WO2016153187A1 - 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 및 장치 - Google Patents

수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 및 장치 Download PDF

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WO2016153187A1
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aqueous solution
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박재성
신현우
김종민
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포항공과대학교 산학협력단
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins

Definitions

  • the present invention provides a method for separating and purifying a large amount of extracellular vesicles contaminated with protein by using an aqueous solution ideal system in a short time. It relates to a multi-stage purification method and apparatus.
  • Extracellular vesicles include exosomes or micro croves icl es, which are 50 to 1000 nm in size, and are attracting attention as diagnostic markers for diseases because they have characteristics of the original cells. .
  • Antibody separation method is a separation method using antigen antibody reaction, which has high selectivity but has difficulty in removing the antibody attached to the endoplasmic reticulum and due to the high price of the antibody
  • Microfluidic technology is a method of rapidly separating endoplasmic reticulum even in a small amount of samples by combining the antibody separation method and the microfluidic chip, but a lot of preparation process is required to apply the antibody to the microfluidic chip.
  • Precipitation using polymers is a simple method of separating endoplasmic reticulum, but has the disadvantage that impurities such as proteins are also separated together to precipitate all substances present in the sample.
  • the present inventors have proposed a technique related to a microfluidic chip that separates extracellular vesicles in Publication No. 2014-0050465.
  • the method of separating the extracellular vesicles from serum using the antibody-coated microfluidic chip described in the patent document requires less time for separation of the extracellular vesicles and does not require separate laboratories. This method has the advantage of being advantageous, but there is still a problem that needs to be improved in order to use this method as a practical and economical diagnostic method due to the low yield.
  • the method using the polymer is a technology that allows the extracellular vesicles to sink by lowering the solubility of body fluids. Is not suitable for use in diagnosis.
  • the object of the present invention is to solve the problems of the prior art, the cell
  • the multi-stage purification method of the extracellular vesicles using the aqueous solution ideal system of the present invention comprises the steps of: (a) mixing the first material and the crab material in the aqueous solution in which the body fluid or extracellular vesicles are present; (b) phase separation of the mixture into a supernatant and an underlayer to prepare an aqueous solution phase; (c) removing the supernatant containing the first material from the aqueous solution phase; (d) supplying and mixing the new supernatant containing the first material to the remaining lower liquor; And (e) performing the steps (b) to (d) at least once or twice or more, and then recovering the extracellular vesicles from the underlayer solution.
  • the first material is selected from water, polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol or picol
  • the second material is E0PO (ethylene oxide propylene oxide), dextran (dext ran) It is characterized by being selected from high concentration salts, levane, Poly (vinyl methyl ethyl ether), ammonium sulfate, sodium sulfate, magnesium sulfate, calcium phosphate or sodium carbonate.
  • the first substance is water
  • the crab substance is E0P0
  • the first substance is polyethylene glycol
  • the second substance is text box, levane, polyvinyl methyl ethyl ether), ammonium sulfate, sodium sulfate, sulfuric acid.
  • Magnesium, potassium phosphate and sodium carbonate may be selected.
  • the first material is polyethylene glycol, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl
  • the second material is preferably dextran, more preferably the first material is polyethylene glycol, and the second material is dextran.
  • the method may further include adjusting an attractive force or repulsive force between molecules in the aqueous solution ideal system by adding an additive to the aqueous solution ideal system.
  • Phase separation of the aqueous solution phase in step (b) can be further accelerated by the step of performing a centrifugation method of 500-2, 000 X g-force, by injecting ultrasonic irradiation or fine bubbles into the aqueous solution phase It may further comprise a step.
  • the body fluid is characterized in that at least any one or more selected from the group consisting of whole blood (who l e blood), serum, peritoneal fluid, breast milk and urine.
  • the extracellular vesicles separated by the multi-step purification method using the aqueous solution ideal system of the present invention can be used in analytical methods such as ELISA, RT-PCR, western blot, proteomi cs or genomi cs.
  • the apparatus for separating extracellular vesicles using the aqueous solution ideal system of the present invention includes an injection unit (10) for injecting a first material and a crab material to form an aqueous solution ideal system; An input unit 20 for inputting an aqueous solution containing body fluid or extracellular vesicles; A main body 30 connected to the inlet and the inlet to centrifugally separate the aqueous solution containing the body fluid or extracellular vesicles from the first material and the second material; A removal unit 40 for removing the supernatant containing the first material after the phase separation; And a recovery unit 50 for recovering the extracellular vesicles obtained in the main body 30.
  • the injection unit 10 may be divided into a crab 1 injection unit 10a and a second injection unit 10b so that the crab 1 material and the second material may be injected, respectively, the injection unit 10 and the input unit 20 It may further include a mixing unit 60 for mixing the first solution and the crab material and the aqueous solution containing the body fluid or extracellular vesicles between the). At this time, it is preferable that the vibrator is mounted on the mixing part 60.
  • the main body 30 may further include an ultrasonic irradiation device or a micro bubble generator, the shape of the main body 30 is characterized in that the cylindrical or calabash.
  • the multi-step purification method of the extracellular vesicles using the aqueous solution ideal system according to the present invention can remove more than 95% of the protein, and can obtain high-purity extracellular vesicles.
  • the present invention relates to a highly competitive multi-stage purification method and apparatus.
  • the extracellular vesicles isolated and purified by the present invention can be used in analytical methods such as RT ⁇ PCR or western blot, and there is an advantage that it can be used for research and disease diagnosis using the same.
  • 1 is a graph showing the recovery rate of extracellular vesicles and proteins according to the number of phase separation.
  • Figure 3 (a) and (b) is an image of the extracellular vesicles obtained by the multi-step purification method and ultra-fast centrifugation method using the aqueous solution ideal system of the present invention through west ern blot analysis.
  • Figure 5 is an image of a multi-stage purified device of extracellular vesicles using the aqueous solution ideal system of the present invention.
  • FIG. 6 is an image of a device further including a mixing unit in FIG. 5.
  • FIG. 7 is an image of a device in which two injection parts are separated in FIG. 6.
  • the present invention relates to (a) a solution of 11 substances in an aqueous solution in which body fluids or extracellular vesicles are present.
  • the extracellular vesicles in the present invention are vesicles generated in the cells and secreted out of the cells, and include, but are not limited to, exosomes, microvesicles and microparticles.
