KR20200077059A - 시료 내 바이오마커를 이용하는 질병 자가 진단 장치 - Google Patents
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Abstract
본 개시는 시료 내 바이오마커를 이용한 질병 자가 진단 장치로서, 디스플레이부, 조작부, 측정부, 메모리부, 및 계산부를 포함하는 본체; 상기 본체에 탈부착이 가능하며, 적어도 3개의 작업 전극을 포함하는 프로브; 및 상기 프로브에 탈부착이 가능한 카트리지를 포함하며, 여기서 상기 카트리지는 시료 카트리지 또는 시약 카트리지인 질병 자가 진단 장치를 제공한다.
Description
본 개시는 시료 내 존재하는 질병의 바이오마커의 농도를 전기화학적으로 측정하여 해당 질병의 유무를 진단하는 장치에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 소변 내 존재하는 방광암 또는 전립선암의 바이오마커의 농도를 전기화학적으로 측정하여 방광암 또는 전립선암의 유무 및/또는 정도를 진단하는 장치에 관한 것이다.
종래부터 인간으로부터 채취된 혈액, 체세포, 피부 조직, 소변 등을 통해 특정 질병의 보유 여부에 대한 진단을 위한 방안이 논의되어 왔다. 이에, 단백질이나 DNA, RNA, 대사 물질 등으로서, 체내의 질병 발생 등의 변화를 알아낼 수 있는 지표인 바이오마커의 변화를 측정하기 위한 연구가 진행되어 왔다.
특히, 소변을 이용한 질병진단에 관한 연구는 1958년 당과 단백질을 검사할 수 있는 요 검사지가 개발되면서 본격적으로 주목을 받기 시작하였으며, 이후 소변을 이용하여 보다 많은 질병들을 진단하기 위한 시스템 및 이를 이용한 검사법에 대한 연구가 진행되고 있다. 전립선암 또는 방광암을 포함하는 다양한 질병들을 소변을 이용하여 진단하는 경우, 채혈과 같은 침습적인 방법과 달리, 비침습적인 방법을 통해 시료를 얻는 것이 가능하여, 환자의 심적, 육체적 부담을 줄일 수 있다는 이점을 갖는다.
한편, 종래의 요 검사지가 질병 유무를 판단함에 변색 등의 시각적인 판단에 의존한 것과 달리, 전기화학센서를 이용하여 소변 내 존재하는 질병의 바이오마커의 농도를 측정하는 경우, 수치로서 질병의 유무를 판단하는 것이 가능해져 그 신뢰도는 더욱 상승할 수 있다.
방광암의 경우 초기 발병의 진단도 물론 중요하나, 재발 가능성이 높은 질병에 해당하여 재발 여부에 대한 지속적인 모니터링이 특히 중요하다. 그러나 현재 환자가 휴대하기 용이하고, 질병 유무를 간단하게 진단할 수 있는 자가 진단 장치에 대하여는 상용화되어 있지 않은 것이 실정이다. 이에, 지속적인 모니터링을 위하여는 재발 가능성이 있는 환자의 주기적인 병원 방문이 요구되며, 이는 해당 환자에게 시간적, 경제적 부담을 주는 문제가 존재한다.
선행기술 KR 10-2016-0138669는 바이오 마커를 측정할 수 있는 프로브 및 이를 적용한 플랫폼을 개시한다. 그러나 상기 선행기술은 턴테이블 방식을 채용, 펌프를 통해 용기 내로 용액을 공급, 전원 케이블의 필요 등 실험실에서 적합한 방식을 채용하고 있음에 휴대가 어렵다는 한계가 존재한다. 또한, 전기화학적 측정 방법으로서 전하의 측정에 대하여는 개시하지 않는다. 또한, pH에 따른 오차의 보정 방안에 대하여도 고려하고 있지 않는다.
한편, 소변의 pH는 환자에 따라, 환자의 컨디션에 따라 상이할 수 있으며, 상기 pH는 최대 4.6 내지 7.5 사이에 값을 가질 수 있다. 이러한 pH의 차이는 전기화학센서에서 바이오마커와 상기 바이오마커와 항원 항체 반응을 통해 결합하는 항체의 결합도에 영향을 미친다. 상기 결합도 차이로 인하여 발생하는 오차는 최종적으로 소변 내 바이오마커의 농도값의 오차가 되므로, 질병 유무의 진단에 중요한 영향을 미칠 수 있다. 상기와 같은 pH에 의한 정확도의 문제에도 불구하고, 현재 소변의 pH에 따른 항원 항체의 결합도를 고려한 바이오마커의 농도를 측정하는 방법에 대하여는 개발되지 않은 상태여서, 보다 정확한 진단에 어려움이 존재하는 실정이다.
선행 기술 US 2017/0199181 A1은 면역 센서 검출을 위하여 소변 샘플을 수정하기 위한 전기화학적 방법에 관한 것을 개시한다. 그러나 상기 선행 기술은 항원 항체 결합 이후, 전기화학적 산화환원 반응을 위해 사용되는 ALP 효소의 활성을 최적화하기 위해 ALP 효소의 최적 pH로 소변의 pH를 조절하는 것일 뿐, pH에 따른 항원 항체의 결합도를 고려한 것이 아니다.
이에, 휴대성이 우수하고, 일반인인 환자가 사용하기에 용이하며, 진단 결과의 신뢰도가 우수한 질병 자가 진단 장치의 개발이 여전히 요구되고 있다.
따라서, 본 개시의 관점은 질병 유무 및/또는 그 정도를 진단하기 위하여, 휴대성 및 조작성이 용이하고, 진단 결과의 신뢰도가 높은 질병 자가 진단 장치를 제공하는데 있다.
본 개시의 관점을 달성하기 위한 시료 내 바이오마커를 이용한 질병 자가 진단 장치는 디스플레이부, 조작부, 측정부, 메모리부, 및 계산부를 포함하는 본체; 상기 본체에 탈부착이 가능하며, 적어도 3개의 작업 전극을 포함하는 프로브; 및 상기 프로브에 탈부착이 가능한 카트리지를 포함하며, 여기서 상기 카트리지는 시료 카트리지 또는 시약 카트리지이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 시료는 인간으로부터 채취된 체액이며, 상기 체액은 혈액, 침, 땀, 및 소변을 포함한다. 보다 바람직하게는 본 개시에서의 시료는 소변일 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 질병은 전립선암 또는 방광암이며, 상기 바이오마커는 Metrix Metallo Peptidase-9(MMP-9), Apolipoprotein A-1(ApoA1), prostate-specific antigen(PSA), Prostate specific membrane antigen (PSMA), Annexin A3(ANX A3), nuclear matrix protein 22(NMP22), bladder tumor antigen(BTA), 및 urinary bladder carcinoma antigen(UBC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 측정부는 상기 작업 전극으로 전압을 인가함에 따른 전류 또는 전하를 측정하며, 상기 메모리부는 특정 시료 내 바이오마커 농도별 전류 또는 전하 값의 데이터를 포함하고, 상기 계산부는 상기 측정부에서 측정된 전류 또는 전하의 값을 상기 메모리부의 특정 시료 내 바이오마커 농도별 전류 또는 전하 값의 데이터에 기초하여 바이오마커의 농도로 환산한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 측정부는 시료의 pH를 측정하는 pH 측정부를 더욱 포함하고, 상기 메모리부는 pH에 따른 바이오마커의 결합 추세 데이터를 더욱 포함하며, 상기 계산부는 상기 pH 측정부에서 측정되는 시료의 pH 및 상기 메모리부의 pH에 따른 바이오마커의 결합 추세 데이터에 기초하여 상기 측정부에서 측정되는 전류 또는 전하의 값을 보정하고, 상기 보정된 전류 또는 전하의 값을 상기 메모리부의 특정 시료 내 바이오마커 농도별 전류 또는 전하 값의 데이터에 기초하여 바이오마커의 농도로 환산한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 본체는 측정된 전류 및 전하의 값; 및 환산된 바이오마커의 농도의 값을 기록하는 기록부를 더욱 포함한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 프로브는 카운터 전극 및 기준 전극을 포함하며, 상기 작업 전극 및 카운터 전극은 ITO(Indium Tin Oxide) Glass 전극이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 카트리지는 가이드판을 구비한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 시약 카트리지는 세척액을 포함하는 세척 카트리지, 전기적 산화환원 반응 효소를 포함하는 효소 카트리지, 또는 전기적 산화환원 반응 기질을 포함하는 기질 카트리지이다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 전기적 산화환원반응 효소는 HRP(Horseradish peroxidase), ALP(Alkaline phosphatase), 글루코스 옥시다아제(Glucose Oxidase), 루시퍼라이제(luciferase), 베타-디-갈락토시다아제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(MDH: malate dehydrogenase), 및 아세틸콜린에스터라아제(acetylcholinestrerase)의 군으로부터 선택되는 1종의 효소이다.
본 개시의 질병 자가 진단 장치는 휴대성 및 조작성이 용이하여 병원의 방문 없이, 전문 의료인의 지시 및 도움 없이도 환자가 직접 질병의 유무를 확인할 수 있다.
