WO2016152519A1 - びまん性神経線維腫用の外用薬 - Google Patents

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WO2016152519A1
WO2016152519A1 PCT/JP2016/057330 JP2016057330W WO2016152519A1 WO 2016152519 A1 WO2016152519 A1 WO 2016152519A1 JP 2016057330 W JP2016057330 W JP 2016057330W WO 2016152519 A1 WO2016152519 A1 WO 2016152519A1
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sirolimus
diffuse
concentration
active ingredient
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PCT/JP2016/057330
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眞理 金田
一朗 片山
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国立大学法人大阪大学
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    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/436—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a six-membered ring having oxygen as a ring hetero atom, e.g. rapamycin
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
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    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a topical drug for diffuse neurofibroma.
  • Neurofibromatosis is a disease that causes various abnormalities in many organs (for example, skin and nerves) of a living body.
  • neurofibromatosis type 1 neurofibromatosis type 1
  • NF2 neurofibromatosis type 2
  • Neurofibromatosis type 1 and neurofibromatosis type 2 are different diseases with different causes.
  • neurofibromatosis type 1 is an autosomal dominant that develops due to an abnormality in the NF1 gene on chromosome 17. It has been shown to be a hereditary disease.
  • Neurofibromatosis type 1 and neurofibromatosis type 2 are also greatly different in symptoms appearing in the living body.
  • symptoms of neurofibromatosis type 1 can include neurofibromas, cafe au lait spots, bone abnormalities, optic gliomas, etc.
  • neurofibromatosis type 1 shows severe symptoms on the skin .
  • the neurofibromatosis type 2 symptom can include an acoustic nerve tumor, etc.
  • the neurofibromatosis type 2 manifests as a central nerve tumor as compared with neurofibromatosis type 1.
  • neurofibromatosis type 1 is often accompanied by various complications such as pheochromocytoma, GIST (Gastrointestinal Stromal Tumor) or vascular malformation, which makes treatment difficult.
  • Patent Document 1 discloses a gel composition and an ointment composition containing at least one of sirolimus and a derivative of sirolimus.
  • Non-Patent Document 1 discloses that sirolimus is used internally for the treatment of neurofibromatosis type 1 neurofibroma, but the therapeutic effect is not obtained.
  • neurofibromatosis is one of the symptoms of neurofibromatosis, and each type is a distinct medically distinct symptom with its own unique properties.
  • cutaneous neurofibroma diffuse plexiform neurofibroma, nodular plexiform neurofibroma, malignant peripheral nerve sheathheattumor; NPNST be able to.
  • Diffuse neurofibromas are fibromas found in about 10% of patients who develop neurofibromas. When diffuse neurofibromas are enormous, the surface of the neurofibromas is abundant and relaxed, and some of them hang down like a tongue. When diffuse neurofibromas extend throughout the lower limbs, infiltration of the neurofibromas from the subcutaneous to subcutaneous adipose tissue and muscles, bone enlargement and extension, and macrophytosis Sometimes. Diffuse neurofibromas may be unilateral facial enlargement, eyelid drooping, macrolimb disease, etc. depending on the site, obstructing visual field due to upper eyelid mass, deforming nose, etc. In many cases, there is a problem (see FIGS. 1A to 1C).
  • diffuse neurofibromas are rich in blood vessels, tissues are fragile, and may form a huge hematoma by slight bruising. It may form huge hematomas rapidly in a short time, but may gradually increase over several days. Once bleeding, bleeding is difficult due to bleeding from a large number of small blood vessels, and sometimes bleeding occurs in large quantities, causing shock or death.
  • Cutaneous neurofibromas do not have particularly frequent sites, and occur innumerably mainly in the trunk in cases that occur frequently throughout the body. Tumors are soft tumors with a regular or light red surface, and vary in size and shape. Some cutaneous neurofibromas are hemispherically raised. The number of cutaneous neurofibromas varies markedly from case to case, from dozens of cases to countless cases.
  • Nerve neurofibromas are neurofibromas that arise from the perineurium of peripheral nerves and appear anywhere in the body. For example, it appears in various places such as around the brain, around the spine, in the pelvic cavity, or subcutaneously. When the neurofibromatosis of the nerve appears in a shallow part of the skin, it appears as a tumor that is relatively well-defined under the skin and touches the spindle in a rigid manner along the nerve running. These neurofibromas of the nerves may be beaded together or form a large mass as a lump.
  • Diffuse neurofibromas cause a large amount of bleeding due to minor trauma, and are the home of malignant tumors (for example, glioblastoma and MPNST (Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor)). Therefore, there is an urgent need for the development of effective therapeutic agents and treatment methods for diffuse neurofibromas.
  • malignant tumors for example, glioblastoma and MPNST (Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor)
  • neurofibroma Since neurofibroma has various properties for each type, it is necessary to select a therapeutic agent and treatment method suitable for each neurofibroma when performing treatment.
  • the neurofibroma When the neurofibroma is small or when the boundary between the neurofibroma and the normal tissue is relatively clear, the neurofibroma can be removed by surgery.
  • diffuse neurofibroma is rich in blood vessels and highly invasive, so the boundary between the tumor and normal tissue is unclear, and the tumor and blood vessels or nerves are intricately intertwined. Yes. Therefore, diffuse neurofibromas have the problem that they are difficult to treat with surgery.
  • the diffuse neurofibromas become large, the tumor is heavy and even the body is difficult to move. If you have a huge tumor in your lower limbs, you may be forced to cut your legs. At present, no effective therapeutic agent or treatment method has been established for giant diffuse neurofibromas.
  • diffuse neurofibromas have a problem that radiation therapy does not function effectively.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned conventional problems, and an object thereof is to provide an external medicine capable of treating diffuse neurofibroma.
  • diffuse neurofibroma can be treated by applying an external medicine containing sirolimus or a sirolimus derivative to the diffuse neurofibroma. It came to complete. Further, the following (a) to (d) have been found for sirolimus and sirolimus derivatives, and the present invention has been completed.
  • the topical drug for diffuse neurofibroma of the present invention is characterized by containing at least one selected from the group consisting of sirolimus and sirolimus derivatives as an active ingredient in order to solve the above-mentioned problems. .
  • the external preparation for diffuse neurofibroma of the present invention is preferably a gel.
  • the external preparation for diffuse neurofibroma of the present invention preferably contains ethanol.
  • the external preparation for diffuse neurofibroma of the present invention preferably contains 20 to 60% by weight of the ethanol.
  • the external preparation for diffuse neurofibroma of the present invention preferably contains 0.2 to 0.8% by weight of the above active ingredient.
  • the external preparation of the present invention can treat diffuse neurofibromas for which effective therapeutic agents and treatment methods have not been established. In particular, it enlarges the enlarged diffuse neurofibromas that are impossible to operate and significantly improves the patient's QOL. In addition, hematoma formation and massive bleeding due to bruises can be prevented. By starting treatment at an early stage, tumor enlargement can be suppressed.
  • the external preparation of the present invention has a high absorption rate and can efficiently bring the active ingredient to the affected skin tissue or muscle tissue.
  • the external preparation of the present invention can maintain a high concentration of the active ingredient locally such as skin tissue and muscle tissue, but the amount of absorbed active ingredient into the blood is small. Therefore, it is a safe preparation with low risk of systemic side effects.
  • the external preparation of the present invention can be applied externally only to a limited lesion site, unlike systemic administration.
