WO2016143989A1 - 단백질 초분자 조립체의 제조방법 - Google Patents

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WO2016143989A1
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supramolecular
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정용원
김영은
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한국과학기술원
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    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a protein supramolecular assembly, a method for displaying a protein on a supramolecular assembly, and an assembly monomer for preparing the supramolecular assembly.
  • the present invention also relates to a method for purifying a supramolecular assembly of a polydispersion distribution into a monodisperse supramolecular assembly.
  • Biomolecules are very attractive building blocks for molecular precision and new nanostructure designs.
  • DNA self-assembly through specific base pairs, known as DNA folding, allows the creation of arrays of specifically programmed nanostructures 1 , 2 .
  • precise design of protein nano-assembly is not in spite of its limited functionality and is more challenging due to the structural complexity of the protein 3-5.
  • the spatial organization of functional proteins varies, very clear nanostructures are a key goal of protein nanotechnology.
  • the protein polymer is assembled a variety of metal ions, proteins, enzyme inhibitors, proteins, peptides and protein 10-14, or chemical / enzymatic binding interaction of a cofactor (cofactor) in the form of molecular recognition comprising 15-18.
  • a cofactor cofactor
  • the current strategy is to produce protein assemblies with a polydispersity distribution in the oligomeric state. Fabrication of homogeneous protein polymers will be an essential step for in-depth understanding and application of supramolecular protein assembly, and protein monodispersion will also provide a great opportunity to obtain accurate structural information of new protein nanoassembly 19 .
  • the present inventors have tried to develop a method for efficiently obtaining macromolecular protein assemblies.
  • the inventors have established novel strategies for the preparation of macromolecular protein assemblies and redesigned the assembly monomers necessary for them, and provide macromolecular protein assemblies in which the macromolecular protein assemblies prepared therefrom are defined.
  • the present invention was completed by elucidating that the protein to be displayed on the macromolecular protein assembly can be displayed in a nano-precision and balance-regulated pattern.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing a protein supramolecular assembly.
  • Another object of the present invention is to provide a method for displaying a protein on supramolecular assembly.
  • Another object of the present invention is to provide an assembly monomer (assembly monomer) for producing the supramolecular assembly.
  • the present invention provides a method for producing a protein supramolecular assembly comprising the following steps:
  • the present inventors have tried to develop a method for efficiently obtaining macromolecular protein assemblies.
  • the inventors have established novel strategies for the preparation of macromolecular protein assemblies and redesigned the assembly monomers necessary for them, and provide macromolecular protein assemblies in which the macromolecular protein assemblies prepared therefrom are defined. Rather, it was found that the protein to be displayed on the macromolecular protein assembly can be displayed in a nano-precision and a balance-regulated pattern.
  • the inventors report the first example of a set of monodisperse protein polymers having a very clear polygonal structure (FIG. 1A) that allows for spatially precise and atomic control expression of various functional proteins.
  • Green fluorescent protein (GFP) was designed to self-assemble through intracellular translation and to produce GFP polymer mixtures of various sizes. Protein aggregation of these GFP polymers (a major problem of large artificial protein assembly) was prevented through the systematic introduction of GFP surface negative charges. More importantly, these GFP supercharges enabled DNA gel shape based purification of monodisperse GFP polymers, and the polygonal arrangement of GFP polymers was visualized by transmission electron microscopy (TEM) (FIG. 1A).
  • TEM transmission electron microscopy
  • GFP nano-functional polygons
  • EGF epidermal growth factor
  • a first split fragment comprising ⁇ strands 1-10 of Green fluorescent protein (GFP)
  • a plurality of assembly monomers are prepared comprising a second split fragment comprising ⁇ strand 11 of GFP bound to the end of a first split fragment.
  • the assembly monomer used in the present invention is newly developed by the present inventors, and is very suitable for preparing a macromolecular protein assembly.
  • GFP contains a total of 11 ⁇ strands. Specifically, GFP includes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 sequence.
  • ⁇ strands 1-10 included in the first split fragment of the assembly monomer include amino acid residues 1-214 in SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ strand 11 included in the second split fragment of the assembly monomer comprises amino acid residues 215-230 in SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ strands 1-11 are continuously bonded to GFP present in nature, the ⁇ strands 1-10 and ⁇ strands 11 are split in the present invention.
  • the second split fragment can be joined at various positions of the first split fragment. Specifically, the second split fragment is linked to the N-terminus or C-terminus of the first split fragment, more specifically to the N-terminus.
  • the second split fragment may be linked directly or indirectly (eg, using a peptide linker) to the first split fragment.
  • a peptide linker suitable for the present invention comprises a neutral amino acid (more specifically, Gly, Ser, Ala, Thr or amino acids residues 2-10 lengths (more specifically, 2-6 lengths) Combination of four amino acids).
  • peptide linkers suitable for the present invention include "Gly-Gly-Ser", “Gly-Gly”, “Gly-Gly-Thr” and "Gly-Gly-Thr-Gly”.
  • the first split fragment is mutated so that the negative charge value is increased by exhibiting a reduced net charge value.
  • the negative charge value is increased in this way to suppress irreversible formation of aggregates when the monomer protein is assembled.
  • the strategy of increasing the negative charge value of the first split fragment may include Asp or Glu in part or all of the amino acid residues (especially positively charged amino acid residues) exposed on the surface in the tertiary structure of the first split fragment. Is replaced by a negatively charged amino acid residue of.
  • the amino acid residues are mutated to negatively charged amino acid residues Glu or Asp.
  • at least one positively charged amino acid residue selected from the group consisting of Lys26, Lys41, Lys52, Lys158 and Lys164 can be mutated to Glu or Asn149 or Asn198 to Asp.
  • the mutated first split fragment has a net charge value of -5 to -15 at neutral pH.
  • the step (a) is carried out by expressing the assembly monomer in a cell comprising a vector containing a nucleic acid molecule encoding the assembly monomer.
  • Vectors that can be used in the present invention include various expression vectors known in the art.
  • the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic or eukaryotic cells as hosts.
  • a strong promoter for example, a tac promoter, a lac promoter, a lac UV5 promoter, an lpp promoter, a p L ⁇ promoter
  • a strong promoter capable of promoting transcription , p R ⁇ promoters, rac 5 promoters, amp promoters, recA promoters, SP6 promoters, trp promoters and T7 promoters, etc.
  • ribosome binding sites for initiation of translation and transcription / detox termination sequences.
  • E. coli Promoter and operator sites of the tryptophan biosynthetic pathway (Yanofsky, C., J. Bacteriol . , 158: 1018-1024 (1984)) and the leftward promoter of phage ⁇ (p L ⁇ promoter, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet. , 14: 399-445 (1980)) can be used as regulatory sites.
  • vectors that can be used in the present invention are plasmids (eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.), phage (eg, ⁇ gt4 ⁇ ⁇ B, ⁇ -Charon, etc., which are often used in the art. , ⁇ z1, M13, etc.) or viruses (eg, SV40, etc.).
  • plasmids eg, pSC101, ColE1, pBR322, pUC8 / 9, pHC79, pUC19, pET, etc.
  • phage eg, ⁇ gt4 ⁇ ⁇ B, ⁇ -Charon, etc.
  • viruses eg, SV40, etc.
  • a promoter derived from the genome of the mammalian cell for example, metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus for example, adeno Late viral promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV
  • a promoter derived from the genome of the mammalian cell for example, metallothionine promoter
  • a promoter derived from a mammalian virus for example, adeno Late viral promoter, vaccinia virus 7.5K promoter, SV40 promoter, cytomegalovirus promoter and tk promoter of HSV
  • Vectors of the invention may be fused with other sequences to facilitate purification of the assembly monomers expressed therefrom.
  • Sequences to be fused include, for example, glutathione S-transferase (Pharmacia, USA), maltose binding protein (NEB, USA), FLAG (IBI, USA) and 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA). Because of the additional sequence for this purification, the protein expressed in the host is purified quickly and easily through affinity chromatography.
  • the fusion protein expressed by the vector containing the fusion sequence is purified by affinity chromatography.
  • glutathione-S-transferase which is a substrate of this enzyme
  • 6x His a desired peroxyredoxin protein
  • the expression vector of the present invention as an optional marker, and includes antibiotic resistance genes commonly used in the art, for example, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, geneticin, neo There are genes resistant to mycin and tetracycline.
  • Cells that can be used in the present invention can use any host cell, for example, E. coli JM109, E. coli Bacillus sp. Strains such as BL21 (DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium Enterobacteria and strains such as Um, Serratia Marcesons and various Pseudomonas species.
  • E. coli JM109 E. coli Bacillus sp. Strains such as BL21 (DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, and Salmonella typhimurium Enterobacteria and strains such as Um, Serratia Marcesons and various Ps
  • yeast Saccharomyce
  • insect cells eg, CHO cell lines (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines
  • CHO cell lines Choinese hamster ovary
  • W138 BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN and MDCK cell lines
  • Vectors injected into a host cell can be expressed in the host cell, in which case a large amount of protein is obtained.
  • the expression vector contains a lac promoter
  • the host cell may be treated with IPTG to induce gene expression.
  • the prepared plurality of assembly monomers are self-assembled to form protein supramolecular assemblies.
  • the formation of the protein supramolecular assembly is made through a self-assembly mechanism, no special treatment is required.
  • a plurality of assembly monomers in PBS solution or a plurality of assembly monomers expressed in cells form protein supramolecular assemblies through self-assembly.
  • step (b) is carried out by self-assembling in said cells the assembly monomer expressed in step (a).
  • the supramolecular assembly thus produced is, for example, supramolecular assembly in which 2-10 granular monomers are bound.
  • the supramolecular assembly prepared in step (b) has a closed polygonal form.
  • step (b) may have a linear form of an open structure.
  • step (a) further comprises the step of preparing a cap GFP (CapGFP) in which GFP 11 is coupled to mature GFP (mature GFP) comprising GFP ⁇ strands 1-12, wherein step (b) is Self-assembly is carried out using the assembly monomer and cap GFP and the finally prepared supramolecular assembly has a linear form of an open structure.
  • CapGFP cap GFP
  • mature GFP mature GFP
  • step (b) Self-assembly is carried out using the assembly monomer and cap GFP and the finally prepared supramolecular assembly has a linear form of an open structure.
  • the invention provides a method of displaying a protein on a protein supramolecular assembly comprising the following steps:
  • a first split fragment comprising (i) ⁇ strands 1-10 of Green fluorescent protein (GFP) and (ii) a first split fragment a plurality of assembly monomers comprising a second split fragment comprising ⁇ strands 11 of GFP bound to the ends of the fragments, and (iii) a first of said assembly monomers; Preparing a protein of interest bound to one split fragment; And
  • the display method of the present invention basically follows the manufacturing method of the supramolecular assembly described above, the contents common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the protein supramolecular assembly prepared in the present invention may serve as a backbone scaffold capable of balancing the regulated protein with nanoscale precision (see Example).
  • the protein of interest is bound to the first split fragment and to the N-terminus or C-terminus of the first split of the assembly monomer.
  • Proteins of the subject matter that can be used in the present invention are, for example, fluorescent proteins, hormones, hormone analogs, enzymes, inhibitors, signaling proteins or parts thereof, antibodies or parts thereof, short chain antibodies, binding proteins or binding domains thereof, Antigens, adhesion proteins, structural proteins, regulatory proteins, toxin proteins, cytokines, transcriptional regulators, blood clotting factors, and plant biodefense inducing proteins.
  • the protein of interest to be used in the present invention includes maltose binding protein, red fluorescent protein and protein G.
  • the present invention provides a fragment of the present invention comprising (i) a first split fragment comprising ⁇ strands 1-10 of Green fluorescent protein (GFP) or Red fluorescent protein (RFP). (a first split fragment), and (ii) a second split fragment comprising ⁇ strand 11 of GFP or RFP bound to the end of the first split fragment. It provides an assembly monomer (assembly monomer) for producing a supramolecular assembly comprising.
  • GFP Green fluorescent protein
  • RFP Red fluorescent protein
  • the assembly monomer of the present invention is used in the method of manufacturing the supramolecular assembly described above, the common contents between the two described above will be omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the second split fragment is linked to the first split fragment via a peptide linker.
  • the peptide linker is composed of neutral amino acids of 2-10 amino acid residues in length.
  • the first split fragment is mutated so that the negative charge value is increased by exhibiting a reduced total charge value.
  • the mutated first split fragment has a net charge value of -5 to -15 at neutral pH.
  • the present invention provides a method for purifying a polydispersed supramolecular assembly into a monodisperse supramolecular assembly comprising the following steps:
  • the assembly monomer is mutated so that the net charge of the assembly monomer is reduced to increase the negative charge value.
  • the term "assembly monomer” refers to any protein monomer capable of forming supramolecular assemblies by self-assembly.
  • the assembly monomer used in the present invention includes a protein having self-assembly capable of biomolecular protein fluorescence complementation.
  • Two-molecule fluorescence complementarity analysis utilizes a phenomenon in which a fluorescent protein is divided into two fragments, and when two fragments are far apart, they do not fluoresce, but when they come closer, they bind to each other to form an intact fluorescent protein complex.
  • Such isolated protein-based receptor systems have been widely used to monitor various protein-protein interactions in vivo and in vitro .
  • Representative assembly monomers usable in the present invention include fluorescent proteins having self-assembly, and specifically include green fluorescent protein (GFP), yellow fluorescent protein (YFP) and red fluorescent protein (RFP).
  • GFP green fluorescent protein
  • YFP yellow fluorescent protein
  • RFP red fluorescent protein
  • VN155 and VC155 or VN173 and VC173 fragments, wherein the protein is cleaved at amino acid 155 or amino acid 173, and red fluorescent proteins that emit light of long wavelength include fragments 1 to 159 and fragment 160, which are cleaved between amino acid sequences 159 and 160 of the mCherry fluorescent protein. To 237 mCherry fluorescent protein fragments.
  • the assembly monomer usable in the present invention is a green fluorescent protein.
  • the assembly monomer of the green fluorescent protein can be described with reference to the contents of the method for producing the protein supramolecular assembly described above.
  • the assembly monomer of the green fluorescent protein used in the present invention is (i) a first split fragment comprising ⁇ strands 1-10 of Green fluorescent protein (GFP), and (ii) And a second split fragment comprising ⁇ strand 11 of GFP bound to the end of the first split fragment.
  • GFP Green fluorescent protein
  • ⁇ strands 1-10 included in the first split fragment of the assembly monomer include amino acid residues 1-214 in SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ strand 11 included in the second split fragment of the assembly monomer comprises amino acid residues 215-230 in SEQ ID NO: 1.