또한, 본 개시의 장치는 종래 전압이 변화하는 방식의 순환전압(Cyclic Voltammetry, CV)법과 달리 정전압을 사용하여 향상된 재현성 및 정밀성을 갖는 것이 가능하다. 또한, 시간대전하(Chronocoulometry, CC)법을 이용함으로써, 시간대전류(Chronoamperometry, CA)법에 비하여 전류의 적분값을 이용하는바, 수학적 신호 증폭을 통한 정밀성의 향상을 도모하는 것이 가능하다.
또한, 본 개시의 장치는 환자별 pH가 시료 내 바이오마커의 농도를 측정함에 미치는 영향을 최소화할 수 있다. 이에, 시료에서의 바이오마커 검출의 정확도를 향상시킬 수 있다. 최종적으로, 질병의 조기진단/예후 및 치료에 큰 개선을 줄 수 있다. 특히, 시료 자체의 pH를 조정하는 기술에 비해, 측정 후 전기적 시그널 값을 pH에 따른 항원 항체 결합의 추세를 이용하여 보정함으로써, pH 제어에 요구되는 버퍼의 사용을 절감할 수 있어, 분석에 있어서 시간, 비용, 노력 측면에서의 이점을 가질 수 있다. 또한, 시료 자체의 pH를 조정하는 경우, pH의 조정의 과정에서 시료 내 존재하는 항원에 영향을 미쳐 항원 항체 반응의 활성을 저하시킬 우려도 있으나, 본 개시의 장치에 적용된 방법의 경우 이러한 위험을 회피할 수 있다.
도 1은 본 개시의 일 구체예에 따른 질병 자가 진단 장치의 사시도이며;
도 2는 도 1의 질병 자가 진단 장치의 분해 사시도이며;
도 3은 본 개시의 일 구체예에 따른 프로브의 측면도이며;
도 4는 본 개시의 일 구체예에 따른 프로브의 배면도이며;
도 5는 본 개시의 일 구체예에 따른 카트리지와 결합된 프로브의 측면도이며;
도 6은 본 개시의 일 구체예에 따른 카트리지의 평면도 및 측면도이며;
도 7은 본 개시의 일 구체예에 따른 효소 카트리지의 평면도 및 측면도이며;
도 8은 본 개시의 일 구체예에 따른 효소 카트리지의 사시도이며;
도 9는 본 개시의 일 실시예에 따라 계산된 pH에 따른 항원 항체 결합의 추세선을 도시한 그래프이며;
도 10은 pH 7.4 조건에서 MMP-9 농도에 따른 전류값을 플롯한 그래프이며;
도 11은 본 개시의 일 구체예에 따른 목적 물질의 효소 반응 및 산화환원 반응의 메커니즘이며;
도 12 내지 14는 종래 순환전압법을 이용하여 측정된 시간에 대한 전류값의 그래프, 시그널 대비 노이즈 지표(S/N ratio), 및 변동 계수이며;
도 15 내지 17은 종래 시간대전류법을 이용하여 측정된 시간에 대한 전류값의 그래프, 시그널 대비 노이즈 지표, 및 변동 계수이며;
도 18 내지 20은 본 개시의 일 구체예에 따른 시간대전하법을 이용하여 측된 시간에 대한 전하값의 그래프, 시그널 대비 노이즈 지표, 및 변동 계수이며;
도 21은 0.4V 및 0.45V가 인가될 때의 시그널 대비 노이즈 지표 및 변동계수이다.
도 2는 도 1의 질병 자가 진단 장치의 분해 사시도이며;
도 3은 본 개시의 일 구체예에 따른 프로브의 측면도이며;
도 4는 본 개시의 일 구체예에 따른 프로브의 배면도이며;
도 5는 본 개시의 일 구체예에 따른 카트리지와 결합된 프로브의 측면도이며;
도 6은 본 개시의 일 구체예에 따른 카트리지의 평면도 및 측면도이며;
도 7은 본 개시의 일 구체예에 따른 효소 카트리지의 평면도 및 측면도이며;
도 8은 본 개시의 일 구체예에 따른 효소 카트리지의 사시도이며;
도 9는 본 개시의 일 실시예에 따라 계산된 pH에 따른 항원 항체 결합의 추세선을 도시한 그래프이며;
도 10은 pH 7.4 조건에서 MMP-9 농도에 따른 전류값을 플롯한 그래프이며;
도 11은 본 개시의 일 구체예에 따른 목적 물질의 효소 반응 및 산화환원 반응의 메커니즘이며;
도 12 내지 14는 종래 순환전압법을 이용하여 측정된 시간에 대한 전류값의 그래프, 시그널 대비 노이즈 지표(S/N ratio), 및 변동 계수이며;
도 15 내지 17은 종래 시간대전류법을 이용하여 측정된 시간에 대한 전류값의 그래프, 시그널 대비 노이즈 지표, 및 변동 계수이며;
도 18 내지 20은 본 개시의 일 구체예에 따른 시간대전하법을 이용하여 측된 시간에 대한 전하값의 그래프, 시그널 대비 노이즈 지표, 및 변동 계수이며;
도 21은 0.4V 및 0.45V가 인가될 때의 시그널 대비 노이즈 지표 및 변동계수이다.
본 개시의 목적, 특정한 장점들 및 신규한 특징들은 첨부된 도면들과 연관되는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이나, 본 개시가 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 개시를 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 개시의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다.
본 개시는 시료 내 바이오마커를 이용한 질병 자가 진단 장치에 관한 것이다. 본 개시에서 상기 '시료'란 동물로부터 얻어지는 체액일 수 있다. 보다 구체적으로는 상기 시료는 인체로부터 얻어지는 체액일 수 있다. 여기서 상기 체액은 예컨대 혈액, 침, 땀, 소변 등을 의미하며, 상기 예에 한정되지 않고, 분석하고자 하는 목적 물질이 체액 내 존재한다면 이용 가능하다. 상기 체액은 인간으로부터 분리/채취된 체액을 의미한다.
본 개시의 진단 장치에 대상이 되는 질병으로는 체액 내 존재하는 바이오마커의 농도를 통해 진단 가능하다면 그 대상이 될 수 있으나, 본 개시의 일 구체예에 따르면 상기 질병은 암일 수 있으며, 구체적으로는 방광암 또는 전립선암, 보다 구체적으로는 방광암일 수 있다. 특히 방광암의 경우 전술한 바와 같이, 재발 가능성이 높다는 문제가 존재하므로, 본 개시의 장치를 이용하면 매우 잦은 주기로 병원을 방문하지 않더라도 환자의 소변을 이용하여 방광암의 재발 여부, 증세의 악화여부를 환자가 직접 확인할 수 있어, 환자의 시간적, 경제적 비용에 따른 부담을 경감시킬 수 있다.
본 개시의 장치에 대상이 되는 바이오마커는 대상이 되는 질병에 따라 상이할 수 있다. 예컨대, 진단의 대상이 되는 질병이 전립선암 또는 방광암인 경우, 대상이 되는 바이오마커는 Metrix Metallo Peptidase-9(MMP-9), Apolipoprotein A-1(ApoA1), prostate-specific antigen(PSA), Prostate specific membrane antigen (PSMA), Annexin A3(ANX A3), nuclear matrix protein 22(NMP22), bladder tumor antigen(BTA), 및 urinary bladder carcinoma antigen(UBC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종일 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 있어서, 상기 바이오마커는 MMP-9일 수 있다. 또한, 본 개시의 다른 구체예에서 상기 바이오마커는 MMP-9, ApoA1, 및 NMP22일 수 있으며, 이들은 하나의 시료로부터 후술하는 복수의 작업 전극에 의해 각각 측정될 수 있다.
MMP-9의 경우, 주로 종양 세포 자체에서 생산되며, 암세포의 전이가 일어나는 과정에서 세포 외 기질을 분해시키는 중요한 효소로 알려져 있다. 오늘날 방광암과 관련하여 주로 MMP-1, 2, 9 등이 연구되고 있으며, 특히 MMP-2, 9 및 Tissue inhibitor of metalloproteinases 2(TIMP-2)가 고등급, 고병기 방광암 및 방광암의 재발에 관여한다는 사실이 보고되고 있다. 상기 MMP-9의 Cut-off value는 8.7ng/ml (european urology, 2007, (52), 1388-1397)이며, 소변 내 상기 value 이상의 MMP-9이 존재하는 경우, 방광암으로 진단하고 있다.
도 1은 본 개시의 일 구체예에 따른 질병 자가 진단 장치의 사시도를 나타낸다. 도 1을 참조하면, 본 개시의 장치는 크게 본체(100); 프로브(200); 및 카트리지(300)로 구성됨을 알 수 있다.
본체
먼저, 상기 본체에 관하여 설명하면, 본 개시의 상기 본체는 디스플레이부(110), 조작부(120), 측정부, 메모리부, 및 계산부를 포함할 수 있다.