  • FIG. 1 A) to (c) are photographs showing symptoms of diffuse neurofibromatosis, and (d) is a histological study of diffuse neurofibroma before and after administration of an external medicine according to an example of the present invention. It is a photograph showing a significant change. It is a graph which shows the measurement result of the density
  • FIG. 3 is a graph comparing the concentration of sirolimus in tissue and blood when continuously administering an external medicine according to an example of the present invention and the concentration of sirolimus in tissue and blood when continuously administering an internal medicine. is there. It is a graph which shows the analysis result of the cell proliferation by the MTT assay method in the Example of this invention, and the analysis result of the cell death by a Trypan blue cell count method.
  • the external preparation of the present embodiment is an external preparation for treating and / or treating diffuse neurofibroma, and contains at least one active ingredient selected from the group consisting of sirolimus and sirolimus derivatives. .
  • Sirolimus aka rapamycin
  • sirolimus derivatives have already been used for the treatment of other diseases, and clinical safety has been confirmed. Therefore, if these are used, it is possible to realize a safer topical medicine for diffuse neurofibroma.
  • the sirolimus derivative is not particularly limited, and examples thereof include everolimus, temsirolimus, lidaforimus, and zotarolimus. These have the same basic skeleton as the basic skeleton of sirolimus and are known to have the same physiological activity as sirolimus. Therefore, these sirolimus derivatives can also be used as an active ingredient of the external preparation of the present embodiment, like sirolimus. From the viewpoint of easily preparing an external medicine, it is preferable to use sirolimus and / or everolimus in the above. In addition, rapamycin, which has been confirmed to be transdermally absorbed, is preferably used as compared with everolimus, which has a large molecular weight and is considered to be water-soluble and difficult to transdermally absorb.
  • the amount of the active ingredient contained in the external preparation of the present embodiment is not particularly limited, but if it is the external preparation of the present embodiment, the active ingredient can be efficiently absorbed into the skin tissue. In addition, the active ingredient can be made to reach the thickened skin tissue of diffuse neurofibromas.
  • the amount of the active ingredient contained in the external medicine of the present embodiment is 0.05 to 1.0% by weight, 0.1 to 0.9% by weight, 0.00% based on the total weight of the external medicine. 2 to 0.8 wt% (or 0.2 wt% or more and less than 0.8 wt%), 0.3 to 0.7 wt%, 0.35 to 0.6 wt%, 0.4 to 0. It can be 6% by weight, or 0.4-0.5% by weight.
  • the amount of the active ingredient contained in the external preparation of the present embodiment is preferably 0.2 to 0.8% by weight (or 0.2% by weight or more and 0.8% by weight) based on the total weight of the external preparation. %), More preferably 0.3 to 0.7% by weight, more preferably 0.4 to 0.6% by weight.
  • the external preparation of the present embodiment is used for treatment (in other words, prevention of symptom progression) and / or treatment of diffuse neurofibroma.
  • the diffuse neurofibroma in which the external medicine of the present embodiment is used can be, for example, a diffuse neurofibromatosis that develops with neurofibromatosis type 1.
  • the external medicine of the present embodiment can be used not only for humans but also for non-human animals.
  • non-human animals include mammals other than humans.
  • mammals other than humans include, for example, cloven hoofs such as cattle, wild boars, pigs, sheep and goats, terrestrial hoofs such as horses, rodents such as mice, rats, hamsters and squirrels, rabbit eyes such as rabbits, and dogs And meat such as cats and ferrets.
  • these non-human animals are not limited to domestic animals or companion animals (companion animals), and may be wild animals.
  • the application amount of the external medicine of the present embodiment per unit surface area of the living body is not particularly limited, but is 0.001 g / cm 2 to 0.01 g / cm 2 , 0.002 g / cm 2 to 0.009 g / cm 2. , 0.003g / cm 2 ⁇ 0.008g / cm 2, 0.004g / cm 2 ⁇ 0.007g / cm 2, may be 0.005g / cm 2 ⁇ 0.006g / cm 2.
  • the external medicine of this embodiment may be applied every day or once every 2 to 3 days in the application amount. It is preferable to apply daily. When applied daily, it is preferably applied 1 to 3 times a day, more preferably 2 to 3 times a day, and most preferably 2 times a day.
  • the topical drug of the present embodiment can effectively treat and / or treat diffuse neurofibromas and prevent side effects from occurring.
  • the external preparation of the present embodiment may be in a dosage form such as a gel, ointment, poultice, liniment, lotion, or cream.
  • a gel can be prepared by gelling a solution containing an active ingredient.
  • an ointment can be prepared by mixing an ointment base and an active ingredient.
  • a poultice, a liniment, a lotion and a cream can be prepared according to well-known methods.
  • a gel agent is a more preferable dosage form because an active ingredient is easy to be absorbed by skin tissue compared with an ointment.
  • the external preparation of the present embodiment may be a gel agent obtained by gelling a solution containing an active ingredient.
  • a solution containing an active ingredient may be gelled using a gelling agent.
  • the gelling agent include carboxyvinyl polymer, carboxymethyl cellulose, aluminum hydroxide, bentonite and the like.
  • the specific structure of the carboxyvinyl polymer is not particularly limited, and Carbopol (registered trademark), Hibis Wako (registered trademark), and Akpec (registered trademark) can be used.
  • Carbopol (registered trademark) 934P NF or Carbopol (registered trademark) 980 is preferable from the viewpoint of goodness.
  • a pH adjuster eg, trishydroxymethylaminomethane, triethanolamine
  • the external preparation of this embodiment preferably contains alcohol.
  • Alcohol allows the active ingredient contained in the external preparation to be efficiently absorbed into the skin tissue and reach the affected area.
  • examples of the alcohol include ethanol and isopropanol, but ethanol is more preferable from the viewpoint of effectively absorbing the active ingredient into the skin tissue.
  • the amount of alcohol contained in the external preparation of the present embodiment is not particularly limited, but is 10 to 70% by weight, 20 to 70% by weight, 30 to 70% by weight, 40 to 70% based on the total weight of the external preparation.
  • the amount of alcohol is sufficient to dissolve sirolimus, and it is preferably 20% by weight or more.
  • the amount of alcohol is preferably 30% by weight or more, more preferably 40% by weight or more of the gel weight. If it exceeds 60% by weight, alcohol tends to evaporate from the preparation, and it becomes difficult to store (store) a preparation having a stable active ingredient concentration. Therefore, it is more preferably around 50% by weight (45 to 55% by weight).
  • the amount is 50% by weight or less, the greater the amount of alcohol, the more the active ingredient is dissolved, and the more efficiently it can be absorbed into the skin tissue.
  • the amount of the gelling agent contained in the gel is not particularly limited as long as it is sufficient for the solution containing the active ingredient to gel.
  • the amount of the gelling agent contained in the gel is, for example, 1.5% by weight or more based on the total weight of the gel (more specifically, 1.5 to 20% by weight, 1.5 to 15% by weight). %, 1.5-10 wt%, 1.5-5 wt%, or 1.5-2.5 wt%).
  • the amount of the pH adjusting agent (neutralizing agent) contained in the gel is not particularly limited, and can be appropriately set according to the amount of the solvent and the gelling agent.
  • the amount of the pH adjusting agent contained in the gel is, for example, 0.5 to 5.0% by weight, 0.5 to 2.5% by weight, or 0.5 to 1 based on the total weight of the gel. It may be 0.0% by weight.
  • the amount of the gelling agent is based on the total weight of the gelling agent.
  • the amount of the pH adjusting agent may be, for example, 0.4% by weight, 0.6% by weight, or 0.8% by weight based on the total weight of the gel agent.
  • the present invention is not limited to this ratio.
  • the amount of the active ingredient contained in the gel is not particularly limited and may be the amount already described as “the amount of the active ingredient contained in the external medicine”.