  • the second split fragment can be joined at various positions of the first split fragment. Specifically, the second split fragment is linked to the N-terminus or C-terminus of the first split fragment, more specifically to the N-terminus.
  • the second split fragment may be linked directly or indirectly (eg, using a peptide linker) to the first split fragment.
  • the second split fragment is bound to the first split fragment via a peptide linker.
  • the first split fragment is caused to cause a mutation so that the reduced net charge value, that is, the negative charge value is increased.
  • the strategy of increasing the negative charge value of the first split fragment may include Asp or Glu in part or all of the amino acid residues (especially positively charged amino acid residues) exposed on the surface in the tertiary structure of the first split fragment. Is replaced by a negatively charged amino acid residue of. More specifically, at least one positively charged amino acid residue selected from the group consisting of the positively charged amino acid residues Lys26, Lys41, Lys52, Lys158, Lys164, Asn149, and Asn198 in the sequence listing first sequence of the first split fragment is negatively charged. Mutation to the amino acid residue Glu or Asp. For example, at least one positively charged amino acid residue selected from the group consisting of Lys26, Lys41, Lys52, Lys158 and Lys164 can be mutated to Glu or Asn149 or Asn198 to Asp.
  • the mutated first split fragment has a net charge value of -5 to -15 at neutral pH.
  • Self-assembly of assembly monomers produces supramolecular assemblies of polydisperse distribution.
  • the term “supermolecular assembly of multidispersion distribution” refers to the population of supramolecular assemblies with varying degrees of multimerization, thereby providing supramolecular assemblies of various molecular weights.
  • supramolecular assemblies of the polydispersity distribution is accomplished through a self-assembly mechanism, so no special treatment is required.
  • assembly monomers in PBS solution or a plurality of assembly monomers expressed in cells form supramolecular assemblies through self-assembly.
  • a plurality of GFP assembly monomers are prepared in the cell by the self-assembly of the negatively charged polydisperse distribution supramolecular assembly.
  • the supramolecular assembly of the prepared polydispersion distribution is separated according to the size of the assembly.
  • Separation according to the size of the supramolecular assembly of the polydispersion distribution of the present invention can be carried out using the characteristics of the isoelectric point or molecular weight of the protein.
  • Examples of separation methods using isoelectric points include SDS-PAGE (Sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), 2D-polyacrylamide-gel electrophoresis (2nd-PAGE) (Giddings, JC, Unified Separation Science, John Wiley & Sons, New) York 1991, pp. 126-128.), Capillary isoelectric focusing (CIFE) (Conti, M.
  • the separation according to molecular weight includes, but is not limited to, flow field flow fractionation (FIFFF) and field flow fractionation (FFF) (JC Giddings, FJF Yang, MN Myers, Science , 193: 1976, 1244 (1976), MH Moon, PS Williams, H. Kwon, Anal., Chem . , 71 (14): 1999, 2657. (1999)).
  • FIFFF flow field flow fractionation
  • FFF field flow fractionation
  • the negatively charged polydisperse supramolecular assemblies are electrophoresed on a PAGE gel to separate into monodisperse supramolecular assemblies.
  • the GFP variants will have an evenly distributed negative charge, so that the supramolecular assemblies made by the GFP variants allow for isolation depending on size in the same manner as DNA.
  • Recovery of monodisperse supramolecular assemblies can be carried out according to various protein recovery methods known in the art.
  • the method for recovering monodisperse supramolecular assembly may be determined according to the separation method and characteristics of the supramolecular assembly.
  • the method for recovering supramolecular granules includes electro gel elution, using a filtration membrane, ion exchange chromatography, immunosorbent chromatography and dye affinity chromatography.
  • the recovery process will be described as follows:
  • the GFP monodisperse supramolecular assembly fluorescent band separated by electrophoresis is extracted using ultraviolet rays, and the horizontal Elution is carried out using a gel electrophoresis device to obtain the eluted fractions.
  • the present invention purifies the separated GFP monodisperse supramolecular assembly using an electrogel elution method, which is one of DNA purification methods.
  • Purification using the electrogel elution method of the present invention is carried out using a supramolecular assembly of GFP monodisperse distribution having a net charge of -9 in consideration of polymerization, solubility and gel separation of granules. The high charge of the assembly enables dissolution from the gel in the electric field.
  • the GFP monodisperse supramolecular assembly purified through this purification process was confirmed through polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and size exclusion chromatography (SEC) analysis, and completed the present invention.
  • PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • SEC size exclusion chromatography
  • the monodisperse supramolecular assembly purification method of the present invention is newly developed by the present inventors, and is very suitable for purifying a polydisperse supramolecular assembly into a monodisperse supramolecular assembly.
  • the present invention provides a technique for the fabrication and separation of green fluorescent protein nanopolygons, which are monodisperse supramolecular assemblies of functional proteins with very definite balance.
  • the present invention provides a technique for purifying negatively charged polydisperse protein supramolecular assemblies into monodisperse supramolecular assemblies.
  • FIG. 1A to 1D show cellular self-assembly of GFP polymer.
  • Figure 1a shows a schematic of the production of monodisperse GFP (nano) polygons. ⁇ strand 11 of GFP was linked to the N terminus of GFP 1-10 using a short peptide linker, and the resulting GFP monomer unit experienced self-assembly of the polygonal structure in the cell. Through supercharge introduction to the polygon surface, the GFP polygon mixture can be separated, and the series generation of monodisperse GFP polygons is separated depending on the number of GFP building blocks.
  • Figure 1b shows the results of SDS-PAGE analysis of the GFP polymer.
  • the mixture of polymers was applied to PAGE gels containing 0.1% SDS without boiling (lane 1) or with boiling (lane 2). Gels were analyzed by 470 nm-irradiation and 530 nm-luminescent filter (left) and Coomassie blue staining (right) and fluorescence image analyzer.
  • 1C shows the size exclusion chromatography (SEC) results of GFP polymer using a superdex 200 column (10/300 GL).
  • FIG. 1D shows the results of analysis on base-PAGE of charge variants of GFP polymers with net charges of ⁇ 3, ⁇ 5, ⁇ 7, ⁇ 9 and ⁇ 15. Improved solubility and gel separation of the polymer.
  • FIGS. 2A to 2C show results of size distribution analysis and visualization of monodisperse GFP polygons.
  • Figure 2a shows the results of the basal-PAGE analysis of purified GFP of dimers to demers. Gels were analyzed by fluorescence image analysis (top) and Coomassie blue staining (bottom).
  • Figure 2b shows the results of SEC analysis of monodisperse GFP polygons of dimers to dimers. The spectral absorbance (488 nm) shows the maximum peaks.
  • 2C shows representative TEM images and schematics of monodisperse GFP polygons. Scale bars, 20 nm
  • FIG. 3A to 3B show the design of charge variants of GFP monomers.
  • FIG. 3A shows Ribbon cartoon diagrams of charge variants of GFP monomers.
  • GFP strand 11 is blue. Substituted residues are red, and mutations are indicated by arrows.
  • 3B shows the protein sequence of GFP monomer with net charges of -5, -7, -9 and -15. Blue, GFP 11; Underlined, peptide linker; Red, mutated negative residues.
  • GFP polymers having a net charge of (a) -5, (b) -7, (c) -9 and (d) -15 were analyzed using a superdex 200 column (10 / 300GL).
  • GFP polymer pure charge-3
  • elution solution containing 100 nM-450 mM imidazole.
  • Samples unboiling
  • Gels were analyzed by 470 nm-irradiation and 530 nm-light filter and fluorescence image analyzer.
  • FIG. 6A to 6B show TEM images of partially purified green fluorescent protein (GFP) polygons with a net charge (-3).
  • FIG. 6A shows the results of partial purification of a mixture of GFP polygons (pure charge-3, wild type) using an electro-elution method and analysis by SDS-PAGE (without boiling).
  • 6B shows TEM images of fragment # 1 to fragment # 5 purified GFP polygons.
  • FIG. 7 shows the results of direct size measurements of monodisperse green fluorescent protein (GFP) polygons of dimers to tetramers based on TEM image results.
  • GFP green fluorescent protein
  • FIG. 8 shows the fluorescence emission spectrum results of di-, tri-, tetra-, penta- and hexamer of GFP polygons. Fluorescence emission profiles of GFP polygons having various oligomeric states (monomer constant concentrations) were monitored by 460 nm irradiation.
  • FIG. 9 shows representative TEM images of GFP polygons of dimers to dimers.
  • the structure of the polygons and the number of GFP building blocks of the purified GFP polygons were analyzed directly with TEM images.
  • GFP polymers with a linear open GFP array are indicated by red lines.
  • GFP polymers of polygons and (possibly) open linear GFP polymers were counted and listed in the table. a, 2mer b, 3mer c, 4mer d, 5mer e, 6mer f, 7mer g, 8mer h, 9mer I, 10mer, scale bars, 100 nm.
  • 10A-10D show multivalent displays of functional proteins in GFP polygons.
  • 10A shows a schematic of triangular GFP polymers located at the N- and C-terminus.
  • 10B shows the base-PAGE analysis of MBP, Protein G, and mCherry displayed polygons. Gels were analyzed by 470 nm-irradiation and 530 nm emission filters (left) and 625 nm-irradiation and 695 nm luminescence filters (right) and a fluorescence image analyzer.
  • Figure 10c shows the results of the basic-PAGE analysis of monodisperse protein G polygons of dimers to dimers.
  • 10D shows a schematic and TEM image of MBP polygons fused at the N- and C-terminus of dimers to dimers. MBP and GFP are indicated in gray and green, respectively. Scale bar, 10 nm.
  • 11A-11B show a multivalent display of functional MBP (maltose binding protein) proteins in GFP polygons.
  • 11A shows the results of purification by N- (lane 1 and lane 3) and C-terminal fused MBP polygons (lane 2 and lane 4), His-affinity purification or MBP affinity purification methods. Gels were analyzed by 470 nm-irradiation and 530 nm-emission filter and fluorescence image analyzer.
  • 11B shows the base-PAGE analysis of monodisperse N- and C-terminal fused MBP polygons.
  • 12A to 12F show the preparation and properties of linear GFP polymer.
  • 12A shows a schematic of a linear open GFP polymer structure.
  • CapGFP was designed to include connecting the N-terminus of His-taq and full-length GFP (1-11) to the GFP 11 strand.
  • CapGFP and GFP monomers (without His-taq) were co-expressed in cells and linear polymers were purified by His-affinity purification.
  • 12B shows the results of basic-PAGE analysis of linear and circular forms of GFP polymer.
  • Figure 12c shows the results of analysis of dimer to pentadecamer monodisperse linear polymer by base-PAGE.
  • 12D shows the assembly of GFP 1-10 fragments and linear GFP polymer in vitro .
  • FIGS. 13A-13B show the size distribution of green fluorescent protein (GFP) polygons on base-PAGE gels. Relative intensities of GFP polymer bands were analyzed with Image 4.1 software.
  • Figure 13a shows the linear form of the polymer.
  • Figure 13b shows the circular form of the polymer.
  • GFP polygons with in vitro GFP 1-10 fragments.
  • GFP polygons trimers, tetramers, and pentamers
  • reacted with more than GFP 1-10 and the resulting protein assemblies were analyzed on a base-PAGE gel.
  • FIG. 15A shows a schematic of multivalent interactions between surface-binding antibodies and Protein G polygons.
  • Multivalent protein G-polygons dimer-heptamer
  • monomeric protein G-GFP were applied to surface-bound antibodies.
  • 15B and 15C show the results of SPR response dissociation (180 seconds) and dissociation (320 seconds) of multivalent protein G polygons corresponding to human (b) or mouse (c) antibodies.
  • Content concentrations of protein G polygons (5 ⁇ g / ml human and 10 ⁇ g / mL mouse antibodies) were used to maintain a fixed concentration independent of the protein G unit of balance.
  • FIG. 15A shows a schematic of multivalent interactions between surface-binding antibodies and Protein G polygons.
  • Multivalent protein G-polygons dimer-heptamer
  • monomeric protein G-GFP were applied to surface-bound antibodies.
  • 15B and 15C show the results of SPR response dissociation (180 seconds) and dissociation (320 seconds) of
  • 15D shows a schematic of the interaction of surface bound antibodies with protein G polygons (mono-, di-, and trimers) or generally fused protein G (mono-, di-, and trimers) repeats.
  • 15E and 15F show the results of SPR response dissociation (180 seconds) and dissociation (320 seconds) of a typical fusion protein G repeat (e) or protein G polygon corresponding to a mouse antibody. All binding curves were normalized by subtracting the change in refractive index upon sample injection.
  • 15G shows the results of confocal microscopy analysis of enhanced internalization of antibody receptor clusters by protein G polygons. Erbitux labeled with Cy5 (EGFR targeting) was treated on A549 cells at 4 ° C. with or without Protein G nucleomers.
  • Cy5- Erbitux red
  • GFP protein G nucleomers
  • SPR response of multivalent protein G polygons that bind human Fc domains The SPR sensor chip surface was covered with recombinant human Fc domain (15000RU) and protein G-fused polygons were applied at constant monomer concentration (10 ⁇ g / mL). The binding curve was normalized by subtracting the change in refractive index upon sample injection.
  • FIG. 19 shows non-specific interactions of protein G polygons on cell surfaces.
  • A549 cells were treated with protein G polygon (10 ⁇ g / mL) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. Nuclei were stained with DAPI. Protein G polygons (green) and DAPI (blue) were monitored using confocal microscopy.
  • GFP monomer protein sequences are provided in the appendix information.
  • the mixture of GFP polymer was separated on a 6% base PAGE gel (HSI SG 600 Series, Hoefer Scientific Instruments, 16 ⁇ 18 cm). Electrophoresis was performed at 280 V for 150-180 minutes. After electrophoresis, the fluorescence band of the polymer was extracted by visualizing using UV light. The extracted gel was placed in a dialysis membrane (Spectrum Labs, MWCO 3500) and filled with electrode run buffer (25 mM Tris base, 192 mM glycine). The polymer was eluted from the gel at 100 V for 40 to 60 minutes using a horizontal gel electrophoresis device and performed at 4 ° C. with cold buffer.
  • Elution fractions containing protein polymer were obtained and added to a final concentration of 125 mM NaCl. Also for application, the eluted polymer was concentrated with polyethylene glycol (PEG) 8000. The polymer solution was placed in a dialysis membrane and placed in PEG 8000 powder. The polymer was generally concentrated to at least 0.5 mg / ml. If necessary, the polymer solution was further dialyzed with PBS.
  • PEG polyethylene glycol
  • GFP polymer was adsorbed onto the carbon grid and negatively stained with 75% uranyl formate.