  • the combination of the first material and the second material (first material / second material) forming the aqueous solution ideal system is water / E0P0 (ethylene oxide propylene oxide), polyethylene glycol / dextran (dextran) ), Polyethylene glycol / high concentration salt, polyethylene glycol / levan, polyvinylpyrrolidone / dextran, polyvinyl alcohol / textane, picol (f icol 0 / dext 3 ⁇ 4, Polyethylene glycol / PolyOinyl methyl ethyl ether, pulley ethylene glycol / amonium sulfate, polyethylene glycol / sodium sulfate, polyethylene glycol / magnesium sulfate, polyethylene glycol / phosphate It is preferable to use any one of potassium phosphate and polyethylene glycol / sodium carbonate, but is not particularly limited thereto. Various combinations of the first material and the second material can be used for.
  • the two materials that are not common to each other to form the aqueous solution ideal system is pulley ethylene glycol / textlan, the extracellular vesicles are dex
  • the molecular weight of polyethylene glycol is 0. It is preferably from 2 to 600 kDa, the concentration is from 5 to 15 wt%, the molecular weight of dextran is from 15 to 2,000 kDa, and the concentration is from 1 to 10%.
  • concentration of polyethylene glycol and dextran is lower than the above range, an aqueous solution anomaly system is not formed, and when the concentration of the polyethylene glycol and dextran is higher than the above range, not only a lot of time is required to dissolve these polymers, but the surface tension between the ideal systems is so high that the third The solute is difficult to dissolve.
  • the aqueous solution phase system can further promote phase separation by centrifuging for 5 to 15 minutes with 500-2,000 g—force. From 2,000 X g-force, it is not desirable to increase the gravitational acceleration (g) because there is no big change in the time required for disassembly.
  • the method may further include the step of irradiating the aqueous phase ideal system with ultrasonic waves or injecting black fine bubbles, which are trapped at the interface between the two phases.
  • the ultrasonic irradiation can be applied to the solution directly or indirectly ultrasonic waves, it is preferable to perform for 20 to 240 minutes at an intensity of 200 W ⁇ 400 W.
  • the intensity of the ultrasonic wave exceeds 400 W, the silver content of the aqueous solution may rapidly increase, and the extracellular vesicles and proteins may be denatured.
  • the intensity of the ultrasonic wave is less than 200 W, the separation of the extracellular vesicles and proteins trapped at the interface is prevented. It causes trouble.
  • the separation degree no longer increases even if the treatment time is longer from the time point exceeding 240 minutes, the efficiency is lowered if less than 20 minutes.
  • the supernatant is removed from the aqueous phase-aqueous phase separated in this manner, and the extracellular vesicles are separated by repeating the process of mixing the new supernatant with no impurities. Repeating this process increases the purity of the extracellular vesicles, but the desired number of repetitions is 2-4 times to reduce the recovery rate.
  • the present invention can easily increase the purity of the extracellular vesicles contaminated with proteins more efficiently and has an advantage that can be applied to various fields, such as disease diagnosis, vaccine research and treatment. More specifically, the disease can be diagnosed by separating the extracellular vesicles from the body fluid and measuring the amount of gene expression present in the extracellular vesicles.
  • the body fluid may be any one or more selected from the group consisting of whole blood, serum, peritoneal fluid, breast milk, or urine, but is not particularly limited thereto.
  • the disease may be any one or more selected from the group consisting of cancer, sepsis, arteriosclerosis, and rheumatoid arthritis, but is not particularly limited thereto.
  • Extracellular vesicles can be used in analytical methods such as ELISA, RT-PCR, western blot, proteomics or genomics.
  • the gene When measuring the expression level of a gene present in the extracellular vesicles, the gene is m RNA showing a difference in expression for stimulation. More specifically, the gene is synthesized into cDNA using oligo (dT) and then performs real time PCR, but the template used to perform real time PCR is not limited to cDNA.
  • oligo oligo
  • the gene is EDNK Endothelin 1), VCAMK Vascular cell adhesion molecule 1), ICAMl (Intercel lular adhesion molecule 1), SELE (Select in E), N0S3 (Nitric oxide synthase 3), BMP4 (Bone morphogenetic protein 4), VWF (Von Wi 1 lebrand factor), MPZ (Myel in protein zero), IRF1 (Interferon regulatory factor 1), TNF (Tumor necrosis factor), IL32 (Inter leukin 32), CFLAR (CASP8 and FADD-1 ike apotosis regulator) , CXCL10 (Chemok i ne (CXX motif) 1 igand 10), I L6 (Inter leukin 6), ICK (Intest inal cell (MA -like) kinase), T FAIP2 (Tumor necrosis factor, al ha-induced protein 2)
  • ARHGAP8 Ra GTPase aciv
  • FIG. 1 An apparatus for separating and purifying extracellular vesicles in multiple stages using the aqueous solution ideal system of the present invention is as shown in FIG.
  • Two substances are injected, and an aqueous solution containing bodily fluids or out-of-cell vesicles is introduced through the input unit 20.
  • aqueous solution containing the extracellular vesicles enters the main body (30.) connected to the inlet (10) and the inlet (20) and is phase separated by centrifugation. After the phase separation, the upper layer containing the first substance The liquid is removed through the removal unit 40, and the extracellular vesicles obtained after one or two or more steps of multiple purification are recovered through the recovery unit 50.
  • a mixing unit 60 may be further included to facilitate mixing of the first and second materials with an aqueous solution containing body fluid or extracellular vesicles.
  • the mixing unit 60 is preferably equipped with a vibrating device so that the mixing can be efficiently performed.
  • the main body 30 further includes an ultrasonic irradiation device or a microbubble generating device, and the device uses ultrasonic waves to effectively separate extracellular vesicles and proteins trapped at the interface between two phases after phase separation. It is a device for irradiating or generating fine bubbles.
  • the injection part 10 is preferably separated into a first injection part 10a and a second injection part 10b so that the first material and the second material can be injected as shown in FIG.
  • the concentration of the first substance and the second substance can be adjusted according to the type of the polymer and the body fluid.
  • the shape of the main body 30 may be cylindrical or, as shown in FIG.
  • the main body 30 is a bottle-shaped type, an interface of an aqueous solution ideal system is formed at a recessed portion. In this case, since the interface is narrow, the trapped extracellular vesicles have a thick thickness, which facilitates separation.
  • Polyethylene glycol and textan were dissolved in phosphate buffered saline (PBS, Phosphate buf fered salin) to prepare an aqueous solution phase, and were prepared at concentrations of 10.5 wt% and 4.5 wt%, respectively. After mixing the polyethylene glycol and dextran mixed aqueous solution in an aqueous solution containing extracellular vesicles and stirred using a shaker at 4 ° C for 3 hours.