  • the gel agent may contain components other than the above-described active ingredient, solvent (alcohol), gelling agent, and pH adjuster (neutralizing agent).
  • solvent alcohol
  • pH adjuster neutralizing agent
  • examples of the other components include water-soluble polymers and desired active ingredients other than the above-described active ingredients.
  • water-soluble polymer examples include polyethylene glycol, starch, methyl cellulose, hydroxypropyl cellulose (HPC), polyvinyl alcohol, polyvinyl methyl ether, and polyvinyl pyrrolidone. If hydroxypropyl cellulose is contained in the gel, the adhesiveness of the gel can be improved. That is, the gel can be made difficult to peel off from the skin.
  • HPC hydroxypropyl cellulose
  • the amount of the other components contained in the gel is not particularly limited, but for example, 50% or less, 40% or less, 30% or less, 20% or less, 10% or less, based on the total weight of the gel. It can be up to 5% by weight, or up to 1% by weight.
  • the external preparation of the present embodiment may be an ointment containing a base and an active ingredient.
  • the amount of the active ingredient contained in the ointment is not particularly limited, and may be the amount already described as “the amount of the active ingredient contained in the external medicine”. Since the amount has already been described, a specific description is omitted here.
  • Examples of the base include waxes (for example, natural wax such as honey beeswax, lanolin, carnauba wax, whale wax, mineral wax such as montan wax, synthetic wax, etc.), paraffins (eg liquid paraffin, solid paraffin, etc.), Vaseline (for example, white petrolatum, yellow petrolatum etc.) etc. can be mentioned.
  • waxes for example, natural wax such as honey beeswax, lanolin, carnauba wax, whale wax, mineral wax such as montan wax, synthetic wax, etc.
  • paraffins eg liquid paraffin, solid paraffin, etc.
  • Vaseline for example, white petrolatum, yellow petrolatum etc.
  • the amount of the base contained in the ointment is not particularly limited, for example, 10 wt% or more, 20 wt% or more, 30 wt% or more, 40 wt% or more, 50 wt% or more based on the total weight of the ointment , 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more.
  • the ointment can contain propylene carbonate, solid paraffin and white petrolatum.
  • the ointment can also contain liquid paraffin in addition to propylene carbonate, solid paraffin and white petrolatum.
  • the ointment can further contain white beeswax in addition to propylene carbonate, solid paraffin, white petrolatum and liquid paraffin.
  • the ointment can be produced according to a known method. Below, an example of a manufacturing method is demonstrated.
  • the base can be prepared using a homomixer (for example, manufactured by Primix Co., Ltd.) or a universal mixer (for example, manufactured by Dalton Co., Ltd.).
  • a homomixer for example, manufactured by Primix Co., Ltd.
  • a universal mixer for example, manufactured by Dalton Co., Ltd.
  • various components that are solid at room temperature for example, waxes, paraffins, petrolatum, etc.
  • a melting point or higher for example, 70 ° C.
  • a solution in which the active ingredient is dissolved is added to the dissolved product.
  • Stir can be cooled to room temperature vicinity (for example, 40 degreeC), stirring, and an ointment can be manufactured.
  • all the bases are dissolved at 70 ° C. to 80 ° C., and using a rotating and rotating mixer (manufactured by Sinky Co., Ltd.), in stirring mode, at 800 rpm for 30 minutes, then at 1000 rpm for 5 minutes, and then at 2000 rpm 1 minute (15 ° C.), add a solution in which the active ingredient is dissolved in the base, and further stir at 1000 rpm for 1 minute, then 2000 rpm for 1 minute (no cooling) to contain the active ingredient A good quality ointment in which very fine particles are more dispersed can be prepared.
  • a rotating and rotating mixer manufactured by Sinky Co., Ltd.
  • a solution in which the active ingredient and other components are dissolved in a desired solvent is prepared, and the base is added to the solution.
  • the ointment may be prepared according to
  • white beeswax, liquid paraffin, solid paraffin and white petrolatum are all weighed in the same container, dissolved at 70 ° C. to 80 ° C., and rotated at 800 rpm in a stirring mode using a rotating / revolving mixer (manufactured by Sinky Corporation). For 30 minutes, then 1000 rpm for 5 minutes, then 2000 rpm for 1 minute (15 ° C.), and a solution of sirolimus dissolved in propylene carbonate on a 60-70 ° C. water bath is added to the solution. Further, the mixture was stirred at 1000 rpm for 1 minute and then at 2000 rpm for 1 minute (without cooling) to prepare an ointment (external preparation 10).
  • Topical drug 4 was applied to diffuse neurofibromas of patients (3 patients) suffering from neurofibromatosis type 1 for 12 weeks. Specifically, the external medicine 4 was applied to the diffuse neurofibroma once a day. In addition, 1 g of topical medicine 4 was applied to 300 cm 2 of diffuse neurofibromas in one application. 84 days after the start of application, the tissue concentration of sirolimus and the blood concentration were measured, the tissue state was confirmed by tissue staining, and the presence or absence of subjective symptoms of the patient was confirmed.
  • the test results are shown in Table 4 and FIG.
  • “ ⁇ ” in the columns of “blood sirolimus concentration” and “tissue sirolimus concentration” indicates that the concentration is below the measurement limit (1 ng / mL or 1 ng / mg).
  • “-” in the column “Subject's subjective symptom” indicates that there was no change in the subjective symptom before and after treatment.
  • the “blood sirolimus concentration” was measured in a hospital examination room using an ARCHITECT (registered trademark) Sirolimus, an ARCHITECT (registered trademark) Sirolimus calibrator, and an ARCHITECT (registered trademark) Sirolimus Whole Blood Precipitation Reagent.
  • the “sirolimus concentration” was measured by the LC-ESI / MS method.
  • the topical drug of this example can maintain a high concentration of sirolimus in the tissue (to a therapeutically effective concentration), while being able to keep the concentration of sirolimus in the blood low. It became clear (in the case of an orally administered drug, the concentration of sirolimus in the blood is about 5 to 10 ng / mL or more). This indicates that the external preparation of this example can not only effectively treat diffuse neurofibroma but also prevent side effects.
  • FIG.1 (d) has shown the dyeing
  • hematoxylin / eosin staining a section was prepared from a paraffin block, and after removing the paraffin from the section, the section was stained with Wako Pure Chemicals Meyer's hematoxylin and eosin.
  • diffuse neurofibromas showed histological changes (specifically, a decrease in the number of cells and swelling of the antigen fibers). This indicates that the external preparation of this example has the effect of reducing diffuse neurofibromas.
  • each of external preparations 6 to 8 was applied to BALB / c rice for 12 days. Specifically, each of the external preparations 6 to 8 was applied to BALB / cmice once a day. In one application, 100 mg of external preparation 6-8 was applied to 10 cm 2 of BALB / c rice skin. Twelve days after the start of application, the concentration of sirolimus in the tissue and blood was measured.
  • each of external preparations 6 to 9 was applied to hairless rice for 3 weeks. Specifically, each of external preparations 6 to 9 was applied to hairless rice once a day. In one application, 100 mg of external preparation 6-9 was applied to 10 cm 2 of hairless skin. Twenty-one days after the start of application, the concentration of sirolimus in the tissue and blood was measured.
  • the test result of BALB / c rice is shown in FIG. 2, and the test result of hairless rice is shown in FIG.
  • the external preparation of this example can maintain the sirolimus concentration in the tissue high (to a therapeutically effective concentration), while keeping the sirolimus concentration in the blood low. It became clear that it was possible.
