 방법을 사용할 수 있다. 예시적으로 본 개시의 측정 방법은 간접적 어세이(indirect assay) 방법을 이용할 수 있다. 이 경우, 신호의 크기를 2배 이상 증폭할 수 있다는 이점이 있다. 또한 예시적으로, 본 개시의 측정 방법은 경쟁적 어세이(competitive assay) 방법을 이용할 수 있다. 이 경우, 어세이 시간이 1/2배 이상 감축될 수 있다는 이점이 있다.
간접적 어세이 방법을 이용하는 일 구현예에 있어서, 시료를 웰에 제공하기 전에, 반응 인자는 간접적 또는 직접적으로 웰의 내부 표면 중 적어도 일부에 고정되어 있을 수 있고, 웰은 또한 산화환원 반응 효소를 포함하고 있을 수 있다.
또, 간접적 어세이 방법을 이용하는 다른 구현예에 있어서, 시료를 웰에 제공하기 전에, 반응 인자는 간접적 또는 직접적으로 웰의 내부 표면 중 적어도 일부에 고정되어 있을 수 있다. 이 때 웰은 산화환원 반응 효소를 포함하지 않는다. 이 경우, 본 개시의 측정 방법은 시료를 웰에 제공하는 것과 함께, 또는 제공한 후에, 산화환원 반응 효소를 웰에 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 간접적 어세이 방법을 이용하는 경우, 시료 내 바이오마커의 함량이 높을수록 더 높은 전기적 신호가 측정되는 것이 기대된다.
한편, 경쟁적 어세이 방법을 이용하는 구현예에 있어서, 시료를 웰에 제공하기 전에, 반응 인자는 간접적 또는 직접적으로 웰의 내부 표면 중 적어도 일부에 고정되어 있을 수 있다. 이 때 웰은 산화환원 반응 효소를 포함하지 않는다. 본 개시의 측정 방법은 시료를 웰에 제공하는 것과 동시에, 산화환원 반응 효소를 웰에 제공하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서 산화환원 반응 효소는 시료 내 바이오마커와 경쟁적으로 반응 인자에 결합하는 물질과 결합된 산화환원 반응 효소이다. 보조 항체가 사용되는 다른 구현예에서, 반응 인자는 시료 및 산화환원 반응 효소가 웰에 제공된 후에 웰에 제공될 수 있다. 상기 반응 인자는 웰 내에서 일 단부가 바이오마커 또는 상기 물질과 결합하는 동시에 다른 단부가 보조 항체와 결합할 수 있다.
본 개시의 일 구현예에서 상기 물질은 시료 내 표적 바이오마커와 동일한 물질일 수 있다. 본 개시의 다른 구현예에서 상기 물질은 반응 인자와의 결합력이 시료 내 표적 바이오마커와 반응 인자 간의 결합력보다 약한 물질일 수 있다.
경쟁적 어세이 방법을 이용하는 경우, 시료 내 바이오마커의 함량이 높을수록 더 낮은 전기적 신호가 측정되는 것이 기대된다.
본 개시의 측정 방법은 플레이트를 미리 결정된 온도로 미리 결정된 시간 동안 유지하는 단계를 포함한다. 본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 단계는 약 30분 내지 3 시간 동안, 약 35 내지 40℃의 온도에서 수행될 수 있다. 보다 바람직하게는 상기 단계는 약 1 내지 2 시간 동안, 약 36 내지 38℃의 온도에서 수행될 수 있다. 상기 시간 범위 미만인 경우, 반응 인자 - 바이오마커 간의 결합 반응이 충분히 진행되지 못하는 문제가 발생할 수 있으며, 상기 시간 범위를 초과하는 경우, 지나치게 많은 시간이 소요되어 현장용 진단 방법으로 적합하지 못하다는 문제가 있다. 또, 상기 온도 범위 미만에서 수행되는 경우에도 반응 인자 - 바이오마커 간의 결합 반응이 충분히 진행되지 않는다는 문제가 발생할 수 있으며, 상기 온도 범위 초과인 경우, 반응 온도가 지나치게 높아 반응 물질들의 변성을 초래할 수 있다는 문제가 존재한다.