  • the electron microscope used a 4K ⁇ 4K Eagle HS CCD camera (FEI) on a 120 kV Tecnai T120 microscope (FEI). Images were taken at a magnification of 67,000 ⁇ defocus setting ranging from -1.4 ⁇ m to ⁇ 1 ⁇ m.
  • the binding properties of the protein G polygons were analyzed by monitoring the ligation and separation steps for 180 and 320 seconds, respectively. After the measurement, the chip surface was regenerated by 10 ⁇ L injection of 10 mM NaOH to remove binding protein G polygons before the next measurement. The binding curve was normalized by subtracting the change in refractive index upon sample injection.
  • a monoclonal mouse IgG1 (Santa cruz SC-138) was used for CM5 sensor chip. Fixed at 3000 RU.
  • Both protein G constructs were surface treated at the same monomer (or monovalent) concentration (gene fusion protein G and 6 ⁇ g / ml of protein G polygon at 30 ⁇ g / ml) and at a flow rate of 30 ⁇ L / min.
  • A549 cells were treated with Cy5-Erbitux (10 ⁇ g / ml) at 4 ° C. for 30 minutes. Unbound Erbitux was washed and protein G polymer (10 ⁇ g / ml) was then treated at 4 ° C. for 30 minutes. Erbitux or Erbitux protein G binding cells alone were incubated at 37 ° C. for 30-150 minutes for initiation receptor internalization. Cells were then washed, fixed with 4% paraformaldehyde and fluorescence images were obtained using confocal microscopy (Carl Zeiss). To quantify the internalized Erbitux-EGF receptor clusters, cells bound with antibody or antibody-protein G were incubated at 37 ° C.
  • GFP green fluorescent protein
  • the present inventors utilized the previously developed 'superfolder' GFP system to construct functionally diverse and structurally clear protein supramolecular structures 20 , 21 .
  • ⁇ strand 11 of GFP (GFP 11, amino acids 215-230) is assembled by spontaneous cleavage of GFP 1-10 (GFP 1-10, amino acids 1-214) from a matured GFP form with fluorescence.
  • GFP 1-10 GFP 1-10, amino acids 1-214
  • These split fragments have unique peptide protein interactions that can be very helpful for protein self-assembly 22 . Since the interaction is non-covalent but nearly irreversible, it can withstand various environmental changes and even potential multistep situations during purification / separation, characterization to obtain protein assemblies.
  • FIG. 1A The strategy for cellular self-assembly of GFP polymer is shown schematically (FIG. 1A).
  • GFP 11 peptide was genetically linked to the N terminus of GFP 1-10 with a small peptide linker.
  • Peptide linkers were carefully designed to avoid intramolecular binding between GFP 11 and the same GFP monomer, GFP 1-10, which imparted intramolecular self-assembly.
  • the designed GFP monomer was well expressed in cells and successfully completed cell self-assembly with a wide range of GFP polymers (FIG. 1).
  • GFP linkers between GFP 1-10 and GFP 11 were studied in various lengths, stiffnesses, charges and sizes (Table 1 and FIG. 1). The length of the linker was a very important factor for cell self-assembly.
  • Flexible tripeptide (GGT) linkers provided maximal protein expression and polymerization while avoiding intramolecular GFP formation.
  • the resulting GFP polymer produced over 100 mg scale from 1 L of E. coli and was purified using nickel-affinity chromatography.
  • Protein sequence of GFP monomeric variants including other linkers Protein Protein sequence mGFP1.1 (His) 6 -GFP11-G-GFP 1-10 mGFP L2 (His) 6 -GFP11-GG-GFP 1-10 mGFP L3 (His) 6 -GFP11-GGT-GFP 1-10 mGFP L4 (His 6- GFP11-GGTG-GFP 1-10 mGFP L5 (His) 6 -GFP11-GGTGGS-GFP 1-10 mGFP L6 (His) 6 -GFP11-KKK-GFP 1-10 mGFP L7 (His) 6 -GFP11- GPPPPPGG-GFP 1-10 mGFP L8 (His) 6 -GFP11- ubiquin -GFP 1-10
  • the size distribution of the assembled GFP polymer was analyzed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) (FIG. 1B) and size exclusion chromatography (SEC).
  • the GFP polymer mixture was not cleanly separated by basic PAGE analysis because of the GFP low surface charge (net charge ⁇ 3).
  • the high stability of existing GFP assemblies eventually required unstable protein polymers to be incubated with SDS for a long time, allowing for PAGE analysis with the addition of denaturing detergent, sodium dodecyl sulfate (SDS), for size-dependent isolation. Multiple bands of large size GFP polymers were observed via detection, fluorescence imaging and coomassie blue staining after GFP monomer truncation denaturation (FIG. 1B).
  • GFP polymers Dimer morphology was clearly seen in the main product, GFP polymers in a wide range (between 56-230 kDa, corresponding to dimers to tetramers). We also observed GFP polymers with sizes greater than 230 kDa (> 10-mer). Based on PAGE and SEC data, GFP monomer, polymer molecular weight (trimer,> 112 kDa) expressed close to 50% was polymerized intracellularly.
  • the mutated amino acids were selected from residues that had previously been modified in supercharged GFPs 25 except 21 residues necessary for protein self-assembly.
  • Charge variants of the assembled GFP with different net charges were successfully polymerized in the form of negatively charged GFP polymers (FIGS. 1D and 4).
  • no significant aggregation was observed from the supercharged GFP polymer (-7, -13, -15) with a protein concentration of at least 5 mg / ml in PBS buffer (125 mM NaCl).
  • the negative charge increase of the GFP polymer resulted in smooth separation and monodisperse migration of the polymer depending on the polymer size in the base PAGE gel (no SDS).
  • Protein polymer separation observed at single protein unit resolution (dimer to deductor) at baseline was not possible with conventional chromatographic methods (FIGS. 1C, 4 and 5). It offers the possibility of size dependent separation, such as negative charge, DNA evenly distributed on the GFP polymer surface.
  • the fluorescent polymer bands were extracted with ultraviolet light without staining. Minimal potential damage to the structure and function of the assembly during protein labeling of fluorescent protein building blocks and simple visualization of the protein assembly within the base gel may be possible. Highly charged polymers eluted well from the gel in the electric field, and the eluted polymers could be concentrated (> 0.5 mg / ml) and stored stably in PBS. Purified GFP polymer was analyzed by base PAGE and SEC (FIGS. 2A and 2B). High purity (monodisperse) polymers of dimers to tetramers have been obtained in the state of maintaining the multimeric structure as well as the fluorescence properties. 15 mg (dimer- tetramer) in approximately 2.5 mg (monomer-trimer) of approximately pure polymer were made from 1 L E. coli culture.
  • the developed GFP polygons provide a powerful backbone scaffold for nano-precision and function-controlled tissue of functional proteins.
  • the function was performed by simple gene fusion of monomeric GFP units. Both N- and C-terminal fusion sites of the monomers are at the apex of the polygon and are well separated from the backbone GFPs (FIG. 10A).
  • Functionalized polygons can be purified into monodisperse groups by plotting by purification depending on the balance of protein G- (FIG. 10C) and MBP- (FIG. 11) labeled polygons.
  • the spatial organization of the proteins displayed on the backbone GFPs was examined by TEM analysis.
  • Relatively large MBPs, also with other forms of GFP, performed structural analysis.
  • TEM images of GFP polygons fused both the N- and C-terminus clearly display the correct polygon of MBP protein with MBP (FIG. 10D).
  • Multivalency interactions are inherently important strategies for achieving highly improved performance, as well as specific dynamic binding between biological systems 26 .
  • multi-balance multivalency
  • ligand display display
  • a variety of scaffolds chemically synthesized was developed 28-29, complete protein-based, and when precisely controlled balance (valency) monodisperse scaffold is a multi-balance when (multivalency) protein-developed for the study of protein interactions Should be done.
  • valency valency protein-functionalized polygons to provide experimental insight into avidity interactions between surface-bound antibodies and multivalency protein G (FIGS. 15 and 16).
  • Human FIG. 15B
  • mouse FIG.
  • Protein G was genetically fused with the multimeric protein G domain formed in a single chain (protein G repeat), and its surface-bound mouse antibody binding was compared to protein G polygons (FIG. 15D). Multiple binding domains of protein G repeats provided more stable interactions in surface antibodies (FIG. 15E). Interestingly, however, the dissociation slowed down by the increased balance was quite effective for protein G repeats (FIGS. 15E, 15F). The broader protein G domains in GFP polygons have a better chance of interacting with multi-surface antibodies, while protein G repeats will have more interaction with a single antibody.
  • multivalency protein G domains are statistically strong binding / recombination to surface antibodies, the correct orientation and spatial arrangement of these binding domains results in multivalency protein G-antibody interactions (multiple protein G and multiple In between).
  • This multivalency interaction is primarily responsible for the irreversible binding of protein G polygons to surface antibodies.
  • the result is enhanced interaction was statistically significant (protein G repeat) and a multi-protein (protein G polygon) coupled to 32, the experimental evidence for the relative contribution of 33 is further multi-balance when (multivalency), the affinity enhanced by the interaction to provide.
  • A549 cells human lung adenocarcinoma
  • Erbitux anti-EGFR monoclonal human antibody
  • multivalency protein G polygon 4 ° C.
  • Cells were then incubated at 37 ° C. to initiate receptor internalization and cell distribution of Erbitux (red) and Protein G polygons (green) was monitored by confocal microscopy (FIG. 15G).
  • the rate of Erbitux internalization was significantly increased by protein G (6mer). Internalization of Erbitux clustered by Protein G nucleomers was observed within 30 minutes, but single Erbitux was slowly internalized within 150 minutes.

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Abstract

본 발명은 (a) (i) 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein: GFP)의 β 가닥 1-10을 포함하는 제1 스플리트 단편(a first split fragment), 및 (ii) 상기 제1 스플리트 단편(a first split fragment)의 말단에 결합된 GFP의 β 가닥 11을 포함하는 제2 스플리트 단편(a second split fragment)을 포함하는 복수의(plural) 조립체 모노머(assembly monomer)를 제조하는 단계; 그리고 (b) 상기 복수의 조립체 모노머의 자기-조립(self-assembly)을 실시하여 초분자 조립체를 제조하는 단계를 포함하는 초분자 조립체(supramolecular assembly)의 제조방법, 그리고 단백질을 초분자 조립체 상에 전시(display)하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 (a) 조립체 모노머의 순전하(net charge)를 감소시켜 음전하 값이 증가되도록 변이(mutation) 시키는 단계; (b) 상기 조립체 모노머의 복수의 자기-조립(self-assembly)을 실시하여 음전하를 띄는 다분산 분포의 초분자 조립체를 제조하는 단계; (c) 상기 다분산 분포의 초분자 조립체를 조립체의 크기에 따라 분리하는 단계; 그리고 (d) 상기 분리된 단분산 초분자 조립체를 회수하는 단계를 포함하는 다분산 분포의 초분자 조립체를 단분산 초분자 조립체로 정제하는 방법에 관한 것이다.

Description

단백질 초분자 조립체의 제조방법
본 발명은 단백질 초분자 조립체(protein supramolecular assembly)의 제조방법, 단백질을 초분자 조립체 상에 전시(display)하는 방법 그리고 초분자 조립체를 제조하기 위한 조립체 모노머(assembly monomer)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 다분산 분포의 초분자 조립체를 단분산 초분자 조립체로 정제하는 방법에 관한 것이다.
생체 분자는 분자 정밀도와 새로운 나노 구조 설계에 매우 매력적인 빌딩 블록이다. DNA 접기로 알려진 특정 염기쌍을 통한 DNA 자기 조립은 특이적으로 프로그래밍된 나노구조물의 배열 생성을 허용한다1 , 2. 반면에, 단백질 나노 조립체의 정밀한 설계는 그것의 기능성이 제한되지 않았음에도 불구하고 단백질의 구조적 복잡성 때문에 많이 도전되고 있다3 - 5. 기능적 단백질의 공간 조직은 다양하지만, 매우 명확한 나노 구조는 단백질 나노 기술의 핵심 목표이다. 몇 연구는 컴퓨터를 사용하여 설계한 원자 수준의 정확도를 가지는 다중체 단백질 서브유닛의 대칭 조립이 보고되고 있지만, 사용 가능한 구조는 여전히 제한적이며 기능이 제현되지 않고 있다6-8.
단백질 조립체의 집단(다가)속성을 완전하게 이해하고 이용하기 위해서, 단백질 빌딩 블록의 개수 또한 정밀하게 제어되어야한다. 이러한 의미에서, 단백질 조립체는 단백질 모노머의 수를 전체적으로 변화한 단백질 폴리머를 제공하고, 단순 분산 집단을 준비할 필요가 있다. 몇 개의 정교한 조립 전략은 격자를 균일하게 하기 위해 단백질 와이어와 링으로부터 다양한 구조를 형성하는 인공 초분자 단백질 폴리머의 구조에 대한 것이 보고되어있다.9-13
이 단백질 폴리머는 금속 이온 단백질, 효소 억제제, 단백질 펩타이드 및 단백질 보조 인자 (cofactor)의 상호작용10 -14, 또는 화학 / 효소 결합을15 -18 포함하는 분자 인식의 형태로 다양하게 조립된다. 그러나, 현재의 전략은 올리고머 상태에서 다분산 분포를 가지는 단백질 조립를 생산하는 것이다. 균일한 단백질 폴리머의 제작은 초분자 단백질 조립의 깊이있는 이해 및 적용을 위한 필수적인 단계가 될 것이며, 단백질 단분산 또한 새로운 단백질 나노 조립의 정확한 구조 정보를 얻는데 큰 기회를 제공할 것이다19.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 인용문헌 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 문헌 및 특허의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 거대분자 단백질 조립체를 효율적으로 얻을 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 거대분자 단백질 조립체를 제조하기 위한 신규한 전략을 수립하고 이에 필요한 조립체 모노머를 새롭게 디자인하고, 이로부터 제조된 거대분자 단백질 조립체가 한정된(defined) 거대분자 단백질 조립체를 제공할 뿐만 아니라 상기 거대분자 단백질 조립체 상에 전시(display)하고자 하는 단백질을 나노정밀도 및 밸런시(valency)-조절된 패턴으로 전시할 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 단백질 초분자 조립체(protein supramolecular assembly)의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 단백질을 초분자 조립체 상에 전시(display)하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 초분자 조립체를 제조하기 위한 조립체 모노머(assembly monomer)를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 다분산 분포의 초분자 조립체를 단분산 초분자 조립체로 정제하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구 범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 단백질 초분자 조립체(protein supramolecular assembly)의 제조방법을 제공한다:
(a) (i) 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein: GFP)의 β 가닥 1-10을 포함하는 제1 스플리트 단편(a first split fragment), 및 (ii) 상기 제1 스플리트 단편(a first split fragment)의 말단에 결합된 GFP의 β 가닥 11을 포함하는 제2 스플리트 단편(a second split fragment)을 포함하는 복수의(plural) 조립체 모노머(assembly monomer)를 제조하는 단계; 그리고
(b) 상기 복수의 조립체 모노머의 자기-조립(self-assembly)을 실시하여 단백질 초분자 조립체를 제조하는 단계.