상기 디스플레이부는 상기 장치의 전기화학적 측정 결과, 바이오마커의 농도, 질병의 유무 및 정도를 출력한다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 출력되는 결과들은 구체적인 수치로 나타날 수 있다. 본 개시의 다른 구체예에 따르면, 상기 출력되는 결과는 수치와 함께 색으로 표현될 수 있으며, 예컨대 질병이 없는 경우 초록, 질병 가능성이 있는 경우 노랑, 질병이 존재하는 경우 빨강과 같이 표현될 수 있다. 또한 상기 색은 질병의 정도에 따라, 즉 바이오마커의 시료 내 농도에 따라 연한 빨강에서 짙은 빨강으로 구별되어 나타날 수 있다.
본 개시의 조작부(120)는 바이오마커 농도의 전기화학적 측정 실시를 제어할 수 있고, 상기 디스플레이부가 나타내는 측정 및 진단 결과의 표현 방식을 설정 및 변경하는 것이 가능하며, 본 개시의 장치의 온/오프 기능을 포함할 수 있다. 본 개시의 조작부(120)는 바이오마커 농도의 전기화학적 측정 실시와 관련하여, 시료의 종류 설정, 바이오마커 종류의 설정, 측정 시작/종료, 분석 등을 제어할 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 조작부는 디스플레이부와 구별되어 별도의 버튼으로 구비될 수 있다. 본 개시의 다른 구체예에 따르면, 상기 조작부는 디스플레이부와 일체로 구현되어 디스플레이 내에서 터치 방식으로 작동을 수행할 수 있다.
본 개시의 측정부는 프로브의 작업 전극으로 소정의 전압을 인가함으로써 발생되는 전기적 시그널을 측정한다. 상기 전기적 시그널은 전류 또는 전하일 수 있고, 전기적 시그널의 정밀성의 관점에서는 바람직하게는 전하일 수 있다.
일반적으로 이용되는 전기화학적 측정 방법으로는 순환전압법이 사용되어 왔다. 순환전압법은 작업 전극의 전압을 일정 속도로 순환시켜 전류를 측정하는 방법으로서, 이를 통해 순환전압전류 곡선을 얻을 수 있다. 그러나 순환전압법의 경우, 정전압과 달리 전압이 계속 변화하므로 전압의 컨트롤이 어려워 기기 비용이 비싸고, 오차 범위도 전류를 컨트롤하는 것보다 크다는 단점을 갖는다. 나아가 상기 이유에서 순환전압법을 이용하는 경우 산화 환원 전류의 최대 피크의 위치가 달라질 수 있어, 측정 전류의 높은 재현성을 갖기 어려운 문제가 있다.
이와 달리, 시간대전류법은 평형을 이루고 있는 전극에 전기화학 반응을 유도할 수 있는 충분히 큰 값의 전압을 스텝으로 인가하게 되면 전류의 흐름이 관찰되는데, 이와 같이 인가한 전압 스텝에 대하여, 시간에 따른 전류 신호를 관찰하는 방법을 의미한다. 이를 통해 시간대전류 곡선을 얻을 수 있다. 시간대전류법의 경우, 정전압을 사용하기 때문에 전압이 변화하는 순환전압법에 비해 유리한 이점을 갖는다.
또한, 시간대전하법은 인가한 전압 스텝에 대하여, 시간에 따른 전하 신호를 관찰하는 방법을 의미한다. 시간대전하법의 경우 시간대전류법과 마찬가지로 정전압을 사용하므로 순환전압법에 비해 유리한 이점을 갖는다. 특히 시간대전하법은 전하의 적분값을 이용하는바, 시간대전류법에 비하여 수학적 신호 증폭을 통한 정밀성의 향상을 도모하는 것이 가능하다.
이에, 본 개시의 측정부는 전기화학적 측정 방법으로서 시간대전하법 및 시간대전류법을 이용할 수 있다. 보다 바람직하게는 본 개시의 측정부는 전기화학적 측정방법으로서 시간대전하법을 이용할 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 정전압은 30 내지 200초 동안, 바람직하게는 40 내지 80초 동안, 보다 바람직하게는 40 내지 60초 동안 인가될 수 있다. 상기 인가 시간은 측정 시간에 비례하는바, 현장 자가진단 목적의 관점에서 짧을수록 좋다. 그러나 30초 미만의 인가 시간은 변동 계수도 크고, 동일한 조건에서 반복 실험시 S/N ratio의 편차도 커서 재현성의 관점에서 바람직하지 않다.
상기 S/N ratio는 동일한 조건에서 측정된 전류 또는 전하값의 시그널 대 노이즈의 지표로서, 재현성의 관점에서 상기 S/N ratio가 일정하게 나타날수록 바람직하다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 동일한 조건에서 상기 S/N ratio의 편차는 10 이하, 바람직하게는 5 이하, 보다 바람직하게는 3 이하일 수 있다.
변동 계수(coefficient of variation)란 일반적으로 표준 편차를 산술 평균으로 나눈 것으로 정의되며, 본 개시에 있어서 변동 계수란 동일한 조건 하에서 시간대전하법을 통해 3회 이상 반복 측정된 전하량에 대한 표준 편차를 상기 전하량의 산술 평균으로 나눈 것을 의미한다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 측정되는 전하값은 동일 조건 하에서 반복 측정시 변동 계수가 15% 이하, 바람직하게는 12% 이하, 보다 바람직하게는 10% 이하일 수 있다. 변동 계수가 15% 이하, 특히 10% 이하인 경우에 우수한 재현성 및 정밀성을 가진다고 볼 수 있으므로, 상용화의 관점에서 바람직하다.
본 개시의 메모리부에는 각 질병에 대응되는 데이터 값이 미리 저장되어 있다. 예를 들어, 상기 메모리부에는 특정 질병에 관한 시료 내 정상인의 바이오마커 수치 데이터, 환자의 바이오마커 수치 데이터가 저장되어 있을 수 있다. 또한, 상기 메모리부에는 미리 실험을 통해 밝혀진 특정 시료 내 바이오마커 농도 및 전류의 상관관계에 관한 데이터 또는 미리 실험을 통해 밝혀진 특정 시료 내 바이오마커 농도 및 전하의 상관관계에 관한 데이터가 저장되어 있을 수 있다. 즉, 상기 메모리부는 특정 시료 내 바이오마커 농도별 전류 또는 전하 값의 데이터를 포함할 수 있다. 상기 메모리부에 저장된 데이터로부터 본 개시의 장치 중 측정부를 통해 측정된 전하 또는 전류 값을 시료 내 바이오마커의 농도로 환산하는 것이 가능하다. 상기 메모리부는 본 개시의 휴대용에 적합한 진단 장치로서의 크기 및 무게에 제한을 가하지 않으면서, 상기와 같은 데이터를 저장하는 것이 가능하다면 그 종류가 특별히 제한되지 않는다.
본 개시의 계산부는 상기 측정부에서 측정된 전기적 시그널 값을 메모리부에 미리 저장되어 있는 데이터에 기초하여 시료 내 특정 바이오마커의 농도로 환산하는 기능을 한다. 또한, 상기 계산부는 상기 환산된 바이오마커 농도 값과 상기 메모리부에 미리 저장되어 있는 정상인 및 환자의 바이오마커 농도 데이터를 비교하여 측정 대상인 시료가 채취된 인체의 질병 보유 여부 및 정도를 분석하는 것이 가능하다.
한편, 상기 측정 및 계산에서 있어서, 환자마다 채취되는 시료의 pH가 상이할 수 있다. 또한, 동일 환자라고 할지라도 환자의 당일 식사 이력, 컨디션, 수분 섭취량 등에 따라 pH가 상이할 수 있다. 시료의 pH가 상이한 경우 바이오마커와 상기 바이오마커와 항원 항체 반응을 통해 결합하는 항체의 결합도에 영향을 미친다. 상기 결합도 차이로 인하여 발생하는 오차는 최종적으로 소변 내 바이오마커의 농도값의 오차가 되므로, 질병 유무의 진단에 중요한 영향을 미칠 수 있다.
이에, 본 개시의 질병 자가 진단 장치는 측정된 시료의 전기적 시그널에 대하여 pH에 의해 발생하는 오차를 보정해주는 기능을 또한 포함할 수 있다.
이에 본 개시의 본체에서, 상기 측정부는 pH 측정부를 포함할 수 있다. 상기 pH 측정부는 시료의 pH를 측정하는 기능을 수행한다. 본 개시의 진단에 영향을 주는 것 없이 시료 내 pH를 측정하는 것이 가능하다면 특별한 제한 없이 공지의 pH 측정 방법이 적용될 수 있다. 상기 pH 측정부에서 측정된 시료의 pH는 후술하는 pH에 따른 바이오마커의 결합 추세 데이터와 함께 원하는 특정 pH에서의 바이오마커의 전기적 시그널을 계산하는데 사용된다.
또한, 상기 메모리부에는 시료별 pH에 따른 바이오마커의 결합 추세 데이터가 미리 저장될 수 있다. 여기서 바이오마커의 결합이란 시료 내의 바이오마커가 작업 전극에 고정되는 항체와 항원 항체 결합을 통해 결합되는 것을 의미한다.