  • PBS phosphate buffered saline
  • Aqueous phases containing the extracellular vesicles prepared in Example 1 were centrifuged at 1 000 X g-force at 4 ° C for 10 minutes to accelerate phase separation into polyethylene glycol and dextran phases. After the phase separation, the polyethylene glycol phase, which was the supernatant except the boundary layer, was removed, and then, the same amount of new polyethylene glycol as the volume removed was added thereto, stirred in the same manner as in Example 1, and the phase separation process was performed.
  • STD is a mixture of extracellular vesicles in PBS as a standard
  • Ul tra is ultracentrifugation method
  • Ul t ra * 5 is 5 times the volume of the sample obtained by ultracentrifugation method
  • ATPS-1 , ATPS-3 and ATPS-5 are samples obtained by one, three and five phase separations, respectively, as shown in Example 2.
  • samples of the same volume were loaded to determine the recovery rate of the extracellular vesicles. Therefore, the total protein amount is different for each sample.
  • FIG. 3 (b) the total protein amount is the same to determine the purity of the extracellular vesicles.
  • One sample was loaded, so the volumes of each sample are all different.
  • the multi-step purification method of the present invention can be isolated and purified extracellular vesicles without damaging the RNA.
  • Extracellular vesicles obtained from melanoma were mixed with serum proteins to prepare extracellular vesicle samples contaminated with proteins similar to biofluids. Subsequently, the extracellular vesicle sample was isolated and purified by a multi-step purification method, followed by RT-PCR (reverse transcription PCR) by extracting an mRNA called Melan A, which was compared with RT-PCR of the anti-gene gene GAPDH. .
  • the multi-stage purification method of the present invention can separate and purify extracellular vesicles without RA damage, and the same cells as compared with conventional ultrafast cardiac separation methods. It is efficient because the extracellular vesicles can be obtained with high purity. Also, in the case of multi-stage purification, the number of extracellular vesicles decreases slightly as the number of phase separations is repeated, but the recovery of protein decreases significantly, and the purity of the extracellular vesicles increases. I could confirm it.
  • the present invention is characterized by removing and presenting extracellular vesicles in aqueous solution containing extracellular vesicles, using a multi-stage purification method using an aqueous solution system, to remove impurities as proteins and to obtain high purity extracellular vesicles.
  • the multi-step purification method of extracellular vesicles using the aqueous solution ideal system according to the present invention can remove more than 95% protein, and can obtain high-purity extracellular vesicles, resulting in very high efficiency compared to conventional purification methods.
  • there is no need for expensive equipment or materials such as ultra-centrifugal centrifuges or antibodies so it is cost effective and economical.
  • the extracellular vesicles isolated and purified according to the present invention can be used in analytical methods such as RT-PCR or western blot, and there is an advantage in that it can be used in research fields and disease diagnosis using the same. .

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Abstract

본 발명은 단백질과 혼합되어 오염된 세포 밖 소포체를 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법을 통하여 짧은 시간 안에 고순도로 많은 양을 분리 및 정제할 수 있는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 및 장치에 관한 것으로, 95 % 이상의 단백질을 제거할 수 있으며, 고순도의 세포 밖 소포체를 획득할 수 있어 종래의 기술에 비하여 매우 높은 효율을 갖는다. 특히 초고속 원심분리 장치나 항체와 같은, 고가의 장비나 재료가 필요 없기에, 비용이 적게 들어 경제적이므로, 경쟁력을 높일 수 있는 방법이다. 또한, 이렇게 분리 및 정제된 세포 밖 소포체는 RT-PCR이나 western blot과 같은 분석 방법에 이용할 수 있어, 이를 이용한 연구 분야 및 질병 진단에도 활용할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 및 장치 【기술분야】
본 발명은 단백질과 흔합되어 오염된 세포 밖 소포체를 수용액 이상계를 이 용한 다단계 정제방법을 통해 짧은 시간 안에 고순도로 많은 양을 분리 및 정제 과 정을 수행할 수 있는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 및 장치에 관한 것이다.
【배경기술】
세포 밖 소포체에는 액소좀 ( exosomes) 또는 마이크로베지클 (mi croves i c l es ) 등이 있으며 크기는 50 ~ 1000 nm 정도로， 원래의 세포가 가지고 있던 특성들을 가 지고 있기 때문에 질병의 진단 마커로 주목받고 있다.
종래의 세포 밖 소포체를 분리하는 기술로는 초고속원심분리법， 항체분리법, 미세유체 기술 및 고분자를 이용한 침전법이 있다. 이 중에서, 초고속원심분리법은 세포 밖 소포체를 분리하는데 가장 널리 쓰이는 방법이고， 원리가 간단하여 가장 신뢰성 있는 분리 방법이다.
하지만， 이러한 초고속원심분리법을 이용해서 세포 밖 소포체를 분리할 경우 에는 세포 밖 소포체의 수율이 낮고， 분리하는데 시간이 많이 소요되며， 비싼 기기 가 필요하다는 단점이 있다.
항체분리법은 항원항체 반응을 이용한 분리 방법으로, 높은 선택성올 가지지 만 소포체에 붙은 항체를 제거하는 데 어려움이 있고 항체의 높은 가격으로 인하여
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대체용지 (규칙 제 26조) 대량생산에 적합하지 않다 . 미세유체 기술은 상기의 항체분리법과 미세유체 칩을 접목시켜 적은 양의 샘 플에서도 빠르게 소포체를 분리시킬 수 있는 방법이지만, 항체를 미세유체칩에 접 목시키는 데 많은 준비과정이 필요하다 . 고분자를 이용한 침전법은 간단하게 소포체를 분리할 수 있는 방법이지만, 샘플에 존재하고 있는 모든 물질을 침전시키기에 단백질과 같은 불순물 또한 같이 분리된다는 단점이 있다 . 이러한 종래기술의 문제점을 극복하고자 본 발명자들은 공개특허 제 2014- 0050465호에서 세포 밖 소포체를 분리하는 미세유체 칩에 관한 기술을 제시한 바 있다. 상기 특허문헌에 기재된， 항체로 코팅된 미세유체 칩을 이용해서 세포 밖 소 포체를 혈청으로부터 분리해내는 방법은 세포 밖 소포체의 분리에 따른 소요시간이 적고， 연구실이 따로 필요하지 않아 경제적인 면에서 유리하다는 장점이 있으나， 이 방법 역시 수율이 낮다는 점에서 실용적이면서도 경제적인 진단 방법으로 활용 하기에는 여전히 개선해야할 문제점들이 존재한다. 한편， 폴리머를 이용한 방법은 체액 (body f luid)의 용해도를 낮춰 줌으로써 세포 밖 소포체를 가라앉게 만들어 주는 기술로서, 긴 준비시간 ( incubat ion t ime) 이 필요하며 단백질도 함께 가라앉기에 침전물의 순도가 좋지않아 진단을 위한 활 용에 적합하지 않다.
