WO2016153179A1 - 3차원 프린팅용 조성물, 이의 제조방법, 및 이를 사용한 3차원 구조체의 제조방법 - Google Patents

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    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Definitions

  • the present invention relates to a composition for three-dimensional printing.
  • the present invention relates to a method for producing a three-dimensional printing composition and a method for producing a three-dimensional structure using the three-dimensional printing composition.
  • Three-dimensional printing converts arbitrary shape information obtained from tissue data with complex shapes or organs into G-code and builds a complex skeletal structure through a layer-by-layer process. I say that.
  • Such three-dimensional printing is also referred to as 'three-dimensional bioprinting' (3D bioprinting).
  • 'multi-axis tissue organ printing system' is one of the representative three-dimensional printing technologies, which uses two pneumatic syringes for pneumatically injecting a material and a step motor to precisely inject in nanoliter units. It consists of two syringes, and various materials can be used at the same time.
  • thermoplastic biocompatible polymer such as polylactic acid (PLA), poly-glycolic acid (PGA), poly-lactic-co-glycolid acid (PLGA), polycaprolactone (PCL), or a mixture thereof is mounted on a pneumatic syringe.
  • PLA polylactic acid
  • PGA poly-glycolic acid
  • PLGA poly-lactic-co-glycolid acid
  • PCL polycaprolactone
  • a hydrogel made of collagen, hyaluronic acid, gelatin, alginate, chitosan or fibrin is used to prepare a three-dimensional structure using a piston syringe.
  • the harvested dECM material is typically processed as a two-dimensional (2D) scaffold from various tissues, including the skin and small intestinal submucosa, where infiltrating or seeding cells are supported by supportive vascular networks. It depends on the diffusion of oxygen and nutrients for survival until a supporting vascular network is established.
  • 2D two-dimensional
  • the structure produced by three-dimensional printing using the dECM bioink should have a mechanical strength capable of maintaining the three-dimensional shape.
  • the bio-ink in the form of pre-gel during extrusion from a syringe is maintained at a temperature of about 15 ° C. or lower while the three-dimensional structure is shaped.
  • the three-dimensional structure shape thus formed is a process for imparting appropriate mechanical strength, and thermal processing or post-print crosslinking is performed. The thermal processing is carried out by gelling in a incubator at about 37 ° C., for example.
  • the post-printing crosslinking is performed by crosslinking by treating a three-dimensional structure shape with a crosslinking agent solution such as glutaraldehyde.
  • a crosslinking agent solution such as glutaraldehyde.
  • the three-dimensional structure obtained by gelling by thermal processing has a relatively low mechanical strength, making it difficult to produce an organ that requires satisfactory mechanical strength.
  • post-printing crosslinking requires the use of a toxic crosslinking agent such as glutaraldehyde, which causes safety problems.
  • the present inventors have conducted various studies to develop an improved manufacturing method for producing a three-dimensional structure having a high mechanical strength by the three-dimensional printing method.
  • the present inventors fabricated a three-dimensional structure by performing a layer-by-layer process through printing using a composition for three-dimensional printing containing riboflavin having high safety as a crosslinking agent and crosslinking under UVA. By thermally gelling the obtained three-dimensional structure shape, a method for producing a three-dimensional structure with high mechanical strength uniformly was developed. That is, the present inventors newly developed a crosslinking-thermal gelation method using riboflavin.
  • an object of this invention is to provide the composition for three-dimensional printing containing riboflavin as a crosslinking agent.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a three-dimensional structure using the three-dimensional printing composition.
  • decellularized extracellular matrix As a crosslinking agent, a composition for three-dimensional printing is provided.
  • the decellularized extracellular matrix is cardiac tissue, cartilage tissue, bone tissue, adipose tissue, muscle tissue, skin tissue, mucosal epithelial tissue (mucosal epithelial tissue) discharged in vitro, Amniotic tissue, or corneal tissue, may be obtained by decellularization; It may be present in an amount of 1 to 4% by weight based on the total weight of the composition. In addition, the riboflavin may be present in an amount of 0.001 to 0.1% by weight based on the total weight of the composition.
  • the composition for three-dimensional printing of the present invention comprises at least one acid selected from the group consisting of acetic acid and hydrochloric acid; At least one protease selected from the group consisting of pepsin and matrix metalloproteinases; And pH adjusters.
  • the three-dimensional printing composition of the present invention based on the total weight of the composition, 1 to 4 weight of the decellularized extracellular matrix; Riboflavin 0.001-0.1 wt%; 0.03 to 30% by weight of at least one acid selected from the group consisting of acetic acid and hydrochloric acid; 0.1-0.4 wt% of at least one protease selected from the group consisting of pepsin and matrix metalloproteinases; And pH adjusting agents.
  • the composition for three-dimensional printing of the present invention may have a viscosity at a shear rate of 1 s ⁇ 1 when measured at about 15 ° C. in a range of 1 to 30 Pa ⁇ S.
  • step (a) adding a decellularized extracellular matrix to an acid solution selected from the group consisting of acetic acid and hydrochloric acid, (b) pepsin to the mixture obtained in step (a) And at least one protease selected from the group consisting of matrix metalloproteinases, followed by stirring
  • a method for producing a composition for three-dimensional printing comprising the step of obtaining, and (c) adding riboflavin and a pH adjusting agent to the solution obtained in step (b).
