WO2016136718A1 - 超解像蛍光イメージング用プローブ - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a novel super-resolution fluorescence imaging probe utilizing fluorescence emission characteristics by intermolecular nucleophilic addition-dissociation equilibrium reaction, and a super-resolution fluorescence imaging method using the probe.
  • the point image spreads to about half of the wavelength due to light diffraction, so the spatial resolution of the optical microscope is limited to the Abbe diffraction limit, and the two points located closer to the point image spread are separated. It has been considered impossible to image.
  • several super-resolution imaging techniques with a resolution exceeding the diffraction limit have been reported since the 1990s (for example, Non-Patent Document 1), and organisms that could not be observed by conventional methods when applied to living cells. The possibility of capturing scientific phenomena is expanding.
  • SMLM single-chain fluorescent dyes and fluorescent proteins are mainly used.
  • organic fluorescent dye in order to cause such a commercially available organic fluorescent dye to emit light stochastically, it is generally excited by a high-intensity laser of about 0.8 kW / cm 2 in the presence of thiol of about 10 to 100 mM. It is essential to create a long-lived non-fluorescent state such as a term, and such conditions are not suitable for imaging in living cells.
  • the present invention does not require an additive other than the probe compound, can omit the laser irradiation that was necessary to make the fluorescent probe non-fluorescent before data acquisition, and It is an object of the present invention to develop a fluorescent probe compound suitable for super-resolution fluorescence imaging that functions even with low-power laser irradiation, and to provide a super-resolution fluorescence imaging technique that can be applied to living cells. It is another object of the present invention to provide a multi-color super-resolution imaging technique that can be observed in the same visual field using such a fluorescent probe compound.
  • a -SH group-containing compound such as glutathione, which is a nucleophilic compound inherently present in living cells, pyronin and a pyronin-like skeleton ( Focusing on the intermolecular nucleophilic addition-dissociation equilibrium reaction with a fluorophore having a “pyronine skeleton”), and using light blinking as a principle of operation, it can be applied to living cells.
  • fluorescent probe molecules that enable super-resolution fluorescence imaging under conditions.
  • X represents an oxygen atom or C (R a ) (R b ) or Si (R a ) (R b ) (where R a and R b independently represent a hydrogen atom or an alkyl group)
  • R 1 represents a hydrogen atom or an optionally substituted aryl (provided that when R 1 is a phenyl group, it does not have a substituent at the 2-position or 6-position in the benzene ring of the phenyl group)
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an alkyl group that may be substituted, a sulfo group, a carboxyl group, an ester group, an amide group, and an azide group.
  • R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group, or N (R 4 ) (R 5 ) forms an amide group or a carbamate group (where R 4 Or when R 5 is an alkyl group, each together with R 2 may form a ring structure containing the nitrogen atom to which they are attached);
  • R 6 and R 7 each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted alkyl group, or N (R 6 ) (R 7 ) forms an amide group or a carbamate group (where R 6 Or when R 7 is an alkyl group, each may be taken together with R 3 to form a ring structure containing the nitrogen atom to which they are attached.
  • a probe for super-resolution fluorescence imaging containing a salt thereof The compound represented by the formula (I) or a salt thereof performs a nucleophilic addition-dissociation equilibrium reaction with a nucleophilic compound containing an —SH group, The super-resolution fluorescent imaging probe; (2) The super-resolution fluorescence imaging probe according to (1), wherein the nucleophilic addition-dissociation equilibrium reaction is performed on a carbon atom to which R 1 is bonded; (3) The super-resolution fluorescent imaging probe according to (1) or (2) above, wherein a dissociation constant in the nucleophilic addition-dissociation equilibrium reaction is in the range of 0.1 ⁇ M to 10 mM.
  • a nucleophilic addition reaction rate constant in the nucleophilic addition-dissociation equilibrium reaction is 1 to 1.0 ⁇ 10 6 s ⁇ 1 in an aqueous solution under neutral conditions,
  • R 1 is a hydrogen atom or an optionally substituted phenyl group (provided that the phenyl group has no substituent at the 2- or 6-position in the benzene ring),
  • a probe for super-resolution fluorescence imaging according to claim 1; (11) The super-resolution fluorescent imaging probe according to any one of (1) to (10), wherein the compound containing the —SH group is a compound having a cysteine residue; (12) The super-resolution fluorescent imaging probe according to any one of (1) to (10) above, wherein the compound containing the —SH group is glutathione; and (13) represented by formula (I): The super-resolution fluorescence imaging probe according to (1), wherein the compound to be selected is a compound selected from the following group: Is to provide.
  • the invention provides: (14) A super-resolution fluorescence imaging method using the super-resolution fluorescence imaging probe according to any one of (1) to (13) above, A probe molecule is bound to a biomolecule, and laser light is irradiated in the presence of a compound containing an —SH group to acquire image data obtained by photographing fluorescence emission from the probe molecule, and this is repeated at regular time intervals.
  • the method includes providing an ultrahigh resolution image of the biomolecule structure by analyzing and superimposing a plurality of the obtained image data.
  • the present invention uses a stochastic fluorescence emission principle based on an intermolecular equilibrium reaction between an intracellular substance such as glutathione and a probe molecule, so that it is not necessary to separately add a high concentration of thiol as in the conventional method.
  • Toxicity can be reduced.
  • by combining the fluorescent probe compound of the present invention it is possible to provide a multi-color super-resolution imaging technique that can be observed in the same visual field.
  • the probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention has a binding site (carboxyl group or the like) to a protein or the like in the molecule, it is suitable for labeling to a target protein or the like, It can be expected that it can be used for a wide range of research in living cell systems.
  • the super-resolution fluorescence imaging method based on the probe is considered to be a highly versatile technique because a commercially available microscope can be used as an optical system. In this way, it can be said that the basic utility of the developed probe has extremely high industrial utility value and economic effect.
  • FIG. 1 shows plots of absorption spectrum change (left), fluorescence spectrum change (center), and absorbance dependence of glutathione concentration (right figure) at each glutathione concentration of the compound 2 which is a probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention. It is shown.
  • FIG. 2 is a plot of absorption spectrum change (left), fluorescence spectrum change (center), and absorbance dependence of glutathione concentration (right figure) at each glutathione concentration of compound 5, which is a probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention. It is shown.
  • FIG. 1 shows plots of absorption spectrum change (left), fluorescence spectrum change (center), and absorbance dependence of glutathione concentration (right figure) at each glutathione concentration of compound 5, which is a probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention. It is shown.
  • FIG. 1 shows plots of absorption spectrum change (left), fluorescence spectrum change (center), and absorbance dependence of glutathione concentration (right figure) at each glut
  • FIG. 3 is a plot (right diagram) of the absorption spectrum change (left), fluorescence spectrum change (center), and absorbance dependence of glutathione concentration at each glutathione concentration of compound 12, which is the super-resolution fluorescence imaging probe of the present invention. It is shown.
  • FIG. 4 shows plots of absorption spectrum change (left), fluorescence spectrum change (middle), and absorbance dependence of glutathione concentration (right figure) at each glutathione concentration of compound 14, which is a probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention. It is shown.
  • FIG. 4 shows plots of absorption spectrum change (left), fluorescence spectrum change (middle), and absorbance dependence of glutathione concentration (right figure) at each glutathione concentration of compound 14, which is a probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention. It is shown.
  • FIG. 5 is a plot (right diagram) of the absorption spectrum change (left), fluorescence spectrum change (center), and absorbance dependence of glutathione concentration at each glutathione concentration of compound 16, which is the probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention. It is shown.
  • FIG. 6 is a plot of the glutathione concentration dependence of the absorption spectrum change (left), fluorescence spectrum change (center), absorbance, and fluorescence intensity at each glutathione concentration of compound 28, which is a super-resolution fluorescent imaging probe of the present invention (right). Figure).
  • FIG. 7 is a plot of the dependence of the absorption spectra and fluorescence intensity on the glutathione concentration at each glutathione concentration (left), fluorescence spectrum change (center), absorbance and fluorescence intensity of the compound 32 which is the probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention (right).
  • FIG. 8 shows the results of SMLM imaging of microtubules in fixed Vero cells using an antibody labeled with compound 17, which is a probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention.
  • the right figure in FIG. 8a is a super-resolution image by SMLM, and the left figure shows an averaged image of fluorescence intensity as a comparison.
  • FIG. 8a is a super-resolution image by SMLM
  • FIG. 8b is a cross-sectional profile of normalized fluorescence intensity in the strip region in the top view (scale bar: 3 ⁇ m) of the averaged image of FIG. 8a and the strip region in the top view (scale bar: 3 ⁇ m) of the super-resolution image. Shows a cross-sectional profile of the number of recognized bright spots in.
  • FIG. 8c is a cross-sectional profile of normalized fluorescence intensity in the in-frame region in the lower diagram (scale bar: 1 ⁇ m) of the averaged image of FIG. 8a and the in-frame region in the lower diagram of the super-resolution image (scale bar: 1 ⁇ m) Shows a cross-sectional profile of the number of recognized bright spots in.
  • FIG. 8c is a cross-sectional profile of normalized fluorescence intensity in the in-frame region in the lower diagram (scale bar: 1 ⁇ m) of the averaged image of FIG. 8a and the in-frame region in the lower diagram of the super-resolution image (scale bar:
  • FIG. 8d shows the frequency distribution of the position determination accuracy with respect to the bright spots constituting the upper diagram of the super-resolution image of FIG. 8a.
  • FIG. 9 shows the results of SMLM imaging of microtubules in fixed Vero cells using an antibody labeled with compound 33, which is a probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention.
  • the right figure in FIG. 9 is a super-resolution image by SMLM, and the left figure shows an averaged image of fluorescence intensity as a comparison.
  • FIG. 10 shows the results of SMLM imaging in two colors of microtubules and mitochondria in fixed Vero cells, obtained by using a combination of an antibody labeled with compound 17 and an antibody labeled with compound 33. Is.
  • the right figure in FIG. 10 is a super-resolution image by SMLM, and the left figure shows an averaged image of fluorescence intensity as a comparison.
  • halogen atom means a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, or an iodine atom.
  • alkyl may be any of an aliphatic hydrocarbon group composed of linear, branched, cyclic, or a combination thereof.
  • the number of carbon atoms of the alkyl group is not particularly limited, for example, 1 to 20 carbon atoms (C 1-20), having 3 to 15 carbon (C 3-15), having 5 to 10 carbon atoms (C 5-10 ). When the number of carbons is specified, it means “alkyl” having the number of carbons within the range.
  • C 1-8 alkyl includes methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, isopentyl, neo-pentyl, n-hexyl, isohexyl, n-heptyl, n-octyl and the like are included.
  • the alkyl group may have one or more arbitrary substituents.
  • substituents examples include, but are not limited to, an alkoxy group, a halogen atom, an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, and acyl.
  • alkyl group has two or more substituents, they may be the same or different.
  • alkyl part of other substituents containing an alkyl part for example, an alkoxy group, an arylalkyl group, etc.
  • a functional group when a functional group is defined as “may be substituted”, the type of substituent, the substitution position, and the number of substituents are not particularly limited, and two or more substitutions are made. If they have groups, they may be the same or different.
  • the substituent group include, but are not limited to, an alkyl group, an alkoxy group, a hydroxyl group, a carboxyl group, a halogen atom, a sulfo group, an amino group, an alkoxycarbonyl group, and an oxo group. These substituents may further have a substituent. Examples of such include, but are not limited to, a halogenated alkyl group, a dialkylamino group, and the like.
  • aryl may be either a monocyclic or condensed polycyclic aromatic hydrocarbon group, and a hetero atom (for example, an oxygen atom, a nitrogen atom, or a sulfur atom) as a ring constituent atom Etc.) may be an aromatic heterocyclic ring. In this case, it may be referred to as “heteroaryl” or “heteroaromatic”. Whether aryl is a single ring or a fused ring, it can be attached at all possible positions.
  • Non-limiting examples of monocyclic aryl include phenyl group (Ph), thienyl group (2- or 3-thienyl group), pyridyl group, furyl group, thiazolyl group, oxazolyl group, pyrazolyl group, 2-pyrazinyl Group, pyrimidinyl group, pyrrolyl group, imidazolyl group, pyridazinyl group, 3-isothiazolyl group, 3-isoxazolyl group, 1,2,4-oxadiazol-5-yl group or 1,2,4-oxadiazole-3 -Yl group and the like.