【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】 본 발명의 목적은 이러한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로， 세포
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대체용지 (규칙 제 26조) 밖 소포체를 포함한 수용액에서 세포 밖 소포체를 분리 및 정제시， 수용액 이상계 를 이용한 다단계 정제방법을 사용함으로써, 불순물인 단백질을 제거하고 고순도의 세포 밖소포체를 획득하는 것을 그 목적으로 한다.
【기술적 해결방법】
이러한 기술적 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 세 포 밖 소포체의 다단계 정제방법은 (a) 체액 또는 세포 밖 소포체가 존재하는 수용 액에 제 1물질과 게 2물질을 흔합하는 단계; (b) 상기 혼합물을 상층액과 하층액으로 상분리시켜 수용액 이상계를 제조하는 단계; (c) 상기 수용액 이상계 중, 제 1물질 이 포함된 상층액을 제거하는 단계; (d) 잔류하는 하충액에 제 1물질을 포함하는 새 로운 상층액을 공급하여 흔합하는 단계; 및 (e) 상기 (b) 내지 (d)단계를 적어도 한번 또는 두번 이상 수행한 후， 상기 하층액으로부터 세포 밖 소포체를 회수하는 단계;를 포함한다.
이때, 제 1물질은 물， 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol ) , 폴리비닐피 로리돈, 폴리비닐 알코올 또는 피콜 중에서 선택되는 것이며, 제 2물질은 E0P0( ethylene oxide propylene oxide) , 덱스트란 (dext ran) , 고농도염， 레반， Poly(vinyl methyl ethyl ether ) , 황산암모늄， 황산나트륨, 황산마그네슘， 인산칼 륨 또는 탄산나트륨 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
더욱 상세하게는 제 1물질이 물일 경우, 게 2물질은 E0P0이고， 제 1물질이 폴리 에틸렌 글라이콜일 경우, 제 2물질은 텍스트란, 레반， Polyvinyl methyl ethyl ether ) , 황산암모늄， 황산나트륨， 황산마그네슘， 인산칼륨, 탄산나트륨 증에서 선 택될 수 있다. 또한 제 1물질이 폴리에틸렌 글라이콜, 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐
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대체용지 (규칙 제 26조) 알코을 또는 피콜 중에서 선택될 경우에는, 제 2물질로 덱스트란인 것이 바람직하 고， 더욱 바람직하게는 제 1물질은 폴리에틸렌 글리콜이고, 제 2물질은 덱스트란인 것이다.
한편， (a)단계 이후 및 (b)단계 이전에， 상기 수용액 이상계에 첨가제를 추 가하여 수용액 이상계 내 분자들 사이의 인력 또는 반발력을 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 (b)단계에서 수용액 이상계의 상 분리는 500 - 2 , 000 X g- force의 원 심분리법을 수행하는 단계를 더 포함하여 가속화할 수 있으며, 상기 수용액 이상계 에 초음파 조사 혹은 미세 기포를 주입하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한， 상기 체액은 전혈 (who l e blood) , 혈청, 복강액, 모유 및 소변으로 이 루어진 군 증에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상인 것을 특징으로 한다.
이렇게 본 발명의 수용액 이상계를 사용하여 다단계 정제 방법으로 분리된 세포 밖 소포체는 ELISA , RT-PCR, western bl ot , proteomi cs 또는 genomi cs 등의 분석 방법에 사용될 수 있다.
본 발명의 수용액 이상계를 이용하여 세포 밖 소포체를 분리하는 장치는 수 용액 이상계를 형성하는 제 1물질 및 게 2물질을 주입하는 주입부 ( 10) ; 체액 또는 세 포밖 소포체가 포함된 수용액을 투입하는 투입부 (20) ; 상기 주입부 및 투입부와 연 결되어 체액 또는 세포 밖 소포체가 포함된 수용액과 제 1물질 및 제 2물질을 원심분 리하여 상 분리하는 본체 (30) ; 상기 상 분리 후 계 1물질이 포함된 상층액을 제거하 는 제거부 (40) ; 및 상기 본체 (30)에서 획득되는 세포 밖 소포체를 회수하는 회수 부 (50) ;를 포함한다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 주입부 ( 10)는 게 1물질과 제 2물질이 각각 주입될 수 있도록 게 1주입부 ( 10a)와 제 2주입부 ( 10b)로 분리될 수 있으며， 주입부 ( 10)와 투입부 (20) 사이에 체액 또는 세포 밖 소포체가 포함된 수용액과 제 1물질 및 게 2물질을 혼합하는 혼합부 (60)를 더 포함할 수 있다. 이때 상기 흔합부 (60)에 진동장치가 장착되어 있는 것이 바람 직하다. 또한 본체 (30)에는 초음파 조사 장치 또는 미세 기포 발생장치가 더 포함 될 수 있으며, 이러한 본체 (30)의 형상은 원통형이거나 호리병형인 것을 특징으로 한다.
【발명의 효과】
본 발명에 따른 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 은 95 % 이상의 단백질을 제거할 수 있으며, 고순도의 세포 밖 소포체를 획득할 수 있는 것으로, 종래의 기술에 비하여 매우 높은 효율을 가진다. 특히 초고속 원심분 리 장치나 항체와 같은 고가의 장비나 재료가 필요 없으므로, 비용이 적게 들어 경 제적이다. 따라서 경쟁력이 매우 높은 다단계 정제방법 및 장치에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 의해 분리 및 정제된 세포 밖 소포체는 RTᅳ PCR이나 western blot과 같은 분석 방법에 이용할 수 있어， 이를 이용한 연구 분야 및 질병 진단에 도 활용할 수 있다는 장점이 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 상분리 횟수에 따른 세포 밖 소포체 및 단백질의 회수율을 나타내는 그래프이다.
도 2에서 (a)와 (b)는 각각 초고속원심분리법 및 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법으로 획득한 세포 밖 소포체의 TEM( transmi ssion el ectron
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대체용지 (규칙 제 26조) mi croscope) 이미지이다 ,
도 3에서 (a)와 (b)는 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법 및 초고속원심분리법으로 획득한 세포 밖 소포체를 west ern blot 분석을 통해 이미 지화한 결과이다.