  • step (i) performing a layer-by-layer process through the printing using the three-dimensional printing composition and crosslinking under UVA to form a three-dimensional structure shape; And (ii) thermal gelation of the shape of the three-dimensional structure obtained in step (i) at a temperature of 15 ° C. or more to obtain a three-dimensional structure.
  • the crosslinking in each lamination process can be performed for 1-10 minutes.
  • the present invention By using a three-dimensional printing composition containing riboflavin and carrying out a layer-by-layer process through crosslinking under UVA to produce a three-dimensional structure shape, and then thermally gelling the obtained three-dimensional structure shape It has been found by the present invention that three-dimensional structures with high mechanical strength can be produced. That is, the present invention enables the production of three-dimensional structures with high mechanical strength uniformly by providing a crosslinking-thermal gelation method using riboflavin.
  • the present invention can avoid the use of toxic crosslinking agents such as glutaraldehyde by using riboflavin having high safety as a crosslinking agent. Accordingly, the present invention can be usefully applied to fabricate tissue-engineering scaffolds, cell-based sensors, drug / toxic screening, and tissue or tumor models with three-dimensional printing.
  • FIG 1 is an optical micrograph and tissue staining photograph (a) of decellularized extracellular matrix (hdECM) (b) obtained from cardiac tissue.
  • hdECM decellularized extracellular matrix
  • FIG. 2 is a photograph showing the shape of a three-dimensional structure manufactured according to the present invention, using the PCL framework.
  • FIG. 3 is a photograph showing the shape of a three-dimensional structure manufactured according to the present invention without using a PCL framework.
  • the present invention is decellularized extracellular matrix; And it provides a composition for three-dimensional printing, comprising riboflavin as a crosslinking agent.
  • the decellularized extracellular matrix can be obtained by decellularizing tissues released from mammals such as humans, pigs, cattle, rabbits, dogs, goats, sheep, chickens, horses, and the like.
  • the tissue is not particularly limited and includes, for example, heart tissue, cartilage tissue, bone tissue, adipose tissue, muscle tissue, skin tissue, mucosal epithelial tissue, amniotic tissue, corneal tissue, and the like.
  • it includes heart tissue, cartilage tissue, bone tissue, more preferably comprises heart tissue obtained from pigs, cartilage tissue, bone tissue.
  • Such decellularization may be carried out by known methods such as Ott, HC et al. Nat. Med. 14, 213-221 (2008), Yang, Z. et al. Tissue Eng.
  • a three-dimensional structure is manufactured by performing a layer-by-layer process through printing using a composition for three-dimensional printing containing riboflavin having high safety and crosslinking under UVA. It has been found that by thermally gelling the obtained three-dimensional structure shape, a three-dimensional structure having high mechanical strength uniformly can be produced. That is, the present invention provides a crosslinking-thermal gelation method comprising the use of riboflavin.
  • the riboflavin may be used in an amount sufficient to crosslink under UVA, for example, in an amount of 0.001 to 0.1% by weight, preferably 0.01 to 0.1% by weight based on the total weight of the composition.
  • the composition for three-dimensional printing of the present invention preferably has a form of a viscoelastic uniform solution having a range of pH 6.5 to 7.5 for efficient three-dimensional printing.
  • the three-dimensional printing composition of the present invention comprises at least one acid selected from the group consisting of acetic acid and hydrochloric acid in an aqueous medium; At least one protease selected from the group consisting of pepsin and matrix metalloproteinases; And a pH adjuster (eg, sodium hydroxide) for adjusting the pH in the range of 6.5 to 7.5.
  • the acid serves to dissolve the decellularized extracellular matrix, preferably acetic acid, hydrochloric acid, etc.
  • the protease performs a digestion function of telopeptide of the decellularized extracellular matrix, and preferably, pepsin, matrix metalloproteinase, or the like may be used.
  • the amount of the protease is different depending on the content of the decellularized extracellular matrix, but may be used, for example, at a rate of 5 to 30 mg, preferably 10 to 25 mg relative to 100 mg of the decellularized extracellular matrix.
  • the pH regulator functions to neutralize the acid used for lysis of the decellularized extracellular matrix, and can be used in an amount sufficient to adjust the pH to 6.5 to 7.5, preferably about pH 7, for example with sodium hydroxide. have.
  • the three-dimensional printing composition of the present invention based on the total weight of the composition, 1 to 4 weight of the decellularized extracellular matrix; Riboflavin 0.001-0.1 wt%; 0.03 to 30% by weight of at least one acid selected from the group consisting of acetic acid and hydrochloric acid; 0.1-0.4 wt% of at least one protease selected from the group consisting of pepsin and matrix metalloproteinases; And pH adjusting agents.
  • composition for three-dimensional printing of the present invention is preferably a viscoelastic material whose viscosity decreases as the shear rate increases, for example, a viscosity at a shear rate of 1 s ⁇ 1 when measured at about 15 ° C. It is preferable that it is the range of 1-30 Pa * S.
  • the viscosity can be adjusted by appropriately adjusting the amount of aqueous medium (eg, water, distilled water, PBS, saline, etc.).
  • the present invention also provides a method for preparing the composition for three-dimensional printing. That is, the present invention comprises the steps of: (a) adding a decellularized extracellular matrix to at least one acid solution selected from the group consisting of acetic acid and hydrochloric acid, (b) pepsin and matrix metal to the mixture obtained in step (a) One or more proteolytic enzymes selected from the group consisting of lotropinase are added, followed by stirring. It provides a method for producing a three-dimensional printing composition comprising the step of obtaining, and (c) adding a riboflavin and a pH adjuster to the solution obtained in step (b).