본 개시의 측정 방법은 플레이트를 세척하는 단계를 포함한다. 상기 단계는 반응 인자와 시료 내 바이오마커가 충분히 결합할 수 있는 시간이 경과한 뒤 실시되어야 한다. 상기 세척을 통해, 웰 표면에 고정되어 있는 반응 인자와 결합하지 못한 바이오마커 및 시료 내 기타 성분이 웰에서 제거될 수 있다. 본 개시의 일 구현예에 있어서, 상기 세척은 식염수를 이용하여 진행될 수 있다.
본 개시의 측정 방법은 플레이트의 각 웰에 산화환원 반응 기질을 포함하는 용액을 제공하는 단계를 포함한다. 산화환원 반응 기질은 산화환원 효소에 의존적으로 결정된다. 상기 기질이 제공되면, 각 웰 내에 존재하는 산화환원 효소가 상기 기질을 전기적 산화환원이 가능하도록 활성화시킨다. 예시적으로, 산화환원 효소로서 ALP가 사용되는 경우, 이에 대응하여 산화환원반응 기질로서 AAP(ascorbic acid-2-phosphate)가 사용될 수 있다. 상기 AAP는 ALP에 의해 포스페이트작용기가 분리되어 효소 반응 생성물로서 AA(ascorbic acid)로 전환된다. 효소-기질 반응을 위해, 상기 용액 제공 단계는 약 10 내지 20분 동안 약 35 내지 40℃의 온도로 웰을 방치하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 개시의 측정 방법은 프로브의 적어도 일부를 웰에 침지하는 단계를 포함한다. 구체적으로 프로브의 적어도 일부는 웰의 홀에 존재하는 용액에 침지된다. 본 개시의 일 구현예에 있어서, 프로브의 적어도 일부는 작동 전극; 상대 전극; 및 기준 전극 각각의 외부에 노출된 표면을 포함할 수 있다.
본 개시의 측정 방법은 프로브의 적어도 일부를 웰에 침지한 상태에서, 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 단계는 약 10 초 내지 2 분 이내로 수행될 수 있다. 앞서 든 예에 이어서, 산화환원 효소로서 ALP가 사용되는 경우, AAP는 AA로 전환되며, 상기 AA는 작동 전극을 통해 인가된 산화 전압에 의해서 탈수소아스코르브산염(dehydroascorbate)로 산화된다. 상기 산화 반응 시 발생하는 전기적 시그널이 측정될 수 있다.
이렇게 측정된 전기적 시그널은 바이오마커의 농도 vs 전기적 시그널과 관련된 데이터베이스에 기초하여 바이오마커의 농도로 환산될 수 있다.
본 개시의 측정 방법은 웰에 침지된 프로브의 적어도 일부를 세척한 후, 프로브가 침지되지 않았던 플레이트의 다른 웰에서 전술한 침지 및 측정 단계를 반복 실시하는 단계를 더욱 포함할 수 있다. 본 개시에 있어서, 프로브 자체에 반응 인자가 고정되지 않기 때문에, 식염수 등을 이용한 단순 세척만으로도 프로브의 재사용이 가능하다. 이에, 복수의 웰을 포함하는 하나의 플레이트에 대하여 하나의 프로브만으로도 본 개시의 방법을 반복 실시함으로써 복수 회의 진단이 가능함을 알 수 있다.
이하, 본 개시의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 개시를 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 개시가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 바이오마커의 고정화
PS 재질의 용기의 내부를 PBS로 3회 세척하고, 100㎍/ml의 아비딘 100-200㎕와 상온에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 소수성 상호작용을 통해 아비딘이 용기 내부 표면 상에 물리적으로 흡착되었다. 이후, 상기 용기와 100㎕의 1% BSA(bovine serum albumin)를 상온에서 약 1시간 동안 반응시켰다. 그리고 상기 용기와 Biotinlated Antibody(10㎍/ml) 50㎕를 상온에서 1시간 반응시켰다. 상기 Biotinlated Antibody는 PAG1 Antibody의 일 단부에 결합하는 보조 항체이다.
2. 소의 임신 진단 실험
전술한 바와 같은 방법으로 항체를 고정시킨 용기 및 본 개시에서 서술한 프로브를 이용하여 소의 임신 샘플을 분석하였다. 소의 임신 샘플로는 비임신 상태인 소, 임신 23일차, 27일차, 33일차, 43일차, 및 6개월 차로 밝혀진 소의 혈액이 사용되었다.