  • Non-limiting examples of fused polycyclic aryl include 1-naphthyl group, 2-naphthyl group, 1-indenyl group, 2-indenyl group, 2,3-dihydroinden-1-yl group, 2,3 -Dihydroinden-2-yl group, 2-anthryl group, indazolyl group, quinolyl group, isoquinolyl group, 1,2-dihydroisoquinolyl group, 1,2,3,4-tetrahydroisoquinolyl group, indolyl group, Isoindolyl group, phthalazinyl group, quinoxalinyl group, benzofuranyl group, 2,3-dihydrobenzofuran-1-yl group, 2,3-dihydrobenzofuran-2-yl group, 2,3-dihydrobenzothiophen-1-yl group, 2 , 3-dihydrobenzothiophen-2-yl group, benzothiazolyl group,
  • an aryl group may have one or more arbitrary substituents on the ring.
  • substituents include, but are not limited to, an alkoxy group, a halogen atom, an amino group, a mono- or di-substituted amino group, a substituted silyl group, and acyl.
  • the aryl group has two or more substituents, they may be the same or different. The same applies to the aryl moiety of other substituents containing the aryl moiety (for example, an aryloxy group and an arylalkyl group).
  • the “alkoxy group” is a structure in which the alkyl group is bonded to an oxygen atom, and examples thereof include a saturated alkoxy group that is linear, branched, cyclic, or a combination thereof.
  • methoxy group, ethoxy group, n-propoxy group, isopropoxy group, cyclopropoxy group, n-butoxy group, isobutoxy group, s-butoxy group, t-butoxy group, cyclobutoxy group, cyclopropylmethoxy group, n- Pentyloxy group, cyclopentyloxy group, cyclopropylethyloxy group, cyclobutylmethyloxy group, n-hexyloxy group, cyclohexyloxy group, cyclopropylpropyloxy group, cyclobutylethyloxy group, cyclopentylmethyloxy group, etc. are preferable Take as an example.
  • ring structure when formed by a combination of two substituents, means a heterocyclic or carbocyclic group, such group being saturated, unsaturated, or aromatic.
  • it includes cycloalkyl, cycloalkenyl, aryl, and heteroaryl as defined above. Examples include cycloalkyl, phenyl, naphthyl, morpholinyl, piperidinyl, imidazolyl, pyrrolidinyl, pyridyl and the like.
  • a substituent can form a ring structure with another substituent, and when such substituents are bonded to each other, those skilled in the art will recognize a specific substitution, such as bonding to hydrogen.
  • the probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention includes a compound having a structure represented by the following general formula (I).
  • X represents an oxygen atom, C (R a ) (R b ), or Si (R a ) (R b ). Since the excitation wavelength is shifted by the substitution of X, it is possible to provide a multicolor imaging probe that can be excited by a general laser.
  • R a and R b each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group.
  • R a and R b are alkyl groups, they can have one or more substituents, and examples of such substituents include alkyl groups, alkoxy groups, halogen atoms, hydroxyl groups, carboxyl groups, You may have 1 or 2 or more amino groups, sulfo groups, etc.
  • R a and R b are preferably both methyl groups. In some cases, R a and R b may be bonded to each other to form a ring structure. For example, when R a and R b are both alkyl groups, R a and R b can be bonded to each other to form a spiro ring.
  • the ring formed is preferably about 5 to 8 membered ring, for example.
  • R 1 represents a hydrogen atom or an optionally substituted aryl.
  • substituent in the aryl which may be substituted include, but are not limited to, an alkyl group, an alkoxy group, a halogen atom, a hydroxyl group, a carboxyl group, an amino group, and a sulfo group.
  • R 1 is a hydrogen atom or an optionally substituted phenyl group.
  • R 1 is a phenyl group
  • the 2-position or 6-position in the benzene ring of the phenyl group that is, the position where R 1 is ortho to the xanthene ring moiety as a substituent on the benzene ring
  • R 1 is a hydrogen atom
  • the compound of general formula (I) has a structure similar to pyronin
  • R 1 is phenyl
  • the compound of general formula (I) has a structure similar to rosamine. .
  • R 2 and R 3 are each independently a hydrogen atom, a hydroxyl group, a halogen atom, an alkyl group that may be substituted, a sulfo group, a carboxyl group, an ester group, an amide group, and an azide group. Represents 1 to 3 identical or different substituents selected. Preferably, R 2 and R 3 are both hydrogen atoms. In some cases, either R 2 or R 3 can include a labeled substituent that can be covalently bound to a biomolecule such as a protein described below. In that case, they may themselves be labeled substituents, or may be substituted with substituents including labeled substituents.
  • R 4 and R 5 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group, or N (R 4 ) (R 5 ) may form an amide group or a carbamate group.
  • R 4 and R 5 both represent an alkyl group, they may be the same or different.
  • R 4 and R 5 are each independently preferably a hydrogen atom, a methyl group or an ethyl group from the viewpoint of the nucleophilic addition reaction rate with a nucleophilic compound containing a —SH group, and R 4 More preferably, R 5 and R 5 are both a hydrogen atom or a methyl group. It is also preferred that one of R 4 or R 5 is a hydrogen atom and the other is a carbonyl group.
  • N (R 4 ) (R 5 ) forms an amide bond.
  • bonded with a carbonyl group is not specifically limited, An alkyl group is preferable and a methyl group is more preferable.
  • N (R 4 ) (R 5 ) preferably contains a substituent (labeled substituent) that can bind to a biomolecule such as a protein by a covalent bond or a non-covalent bond. In that case, they may themselves be labeled substituents, or may be substituted with substituents including labeled substituents.
  • R 4 and R 5 are substituted with a substituent including a leaving group such as N-hydroxysuccinimide, a benzylguanine derivative that is a substrate of SNAP-tag, or a ligand used in HaloTag®. It may be. Alternatively, it may be substituted with a substituent containing a taxane such as paclitaxel or docetaxel that binds to microtubules or a cyclic peptide such as phalloidin that binds to actin filaments. Alternatively, it may be substituted with N-hydroxysuccinimide that forms a bond with an amino group such as a lysine residue of a protein present in the cell membrane.
  • a substituent including a leaving group such as N-hydroxysuccinimide, a benzylguanine derivative that is a substrate of SNAP-tag, or a ligand used in HaloTag®. It may be. Alternatively, it may be substituted with a substituent
  • R 4 or R 5 when R 4 or R 5 is an alkyl group, it may be combined with R 2 to form a ring structure containing a nitrogen atom to which they are bonded. In that case, only one of R 4 and R 2 or a combination of R 5 and R 2 may form a ring structure, or both may form a ring structure.
  • R 6 and R 7 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group, or N (R 6 ) (R 7 ) may form an amide group or a carbamate group.
  • R 6 and R 7 both represent an alkyl group, they may be the same or different.
  • R 6 and R 7 are each independently preferably a hydrogen atom, a methyl group, or an ethyl group, and R 6 and R 7 are both hydrogen atoms, or both are methyl groups. preferable. It is also preferred that one of R 6 or R 7 is a hydrogen atom and the other is a carbonyl group. In this case, N (R 6 ) (R 7 ) forms an amide bond.
  • N (R 6 ) (R 7 ) contains the above-described labeled substituent. In that case, they may themselves be labeled substituents, or may be substituted with substituents including labeled substituents. As described above, such a labeled substituent is not particularly limited, and any known substituent in the art can be used.
  • R 6 or R 7 when R 6 or R 7 is an alkyl group, each may be taken together with R 3 to form a ring structure containing a nitrogen atom to which they are bonded. In that case, only one of R 6 and R 3 , or a combination of R 7 and R 3 may form a ring structure, or both may form a ring structure.
  • X is C (R a ) (R b ) or Si (R a ) (R b ), and R a and R b are both methyl groups.
  • R 1 is a hydrogen atom or a phenyl group
  • R 2 and R 3 are all hydrogen atoms
  • R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are all hydrogen atoms or all are methyl groups. There are cases.
  • X is an oxygen atom
  • R 1 is a hydrogen atom or a phenyl group
  • R 2 and R 3 are both hydrogen atoms
  • R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are either Also preferred is a hydrogen atom or a methyl group.
  • the compound of the formula (I) which is representative as a probe for super-resolution fluorescence imaging of the present invention, Can be mentioned. However, it is not limited to these. Moreover, the said compound can have a labeled substituent in arbitrary positions.
  • the compound represented by the above formula (I) has a monovalent positive charge at the N atom to which R 6 and R 7 are linked, it usually exists as a salt.
  • salts include base addition salts, acid addition salts, amino acid salts and the like.
  • base addition salt include metal salts such as sodium salt, potassium salt, calcium salt, magnesium salt, ammonium salt, or organic amine salts such as triethylamine salt, piperidine salt, morpholine salt, and acid addition salt.
  • Examples include mineral acids such as hydrochlorides, sulfates and nitrates, carboxylates such as trifluoroacetates, organic acids such as methanesulfonate, paratoluenesulfonate, citrate and oxalate. Mention may be made of salts. Examples of amino acid salts include glycine salts. However, it is not limited to these salts.
  • the compound represented by the formula (I) may have one or more asymmetric carbons depending on the type of substituent, and there are stereoisomers such as optical isomers or diastereoisomers. There is a case. Pure forms of stereoisomers, any mixture of stereoisomers, racemates, and the like are all within the scope of the present invention.
  • the compound represented by the formula (I) or a salt thereof may exist as a hydrate or a solvate, and any of these substances is included in the scope of the present invention.
  • solvents such as ethanol, acetone, isopropanol, can be illustrated.
  • the above-described fluorescent probe may be used as a composition by blending an additive for use in a physiological environment, if necessary.
  • an additive for example, additives such as a solubilizing agent, a pH adjusting agent, a buffering agent, and an isotonic agent can be used, and the amount of these can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • These compositions can be provided as a composition in an appropriate form such as a powder-form mixture, a lyophilized product, a granule, a tablet, or a liquid.
  • the super-resolution fluorescence imaging method of the present invention comprises contacting a probe molecule of formula (I) described above with a biomolecule, and In the presence, image data is acquired by a CCD camera or the like that has been irradiated with laser light to photograph fluorescence emission from the probe molecules, and a plurality of the image data obtained by repeating this at a predetermined time interval are obtained. This includes superimposing an image with respect to the structure of the biomolecule by superimposing it after analysis. Examples of biomolecules to be observed include cell membranes (lipids), proteins, DNA, RNA, and the like.
  • SMLM single-molecule-localization-microscopy
  • the basic procedure in the super-resolution fluorescence imaging method of the present invention can refer to the super-resolution fluorescence imaging method described in the document except that the probe of formula (I) is used.
  • the compound (I) before the reaction (left side) absorbs excitation light of about 400 to 700 nm and emits strong fluorescence, whereas a nucleophilic compound (here, a compound containing an —SH group such as glutathione).
  • a nucleophilic compound here, a compound containing an —SH group such as glutathione.
  • R—SH nucleophilic attacked by “R—SH”.
  • nucleophilic compound that causes such a nucleophilic addition-dissociation equilibrium reaction include, in addition to the —SH group-containing compounds shown here, for example, compounds containing —OH groups such as water and hydroxide ions, Alternatively, a —NH group-containing compound such as a lysine residue in a protein can be used.
  • a CCD that is a detector in which preferred fluorescence flashing due to the above-described equilibrium reaction is generally used in the presence of glutathione in such a concentration range.
  • the present invention has an advantage that cytotoxicity can be reduced because the intensity of the laser used can be reduced to about 1/10 of the conventional one.
  • the intensity of the laser is preferably about 0.0001 to 10 kW / cm 2 , and from the viewpoint of signal-to-noise ratio (S / N ratio), cytotoxicity, etc., about 0.01 to 0.5 kW / cm 2. It is more preferable that
  • the fluorescent probe molecule In super-resolution fluorescence imaging with SMLM, it is not preferable that the fluorescent probe molecule emits light at a location closer than the diffraction limit of light. Therefore, the number of probe molecules that emit fluorescence in one measurement needs to be less than a certain percentage. There is. Therefore, the abundance ratio of compound (I) to compound (II) in the above equilibrium is preferably 1: 10000 to 1:10 at room temperature in an aqueous solution under neutral conditions, and 1: 1000 to 1: 100 is more preferable.
  • the dissociation constant K d of the nuclear addition-dissociation equilibrium is preferably in the range of 0.1 ⁇ M to 10 mM, and more preferably in the range of 0.1 to 100 ⁇ M from the viewpoint of improving the labeling density.
  • the lifetime of the compound of formula (I) in the fluorescence state is preferably in the range of 1 microsecond to 1 second, and the signal-to-noise ratio From the viewpoint of improving the (S / N ratio), it is more preferably in the range of 1 millisecond to 1 second.
  • the nucleophilic addition reaction rate constant in the above equilibrium should be in the range of 1 to 1.0 ⁇ 10 6 s ⁇ 1 at room temperature in an aqueous solution under neutral conditions. Preferably, it is in the range of 1 to 1000 s ⁇ 1 .
  • the reaction rate is calculated by exciting a fluorescent probe with a nanosecond laser and measuring transient absorption on the order of nanoseconds to milliseconds using a system such as laser flash photolysis known in the art. Can do.
  • the compound that functions as a nucleophilic molecule in the nucleophilic addition-dissociation equilibrium reaction is a compound containing an —SH group, and preferably glutathione that is a nucleophilic molecule present in a cell.
  • glutathione listed here, and any compound having a —SH group in the molecule can include compounds and peptides having a wide cysteine residue, and these compounds can be used as long as the above equilibrium reaction is obtained.
  • Etc. can also be used in the present invention.
  • a compound having a nucleophilic functional group such as an —OH group or —NH group in the molecule, such as a compound having water, a lysine residue, etc.
  • Any peptide can be used as the nucleophilic compound in the present invention as long as the above equilibrium reaction can be obtained.
  • these dissociation constants and nucleophilic addition reaction rate constants can also obtain more optimal dissociation constants and reaction rates by molecular design that selects an appropriate combination as a substituent or the like in the compound of formula (I). .