도 4는 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법으로 획득한 세포 밖소포체의 mRNA인 Me l anA를 RT-PCR을 실행하고 이미지화한 결과이다.
도 5는 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장 치에 대한 이미지이다 .
도 6은 도 5에서 흔합부가 더 포함된 장치에 대한 이미지이다.
도 7은 도 6에서 주입부가 두 개로 분리된 장치에 대한 이미지이다.
도 8은 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장 치에서 본체의 형상이 호리병 형인 장치에 대한 이미지이다.
【발명의 실시를 위한 형태】
이하에서는 본 발명의 기술적 특징을 좀 더 구체적으로 살펴보기 위해 실시 예와 도면을 참조하여 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로， 본 발명의 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들 이 있을 수 있음을 이해하여야 한다. 본 발명은 (a) 체액 또는 세포 밖 소포체가 존재하는 수용액에 거 11물질과 제
2물질을 혼합하는 단계; (b) 상기 흔합물을 상층액과 하층액으로 상분리시켜 수용
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대체용지 (규칙 제 26조) 액 이상계를 제조하는 단계; (c) 상기 수용액 이상계 중, 제 1물질이 포함된 상층액 을 제거하는 단계; (d) 잔류하는 하층액에 제 1물질을 포함하는 새로운 상층액을 공 급하여 흔합하는 단계; 및 (e) 상기 b) 내지 (d)단계를 적어도 한번 또는 두번 이 상 수행한 후， 상기 하층액으로부터 세포 밖 소포체를 회수하는 단계;를 포함하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖소포체의 다단계 정제방법에 관한 것이다.
본 발명에서 세포 밖 소포체란 세포에서 생성되어 세포 밖으로 분비되는 소 포체로써， 액소좀 (exosome), 마이크로베지클 (microvesicle) 및 마이크로파티 클 (microparticle) 등을 포함하나, 이들만으로 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 수용액 이상계를 형성하는 제 1물질과 제 2물질의 조합 (제 1물질 / 계 2물질)은， 물 /E0P0( ethylene oxide propylene oxide), 폴리에틸렌 글리 콜 (polyethylene glycol )/덱스트란 (dextran)， 플리에틸렌 글리콜 /고농도 염 , 폴리 에틸렌 글리콜 /레반 (levan), 폴리비닐피로리돈 (polyvinylpyrrolidone)/덱스트란, 폴리비닐 알코을 (polyvinyl alcohol)/텍스트란， 피콜 (f icol 0/덱스트 ¾， 폴리에틸 렌 글리콜 /PolyOinyl methyl ethyl ether), 풀리에틸렌 글리콜 /황산암모 늄 (a隱 onium sulfate), 폴리에틸렌 글리콜 /황산나트륨 (sodium sulfate), 폴리에틸 렌 글리콜 /황산마그네슘 (magnesium sulfate), 폴리에틸렌 글리콜 /인산칼 륨 (potassium phosphate) 및 폴리에틸렌 글리콜 /탄산나트륨 (sodium carbonate) 중 에서 어느 하나인 것이 바람직하나, 특별히 이들로 제한되는 것은 아니며， 수용액 이상계를 형성하는 제 1물질과 제 2물질의 다양한 조합이 사용될 수 있다.
한편, 상기 수용액 이상계를 형성하기 위한 서로 흔화되지 않는 두 가지 물 질은 풀리에틸렌 글리콜 /텍스트란인 것이 가장 바람직하며, 세포 밖 소포체는 덱스
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대체용지 (규칙 제 26조) 트란 상에 농축이 되는 특징이 있고, 상기 덱스트란 상에 농축된 세포 밖 소포체는 피펫 등의 분리방법을 통해 분리될 수 있다.
이때， 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 0 . 2 ~ 600 kDa이고， 농도는 5 ~ 15 wt% 이며, 덱스트란의 분자량은 15 ~ 2 , 000 kDa이고, 농도는 1 ~ 10 %인 것이 바람직 하다. 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란의 농도가 상기 범위보다 낮으면 수용액 이상 계가 형성되지 않고， 상기 농도 범위보다 높으면 이들 고분자를 녹이기 위해 많은 시간이 필요할 뿐 아니라 이상계 사이의 표면 장력이 너무 높아져서 체액과 같은 제 3의 용질이 녹아들기 어렵다.
( a)단계 이후 및 (b)단계 이전에, 수용액 이상계에 첨가제를 추가함으로써， 수용액 이상계 내 분자들 사이의 인력 또는 반발력을 조절할 수 있고, 이를 통해 세포 밖 소포체의 분리효율을 높일 수 있다. 특히 염을 추가함으로써 수용액 이상 계의 전위를 조절하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0 .05 mol K3P04를 추가 할 수 있다.
(b)단계에서 수용액 이상계는 500 - 2 , 000 g— force로 5 - 15분간 원심분 리하여 상 분리 현상을 더욱 촉진할 수 있는데， 500 X g- force 미만인 경우 분리 시 시간이 많이 소요되어 원심분리를 하는 의미가 없으며， 2 , 000 X g-force 부터 는 중력 가속도 (g)를 올려도 분라 시 소요되는 시간에 큰 변화가 없으므로 바람직 하지 않다.
또한 상기 수용액 이상계에 초음파를 조사하거나, 흑은 미세 기포를 주입하 는 단계를 더 포함할 수 있는데ᅳ 두 개의 상 사이의 경계면에 트랩 ( t rap)되어 있는
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대체용지 (규칙 제 26조) 세포 밖 소포체 및 단백질을 더욱 효과적으로 분리해낼 수 있다.
상기 초음파 조사는 용액에 직접 또는 간접적으로 초음파를 가할 수 있으며， 200 W ~ 400 W의 강도에서 20 ~ 240 분 동안 수행하는 것이 바람직하다. 초음파의 강도가 400 W를 초과하는 경우에는 수용액의 은도가 급상승하여 세포 밖 소포체 및 단백질이 변성될 수 있고， 초음파의 강도가 200 W 미만인 경우에는 경계면에 트랩 되어 있는 세포 밖 소포체 및 단백질의 분리가 잘 되지 않는 문제점을 초래한다. 또한 초음파 처리 시간의 경우， 240 분을 초과하는 시점부터는 처리 시간이 길어져 도 분리 정도가 더 이상 증가하지 않으며， 20 분 미만인 경우 그 효율이 떨어진다. 이와 같은 방법으로 상분리된 수용액 이상계에서 상층액을 제거하고 다시 불 순물이 섞이지 않은 새로운 상층액을 혼합하는 과정을 반복하여 세포 밖 소포체를 분리해낸다. 이러한 과정을 반복할수록 세포 밖 소포체의 순도가 높아지지만, 회수 율은 줄어들기에 바람직한 반복회수는 2 ~ 4회이다.