본 발명자들은 거대분자 단백질 조립체를 효율적으로 얻을 수 있는 방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 본 발명자들은 거대분자 단백질 조립체를 제조하기 위한 신규한 전략을 수립하고 이에 필요한 조립체 모노머를 새롭게 디자인하고, 이로부터 제조된 거대분자 단백질 조립체가 한정된(defined) 거대분자 단백질 조립체를 제공할 뿐만 아니라 상기 거대분자 단백질 조립체 상에 전시(display)하고자 하는 단백질을 나노정밀도 및 밸런시(valency)-조절된 패턴으로 전시할 수 있음을 규명하였다.
본 발명에서, 발명자들은 다양한 기능성 단백질의 공간적으로 정밀하고 원자 제어 표명이 허용된 매우 명확한 폴리곤 구조(도 1a)를 가지는 단분산 단백질 폴리머 세트의 첫 번째 예를 보고한다. 녹색 형광 단백질(GFP)은 세포내 번역(translation)을 통해 자기 조립하고, 다양한 크기의 GFP 폴리머 혼합물을 제작하기 위해 설계되었다. 이러한 GFP 폴리머의 단백질 응집 (큰 인공 단백질 조립의 주 문제점)은 GFP 표면 음전하의 체계적인 도입을 통해 예방하였다. 더 중요한 것은, 이 GFP 초전하들이 단분산 GFP 폴리머의 DNA 겔 형상 기반 정제를 가능하게 하고, GFP 폴리머의 폴리곤 배열은 투과 전자 현미경 (TEM)에 의해 가시화하였다(도. 1a). 더욱이 이러한 GFP (나노) 폴리곤, 선형 개방 GFP 폴리머는 세포의 GFP 조립체를 수정하여 구성하였다. 적색 형광 단백질, 말토오스 결합 단백질 및 항체 결합 단백질 G 와 같은 여러 기능성 단백질은 성공적으로 간단한 유전자 융합에 의해 GFP 폴리곤으로 보여졌다. 단백질은 명확한 방향과 단백질 유닛 수를 가지는 폴리곤 모형안에 정확하게 위치하였다. G 단백질-기능성 폴리곤을 사용함으로써, 본 발명자는 멀티밸런트(multivalent) 단백질 상호작용이 결합 단백질의 밸런시(valency) 뿐만 아니라 나노공간 배열에 중요한 영향을 받는다는 것을 발견하였다. 더욱이, 단백질 G 폴리곤의 단분산 세트는 세포 표면의 항체 - 매개 EGF (상피 세포 성장 인자)의 수용체 무리의 레벨을 제어하기 위해 사용되었다.
본 발명의 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 조립체 모노머(assembly monomer)의 제조
본 발명에 따르면, 우선 (i) 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein: GFP)의 β 가닥 1-10을 포함하는 제1 스플리트 단편(a first split fragment), 및 (ii) 상기 제1 스플리트 단편(a first split fragment)의 말단에 결합된 GFP의 β 가닥 11을 포함하는 제2 스플리트 단편(a second split fragment)을 포함하는 복수의(plural) 조립체 모노머(assembly monomer)를 제조한다.
본 발명에서 이용되는 조립체 모노머는 본 발명자들에 의해 새롭게 개발된 것으로서, 거대분자 단백질 조립체를 제조하는데 매우 적합하다.
GFP는 총 11개의 β 가닥을 포함한다. 구체적으로 GFP는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다.
조립체 모노머의 제1 스플리트 단편에 포함되는 β 가닥 1-10은 서열목록 제1서열에서 아미노산 잔기 1-214를 포함한다. 조립체 모노머의 제2 스플리트 단편에 포함되는 β 가닥 11은 서열목록 제1서열에서 아미노산 잔기 215-230을 포함한다.
자연계에서 존재하는 GFP에는 β 가닥 1-11이 연속적으로 결합되어 있으나, 본 발명에서는 β 가닥 1-10과 β 가닥 11을 분할(split)하여 이용한다.
제2 스플리트 단편은 제1 스플리트 단편의 다양한 위치에 결합될 수 있다. 구체적으로, 제2 스플리트 단편은 제1 스플리트 단편의 N-말단 또는 C-말단, 보다 구체적으로 N-말단에 결합되어 있다.
제2 스플리트 단편은 제1 스플리트 단편에 직접 또는 간접적으로(예컨대, 펩타이드 링커를 이용하여) 결합될 수 있다.
구체적으로, 제2 스플리트 단편은 제1 스플리트 단편에 펩타이드 링커를 통하여 결합된다. 이 펩타이드 링커는, 본 발명의 조립체 모노머가 조립체를 형성하는데 어느 정도 영향을 미치기 때문에 적합한 링커를 선택한다. 예를 들어, 상기 펩타이드 링커의 길이, 강성, 전하 및/또는 크기를 최적화 하여, 적합한 펩타이드 링커를 선택함으로써, 분자내(intramolecular) GFP 형성을 피하면서 최대한의 단백질 발현 및 중합을 제공하도록 한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명에 적합한 펩타이드 링커는, 아미노산 잔기 2-10 길이(보다 구체적으로, 2-6 길이)의 중성 아미노산(보다 구체적으로, Gly, Ser, Ala, Thr 또는 이들 4가지 아미노산의 조합)으로 구성된 것이다. 본 발명에 적합한 펩타이드 링커의 예는, "Gly-Gly-Ser", "Gly-Gly", "Gly-Gly-Thr" 및 "Gly-Gly-Thr-Gly"을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 스플리트 단편은 감소된 순전하(net charge) 값을 나타내어 음전하 값이 증가되도록 변이된(mutated) 것이다. 이와 같이 음전하 값이 증가하도록 하는 것은, 모노머 단백질 조립을 실시하였을 때, 비가역적으로 응집체를 형성하는 것을 억제하기 위한 것이다. 구체적으로, 제1 스플리트 단편의 음전하 값을 증가하도록 하는 전략은, 제1 스플리트 단편의 3차 구조에서 표면에 노출된 아미노산 잔기(특히, 양전하된 아미노산 잔기) 중에서 일부 또는 전부를 Asp 또는 Glu의 음전하성 아미노산 잔기로 대체하는 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제1 스플리트 단편의 서열목록 제1서열에서 양전하성 아미노산 잔기인 Lys26, Lys41, Lys52, Lys158, Lys164, Asn149 및 Asn198으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 양전하성 아미노산 잔기를 음전하성 아미노산 잔기 Glu 또는 Asp로 변이시킨다. 예컨대, Lys26, Lys41, Lys52, Lys158 및 Lys164으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 양전하성 아미노산 잔기를 Glu로 변이시킬 수 있고 또는 Asn149 또는 Asn198를 Asp로 변이시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 변이된 제1 스플리트 단편은 중성 pH에서 -5 ~ -15의 순전하(net charge) 값을 갖는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 단계 (a)는 조립체 모노머를 코딩하는 핵산분자 포함된 벡터를 포함하는 세포에서 상기 조립체 모노머를 발현시켜 실시한다.
본 발명에서 이용될 수 있는 벡터는 당업계에 공지된 다양한 발현벡터를 포함한다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pL λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann. Rev. Genet., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다. 한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET 등), 파지(예: λgt4·λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 그로부터 발현되는 조립체 모노머의 정제를 용이하게 하기 위하여, 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은 예컨대, 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG (IBI, USA) 및 6x His (hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 정제를 위한 추가적인 서열 때문에, 숙주에서 발현된 단백질은 친화성 크로마토그래피를 통하여 신속하고, 용이하게 정제된다.
본 발명의 구현예에 따르면, 상기 융합 서열이 포함되어 있는 벡터에 의해 발현된 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예컨대, 글루타티온-S-트랜스퍼라제가 융합된 경우에는 이 효소의 기질인 글루타티온을 이용할 수 있고, 6x His이 이용된 경우에는 Ni-NTA His-결합 레진 컬럼을 이용하여 소망하는 퍼옥시레독신 단백질을 신속하고 용이하게 얻을 수 있다.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 세포는 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
숙주 세포 내로 주입된 벡터는 숙주 세포 내에서 발현될 수 있으며, 이러한 경우에는 다량의 단백질을 얻게 된다. 예를 들어, 상기 발현 벡터가 lac 프로모터를 포함하는 경우에는 숙주 세포에 IPTG를 처리하여 유전자 발현을 유도할 수 있다.
단계 (b): 조립체 모노머의 자기-조립에 의한 단백질 초분자 조립체의 형성
이어, 상기 제조된 복수의 조립체 모노머들을 자기-조립(self-assembly)화 하여 단백질 초분자 조립체를 형성시킨다.
본 발명에 있어서, 단백질 초분자 조립체의 형성은 자기-조립 기전을 통하여 이루어지기 때문에, 특별한 처치가 필요없다. 예를 들어, PBS 용액에 있는 복수의 조립체 모노머들 또는 세포 내에서 발현된 복수의 조립체 모노머들은 자기-조립을 통해 단백질 초분자 조립체를 형성한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)는 단계 (a)에서 발현된 조립체 모노머를 상기 세포에서 자기-조립하여 실시한다.
이렇게 하여 제조된 초분자 조립체는, 예컨대 조립체 모노머가 2-10개가 결합된 초분자 조립체이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 제조된 초분자 조립체는 폐쇄 (closed) 구조의 폴리곤(polygon) 형태를 갖는다.
택일적으로, 단계 (b)에서 제조된 초분자 조립체는 오픈(opend) 구조의 선형 형태를 가질 수 있다. 이 경우, 단계 (a)에서 GFP β 가닥 1-12를 포함하는 성숙 GFP(mature GFP)에 GFP 11이 결합된 캡GFP(CapGFP)를 제조하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계 (b)는 상기 조립체 모노머 및 캡GFP를 이용하여 자기-조립을 통해 실시하며 상기 최종적으로 제조된 초분자 조립체는 오픈(opend) 구조의 선형 형태를 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 단백질을 단백질 초분자 조립체 상에 전시(display)하는 방법을 제공한다:
(a) (i) 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein: GFP)의 β 가닥 1-10을 포함하는 제1 스플리트 단편(a first split fragment) 및 (ii) 상기 제1 스플리트 단편(a first split fragment)의 말단에 결합된 GFP의 β 가닥 11을 포함하는 제2 스플리트 단편(a second split fragment)을 포함하는 복수의(plural) 조립체 모노머(assembly monomer), 그리고 (iii) 상기 조립체 모노머의 제1 스플리트 단편에 결합된 전시 대상의 단백질을 제조하는 단계; 그리고
(b) 상기 복수의 조립체 모노머의 자기-조립(self-assembly)을 실시하여 단백질 초분자 조립체 상에 단백질을 전시하는 단계.
본 발명의 전시 방법은 상술한 초분자 조립체의 제조방법을 기본적으로 따르기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 제조되는 단백질 초분자 조립체는 전시 대상의 단백질을 나노수준의 정밀도로 밸런시-조절된(valency-controlled) 정열이 가능한 백본 스캐폴드 역할을 할 수 있다(참조: 실시예).
본 발명에서, 전시 대상의 단백질은 제1 스플리트 단편에 결합되어 있으며, 조립체 모노머의 제1 스플리트의 N-말단 또는 C-말단에 결합되어 있다.
본 발명에서 이용 가능한 전시 대상의 단백질은, 예를 들어, 형광 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 효소, 효소저해제, 신호전달단백질 또는 그 일부분, 항체 또는 그 일부분, 단쇄항체, 결합단백질 또는 그 결합도메인, 항원, 부착단백질, 구조단백질, 조절단백질, 독소단백질, 사이토카인, 전사조절 인자, 혈액 응고 인자 및 식물 생체방어 유도 단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예컨대, 본 발명에서 이용 가능한 전시 대상의 단백질은, 말토오스 결합 단백질, 적색 형광 단백질 및 단백질 G를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein: GFP) 또는 적색 형광 단백질(Red fluorescent protein: RFP)의 β 가닥 1-10을 포함하는 제1 스플리트 단편(a first split fragment), 및 (ii) 상기 제1 스플리트 단편(a first split fragment)의 말단에 결합된 GFP 또는 RFP의 β 가닥 11을 포함하는 제2 스플리트 단편(a second split fragment)을 포함하는 초분자 조립체를 제조하기 위한 조립체 모노머(assembly monomer)를 제공한다.
본 발명의 조립체 모노머는 상술한 초분자 조립체의 제조방법에서 이용되는 것이기 때문에, 위에서 설명한 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 제2 스플리트 단편은 상기 제1 스플리트 단편에 펩타이드 링커를 통하여 결합되어 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 펩타이드 링커는 아미노산 잔기 2-10 길이의 중성 아미노산으로 구성된 것이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 스플리트 단편은 감소된 총 전하 값을 나타내어 음전하 값이 증가되도록 변이된(mutated) 것이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 변이된 제1 스플리트 단편은 중성 pH에서 -5 ~ -15의 순전하 값을 갖는다.
이러한 GFP 폴리머의 단백질 응집(큰 인공 단백질 조립의 주 문제점)은 GFP 표면 음전하의 체계적인 도입을 통해 예방하였다
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 다분산 분포의 초분자 조립체를 단분산 초분자 조립체로 정제하는 방법을 제공한다:
(a) 조립체 모노머의 순전하(net charge)를 감소시켜 음전하 값이 증가되도록 조립체 모노머를 변이(mutation) 시키는 단계;
(b) 상기 조립체 모노머의 복수의 자기-조립(self-assembly)을 실시하여 음전하를 띄는 다분산 분포의 초분자 조립체를 제조하는 단계;
(c) 상기 다분산 분포의 초분자 조립체를 조립체의 크기에 따라 분리하는 단계; 그리고
(d) 상기 분리된 단분산 초분자 조립체를 회수하는 단계.
본 발명의 정제 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 변이된 조립체 모노머의 준비
본 발명에 따르면, 우선 조립체 모노머의 순전하(net charge)를 감소시켜 음전하 값이 증가되도록 조립체 모노머를 변이(mutation) 시킨다.