  • the acid, decellularized extracellular matrix, riboflavin, protease, and pH regulator are as described above.
  • the acid solution of step (a) may be, for example, 0.01 to 0.5 M aqueous acetic acid solution, preferably about 0.5 M aqueous acetic acid solution.
  • the agitation of step (b) may be performed until complete lysis of the decellularized extracellular matrix, which may typically be performed for 24 to 48 hours, but is not limited thereto.
  • the process of step (c) is preferably carried out at a low temperature of about 15 ° C. or lower, preferably about 4 to 10 ° C., in order to prevent gelation.
  • the resulting three-dimensional printing composition is in the form of a pH-adjusted pre-gel, preferably refrigerated at about 4 ° C.
  • the present invention also comprises the steps of (i) forming a three-dimensional structure by performing a layer-by-layer process through printing using the composition for three-dimensional printing and crosslinking under UVA; And (ii) thermal gelation of the shape of the three-dimensional structure obtained in step (i) at a temperature of 15 ° C. or more to obtain a three-dimensional structure.
  • the printing of step (i) is carried out using a known three-dimensional printing method (e.g., a printing method using a 'multiaxial tissue organ printing system'), Falguni Pati, et al., Nat Commun . 5, 3935 (2014) and the like.
  • the printing can be performed using two syringes of a multiaxial tissue organ printing system. That is, a polycaprolactone (PCL) framework is loaded into a syringe and heated to about 80 ° C. to melt the polymer.
  • PCL polycaprolactone
  • the above composition for three-dimensional printing in the form of pre-gel is loaded into another syringe and the temperature is maintained at about 15 ° C. or lower, preferably about 4 to 10 ° C.
  • Pneumatic pressure is applied in the 400-650 kPa range for fabrication of the PCL framework.
  • the composition in pre-gel form is sprayed using a plunger-based low-dosage dispensing system.
  • the printing may also be carried out by spraying only the composition in the pre-gel form using a plunger-based low-dosage dispensing system without the use of a polycaprolactone framework.
  • Crosslinking under the UVA can be carried out by irradiating UVA at a wavelength of 315 to 400 nm, preferably about 360 nm for 1 to 10 minutes, preferably for about 3 minutes.
  • a three-dimensional structure shape is formed.
  • the hydrogel obtained according to the present invention has a modulus of 10.58 kPa at 1 rad / s, which represents about 30 times more strength improvement by crosslinking.

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Abstract

본 발명은 탈세포화된 세포외 기질; 및 가교제로서 리보플라빈을 포함하는, 3차원 프린팅용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 3차원 프린팅용 조성물을 사용한 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통한 적층 공정(layer-by-layer process)을 수행하여 3차원 구조체 형상을 제작한 다음, 얻어진 3차원 구조체 형상을 열적 겔화할 경우, 높은 기계적 강도를 갖는 3차원 구조체를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 3차원 프린팅용 조성물의 제조방법 및 상기 3차원 프린팅용 조성물을 사용한 3차원 구조체의 제조방법을 제공한다.

Description

3차원 프린팅용 조성물, 이의 제조방법, 및 이를 사용한 3차원 구조체의 제조방법
본 발명은 3차원 프린팅용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 3차원 프린팅용 조성물의 제조방법 및 3차원 프린팅용 조성물을 사용한 3차원 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
3차원 프린팅은 복잡한 형상을 가진 조직(tissue)이나 장기(organ)의 의료 데이터로부터 얻은 임의 형상 정보를 G-code로 변환한 후 적층 공정(layer-by-layer process)을 통하여 복잡한 골격 구조를 구축하는 것을 말한다. 이러한 3차원 프링팅은 또한 '3차원 바이오프린팅(three-dimensional bioprinting, 3D bioprinting)'으로도 지칭된다. 예를 들어, '다축 조직 장기 프린팅 시스템'은 대표적인 3차원 프린팅 기술 중 하나로서, 재료를 공압으로 분사하는 공압식 시린지 2개와 스텝 모터(step motor)를 이용하여 나노리터 단위로 정밀하게 분사하는 피스톤식 시린지 2개로 이루어져 있으며, 다양한 재료를 동시에 이용할 수 있다. 통상, PLA(Polylactic Acid), PGA(Poly-glycolic Acid), PLGA(Poly-lactic-co-glycolid Acid), PCL(Polycaprolactone), 혹은 이들의 혼합물과 같은 열가소성 생체적합성 고분자를 공압식 시린지에 장착하여 구조체를 제작한다. 또한, 콜라겐, 히알루론산, 젤라틴, 알기네이트, 키토산 또는 피브린(fibrin) 등으로 이루어진 하이드로겔을 피스톤식 시린지를 이용하여 3차원 구조체를 제작한다.
바이오프린팅은 세포-함유 매체의 분배를 필요로 하기 때문에, 바이오프린팅의 중요한 측면은 프린팅 공정이 세포적합성(cytocompatible)이어야 한다는 것이다. 이러한 제한은, 수성 또는 수성 겔 환경에서 수행하여야 할 필요성 때문에, 재료의 선택을 감소시킨다. 따라서, 젤라틴, 젤라틴/키토산, 젤라틴/알기네이트, 젤라틴/피프로넥틴, 루트롤 F127(Lutrol F127)/알기네이트, 및 알기네이트 등의 재료를 사용한 하이드로겔이 간에서 골에 이르기까지 다양한 조직을 제조하기 위한 바이오프린팅에 사용되고 있다. 바이오프린팅에 사용되는 상기 하이드로겔 또는 하이드로겔과 세포의 혼합물 등은 '바이오잉크(bioink)'로도 지칭된다.