본 발명은 단백질에 의해 오염된 세포 밖 소포체의 순도를 손쉽게 보다 효율 적으로 높일 수 있으며, 질병의 진단, 백신 연구 및 치료 등 다양한 분야에 응용될 수 있는 장점이 있다. 더욱 상세하게는, 체액으로부터 세포 밖 소포체를 분리한후 세포 밖 소포체에 존재하는 유전자 발현량을 측정하여 질병을 진단할 수 있다. 이 때 상기 체액은 전혈 (whol e blood) , 혈청， 복강액, 모유, 또는 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 질병은 암, 패혈증， 동맥경화증 및 류마티스 관절염으로 이루어진 군 중 에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
한편， 본 발명의 수용액 이상계를 사용하여 다단계 정제 방법으로 분리된
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대체용지 (규칙 제 26조) 세포 밖 소포체는 ELISA, RT-PCR, western blot, proteomics 또는 genomics 등의 분석 방법에 사용될 수 있다.
세포 밖 소포체 내에 존재하는 유전자의 발현량 측정 시， 상기 유전자는 자 극에 대해 발현 차이를 보이는 mRNA이며, 유전자의 분리 과정은 세포나 조직에서 유전자를 분리하는 종래의 방법과 동일하다. 더욱 상세하게는, 상기 유전자는 oligo(dT)를 이용하여 cDNA로 합성된 뒤에 real time PCR을 수행하나， real time PCR을 수행하는데 사용되는 주형이 cDNA에 제한되는 것은 아니다.
이때 상기 유전자는 EDNKEndothelin 1), VCAMK Vascular cell adhesion molecule 1)， ICAMl(Intercel lular adhesion molecule 1)， SELE(Select in E) , N0S3(Nitr ic oxide synthase 3) , BMP4(Bone morphogenet ic protein 4), VWF(Von Wi 1 lebrand factor) , MPZ(Myel in protein zero) , IRF1( Interferon regulatory factor 1), TNF(Tumor necrosis factor), IL32( Inter leukin 32)， CFLAR(CASP8 and FADD-1 ike apotosis regulator) , CXCL10 ( Chemok i ne ( C-X-X motif) 1 igand 10)， I L6( Inter leukin 6), ICK( Intest inal cell (MA -like) kinase), T FAIP2 (Tumor necrosis factor , al ha- induced protein 2) , ARHGAP8(Rho GTPase ac ivating protein 8) 및 F3(Coagulat ion factor HI) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상 인 것올 특징으로 하나， 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 수용액 이상계를 이용하여 세포 밖 소포체를 다단계로 분리 및 정 제하는 장치는 도 5와 같으며， 더욱 상세하게는 주입부 (Π3)를 통하여 , 수용액 이상 계를 형성하는 제 1물질 및 제 2물질이 주입되고， 투입부 (20)를 통하여 체액 또는 세 포 밖 소포체가 포함된 수용액이 투입된다. 상기 제 1물질， 제 2물질 및 체액 또는
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대체용지 (규칙 제 26조) 세포 밖 소포체가 포함된 수용액은 주입부 ( 10) 및 투입부 (20)와 연결되어 있는 본 체 (30.)로 들어가 원심분리를 통하여 상 분리가 되며， 상 분리 후 제 1물질이 포함된 상층액은 제거부 (40)를 통해 제거되고， 한번 또는 두번 이상의 다단계 분리정제 후 획득되는 세포 밖 소포체는 회수부 (50)를 통해 회수된다.
주입부 ( 10)와 투입부 (20) 사이에는 도 6과 같이, 체액 또는 세포 밖 소포체 가 포함된 수용액과 제 1물질 및 제 2물질의 혼합이 용이할 수 있도록 흔합부 (60)를 더 포함할 수 있으며， 상기 흔합부 (60)에는 진동장치가 장착되어 흔합이 효율적으 로 될 수 있도록 하는 것이 바람직하다.
본체 (30)에 초음파 조사 장치 또는 미세 기포 발생 장치가 더 포함되는 것이 바람직하며， 상기 장치는 상 분리 후 두 개의 상 사이의 경계면에 트랩되어 있는 세포 밖 소포체 및 단백질을 효과적으로 분리해내기 위하여 초음파를 조사하거나 미세 기포를 발생시키는 장치이다.
주입부 ( 10)는 도 7과 같이 제 1물질과 제 2물질이 각각 주입될 수 있도록 제 1 주입부 ( 10a)와 제 2주입부 (10b)로 분리되는 것이 바람직하며, 수용액 이상계 제조 시 제 1물질 및 제 2물질의 농도를 각각의 폴리머 및 체액의 종류에 따라 조절할 수 있다.
또한 본체 (30)의 형상은 원통형일 수도 있고， 도 8과 같이 호리병형일 수 도 있다. 본체 (30)가 호리병형인 경우， 오목하게 들어간 부위에 수용액 이상계의 경계면이 형성되는 데, 이 경우 경계면이 좁기 때문에 트랩된 세포 밖 소포체의 두 께가두껍게 형성되어 분리가 용이해진다는 장점이 있다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 이하에서는 본 발명의 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 분리방법에 대하여 구체적인 실시예를 증심으로 설명하고자 한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하 는 것은 아니므로, 본 발명의 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
[실시예 1] 세포 밖 소포체 분리 및 정제를 위한 수용액 이상계 준비
수용액 이상계를 만들기 위해 폴리에틸렌 글리콜 및 텍스트란을 인산 완층 식염수 (PBS , Phosphate buf fered sal ine)에 녹여 각각 10.5 wt% 및 4.5 wt% 의 농 도로 준비하였다. 이후 세포 밖 소포체를 포함하는 수용액에 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란 흔합 수용액을 흔합하여 4 °C에서 3 시간 동안 쉐이커를 사용하여 교반하 였다.
[실시예 2] 수용액 이상계에서 세포 밖 소포체 정제
실시예 1에 의해 제조된 세포 밖 소포체를 포함한 수용액 이상계를 1 , 000 X g-force로 4 °C에서 10분 간 원심분리를 하여 폴리에틸렌 글리콜 상 및 덱스트란 상으로 상 분리를 가속화시켰다. 상 분리 후 경계층을 제외한 상층액인 폴리에틸렌 글리콜 상을 제거한 후 제거한 부피와 동일한 양의 새로운 폴리에틸렌 글리콜을 넣 고 실시예 1에서와 같은 방법으로 교반하고 상 분리 과정을 수행하였다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 이러한 상 분리 과정을 각각 1회, 3회 및 5회 실시하였으며， 각각의 다단계 정제가 끝난 후 단백질과 세포 밖 소포체의 회수율을 아래의 식 ( 1 )에 따라 계산하 였으며， 그 결과는 도 1과 같다.