본 명세서에서, 용어 "조립체 모노머"는 자가-조립에 의해 초분자 조립체를 형성시킬 수 있는 어떤 단백질 단위체(any protein monomer)를 의미한다. 예를 들어, 본 발명에서 이용되는 조립체 모노머는 이분자 형광 상보 분석(biomolecular protein fluorescence complementation)이 가능한 자가-조립능을 갖는 단백질을 포함한다. 이분자 형광 상보 분석은 형광 단백질을 두 개의 단편으로 나누었을 때, 두 개의 단편이 멀리 떨어져 있을 때에는 형광을 내지 않다가 가까이 오게 되면 상호 결합하여 온전한 형광 단백질 복합체를 형성함으로써 형광을 내는 현상을 이용한 것이다. 이러한 분리 단백질-기반 수용체 시스템은 인 비보 및 인 비트로에서 다양한 단백질-단백질 상호작용을 모니터하기 위해 널리 사용되어 왔다.
본 발명에서 사용 가능한 대표적인 조립체 모노머는 자가-조립능을 갖는 형광 단백질을 포함하며, 구체적으로 녹색 형광 단백질(GFP), 황색 형광 단백질(YFP) 및 적색 형광 단백질(RFP)을 포함한다.
예를 들어 녹색 형광 단백질(GFP) β 가닥을 절단한 형태인 GFP 단편 11 및 1-10, 황색 형광 단백질을 아미노산 155에서 절단한 형태의 단편 YN155 및 YC155, 황색 형광 단백질의 변종인 비너스(Venus) 단백질을 아미노산 155 또는 아미노산 173에서 절단한 VN155와 VC155 또는 VN173과 VC173 단편, 장파장의 빛을 방출하는 적색 형광 단백질로는 mCherry 형광 단백질의 아미노산 서열 159 및 160 사이에서 절단한 단편 1 내지 159 및 단편 160 내지 237의 mCherry 형광 단백질 단편을 포함한다.
가장 구체적으로, 본 발명에서 사용 가능한 조립체 모노머는 녹색 형광 단백질이다. 녹색 형광 단백질의 조립체 모노머는, 상술한 단백질 초분자 조립체의 제조방법의 내용을 참고하여 설명될 수 있다.
본 발명에서 이용되는 녹색 형광 단백질의 조립체 모노머는 (i) 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein: GFP)의 β 가닥 1-10을 포함하는 제1 스플리트 단편(a first split fragment), 및 (ii) 상기 제1 스플리트 단편(a first split fragment)의 말단에 결합된 GFP의 β 가닥 11을 포함하는 제2 스플리트 단편(a second split fragment)을 포함한다.
조립체 모노머의 제1 스플리트 단편에 포함되는 β 가닥 1-10은 서열목록 제1서열에서 아미노산 잔기 1-214를 포함한다. 조립체 모노머의 제2 스플리트 단편에 포함되는 β 가닥 11은 서열목록 제1서열에서 아미노산 잔기 215-230을 포함한다.
제2 스플리트 단편은 제1 스플리트 단편의 다양한 위치에 결합될 수 있다. 구체적으로, 제2 스플리트 단편은 제1 스플리트 단편의 N-말단 또는 C-말단, 보다 구체적으로 N-말단에 결합되어 있다.
제2 스플리트 단편은 제1 스플리트 단편에 직접 또는 간접적으로(예컨대, 펩타이드 링커를 이용하여) 결합될 수 있다.
구체적으로, 제2 스플리트 단편은 제1 스플리트 단편에 펩타이드 링커를 통하여 결합된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 제1 스플리트 단편에 변이(mutation)를 유발하여 감소된 순전하(net charge) 값, 즉 음전하 값이 증가되도록 변이를 유발시킨다.
구체적으로, 제1 스플리트 단편의 음전하 값을 증가하도록 하는 전략은, 제1 스플리트 단편의 3차 구조에서 표면에 노출된 아미노산 잔기(특히, 양전하된 아미노산 잔기) 중에서 일부 또는 전부를 Asp 또는 Glu의 음전하성 아미노산 잔기로 대체하는 것이다. 보다 구체적으로, 제1 스플리트 단편의 서열목록 제1서열에서 양전하성 아미노산 잔기인 Lys26, Lys41, Lys52, Lys158, Lys164, Asn149 및 Asn198으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 양전하성 아미노산 잔기를 음전하성 아미노산 잔기 Glu 또는 Asp로 변이시킨다. 예컨대, Lys26, Lys41, Lys52, Lys158 및 Lys164으로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 하나의 양전하성 아미노산 잔기를 Glu로 변이시킬 수 있고 또는 Asn149 또는 Asn198를 Asp로 변이시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 변이된 제1 스플리트 단편은 중성 pH에서 -5 ~ -15의 순전하(net charge) 값을 갖는다.
단계 (b): 다분산 분포의 초분자 조립체 제조
이어, 상기 조립체 모노머의 복수의 자기-조립을 실시하여, 음전하를 띄는 다분산 분포의 초분자 조립체를 제조한다.
조립체 모노머의 자기-조립에 의해 다분산 분포의 초분자 조립체가 제조된다. 본 명세서에서, 용어 "다분산 분포의 초분자 조립체"는 멀티머화(multimerization) 정도가 다양한 초분자 조립체의 파퓰레이션(population)을 의미하며, 이에 의해 다양한 분자량의 초분자 조립체가 제공된다.
본 발명에 있어서 다분산 분포의 초분자 조립체 형성은 자기-조립 기전을 통하여 이루어지기 때문에 특별한 처치가 필요 없다. 예를 들어, PBS 용액에 있는 조립체 모노머들 또는 세포 내에서 발현된 복수의 조립체 모노머들은 자기-조립을 통해 초분자 조립체를 형성한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 복수의 GFP 조립체 모노머를 세포에서 자기-조립을 통해 음전하를 띄는 다분산 분포의 초분자 조립체를 제조한다.
단계 (c): 다분산 분포의 초분자 조립체 분리 단계
그런 다음, 상기 제조된 다분산 분포의 초분자 조립체를 조립체의 크기에 따라 분리한다.
본 발명의 상기 다분산 분포의 초분자 조립체의 크기에 따른 분리는 단백질의 등전점(isoelectric point) 또는 분자량의 특성을 이용하여 실시할 수 있다. 등전점을 이용한 분리 방법의 예는, SDS-PAGE(Sodium dodecylsulfate - polyacrylamide gel electrophoresis), 이차원-폴리아크릴아마이드-겔 전기영동법(2nd-PAGE)(Giddings, J. C., Unified Separation Science, John Wiley & Sons, New York 1991, pp. 126-128.), 모세관등전집중(capillary isoelectric focusing, CIFE)(Conti, M. et al., Electrophoresis, 17:1485-1491(1996)), 등전집중(IEF)(Quigley, W.C.; Dovichi, N. J. Anal. Chem.,76:4645-4658(2000)) 모세관 역상 액체 크로마토그래피(reverse phase liquid chromatography, RPLC) 및 모세관등전집중-역상 액체 크로마토그래피(CIEF-RPLC)(Chen, J., Lee, C. S., Shen, Y., Smith, R. D., Baehrecke, E. H., Electrophoresis , 23:3143-3148(2002)), 모세관겔전기영동법(capillary gel electrophoresis, CGE) 및 모세관등전집중-모세관겔전기영동(CIEF-CGE)(Yang, C.l Liu, H., Yang, Q., Zhang, L., Zhang, W., Zhang Y. Anal., Chem. , 75:215-218(2003))을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 한편, 분자량에 따른 분리는, 흐름장-흐름분획(flow field flow fractionation, FIFFF)법 및 장-흐름분획(field flow fractionation, FFF)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다(J. C. Giddings, F.J.F. Yang, M. N. Myers, Science, 193: 1976, 1244(1976), M. H. Moon, P.S. Williams, H. Kwon, Anal., Chem ., 71(14): 1999, 2657.(1999)).
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 음전하를 띄는 다분산 분포의 초분자 조립체를 PAGE 겔에서 전기영동하여 단분산 초분자 조립체로 분리한다. 상술한 GFP의 변이 구현예에서, GFP 변이체는 균등하게 분산된 음전하를 갖게 되며, 따라서 GFP 변이체에 의해 제조된 초분자 조립체는 DNA와 같은 방식의 크기에 의존한 분리를 가능하게 한다.
단계 (d): 단분산 초분자 조립체 회수 단계
최종적으로, 분리된 단분산 초분자 조립체를 회수한다.
단분산 초분자 조립체의 회수는 당업계에 공지된 다양한 단백질 회수 방법에 따라 실시할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 단분산 초분자 조립체를 회수하는 방법은 초분자 조립체의 분리 방법 및 특성에 따라 결정될 수 있다. 초분자 조립체의 회수방법은, 전기겔용출법(electro gel elution), 여과막 이용, 이온 교환 크로마토그래피, 면역흡착 크로마토그래피 및 염료 친화성 크로마토그래피을 포함한다.
GFP 조립체의 구현예를 참조하여, 회수 과정을 설명하면 다음과 같다: 본 발명의 일 구현예에 따르면, 전기영동 과정을 통해 분리된 GFP 단분산 초분자 조립체 형광밴드를 자외선을 사용하여 적출하고, 수평 겔 전기영동 장치를 사용하여 용출시키고 용출된 분획을 수득한다. 본 발명은 DNA 정제 방법 중에 하나인 전기겔용출법을 이용하여 상기 분리된 GFP 단분산 초분자 조립체를 정제한다. 본 발명의 전기겔용출법을 이용한 정제는 중합, 용해성 및 조립체의 겔 분리를 고려하여 순전하 -9를 가지는 GFP 단분산 분포의 초분자 조립체를 이용하여 실시한다. 상기 조립체의 높은 전하는 전기적 전계내 겔로부터의 용출이 가능하게 한다.
상기 이러한 정제 과정을 통해 정제된 GFP 단분산 초분자 조립체는 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동(PAGE) 및 크기 배재 크로마토그래피(SEC) 분석을 통해 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 단분산 초분자 조립체 정제 방법은 본 발명자들에 의해 새롭게 개발된 것으로서, 다분산 분포의 초분자 조립체를 단분산 초분자 조립체로 정제하는데 매우 적합하다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 매우 명확한 밸런시(valency)를 가지는 기능 단백질의 단분산 초분자 조립체인 녹색 형광 단백질 나노폴리건의 제작 및 분리 기술을 제공한다.
(b) 본 발명의 다중 단백질 조립체의 제작 및 분리 기술은 세포내 단백질간의 상호작용, 면역반응 및 바이러스 감염과 같은 생물학적 연구에 유용하게 이용될 수 있다.
(c) 본 발명은 음전하를 띄는 다분산 분포의 단백질 초분자 조립체를 단분산 초분자 조립체로 정제하는 기술을 제공한다.
도 1에 도 1a 내지 도 1d는 GFP 폴리머의 세포 자기 조립을 보여준다. 도 1a는 단분산 GFP(나노)폴리곤의 제조 모식도를 보여준다. GFP의 β 가닥 11을 짧은 펩타이드 링커를 사용하여 GFP 1-10의 N 말단에 연결하였고, 생성된 GFP 모노머 유닛은 세포에서 폴리곤 구조의 자기 조립을 경험하였다. 폴리곤 표면에 초전하 도입을 통해, GFP 폴리곤 혼합물을 분리 할 수 있고, 단분산 GFP 폴리곤의 시리즈 생성은 GFP 빌딩 블록의 수에 의존하여 분리된다. 도 1b는 GFP 폴리머의 SDS-PAGE 분석한 결과를 보여준다. 폴리머의 혼합물을 boiling 하지 않은(레인 1) 또는 boiling 한(레인 2) 0.1% SDS가 포함된 PAGE 겔에 적용하였다. 겔을 470 nm-조사 및 530 nm-발광 필터(왼쪽) 및 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색(오른쪽)과 형광 화상 분석기로 분석하였다. 도 1c는 superdex 200 컬럼(10/300 GL)를 사용한 GFP 폴리머의 크기 배제 크로마토 그래피(SEC) 결과를 보여준다. 도 1d는 -3, -5, -7, -9 및 -15의 순전하를 가지는 GFP 폴리머의 전하 변이체의 기본-PAGE에 분석한 결과를 보여준다. 폴리머의 향상된 용해성 및 겔 분리를 나타낸다.
도 2에 도 2a 내지 도 2c는 단분산 GFP 폴리곤의 크기 분포 분석 및 가시화한 결과를 보여준다. 도 2a는 이량체~십량체의 정제된 GFP의 기본-PAGE 분석 결과를 보여준다. 겔은 형광 이미지 분석(위) 및 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색(아래)으로 분석하였다. 도 2b는 이량체~십량체의 단분산 GFP 폴리곤의 SEC 분석 결과를 보여준다. 스펙트럼 흡광도(488 nm)는 최대 피크(peaks)를 나타낸다. 도 2c는 단분산 GFP 폴리곤의 대표적인 TEM 이미지와 개략도를 보여준다. 눈금자(scale bars), 20 nm
도 3에 도 3a 내지 도 3b는 GFP 모노머의 전하 변이체의 설계를 보여준다. 도 3a는 GFP 모노머의 전하 변이체의 리본 카툰 도해(Ribbon cartoon diagrams)를 나타낸다. GFP 가닥 11은 파란색. 치환된 나머지는 빨강, 및 변이는 화살표로 표시하였다. 도 3b는 -5, -7, -9 및 -15의 순 전하를 가지는 GFP 모노머의 단백질 서열을 나타낸다. 파란색, GFP 11; 밑줄, 펩타이드 링커; 빨간색, 변이된 네가티브 잔기.
도 4는 GFP 폴리머 전하 변이체의 SEC 분석 결과를 보여준다. (a)-5, (b)-7, (c)-9 및 (d)-15의 순전하를 가지는 GFP 폴리머를 superdex 200 컬럼(10/300GL)을 사용하여 분석하였다.
도 5는 친화성 크로마토그래피에 의한 GFP의 부분적 정제 결과를 보여준다. GFP 폴리머(순전하 -3)는 100 nM ~ 450 mM 이미다졸을 포함한 용출 용액을 가지는 Ni-채널 컬럼을부터 용출하였다. 시료(boiling 하지 않은)는 SDA-PAGE로 분석하였다. 겔은 470 nm-조사 및 530 nm-발광필터와 형광 이미지 분석기로 분석하였다.