  • the obtained compound was dissolved in methanol (2 ml), and sodium borohydride was added until the color of the solution became pale yellow. Water was added to stop the reaction, and the mixture was extracted twice with dichloromethane. The obtained organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure. The obtained compound was dissolved in deoxygenated dichloromethane (5 ml), and 1,3-dimethylbarbituric acid (185 mg, 1.17 mmol, 21 eq.) And tetrakis (triphenylphosphine) palladium (11 mg, 9 ⁇ mol, 0.2 eq.) was added and stirred at room temperature overnight.
  • reaction solution was extracted with ethyl acetate, washed twice with a saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution, saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and then the solvent was removed under reduced pressure.
  • Chloranil 23 mg, 0.094 mmol, 1.7 eq. was added to the obtained compound, and the mixture was stirred at room temperature for 5 minutes.
  • dichlorodimethylsilane (700 ⁇ l, 5.75 mmol, 1.3 eq.) was diluted with THF (5 ml), gradually returned to room temperature, and stirred for 2 hours.
  • 1 N Hydrochloric acid was added to acidify, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate solution was added, and THF was removed under reduced pressure.
  • the obtained aqueous layer was extracted with ethyl acetate, and then the organic phase was washed with water and saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure.
  • the organic phase was washed with water and saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure.
  • the organic layer was washed with water and saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered, and the solvent was removed under reduced pressure.
  • the reaction mixture was filtered through celite, the filtrate and celite were washed with ethyl acetate, and the solvent was removed under reduced pressure from the mixture of the filtrate and the washing solution.
  • the obtained aqueous layer was extracted with dichloromethane, and then the organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure.
  • the obtained residue was dissolved in methanol, sodium borohydride (376.5 mg, 9.95 mmol, 1.6 eq.) Was added at 0 ° C, and the mixture was stirred for 10 min. Water was added and extracted with dichloromethane, and then the organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure.
  • the reaction mixture was filtered through celite, the filtrate and celite were washed with ethyl acetate, and the solvent was removed under reduced pressure from the mixture of the filtrate and the washing solution.
  • the organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure.
  • dehydrated acetone (210 ⁇ l, 2.85 mmol, 6.0 eq.) was added little by little, and the mixture was stirred at ⁇ 78 ° C. for 15 minutes, then returned to room temperature, and further stirred for 5 hours.
  • tetrahydrofuran was removed under reduced pressure.
  • the obtained aqueous phase was extracted with dichloromethane, and then the organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure.
  • the organic layer was washed with saturated brine, dried over anhydrous sodium sulfate, and the solvent was removed under reduced pressure.
  • N-diisopropylamine (8.8 ⁇ l, 0.0504 mmol, 20 eq.)
  • O- (7-azabenzotriazol-1-yl) -N, N, N ', N'-tetramethyluronium hexafluorophosphate Salt (5.9 mg, 0.0155 mmol, 6.1 eq.) was added, and the mixture was stirred for 15 minutes, then returned to room temperature and further stirred for 13 hours.
  • FIGS. 1 to 5 show absorption spectrum changes (left figure) and fluorescence spectrum changes (center figure; excitation wavelength: compound 2 is 570 nm, compounds 5, 14 and 16 are 620 nm, and compounds are compounds 2, 5, 12, 14 and 16. 12 is 600 nm), and a plot (right figure) of the absorbance dependence of glutathione concentration is shown.
  • the measurement was performed with a 1% DMSO aqueous solution containing 1 ⁇ M of the probe compound.
  • the obtained dissociation constant values are shown in Table 1-1 below.
  • FIGS. 6 and 7 show changes in the absorption spectra of compounds 28 and 32 (left figure), fluorescence spectrum changes (middle figure; excitation wavelength 530 nm), and glutathione concentration dependence of absorbance and fluorescence intensity (right figure). Respectively.
  • the measurement was performed with a 1% DMSO aqueous solution containing 1 ⁇ M of the probe compound.
  • the obtained dissociation constant values are shown in Table 1-2 below.
  • the dissociation constants of these compounds are all in the range of 1 to 100 ⁇ M, and it was found that most of them exist as non-fluorescent nucleophilic adducts at a concentration of several mM of glutathione, which is similar to that in cells. . This indicates that the abundance ratio of the unreacted probe compound that emits fluorescence and the compound that has been quenched by reacting with glutathione is within the range suitable for super-resolution fluorescence imaging by SMLM.
  • the probe compound of the present invention shows that nucleophilic addition with glutathione proceeds with a time constant on the order of milliseconds, and that under conventional laser irradiation of 1/10 or less. It became clear that the fluorescence blinking suitable for super-resolution fluorescence imaging was demonstrated.
  • the fluorescence quantum yield of the probe compound of the present invention was measured.
  • the solution conditions are 1 ⁇ M probe compound, 1% DMSO aqueous solution, pH 7.4 (200 mM NaPi buffer).
  • the results obtained for compounds 5, 12, 14, 16, 17, 28, and 32 are shown in Table 7. It has been clarified that the probe compound of the present invention exhibits a high fluorescence quantum yield suitable for super-resolution fluorescence imaging by SMLM.
  • the antibody labeled with the probe compound was purified by PD MiniTrap TM G-25 (GE Healthcare) using phosphate buffered saline (PBS) (pH 7.4, GIBCO) as the eluent.
  • PBS phosphate buffered saline
  • the ratio of probe compound [mol] / antibody molecule [mol] was calculated as the degree of labeling (DOL) of the probe compound relative to the antibody.
  • DOL degree of labeling
  • the concentration of the probe compound was calculated from the absorbance measurement value derived from the probe compound, and the concentration of the antibody molecule was assumed to have no loss of the antibody molecule in the purification process, and the concentration of the antibody molecule used for the preparation was Calculated from the total amount.
  • SMLM super-resolution imaging
  • a labeled anti-mouse antibody with a labeling degree of 2.1 and a labeled anti-rabbit antibody with a labeling degree of 1.3 were used.
  • Compound 33 which is a probe compound having an azido group introduced at the end of compound 28, was similarly labeled to an antibody.
  • Compound 33 and dibenzocyclooctyne-N-hydroxysuccinimidyl ester were each dissolved in DMSO to prepare a 10 mM stock solution.
  • a goat-derived anti-mouse secondary antibody IgG, Sigma-Aldrich
  • IgG immunostaining of ⁇ -tubulin was mixed with DBCO-NHS in 0.2 M sodium phosphate buffer (pH 8.5) ( Room temperature for 30 minutes).
  • An antibody (DBCO-IgG) labeled with DBCO-NHS was purified by PD MiniTrap TM G-25 (GE Healthcare) using PBS (pH 7.4, GIBCO) as an eluent.
  • the stock solution of Compound 33 was added to the obtained eluent containing DBCO-IgG and mixed in PBS (pH 7.4, GIBCO) (room temperature, 30 minutes).
  • the antibody (DBCO-IgG) labeled with the probe compound was purified by PD MiniTrap TM G-25 (GE Healthcare) using PBS (pH 7.4, GIBCO) as an eluent.
  • the ratio of probe compound [mol] / antibody molecule [mol] was calculated as the degree of labeling (DOL) of the probe compound relative to the antibody.
  • DOL degree of labeling
  • the concentration of the probe compound was calculated from the absorbance measurement value derived from the probe compound, and the concentration of the antibody molecule was assumed to have no loss of the antibody molecule in the purification process, and the concentration of the antibody molecule used for the preparation was Calculated from the total amount.
  • SMLM super-resolution imaging
  • Vero cells derived from the kidney of African green monkeys were transformed into Dulbecco's modified Eagle medium (high glucose) (GIBCO) without phenol red and L-glutamine with fetal calf serum (Invitrogen) and 1% penicillin. - streptomycin solution (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were cultured in the added medium in (37 °C, 5% CO 2 ). The day before the imaging, the cells were seeded on a Lab-Tek II 8-well chamber cover glass (Thermo Fisher Scientific). Fixing and immunostaining were performed as follows with reference to the following documents. ⁇ M. Bates, G. T. Dempsey, K. H.
  • Methanol fixation and ⁇ -tubulin immunostaining were performed as follows. Cells were washed with PBS pre-warmed to 37 ° C. and fixed with ⁇ 20 ° C. methanol containing 5 mM glycol ether diamine tetraacetic acid (EGTA) for 5-10 minutes. Wash 2 to 3 times with BRB80 (80 mM potassium PIPES buffer containing 1 mM magnesium chloride and 1 mM EGTA, pH 6.8), block with blocking buffer (PBS containing 1% bovine serum albumin) for 20 minutes, then blocking buffer Mouse anti- ⁇ -tubulin antibody (TUB2.1, Sigma-Aldrich, T4026, diluted 1/100) diluted with 1 was added and shaken for 1 hour.
  • BRB80 80 mM potassium PIPES buffer containing 1 mM magnesium chloride and 1 mM EGTA, pH 6.8
  • blocking buffer PBS containing 1% bovine serum albumin
  • the fixation with paraformaldehyde and glutaraldehyde, and immunostaining of ⁇ -tubulin and Tom20 were performed as follows. Cells were washed with PBS pre-warmed to 37 ° C. and fixed with PBS containing 3% paraformaldehyde and 0.1% glutaraldehyde for 10 minutes at room temperature. The unreacted aldehyde group and the fluorescent product generated during the fixing operation were reduced with the PBS solution of 0.1% sodium borohydride prepared immediately before. After washing with PBS, blocking and membrane permeabilization were performed for 20 minutes with blocking buffer (3% BSA and 0.5% Triton X-100 in PBS).
  • mouse anti- ⁇ -tubulin antibody (TUB2.1, Sigma-Aldrich, T4026, / 100 dilution) and / or rabbit anti-Tom20 antibody (Santa Cruz, sc11415, 1/50 dilution) diluted with blocking buffer was added. And shaken for 30 minutes. Thereafter, the sample was washed with a washing buffer (0.2% BSA and 0.1% Triton X-100 in PBS) three times for 10 minutes each. Staining was carried out for 30 minutes with a labeled secondary antibody (10-20 ⁇ g / mL for ⁇ -tubulin; 10 ⁇ g / mL for Tom20) diluted in blocking buffer.
  • a labeled secondary antibody (10-20 ⁇ g / mL for ⁇ -tubulin; 10 ⁇ g / mL for Tom20
  • the plate was washed three times with a washing buffer for 10 minutes, further washed with PBS for 10 minutes, and post-fixed with PBS containing 3% paraformaldehyde and 0.1% glutaraldehyde at room temperature for 10 minutes. Thereafter, it was washed 3 times with PBS. Prior to SMLM imaging, the buffer was replaced with 0.2 M sodium phosphate buffer containing 1-10 mM GSH (Wako Pure Chemical Industries).
  • SMLM imaging was performed at room temperature using an SMLM imaging N-STORM device (Nikon). Excitation of the compound 17 and the compound 33, which are probe compounds, is performed by total reflection illumination using laser light of 647 nm (40 to 500 W / cm 2 ) and 561 nm (40 to 500 W / cm 2 ), or light-shielding illumination close to total reflection illumination, respectively. It went by. Image data was recorded at 15 ms / frame or 30 ms / frame, and a super-resolution image was constructed by analyzing with image integration software (NIS-Elements Advanced Research, Nikon). In displaying the super-resolution image, only bright spots where 150 photons or more or 200 photons or more were detected were displayed.
  • image integration software NIS-Elements Advanced Research, Nikon
  • FIG. 8 shows the results of SMLM imaging of microtubules in fixed Vero cells using an antibody labeled with Compound 17.
  • the right figure in FIG. 8a is a super-resolution image by SMLM, and the left figure shows an averaged image of fluorescence intensity as a comparison.
  • FIG. 8b is a cross-sectional profile of normalized fluorescence intensity in the strip region in the top view (scale bar: 3 ⁇ m) of the averaged image of FIG. 8a and the strip region in the top view (scale bar: 3 ⁇ m) of the super-resolution image. Shows a cross-sectional profile of the number of recognized bright spots in.
  • FIG. 8 shows the results of SMLM imaging of microtubules in fixed Vero cells using an antibody labeled with Compound 17.
  • the right figure in FIG. 8a is a super-resolution image by SMLM, and the left figure shows an averaged image of fluorescence intensity as a comparison.
  • FIG. 8b is a cross-sectional
  • FIG. 8c is a cross-sectional profile of normalized fluorescence intensity in the in-frame region in the lower diagram (scale bar: 1 ⁇ m) of the averaged image of FIG. 8a and the in-frame region in the lower diagram of the super-resolution image (scale bar: 1 ⁇ m). Shows a cross-sectional profile of the number of recognized bright spots in.
  • FIG. 8d shows the frequency distribution of the position determination accuracy with respect to the bright spots constituting the upper diagram of the super-resolution image of FIG. 8a.
  • the results shown in FIG. 8 demonstrate super-resolution imaging of microtubules in fixed Vero cells using an antibody labeled with compound 17.
  • the super-resolution image showed higher spatial resolution than the averaged image in microtubule line width and separation of adjacent microtubules.
  • FIG. 9 shows the results of SMLM imaging of microtubules in fixed Vero cells using an antibody labeled with Compound 33.
  • the right figure in FIG. 9 is a super-resolution image by SMLM, and the left figure shows an averaged image of fluorescence intensity as a comparison.
  • the results shown in FIG. 9 demonstrate super-resolution imaging of microtubules in fixed Vero cells using an antibody labeled with compound 33.
  • the super-resolution image showed higher spatial resolution than the averaged image in microtubule line width and separation of adjacent microtubules.
  • FIG. 10 shows the results of SMLM imaging in two colors of microtubules and mitochondria in fixed Vero cells using a combination of an antibody labeled with compound 17 and an antibody labeled with compound 33.
  • the right figure in FIG. 10 is a super-resolution image by SMLM, and the left figure shows an averaged image of fluorescence intensity as a comparison.
  • the antibody labeled with compound 33 stains microtubules shown in green, while the antibody labeled with compound 17 stains mitochondria shown in red. By merging these images, a super-resolution image in two colors indicated by red and green was obtained.
  • FIG. 10 demonstrate that the present invention can be applied to two-color super-resolution imaging by using two types of probe compounds of the present invention in which the X atom in formula (I) is changed.