상기 결합 추세 데이터는 하기와 같은 방법을 통해 미리 얻어질 수 있다.
본 개시의 pH에 따른 바이오마커 결합의 추세를 결정하는 방법은 바이오마커를 포함하며, 4 ≤ pH1, pH2, ..., pHn ≤10인 상이한 pH를 갖는 n개의 버퍼 용액을 준비하는 단계; 작업 전극 표면 상에 항체가 고정된 전기화학센서를 이용하여, 상기 각각의 버퍼 용액에서의 바이오마커 및 항체의 결합에 따른 전기적 시그널을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 전기적 시그널로부터 바이오마커와 항체 간 pH에 따른 결합도의 추세선을 계산하는 단계를 포함한다.
상기 버퍼 용액은 동일한 바이오마커를 동일한 농도로 포함한다. 상기 버퍼 용액은 바람직하게는 5≤ pH1, pH2, ..., pHn ≤9인 상이한 pH를 갖는 n개의 버퍼 용액일 수 있다. 여기서 상기 n은 5 이상의 정수일 수 있으며, 예컨대 5, 6, 10, 12, 20, 및 50일 수 있다.
상기 버퍼 용액은 바이오마커의 대응 항체와의 항원 항체 반응에 영향을 미치지 않으면서 원하는 pH로의 제어가 가능하다면 특별히 제한되지 않는다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 버퍼 용액은 시트르산 버퍼, 인산염완충식염수 버퍼, 또는 탄산염완충식염수 버퍼을 포함할 수 있다. 버퍼 용액의 pH 4 내지 8로의 조정은 시트르산 버퍼 또는 인산염완충식염수 버퍼가 사용될 수 있다. 또한, 버퍼 용액의 pH 8 초과 내지 10으로의 조정은 탄산염완충식염수 버퍼가 사용될 수 있다.
상기 바이오마커를 포함하는, 상이한 pH를 갖는 버퍼 용액의 각각에 대하여, 작업 전극 표면 상에 항체가 고정된 전기화학센서를 이용하여, 바이오마커 및 항체의 결합에 따른 전기적 시그널을 측정한다. 상기 전기적 시그널의 측정은 작업 전극을 버퍼 용액에 침지하여, 바이오마커와 항체의 항원 항체 결합 반응을 수행하고, 상기 침지된 작업 전극에 전기적 산화환원반응 효소를 처리한 후, 전기적 산화환원반응 기질을 포함하는 용액에 침지하고 산화환원 전압을 인가하여 산화환원 반응에 따른 전기적 시그널을 측정할 수 있다. 이를 pH가 상이한 각각의 버퍼 용액에 반복적으로 수행하여, 상이한 pH에 대한 바이오마커 및 항체의 결합에 따른 전기적 시그널을 측정할 수 있다.
상기 전기적 시그널의 측정은 또한, 순환전압법을 이용하여 수행될 수 있다. 순환전압법을 사용하는 경우, 상기 전기적 시그널은 각각의 버퍼 용액에 침지된 작업 전극에 대하여 특정의 동일한 전압에서 발생한 전류값을 의미하며, 상기 특정 전압은 상기 효소 및 기질의 반응이 최대로 활성화될 수 있는 전압인 것이 바람직하다. 효소 및 기질의 반응이 최대로 활성화될 수 있는 전압에서의 전류값을 측정함으로써, 그 외의 변수를 최소화하여, 상이한 pH를 갖는 버퍼 용액들에서의 항원 항체 결합에 따른 전기적 시그널의 추세의 신뢰성을 높일 수 있다.
예컨대, 전기적 산화환원반응 효소로서 ALP를 사용한 경우, 선행특허출원 KR 10-2017-0154148에서 개시하고 있는 바와 같이, 0.34V의 전압에서 측정되는 각각의 전류값을 이용하여 추세를 결정함이 바람직하다.
상기 상이한 pH를 갖는 버퍼 용액으로부터 측정된 전기적 시그널을 이용하여, x축을 pH 값, y축을 전기적 시그널로 하는 추세선을 계산할 수 있다. 본 개시의 구체예를 따르면, 상기 추세선의 결정계수(R2)는 0.95 이상, 바람직하게는 0.97 이상, 보다 바람직하게는 0.99 이상일 수 있다. 상기 결정계수의 값이 1에 근사할 수록 바이오마커와 항체 간 pH에 따른 결합도의 추세의 신뢰도는 상승한다.
일단 특정 항원에 대하여 상기의 추세 결정 방법을 통해 pH에 따른 바이오마커 결합의 추세를 결정하고, 이를 메모리부에 저장하였다면, 상기 특정 항원에 대하여는 추후 추세 결정을 위한 별도의 실험이 요구되지 않는바, 시간적, 비용적 관점에서 매 진단 시마다 시료에 pH 적정을 수행한 후, 전기적 시그널을 측정하는 것보다 유리한 이점을 갖는다.
전술한 pH 측정부에서 측정된 시료의 pH 값과 메모리부에 미리 저장되는 pH에 따른 바이오마커의 결합 추세 데이터에 기초하여, 상기 계산부는 측정부에서 측정된 전기적 시그널을 미리 특정된 pH에서의 전기적 시그널로 보정할 수 있다. 상기 보정을 통해 질병 유무의 판단 기준이 되는 미리 특정된 pH에서의 바이오마커의 농도를 계산하는 것이 가능하다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 측정된 전기적 시그널은 상기 보정을 통해 pH가 7.4일 때의 전기적 시그널로 보정될 수 있다. 이렇게 보정된 전기적 시그널은 전술한 바와 같이 계산부를 통해 상기 메모리부에 미리 저장되어 있는 데이터에 기초하여 시료 내 특정 바이오마커의 농도로 환산될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 본체는 기록부 및 전원부를 더욱 포함할 수 있다. 상기 기록부는 측정부에서 측정되는 전기적 시그널 값, 계산부를 통해 환산된 바이오마커 농도의 값, 및 판단된 진단 결과를 기록할 수 있다. 이를 통해, 환자의 몸 상태의 경과를 지속적으로 관찰하는 것이 가능하다. 또한, 상기 전원부는 본 개시의 진단 장치에 전력을 공급하는 기능을 수행하며, 휴대성을 해치지 않는다면 그 종류는 특별히 제한되지 않으며, 휴대성 및 재충전성의 관점에서 내장 배터리, 건전지 등이 바람직하다.
프로브
본 개시의 일 구체예에 따른 질병 자가 진단 장치의 분해 사시도을 도시한 도 2를 참조하면, 본 개시의 프로브(200)는 후술하는 카트리지(300) 내에서 시료와 직접적으로 접촉하는 전극(210, 220, 230)을 포함한다. 상기 시료와 접촉하는 전극의 부분과 반대 부분에서 전극(210, 220, 230)은 본체(100)와 접촉한다. 상기 전극의 본체와의 접촉은 전압의 인가 및 전기적 시그널의 측정에 지장을 주지 않는다면 특별히 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 프로브 내의 전극은 본체와 포고핀(pogo pin) 또는 핑거 스프링(finger spring)을 이용하여 연결될 수 있다. 포고핀을 이용하는 경우 전극과 본체가 연결될 시에 포고가 본체 내로 더욱 들어가면서 동시에 전극의 접촉 부분을 눌러주어 접촉 및 전극 고정의 동시 기능을 수행할 수 있는 점에서 유리한 이점을 갖는다. 또한, 핑거 스프링을 사용하는 경우 프로브를 본체로부터 분리하지 않고도 전극만을 분리하는 것이 가능해져서 프로브 전체 교체에 따른 비용 부담을 저감할 수 있다.
본 개시의 프로브(200)는 본체(100)와의 탈부착이 가능하며, 본체(100)와의 결합에 있어서 그 방식은 반복적인 탈부착을 제한하지 않는다면 공지의 방식으로 결합되어도 무방하다. 본 개시의 일 구체예에 따르면 상기 프로브(200)는 일회용일 수 있다. 종래 진단 기기에서는 프로브 내 전극의 교체가 불가하여, 세척 후의 반복적인 사용을 하였으나, 이 경우 반복 세척에도 불구하고 지속적으로 이물질이 전극 표면 상에 부착될 수 있어 전기적 시그널 측정의 민감도가 저감되는 문제가 존재하였다. 이에, 일회용 프로브를 채택함으로써 이러한 문제점을 극복하는 것이 가능하다.
본 개시의 프로브는 카운터 전극(210), 기준 전극(220), 및 작업 전극(230)을 포함할 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 작업 전극은 적어도 3개일 수 있다. 도 3은 본 개시의 일 구체예에 따른 프로브의 측면도이며, 도 4는 본 개시의 일 구체예에 따른 프로브의 배면도이다. 도 3 및 도 4에서 도시하는 바와 같이, 프로브 내에 배치되는 복수의 작업 전극(230) 각각은 기준 전극(220)과 동일한 거리만큼 이격되어 배치되어야 한다. 이는 작업 전극과 기준 전극의 거리에 따라 저항이 변동되기 때문이다. 본 개시의 일 구체예에 따른면, 본 개시의 복수의 작업 전극(230)은 기준 전극(220)을 원점으로 하여 하나의 원 상에 배치될 수 있다.