도 6에 도 6a 내지 도6b는 순 전하(-3)을 가지는 부분적으로 정제된 녹색 형광 단백질(GFP) 폴리곤들의 TEM 이미지를 나타낸다. 도 6a는 GFP 폴리곤(순전하 -3, wild type)의 혼합물을 전기-용출 방법을 사용하여 부분적으로 정제하고, SDS-PAGE(boiling 없이)로 분석한 결과이다. 도 6b는 단편 #1 ~ 단편 #5 정제된 GFP 폴리곤의 TEM 이미지를 보여준다.
도 7은 TEM 이미지 결과를 기초로 한 이량체~십량체의 단분산 녹색 형광 단백질(GFP) 폴리곤들의 직접적인 크기 측정 결과를 보여준다.
도 8은 GFP 폴리곤의 di-, tri-, tetra-, penta- 및 핵사머(hexamer)의 형광 방출 스펙트럼 결과를 보여준다. 다양한 올리고메릭 상태를 가지는(모노머 상수 농도) GFP 폴리곤의 형광 방출 프로필(profiles)은 460 nm 조사하여 모니터링하였다.
도 9는 이량체~십량체의 GFP 폴리곤의 대표적인 TEM 이미지를 보여준다. 폴리곤의 구조 및 정제된 GFP 폴리곤의 GFP 빌딩 블록의 수를 TEM 이미지를 가지고 직접적으로 분석하였다. 선형 개방 GFP 배열을 가진 GFP 폴리머는 빨간선으로 표시하였다. 폴리곤의 GFP 폴리머 및 (가능한)개방 선형 GFP 폴리머를 카운팅하여 표에 기재하였다. a, 2mer b, 3mer c, 4mer d, 5mer e, 6mer f, 7mer g, 8mer h, 9mer I, 10mer, 눈금자(scale bars), 100 nm.
도 10에 도 10a 내지 도 10d는 GFP 폴리곤에 기능성 단백질의 멀티밸런트 전시(multivalent display)를 보여준다. 도 10a는 N- 및 C- 말단에 위치하는 삼각(triangular) GFP 폴리머의 개략도를 보여준다. 도 10b는 MBP, 단백질 G, 및 mCherry 전시된(displayed) 폴리곤의 기본-PAGE 분석 결과를 보여준다. 겔을 470 nm-조사 및 530 nm 방출 필터(왼쪽) 및 625 nm-조사 및 695 nm 발광 필터(오른쪽)와 형광 화상 분석기로 분석하였다. 도 10c는 이량체~십량체의 단분산 단백질 G 폴리곤의 기본-PAGE 분석 결과를 보여준다. 도 10d는 이량체~십량체의 N- 및 C- 말단에 융합된 MBP 폴리곤의 개략도 및 TEM 이미지를 보여준다. MBP 및 GFP는 회색 및 녹색으로 각각 표시하였다. 눈금자(scale bar), 10 nm.
도 11에 도 11a 내지 도 11b는 GFP 폴리곤에 기능적 MBP(말토오즈 결합 단백질)단백질의 멀티밸런트 전시(multivalent display)를 보여준다. 도 11a는 N-(레인 1 및 레인 3) 및 C-말단 융합된 MBP 폴리곤(레인 2 및 레인 4), His-친화성 정제 또는 MBP 친화성 정제 방법에 의해 정제한 결과를 보여준다. 겔은 470 nm-조사 및 530 nm-방출 필터와 형광 이미지 분석기로 분석하였다. 도 11b는 단분산 N- 및 C- 말단 융합된 MBP 폴리곤의 기본-PAGE 분석 결과를 보여준다.
도 12에 도 12a 내지 도 12f는 선형 GFP 폴리머의 제조 및 특성을 나타낸다. 도 12a는 선형 개방 GFP 폴리머 구조의 개략도를 보여준다. CapGFP는 GFP 11 가닥에 His-taq과 전장(full-length) GFP(1-11)의 N 말단을 연결한 것을 포함하도록 설계하였다. CapGFP 및 GFP 모노머(His-taq 없는)는 세포에서 공동 발현하고, 선형 폴리머는 His-친화성 정제에 의해 정제하였다. 도 12b는 GFP 폴리머의 선형 및 원형 형태의 기본-PAGE 분석 결과를 보여준다. 도 12c는 기본-PAGE에 의한 이량체~십오량체(pentadecamer) 단분산 선형 폴리머의 분석 결과를 보여준다. 도 12d는 인 비트로 GFP 1~10 단편과 선형 GFP 폴리머의 조립체를 나타낸다. 선형 GFP 삼량체, 사량체 및 오량체는 GFP 1~10에 초과하여 반응하고, 생성된 단백질 조립체는 기본-PAGE 겔에서 분석하였다. 도 12e는 선형 GFP 삼량체의 TEM 이미지를 보여준다. 도 12f는 MBP-전시된(displayed) 선형 GFP 삼량체의 TEM 이미지와 개략도를 보여준다, 눈금자(scale bars), 10 nm.
도 13에 도 13a 내지 도 13b는 기본-PAGE 겔 상에 녹색 형광 단백질(GFP) 폴리곤의 크기 분포를 보여준다. GFP 폴리머 밴드의 상대 강도는 이미지 4.1 소프트웨어로 분석하였다. 도 13a, 폴리머의 선형 형태를 보여준다. 도 13b, 폴리머의 원형 형태를 보여준다.
도 14는 인 비트로 GFP 1~10 단편을 가진 GFP 폴리곤의 조립체를 나타낸다. GFP 폴리곤(삼량체, 사량체, 및 오량체)은 GFP 1-10 초과와 반응하였고, 생성된 단백질 조립체는 기본-PAGE 겔로 분석하였다.
도 15에 도 15a 내지 도 15h는 단백질 G-기능화된 GFP 폴리곤의 멀티밸런트(multivalent) 상호작용 및 세포의 응용을 보여준다. 도 15a는 표면-결합 항체 및 단백질 G 폴리곤 사이의 멀티밸런트(multivalent) 상호작용 모식도를 보여준다. 멀티밸런트(multivalent) 단백질 G-폴리곤(이량체~칠량체(heptamer)) 및 모노메릭 단백질 G-GFP를 표면-결합 항체에 응용하였다. 도 15b 및 도 15c는 인간(b) 또는 생쥐(c) 항체에 대응하는 멀티밸런트(multivalent) 단백질 G 폴리곤의 SPR 반응 해리(180초) 및 해리(320초) 결과를 보여준다. 단백질 G 폴리곤의 함량 농도(5 ㎍/㎖ 인간 및 10 ㎍/mL 마우스 항체)는 밸런시(valency)의 단백질 G 유닛(unit)에 무관한 고정 농도를 유지하기 위해 사용하였다. 도 15d는 단백질 G 폴리곤(mono-, di-, 및 trimers) 또는 일반적으로 융합된 단백질 G(mono-, di-, 및 trimers) 반복과 표면 결합 항체의 상호작용 모식도를 보여준다. 도 15e 및 도 15f는 생쥐 항체에 대응하는 일반적인 융합 단백질 G 반복 (e) 또는 단백질 G 폴리곤의 SPR 반응 해리(180초) 및 해리(320초) 결과를 보여준다. 모든 결합 곡선은 시료 주입시 굴절률 변화를 감산하여 규격화하였다. 도 15g는 단백질 G 폴리곤에 의한 항체 수용체 클러스터(clusters)의 향상된 내부화의 공초점 현미경 분석 결과를 보여준다. Cy5에 표지된 얼비툭스(EGFR 타겟팅)는 단백질 G 핵사머 없이 또는 함께 4 ℃에서 A549 세포에 처리하였다. 37℃로 온도 변경 후, 수용체 내부화는 상이한 시점에서 단백질 G 핵사머(GFP) 뿐만 아니라 얼비툭스(Cy5)을 이미지화하여 모니터링링하였다. Cy5-얼비툭스, 빨강; 단백질 G-핵사머, 녹색 h, 항체-매개 수용체 내부화의 유동 세포 계측법 분석. A549 세포에 Cy5에-얼비툭스와 후에 다양한 밸런시를 가진 단백질 G 폴리곤를 처리하였다. Cy5에-얼비툭스의 내부화 레벨은 유동 세포 계측법에 의해 정량화 하였다.
도 16. 표면 결합 항체에 단백질 G-융합된 GFP 폴리곤의 특이적 상호작용. SPR 센서 칩 표면을 생쥐 IgG(4000R), 및 GFP 폴리곤(폴리곤 3mer 및 7mer)으로 덮고, 단백질 G-융합된 GFP 폴리곤(단백질 G 3mer 및 7mer)을 상수 모노머 농도(10 ㅅg/mL)로 적용하였다. 결합 곡선은 시료 주입시 굴절률 변화를 감산하여 규격화하였다.
도 17. 인간 Fc 도메인과 결합하는 멀티밸런트(multivalent) 단백질 G 폴리곤의 SPR 반응. SPR 센서 칩 표면을 재조합 인간 Fc 도메인(15000RU)으로 덮고, 단백질 G-융합된 폴리곤을 상수 모노머 농도(10 ㎍/mL)로 적용하였다. 결합 곡선은 시료 주입시 굴절률 변화를 감산하여 규격화하였다.
도 18. 다양한 밸런시(valency)를 가지는 단백질 G 폴리곤에 의한 항체-수용체 클러스터(clusters)의 내부화에 대한 공초점 현미경 분석. A549 세포에 다양한 밸런시 또는 프리 단백질 G(10 ㎍/mL)와 Cy5-얼비툭스(10 ㎍/mL) 및 단백질 G-융합된 GFP 폴리곤(10 ㎍/mL)을 순차적으로 처리하였다. 얼리툭스 단독 또는 얼비툭스-단백질 G 결합된 세포는 37℃에서 30분 동안 배양하였고, 수용체 내부화는 공초점 현미경으로 모니터링하였다. Cy5-얼리툭스, 레드; 단백질 G-폴리곤, 녹색.
도 19는 세포 표면상에 단백질 G 폴리곤의 비 특이적 상호작용을 나타낸다. A549세포에 단백질 G 폴리곤(10 ㎍/mL)을 처리하고, 37℃에서 30분 동안 배양하였다. 핵은 DAPI로 염색하였다. 단백질 G 폴리곤(녹색) 및 DAPI(파란색)은 공초점 현미경을 사용하여 모니터링하였다.
도 20은 항체-매개 수용체 내부화 180분 후 유동 세포 계측 분석 결과를 보여준다. 얼비툭스 또는 얼비툭스-단백질 G 결합 세포를 37℃에서 180분 동안 배양하였다. Cy5-얼비툭스 내부화는 유동 세포로 정량화하였고, 형광 강도는 세포 분석법 프로파일 결과로 나타내었다.
이하, 본 발명의 일부 실시예들을 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다.
실시예
실험 방법
녹색 형광 단백질(GFP) 폴리머의 발현 및 정제
다양한 GFP 모노머를 코딩하는 유전자를 pET-28A(Novagen) 발현 벡터에 클로닝 하였다. GFP 선형 폴리머의 설계를 위해서, CapGFP 및 GFP 모노머 두 유전자를 각각 유전자 발현 벡터 pACYDuet-1(Novagen)의 MCS1(다중 클로닝 부위 1) 및 MCS2에 클로닝 하였다. GFP 모노머 단백질 서열은 부록 정보에 제공된다. 벡터를 보유하는 대장균 BL21(DE3) 세포를 OD600 = 0.6이 될 때까지 37℃에서 증식시켰고, 단백질의 발현을 1 mM의 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시드(IPTG)로 유도한 다음 20℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 유도된 세포를 원심 분리하여 수집하고, 친화성 크로마토 그래피에 적합한 버퍼로 초음파 처리하여 용해시켰다. His6 태그된 GFP 폴리머는 니켈-NTA(Qiagen)을 사용하여 세포를 용해한 후 수용성 단백질 분획으로부터 정제하였다. 폴리머는 4℃에서 1-2 개월 동안 저장하였다. 폴리머 농도는 브래드 포드 및 BCA 분석을 통해 확인하였다. PAGE 겔에서 폴리머의 형광 이미지를 Chemi-DOC(바이오 라드)으로 획득하였다.
단분산 GFP 폴리머의 준비
GFP 폴리머의 혼합물은 6% 기본 PAGE 겔(HSI SG 600 Series, Hoefer Scientific Instruments, 16 × 18 cm)에서 분리하였다. 전기 영동은 280 V에서 150-180 분 동안 실시하였다. 전기 영동 후, 폴리머의 형광 밴드는 UV 광을 사용하여 기시화하여 적출하였다. 적출한 겔은 투석막(Spectrum Labs, MWCO 3500 )에 넣고 전극 실행 완충액(25 mM 트리스 염기, 192 mM의 글리신)으로 채웠다. 폴리머는 수평 겔 전기 영동 장치를 사용하여 40 내지 60 분동안 100 V로 겔로부터 용출시켰고, 냉각처리된 완충액으로 4 ℃에서 수행하였다. 단백질 폴리머를 포함하는 용출 분획을 수득하고, 최종 농도 125 mM NaCl이 되도록 첨가하였다. 또한, 적용을 위해, 용출된 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 8000에 의해 농축시켰다. 폴리머 용액을 투석막에 넣고 PEG 8000 분체에 올려 놓았다. 폴리머는 일반적으로 0.5 ㎎/㎖ 이상으로 농축시켰다. 필요한 경우, 추가적으로 폴리머 용액을 PBS로 투석하였다.
네거티브 염색(Negative stain) 전자 현미경
GFP 폴리머는 탄소 그리드에 흡착하고 네거티브하게 75%의 포름산 우라닐로 염색하였다. 전자 현미경은 120 kV의 Tecnai T120 현미경(FEI)에 4K × 4K Eagle HS CCD 카메라(FEI)를 사용하였다. 이미지는 -1.4 μm ~ -1 μm에 이르기까지 67,000 × 디 포커스 설정의 배율로 촬영하였다.
표면 플라즈몬 공명(Surface plasmon resonance) 분석
SPR 실험은 running 용액으로 PBS 완충액을 이용하고 덱스트란 금 CM5 칩 (GE Healthcare)를 사용하여 비아 코어 3000 기기로 실시하였다. 인간 면역 글로불린 G(IgG)(Sigma 12511, 2000 RU) 및 단일 클론 마우스의 IgG1(R & D system # 71903, 4000 RU)을 EDC / NHS 아민 결합을 사용하여 센서 칩에 고정하였다. 초과 반응 그룹은 1 M 에탄올 아민(PH 8.5)으로 차단하였다. 단백질 G 폴리곤은 30 μL/분의 유속으로 항체 - 결합 표면(5 ㎍/㎖ 인간 항체 및 10 ㎍/mL 마우스 항체)을 처리하였다. 단백질 G 폴리곤의 결합 특성은 각각 180, 320 초 동안 연결 및 분리 단계를 모니터링링하여 분석하였다. 측정 후에, 칩 표면은 다음 측정 전에 결합 단백질 G 폴리곤을 제거하기 위해 10 mM NaOH을 10 μL 주사하여 재생시켰다. 결합 곡선은 시료 주입시 굴절률 변화를 감산하여 규격화하였다. 유전적으로 융합된 단백질 G의 반복(mono-, di-, trivalent) 및 단백질 G 폴리곤(1, 2, 3 량체)을 비교 분석하기 위해, 단일 클론 마우스 IgG1(Santa cruz SC-138)을 CM5 센서 칩에 3000 RU로 고정하였다. 두 단백질 G 구조물은 동일한 모노머(또는 일가) 농도(유전자 융합 단백질 G와 30 ㎍/㎖의 단백질 G 폴리곤 6 ㎍/㎖), 30 μL /분의 유속으로 표면 처리하였다.