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Abstract

【課題】分子間求核付加－解離平衡反応による蛍光発光特性を利用した新規な超解像蛍光イメージング用プローブ、及び当該プローブを用いた超解像蛍光イメージング方法の提供。 【解決手段】以下の式（Ｉ）で表される化合物〔式中、 Ｘは、酸素原子又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す）； Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいアリールを表し（ただし、Ｒ１がフェニル基の場合、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置に置換基を有しない）； Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１～３個の同一又は異なる置換基を表し； Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、それぞれＲ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい）；及び、 Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子もしくは置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ６又はＲ７がアルキル基である場合、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。〕 又はその塩を含む超解像蛍光イメージング用プローブであって、式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が、－ＳＨ基を含有する求核性化合物との間で求核付加－解離平衡反応を行うことを特徴とする、該超解像蛍光イメージング用プローブ。

Description

超解像蛍光イメージング用プローブ
　本発明は、分子間求核付加－解離平衡反応による蛍光発光特性を利用した新規な超解像蛍光イメージング用プローブ、及び当該プローブを用いた超解像蛍光イメージング方法に関する。
一般に、光の回折により点像は波長の半分程度に広がってしまうため、光学顕微鏡の空間分解能は、Ａｂｂｅの回折限界に制限され、点像の広がりよりも近接に位置する２点を分離してイメージングすることは不可能と考えられてきた。しかしながら、１９９０年代から回折限界を上回る分解能での超解像イメージング手法がいくつか報告されてきており（例えば、非特許文献１等）、生細胞に適用することで従来法では観測できなかった生物学的現象を捉える可能性が広がりつつある。
　超解像イメージング法の１種であるＳＴＯＲＭ（ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｏｐｔｉｃａｌ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）やＰＡＬＭ（ｐｈｏｔｏ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）に代表されるＳＭＬＭ法（ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）では、試料内にある蛍光分子を十分距離が離れた１分子ずつ確率的に発光させ、各分子の位置を正確に特定し、重ね合わせることで数１０ｎｍの解像度の蛍光画像を構築することができる（例えば、特許文献１等）。
　このようなＳＭＬＭでは、主に、市販の蛍光色素や蛍光蛋白質が用いられている。しかしながら、このような市販の有機蛍光色素を確率的に発光させるためには、一般的に１０～１００ｍＭ程度のチオール存在下で、０．８ｋＷ/ｃｍ２程度の高強度のレーザーにより励起し、三重項等の長寿命の無蛍光状態を作り出すことが必須であり、このような条件は生細胞におけるイメージングには適さない。
　また、これまでの、超解像蛍光イメージング法の開発は、主に光学系や解析ソフトウェアの観点からの開発がほとんどであり、重要な蛍光プローブの開発が遅れているのが現状である。
Ｚｈｕａｎｇら、米国特許公開公報ＵＳ２００８/００３２４１４
Ｍ.Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ－Ｓｕａｒｅｚら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，９,９２９，２００８
　そこで、本発明は、プローブ化合物以外の添加物が不要であって、また、データ取得前に蛍光性のプローブを無蛍光性状態にするために必要であったレーザー照射を省くことができ、かつ低出力のレーザー照射でも機能する超解像蛍光イメージングに適した蛍光プローブ化合物を開発し、生細胞にも適用可能な超解像蛍光イメージング手法を提供することを課題とするものである。さらに、かかる蛍光プローブ化合物を用いて、同一視野で観察可能な多色での超解像イメージング手法を提供することも課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った結果、生細胞内に内在的に存在する求核性化合物であるグルタチオン等の－ＳＨ基含有化合物と、ピロニン及びピロニン類似骨格（以下、まとめて「ピロニン骨格」という。）を有する蛍光団との分子間求核付加－解離平衡反応に着目し、当該反応による光明滅を動作原理とすることで、生細胞にも適用可能な条件下における超解像蛍光イメージングを可能とする蛍光プローブ分子を見出した。より具体的には、上記求核付加－解離平衡反応における解離定数及び求核付加反応速度を最適化することによって、従来のような高濃度のチオール添加や高強度のレーザー照射に依らずに、生細胞内におけるグルタチオンの濃度範囲で超解像蛍光イメージングに適した確率的な発光が得られることを見出した。これらの知見に基づき、本発明を完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、一態様において、
（１）以下の式（Ｉ）で表される化合物
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003

〔式中、
Ｘは、酸素原子又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す）；
Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいアリールを表し（ただし、Ｒ１がフェニル基の場合、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置に置換基を有しない）；
Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１～３個の同一又は異なる置換基を表し；
Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、それぞれＲ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい）；及び、
Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子もしくは置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ６又はＲ７がアルキル基である場合、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。）
又はその塩を含む超解像蛍光イメージング用プローブであって、
式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が、－ＳＨ基を含有する求核性化合物との間で求核付加－解離平衡反応を行うことを特徴とする、
該超解像蛍光イメージング用プローブ；
（２）前記求核付加－解離平衡反応が、Ｒ１が結合する炭素原子において行われる、上記（１）に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（３）前記求核付加－解離平衡反応における解離定数が、０．１μＭ～１０ｍＭの範囲内であることを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（４）前記求核付加－解離平衡反応における求核付加反応速度定数が、中性条件の水系溶液中において、１～１．０ｘ１０６ｓ－１であることを特徴とする、上記（１）～（３）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（５）Ｘが、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）である、上記（１）～（４）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（６）Ｒａ及びＲｂが、いずれもメチル基である、上記（５）に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（７）Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいフェニル基である（ただし、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置に置換基を有しない）、上記（１）～（６）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（８）Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれも水素原子である、上記（１）～（７）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（９）Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれもメチル基である、上記（１）～（７）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（１０）Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうち少なくとも１つが、生体分子と共有結合又は非共有結合によって結合し得るラベル化置換基を含む、上記（１）～（７）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（１１）前記－ＳＨ基を含有する化合物が、システイン残基を有する化合物である、上記（１）～（１０）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；
（１２）前記－ＳＨ基を含有する化合物が、グルタチオンである、上記（１）～（１０）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ；及び
（１３）式（Ｉ）で表される化合物が以下の群から選択される化合物である、上記（１）に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004