보조 항체를 고정시킨 용기에 HRP가 결합된 PAG-1(10㎍/ml) 50-100㎕와 샘플 50-100㎕를 공급하였고, PAG1 Antibody 를 공급 (10㎍/ml, 50-100㎕)하여 약 37℃의 온도에서 약 1 시간 동안 방치하였다. 이후 식염수로 상기 용기를 세척하였다.
세척된 용기에 과산화수소 및 하이드로퀴논(hydroquinone, HQ)을 포함하는 혼합 용액을 공급한 후, 프로브의 작동 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 상기 혼합 용액에 2분간 침지한 후, 25℃에서 -0.5V의 전압을 인가하여 시간대전류(Chronoamperometry, CA)법을 이용하여 시간에 대한 전류값을 10초 동안 측정하였다. 각 샘플별로 측정된 최대 전류값을 도 3에 도시하였다.
도 3을 참조하면, 본 개시의 진단 기기를 사용하여, 현장에서도 임신 약 20일 경과의 극초반부터 소의 임신 여부를 진단 가능한 것을 알 수 있다. 비임신 상태의 암소 및 수컷소의 혈청 샘플에서 검출된 전류값은 약 0.0025-0.005 mA였으며, 임신 상태의 소는 상기 0.0025 mA보다 약 30% 이상 낮은 값(약 0.00175 mA)을 나타냄을 확인할 수 있다.
본 개시의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 개시의 영역에 속하는 것이며, 본 개시의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.

Claims (10)

  1. 현장용 진단 기기로서,
    복수의 전극 및 절연부를 포함하는 프로브; 및 플레이트를 포함하며,
    플레이트는 복수의 웰을 포함하며, 각 웰은 상면 방향으로 개방된 홀을 가지며,
    각 웰은 반응 인자를 포함하며, 반응 인자는 미리 결정된 표적(target) 바이오마커와 반응하고, 반응 인자는 각 웰의 내부 표면 중 적어도 일부에 고정되는, 현장용 진단 기기.
  2. 청구항 1에 있어서,
    복수의 전극은 작동 전극, 상대 전극, 및 기준 전극을 포함하는, 현장용 진단 기기.
  3. 청구항 1에 있어서,
    절연부 및 플레이트는 폴리스티렌, 폴리카보네이트, PMMA, 폴리프로필렌, PET, 폴리에틸렌, 테플론, 또는 이들의 조합을 포함하는, 현장용 진단 기기.
  4. 청구항 1에 있어서,
    플레이트는 2 내지 2000개의 웰을 포함하는, 현장용 진단 기기.
  5. 청구항 1에 있어서,
    반응 인자는 각 웰의 내부 표면 중 적어도 일부에 링커 화합물을 통해 고정되는, 현장용 진단 기기.
  6. 청구항 1에 있어서,
    각 웰은 전기적 산화환원 반응 효소를 더욱 포함하는, 현장용 진단 기기.
  7. 청구항 1에 있어서,
    현장용 진단 기기는 가열부 및 측정부를 더욱 포함하는, 현장용 진단 기기.
  8. 청구항 1에 따른 현장용 진단 기기를 이용하여, 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법으로서,
    (a) 플레이트의 웰에 시료를 제공하는 단계;
    (b) 플레이트를 미리 결정된 온도로 미리 결정된 시간동안 유지하는 단계;
    (c) 플레이트를 세척하는 단계;
    (d) 플레이트의 웰에 산화환원반응 기질을 포함하는 용액을 제공하는 단계;
    (e) 프로브의 적어도 일부를 웰에 침지하는 단계; 및
    (f) 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계를 포함하는, 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    (b) 단계는 30분 내지 3 시간 동안, 35 내지 40℃의 온도로 수행되는, 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 방법은 침지된 프로브의 적어도 일부를 세척한 후, 프로브가 침지되지 않은 플레이트의 다른 웰에서 (e) 및 (f)를 반복하여 수행하는 단계를 더욱 포함하는, 시료 내 바이오마커의 농도를 측정하는 방법.
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