  • the concentration of sirolimus in the topical medicine is changed from 0.2% to 0.4%, the concentration of sirolimus in the tissue is greatly increased compared to blood.
  • the concentration of sirolimus in it was almost the same. This means that the concentration of sirolimus in the external preparation is approximately 0.4% (for example, 0.2 to 0.8% by weight (or 0.2% by weight or more and less than 0.8% by weight), preferably 0.8%.
  • topical medicine 4 containing ethanol or the topical medicine 7 containing isopropanol was applied to the hairless rice for 3 weeks. Specifically, the external medicine 4 or the external medicine 7 was applied to the hairless once per day. Moreover, 100 mg of the external preparation 4 or the external preparation 7 was applied to 10 cm 2 of hairless rice skin in one application. Twenty-one days after the start of application, the concentration of sirolimus in the tissue and blood was measured.
  • External preparation 15 mg of external preparation 5 (total 120 ⁇ g of sirolimus) was applied once on the back of hairless rice. 1 hour, 3 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours, and 72 hours after application, the tissue of the mouse is tape stripped and exfoliated from the back. The concentration of sirolimus in it was measured.
  • mice were given a single dose of 200 ⁇ L of a solution containing sirolimus at a concentration of 250 ⁇ g / 200 ⁇ L. At 1 hour, 3 hours, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 36 hours, 48 hours, and 72 hours after the oral administration, the tissue of the mouse was tape stripped and exfoliated from the back. The concentration of sirolimus in it was measured.
  • Oral medication Mice were given 200 ⁇ L of a solution containing sirolimus at a concentration of 250 ⁇ g / 200 ⁇ L once a day. The oral administration was performed continuously for 5 days. The concentration of sirolimus in the tissues and the concentration of sirolimus in the blood were measured 1, 2, 3, 4 and 5 days after the start of continuous administration.
  • Cell proliferation was analyzed according to the MTT assay method, more specifically, using Cell Count Reagent SF manufactured by Nacalai Co., Ltd.
  • cell death was analyzed according to Trypan blue cell count method, and more specifically, Trypan Blue # 145-0021 manufactured by Bio-rad Co., Ltd. was used for analysis. The specific method followed the protocol attached to each kit.
  • the present invention can be used for the treatment or treatment of diffuse neurofibromatosis (for example, diffuse neurofibromatosis that develops in a patient suffering from neurofibromatosis type 1).
  • diffuse neurofibromatosis for example, diffuse neurofibromatosis that develops in a patient suffering from neurofibromatosis type 1).

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Abstract

　びまん性神経線維腫用の外用薬を提供する。本発明のびまん性神経線維腫用の外用薬は、有効成分として、シロリムスおよびシロリムス誘導体からなる群より選択される少なくとも１つを含有している。

Description

びまん性神経線維腫用の外用薬
　本発明は、びまん性神経線維腫用の外用薬に関する。
　神経線維腫症は、生体の多くの器官（例えば、皮膚および神経など）に様々な異常を生じる病気である。
　神経線維腫症には、様々なタイプが存在し、その例として、神経線維腫症１型（ＮＦ１、レックリングハウゼン病）および神経線維腫症２型（ＮＦ２）を挙げることができる。神経線維腫症１型と神経線維腫症２型とは、原因が異なる別々の病気であって、例えば、神経線維腫症１型は、１７番染色体のＮＦ１遺伝子の異常によって発症する常染色体優性遺伝性疾患であることが明らかになっている。
　神経線維腫症１型と神経線維腫症２型とでは、生体に現れる症状も大きく異なる。例えば、神経線維腫症１型の症状としては、神経線維腫、カフェオレ斑、骨異常および視神経膠腫などを挙げることができ、神経線維腫症１型では、皮膚に重篤な症状が現れる。一方、神経線維腫症２型の症状としては、聴神経の腫瘍などを挙げることができ、神経線維腫症２型では、神経線維腫症１型と比較して、中枢神経の腫瘍として症状が現れることが多く、皮膚に症状が現れることが少ない。更に、神経線維腫症１型は、褐色細胞腫、ＧＩＳＴ（Gastrointestinal Stromal Tumor）または血管奇形などの様々な合併症を伴うことが多く、治療を困難なものにしている。
　特許文献１には、シロリムスおよびシロリムスの誘導体の少なくとも１つを含有する、ゲル組成物および軟膏組成物が開示されている。非特許文献１には、シロリムスを神経線維腫症１型の神経線維腫の治療に内服で用いることが開示されているが、治療効果は得られていない。