일반적으로, 세포는 전체 배양 기간 동안 원래의 놓여진 위치에 특이적으로 계속 위치해 있으며, 이는 세포가 주위의 알기네이트 겔 매트릭스를 유지하거나 분해할 수 없기 때문이다(Fedorovich, N. E. et al. Tissue Eng. 13, 1905-1925 (2007). 따라서, 세포-프린트 구조체의 바이오프린팅에 관한 몇가지 성공 보고가 있을 지라도, 최소한의 세포-재료 상호작용(cell-material interactions) 및 열등한(inferior) 조직 형성은 가장 중요한 문제이다. 실제로, 이들 재료는 천연의 세포외 기질(extracellular matrices, ECMs)의 복잡성을 나타낼 수 없으며, 이에 따라 생체 조직의 전형적인 세포-세포 연결(cell-cell connections) 및 3차원(three-dimensional, 3D) 세포 구성을 갖는 미세환경을 재현하기에 충분하지 않다. 따라서 상기 하이드로겔 중의 세포는 생체 내에서 살아있는 조직의 고유한 형태 및 기능을 나타낼 수 없다. 따라서, 세포의 모 조직(parent tissue)과 유사한 천연의 미세환경을 세포에 제공된다면 이상적일 것이다. 탈세포화된 세포외 기질(decellularized extracellular matrix, dECM)은 이렇게 하기 위한 최선의 선택이며, 이는 어떠한 천연의 혹은 인공 재료도 천연의 세포외 기질의 특성 모두를 재현할 수 없기 때문이다. 더욱이, 각 조직의 ECM은 조성(composition) 및 국소해부학(topology) 관점에서 독특하며, 상기 조성 및 해부학 특성은 상주하는 세포(resident cells)와 미세환경 사이의 역동적이고 상호적인 상호작용을 통해 생성된다. 조직 및 장기로부터 분리된 세포와 ECM의 최근 연구는 선택된 세포 기능 및 표현형(phenotype)을 보존하기 위하여 조직 특이성(tissue specificity)의 필요성을 강조하고 있다(Sellaro, T. L. et al. Tissue Eng . Part A 16, 1075-1082 (2010); Petersen, T. H. et al. Science 329, 538-541 (2010); Uygun, B. E. et al. Nat. Med . 16, 814-821 (2010); Ott, H. C. et al. Nat. Med . 16, 927-933 (2010); Flynn, L. E. Biomaterials 31, 4715-4724 (2010)). 수확된 dECM 재료는 전형적으로 피부, 소장 점막하조직(small intestinal submucosa)을 포함한 다양한 조직으로부터 2차원(two-dimensional, 2D) 스캐폴드로서 가공되며, 초기 단계에서 침투성 또는 시딩된 세포는 지지성 혈관 네트워크(supporting vascular network)가 생길 때까지 생존을 위해 산소 및 영양소의 확산에 의존한다. 그러나, 프린팅된 조직 유사체 구조는 영양소의 흐름을 허용하도록 개방된 다공성 3D 구조를 고안하는 제조방법을 필요로 한다. 본 발명자들은 3D 구조 조직의 성장에 적합한 최적화된 미세환경을 제공할 수 있는 dECM 바이오잉크를 사용한 세포-담지(cell-laden) 구조의 프린팅을 위한 3차원 프린팅 방법을 개발한 바 있으며, 상기 세포-담지 구조는 고유의 세포 형태 및 기능을 재현할 수 있다(Falguni Pati, et al., Nat Commun . 5, 3935 (2014)).
한편, dECM 바이오잉크를 사용하여 3차원 프린팅에 의해 제작된 구조체는 3차원 형상을 유지할 수 있는 기계적 강도를 가져야 한다. 예를 들어, 다축 조직 장기 프린팅 시스템과 같은 압출-계 프린팅에 있어서, 시린지로부터의 압출 과정에서 프리-겔(pre-gel) 형태의 바이오잉크는 약 15℃ 이하의 온도로 유지되면서 3차원 구조체 형상을 형성한다. 이와 같이 형성된 3차원 구조체 형상은, 적절한 기계적 강도를 부여하기 위한 공정으로서, 열적 가공(thermal processing) 또는 프린트-후 가교(post-print crosslinking)가 수행된다. 상기 열적 가공은 예를 들어 약 37℃에서 인큐베이터(humid incubator) 중에서 겔화시킴으로써 수행된다. 상기 프린트-후 가교는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 가교제 용액을 3차원 구조체 형상에 처리하여 가교화함으로써 수행된다. 그러나, 열적 가공에 의해 겔화시켜 얻어지는 3차원 구조체는 기계적 강도가 상대적으로 낮아, 만족할 만한 기계적 강도를 필요로 하는 장기를 제조하는 것이 곤란하다. 또한, 프린트-후 가교는 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 독성 가교제의 사용을 필요로 하므로 안전성 문제가 야기되며, 또한 3차원 구조체 내부에는 충분한 가교가 이루어지지 않아 불균일하게 가교된 3차원 구조체가 얻어지는 문제가 있다.