항체-매개성 수용체 내부화 분석
A549 세포는 4℃에서 30분 동안 Cy5-얼비툭스(Erbitux)(10 ㎍/㎖)를 처리하였다. 결합하지 않은 얼비툭스를 세정하고, 단백질 G 폴리머(10 ㎍/㎖)을 이어서 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 단독 얼비툭스 또는 얼비툭스 단백질 G 결합 세포는 개시 수용체 내부화를 위해 37℃에서 30 ~ 150 분동안 배양하였다. 그 후, 세포를 세척하고, 4% 파라포름알데히드로 고정하고, 형광 이미지는 공초점 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 수득하였다. 내부화된 얼비툭스-EGF 수용체 클러스터를 정량하기 위해서, 항체 또는 항체-단백질 G가 결합된 세포를 37℃에서 10분간 배양하고 전처리 냉각된 PBS로 세척하였다. 세포 표면-결합 항체는 4% 파라 포름알데히드로 고정하고 트립신 처리 한 후, 산 스트리핑(stripping) 과정을 통해 제거하였다. 내부화된-Cy5-얼비툭스는 유동 세포 계측법(BD Biosciences FACSAria)으로 분석하였다.
실험 결과
녹색 형광 단백질(GFP)의 세포 자기 조립
본 발명자는 기능적으로 다양하고 구조적으로 명확한 단백질 초분자 구조를 구축하기 위해, 이전에 개발된 'superfolder'GFP system을 활용하였다20 , 21. GFP의 β 가닥 11(GFP 11, 아미노산 215-230)은 형광을 가지는 성숙된 GFP 형태로부터 GFP 1-10(GFP 1-10, 아미노산 1-214)이 자발적으로 절단되어 조립된다. 이러한 분할 조각은 단백질 자기 조립에 매우 도움이 될 수 있는 독특한 펩타이드 단백질 상호 작용을 갖추고 있다22. 상호 작용은 비-공유이지만 거의 비가역적이기 때문에, 단백질 조립체를 수득하는 정제/분리, 특성화 중에 여러 환경 변화, 심지어 잠재적 다단계 상황을 견딜 수 있다. 또한, 이것의 완전한 단백질 기본 상호 작용은 리간드 또는 화학적/효소 반응 결합에 필수적인 작용 및 유전자 융합을 통해 다양한 작용을 위한 세포내에 단백질 조립을 허용할 것이다. GFP 자체의 고유 형광 신호와 이용가능한 구조 및 기능적 변이체는 매우 광범위하고 매력적인 빌딩 블록이다23,24.
GFP 폴리머의 세포 자기 조립에 대한 전략은 개략적으로(도 1a)에 표시하였다. 우리는 더 높은 세포 생산 및 기능성 단백질의 추가 설립을 위해 가능한 가장 작은 단위로 GFP 모노머를 조립할 수 있도록 설계하였다. GFP 11 펩타이드는 작은 펩타이드 링커로 GFP 1-10의 N 말단에 유전적으로 연결시켰다. 펩타이드 링커는 GFP 11 및 동일한 GFP 모노머, 분자내 자기 조립를 부여한 GFP 1 ~ 10 사이의 분자내 결합을 피해 주의깊게 설계하였다. 설계된 GFP 모노머는 세포에서 잘 발현되었고 광범위한 범위의 GFP 폴리머들로 세포 자기 조립을 성공적으로 이루어냈다(도 1). GFP 1-10 및 GFP 11 사이의 다른 펩타이드 링커는 다양한 길이, 강성, 전하 및 크기로 연구하였다(표 1 및 도 1). 링커의 길이는 세포 자기 조립을 위해 매우 중요한 요인이었다. 유연한 트리 펩타이드(GGT) 링커는 분자내 GFP 형성을 피하면서, 최대한의 단백질 발현 및 중합을 제공하였다. 얻어진 GFP 폴리머는 대장균 1L 로부터 100 mg 스케일 이상을 생산하였고 니켈-친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
다른 링커를 포함한 GFP 모노머 변이체의 단백질 서열
Protein Protein sequence
mGFP1.1 (His)6 -GFP11-G-GFP 1-10 mGFP L2 (His)6 -GFP11-GG-GFP 1-10 mGFP L3 (His)6 -GFP11-GGT-GFP 1-10 mGFP L4 (His)6 -GFP11-GGTG-GFP 1-10 mGFP L5 (His)6 -GFP11-GGTGGS-GFP 1-10 mGFP L6 (His)6 -GFP11-KKK-GFP 1-10 mGFP L7 (His)6 -GFP11-GPPPPPGG-GFP 1-10 mGFP L8 (His)6 -GFP11-ubiquin-GFP 1-10
조립된 GFP 폴리머의 크기 분포는 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(PAGE)(도 1b) 및 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 분석하였다. GFP 폴리머 혼합물은 GFP 낮은 표면 전하(순 전하 -3) 때문에 기본 PAGE 분석에 의해 깨끗하게 분리되지 않았다. 기존 GFP 조립체의 높은 안정성은, 그러나, 결국 불안정한 단백질 폴리머를 SDS와 함께 오랫동안 배양해야 하여, 크기-의존성 분리를 위해, 변성 세제, 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 첨가한 PAGE 분석을 허용하였다. 큰 사이즈 GFP 폴리머들의 다중 밴드는 GFP 모노머 잘림 변성 후에 검출, 형광 이미징 및 코마시 블루 염색을 통해 관찰하였다(도 1b). 이량체 형태는 주 결과물, GFP 폴리머는 넓은 범위(56-230 kDa 사이, 이량체 ~ 십량체에 대응되는)에서 분명하게 보여졌다. 또한 230 kDa의(> 십량체)보다 큰 크기를 갖는 GFP 폴리머를 관찰하였다. PAGE 및 SEC 데이터에 기초하여, 50%에 가깝게 발현된 GFP 모노머, 폴리머 분자량(> 112 kDa의, 삼량체(trimer))를 세포내에서 중합하였다.
인공 단백질 폴리머의 구조에서 발생하는 중요한 문제 중 하나는 특히 자연적 모노머 단백질 조립을 실시하였을 때, 비가역적으로 응집체를 형성하는 큰 단백질 조립체 경향이 나타나는 것이다. 여기서 정제된 GFP 폴리머는 고농도 염(1 ㎎ GFP 폴리머 안정화에 NaCl 500 mM 이상이 필수적임) 존재하에서 안정화하였다. 폴리머 용해도를 개선하기 위해서, 우리는 조립 가능한 GFP 유닛의 표면 전하를 설계하였다. 앞서, -30, -25, +36, 또는 +48의 전하를 띄는 다양한 초전하 GFP들은 단백질 응집에 대한 저항이 크게 증가된다는 것이 보고되어 있다25. GFP 모노머의 표면에 노출된 아미노산을 전체적으로 음전하된 아미노산 (Asp 또는 Glu)으로 대체하였다(도 2 및 표 2). 변이된 아미노산은 단백질 자기 조립을 위해 필수적인 잔기를21 제외한, 초음전하된 GFPs25내 종전에 변형되었던 잔기들로부터 선택하였다. 다른 순전하를 가지는 조립 GFP의 전하 변이체들(-5, -6 -13 또는 -15)은 성공적으로 음전하 GFP 폴리머 형태로 중합되었다(도 1D 및 도 4). 중요하게는, PBS 완충액(125 mM의 NaCl)내에서 5 ㎎/㎖ 이상의 단백질 농도를 가지는 초전하된 GFP 폴리머(-7, -13, -15)로부터 상당한 응집은 관찰되지 않았다.
GFP 모노머 전하 변이체들의 단백질 특징
Length(aa) Npos Nneg Ncharged Qnet
CpmGFP (wt) 252 28 31 50 -3CpmGFP (-5) 252 28 33 61 -5CpmGFP (-7) 252 27 34 61 -7CpmGFP (-9) 252 26 35 61 -9CpmGFP (-15) 252 24 39 63 -15
Npos, 양전하성 아미노산 수(Lys 및 Arg)
Nneg, 음전하성 아미노산 수(Glu 및 Asp)
Ncharged, 총 전하성 아미노산 수
Qnet, 이론상 중성 pH 순 전하
GFP 폴리머의 음전하 증가는 기본 PAGE 겔(SDS 없음)에서 폴리머 크기에 의존한 폴리머의 순조로운 분리 및 단분산 이동이 이루어졌다. 기본 상태에서 단일 단백질 단위 해상도(이량체 ~ 십량체)로 관찰된 단백질 폴리머 분리는 일반적인 크로마토그래피 방법으로는 불가능하였다(도 1c, 도 4 및 5). GFP 폴리머 표면에 균등하게 분산된 음전하, DNA와 같은, 크기에 의존한 분리에 가능성을 부여한다. 우리는 주 DNA 정제 방법 중에 하나인 전기겔용출 방법을 이용하여 개별 GFP 폴리머의 정제를 시도하였다. 중합, 용해성 및 폴리머의 겔 분리를 고려하여, -9 순 전하를 가지는 GFP 폴리머의 정제를 시도하였다. 전기 영동 후에, 형광 폴리머 밴드는 염색 과정 없이 자외선으로 적출하였다. 형광 단백질 빌딩 블록의 단백질 라벨링 동안 조립체의 구조 및 기능의 최소한의 잠재적 손상과, 기본 겔안에 단백질 조립체의 간단한 가시화가 가능할 수 있다. 높게 전하된 폴리머들은 전기적 전계내 겔로부터 잘 용출되었고, 용출된 폴리머들은 농축(0.5 ㎎/㎖ 이상) 할 수 있으며, PBS내에서 안정적으로 저장되었다. 정제된 GFP 폴리머는 기본 PAGE 및 SEC으로 분석하였다(도 2a 및 도 2b). 이량체 내지 십량체의 높은 순도(단분산) 폴리머는 형광 특성 뿐만 아니라 다량체 구조로 유지된 상태에서 수득되었다. 대략 순수한 폴리머 2.5 mg(모노머-십량체)에서 15 mg(이량체-사량체)이 1L 대장균 배양으로부터 제작되었다.
다음으로, 단분산 GFP 폴리머의 구조는 TEM을 사용하여 직접적으로 관찰하였다. GFP 폴리머의 각 모노머 유닛은 TEM 이미지로 명확하게 기시화하였다. 이량체 ~ 십량체 GFP 올리고머는 8-20 nm 범위내에 폭을 가지는 폴리곤 나노 구조로 견고하게 정열하였다(도 2C 및 도 6, 7). 폴리곤 구조는 마지막으로 조립된 GFP 1-10의 불안정한 GFP 1-10 단편이21 ,22 이동하는 것을 피하기 위해 처음 GFP 11 펩타이드에 의해 폐쇄되는 것을 나타낸다(도 1a). 실제로, GFP 폴리곤의 모든 모노머는 형광 활성이 있다(도 8). 또한 TEM 이미지는 우리의 GFP 폴리곤의 높은 단분산 특성을 보여준다. GFP 유닛의 정확한 수 및 엄격한 폴리곤 구조들의 2-, 3-, 4-, 및 5-량체 GFP 폴리머를 관찰하였다(도 9). 큰 GFP 폴리곤의 경우, GFP 폴리머의 약간 확장된 형태로 관찰되었다(6 mer, 2.8%; 7 mer, 4.6%; 8 mer, 4.5%; 9 mer, 5.8%; 10 mer, 9.5%). 이러한 결과를 종합하여, 우리는 정밀하게 제어된 올리고머 상태의 고차 단분산 단백질 나노 조립체의 수득을 보고한다.
한정된 GFP 폴리곤에 기능성 단백질의 멀티밸런트 전시(multivalent display)
개발된 GFP 폴리곤들은 나노 정밀도와 기능 단백질의 밸리시 조절된(valency-controlled) 조직을 위한 강력한 백본 스캐폴드를 제공한다. 기능은 모노머 GFP 유닛의 간단한 유전자 융합에 의해 수행되었다. 모노머의 N- 및 C- 말단 융합 사이트 둘다 폴리곤의 정점에 위치하고, 백본 GFPs로부터 잘 분리되었다 (도 10a). 우리는 작은 분자 결합 MBP(말토오스 결합 단백질, 44 KDa), 형광 mCherry(적색 형광 단백질, 25 KDa) 및 단백질 결합 단백질 G(항체 결합 단백질, 7 KDa)을 포함하는 다양한 기능 단백질도 도입했다. 모든 단백질들은 중합없이 GFP 폴리곤에 성공적으로 전시되었다(도 10b).
모든 MBP-전시된(displayed) 폴리곤은 잠재적으로 MBP의 큰 크기 때문에 약간 낮은 정도의 중합을 보였다. 모든 전시된 단백질은 그것의 결합 및 형광 기능을 유지하였다(도 10b 및 도 11).
기능화된 폴리곤들은 단백질 G-(도 10c) 및 MBP-(도 11) 표지된 폴리곤의 밸런시(valency)에 의존한 정제에 의해 도식화함으로서, 단분산된 군으로 정제할 수 있다. 백본 GFPs에 전시된(displayed) 단백질의 공간적 조직은 TEM 분석을 통해 실험하였다. 또한 GFP의 다른 형태을 갖는, 비교적 큰 MBP는, 구조적 분석을 수행하였다. GFP 폴리곤의 TEM 이미지들은 N- 및 C- 말단 둘다 명확하게 MBP 단백질의 정확한 폴리곤을 전시된(displayed) MBP와 융합하였다(도 10d).