　神経線維腫症の症状の１つである神経線維腫には様々なタイプが存在し、各タイプは、それぞれ独自の性質を有した、医学的に区別される別々の症状である。例えば、皮膚の神経線維腫（cutaneous neurofibroma）、びまん性神経線維腫（diffuse plexiform neurofibroma）、神経の神経線維腫（nodular plexiform neurofibroma）、悪性末梢神経鞘腫瘍（malignant peripheral nerve sheath tumor; NPNST）を挙げることができる。
　びまん性神経線維腫は、神経線維腫を発症した患者の約１０％にみられる線維腫である。びまん性神経線維腫が巨大な場合には、神経線維腫の表面は皺壁に富んで弛緩し、舌状に下垂するものもある。びまん性神経線維腫が下肢全体に及ぶような場合には、皮下から皮下脂肪組織、筋肉内にまで神経線維腫の浸潤がみられ、骨の肥大および延長もみられ、巨肢症の状態を呈することもある。びまん性神経線維腫は、部位により片側顔面肥大、眼瞼下垂、巨肢症などを認め、上眼瞼の腫瘤による視野の妨げ、鼻の変形など、顔面に生じた場合には、小型であっても問題になる場合が多い（図１（ａ）～（ｃ）参照）。
　また、びまん性神経線維腫は、血管が豊富であり、組織は脆弱で、軽微な打撲により巨大な血腫を形成することがある。短時間で急激に巨大な血腫を形成することもあるが、数日にわたって徐々に増大することもある。一度出血すると、多数の小血管から出血するために、止血が困難であり、時に大量に出血してショックを起こしたり、死亡した症例もある。
　皮膚の神経線維腫は、特に好発部位はなく、全身に多発した症例では体幹を主として、無数に生じる。腫瘍は、表面が常色または淡紅色の軟らかな腫瘍であり、大きさや形状は、様々である。皮膚の神経線維腫には、半球状に隆起するものもある。皮膚の神経線維腫の数は症例によって著しく異なり、数十個認められる症例から、無数認められる症例もある。
　神経の神経線維腫は、末梢神経の神経周膜から発生する神経線維腫であって、全身のどこにでも出現する。例えば、脳の周囲、脊椎の周囲、骨盤腔内、または、皮下など、種々な場所に出現する。神経の神経線維腫は、皮膚の浅いところに出現する場合には、神経の走行に沿って、皮下に比較的境界明瞭で紡錘形に弾性硬に触れる腫瘍として出現する。これらの神経の神経線維腫が、連なって数珠状になったり、一塊となって大きな腫瘤を形成する場合もある。
　びまん性神経線維腫は、軽微な外傷にて大量の出血をおこしたり、悪性腫瘍（例えば、グリオブラストーマ、および、ＭＰＮＳＴ（Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor）など）の発生母地となる。それ故に、びまん性神経線維腫の有効な治療薬や治療方法の開発が急がれている。
ＷＯ２０１２／１０５５２１　Ａ１（２０１２年８月９日公開）
Brian Weiss et. al., Pediatr Blood Cancer 2014, 61, 982-986
　神経線維腫はタイプ毎に様々な性質を有しているので、治療を行う場合には、各神経線維腫に適した治療薬や治療方法を選択する必要がある。
　神経線維腫が小さい場合や、神経線維腫と正常組織との境界が比較的鮮明である場合には、神経線維腫を手術により切除することが可能である。しかしながら、びまん性神経線維腫は、血管が豊富であり、かつ、浸潤性が高いために、腫瘍と正常組織との境界が不明瞭であり、かつ、腫瘍と血管または神経とが複雑に絡み合っている。それ故に、びまん性神経線維腫は、手術にて治療することが困難であるという問題を有している。特に、びまん性神経線維腫が巨大化すると、腫瘍が重く体の移動さえ困難となる。下肢に巨大な腫瘍を有する場合においては、足の切断を余儀なくされる場合がある。巨大化したびまん性神経線維腫については、現時点で有効な治療薬や治療方法は確立されていない。
　また、びまん性神経線維腫は、放射線療法が有効に機能しないという問題を有している。
　びまん性神経線維腫を内服薬によって治療しようとする試みはなされているが、有意な治療効果が確認されている内服薬の報告はない。
　また、以下の（ｉ）および（ｉｉ）の先入観により、外用薬によりびまん性神経線維腫を治療しようという試みはなされていない。
（ｉ）外用薬では、特にシロリムスのような分子量の大きい物質の場合は、びまん性神経線維腫の患部（換言すれば、肥厚した皮膚組織）への有効成分の送達効率が低い；
（ｉｉ）巨大な線維腫を外用薬で治療する方法は有効ではなく、内服薬こそが有効な治療方法である。
　本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、びまん性神経線維腫を治療することができる外用薬を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、びまん性神経線維腫にシロリムスまたはシロリムス誘導体を含有する外用薬を塗布することにより、びまん性神経線維腫を治療できることを見出し、本発明を完成させるに至った。また、シロリムスおよびシロリムス誘導体について、以下の（ａ）～（ｄ）を見出し、本発明を完成させるに至った。
（ａ）経口薬の場合、有効成分の血中濃度は上昇するが、皮膚組織（換言すれば、びまん性神経線維腫の患部）中の有効成分の濃度は、治療有効濃度までには達し難いこと；
（ｂ）経口薬によって皮膚組織中の有効成分の濃度を治療有効濃度まで上げようとすれば、患者に対して多量の経口薬を投与する必要が生じ、この場合には、全身性の副作用が生じる危険性が高まること；
（ｃ）外用薬の場合、皮膚組織中（局所）での有効成分の濃度は治療有効濃度までに上がる一方で、血液中への有効成分の移行は行われ難いこと；
（ｄ）アルコールを含有する外用薬にすることによって、外用薬に含まれる有効成分を、更に効率よく皮膚組織に吸収させ得ること。
　本発明のびまん性神経線維腫用の外用薬は、上記課題を解決するために、有効成分として、シロリムスおよびシロリムス誘導体からなる群より選択される少なくとも１つを含有していることを特徴としている。
　本発明のびまん性神経線維腫用の外用薬は、ゲル剤であることが好ましい。
　本発明のびまん性神経線維腫用の外用薬は、エタノールを含有していることが好ましい。
　本発明のびまん性神経線維腫用の外用薬は、上記エタノールを、２０～６０重量％含有していることが好ましい。
　本発明のびまん性神経線維腫用の外用薬は、上記有効成分を、０．２～０．８重量％含有していることが好ましい。
　本発明の外用薬は、有効な治療薬や治療方法が確立されていない、びまん性神経線維腫を治療することができる。特に、手術が不可能な巨大化したびまん性神経線維腫を縮小させ、患者のＱＯＬを著しく改善する。また、打撲などによる血腫形成や大量出血を防ぐことができる。早期に治療を開始することにより、腫瘍の巨大化を抑制できる。
　本発明の外用薬は、吸収率が高く、有効成分を効率良く、患部である皮膚組織や筋肉組織に到達させることができる。
　本発明の外用薬は、皮膚組織や筋肉組織などの局所での有効成分の濃度を高く保持できるが、吸収された有効成分の血液移行量は少ない。よって、全身性の副作用が生じる危険性が低く安全な製剤である。
　本発明の外用薬は、全身投与と異なり、限られた病変部位にのみ外用することができる。
（ａ）～（ｃ）は、びまん性神経線維腫の症状を示す写真であり、（ｄ）は、本発明の実施例に係る外用薬の投与前後における、びまん性神経線維腫の組織学的な変化を示す写真である。 本発明の実施例に係る外用薬の投与後における、組織中および血液中のシロリムスの濃度の測定結果を示すグラフである。 本発明の実施例に係る外用薬の投与後における、組織中および血液中のシロリムスの濃度の測定結果を示すグラフである。 本発明の実施例に係る外用薬の投与後における、組織中および血液中のシロリムスの濃度の測定結果を示すグラフである。 本発明の実施例に係る外用薬を単回投与した場合の組織中のシロリムスの濃度と、内服薬を単回投与した場合の組織中のシロリムスの濃度とを比較したグラフである。 本発明の実施例に係る外用薬を連続投与した場合の、組織中および血液中のシロリムスの濃度と、内服薬を連続投与した場合の、組織中および血液中のシロリムスの濃度とを比較したグラフである。 本発明の実施例における、ＭＴＴ　アッセイ法による細胞増殖の解析結果、および、Ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　セルカウント法による細胞死の解析結果を示すグラフである。