본 개시에서 사용되는 전극(210, 220, 230)은 예를 들어, 수은 전극, 아말감 전극, Pt, Au, Pd, Rh 전극과 같은 귀금속 전극, 열분해 흑연(pyrolytic graphite) 전극, 유리 탄소(glassy carbon) 전극, 탄소 페이스트 전극, 탄소 섬유 전극과 같은 탄소 전극, 인듐 산화 주석(Indium tin oxide, ITO) 전극 등일 수 있다. 본 개시의 일 구체예에 따르면 상기 카운터 전극(210) 및 작업 전극(230)은 ITO glass 전극이며, 상기 기준 전극(220)은 Ag/AgCl 전극일 수 있다. 특히 ITO glass 전극은 바이오 센서에 적용 시, 시그널의 노이즈를 줄일 수 있고 별도의 점착층 없이 유기 기판 상에 ITO 박막이 침적된 기판을 그대로 사용할 수 있는 장점이 있다. 상기 ITO glass 전극은 디스플레이 산업 등에서 대형 기판 상에 높고 안정적인 전기전도성 특성을 갖는 박막 기판 제조 공정을 동일하게 활용할 수 있으므로, 매우 저렴하게 전극으로 제작이 가능하다는 이점을 갖는다.
상기 작업 전극(230)은 후술하는 카트리지 내에서 시료와 접촉하여 시료 내 바이오마커의 결합을 유도한다. 이에, 상기 바이오마커의 결합을 위하여 작업 전극(230)에는 항체가 고정된다. 본 개시에 있어서, 상기 항체는 상기 바이오마커와 결합할 수 있는 항체로서, 작업 전극 상에서 바이오마커를 캡처할 수 있는 항체를 의미한다.
상기 캡처 항체의 종류는 해당 바이오마커를 캡처하는 것이 가능하다면 특별히 제한되지 않는다. 상기 항체는 작업 전극의 표면 상에 직접적 또는 간접적으로 고정될 수 있다. 본 개시에서, 직접적 고정 또는 결합이란 두 물체의 사이에 별도의 매개, 물질, 또는 물체의 존재 없이 두 물체가 고정 또는 결합된 것을 의미한다. 또한, 간접적 고정 또는 결합이란, 두 물체의 사이에 별도의 매개, 물질, 또는 물체가 존재하여 이들을 고정 또는 결합시키는 것을 의미한다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 항체는 작업 전극의 표면 상에 연결 화합물을 통해 간접적으로 고정될 수 있다. 여기서 연결 화합물이란 작업 전극 및 항체를 연결하는 화합물을 의미하며, 상기 연결 화합물로서 생화학적 반응 결합물인 비오틴-아비딘 또는 비오틴-스트렙타비딘(streptavidin)이 이용될 수 있다. 또한, 화학적 공유 결합물로서, 단백질의 프라이머리 아민과 결합하는 카보디이미드(carbodiimide) 가교제 또는 석신이미드(succinimide) 가교제가 이용될 수 있다.
본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 항체는 연결 화합물로서 비오틴-아비딘을 이용하여 작업 전극의 표면 상에 고정될 수 있다. 다시 말해, 본 개시에서는 연결 화합물로서 바람직하게는 비오틴-아비딘 결합 화합물이 이용될 수 있다. 화학적 공유결합을 이용하여 효소를 고정하는 방법의 경우, 고정화되는 효소의 방향성의 무작위성이 존재하지만, 비오틴-아비딘 결합 화합물을 이용하는 경우, 고정화되는 효소의 바인딩 사이트의 표면적 표출 방향성의 제어가 용이하여, 표면 상에 효소의 적절한 방향성 제어로 효소의 바인딩 사이트의 표면적 표출을 극대화할 수 있고, 이를 통해 시료 내 목적 물질의 검출 능력을 극대화시킬 수 있다.
카트리지
다시 도 2를 참조하면, 본 개시의 질병 자가 진단 장치는 카트리지(300)를 포함한다. 또한, 본 개시의 카트리지(300)는 시료 카트리지 또는 시약 카트리지로 구성된다. 상기 카트리지(300)는 프로브(200)와의 탈부착이 가능하며, 프로브(200)와의 결합에 있어서 그 방식은 반복적인 탈부착을 제한하지 않는다면 공지의 방식으로 결합되어도 무방하다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 도 5에 도시된 바와 같이, 프로브(200)의 하단의 내측과 카트리지(300)의 외측이 접촉하는 방식으로 프로브와 카트리지가 결합될 수 있다. 이 경우, 후술하는 가이드판(340)과 함께 프로브가 카트리지의 내용물의 외부 환경과의 접촉을 물리적으로 차단함으로써 카트리지의 내용물의 오염을 보다 방지할 수 있다는 이점이 존재한다.
본 개시의 일 구체예에 따르면 상기 카트리지(300)는 일회용일 수 있다. 시료 및 시약의 경우 외부 환경에 노출됨으로써 오염될 가능성이 존재하는바, 동일한 시료 및 시약의 반복적인 사용은 진단의 정확도에 귀결된다. 이에 일회용 방식의 카트리지를 사용함으로써 이러한 오염의 문제를 경감시키는 것이 가능하다.
또한, 본 개시의 일 구체예에 따르면 상기 카트리지(300)은 가이드판(340)을 구비할 수 있다. 상기 가이드판은 카트리지 내에 공급하는 시료 또는 시약의 적정량을 이용자에게 안내하며, 이와 함께 외부 오염 물질의 물리적 차단의 기능을 갖는다. 상기 가이드판의 형태는 상기 기능에 부합하는한 특별히 제한되지 않으나, 본 개시의 일 구체예에 따르면 도 6의 평면도로 도시된 바와 같이, 프로브의 전극(210, 220, 230)이 관통할 수 있는 개구(310, 320, 330)를 구비하는 형태를 취할 수 있다.
또한, 본 개시의 카트리지는 필름을 통해 밀봉된 형태로 제공될 수 있다. 상기 필름은 외부 물질을 차단이 가능하고, 시약 카트리지의 경우 내부 시약과의 반응성이 없는 것이면 충분하고 특별히 제한되지 않는다.
본 개시의 시료 카트리지란 시료를 담을 수 있는 카트리지를 의미하며, 보다 구체적으로는 소변을 담을 수 있는 카트리지를 의미한다. 상기 시료 카트리지는 비어 있는 상태로 이용자에게 제공되며, 이용자가 진단 장치를 이용하고자 하는 경우 바로 직전에 신체로부터 채취되는 시료를 상기 시료 카트리지에 공급하여 이용할 수 있다. 상기 시료 카트리지를 프로브와 결합하면, 작업 전극에 고정된 항체와 시료 내 바이오마커가 항원 항체 결합을 통하여 서로 결합한다.
본 개시의 시약 카트리지란 질병 진단에 사용되는 시약이 담겨져 제공되는 카트리지로서, 상기 시약 카트리지는 세척 카트리지, 효소 카트리지(400), 기질 카트리지를 포함한다. 먼저, 효소 카트리지(400)는 전기적 산화환원 반응 효소를 포함한다. 본 개시의 일 구체예에 따르면, 상기 효소 카트리지는 시료 카트리지와 동일한 구조를 가질 수 있다. 즉, 효소 카트리지는 도 6에 도시된 바와 같은 카트리지의 구조를 취할 수 있다. 본 개시의 다른 구체예에 따르면, 상기 효소 카트리지(400)는 도 7 및 8에 도시된 바와 같은 구조를 취할 수 있다. 도 7을 참조하면, 상기 효소 카트리지(400)는 작업 전극의 수에 대응하는 적어도 3개의 효소 격실(440)을 구비할 수 있다. 효소의 경우 일반적으로 그 가격이 비싸며, 바이오마커의 전기화학적 측정에 있어서, 상기 효소는 작업 전극에만 고정되면 족하기에 효소는 효소 카트리지 중 효소 격실 내에만 존재하며, 상기 격실은 작업 전극의 격실 내에 침지되기에 충분한 크기를 갖도록 설계될 수 있다.
본 개시에서 상기 전기적 산화환원 반응 효소란 전기적 산화환원 반응 기질을 산화환원 반응이 가능하도록 활성화시키는 물질을 의미한다. 예를 들어, 상기 전기적 산화환원 반응 효소는 포스파타제(Phosphatase), 퍼옥시다제(Peroxidase), 글루코스 옥시다제(Glucose Oxidase), 루시퍼라제(luciferase), 베타-디-갈락토시다제(β-D-galactosidase), 말산탈수소효소(malate dehydrogenase, MDH), 아세틸콜린에스터라제(acetylcholinesterase) 등일 수 있다. 특히 바람직하게는 상기 효소는 알칼리성 포스파타제(Alkaline phosphatase, ALP) 또는 호스래디시 퍼옥시다제(Horseradish peroxidase, HRP)일 수 있다. ALP 및 HRP는 매우 민감한 반응성을 갖는 이점이 있으며, 특히 HRP의 경우 저렴하여 비용 측면에서 이점이 있다. 또한, ALP의 경우 약 24 내지 48시간의 긴 시그널 유지 시간을 갖는 점에서 유리한 이점이 있다.