본 발명자들은 3차원 프린팅 방법에 의해 높은 기계적 강도를 가진 3차원 구조체를 제조하기 위한 개선된 제조방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 본 발명자들은 높은 안전성을 갖는 리보플라빈을 가교제로서 포함하는 3차원 프린팅용 조성물을 사용한 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통한 적층 공정(layer-by-layer process)을 수행하여 3차원 구조체 형상을 제작한 다음, 얻어진 3차원 구조체 형상을 열적 겔화시킴으로써 높은 기계적 강도를 균일하게 갖는 3차원 구조체를 제조할 수 있는 방법을 개발하였다. 즉, 본 발명자들은 리보플라빈을 사용하는 가교-열적 겔화 방법(crosslinking-thermal gelation)을 새롭게 개발하였다.
따라서, 본 발명은 가교제로서 리보플라빈을 함유하는 3차원 프린팅용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 3차원 프린팅용 조성물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 3차원 프린팅용 조성물을 사용한 3차원 구조체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, 탈세포화된 세포외 기질; 및 가교제로서 리보플라빈을 포함하는, 3차원 프린팅용 조성물이 제공된다.
본 발명의 3차원 프린팅용 조성물에 있어서, 상기 탈세포화된 세포외 기질은 체외로 배출된 심장 조직, 연골 조직, 골 조직, 지방 조직, 근육 조직, 피부 조직, 점막 상피 조직(mucosal epithelial tissue), 양막 조직, 또는 각막 조직을 탈세포화함으로써 얻어진 것일 수 있으며; 조성물 총 중량에 대하여 1∼4 중량%의 함량으로 존재할 수 있다. 또한, 상기 리보플라빈은 조성물 총 중량에 대하여 0.001∼0.1 중량%의 함량으로 존재할 수 있다.
본 발명의 3차원 프린팅용 조성물은 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제(matrix metalloproteinase)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소; 및 pH 조절제를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 3차원 프린팅용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여, 탈세포화된 세포외 기질 1∼4 중량; 리보플라빈 0.001∼0.1 중량%; 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 0.03∼30 중량%; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소 0.1∼0.4 중량%; 및 pH 조절제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 3차원 프린팅용 조성물은 약 15℃에서 측정될 때 전단율(shear rate) 1 s-1 에서의 점도가 1∼30 Pa·S의 범위일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, (a) 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 용액에, 탈세포화된 세포외 기질을 첨가하는 단계, (b) 단계(a)에서 얻어진 혼합물에 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소를 가한 후, 교반하여 용액을 얻는 단계, 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 용액에 리보플라빈 및 pH 조절제를 첨가하는 단계를 포함하는 3차원 프린팅용 조성물의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또다른 태양에 따라, (i) 상기 3차원 프린팅용 조성물을 사용한 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통한 적층 공정(layer-by-layer process)을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하는 단계; 및 (ii) 단계(i)에서 얻어진 3차원 구조체 형상을 15 ℃ 이상의 온도에서 열적 겔화(thermal gelation)하여 3차원 구조체를 얻는 단계를 포함하는 3차원 구조체의 제조방법이 제공된다.
일 구현예에서, 각각의 적층 공정에서의 가교화는 1∼10 분 동안 수행될 수 있다.
리보플라빈을 포함하는 3차원 프린팅용 조성물을 사용한 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통한 적층 공정(layer-by-layer process)을 수행하여 3차원 구조체 형상을 제작한 다음, 얻어진 3차원 구조체 형상을 열적 겔화함으로써 높은 기계적 강도를 갖는 3차원 구조체를 제조할 수 있다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 즉, 본 발명은 리보플라빈을 사용한 가교-열적 겔화 방법(crosslinking-thermal gelation)을 제공함으로써 높은 기계적 강도를 균일하게 갖는 3차원 구조체의 제조를 가능하게 한다. 또한, 본 발명은 높은 안전성을 갖는 리보플라빈을 가교제로 사용함으로써, 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 독성 가교제의 사용을 회피할 수 있다. 따라서, 본 발명은 조직 공학 스캐폴드(tissue-engineering scaffolds), 세포-기반 센서(cell-based sensors), 약물/독성 스크리닝, 및 조직 또는 종양 모델을 3차원 프린팅으로 제작하는데 유용하게 적용될 수 있다.
도 1은 심장 조직으로부터 얻어진 탈세포화된 세포외 기질(hdECM)(b)의 광학 현미경 사진 및 조직염색 사진(a)이다.
도 2는 PCL 프레임웍을 사용하여, 본 발명에 따라 제조된 3차원 구조체의 형상을 나타내는 사진이다.
도 3은 PCL 프레임웍을 사용하지 않고, 본 발명에 따라 제조된 3차원 구조체의 형상을 나타내는 사진이다.
본 발명은 탈세포화된 세포외 기질; 및 가교제로서 리보플라빈을 포함하는, 3차원 프린팅용 조성물을 제공한다.