　本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献及び特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上Ｂ以下」を意図する。
　本実施の形態の外用薬は、びまん性神経線維腫を処置および／または治療するための外用薬であって、シロリムスおよびシロリムス誘導体からなる群より選択される少なくとも１つの有効成分を含有している。
　シロリムス（別名：ラパマイシン）やシロリムス誘導体は、既に、他の病気の治療にも用いられており、臨床における安全性が確認されている。それ故に、これらを用いれば、より安全性の高い、びまん性神経線維腫用の外用薬を実現することができる。
　上記シロリムス誘導体としては、特に限定されないが、例えば、エベロリムス、テムシロリムス、リダフォロリムス、およびゾタロリムスを挙げることができる。これらは、シロリムスの基本骨格と略同じ基本骨格を有しており、シロリムスと同等の生理活性を有していることが知られている。それ故に、これらのシロリムス誘導体も、シロリムスと同様に、本実施の形態の外用薬の有効成分として用いることができる。容易に外用薬を調製するという観点から言うと、上述した中では、シロリムスおよび／またはエベロリムスを用いることが好ましい。また、上述した中では通常分子量が大きく、水溶性で経皮吸収が困難と考えられるエベロリムスなどに比して、経皮吸収が確認されているラパマイシンを用いることが好ましい。
　本実施の形態の外用薬に含有される有効成分の量は、特に限定されないが、本実施の形態の外用薬であれば有効成分を効率良く皮膚組織内に吸収させることができる。また、びまん性神経線維腫の肥厚した皮膚組織にも有効成分を到達させることができる。
　例えば、本実施の形態の外用薬に含有される有効成分の量は、外用薬の総重量を基準として、０．０５～１．０重量％、０．１～０．９重量％、０．２～０．８重量％（または、０．２重量％以上０．８重量％未満）、０．３～０．７重量％、０．３５～０．６重量％、０．４～０．６重量％、または、０．４～０．５重量％であり得る。
　有効成分の血液中への移行をできるだけ抑え、かつ、皮膚組織中の有効成分の濃度を治療有効濃度にまで高めることによって、全身性の副作用を抑え、かつ、治療効果を得るという観点からは、本実施の形態の外用薬に含有される有効成分の量は、外用薬の総重量を基準として、好ましくは０．２～０．８重量％（または、０．２重量％以上０．８重量％未満）、より好ましくは０．３～０．７重量％、より好ましくは０．４～０．６重量％である。
　本実施の形態の外用薬は、びまん性神経線維腫の処置（換言すれば、症状の進行の阻止）および／または治療に用いられる。本実施の形態の外用薬が用いられるびまん性神経線維腫は、例えば、神経線維腫症１型に伴って発症する、びまん性神経線維腫であり得る。
　本実施の形態の外用薬は、ヒトは勿論のこと、非ヒト動物に対しても用いることができる。非ヒト動物としては、例えば、ヒトを除く哺乳類を挙げることができる。ヒトを除く哺乳類としては、例えば、ウシ、イノシシ、ブタ、ヒツジ、ヤギなどの偶蹄類、ウマなどの奇蹄類、マウス、ラット、ハムスター、リスなどのげっ歯類、ウサギなどのウサギ目、イヌ、ネコ、フェレットなどの食肉類などを挙げることができる。また、これらの非ヒト動物は、家畜またはコンパニオンアニマル（愛玩動物）であることに限定されるものではなく、野生動物であってもよい。
　生体の単位表面積あたりの本実施の形態の外用薬の塗布量は、特に限定されないが、０．００１ｇ／ｃｍ２～０．０１ｇ／ｃｍ２、０．００２ｇ／ｃｍ２～０．００９ｇ／ｃｍ２、０．００３ｇ／ｃｍ２～０．００８ｇ／ｃｍ２、０．００４ｇ／ｃｍ２～０．００７ｇ／ｃｍ２、０．００５ｇ／ｃｍ２～０．００６ｇ／ｃｍ２であり得る。
　当該塗布量で本実施形態の外用薬を、毎日、または、２～３日に１回塗布すればよい。毎日塗布することが好ましい。毎日塗布する場合は、１日に１～３回の塗布が好ましく、さらに好ましくは１日に２～３回の塗布、最も好ましくは１日に２回の塗布である。
　本実施の形態の外用薬であれば、効果的にびまん性神経線維腫を処置および／または治療することができるとともに、副作用が生じることを防ぐことができる。
　本実施の形態の外用薬は、ゲル剤、軟膏剤、パップ剤、リニメント剤、ローション剤、および、クリーム剤などの剤形であってもよい。
　例えば、ｉ）有効成分を含有している溶液をゲル化することにより、ゲル剤を調製することができる。また、ｉｉ）軟膏基剤と有効成分とを混合することにより、軟膏剤を調製することができる。また、パップ剤、リニメント剤、ローション剤およびクリーム剤は、周知の方法にしたがって調製することができる。なお、ゲル剤は、軟膏剤と比較して、皮膚組織に有効成分が吸収され易く、より好ましい剤形であるといえる。
　以下に、ゲル剤の具体的な構成の一例、および、軟膏剤の具体的な構成の一例について説明するが、本発明は、これらの構成に限定されない。
　（Ａ）ゲル剤
　上述したように、本実施の形態の外用薬は、有効成分を含有している溶液をゲル化して得られる、ゲル剤であってもよい。
　ゲル剤を調製する場合には、ゲル化剤を用いて、有効成分を含有している溶液をゲル化すればよい。ゲル化剤として、例えば、カルボキシビニルポリマー、カルボキシメチルセルロース、水酸化アルミニウム、ベントナイトなどを挙げることができる。
　カルボキシビニルポリマーの具体的な構成は、特に限定されず、カーボポール（登録商標）、ハイビスワコー（登録商標）、アクペック（登録商標）を用いることができるが、外用薬として塗布した場合の質感の良さの観点から、これらの中では、カーボポール（登録商標）９３４Ｐ　ＮＦまたはカーボポール（登録商標）９８０が好ましい。
　カーボポール（登録商標）を用いる場合、カーボポール（登録商標）を含有している溶液にｐＨ調整剤（例えば、トリスヒドロキシメチルアミノメタン、トリエタノールアミン）を添加し、これによって溶液のｐＨを中性に調整することによって、溶液をゲル化させることができる。
　本実施の形態の外用薬は、好適にはアルコールを含有する。アルコールにより、外用薬に含まれる有効成分を効率よく皮膚組織に吸収させ患部へ到達させることができる。アルコールの例としては、エタノールおよびイソプロパノールを挙げることができるが、有効成分をより効率よく皮膚組織に吸収させるという観点から、エタノールがより好ましい。
　本実施の形態の外用薬に含まれるアルコールの量は、特に限定されないが、外用薬の総重量を基準として、１０～７０重量％、２０～７０重量％、３０～７０重量％、４０～７０重量％、４５～７０重量％、５０～７０重量％、５５～７０重量％、６０～７０重量％、１０～６０重量％、２０～６０重量％、３０～６０重量％、４０～６０重量％、４５～６０重量％、１０～５５重量％、２０～５５重量％、３０～５５重量％、４０～５５重量％、４５～５５重量％、１０～５０重量％、２０～５０重量％、３０～５０重量％、４０～５０重量％、または、４５～５０重量％であってもよい。好ましくは、２０～６０重量％である。
　アルコール量はシロリムスを十分に溶解することができる量である事が、必須であり、２０重量％以上が好ましい。効果の期待できる濃度のゲルを調製するためにはゲル重量の３０重量％以上、さらに好ましくは４０重量％以上アルコール量が好ましい。６０重量％を超えると、製剤からアルコールが蒸発しやすくなるため、安定した有効成分濃度の製剤を保存（保管）する事が難しくなる。よって、より好ましくは、５０重量％前後（４５～５５重量％）である。有効成分が十分に溶解するアルコール量を含有することにより、有効成分をより効率よく皮膚組織に吸収させることができる。５０重量％以下であるならばアルコールの量が多いほど、有効成分が十分に溶解しており、より効率よく皮膚組織に吸収させることができる。