이때 단백질의 양은 브래드포드 방법올 이용하였고 세포 밖 소포체는 RNA양 을 이용하여 그 값을 구하였다. 회수율 (Recovery ef f i ci ency)= (덱스트란 충에 있는 단백질 또는 세포 밖 소 포체의 양) /(전체 단백질 또는 세포 밖 소포체의 양) ( 1)
도 1에 따르면, 1회， 3희, 5회의 다단계 정제 후 세포 밖 소포체의 회수율은 각각 7그 9% , 77.4% 및 74.7%으로 다단계 정제의 횟수가 반복될수록， 세포 밖 소포 체의 회수율은 큰 차이 없이 근소하게 감소하였지만， 단백질의 회수율은 각각 29.4¾, 3.6% 및 2.4¾>로 다단계 정제의 횟수가 반복될수록 크게 감소하였다. 따라서 다단계 정제의 횟수가 반복될수록 세포 밖 소포체의 순도가 급격하게 증가하는 것 을 확인할 수 있다.
[실시예 3] 정제된 세포 밖소포체의 분석
실시예 2에 따라 정제된 세포 밖 소포체와 종래의 기술인 초고속원심분리법 을 이용하여 얻은 세포 밖 소포체의 동일성을 비교하고, 분석 방법에 사용하여 assay를 수행할 수 있는지 확인하기 위해서 아래와 같이 TEM , western b lot , RT-
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대체용지 (규칙 제 26조) PCR분석을 시행하였다. a. 분리된 세포 밖소포체의 동일성 비교 (TEM) 실시예 2에서 정제된 세포 밖 소포체와 초고속원심분리법으로 획득한 세포 밖 소포체를 투과전자현미경 (TEM , Transmi ssi on El ect ron Mi croscopy)을 이용하여 관찰하였고 그 결과는 도 2과 같다. 도 2의 결과를 보면 초고속원심분리기로 얻은 세포 밖 소포체와 본 발명에 의해 정제된 세포 밖 소포체의 형태는 동일함을 확인할 수 있다. b. Western blot 분석 세포 밖 소포체에 존재하는 CD81 마커를 이용하여 Western blot을 수행하였 다. 도 3(a)에서 STD는 standard로서 PBS에 세포 밖 소포체를 혼합한 것이며, Ul tra는 초원심분리법, Ul t ra*5는 초원심분리법으로 얻은 샘플의 5배 부피를 뜻하 고, ATPS-1 , ATPS-3 및 ATPS-5는 실시예 2에서 나타난 바와 같이 상 분리를 각각 1 회， 3회 및 5회 하여 얻은 샘플이다. 이때 세포 밖 소포체의 회수율을 알아보기 위 하여 동일한 부피의 샘플을 로딩하였으며， 따라서 총 단백질량은 각 샘플별로 모두 상이하다ᅳ 도 3(b)에서는 세포 밖 소포체의 순도를 알아보기 위하여 총 단백질량이 동 일한 샘플을 로딩하였으며, 따라서 각 샘플의 부피는 모두 상이하다. 도 3(a)와 도 3(b)에 따라 초원심분리법과 본 발명의 다단계 정제방법을 비 교해보면, 초원심분리법으로 획득한 세포 밖 소포체의 경우 순도는 더 높지만, 회 수율에서 매우 낮은 효율을 가지므로 바람직하지 못하다. 또한 본 발명의 다단계
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대체용지 (규칙제 26조) 점제방법에서 상 분리 횟수가 1회， 3회， 5회로 증가하여도 세포 밖 소포체의 회수 율은 크게 변화가 없지만， 순도의 경우 상 분리 횟수가 증가할수록 높아지게 된다. c RT-PCR분석
본 발명의 다단계 정제방법으로 RNA의 손상없이 세포 밖 소포체를 분리 및 정제할 수 있음을 아래와 같은 방법으로 확인하였다.
멜라노마 (melanoma)에서 얻은 세포 밖 소포체에 혈청단백질을 섞어서 생체유 체와 유사하게 단백질에 의해 오염된 세포 밖 소포체 샘폴을 제조하였다. 이후, 상 기 세포 밖 소포체 샘폴을 다단계 정제방법으로 분리 및 정제하고， Melan A라는 mRNA를 추출하여 RT— PCR(reverse transcription PCR)을 실행하였으며， 이를 항존 유전자인 GAPDH의 RT— PCR 결과와 비교하였다. 도 4의 RT-PCR 결과에 따르면， Melan A와 GAPDH는 동일함을 확인할 수 있는 데, 이는 본 발명에 따른 세포밖 소포체의 다단계 분리 및 정제 방법을 통해서 분 리된 세포 밖 소포체가 RNA의 손상 없이 분리되었음을 의미한다 (도 4의 Negative는 세포 밖 소포체가 없는 경우이며, 이때 세포 밖 소포체가 포함된 시료 대신 DW(distilled water)를 사용하였다).
이상과 같이 실시.예 1 내지 3의 실험결과를 통해， 본 발명의 다단계 정제방 법은 R A 손상없이 세포 밖 소포체를 분리 및 정제할 수 있으며， 종래의 초고속원 심분리법과 비교하였을 때, 동일한 세포 밖 소포체를 고순도로 얻을 수 있어 효율 적이다ᅳ 또한 다단계 정제 시, 상 분리 횟수가 반복될수록 세포 밖 소포체의 희수 율은 약간 줄어들지만， 단백질의 회수율은 크게 줄어들어， 세포 밖 소포체의 순도 는 점점 높아지는 것을 확인할 수 있었다.
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대체용지 (규칙 제 26조) 【산업상 이용가능성】
본 발명은 세포밖 소포체를 포함한수용액에서 세포 밖 소포체를 분리 및 정 제시, 수용액 이상계를 이용한 다단계 정제방법을 사용함으로써, 불순물인 단백질 을 제거하고 고순도의 세포 밖 소포체를 획득하는 것을 기술적 특징으로 하고 있 어， 본 발명에 따른 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법은 95 % 이상의 단백질을 제거할 수 있으며， 고순도의 세포 밖 소포체를 획득할 수 있 는 것으로 기존의 정제 방법에 비하여 매우 높은 효율을 가지며， 특히 초고속 원 심분리 장치나 항체와 같은 고가의 장비나 재료가 필요 없으므로, 비용이 적게 들 어 경제적인 효과가 있다. 또한, 본 발명에 의해 분리 및 정제된 세포 밖 소포체는 RT-PCR이나 western blot과 같은 분석 방법에 이용할 수 있어, 이를 이용한 연구 분야 및 질병 진단에도 활용할 수 있다는 장점이 있으므로, 산업상 이용 가능성이 있다.