상기 탈세포화된 세포외 기질(decellularized extracellular matrix)은 인간, 돼지, 소, 토끼, 개, 염소, 양, 닭, 말 등의 포유동물로부터 배출된 조직을 탈세포화함으로써 얻어질 수 있다. 상기 조직은 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 심장 조직, 연골 조직, 골 조직, 지방 조직, 근육 조직, 피부 조직, 점막 상피 조직(mucosal epithelial tissue), 양막 조직, 또는 각막 조직 등을 포함하며, 바람직하게는 심장 조직, 연골 조직, 골 조직을 포함하며, 더욱 바람직하게는 돼지로부터 얻어진 심장 조직, 연골 조직, 골 조직을 포함을 포함한다. 상기 탈세포화는 공지의 방법, 예를 들어 Ott, H. C. et al. Nat. Med. 14, 213-221 (2008), Yang, Z. et al. Tissue Eng. Part C Methods 16, 865-876 (2010) 등에 개시된 방법을 사용하여 혹은 약간 변형하여 수행될 있다. 바람직하게는, 본 발명자들이 보고한 탈세포화 방법, 즉 Falguni Pati, et al., Nat Commun . 5, 3935 (2014)에 개시된 탈세포화 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 얻어진 탈세포화된 세포외 기질은 통상 동결건조된 분말형태로 보관된다. 상기 탈세포화된 세포외 기질의 사용량은 특별히 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 조성물 총 중량에 대하여 1∼4 중량%, 바람직하게는 2∼3 중량%의 함량으로 사용될 수 있다.
본 발명에 의해, 높은 안전성을 갖는 리보플라빈을 포함하는 3차원 프린팅용 조성물을 사용한 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통한 적층 공정(layer-by-layer process)을 수행하여 3차원 구조체 형상을 제작한 다음, 얻어진 3차원 구조체 형상을 열적 겔화함으로써 높은 기계적 강도를 균일하게 갖는 3차원 구조체를 제조할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 즉, 본 발명은 리보플라빈 사용을 포함하는 가교-열적 겔화 방법(crosslinking-thermal gelation)을 제공한다. 상기 리보플라빈은 UVA 하에서 가교되는데 충분한 양으로 사용될 수 있으며, 예를 들어 조성물 총 중량에 대하여 0.001∼0.1 중량%, 바람직하게는 0.01∼0.1 중량%의 함량으로 사용될 수 있다.
본 발명의 3차원 프린팅용 조성물은, 효율적인 3차원 프린팅을 위하여, pH 6.5 내지 7.5의 범위를 갖는 점탄성의 균일한 용액의 형태를 가지는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 3차원 프린팅용 조성물은 수성 매질 중에 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제(matrix metalloproteinase)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소; 및 pH를 6.5 내지 7.5의 범위로 조절하기 위한 pH 조절제(예를 들어, 수산화나트륨)을 추가로 포함할 수 있다. 상기 산은 탈세포화된 세포외 기질을 용해시키는 기능을 수행하며, 바람직하게는 아세트산, 염산 등이 사용될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.01∼10 M의 아세트산 수용액(예를 들어, 약 0.5M의 아세트산 수용액) 또는 0.01∼10 M의 염산 수용액의 형태로 사용될 수 있다. 상기 단백질 분해효소는 탈세포화된 세포외 기질의 텔로펩타이드(telopeptide)의 소화(digestion) 기능을 수행하며, 바람직하게는 펩신, 매트릭스 메탈로프로티나아제 등이 사용될 수 있다. 상기 단백질 분해효소의 사용량은 탈세포화된 세포외 기질의 함량에 따라 상이하나, 예를 들어 탈세포화된 세포외 기질 100 mg에 대하여 5∼30 mg, 바람직하게는 10∼25 mg의 비율로 사용될 수 있다. pH 조절제는 탈세포화된 세포외 기질의 용해를 위해 사용된 산을 중화시키는 기능을 하며, 예를 들어 수산화나트륨을 사용하여 pH 6.5 내지 7.5, 바람직하게는 약 pH 7로 조절하는데 충분한 양으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 3차원 프린팅용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여, 탈세포화된 세포외 기질 1∼4 중량; 리보플라빈 0.001∼0.1 중량%; 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 0.03∼30 중량%; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소 0.1∼0.4 중량%; 및 pH 조절제를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 3차원 프린팅용 조성물은 전단율이 증가할수록 점도가 낮아지는 점탄성 물질인 것이 바람직하며, 예를 들어 약 15℃에서 측정될 때 전단율(shear rate) 1 s-1 에서의 점도가 1∼30 Pa·S의 범위인 것이 바람직하다. 상기 점도는 수성 매질(예를 들어, 물, 증류수, PBS, 생리식염수 등)의 양을 적절히 조절함으로써 조절될 수 있다.
본 발명은 또한 상기 3차원 프린팅용 조성물의 제조방법을 제공한다. 즉, 본 발명은 (a) 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 용액에, 탈세포화된 세포외 기질을 첨가하는 단계, (b) 단계(a)에서 얻어진 혼합물에 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소를 가한 후, 교반하여 용액을 얻는 단계, 및 (c) 단계(b)에서 얻어진 용액에 리보플라빈 및 pH 조절제를 첨가하는 단계를 포함하는 3차원 프린팅용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제조방법에서, 산, 탈세포화된 세포외 기질, 리보플라빈, 단백질 분해효소, 및 pH 조절제는 상기에서 설명한 바와 같다.
단계(a)의 산 용액은 예를 들어, 0.01∼0.5 M의 아세트산 수용액, 바람직하게는 약 0.5 M의 아세트산 수용액일 수 있다. 단계(b)의 상기 교반은 탈세포화된 세포외 기질의 완전한 용해를 달성할 때까지 수행될 수 있으며, 통상 24∼48 시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 단계(c)의 공정은 겔화를 방지하기 위하여 약 15℃ 이하, 바람직하게는 약 4∼10℃의 저온에서 수행되는 것이 바람직하다. 얻어지는 3차원 프린팅용 조성물은 pH-조절된 프리-겔(pH-adjusted pre-gel) 형태로서, 약 4℃에서 냉장 보관하는 것이 바람직하다.