본 개시의 프로브와 시료 카트리지를 결합하여 바이오마커의 항원 항체 결합을 수행한 이후에, 시료 카트리지를 프로브로부터 분리하고, 효소 카트리지를 프로브에 결합시킬 수 있다. 이를 통해, 프로브 내 작업 전극이 효소가 담겨있는 효소 격실에 침지되어 상기 효소가 작업 전극에 결합된 바이오마커와 결합하게 된다.
한편, 본 개시의 기질 카트리지는 전기적 산화환원 반응 기질을 포함한다. 본 개시에서 전기적 산화환원반응 기질이란 활성화된 후, 작업 전극을 통해 전압이 인가되었을 때, 상기 인가된 전압에 의해 산화환원 반응이 진행되어 전자를 흡수 또는 방출함으로써 전류를 발생시키는 물질을 의미한다. 예컨대, 도 11에 도시된 바와 같이, 전기적 산화환원반응 효소로서 ALP(alkaline phosphatase)가 사용되는 경우, 전기적 산화환원반응 기질로서 AAP(ascorbic acid-2-phosphate)가 사용될 수 있다. 상기 AAP는 ALP에 의해 포스페이트 작용기가 분리되어 효소 반응 생성물로서 AA(ascorbic acid)로 전환된다. 상기 AA는 작업 전극을 통해 인가된 산화 전압에 의해서 탈수소 아스코르브산염(dehydroascorbate)로 산화된다. 상기 산화 반응 시 발생하는 전기적 시그널이 측정되어, 이로부터 시료 내 원하는 목적 물질의 농도를 계산할 수 있다.
본 개시의 기질 카트리지는 시료 카트리지와 동일한 구조를 가질 수 있다. 상기 기질 카트리지가 프로브와 결합됨으로써, 프로브 내 모든 전극(210, 220, 230)은 전기적 산화환원반응 기질 내에 침지된다. 전기적 산화환원반응 효소에 의해 전기적 산화환원반응 기질이 활성화되기에 충분한 시간이 경과한 후 작업 전극에 전압을 인가하면 전기적 시그널을 측정하는 것이 가능하다.
본 개시에서 이용하는 시간대전하법은 상기 작업 전극에 정전압을 인가하는 바, 시간에 따라 전압이 변하는 순환전압법에 비하여 전압의 제어가 용이하고, 이에 따라 측정의 재현성이 우수해지는 이점을 갖는다. 본 개시에서 인가되는 정전압의 양은 효소 반응 생성물의 종류에 따라서 달라질 수 있다. 물의 산화 환원전압이 1.23V이므로 1.23V 이하에서 수용액상 전기화학적 활성화 물질의 최적 산화환원 전압이 정해진다. 본 개시의 일 구체예에 따르면 약 0.1 내지 1V 사이에서 인가되는 정전압의 양이 정해질 수 있다. 예컨대 효소 반응 생성물로서 AA의 경우, 상기 인가되는 정전압은 0.3 내지 0.6V, 바람직하게는 0.4 내지 0.5V, 가장 바람직하게는 0.45V일 수 있다. 상기 정전압이 0.3V 미만인 경우, 전압이 충분하지 못해서 변동계수가 증가하는 문제가 발생할 수 있다. 도 12에서와 같이 AA의 0.3V 이후 0.6V 이전에 전극 표면에서 전기화학 반응이 극대화된다. 0.3V 이전엔 AA의 완전한 전기화학반응을 얻기 전이므로 산화 전류 값이 불안정할 수 있기 때문이다. 이로 인해 결과값들의 오차가 클 확률이 증가한다. 반면, 전압이 0.6V 이상인 경우 AA가 아닌 AAP가 환원될 수 있어, 백그라운드 시그널이 크게 올라가 정확한 측정이 불가능한 문제가 발생할 수 있다.
본 개시의 세척 카트리지는 세척액을 포함하며, 시료 카트리지 및 효소 카트리지의 프로브에의 결합 및 분리 후 전극(210, 220, 230)에 고정되지 않은 상태로 잔류하는 시료 및 전기적 산화환원반응 효소를 제거하는 기능을 수행할 수 있다. 상기 세척액은 전극에 고정된 바이오마커 및 전기적 산화환원반응 효소를 제거하지 않으면서 이물질을 제거할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 본 개시의 일 구체예에 따르면 상기 세척액은 식염수일 수 있다. 예컨대, 상기 세척액은 PBS(Phosphate Buffered Saline)(pH 7.4): NaCl 0.137 M, KCl 0.0027 M, Na2HPO4 0.01 M, KH2PO4 0.0018 M일 수 있다.
이하, 본 개시의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 제시하지만, 하기의 실시예는 본 개시를 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 개시가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
I. pH에 따른 전기적 시그널의 보정 및 방광암의 진단 방법론
본 개시의 질병 자가 진단 장치에 적용되는 pH에 따라 발생할 수 있는 오차의 보정은 하기와 같은 방법에 의하여 수행될 수 있다.
제조예 1. 전기화학적 ELISA 플랫폼의 제조
ITO 전극 표면(24mm2)을 10mL의 Trichloroethylene 용액, 에탄올 용액, 및 DI water 각각에서 15분간 Sonication처리를 하고 난 후 Ammonium hydroxide 용액, Hydrogen peroxide, DI water를 1:1:5로 배합한 용액에 전극을 담그고 75℃의 항온조에서 1시간 30분 동안 반응시킨 후, DI water에 전극을 씻어 최종적으로 전극 표면 상에 OH기를 활성화 시켰다. 100㎍/ml의 아비딘 15㎕와 상온에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 소수성 상호작용을 통해 아비딘이 ITO 전극 표면 상에 물리적으로 흡착되었다. 이후, 상기 전극과 15㎕의 1% BSA(bovine serum albumin)를 4℃에서 약 24시간 동안 반응시켰다. 그리고 상기 전극과 Human/Primate MMP-9 Biotinlated Antibody(BAF911, R&D Systems사 제조, 10㎍/ml) 15㎕를 4℃에서 약 30분간 반응시켰다.
실험 1. pH에 따른 항원 항체 결합 추세선의 결정
바이오마커로서 100ng/mL의 Recombinant human MMP-9(911-MP-010, R&D systems사 제조)을 포함하는 pH 4, 5, 6, 7, 8, 9의 버퍼 용액을 제조하였다. 상기 pH 4 내지 8의 버퍼 용액의 제조에는 시트르산 버퍼 또는 인산염완충식염수 버퍼를 사용하였으며, pH 9의 버퍼 용액의 제조에는 탄산염완충식염수 버퍼를 사용하였다.
상기 제조된 pH 4의 버퍼 용액에 제조예 1에서 제조한 작업 전극을 25℃의 상온에서 2분간 침지하였다.
이후, 상기 작업 전극에 Human/Primate MMP-9 Antibody(MAB936-100, R&D systems사 제조) 및 Anti-Mouse IgG(whole molecule)-Alkaline Phosphatase antibody(A3562, 시그마알드리치사 제조)를 각각 10㎍/ml로 순차적으로 작업 전극 표면과 접촉시켜 25℃에서 30분간 반응시켰다.
50mM Tris-HCl(pH 9.6), 10mM MgCl2, 및 물을 포함하는 용액에 1mM의 고형 AAP 분말을 용해시킨 혼합 용액에 상기 처리된 작업 전극을 2분간 침지한 후, 25℃에서 순환전압법을 이용하여 전압에 대한 전류값을 측정하였다. 전압은 0 내지 0.6V 사이에서 순환되었으며, 0.34V에서의 전류값을 하기 표 1에 나타내었다.
상기 과정을 pH가 5, 6, 7, 8, 및 9로 상이한 버퍼 용액에 대하여도 동일하게 반복 실시하였고, 각각의 버퍼 용액에서의 실험에서 측정된 전류값 중 0.34V에서의 전류값을 하기 표 1에 나타내었다. 또한, 하기 표 1의 pH 5 내지 pH 9의 데이터를 이용하여 x축을 pH, y축을 전류값으로 하는 그래프에 추세선을 계산하였다. 이는 도 9에 도시하였고, 도 9를 참조하면 상기 추세선은 1차 함수의 관계식을 가지면서 결정계수(R2)도 0.95 이상임을 알 수 있다.
상기 도 9의 추세선의 식은 하기와 같다.
식 1.
여기서 pH z는 바이오마커를 함유하는 용액의 pH 값이며, y는 pH z일 때 추세에 따른 전류값이다.