　ゲル剤に含まれるゲル化剤の量は、特に限定されず、有効成分を含有している溶液がゲル化するために十分な量であればよい。ゲル剤に含まれるゲル化剤の量は、例えば、ゲル剤の総重量を基準として、１．５重量％以上（より具体的には、１．５～２０重量％、１．５～１５重量％、１．５～１０重量％、１．５～５重量％、または、１．５～２．５重量％）であり得る。
　ゲル剤に含まれるｐＨ調整剤（中和剤）の量は、特に限定されず、溶媒およびゲル化剤の量に応じて適宜設定し得る。ゲル剤に含まれるｐＨ調整剤の量は、例えば、ゲル剤の総重量を基準として、０．５～５．０重量％、０．５～２．５重量％、または、０．５～１．０重量％であり得る。
　より具体的に、カーボポール（登録商標）９３４Ｐ　ＮＦなどのゲル化剤と、トリスヒドロキシメチルアミノメタンなどのｐＨ調整剤と、を用いる場合、ゲル化剤の量が、ゲル剤の総重量を基準として、１．６重量％であり、ｐＨ調整剤の量が、ゲル剤の総重量を基準として、例えば０．４重量％、０．６重量％または０．８重量％であってもよい。勿論、本発明は、当該比率に限定されない。
　ゲル剤に含まれる有効成分の量は特に限定されず、「外用薬に含有される有効成分の量」として既に説明した量であり得る。
　ゲル剤には、上述した有効成分、溶媒（アルコール）、ゲル化剤およびｐＨ調整剤（中和剤）以外の他の成分が含まれていてもよい。当該他の成分としては、例えば、水溶性高分子、および、上述した有効成分以外の所望の有効成分が挙げられる。
　上記水溶性高分子としては、例えば、ポリエチレングリコール、デンプン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、および、ポリビニルピロリドンなどを挙げることができる。ゲル剤にヒドロキシプロピルセルロースが含まれていれば、当該ゲル剤の粘着性を向上させることができる。つまり、ゲル剤が皮膚から剥がれ難くすることができる。
　ゲル剤に含まれる上記他の成分の量は、特に限定されないが、例えば、ゲル剤の総重量を基準として、５０重量％以下、４０重量％以下、３０重量％以下、２０重量％以下、１０重量％以下、５重量％以下、または、１重量％以下であり得る。
　（Ｂ）軟膏剤
　上述したように、本実施の形態の外用薬は、基剤と有効成分とを含有する軟膏剤であってもよい。
　軟膏剤に含まれる有効成分の量は特に限定されず、「外用薬に含有される有効成分の量」として既に説明した量であり得る。当該量については既に説明したので、ここでは、具体的な説明を省略する。
　基剤としては、例えば、ロウ類（例えば、サラシミツロウ、ラノリン、カルナバロウ、鯨ロウなどの天然ロウ、モンタンロウなどの鉱物ロウ、合成ロウなど）、パラフィン類（例えば、流動パラフィン、固形パラフィンなど）、ワセリン（例えば、白色ワセリン、黄色ワセリンなど）などを挙げることができる。
　軟膏剤に含まれる基剤の量は特に限定されないが、例えば、軟膏剤の総重量を基準として、１０重量％以上、２０重量％以上、３０重量％以上、４０重量％以上、５０重量％以上、６０重量％以上、７０重量％以上、８０重量％以上、または、９０重量％以上であり得る。
　軟膏剤は、炭酸プロピレン、固形パラフィンおよび白色ワセリンを含むことが可能である。また、軟膏剤は、炭酸プロピレン、固形パラフィンおよび白色ワセリンに加えて、更に流動パラフィンを含むことも可能である。また、軟膏剤は、炭酸プロピレン、固形パラフィン、白色ワセリンおよび流動パラフィンに加えて、更にサラシミツロウを含むことが可能である。
　軟膏剤は、周知の方法にしたがって製造することができる。以下に、製造方法の一例を説明する。
　例えば、ホモミキサー（例えば、プライミクス株式会社製）や万能ミキサー（例えば株式会社ダルトン製）を用いて調製することができる。基剤が室温において固体である場合、基剤を液体になるまで加熱し、液体状の基剤と、有効成分が溶解した溶液とを混合すればよい。例えば、室温において固体である各種成分（例えば、ロウ類、パラフィン類、ワセリンなど）を融点以上（例えば７０℃）に加熱して溶解し、当該溶解物へ、有効成分が溶解した溶液を添加し、撹拌する。そして、撹拌しながらこの混合物を室温付近にまで（例えば４０℃）冷却し、軟膏剤を製造することができる。
　別の方法として、基剤を全て７０℃～８０℃で溶解し、自転公転ミキサー（株式会社シンキー製）を用い、攪拌モードで、８００ｒｐｍにて３０分間、次いで１０００ｒｐｍにて５分間、次いで２０００ｒｐｍにて１分間（１５℃）攪拌し、当該基剤に有効成分を溶解した溶液を加え、更に１０００ｒｐｍにて１分間、次いで２０００ｒｐｍにて１分間（冷却なし）で攪拌することで、有効成分を含む非常に微細な粒子がより分散した良質な軟膏を調製することができる。
　上述した他の成分を軟膏剤に含有させる場合、有効成分と他の成分とを所望の溶媒に溶解させた溶液を調製し、当該溶液に基剤を添加し、添加以後の工程は上述した方法にしたがって軟膏剤を調製すればよい。
　＜１．外用薬の調製＞
　シロリムス（ラパマイシン）を、エタノールまたはイソプロパノールに添加して溶解した後、更に水（具体的には、注射用水）を添加および混合して、混合溶液を調製した。当該混合溶液にカーボポール（登録商標）（具体的には、カーボポール（登録商標）９３４Ｐ　ＮＦ）を添加および混合して、均一な懸濁液を調製した。当該懸濁液に中和剤（具体的には、トリスヒドロキシメチルアミノメタン）を添加および混合して、ゲル剤（外用薬１～９）を調製した。ゲル剤の組成を下記表１および表２に示す。
　一方、サラシミツロウ、流動パラフィン、固形パラフィン、白色ワセリンを全て同一容器に量り取り、これらを７０℃～８０℃で溶解し、自転公転ミキサー（株式会社シンキー製）を用い、攪拌モードで、８００ｒｐｍにて３０分間、次いで１０００ｒｐｍにて５分間、次いで２０００ｒｐｍにて１分間（１５℃）攪拌し、当該溶解物に対して、シロリムスを炭酸プロピレンで６０～７０℃の湯浴上で溶解した溶液を加え、更に１０００ｒｐｍにて１分間、次いで２０００ｒｐｍにて１分間（冷却なし）で攪拌して、軟膏剤（外用薬１０）を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　＜２．びまん性神経線維腫に対する外用薬の効果＞
　神経線維腫症１型を患う患者（３名）のびまん性神経線維腫に、外用薬４を１２週間塗布した。具体的に、外用薬４を、１日あたり１回、びまん性神経線維腫に塗布した。また、１回の塗布で、びまん性神経線維腫３００ｃｍ２に対して１ｇの外用薬４を塗布した。塗布を開始してから８４日後に、シロリムスの組織中の濃度および血液中の濃度を測定し、組織染色によって組織の状態を確認し、かつ、患者の自覚症状の有無を確認した。
　試験結果を、表４および図１（ｄ）に示す。下記表４において、「血中のシロリムス濃度」および「組織中のシロリムス濃度」の欄の「－」は、測定限界（１ｎｇ／ｍＬ、または、１ｎｇ／ｍｇ）以下の濃度であることを示す。また、「患者の自覚症状」の欄の「－」は、治療前後において、自覚症状に変化が無かったことを示す。なお、「血中のシロリムス濃度」は、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｓｉｒｏｒｉｍｕｓ、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｓｉｒｏｒｉｍｕｓ　キャリブレータ、ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ（登録商標）Ｓｉｒｏｒｉｍｕｓ　Ｗｈｏｌｅ　Ｂｌｏｏｄ　Ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、病院検査室で測定し、「組織中のシロリムス濃度」は、ＬＣ－ＥＳＩ／ＭＳ法で測定した。
　表４に示すように、本実施例の外用薬は、組織中のシロリムスの濃度を高く（治療有効濃度に）維持することができる一方で、血液中のシロリムスの濃度を低く抑えることができることが明らかになった（経口投与薬であれば、血液中のシロリムス濃度は、略５～１０ｎｇ／ｍＬ、または、それ以上になる）。このことは、本実施例の外用薬は、びまん性神経線維腫を効果的に治療できるのみならず、副作用を防ぐことができることを示している。