を提供するものである。
　別の態様において、本発明は、
（１４）上記（１）～（１３）のいずれか１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブを用いる超解像蛍光イメージング方法であって、
生体分子にプローブ分子を結合させ、－ＳＨ基を含有する化合物の存在下でレーザー光を照射して前記プローブ分子からの蛍光発光を撮影した画像データを取得し、一定の時間間隔でこれを繰り返して得られた複数の前記画像データを解析したうえで重ね合わせることによって、前記生体分子の構造に対する超高解像のイメージ画像を得ることを含む、該方法
を提供するものである。
　本発明は、グルタチオン等の細胞内物質とプローブ分子の分子間平衡反応を確率的な蛍光発光の原理とするため、従来法のように高濃度のチオールを別途添加する必要はなく、データ取得前に蛍光性のプローブを無蛍光性状態にするために必要であったレーザー照射を省くことができ、かつ、レーザー強度を従来の１／１０程度まで低減した条件下で使用することができ，細胞毒性を低減することができる。また、本発明の蛍光プローブ化合物を組み合わせることで、同一視野で観察可能な多色での超解像イメージング手法を提供することもできる。
　さらに、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブが、その分子内にタンパク質等への結合部位（カルボキシル基等）を有する場合には、目標タンパク質等へのラベル化にも適しており、固定細胞だけでなく、生細胞系における広範な研究に利用できると期待できる。また、当該プローブに基づく超解像蛍光イメージング法は、市販の顕微鏡を光学系として利用することができるため、汎用性の高い手法であると考えられる。このように、開発したプローブの基礎研究上、産業上の利用価値、経済効果は極めて大きいものといえる。
図１は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物２の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。 図２は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物５の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。 図３は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物１２の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。 図４は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物１４の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。 図５は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物１６の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。 図６は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物２８の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度及び蛍光強度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。 図７は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物３２の各グルタチオン濃度における吸収スペクトル変化（左）、蛍光スペクトル変化（中央）、吸光度及び蛍光強度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）を示したものである。 図８は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物１７でラベル化した抗体を用いた、固定ベロ細胞中における微小管のＳＭＬＭイメージングの結果を示したものである。図８ａにおける右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。図８ｂは、図８ａの平均化画像の上図（スケールバー：３μｍ）中の帯状領域における規格化された蛍光強度の横断プロファイル及び超解像度画像の上図（スケールバー：３μｍ）中の帯状領域における規格化された認識輝点数の横断プロファイルを示したものである。図８ｃは、図８ａの平均化画像の下図（スケールバー：１μｍ）中の枠内領域における規格化された蛍光強度の横断プロファイル及び超解像度画像の下図（スケールバー：１μｍ）中の枠内領域における規格化された認識輝点数の横断プロファイルを示したものである。図８ｄは、図８ａの超解像度画像の上図を構成する輝点に関してその位置決定精度の度数分布を示したものである。 図９は、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物３３でラベル化した抗体を用いた、固定ベロ細胞中における微小管のＳＭＬＭイメージングの結果を示したものである。図９における右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。 図１０は、化合物１７でラベル化した抗体及び化合物３３でラベル化した抗体を組み合わせて用いることによって得られた、固定ベロ細胞中における微小管及びミトコンドリアの２色でのＳＭＬＭイメージングの結果を示したものである。図１０における右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。
　以下、本発明の実施形態について説明する。本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施することができる。
１．定義
　本明細書中において、「ハロゲン原子」とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子を意味する。
　本明細書中において、「アルキル」は直鎖状、分枝鎖状、環状、又はそれらの組み合わせからなる脂肪族炭化水素基のいずれであってもよい。アルキル基の炭素数は特に限定されないが、例えば、炭素数１～２０個（Ｃ１～２０）、炭素数３～１５個（Ｃ３～１５）、炭素数５～１０個（Ｃ５～１０）である。炭素数を指定した場合は、その数の範囲の炭素数を有する「アルキル」を意味する。例えば、Ｃ１～８アルキルには、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、イソペンチル、ｎｅｏ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、イソヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチル等が含まれる。本明細書において、アルキル基は任意の置換基を1個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アルキル基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アルキル部分を含む他の置換基（例えばアルコシ基、アリールアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。
　本明細書において、ある官能基について「置換されていてもよい」と定義されている場合には、置換基の種類、置換位置、及び置換基の個数は特に限定されず、２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。これらの置換基にはさらに置換基が存在していてもよい。このような例として、例えば、ハロゲン化アルキル基、ジアルキルアミノ基などを挙げることができるが、これらに限定されることはない。
　本明細書中において、「アリール」は単環式又は縮合多環式の芳香族炭化水素基のいずれであってもよく、環構成原子としてヘテロ原子（例えば、酸素原子、窒素原子、又は硫黄原子など）を１個以上含む芳香族複素環であってもよい。この場合、これを「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」と呼ぶ場合もある。アリールが単環及び縮合環のいずれである場合も、すべての可能な位置で結合しうる。単環式のアリールの非限定的な例としては、フェニル基（Ｐｈ）、チエニル基（２－又は３－チエニル基）、ピリジル基、フリル基、チアゾリル基、オキサゾリル基、ピラゾリル基、２－ピラジニル基、ピリミジニル基、ピロリル基、イミダゾリル基、ピリダジニル基、３－イソチアゾリル基、３－イソオキサゾリル基、１，２，４－オキサジアゾール－５－イル基又は１，２，４－オキサジアゾール－３－イル基等が挙げられる。縮合多環式のアリールの非限定的な例としては、１－ナフチル基、２－ナフチル基、１－インデニル基、２－インデニル基、２，３－ジヒドロインデン－１－イル基、２，３－ジヒドロインデン－２－イル基、２－アンスリル基、インダゾリル基、キノリル基、イソキノリル基、１，２－ジヒドロイソキノリル基、１，２，３，４－テトラヒドロイソキノリル基、インドリル基、イソインドリル基、フタラジニル基、キノキサリニル基、ベンゾフラニル基、２，３－ジヒドロベンゾフラン－１－イル基、２，３－ジヒドロベンゾフラン－２－イル基、２，３－ジヒドロベンゾチオフェン－１－イル基、２，３－ジヒドロベンゾチオフェン－２－イル基、ベンゾチアゾリル基、ベンズイミダゾリル基、フルオレニル基又はチオキサンテニル基等が挙げられる。本明細書において、アリール基はその環上に任意の置換基を１個以上有していてもよい。該置換基としては、例えば、アルコキシ基、ハロゲン原子、アミノ基、モノ若しくはジ置換アミノ基、置換シリル基、又はアシルなどを挙げることができるが、これらに限定されることはない。アリール基が２個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。アリール部分を含む他の置換基（例えばアリールオキシ基やアリールアルキル基など）のアリール部分についても同様である。
　本明細書中において、「アルコキシ基」とは、前記アルキル基が酸素原子に結合した構造であり、例えば直鎖状、分枝状、環状又はそれらの組み合わせである飽和アルコキシ基が挙げられる。例えば、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、イソプロポキシ基、シクロプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓ－ブトキシ基、ｔ－ブトキシ基、シクロブトキシ基、シクロプロピルメトキシ基、ｎ－ペンチルオキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロプロピルエチルオキシ基、シクロブチルメチルオキシ基、ｎ－ヘキシルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロプロピルプロピルオキシ基、シクロブチルエチルオキシ基又はシクロペンチルメチルオキシ基等が好適な例として挙げられる。
　本明細書中において用いられる「アミド」とは、ＲＮＲ’ＣＯ－（Ｒ＝アルキルの場合、アルカミノカルボニル－）及びＲＣＯＮＲ’－（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルアミノ－）の両方を含む。
　本明細書中において用いられる「エステル」とは、ＲＯＣＯ－（Ｒ＝アルキルの場合、アルコキシカルボニル－）及びＲＣＯＯ－（Ｒ＝アルキルの場合、アルキルカルボニルオキシ－）の両方を含む。
　本明細書中において、「環構造」という用語は、二つの置換基の組み合わせによって形成される場合、複素環または炭素環基を意味し、そのような基は飽和、不飽和、または芳香族であることができる。従って、上記において定義した、シクロアルキル、シクロアルケニル、アリール、及びヘテロアリールを含むものである。例えば、シクロアルキル、フェニル、ナフチル、モルホリニル、ピペルジニル、イミダゾリル、ピロリジニル、及びピリジルなどが挙げられる。本明細書中において、置換基は、別の置換基と環構造を形成することができ、そのような置換基同士が結合する場合、当業者であれば、特定の置換、例えば水素への結合が形成されることを理解できる。従って、特定の置換基が共に環構造を形成すると記載されている場合、当業者であれば、当該環構造は通常の化学反応によって形成することができ、また容易に生成することを理解できる。かかる環構造及びそれらの形成過程はいずれも、当業者の認識範囲内である。
２．超解像蛍光イメージング用プローブ
　本発明の超解像蛍光イメージング用プローブは、一態様において、以下の一般式（Ｉ）で表される構造を有する化合物を含むものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記一般式（Ｉ）において、Ｘは、酸素原子又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表す。Ｘの置換により励起波長がシフトするため、一般的なレーザーで励起可能な多色イメージングプローブの提供が可能となる。ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す。Ｒａ及びＲｂが、アルキル基である場合、それらは１以上の置換基を有することができ、そのような置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基などを１個又は２個以上有していてもよい。Ｒａ及びＲｂは、いずれもメチル基であることが好ましい。また、場合によっては、Ｒａ及びＲｂは互いに結合して環構造を形成していてもよい。例えば、Ｒａ及びＲｂがともにアルキル基である場合に、Ｒａ及びＲｂが互いに結合してスピロ環を形成することができる。形成される環は、例えば５ないし８員環程度であることが好ましい。
　Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいアリールを表す。置換されていてもよいアリールにおける置換基としては、例えば、アルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子、水酸基、カルボキシル基、アミノ基、スルホ基などが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。また、当該置換基を１個又は２個以上有していてもよい。好ましくは、Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいフェニル基である。ただし、Ｒ１がフェニル基の場合、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置（すなわち、Ｒ１がベンゼン環上の置換基としてのキサンテン環部分に対してオルト位になる位置）に置換基を有しないことが求核性化合物との反応性の観点から好ましい。Ｒ１が水素原子の場合、一般式（Ｉ）の化合物はピロニンに類似する構造を有し、Ｒ１がフェニルの場合、一般式（Ｉ）の化合物はロザミン（ｒｏｓａｍｉｎｅ）に類似する構造を有する。
　Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１～３個の同一又は異なる置換基を表す。好ましくは、Ｒ２及びＲ３は、いずれも水素原子である。場合によっては、Ｒ２及びＲ３のいずれかが、後述するタンパク質等の生体分子と共有結合し得るラベル化置換基を含むこともできる。その場合、それら自身がラベル化置換基であってもよいし、又はラベル化置換基を含む置換基によって置換されていてもよい。
　Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又はアルキル基を示し、又は、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）がアミド基もしくはカルバメート基を形成するものであることができる。Ｒ４及びＲ５がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ４及びＲ５はそれぞれ独立に、水素原子、メチル基又はエチル基であることが－ＳＨ基を含有する求核性化合物との間で求核付加反応速度の観点から好ましく、Ｒ４及びＲ５がいずれも水素原子であるか、またはいずれもメチル基である場合がさらに好ましい。Ｒ４又はＲ５の一方が水素原子であって、他方がカルボニル基であることも好ましい。この場合、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）はアミド結合を形成する。カルボニル基に結合する他の置換基は特に限定されないが、アルキル基が好ましく、メチル基がより好ましい。場合によっては、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）が、タンパク質等の生体分子と共有結合又は非共有結合等により結合し得る置換基（ラベル化置換基）を含むことが好ましい。その場合、それら自身がラベル化置換基であってもよいし、又はラベル化置換基を含む置換基によって置換されていてもよい。例えば、Ｒ４とＲ５のいずれか又は両方がＮ-ヒドロキシスクシンイミド等の脱離基やＳＮＡＰ－ｔａｇの基質であるベンジルグアニン誘導体やＨａｌｏＴａｇ（登録商標）で用いられるリガンドを含む置換基で置換されていてもよい。又は、微小管と結合するパクリタキセルやドセタキセル等のタキサン類やアクチンフィラメントに結合するファロイジン等の環状ペプチドを含む置換基で置換されていてもよい。又は、細胞膜に存在するタンパク質のリジン残基等のアミノ基と結合を形成するＮ-ヒドロキシスクシンイミドで置換されていてもよい。さらには、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドを介したアミノ基との結合等により、タンパク質に導入したアルキン構造とクリックケミストリーにより共有結合を形成するアジド基で置換されていてもよい。そのようなラベル化置換基は、特に限定されず、当該技術分野において公知のものであれば用いることができる。
　また、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、それぞれＲ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。その場合、Ｒ４とＲ２、又はＲ５とＲ２の組み合わせのいずれか一方のみが環構造を形成してもよいし、いずれもが環構造を形成してもよい。
　Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子、アルキル基を示し、又は、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）がアミド基もしくはカルバメート基を形成するものであることができる。Ｒ６及びＲ７がともにアルキル基を示す場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、Ｒ６及びＲ７はそれぞれ独立に、水素原子、メチル基又はエチル基であることが好ましく、Ｒ６及びＲ７がいずれも水素原子であるか、またはいずれもメチル基である場合がさらに好ましい。Ｒ６又はＲ７の一方が水素原子であって、他方がカルボニル基であることも好ましい。この場合、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）はアミド結合を形成する。カルボニル基に結合する他の置換基は特に限定されないが、アルキル基が好ましく、メチル基がより好ましい。場合によっては、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）が、上述したラベル化置換基を含むことが好ましい。その場合、それら自身がラベル化置換基であってもよいし、又はラベル化置換基を含む置換基によって置換されていてもよい。上述のとおり、そのようなラベル化置換基は、特に限定されず、当該技術分野において公知のものであれば用いることができる。
　また、Ｒ６又はＲ７がアルキル基である場合、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。その場合、Ｒ６とＲ３、又はＲ７とＲ３の組み合わせのいずれか一方のみが環構造を形成してもよいし、いずれもが環構造を形成してもよい。
　上記各置換基の好ましい組み合わせとしては、例えば、Ｘが、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）であり、Ｒａ及びＲｂは、いずれもメチル基であり、Ｒ１が水素原子又はフェニル基であり、Ｒ２及びＲ３は、いずれも水素原子であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれも水素原子又はいずれもメチル基である場合が挙げられる。同様に、Ｘが、酸素原子であり、Ｒ１が水素原子又はフェニル基であり、Ｒ２及びＲ３は、いずれも水素原子であり、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれも水素原子又はいずれもメチル基である場合も好ましい。
　本発明の超解像蛍光イメージング用プローブとして代表的な式（Ｉ）の化合物の具体例としては、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006