16
대체용지 (규칙 제 26조)

Claims

【청구의 범위】
【청구항 1】
(a) 체액 또는 세포 밖 소포체가존재하는 수용액에 게 1물질과 제 2물질을 혼 합하는 단계 ;
(b) 상기 흔합물을 상층액과 하층액으로 상분리시켜 수용액 이상계를 제조하 는 단계 ;
(c) 상기 수용액 이상계 증， 거 U물질이 포함된 상층액을 제거하는 단계;
(d) 잔류하는 하층액에 제 1물질을 포함하는 새로운 상층액을 공급하여 흔합 하는 단계; 및
(e) 상기 (b) 내지 (d)단계를 적어도 한번 또는 두번 이상 수행한 후， 상기 하층액으로부터 세포 밖 소포체를 회수하는 단계;를 포함하는， 수용액 이상계를 이 용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 .
【청구항 2】
거 U항에 있어서，
상기 제 1물질은 물, 폴리에틸렌 글리콜， 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐 알코을 또는 피콜 증에서 선택되는 것이며,
상기 제 2물질은 EOPC ethylene oxide propylene oxide) , 덱스트란, 고농도 염, 레반， Po ly(vinyl methyl ethyl ether ) , 황산암모늄， 황산나트륨, 황산마그네 슘， 인산칼륨 또는 탄산나트륨 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는， 수용액 이상 계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
【청구항 3】
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대체용지 (규칙 제 26조) 제 2항에 있어서，
상기 제 1물질은 물이고， 상기 제 2물질은 E0P0인 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법.
【청구항 4]
게 2항에 있어서，
상기 제 1물질은 폴리에틸렌 글라이콜이고, 상기 제 2물질은 덱스트란, 레반, Poly(vinyl methyl ethyl ether ) , 황산암모늄， 황산나트륨, 황산마그네슘, 인산칼 륨， 탄산나트륨 증에서 선택되는 것을 특징으로 하는， 수용액 이상계를 이용한 세 포 밖 소포체의 다단계 정제방법 .
【청구항 5】
게 2항에 있어서，
상기 게 1물질은 폴리에틸렌 글라이콜， 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐 알코올 또는 피콜 중에서 선택되는 것이고， 상기 제 2물질은 텍스트란인 것을 특징으로 하 는， 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 .
【청구항 6】
제 2항에 있어서，
상기 제 1물질은 폴리에틸렌 글리콜 (polyethyl ene glycol )이며, 상기 제 2물질 은 텍스트란 (dextran)인 것을 특징으로 하는， 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소 포체의 다단계 정제방법.
【청구항 7】
제 1항에 있어서，
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대체용지 (규칙 제 26조) 상기 (a)단계 이후 및 (b)단계 이전에，
상기 수용액 이상계에 첨가제를 추가하여 수용액 이상계 내 분자들 사이의 인력 또는 반발력을 조절하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는， 수용액 이 상계를 이용한 세포 밖소포체의 다단계 정제방법.
【청구항 8】 제 1항에 있어서，
상기 (b)단계의 상 분리는 500 ~ 2 , 000 g-force의 원심분리법으로 수행되 는 것을 특징으로 하는， 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방
【청구항 9】 제 1항에 있어서，
상기 (b)단계에서,
상기 수용액 이상계에 초음파조사 혹은 미세 기포를 주입하는 단계를 더 포 함하는 것을 특징으로 하는， 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정 제방법.
【청구항 10] 제 1항에 있어서，
상기 체액은 전혈 (whole b lood) , 혈청, 복강액， 모유 및 소변으로 이루어진 군 중에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는， 수용액 이상계 를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제방법 .
【청구항 11]
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대체용지 (규칙 제 26조) 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 통해 분리 및 정제된 세 포 밖 소포체로 ELI SA , RT-PCR, western blot , proteomi cs 또는 genomi cs으로 assay를 수행하는 방법 .
【청구항 12]
수용액 이상계를 이용하여 세포 밖 소포체를—.다단계 정제하는 장치에.
있어서，
수용액 이상계를 형성하는 제 1물질 및 제 2물질을 주입하는 주입부 ( 10) ; 체액 또는 세포 밖 소포체가 포함된 수용액을 투입하는 투입부 (20) ;
상기 주입부 및 투입부와 연결되어 체액 또는 세포 밖 소포체가 포함된 수용 액과 게 1물질 및 제 2물질을 원심분리하여 상 분리를 하는 본체 (30) ;
상기 상 분리 후 제； I물질이 포함된 상층액을 제거하는 제거부 (40) ;
상기 본체 (30)에서 획득되는 세포밖 소포체를 회수하는 회수부 (50) ;를 포함 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장치.
ί청구항 13]
제 12항에 있어서,
상기 주입부 ( 10)와 투입부 (20) 사이에 체액 또는 세포 밖 소포체가 포함된 수용액과 제 1물질 및 제 2물질을 흔합하는 흔합부 (60)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장치 .
【청구항 14】
제 13항에 있어서,
상기 혼합부 (60)에 진동장치가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는， 수용액
20
대체용지 (규칙 제 26조) 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장치 . 【청구항 15] 제 12항에 있어서， 상기 본체 (30)에 초음파 조사 장치가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는, 수 용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장치. 【청구항 16】 ᅳ 제 12항에 있어서, 상기 본체 (30)에 미세 기포 발생 장치가 포함되어 있는 것을 특징으로 하는， 수용액 이상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장치 . 【청구항 17】 제 12항에 있어서， 상기 주입부 ( 10)는 제 1물질과 제 2물질이 각각 주입될 수 있도록 제 1주입 부 ( 10a)와 제 2주입부 ( 10b)로 분리되는 것을 특징으로 하는， 수용액 이상계를 이용 한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장치 . 【청구항 18] 제 12항에 있어서, 상기 본체 (30)의 형상은 원통형이거나 호리병형인 것을 특징으로 하는， 수용액 이 상계를 이용한 세포 밖 소포체의 다단계 정제장치 .
21
대체용지 (규칙 제 26조)
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