본 발명은 또한 (i) 상기 3차원 프린팅용 조성물을 사용한 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통한 적층 공정(layer-by-layer process)을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하는 단계; 및 (ii) 단계(i)에서 얻어진 3차원 구조체 형상을 15 ℃ 이상의 온도에서 열적 겔화(thermal gelation)하여 3차원 구조체를 얻는 단계를 포함하는 3차원 구조체의 제조방법을 제공한다.
단계(i)의 상기 프린팅은 공지의 3차원 프린팅 방법(예를 들어, '다축 조직 장기 프린팅 시스템'을 사용한 프린팅 방법)을 사용하여, Falguni Pati, et al., Nat Commun . 5, 3935 (2014) 등에 개시된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 다축 조직 장기 프린팅 시스템의 2개의 시린지를 이용하여 상기 프린팅을 수행할 수 있다. 즉, 폴리카프로락톤 프레임웍(polycaprolactone (PCL) framework)을 시린지에 로딩하고, 약 80℃로 가열하여 중합체를 용융시킨다. 상기한 프리-겔 형태의 3차원 프린팅용 조성물을 다른 시린지에 로딩하고, 온도를 약 15℃ 이하, 바람직하게는 약 4∼10℃로 유지시킨다. PCL 프레임웍의 제작(fabrication)을 위해 400-650 kPa 범위로 공기압(pneumatic pressure)을 가한다. 상기 프리-겔 형태의 조성물을 플런저-계 저용량 분사 시스템(plunger-based low-dosage dispensing system)을 사용하여 분사한다. 또한, 상기 프린팅은 폴리카프로락톤 프레임웍의 사용 없이 상기 프리-겔 형태의 조성물만을 플런저-계 저용량 분사 시스템(plunger-based low-dosage dispensing system)을 사용하여 분사함으로써 수행될 수도 있다.
상기 UVA 하에서 가교화는 315∼400 nm 파장, 바람직하게는 약 360 nm 파장의 UVA를 1∼10 분 동안, 바람직하게는 약 3 분 동안 조사함으로써 수행될 수 있다. 상기 프린팅 및 UVA 하에서 가교화를 반복적으로 수행함으로써, 즉 적층 공정(layer-by-layer process))을 수행함으로써, 3차원 구조체 형상이 형성된다.
단계(ii)는 단계(i)에서 얻어진 3차원 구조체 형상을 15 ℃ 이상에서 열적 겔화(thermal gelation)함으로써 수행된다. 상기 열적 겔화는 바람직하게는 20∼40 ℃, 더욱 바람직하게는 약 37℃로 유지되는 인큐베이터(humid incubator) 중에서 5∼60 분 동안, 바람직하게는 20∼30 분 동안 유지시킴으로써 수행될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
하기 실시예에서 사용된 탈세포화된 세포외 기질은 돼지의 심장 조직을 사용하여 Falguni Pati, et al., Nat Commun . 5, 3935 (2014)에 개시된 방법에 따라 얻어진 것을 사용하였으며, 이하 'hdECM' 이라 칭한다. 상기 hdECM은 최종적으로 동결건조하여 사용전까지 냉동보관하였다. 상기 hdECM의 광학 현미경 사진 및 조직염색 사진은 도 1과 같다.
실시예 1: 3차원 프린팅용 조성물의 제조
액제 질소를 동결건조된 hdECM에 붓고 모르타르 및 막자로 분쇄하였다. 0.5M 아세트산 수용액(10 ml)에 hdECM 분말(330 mg)을 첨가한 후, 펩신(33 mg)(P7125, Sigma-Aldrich)을 가한 다음 상온에서 48시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액의 온도를 10℃ 이하로 유지하면서, 리보플라빈(2 mg)을 가하고 10℃ 이하로 냉각시킨 10M NaOH 용액을 적가하여 pH를 약 pH 7로 조절하였다. 얻어진 프리-겔(pre-gel) 형태의 용액은 약 4℃에서 냉장 보관하였다.
실시예 2: 3차원 구조체의 제조
실시예 1에서 얻어진 3차원 프린팅용 조성물을 사용하여 Falguni Pati, et al., Nat Commun . 5, 3935 (2014)에 개시된 방법에 따라 3차원 구조체를 제작하였다. 구체적으로, PCL 프레임웍(polycaprolactone (PCL) framework)을 다축 조직 장기 프린팅 시스템(Jin-Hyung Shim et al., J. Micromech . Microeng . 22 085014 (2012))의 시린지(제1 시린지)에 로딩하고, 약 80℃로 가열하여 중합체를 용융시켰다. 실시예 1에서 얻어진 프리-겔 형태의 3차원 프린팅용 조성물을 다른 시린지(제2 시린지)에 로딩하고, 온도를 약 10℃ 이하로 유지시켰다. 제1 시린지에 약 600 kPa의 공기압을 가하여 약 100 μm 이하의 선폭을 가지고, 약 300 μm 의 공극을 지닌 120 μm 두께의 얇은 PCL 프레임웍을 제작하고, PCL 프레임웍 위에 제2 시린지의 내용물을 분사한 후, 약 360 nm의 UVA를 3분 동안 조사하여 가교화하였다.