を挙げることができる。ただし、これらに限定されるものではない。また、当該化合物は、任意の位置にラベル化置換基を有することができる。
　上記式（Ｉ）で表される化合物は、Ｒ６及びＲ７が連結するＮ原子において１価の正電荷を有するため、通常は塩として存在する。そのような塩としては、塩基付加塩、酸付加塩、アミノ酸塩などを挙げることができる。塩基付加塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩などの金属塩、アンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩、ピペリジン塩、モルホリン塩などの有機アミン塩を挙げることができ、酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、トリフルオロ酢酸塩などのカルボン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩などの有機酸塩を挙げることができる。アミノ酸塩としてはグリシン塩などを例示することができる。もっとも、これらの塩に限定されることはない。
　式（Ｉ）で表される化合物は、置換基の種類に応じて１個または２個以上の不斉炭素を有する場合があり、光学異性体又はジアステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合がある。純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などはいずれも本発明の範囲に包含される。
　式（Ｉ）で表される化合物又はその塩は、水和物又は溶媒和物として存在する場合もあるが、これらの物質はいずれも本発明の範囲に包含される。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、エタノール、アセトン、イソプロパノールなどの溶媒を例示することができる。
　上記の蛍光プローブは、必要に応じて、生理的環境で用いるための添加剤を配合して組成物として用いてもよい。そのような添加剤としては、例えば、溶解補助剤、ｐＨ調節剤、緩衝剤、等張化剤などの添加剤を用いることができ、これらの配合量は当業者に適宜選択可能である。これらの組成物は、粉末形態の混合物、凍結乾燥物、顆粒剤、錠剤、液剤など適宜の形態の組成物として提供され得る。
　本明細書の実施例には、式（Ｉ）で表される本発明の化合物に包含される代表的化合物についての製造方法が具体的に示されているので、当業者は本明細書の開示を参照することにより、及び必要に応じて出発原料や試薬、反応条件などを適宜選択することにより、式（Ｉ）に包含される任意の化合物を容易に製造することができる。
３．本発明のプローブを用いた超解像蛍光イメージング方法
　本発明の超解像蛍光イメージング方法は、生体分子に上記で説明した式（Ｉ）のプローブ分子を接触させ、－ＳＨ基を含有する化合物の存在下で、これにレーザー光を照射して前記プローブ分子からの蛍光発光を撮影したＣＣＤカメラ等によって画像データを取得し、一定の時間間隔でこれを繰り返して得られた複数の前記画像データを解析したうえで重ね合わせることによって、前記生体分子の構造に対する超高解像のイメージ画像を得ることを含むものである。観測対象となる生体分子としては、細胞膜（脂質）、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ等が挙げられる。
　かかるイメージング方法としては、典型的には、ＳＭＬＭ（ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）による超解像蛍光イメージングを用いることができ、その原理については、非特許文献１に詳述されている。従って、本発明の超解像蛍光イメージング方法における基本手順は、式（Ｉ）のプローブを用いる点以外は、当該文献に記載された超解像蛍光イメージング手法を参照することができる。
　本発明の超解像蛍光イメージング方法は、水溶液中の式（Ｉ）の化合物が、グルタチオン等の－ＳＨ基含有化合物の求核付加を受けると可視光領域の吸収及び蛍光が消失し、当該付加した－ＳＨ基含有化合物が解離すると吸収及び蛍光が回復する現象を光明滅機構として利用するものである。かかる求核付加－解離平衡反応の機構を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　反応前（左側）の化合物（Ｉ）では４００～７００ｎｍ程度の励起光を吸収して強い蛍光を発光するのに対し、求核性化合物（ここで、グルタチオン等の-ＳＨ基を含有する化合物を「Ｒ－ＳＨ」と示している。）によりキサンテン様の縮合環の９位が求核攻撃されると化合物（ＩＩ）では可視光領域の吸収及び蛍光とも消失する。そして、この分子間の求核付加反応が、可逆性を有する求核付加－解離平衡反応となることから、所定の解離定数及び求核付加反応速度となるプローブ分子を用いることで、超解像蛍光イメージングに適した蛍光明滅が得られることを利用したものである。なお、かかる求核付加－解離平衡反応をもたらす求核性化合物としては、ここで示した－ＳＨ基含有化合物以外にも、例えば、水や水酸化物イオン等の－ＯＨ基を含有する化合物、或いはタンパク質におけるリジン残基等の－ＮＨ基含有化合物を用いることができる。
　特に、グルタチオンは、細胞内に数ｍＭオーダー前後の濃度で存在することが知られているため、かかる濃度範囲のグルタチオンの存在下で上記平衡反応による好ましい蛍光明滅が一般に用いられる検出器であるＣＣＤカメラ等のフレームレートに最適化することによって、従来のように高濃度のチオール又は還元剤の別途添加や高強度のレーザー照射など、プローブ分子を無蛍光状態とするために外部刺激を用いることなく、生理的条件下の生細胞中において超解像蛍光イメージングを行うことができる。
　さらに、本発明では、用いるレーザーの強度を従来の１／１０程度で行うことができるため、細胞毒性を低減することができるという利点も有する。当該レーザーの強度は、０．０００１～１０ｋＷ/ｃｍ２程度であることが好ましく、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）や細胞毒性等の観点から、０．０１～０．５ｋＷ/ｃｍ２程度であることがより好ましい。
　ＳＭＬＭによる超解像蛍光イメージングでは、光の回折限界よりも近接した場所において蛍光プローブ分子が発光することは好ましくないため、一度の測定において蛍光を発する状態のプローブ分子は、一定割合以下である必要がある。従って、上記平衡における化合物（Ｉ）と化合物（ＩＩ）の存在比は、中性条件の水系溶液中において、室温で、１：１００００～１：１０であることが好ましく、１：１０００～１：１００がより好ましい。特に、プローブ分子と求核付加－解離平衡反応を行う求核性化合物が、細胞内に数ｍＭオーダー前後の濃度で存在するグルタチオンである場合、このような存在比となるためには、上記求核付加－解離平衡の解離定数Ｋdが、０．１μＭ～１０ｍＭの範囲内が好ましく、ラベル化密度の向上の観点から０．１～１００μＭの範囲内となることがより好ましい。当該解離定数は、Ｋd＝［平衡状態における（Ｉ）の濃度］[グルタチオンの濃度]／［平衡状態における（ＩＩ）の濃度］で表され、当該技術分野における周知の手法によって実験的に算出することができる。
　また、検出器であるＣＣＤカメラ等のフレームレートに対応させるためには、蛍光状態の式（Ｉ）の化合物の寿命は、１マイクロ秒～１秒の範囲であることが好ましく、シグナル対ノイズ比（Ｓ／Ｎ比）の向上の観点から１ミリ秒～１秒の範囲であることがより好ましい。そのような寿命の範囲となるためには、上記平衡における求核付加反応速度定数が、中性条件の水系溶液中において、室温で、１～１．０ｘ１０６ｓ－１の範囲であることが好ましく、１～１０００ｓ－１の範囲であることがより好ましい。当該反応速度については、当該技術分野において公知のレーザーフラッシュフォトリシス等のシステムを用いて、ナノ秒レーザーによって蛍光プローブを励起し、ナノ秒～ミリ秒オーダーの過渡吸収を測定することによって算出することができる。
　上記求核付加－解離平衡反応において求核性分子として機能する化合物は、－ＳＨ基を含有する化合物であって、好ましくは、細胞内に存在する求核性分子であるグルタチオンである。ただし、ここで挙げたグルタチオンに限らず、分子内に－ＳＨ基を有する分子であれば、広くシステイン残基を有する化合物やペプチドを含むことができ、上記平衡反応が得られる限り、これらの化合物等についても本発明において用いることが可能である。また、上述のとおり、－ＳＨ基を含有する化合物に代えて、分子内に－ＯＨ基や－ＮＨ基等の求核性官能基を有する化合物、例えば、水、リジン残基等を有する化合物やペプチドを含むことができ、上記平衡反応が得られるものであれば本発明における求核性化合物として用いることが可能である。
　上述のとおり、これら解離定数及び求核付加反応速度定数は、式（Ｉ）の化合物における置換基等として適切な組み合わせを選択する分子設計によって、より最適な解離定数及び反応速度を得ることもできる。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらによって限定されるものではない。
１．プローブ分子の合成
　以下に示すとおり、本発明の超解像蛍光イメージング用プローブである化合物２、５、１２、１４、１６、１７、２８、３２、３３、３４、及び３５をそれぞれ合成した。
［化合物2の合成］
　以下のスキームに従って化合物2を合成した。なお、化合物１はKushida K et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 22 (2012) 3908-3911に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　化合物1（23.8 mg, 0.056 mmol, 1 eq.）をTHF（5 ml）に溶かし、アルゴン雰囲気下、-78 °Cで撹拌した。1.9 M フェニルリチウム ジブチルエーテル溶液（200 μl, 0.380 mmol, 7 eq.）をゆっくり加え、室温で1時間撹拌した。1 N 塩酸を加えて酸性にし、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで3回抽出し、得られた有機相を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた化合物をメタノール（2 ml）に溶かし、水素化ホウ素ナトリウムを溶液の色が淡黄色になるまで加えた。水を加えて反応を停止し、ジクロロメタンで２回抽出し、得られた有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた化合物を脱酸素したジクロロメタン（5 ml）に溶かし、1,3-ジメチルバルビツール酸（185 mg, 1.17 mmol, 21 eq.）及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（11 mg, 9 μmol, 0.2 eq.）を加え、室温にて終夜撹拌した。反応液を酢酸エチルで抽出し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液で2回、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた化合物をクロラニル（23 mg, 0.094 mmol, 1.7 eq.）を加えて室温にて5分撹拌し、濃青紫色の反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン/メタノール = 100/0 to 80/20）にて分離し、青紫色のフラクションを回収して溶媒を減圧留去し、さらにHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（1回目：A/B = 90/10 to 10/90, 25 min、2回目：A/B = 70/30 to 30/70, 25 min）、目的化合物2 (10.2 mg, 41%)を青紫色固体として得た。
［化合物 4の合成］　
　以下のスキームに従って化合物4を合成した。なお、化合物3及び化合物4の合成については、Y. Koide et al., J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 5029-5031.に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009

　化合物3（1.80 g, 4.37 mmol, 1 eq.）をTHF（100 ml）に溶かし、アルゴン雰囲気下、－78 °Cで15分間撹拌した。1.1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/n-ヘキサン溶液（9 ml, 9.9 mmol, 2.3 eq.）を15分間かけてゆっくり加えた。次いでジクロロジメチルシラン（700 μl, 5.75 mmol, 1.3 eq.）をTHF（5 ml）に希釈して加えて徐々に室温に戻し、2時間撹拌した。1 N 塩酸を加えて酸性にし、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、THFを減圧除去した。得られた水層を酢酸エチルで抽出し、次いで有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 95/5 to 80/20）、目的化合物4 (852 mg, 63%)を薄黄色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.28 (s, 3H) , 2.96 (s, 12H), 3.98 (s, 2H), 6.76 (dd, J = 8.4, 2.8 Hz, 2H), 7.02 (d, J = 2.8 Hz, 2H), 7.21 (d, J = 8.4 Hz, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.6, 39.3, 41.3, 114.2, 117.7, 128.6, 135.3, 136.2, 148.8.
[化合物5の合成]
　以下のスキームに従って化合物5を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010