　表４の「組織の所見」の欄の試験結果を、別途、図１（ｄ）に示す。なお、図１（ｄ）は、治療前後のびまん性神経線維腫をヘマトキシリン・エオジン染色した染色像を示している。なお、ヘマトキシリン・エオジン染色は、パラフィンブロックから切片をつくり、当該切片からパラフィンを除去した後で、当該切片を和光純薬のマイヤーヘマトキシリンと、エオジンとを用いて、染色した。治療の前後において、びまん性神経線維腫に組織学的な変化（具体的には、細胞数の減少、および、抗原繊維の膨化）が認められた。このことは、本実施例の外用薬は、びまん性神経線維腫を縮小させる効果を有していることを示している。
　更に、表４の「患者の自覚症状」の欄に示すように、衣類の着用が容易になったとの自覚症状が現れた患者も存在した。このことも、本実施例の外用薬は、びまん性神経線維腫を縮小させる効果を有していることを示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　＜３．シロリムスの組織中の濃度および血液中の濃度＞
　ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅに、外用薬６～８の各々を１２日間塗布した。具体的に、外用薬６～８の各々を、１日あたり１回、ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅに塗布した。なお、１回の塗布で、ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅの皮膚１０ｃｍ２に対し１００ｍｇの外用薬６～８を塗布した。塗布を開始してから１２日後に、シロリムスの組織中の濃度および血液中の濃度を測定した。
　また、ｈａｉｒｌｅｓｓ　ｍｉｃｅに、外用薬６～９の各々を３週間塗布した。具体的に、外用薬６～９の各々を、１日あたり１回、ｈａｉｒｌｅｓｓ　ｍｉｃｅに塗布した。なお、１回の塗布で、ｈａｉｒｌｅｓｓ　ｍｉｃｅの皮膚１０ｃｍ２に対して１００ｍｇの外用薬６～９を塗布した。塗布を開始してから２１日後に、シロリムスの組織中の濃度および血液中の濃度を測定した。
　ＢＡＬＢ／ｃ　ｍｉｃｅの試験結果を図２に示し、ｈａｉｒｌｅｓｓ　ｍｉｃｅの試験結果を図３に示す。図２および図３に示すように、本実施例の外用薬は、組織中のシロリムスの濃度を高く（治療有効濃度に）維持することでできる一方で、血液中のシロリムスの濃度を低く抑えることができることが明らかになった。
　更に、図２および図３に示すように、外用薬中のシロリムスの濃度を０．２％から０．４％へ変化させた場合、組織中のシロリムスの濃度は大きく増加するのに比べ、血液中のシロリムスの濃度は略同じであった。このことは、外用薬中のシロリムスの濃度が略０．４％（例えば、０．２～０．８重量％（または、０．２重量％以上０．８重量％未満）、好ましくは０．３～０．８重量％（または、０．３重量％以上０．８重量％未満）、より好ましくは０．４～０．８重量％（または、０．４重量％以上０．８重量％未満））であれば、血液中のシロリムスの濃度を極力低下させた状態で、組織中のシロリムスの濃度を極力上昇させることができること、つまり、当該構成であれば、副作用を極力抑えた状態で、びまん性神経線維腫を効果的に治療することができる。
　＜４．外用薬に含まれるアルコールに関する検討＞
　ｈａｉｒｌｅｓｓ　ｍｉｃｅに、エタノールを含有している外用薬４、または、イソプロパノールを含有している外用薬７の各々を３週間塗布した。具体的に、外用薬４または外用薬７を、１日あたり１回、ｈａｉｒｌｅｓｓ　ｍｉｃｅに塗布した。また、１回の塗布で、ｈａｉｒｌｅｓｓ　ｍｉｃｅの皮膚１０ｃｍ２に対して１００ｍｇの外用薬４または外用薬７を塗布した。塗布を開始してから２１日後に、シロリムスの組織中の濃度および血液中の濃度を測定した。
　試験結果を図４に示す。図４に示すように、イソプロパノールを含む外用薬と比較して、エタノールを含む外用薬の方が、シロリムスの組織中への吸収効果が高いことが明らかになった。また、図４に示すように、エタノールを含む外用薬も、組織中のシロリムスの濃度を高く（治療有効濃度に）維持することでできる一方で、血液中のシロリムスの濃度を低く抑えることができることが明らかになった。
　＜５．外用薬と内服薬との比較（単回投与）＞
　外用薬：１５ｍｇの外用薬５（合計１２０μｇのシロリムス）を、ｈａｉｒｌｅｓｓ　ｍｉｃｅの背に、１回塗布した。塗布してから、１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、および、７２時間後に、マウスの背をテープストリッピングし、背から角質を除いた後で、組織中のシロリムスの濃度を測定した。
　内服薬：２５０μｇ／２００μＬの濃度にてシロリムスを含有する溶液２００μＬを、マウスに１回内服させた。内服させてから、１時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、および、７２時間後に、マウスの背をテープストリッピングし、背から角質を除いた後で、組織中のシロリムスの濃度を測定した。
　試験結果を図５に示す。図５に示すように、内服薬よりも外用薬の方が、組織中のシロリムスの濃度を、はるかに上昇させ得ることが明らかになった。
　＜６．外用薬と内服薬との比較（連続投与）＞
　外用薬：１５ｍｇの外用薬５（合計１２０μｇのシロリムス）を、ｈａｉｒｌｅｓｓ　ｍｉｃｅの背に、１日あたり１回塗布した。当該塗布を、５日間連続して行った。連続投与を開始してから、１日、２日、３日、４日、および、５日後に、組織中のシロリムスの濃度、および、血液中のシロリムスの濃度を測定した。
　内服薬：２５０μｇ／２００μＬの濃度にてシロリムスを含有する溶液２００μＬを、マウスに１日あたり１回内服させた。当該内服を、５日間連続して行った。連続投与を開始してから、１日、２日、３日、４日、および、５日後に、組織中のシロリムスの濃度、および、血液中のシロリムスの濃度を測定した。
　試験結果を図６に示す。図６に示すように、血液中のシロリムスの濃度が略同一であるときを比較すると、外用薬の方が、内服薬よりも、組織中のシロリムスの濃度が略１００倍高いことが明らかになった。
　＜７．シロリムスの細胞増殖抑制作用および細胞死誘導作用に関する検討＞
　周知の方法にしたがって神経線維腫症１型を患う患者のびまん性神経線維腫に由来する線維芽細胞を培養した。当該線維芽細胞を培養している培地に、最終濃度が０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭとなるようにシロリムスを加えて培養した後で、線維芽細胞の細胞増殖と細胞死とを解析した。なお、シロリムスに対するネガティブコントロールとしては、ＤＭＳＯを用いた。
　細胞増殖は、ＭＴＴ　アッセイ法にしたがって解析し、より具体的には、ナカライ株式会社製のＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔ　Ｒｅａｇｅｎｔ　ＳＦを用いて解析した。一方、細胞死は、Ｔｒｙｐａｎ　ｂｌｕｅ　セルカウント法にしたがって解析し、より具体的には、Ｂｉｏ－ｒａｄ株式会社製のＴｒｙｐａｎ　Ｂｌｕｅ　♯１４５－００２１を用いて解析した。具体的な方法は、各キットに添付のプロトコールにしたがった。
　試験結果を図７に示す。図７に示すように、シロリムスの濃度依存的に、細胞増殖が抑制され、かつ、細胞死が誘導されることが明らかになった。
　本発明は、びまん性神経線維腫（例えば、神経線維腫症１型を患う患者に発症する、びまん性神経線維腫）の処置または治療に利用することができる。

Claims (5)

  1. 　有効成分として、シロリムスおよびシロリムス誘導体からなる群より選択される少なくとも１つを含有していることを特徴とする、びまん性神経線維腫用の外用薬。
  2. 　上記外用薬は、ゲル剤であることを特徴とする請求項１に記載の、びまん性神経線維腫用の外用薬。
  3. 　エタノールを含有していることを特徴とする請求項１または２に記載の、びまん性神経線維腫用の外用薬。
  4. 　上記エタノールを、２０～６０重量％含有していることを特徴とする請求項３に記載の、びまん性神経線維腫用の外用薬。
  5. 　上記有効成分を、０．２～０．８重量％含有していることを特徴とする請求項１～４の何れか１項に記載の、びまん性神経線維腫用の外用薬。
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