이후, 제2 시린지의 내용물 분사 및 상기 가교화를 통한 적층 공정(layer-by-layer process)을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하였다. 얻어진 3차원 구조체 형상을 약 37℃의 인큐베이터(humid incubator)에 넣고 30분 동안 유지시켜 열적 겔화시켜 3차원 구조체를 제조하였다. 얻어진 3차원 구조체는 약 300∼400 μm 두께를 가지며, 그 형상의 일 예는 도 2와 같다.
실시예 3: 3차원 구조체의 제조
PCL 프레임웍을 사용하지 않은 것을 제외하고는, 실시예 2와 동일한 방법으로 3차원 구조체를 제조하였다. 즉, 다축 조직 장기 프린팅 시스템(Jin-Hyung Shim et al., J. Micromech . Microeng . 22 085014 (2012))의 시린지에 실시예 1에서 얻어진 프리-겔 형태의 3차원 프린팅용 조성물을 로딩하고, 온도를 약 10℃ 이하로 유지시켰다. 상기 시린지에 약 600 kPa의 공기압을 가하여 내용물을 분사한 후, 약 360 nm의 UVA를 3분 동안 조사하여 가교화하였다. 이후, 시린지의 내용물 분사 및 상기 가교화를 통한 적층 공정(layer-by-layer process)을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하였다. 얻어진 3차원 구조체 형상을 약 37℃의 인큐베이터(humid incubator)에 넣고 30분 동안 유지시켜 열적 겔화시켜 3차원 구조체를 제조하였다. 얻어진 3차원 구조체는 약 400 μm 두께를 가지며, 그 형상의 일 예는 도 3과 같다.
비교예
리보플라빈을 사용하지 않은 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 프리-겔 형태의 용액을 제조하였다.
시험예
실시예 1에서 얻어진 프리-겔 형태의 용액을 약 360 nm의 UVA를 3분 동안 조사하여 가교화한 후, 약 37℃의 인큐베이터(humid incubator)에 넣고 30분 동안 유지시켜 열적 겔화시켜 하이드로겔을 형성시켰다(하이드록겔 A). 또한, 비교예에서 얻어진 프리-겔 형태의 용액을 약 37℃의 인큐베이터(humid incubator)에 넣고 30분 동안 유지시켜 열적 겔화시켜 하이드로겔을 형성시켰다(하이드록겔 B). 얻어진 각각의 하이드로겔에 대하여, 빈도(frequency) 1 rad/s에서의 복소 모듈러스(complex modulus)를 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 1과 같다.
모듈러스 (n=3, 1 rad/s)
하이드로겔 A 10.58 ± 3.4 kPa
하이드로겔 B 0.33 ± 0.13 kPa
상기 표 1의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 얻어진 하이드로겔은 1 rad/s에서의 모듈러스가 10.58 kPa로서, 가교화에 의해 약 30배 이상의 강도 향상을 나타냄을 알 수 있다.

Claims (13)

  1. 탈세포화된 세포외 기질; 및 가교제로서 리보플라빈을 포함하는, 3차원 프린팅용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 탈세포화된 세포외 기질이 체외로 배출된 심장 조직, 연골 조직, 골 조직, 지방 조직, 근육 조직, 피부 조직, 점막 상피 조직, 양막 조직, 또는 각막 조직을 탈세포화함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 탈세포화된 세포외 기질이, 조성물 총 중량에 대하여, 1∼4 중량%의 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 리보플라빈이, 조성물 총 중량에 대하여, 0.001∼0.1 중량%의 함량으로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소; 및 pH 조절제를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여, 탈세포화된 세포외 기질 1∼4 중량; 리보플라빈 0.001∼0.1 중량%; 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 0.03∼30 중량%; 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소 0.1∼0.4 중량%; 및 pH 조절제를 포함하는 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 15℃에서 측정될 때 전단율(shear rate) 1 s-1 에서의 점도가 1∼30 Pa·S의 범위인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. (a) 아세트산 및 염산으로 이루진 군으로부터 1종 이상 선택된 산 용액에, 탈세포화된 세포외 기질을 첨가하는 단계,
    (b) 단계(a)에서 얻어진 혼합물에 펩신 및 매트릭스 메탈로프로티나아제로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 단백질 분해효소를 가한 후, 교반하여 용액을 얻는 단계, 및
    (c) 단계(b)에서 얻어진 용액에 리보플라빈 및 pH 조절제를 첨가하는 단계
    를 포함하는 3차원 프린팅용 조성물의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 탈세포화된 세포외 기질이 체외로 배출된 심장 조직, 연골 조직, 골 조직, 지방 조직, 근육 조직, 피부 조직, 점막 상피 조직, 양막 조직, 또는 각막 조직을 탈세포화함으로써 얻어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 탈세포화된 세포외 기질이, 조성물 총 중량에 대하여, 1∼4 중량%의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 리보플라빈이, 조성물 총 중량에 대하여, 0.001∼0.1 중량%의 함량으로 사용되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  12. (i) 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 3차원 프린팅용 조성물을 사용한 프린팅 및 UVA 하에서의 가교화를 통한 적층 공정을 수행하여 3차원 구조체 형상을 형성하는 단계; 및
    (ii) 단계(i)에서 얻어진 3차원 구조체 형상을 15 ℃ 이상의 온도에서 열적 겔화하여 3차원 구조체를 얻는 단계
    를 포함하는 3차원 구조체의 제조방법.
  13. 제12항에 있어서, 각각의 적층 공정에서의 가교화가 1∼10 분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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