化合物4（36.5 mg, 0.115 mmol, 1 eq.）をクロラニル（27 mg, 0.115 mmol, 1 eq.）を加えて室温にて10分撹拌し、濃青色の反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（溶離液：ジクロロメタン/メタノール = 100/0 to 80/20）にて分離し、青色のフラクションを回収して溶媒を減圧留去し、さらにHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 10/90, 25 min）、目的化合物5 (53.6 mg, 96%)を青色固体として得た。
1H NMR (400 MHz, CD3CN): δ 0.50 (s, 6H), 3.30 (s, 12H), 6.89 (dd, J = 9.2, 2.7 Hz, 2H), 7.25 (d, J = 2.7 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 9.2 Hz, 2H), 7.80 (s, 1H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 309.17815, Found, 309.17801 (-0.1 mmu).
[化合物6の合成]
　以下のスキームに従って化合物6を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011

　炭酸カリウム（7.46 g, 54.0 mmol, 2.0 eq.）をアセトニトリル（20 ml）に懸濁させ、3-ブロモ-N-メチルアニリン（4.96 g, 26.7 mmol, 1 eq.）及び臭化アリル（3.87 g, 31.3 mmol, 1.2 eq.）を加え、撹拌しながら90 °Cで終夜加熱還流した。反応混合物をセライトで濾過した後、濾物及びセライトを酢酸エチルで洗浄し、濾液及び洗浄液の混合液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 98/2）、目的化合物6 (5.98 g, 99 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 2.95 (s, 3H), 3.91-3.93 (m, 2H), 5.15-5.21 (m, 2H), 5.79-5.89 (m, 1H), 6.63-6.65 (m, 1H), 6.82-6.86 (m, 2H), 7.06-7.10 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 38.1, 55.0, 110.9, 115.0, 116.4, 119.1, 123.5, 130.4, 133.1, 150.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 226.02259, Found, 226.02210 (-0.5 mmu).
[化合物7の合成]
　以下のスキームに従って化合物7を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012

　化合物6（4.60 g, 20.4 mmol, 1 eq.）及び3-ブロモ-N,N-ジメチルアニリン（5.00 g, 25.0 mmol, 1.2 eq.）を酢酸（10 ml）に溶かし、37 % ホルムアルデヒド水溶液（6.30 ml, 227 mmol, 11 eq.）を加え、80 °Cまで徐々に昇温させた後、3時間加熱した。反応混合液から酢酸を減圧除去し、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/ジクロロメタン = 80/20 to 70/30 to 60/40 to 50/50）、目的化合物7を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 2.92 (s, 3H), 2.93 (s, 6H), 3.88-3.90 (m, 2H), 4.02 (s, 2H), 5.15-5.20 (m, 2H), 5.83 (ddt, 1H, J = 14.8, 12.6, 4.9 Hz), 6.57-6.62 (m, 2H), 6.85 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.88 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 2.7 Hz), 6.96 (d, 1H, J = 2.6 Hz); 13C NMR (100 MHz, THF-d8): δ 38.2, 40.5, 40.6, 55.7, 112.6, 112.7, 116.3, 116.7, 116.8, 126.16, 126.17, 127.6, 127.7, 131.5, 131.6, 134.7, 150.1, 151.2; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 437.02225, Found, 437.02225 (±0.0 mmu).
[化合物8の合成]
　以下のスキームに従って化合物8を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013

　化合物7（900 mg, 2.05mmol, 1 eq.）をTHF（60 ml）に溶かし、アルゴン雰囲気下、－78 °Cで15分間撹拌した。1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/n-ヘキサン溶液（6.50 ml, 6.50 mmol, 3.2 eq.）を８分間かけてゆっくり加え、22分間撹拌した。次いでジクロロジメチルシラン（500 μl, 4.18 mmol, 2.0 eq.）のTHF（13 ml）溶液を加えて徐々に室温に戻し、3時間撹拌した。2 N 塩酸を加えて酸性にし、次いで飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、THFを減圧除去した。得られた水層をジクロロメタンで抽出し、次いで有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 94/6）、目的化合物8 (382 mg, 55 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.44 (s, 6H), 2.927-2.93 (m, 9H), 3.90-3.91 (m, 2H), 3.95 (s, 2H), 5.12-5.20 (m, 2H), 5.85 (ddt, 1H, J = 17.2, 10.2, 5.2 Hz), 6.69-6.74 (m, 2H), 6.97 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.15-7.19 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.7, 38.3, 39.2, 41.2, 55.9, 114.0, 114.2, 116.4, 117.4, 117.6, 128.56, 128.58, 134.3, 134.9, 135.3, 136.09, 136.13, 147.5, 148.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 337.20945, Found, 337.20957 (+0.1 mmu).
[化合物9の合成]
　以下のスキームに従って化合物9を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014

化合物8 (382 mg, 1.13 mmol, 1 eq.)を脱酸素したジクロロメタン（14 ml）に溶かし、1,3-ジメチルバルビツール酸（1.48 g, 9.48 mmol, 8.4 eq.）及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（274 mg, 237 μmol, 0.2 eq.）を加え、室温にて終夜撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 91/9 to 70/30）、目的化合物9 (289 mg, 86 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.44 (s, 6H), 2.85 (s, 3H), 2.93 (s, 6H), 3.94 (s, 2H), 6.58 (dd, 1H, J = 8.1, 2.6 Hz), 6.73 (dd, 1H, J = 8.4, 2.8 Hz), 6.85 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.14 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 8.4 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.7, 31.2, 39.4, 41.3, 113.3, 114.3, 117.4, 117.7, 128.6, 128.7, 135.4, 135.7, 136.1, 136.4, 147.1, 148.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 297.17815, Found, 297.17853 (+0.4 mmu).
[化合物11の合成]
　以下のスキームに従って化合物11を合成した。なお、化合物10の合成については、J. Le Notre et al., Adv. Synth. Catal. 349, 432 (2007).に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015

　化合物9（102.8 mg, 0.347 mmol, 1 eq.）及び化合物10（756.9 mg, 2.94 mmol, 8.5 eq.）をアセトニトリル（4 ml）に溶かし、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（512 μl, 2.94 mmol, 8.5 eq.）及び少量のヨウ化カリウムを加え、80 °Cで5.5時間加熱還流した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 86/14 to 65/35）、目的化合物11 (91.7 mg, 56 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 0.45 (s, 6H), 1.93 (quin, 2H, J = 7.2 Hz), 2.41 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 2.90 (s, 3H), 2.94 (s, 6H), 3.34 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.95 (s, 2H), 5.10 (s, 2H), 6.68 (dd, 1H, J = 8.4, 2.8 Hz), 6.74 (dd, 1H, J = 8.4, 2.8 Hz), 6.95 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 6.99 (d, 1H, J = 2.8 Hz), 7.15 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.18 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.31-7.36 (m, 5H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ -2.7, 22.4, 31.8, 38.6, 39.2, 41.2, 52.4, 66.4, 113.8, 114.2, 117.2, 117.3, 117.7, 128.3, 128.4, 128.5, 128.65, 128.67, 134.8, 136.0, 136.1, 136.2, 147.3, 148.8, 173.2; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 473.26188, Found, 473.26185 (-0.0 mmu).
[化合物12の合成]
　以下のスキームに従って化合物12を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016

　化合物11（171 mg, 0.361 mmol, 1 eq.）をメタノールに溶かし、パラジウム炭素を加え、水素雰囲気下、室温で2日間撹拌した。反応混合物を濾過し、濾液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタンに溶かし、2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノ-p-ベンゾキノン（180.3 mg, 0.794 mmol, 2.2 eq.）を加え、室温で終夜撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、有機相を水及び飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物12 (110 mg, 61 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.54 (s, 6H), 1.95-2.02 (m, 2H), 2.45 (t, 2H, J = 6.5 Hz), 3.34 (s, 3H), 3.37 (s, 6H), 3.73-3.77 (m, 2H), 6.98 (dd, 1H, J = 9.2, 2.7 Hz), 7.02 (dd, 1H, J = 9.1, 2.6 Hz), 7.33 (d, 1H, J = 2.2 Hz), 7.51 (m, 1H), 7.71-7.73 (m, 2H, g), 7.87 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3CN): δ -1.3, 23.0, 31.1, 39.8, 41.4, 53.1, 115.06, 115.12, 122.3, 122.4, 128.25, 128.31, 144.0, 144.1, 148.42, 148.44, 155.68, 156.17, 160.6, 174.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 381.19928, Found, 381.19929 (+0.0 mmu).
[化合物14の合成]
　以下のスキームに従って化合物14を合成した。なお、化合物13の合成については、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２００３，　２１，８６－８９に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017

化合物12（9.40 mg, 0.0190 mmol, 1 eq.）を脱水N,N-ジメチルホルムアミドに溶かし、化合物13（7.5 mg, 0.0277 mmol, 1.5 eq.）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（9.1 mg, 0.0594 mmol, 3.1 eq.）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（6.6 mg. 0.0344 mmol, 1.8 eq.）、及びトリエチルアミン（10 μl, 0.0717 mmol, 3.8 eq.）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で21時間撹拌した後、化合物13（2.3 mg, 0.00850 mmol, 0.45 eq.）を加え、さらに24時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物14 (7.5 mg, 53 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.52 (s, 6H), 1.99-2.06 (m, 2H), 2.38 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.33 (s, 3H), 3.37 (s, 6H), 3.70-3.74 (m, 2H), 4.41 (s, 2H), 5.63 (s, 2H), 6.96-7.00 (m, 2H), 7.31 (d, 1H, J = 2.3 Hz), 7.35 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.41 (br s, 1H), 7.52 (d, 2H, J = 8.1 Hz), 7.68-7.72 (m, 2H), 7.86 (s, 1H), 8.33 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.4, 24.0, 33.1, 39.5, 41.0, 43.8, 53.4, 70.8, 108.2, 115.3, 122.3, 122.4, 128.86, 128.95, 128.98, 130.2, 135.4, 141.0, 143.5, 144.5, 144.6, 149.0, 149.1, 153.7, 156.2, 156.8, 158.3, 161.09, 161.11, 161.7, 174.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 633.31163, Found, 633.31169 (+0.1 mmu).
[化合物16の合成]
　以下のスキームに従って化合物16を合成した。なお、化合物15の合成については、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３，１３５，６１８４－６１９１に開示されており、これに基づいて合成を行なった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018

化合物12（11.3 mg, 0.0228 mmol, 1 eq.）を脱水N,N-ジメチルホルムアミド（1.5 ml）に溶かし、化合物15（9.1 mg, 0.0407 mmol, 1.8 eq.）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（6.1 mg, 0.0451 mmol, 2.0 eq.）、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（7.2 mg. 0.0375 mmol, 1.6 eq.）、及びトリエチルアミン（14.3 μl, 0.103 mmol, 4.5 eq.）を0 °Cで加え、アルゴン雰囲気下で徐々に室温に戻し、終夜撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物16 (9.21 mg, 58 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.55 (s, 6H), 1.32-1.44 (m, 4H), 1.55 (quin, 2H, J = 7.0 Hz), 1.72 (quin, 2H, J = 7.0 Hz), 1.98-2.05 (m, 2H), 2.33 (t, 2H, J = 6.8 Hz), 3.34 (s, 3H), 3.38 (s, 6H), 3.44 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 3.50-3.60 (m, 10H), 3.73 (t, 2H, J = 7.7 Hz), 6.98-7.03 (m, 2H), 7.33 (d, 1H, J = 2.5 Hz), 7.41 (br s, 1H), 7.71-7.73 (m, 2H), 7.88 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.4, 24.0, 26.5, 27.7, 30.5, 33.2, 33.7, 39.6, 40.4, 41.0, 45.7, 53.4, 70.5, 71.21, 71.24, 72.2, 115.26, 115.29, 122.3, 122.4, 128.97, 129.00, 144.57, 144.60, 149.0, 149.1, 156.2, 156.8, 161.1, 174.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 586.32262, Found, 586.32267 (+0.0 mmu).
[化合物17の合成]
　以下のスキームに従って化合物17を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019