일반적인 생체 조건 pH인 pH 7.4에서의 전류값은 상기 식 1로부터 약 0.23㎂이며, 이를 기준으로 각 pH에서의 전류값의 편차를 하기 표 1에 나타내었다.
| pH z | pH 4 | pH 5 | pH 6 | pH 7 | pH 8 | pH 9 |
| 전류값(㎂) (@ 0.34V) |
0.17 | 0.29 | 0.27 | 0.25 | 0.22 | 0.19 |
| pH 7.4에서의 전류값과의 편차(%) | -27.23 | +22.55 | 15.74 | 7.23 | -7.66 | -10.85 |
식 1 및 표 1의 결과로부터, pH에 따른 바이오마커의 전기화학적 분석 시 전기적 시그널의 최대 편차는 22.55%로 나타나며, 이에, 상기 추세선을 이용한 전기적 시그널의 보정을 통해 최종 진단의 오차를 22.55% 이내로 개선할 수 있음을 알 수 있다.
방광암 진단에의 적용
환자의 소변 내 바이오마커의 전기화학적 측정에 따른 전류값은 상기 식 1 및 하기 식 2를 이용하여 보정될 수 있다.
식 2.
여기서, y pH calibrated는 상기 식 2에 의해 보정된 전류값이고, y(측정)은 환자의 소변으로부터 측정된 전류값이며, y(추세)는 상기 식 1에 의해 계산되는 추세에 따른 전류값을 의미한다. 또한, 상기 식 2의 '±'와 관련하여, z가 7.4보다 큰 경우, 이는 '+'로 계산되고, z가 7.4보다 작은 경우 이는 '-'로 계산된다.
이에, 환자의 소변의 pH 및 전류값이 측정되면, 상기 식 1 및 2를 이용하여 보정된 전류값을 계산하는 것이 가능하다.
한편, 도 10은 pH 7.4 조건에서 MMP-9 농도에 따른 전류값을 플롯한 그래프이다. 도 10에 도시된 그래프의 식은 하기와 같다.
식 3.
여기서 x는 MMP-9의 농도이고, y(pH 7.4)는 pH 7.4의 조건에서 특정 MMP-9의 농도에 따른 전류값이다.
앞서 식 1 및 2를 이용하여 계산된 보정된 전류값을 상기 식 3에 대입하면 역산하여 환자의 소변 내의 MMP-9의 농도를 계산하는 것이 가능하다.
또한, 전술한 바와 같이 방광암 진단에 있어서, MMP-9의 Cut-off value는 8.7ng/ml이므로, 상기 계산된 환자의 소변 내의 MMP-9의 값을 이와 비교하여 환자의 방광암 여부를 진단하는 것이 가능하다.
II. 전기화학적 측정 방법의 비교 및 최적 인가 전압 및 인가 시간의 결정
제조예 2 : 플랫폼의 제조
ITO 전극 표면(24mm2)을 10mL의 Trichloroethylene 용액, 에탄올 용액, 및 DI water 각각에서 15분간 Sonication처리를 하고 난 후 Ammonium hydroxide 용액, Hydrogen peroxide, DI water를 1:1:5로 배합한 용액에 전극을 담그고 75℃의 항온조에서 1시간 30분동안 반응시킨 후, DI water에 전극을 씻어 최종적으로 전극 표면상에 OH기를 활성화시켰다. 100㎍/ml의 아비딘 15㎕와 상온에서 약 2시간 동안 반응시켰다. 소수성 상호작용을 통해 아비딘이 ITO 전극 표면 상에 물리적으로 흡착되었다. 이후, 상기 전극과 15㎕의 1% BSA(bovine serum albumin)를 4℃에서 약 24시간 동안 반응시켰다.
제조예 3 : 플랫폼의 제조
상기 제조예 2의 플랫폼에 비오틴이 부착된 ALP(10㎍/ml)를 4℃에서 약 30분간 반응시켜서 ALP를 포함하는 작업 전극의 플랫폼을 완성하였다.
비교 실험예 1: 순환전압법을 이용한 샘플의 측정
아스코르브산-2-포스페이트(AAP)를 목적 물질로 하였고, 효소로 ALP를 사용하였다. 시료 내에 앞서 제조한 플랫폼을 작업 전극으로 하여 침지하였다. 침지 후 순환전압법을 이용하여 전압에 대한 전류값을 측정하였다. 전압은 0 내지 0.6V 사이에서 순환되었다. 이를 동일한 조건에서 3회(SET 1 내지 3) 반복하였다. 이에 순환전압전류 곡선을 얻었고, 이를 도 12에 나타냈다.
제조예 2 대신 제조예 3의 플랫폼을 작업 전극으로 한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 순환전압법을 이용하여 전압에 대한 전류값을 측정하였다. 마찬가지로 동일한 조건에서 3회 반복하였다. 이에 순환전압전류 곡선을 얻었고, 이를 도 12에 나타냈다.
상기 제조예 2 및 제조예 3의 플랫폼을 사용하여 측정된 전류로부터 전압에 따른 S/N ratio를 계산하였다. 0.2V, 0.3V, 0.4V 각각에서의 S/N ratio를 계산하였다. 본 개시에 있어서, S/N ratio는 제조예 3으로 만든 전극의 전류값 또는 전하량 나누기 제조예 2로 만든 전극의 전류값 또는 전하량을 의미한다. 상기 결과를 도 13에 나타내었다.
또한, 상기 제조예 2 및 제조예 3의 플랫폼을 사용하여 측정된 전류값의 변동 계수를 계산하였다. 상기 계산 결과는 도 14에 나타내었다.
비교 실험예 2: 시간대전류법을 이용한 샘플의 측정
비교 실험예 1과 동일한 시료, 목적 물질, 효소를 사용하였고, 시료 내에 앞서 제조한 제조예 2의 플랫폼을 작업 전극으로 하여 침지하였다. 침지 후 0.45V의 정전압을 인가하여, 시간대전류법을 통해 시간에 대한 전류값을 측정하였다. 이를 동일한 조건에서 3회 반복하였다. 이에 시간대전류 곡선을 얻었고, 이를 도 15에 나타냈다.
제조예 2 대신 제조예 3의 플랫폼을 작업 전극으로 한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 시간대전류법을 이용하여 시간에 대한 전류값을 측정하였다. 마찬가지로 동일한 조건에서 3회 반복하였다. 이에 시간대전류 곡선을 얻었고, 이를 도 15에 나타냈다.
상기 일정 전압을 0.2V, 0.3V, 0.4V로 다르게 하고, 제조예 2 및 제조예 3의 플랫폼을 사용하여 각각 3회씩 반복하여 시간에 대한 전류값을 측정하였다. 상기 측정된 전류값으로부터 각 전압별 시간에 따른 S/N ratio를 계산하였다. 이를 그래프화하여 도 16에 나타냈다.
또한, 상기 측정된 전류값의 변동 계수를 계산하였다. 상기 계산 결과는 도 17에 나타내었다.
실험예 1: 시간대전하법을 이용한 샘플의 측정
비교 실험예 1과 동일한 시료, 목적 물질, 효소를 사용하였고, 시료 내에 앞서 제조한 제조예 2의 플랫폼을 작업 전극으로 하여 침지하였다. 침지 후 0.45V의 정전압을 인가하여, 시간대전하법을 통해 시간에 대한 전하값을 측정하였다. 이를 동일한 조건에서 3회 반복하였다. 이에 시간대전하 곡선을 얻었고, 이를 도 18에 나타냈다.
제조예 2 대신 제조예 3의 플랫폼을 작업 전극으로 한 것을 제외하고는 동일한 방법으로 시간대전하법을 이용하여 시간에 대한 전하값을 측정하였다. 마찬가지로 동일한 조건에서 3회 반복하였다. 이에 시간대전하 곡선을 얻었고, 이를 도 18에 나타냈다.
상기 일정 전압을 0.2V, 0.3V, 0.4V로 다르게 하고, 제조예 2 및 제조예 3의 플랫폼을 사용하여 각각 3회씩 반복하여 시간에 대한 전하값을 측정하였다. 상기 측정된 전하값으로부터 각 전압별 시간에 따른 S/N ratio를 계산하였다. 이를 그래프화하여 도 19에 나타냈다.
또한, 상기 측정된 전하값의 변동 계수를 계산하였다. 상기 계산 결과는 도 20에 나타내었다.
상기 비교 실험예 1, 2 및 실험예 1을 살펴보면, 도 12, 15, 18에서 각각의 측정 방법에서 동일한 조건하의 3회의 반복 실험 결과가 각각 오차가 존재함을 알 수 있다. 상기 오차를 줄일 수 있는 측정 방법이 재현성의 관점에서 바람직하다. 상기 오차에 대하여 상기 3 종류의 측정 방법을 비교하여 보면, 도 13에 도시된 바와 같이, 순환전압법을 이용한 경우, S/N ratio의 편차는 10을 초과하여 매우 큰 것으로 확인된다. 또한, 도 14에 나타난 바와 같이, 순환전압법을 이용한 경우의 전류값의 변동 계수는 제조예 3의 플랫폼을 사용한 경우만, 그 중에서도 전압이 0.4V인 경우만 전류값의 변동 계수가 15% 이하임을 알 수 있다. 효소가 존재하지 않는 경우에도 높은 변동 계수를 갖는바, 이는 실제 효소 존재하에 시료 내 목적 물질의 농도를 측정함에 있어서도 많은 오차를 야기할 우려가 있고, 특정 전압에서의 변동 계수가 낮음은 전압을 순환적으로 변동시키는 순환전압법에서 결코 이점이 될 수 없다는 문제가 존재한다.