선형 개방 GFP 폴리머의 설계
단백질 나노-조립 공정의 다양성은 나노 공간에서 기능성 단백질의 많은 공간적 조직에 매우 바람직하다. 염색된 GFP 폴리곤에 더하여, 우리는 선형 개방 또는 많은 릴렉스된 GFP 폴리머를 설계하였다. GFP 모노머는 블로킹 GFP 11 가닥이 성숙한 GFP(1-11)에 연결된 CapGFP와 공동 발현되었다(도 12a). 폴리곤 형태에 GFP 폴리머들의 순환으로부터 CapGFP의 연계로 차단되었고, 선형 GFP 폴리머의 개방형 형태가 생성되었다. 또한, CapGFPs는 His-Taq과 융합시키고, 선형 GFP 폴리머는 니켈 친화성 크로마토그래피에 의해 개폐(폴리곤) 형태의 혼합물로부터 정제하였다. 흥미롭게, 선형 GFP 폴리머는 폴리곤보다 더 많이 기본 겔로부터 뚜렷하게 분리되었다(도 12b). 더욱이, 큰 크기의 폴리머는 선형 형태로 더 우세하게 생산되었다(도 13). 결과적으로, 우리는 15mer의 단분산 선형 GFP 폴리머를 분리할 수 있었다(도 12c). 선형 조립 공정은 추가적으로 GFP 1-10 단편을 조립할 수 있는 폴리머의 한쪽에 미반응된 GFP 11 모노머 가닥이 남는다. 공동-발현된 GFP 폴리머들의 개방 선형 구조를 확인하기 위해, 우리는 검증하였다. 추가로 GFP 유닛 형태에서 GFP 1-10으로 부터 정제된 삼량체, 사량체, 및 오량체 조립체를 인 비트로 상에서 검증하였다(도 12d). 정제된 폴리머 밴드들은 조립에 의해 완전하게 이동하였지만, GFP 폴리곤들은 고순도의 선형 폴리머가 폐쇄 폴리곤 GFP 폴리머에서 자유롭게 나타나는 GFP1-10에 의해 영향을 받지 않았다(도 14). 개방 선형 폴리머의 GFP 배열의 정제된 삼량체는 TEM 이미지를 통해 가시화하였다. 선형 GFP 이량체에 융합된 MBP 단백질들의 무질서한 위치 또한 관찰되었다. 그러나, 더 높은 올리고머 상태(> 사량체)에 개방 폴리머들은 TEM 이미지에 폴리머의 매우 유연한 특성을 보여주는 어떠한 명확한 구조들도 보이지 않았다.
기능화된 GFP 폴리곤을 사용한 멀티밸런시(multivalency)의 연구
멀티밸런시(multivalency) 상호 작용은 생물학적 시스템26 사이에 특이적인 동적 결합 뿐만 아니라, 매우 향상된 성과를 달성하기 위해 본질적으로 중요한 전략이다. 멀티밸런시(multivalency) 연구 및 사용을 위해, 멀티밸런시(multivalency) 리간드 전시(display) 스캐폴드의 전체적인 설계는 필수적이다27 ,28. 다양하게 화학적으로 합성된 스캐폴드는 개발되었지만28 -29, 완전 단백질-기반 및 정밀하게 조절된 밸런시(valency) 단분산 스캐폴드는 멀티밸런시(multivalency) 단백질-단백질 상호작용의 연구를 위해 개발되어져야 한다. 여기에서 우리는 표면-결합 항체들과 멀티밸런시(multivalency) 단백질 G(도 15 및 도 16) 사이의 결합력 상호 작용에 대한 실험적인 통찰력을 제공하기 위해 우리의 단백질 G-기능화된 폴리곤을 사용하였다. 인간(도 15b) 및 생쥐(도 15c) 항체들은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 센서 칩에 고정하고, 정제된 단백질 G 폴리곤(일정한 모노머 농도)을 표면에 적용하였다. 단백질 G는 생쥐 항체보다 인간 항체에 더 강력하게 결합하였다. 단백질 G 모노머(1mer)에 결합한 센서그램은 두 항체의 상호 결합 친화성과 매우 연관성이 있었다. 폴리머 주입(초기 180 초) 동안에 단백질 G 폴리곤(2mer - 7mer)의 표면 결합은 단백질 G 밸런시(valency)가 증가됨에 따라 감소하였다 이와 같은 이유로 폴리곤 농도는 비례 상수 모노머 농도 밸런시(valency)에 대해 서서히 감소하였다. 인간 항체(또는 단백질 G - 결합 항체 단편, 도 16), 이량체 단백질 G(2mer) 항체 표면으로부터 무시해도 될 정도의 해리 (180초 - 500초)를 보여준다(도 15b). 생쥐 항체에 대해서는, 그러나, 세 개 이상이 표지된 단백질 G가 유사하게 느린 해리는 필수적이었다(도 15c). 해리 속도 상수(Koff)는 결합 속도 상수(Kon) 보다 단백질의 밸런시(valency)에 실질적으로 더 많은 영향을 끼쳤다. Kon 및 변화된 Koff 상수에 모의 결합 곡선은 우리의 실험 결과와 놀라운 유사성을 보여주었다. 예를 들어, 단백질 G 폴리곤의 1mer, 2mer, 및 4mer 에 생쥐 항체의 결합 곡선은 각각의 상수 Koff 10-1s-1, 10-3s-1 및 10-5s-1, Kon 0.5 ×105M-1s-1인 운동 결합 모형 특징과 거의 동일하였다.
우리는 다음으로 멀티밸런시(multivalency) 상호 작용에 결합 단백질의 공간적 배열의 영향을 연구하였다. 단백질 G는 단일 쇄(단백질 G 반복) 안에 반복 형성된 다량체 단백질 G 도메인과 유전적으로 융합하고, 그것의 표면-결합 생쥐 항체 결합은 단백질 G 폴리곤과 비교하였다(도 15d). 단백질 G 반복의 다중 결합 도메인은 표면 항체에서 보다 안정적인 상호작용을 제공했다(도 15e). 그러나 흥미롭게도, 증가된 밸런시(valency)의해 느려진 해리는 단백질 G 반복에 상당히 효과적이었다(도 15e, 15f). GFP 폴리곤에 더 광범위한 단백질 G 도메인은 다중 표면 항체와의 상호작용에 더 좋은 기회를 가지지만, 단백질 G 반복은 단일 항체와 더 많이 상호작용을 가질 것이다. 멀티밸런시(multivalency) 단백질 G 도메인이 표면 항체에 통계적으로 강한 결합 / 재결합을 하지만,이 결합 도메인의 올바른 방향과 공간 배열은 멀티밸런시(multivalency) 단백질 G-항체 상호작용(여러 단백질 G와 여러 항체 사이에)을 위해서 필수적이다. 이 멀티밸런시(multivalency) 상호 작용은 표면 항체에 단백질 G 폴리곤들의 돌이킬 수 없는 결합에 주된 책임이 있다. 그 결과는 통계학적으로 향상된 상호 작용(단백질 G 반복) 및 다중 단백질(단백질 G 폴리곤) 결합에32 ,33 의해 강화된 친화성이 추가적 멀티밸런시(multivalency) 상호작용의 상대적 기여도에 대한 실험적 증거를 제공한다.
세포 표면 수용체에 의한 세포의 소통은 매우 무겁게 멀티밸런시(multivalency) 리간드-수용체 상호작용에 의해 영향을 받는다28 , 34. 수용체의 리간드-유도 클러스터링은 세포 신호 전달 메카니즘 키(key) 중에 하나이고, 이에 다양한 멀티밸런시(multivalency) 리간드 시스템은 연구 및 세포적 조절 신호에 이용되어 왔다. 우리는 마지막으로 세포 표면에 표피 성장 인자 수용체(EGFR)의 항체-매개 클러스터링(clustering)을 제어하는 멀티밸런시(multivalency) 단백질 G 폴리곤을 이용하였다. 항체 약물(예: 얼비툭스(Erbitux)) 처리는 다운스트림(downstream) 신호의 활성 없이 수용체 내부화에 의해 매개되는 EGFR-다운 조절을 유도하는 것으로 알려져있다38. 몇 개의 보고서들은 EGFR 내부화의 속도가 수용체 글러스터의 크기에 의해 영향을 받음을 제안한다39 - 41. 우리는 항체-EGFR 클러스터(cluster)의 수준의 체계적인 조작 후에도 수용체 내부화가 가능 할 수 있는지 여부를 연구하였다. A549 세포(인간 폐 선암)는 염료(Cy5) 표지된 얼비툭스(Erbitux)(항-EGFR 단일 클론 인간 항체) 및 멀티밸런시(multivalency) 단백질 G 폴리곤을 4℃에서 순차적으로 처리하였다. 이어서, 세포들은 수용체 내부화를 개시하기 위해 37℃에서 배양하였고, 얼비툭스(Erbitux)(적색) 및 단백질 G 폴리곤(녹색)의 세포 분포는 공초점 현미경에 의해 모니터링 하였다(도 15g). 얼비툭스(Erbitux) 내부화의 속도는 단백질 G(6mer)에 의해 중요하게 증가하였다. 단백질 G 핵사머에 의해 클러스터된(clustered) 얼비툭스(Erbitux)의 내부화는 30분내에 관찰되었지만, 단일 얼비툭스는 150분 이내로 느리게 내부화 되었다. 내부화된 GFP 신호들은 내부화 후에 단백질 분해로 인한 가능성 때문에, 150분 이내에 사라졌다38. 유동 세포 측정 계측법은 얼비툭스의 세포내 축적이 단백질 G 폴리곤의 밸런시(valency)를 증가시키는 것으로 나타났다(도 15h). 얼비툭스 내부화는 단백질 G 폴리곤의 비특이적 결합이 세포 표면에서 관찰되지는 않더라도, 모노머 단백질 G에 의해 약간 강화되었다(도 18 및 19). 얼비툭스 축적은 단백질 G 폴리곤이 추가되지 않아도, 장기간 배양(3시간) 후에 포화되었다(도 20).
이러한 결과는 우리의 폴리곤 스캐폴드가 EGFR 항체-매개 클러스터링(clustering)을 조사하고 이러한 수용체 클러스터(clusters)의 내부화를 가속화 할 수 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (16)

  1. 다음 단계를 포함하는 단백질 초분자 조립체(protein supramolecular assembly)의 제조방법:
    (a) (i) 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein: GFP)의 β 가닥 1-10을 포함하는 제1 스플리트 단편(a first split fragment), 및 (ii) 상기 제1 스플리트 단편(a first split fragment)의 말단에 결합된 GFP의 β 가닥 11을 포함하는 제2 스플리트 단편(a second split fragment)을 포함하는 복수의(plural) 조립체 모노머(assembly monomer)를 제조하는 단계; 그리고
    (b) 상기 복수의 조립체 모노머의 자기-조립(self-assembly)을 실시하여 단백질 초분자 조립체를 제조하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 제2 스플리트 단편은 상기 제1 스플리트 단편의 N-말단에 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 제2 스플리트 단편은 상기 제1 스플리트 단편에 펩타이드 링커를 통하여 결합된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 스플리트 단편은 감소된 순전하(net charge) 값을 나타내어 음전하 값이 증가되도록 변이된(mutated) 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 변이된 제1 스플리트 단편은 중성 pH에서 -5 ~ -15의 순전하(net charge) 값을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 제조된 초분자 조립체는 폐쇄 (closed) 구조의 폴리곤(polygon) 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)에서 GFP β 가닥 1-12를 포함하는 성숙 GFP(mature GFP)에 GFP 11이 결합된 캡GFP(CapGFP)를 제조하는 단계를 추가적으로 포함하며, 상기 단계 (b)는 상기 조립체 모노머 및 캡GFP를 이용하여 자기-조립을 통해 실시하며 상기 최종적으로 제조된 초분자 조립체는 오픈(opend) 구조의 선형 형태를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 조립체 모노머를 코딩하는 핵산분자가 포함된 벡터를 포함하는 세포에서 상기 조립체 모노머를 발현시켜 실시하며, 상기 단계 (b)는 상기 단계 (a)에서 발현된 조립체 모노머를 상기 세포에서 자기-조립하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 다음 단계를 포함하는 단백질을 단백질 초분자 조립체 상에 전시(display)하는 방법:
    (a) (i) 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein: GFP)의 β 가닥 1-10을 포함하는 제1 스플리트 단편(a first split fragment) 및 (ii) 상기 제1 스플리트 단편(a first split fragment)의 말단에 결합된 GFP의 β 가닥 11을 포함하는 제2 스플리트 단편(a second split fragment)을 포함하는 복수의(plural) 조립체 모노머(assembly monomer), 그리고 (iii) 상기 조립체 모노머의 제1 스플리트 단편에 결합된 전시 대상의 단백질을 제조하는 단계; 그리고
    (b) 상기 복수의 조립체 모노머의 자기-조립(self-assembly)을 실시하여 단백질 초분자 조립체 상에 단백질을 전시하는 단계.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 전시 대상의 단백질은 상기 조립체 모노머의 제1 스플리트의 N-말단 또는 C-말단에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. (i) 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein: GFP)의 β 가닥 1-10을 포함하는 제1 스플리트 단편(a first split fragment), 및 (ii) 상기 제1 스플리트 단편(a first split fragment)의 말단에 결합된 GFP의 β 가닥 11을 포함하는 제2 스플리트 단편(a second split fragment)을 포함하는 단백질 초분자 조립체를 제조하기 위한 조립체 모노머(assembly monomer).
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 제2 스플리트 단편은 상기 제1 스플리트 단편에 펩타이드 링커를 통하여 결합된 것을 특징으로 하는 조립체 모노머.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 펩타이드 링커는 아미노산 잔기 2-10 길이의 중성 아미노산으로 구성된 것을 특징으로 하는 조립체 모노머.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 제1 스플리트 단편은 감소된 순전하(net charge) 값을 나타내어 음전하 값이 증가되도록 변이된(mutated) 것을 특징으로 하는 조립체 모노머.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 변이된 제1 스플리트 단편은 중성 pH에서 -5 ~ -15의 순전하(net charge) 값을 갖는 것을 특징으로 하는 조립체 모노머.
  16. 다음 단계를 포함하는 다분산 분포의 초분자 조립체를 단분산(monodisperse) 초분자 조립체로 정제하는 방법:
    (a) 조립체 모노머의 순전하(net charge)를 감소시켜 음전하 값이 증가되도록 조립체 모노머를 변이(mutation) 시키는 단계;
    (b) 상기 조립체 모노머의 복수의 자기-조립(self-assembly)을 실시하여 음전하를 띄는 다분산 분포의 초분자 조립체를 제조하는 단계;
    (c) 상기 다분산 분포의 초분자 조립체를 조립체의 크기에 따라 분리하는 단계; 그리고
    (d) 상기 분리된 단분산 초분자 조립체를 회수하는 단계.
PCT/KR2015/013668 2015-03-06 2015-12-14 단백질 초분자 조립체의 제조방법 WO2016143989A1 (ko)

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