한편, 도 16에 도시된 바와 같이, 시간대전류법을 이용한 경우, S/N ratio의 편차는 10을 초과하여 매우 큰 것으로 확인된다. 또한, 도 17에 나타난 바와 같이, 시간대전류법을 이용한 경우의 전류값의 변동 계수는 30초 이상의 인가 시간이 경과한 후에도 15%를 초과함을 알 수 있다. 이러한 높은 변동 계수는 재현성의 관점에서 바람직하지 않다.
이와 달리, 시간대전하법을 이용한 경우, 도 19에 나타난 바와 같이, 10 이하의 S/N ratio 편차를 갖는다. 이를 통해 시간대전하법을 이용하는 경우가 순환전압법이나 시간대전류법을 이용하는 경우보다 상대적으로 S/N ratio의 편차가 작음을 알 수 있다. 또한, 도 20에 나타난 바와 같이, 시간대전하법을 이용한 경우의 0.3V 이상의 정전압을 30초 이상 인가한 경우 변동 계수가 15% 이하임을 알 수 있다. 시간대전하법의 경우, 시간대전하 곡선이 시간에 대한 누적 전하량으로 표현이 되면서 시그널 크게 증폭되며, 측정시간에서 불안정한 시그널 오차가 상대적으로 감소한다. NC(negative control)의 경우, 시그널이 거의 없어 적분에 의한 증폭은 크게 이루어지지 않았지만, 불안정한 시그널에 대한 오차는 상대적으로 감소한다. 이는 이론에 한정되고 싶지는 않으나, 유의미한 시그널이 없는 상태에서 상대적으로 안정한 전하량이 측정된 것의 영향으로 생각된다. 따라서, 상기 S/N ratio의 편차 및 변동 계수로부터 재현성 및 정밀성의 관점에서 시간대전하법이 순환전압법 및 시간대전류법에 비하여 상대적으로 우수한 측정 방법임을 알 수 있다.
시간대전하법을 이용하는 경우, 최적 인가 전압 및 인가 시간의 결정
상기 실험예 1과 동일한 조건에서, 본 개시의 발명자들은 0.4V 내지 0.5V 내에서 시간대전하법을 이용하는 경우, 재현성 및 정밀성의 관점에서 센서가 우수한 센싱 능력을 가짐을 발견하였다. 이에 시간대전하법을 이용하는 현장 자가진단용 센서의 최적 측정 조건을 결정하기 위해 0.4V 및 0.45V에서의 S/N ratio 및 변동 계수를 비교하였다.
전압 외에는 실험예 1과 동일한 조건에서 측정 및 계산을 실시하였다. 계산 결과는 도 21에 나타냈다. 상기 도 21에 나타난 바와 같이, 0.45V의 경우가 S/N ratio의 편차가 상대적으로 작은 것을 알 수 있다. 또한, 상기 도 21에 나타난 바와 같이 변동 계수도 0.45V의 경우가 0.4V의 경우보다 상대적으로 적음을 알 수 있다. 한편, 인가 시간의 관점에서는, 50초 동안 인가한 경우가 그 이상 인가한 경우보다 S/N ratio의 편차가 더 작고, 변동 계수도 작음을 알 수 있다. 이에 결론적으로 시간대전하법을 이용하여 전기화학적 센서를 통해 시료 내 목적 물질의 농도를 측정함에 있어서, 0.45V의 정전압으로 50초간 인가하는 것이 가장 바람직함을 알 수 있다.
이상으로 본 개시의 바람직한 실시예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 개시는 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 개시의 요지를 벗어남이 없이 당해 개시가 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형 실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형 실시들은 본 개시의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어져서는 안될 것이다.
100: 본체
110: 디스플레이부
120: 조작부 200: 프로브
210: 카운터 전극 220: 기준 전극
230: 작업 전극 300: 카트리지
310, 320, 330 : 개구 340: 가이드판
400: 효소 카트리지 410, 420, 430: 개구
440: 효소 격실
120: 조작부 200: 프로브
210: 카운터 전극 220: 기준 전극
230: 작업 전극 300: 카트리지
310, 320, 330 : 개구 340: 가이드판
400: 효소 카트리지 410, 420, 430: 개구
440: 효소 격실
Claims (8)
- 시료 내 바이오마커를 이용한 질병 자가 진단 장치로서,
디스플레이부, 조작부, 측정부, 메모리부, 및 계산부를 포함하는 본체;
상기 본체에 탈부착이 가능하며, 적어도 3개의 작업 전극을 포함하는 프로브; 및
상기 프로브에 탈부착이 가능한 카트리지를 포함하며, 여기서 상기 카트리지는 시료 카트리지 또는 시약 카트리지인 질병 자가 진단 장치. - 청구항 1에 있어서,
상기 시료는 인간으로부터 채취된 체액이며, 상기 체액은 혈액, 침, 땀, 및 소변을 포함하는 것을 특징으로 하는 질병 자가 진단 장치. - 청구항 1에 있어서,
상기 질병은 전립선암 또는 방광암이며,
상기 바이오마커는 Metrix Metallo Peptidase-9(MMP-9), Apolipoprotein A-1(ApoA1), prostate-specific antigen(PSA), Prostate specific membrane antigen (PSMA), Annexin A3(ANX A3), nuclear matrix protein 22(NMP22), bladder tumor antigen(BTA), 및 urinary bladder carcinoma antigen(UBC)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나인 것을 특징으로 하는 질병 자가 진단 장치. - 청구항 1에 있어서,
상기 측정부는 상기 작업 전극으로 전압을 인가함에 따른 전류 또는 전하를 측정하며,
상기 메모리부는 특정 시료 내 바이오마커 농도별 전류 또는 전하 값의 데이터를 포함하고,
상기 계산부는 상기 측정부에서 측정된 전류 또는 전하의 값을 상기 메모리부의 특정 시료 내 바이오마커 농도별 전류 또는 전하 값의 데이터에 기초하여 바이오마커의 농도로 환산하는 것을 특징으로 하는 질병 자가 진단 장치. - 청구항 4에 있어서,
상기 측정부는 시료의 pH를 측정하는 pH 측정부를 더욱 포함하고,
상기 메모리부는 pH에 따른 바이오마커의 결합 추세 데이터를 더욱 포함하며,
상기 계산부는 상기 pH 측정부에서 측정되는 시료의 pH 및 상기 메모리부의 pH에 따른 바이오마커의 결합 추세 데이터에 기초하여 상기 측정부에서 측정되는 전류 또는 전하의 값을 보정하고, 상기 보정된 전류 또는 전하의 값을 상기 메모리부의 특정 시료 내 바이오마커 농도별 전류 또는 전하 값의 데이터에 기초하여 바이오마커의 농도로 환산하는 것을 특징으로 하는 질병 자가 진단 장치. - 청구항 1에 있어서,
상기 본체는 측정된 전류 및 전하의 값; 및 환산된 바이오마커의 농도의 값을 기록하는 기록부를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 질병 자가 진단 장치. - 청구항 1에 있어서,
상기 프로브는 카운터 전극 및 기준 전극을 포함하며,
상기 작업 전극 및 카운터 전극은 ITO(Indium Tin Oxide) Glass 전극인 것을 특징으로 하는 질병 자가 진단 장치. - 청구항 1에 있어서,
상기 카트리지는 가이드판을 구비하는 것을 특징으로 하는 질병 자가 진단 장치.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180166207A KR20200077059A (ko) | 2018-12-20 | 2018-12-20 | 시료 내 바이오마커를 이용하는 질병 자가 진단 장치 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020180166207A KR20200077059A (ko) | 2018-12-20 | 2018-12-20 | 시료 내 바이오마커를 이용하는 질병 자가 진단 장치 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20200077059A true KR20200077059A (ko) | 2020-06-30 |
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ID=71121228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020180166207A KR20200077059A (ko) | 2018-12-20 | 2018-12-20 | 시료 내 바이오마커를 이용하는 질병 자가 진단 장치 |
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| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20200077059A (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023153669A1 (ko) * | 2022-02-09 | 2023-08-17 | 한국전자기술연구원 | 현장용 진단 기기 및 이의 사용 방법 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20160138669A (ko) | 2015-05-26 | 2016-12-06 | 전자부품연구원 | 다종의 바이오 마커를 측정할 수 있는 프로브 및 이를 적용한 플랫폼 |
| US20170199181A1 (en) | 2013-03-14 | 2017-07-13 | Abbott Point Of Care Inc. | Electrochemical methods and devices for amending urine samples for immunosensor detection |
-
2018
- 2018-12-20 KR KR1020180166207A patent/KR20200077059A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| WO2023153669A1 (ko) * | 2022-02-09 | 2023-08-17 | 한국전자기술연구원 | 현장용 진단 기기 및 이의 사용 방법 |
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