化合物12（7.0 mg, 0.0142 mmol, 1 eq.）を脱水N,N-ジメチルホルムアミド（5 ml）に溶かし、N-ヒドロキシコハク酸イミド（8.7 mg, 0.0756 mmol, 5.3 eq.）及び1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（6.1 mg. 0.0318 mmol, 2.2 eq.）を加え、アルゴン雰囲気下、室温で33時間撹拌した後、N-ヒドロキシコハク酸イミド（9.8 mg, 0.0852 mmol, 6.0 eq.）及び1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（11.1 mg. 0.0579 mmol, 4.1 eq.）を加え、さらに43時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物17 (1.7 mg, 20 %)を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 0.53 (s, 6H), 2.10-2.17 (m, 2H), 2.82 (t, 2H, J = 6.6 Hz), 2.87 (s, 4H), 3.36 (s, 3H), 3.38 (s, 6H), 3.80-3.84 (m, 2H), 6.98-7.04 (m, 2H), 7.34 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 7.38 (d, 1H, J = 2.4 Hz), 7.71-7.74 (m, 2H), 7.89 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ -1.5, 23.2, 26.5, 28.7, 39.5, 41.1, 52.6, 115.3, 115.4, 122.1, 122.4, 129.0, 129.1, 144.6, 144.8, 148.9, 149.4, 156.1, 156.9, 161.4, 170.2, 171.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 478.21566, Found, 478.21559 (-0.1 mmu).
［化合物19の合成］
　以下のスキームに従って化合物19を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020

炭酸カリウム（11.96 g, 86.54 mmol, 2.5 eq.）をアセトニトリル(40 ml)に懸濁させ、3-ブロモアニリン（5.96 g, 34.65 mmol, 1 eq.）及び臭化アリル（21.89 g, 180.9 mmol, 5.2 eq.）を加え、撹拌しながら80 °Cで26時間加熱還流した。室温に戻した後、反応混合物をセライトで濾過し、濾物及びセライトを酢酸エチルで洗浄し、濾液及び洗浄液の混合液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 89/11）、目的化合物19（5.68 g, 22.5 mmol, 65 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.93-3.95 (m, 4H), 5.20-5.25 (m, 4H), 5.83-5.93 (m, 2H), 6.64-6.67 (m, 1H), 6.84-6.89 (m, 2H), 7.06-7.10 (m, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 52.7, 110.9, 115.0, 116.3, 119.1, 123.4, 130.3, 133.3, 149.9; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 252.03824, Found, 252.03819 (-0.1 mmu).
[化合物21の合成]
　以下のスキームに従って化合物21を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021

アルゴンガスを封入したフラスコ内で化合物20（1.57 g, 6.22 mmol, 1 eq.）をトルエン（10 ml）に溶かし、N,N-ジメチルホルムアミド（700 μl, 9.04 mmol, 1.5 eq.）及び塩化ホスホリル（700 μl, 7.51 mmol, 1.2 eq.）を加え、80 °Cで3.5時間撹拌した。室温に戻した後、2N水酸化ナトリウム水溶液を加え、混合溶液からトルエンを減圧除去した。得られた水層をジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をメタノールに溶かし、0 °C下で水素化ホウ素ナトリウム(376.5 mg, 9.95 mmol, 1.6 eq.)を加え、10分間撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 83/17 to 62/38）、目的化合物21（740 mg, 2.62 mmol, 42 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.89-3.90 (m, 4H), 4.59 (s, 2H), 5.13-5.19 (m, 4H), 5.82 (ddt, 2H, J = 17.0, 10.5, 4.8 Hz), 6.60 (dd, 1H, J = 8.5, 2.6 Hz), 6.86 (d, 1H, J = 2.6 Hz), 7.20 (d, 1H, J = 8.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 52.7, 64.8, 111.4, 115.9, 116.4, 124.3, 127.1, 130.3, 133.2, 149.3; HRMS (ESI+): Calcd for [M+Na]+, 304.03075, Found, 304.03081 (+0.1 mmu).
[化合物23の合成]
　以下のスキームに従って化合物23を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022

炭酸カリウム（9.53 g, 68.97 mmol, 2.1 eq.）をアセトニトリル（30 ml）に懸濁させ、アニリン（3.07 g, 32.96 mmol, 1 eq.）及び臭化アリル（10.28 g, 85.01 mmol, 2.6 eq.）を加え、撹拌しながら80 °Cで5時間加熱還流した。臭化アリル（2.58 g, 21.29 mmol, 0.6 eq.）を追加した後、80 °Cでさらに13時間撹拌及び加熱還流した。室温に戻した後、反応混合物をセライトで濾過し、濾物及びセライトを酢酸エチルで洗浄し、濾液及び洗浄液の混合液から溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 97/3）、目的化合物23（5.35 g, 30.9 mmol, 94 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.86-3.88 (m, 4H), 5.10-5.18 (m, 4H), 5.82 (ddt, 2H, J = 17.2, 10.3, 4.9 Hz), 6.64-6.68 (m, 3H), 7.14-7.19 (m, 2H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 52.8, 112.4, 116.0, 116.4, 129.1, 134.1, 148.7; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 174.12773, Found, 174.12867 (+0.9 mmu).
[化合物25の合成]
　以下のスキームに従って化合物25を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
化合物21（386.0 mg, 1.368 mmol, 1.1 eq.）及び化合物23（218.8 mg, 1.263 mmol, 1 eq.）を脱水ジクロロメタン（10 ml）に溶かし、0 °C下で三フッ化ホウ素ジエチルエーテル錯体（500 μl, 4.051 mmol, 3.2 eq.）を少しずつ加え、10分間撹拌した後、室温に戻してさらに3時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 100/0 to 88/12）、目的化合物25（395.2 mg, 0.903 mmol, 72 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 3.90-3.94 (m, 10H), 5.17-5.25 (m, 8H), 5.82-5.94 (m, 4H), 6.60 (dd, 1H, J = 8.6, 2.7 Hz), 6.67-6.70 (m, 2H), 6.93 (d, 1H, J = 2.7 Hz), 6.98 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.08 (d, 2H, J = 8.6 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 39.7, 52.9, 53.0, 111.9, 112.6, 116.06, 116.12, 116.3, 125.5, 128.4, 128.6, 129.6, 131.1, 133.7, 134.4, 147.2, 148.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 437.15869, Found, 437.15873 (+0.0 mmu).
[化合物26の合成]
　以下のスキームに従って化合物26を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024

アルゴンを封入したフラスコ内で化合物25（208.5 mg, 0.477 mmol, 1 eq.）を脱水テトラヒドロフラン（15 ml）に溶かし、撹拌しながら-78 °Cに冷却した。1 M sec-ブチルリチウム シクロヘキサン/ノルマルヘキサン溶液（1.0 ml, 1.0 mmol, 2.1 eq.）を少しずつ加え、10分間撹拌した。次いで脱水アセトン（210 μl, 2.85 mmol, 6.0 eq.）を少しずつ加え、-78 °Cのまま15分間撹拌した後、室温に戻し、さらに5時間撹拌した。飽和塩化アンモニウム水溶液を加えた後、テトラヒドロフランを減圧除去した。得られた水相をジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 89/11 to 68/32）、目的化合物26（125.8 mg, 0.302 mmol, 63 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.61 (s, 6H), 1.77 (s, 1H), 3.87-3.89 (m, 4H), 3.91-3.92 (m, 4H), 4.17 (s, 2H), 5.12-5.23 (m, 8H), 5.80-5.92 (m, 4H), 6.57 (dd, 1H, J = 8.5, 2.7 Hz), 6.62 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 6.83 (d, 1H, J = 2.7 Hz), 6.94-6.98 (m, 3H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 31.9, 38.0, 53.0, 53.2, 74.3, 110.3, 111.4, 112.7, 116.1, 116.2, 126.5, 129.4, 130.9, 134.0, 134.5, 134.6, 146.6, 146.9, 147.0; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 417.29004, Found, 417.29000 (-0.0 mmu).
[化合物27の合成]
　以下のスキームに従って化合物27を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025

0 °C下で化合物26（188.5 mg, 0.452 mmol, 1 eq.）に80 %硫酸を加え、30分間撹拌した後、室温に戻し、さらに30分間激しく撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去し、目的化合物（177.2 mg, 0.445 mmol, 98 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.49 (s, 6H), 3.80 (s, 2H), 3.91-3.93 (m, 8H), 5.12-5.21 (m, 8H), 5.89 (ddt, 4H, J = 17.2, 10.3, 5.0 Hz), 6.57 (dd, 2H, J = 8.3, 2.6 Hz), 6.90 (d, 2H, J = 2.6 Hz), 7.02 (d, 2H, J = 8.3 Hz); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 29.4, 34.6, 40.6, 54.6, 110.7, 112.2, 116.3, 126.0, 129.1, 136.1, 146.7, 148.8; HRMS (ESI+): Calcd for [M+H]+, 399.27948, Found, 399.27955 (+0.1 mmu).
[化合物28の合成]
　以下のスキームに従って化合物28を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026

1,3-ジメチルバルビツール酸（60.55 mg, 0.388 mmol, 27 eq.）及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（7.8 mg, 0.00675 mmol, 0.47 eq.）を入れたフラスコにアルゴンを封入し、脱酸素したジクロロメタン（7 ml）に溶かした化合物27（5.7 mg, 0.0143 mmol, 1 eq.）を加え、室温で終夜撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタンに溶かし、p-クロラニル（20.0 mg, 0.0813 mmol, 5.7 eq.）を加え、室温で1時間撹拌した。水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物28（2.1 mg, 0.00599 mmol, 42 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.63 (s, 6H), 6.77 (dd, 2H, J = 8.7, 2.0 Hz), 7.08 (dd, 2H, J = 2.0, 0.8 Hz), 7.63 (d, 2H, J = 8.7 Hz), 8.06 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 33.5, 42.6, 114.1, 116.0, 122.1, 141.6, 156.2, 159.5, 161.4; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 237.13862, Found, 237.13854 (-0.1 mmu).
[化合物29の合成]
以下のスキームに従って化合物29を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027

1,3-ジメチルバルビツール酸（2.99 g, 19.14 mmol, 25 eq.）及びテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム（181.0 mg, 0.157 mmol, 0.2 eq.）を入れたフラスコにアルゴンを封入し、脱酸素したジクロロメタン（15 ml）に溶かした化合物27（307.0 mg, 0.770 mmol, 1 eq.）を加え、室温で4時間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物29（157.0 mg, 0.65 mmol, 86 %）を得た。
[化合物31の合成]
　以下のスキームに従って化合物31を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028

4-ブロモ酪酸（2.57 g, 15.39 mmol, 1 eq.）をジクロロメタン（20 ml）に溶かし、硫酸マグネシウム（7.74 g, 64.30 mmol, 4.2 eq.）、tert-ブチルアルコール（5.70 g, 76.95 mmol, 5 eq.）、及び濃硫酸（0.25 ml）を加え、室温で2日間撹拌した。飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣を中圧シリカゲルクロマトグラフィーで精製し（溶離液：ノルマルヘキサン/酢酸エチル = 50/50）、目的化合物31（1.17 g, 5.24 mmol, 47 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.27 (s, 9H), 1.91-1.98 (m, 2H), 2.22 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.27 (t, 2H, J = 6.5 Hz); 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 27.9, 28.0, 32.8, 33.7, 80.5, 171.7.
[化合物32の合成]
　以下のスキームに従って化合物32を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029




化合物29（31.0 mg, 0.130 mmol, 1 eq.）をアセトニトリル（2 ml）に溶かし、化合物31（22.3 mg, 0.100 mmol, 0.8 eq.）、N,N-ジイソプロピルエチルアミン (113.3μl, 0.650 mmol, 5 eq.)、及び少量のヨウ化カリウムを加え、60 °Cで21時間撹拌した後、80 °Cでさらに7時間撹拌した。室温に戻した後、水を加え、ジクロロメタンで抽出し、次いで有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタン（10 ml）に溶かし、トリフルオロ酢酸（2 ml）を加え、室温で2時間撹拌した後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をジクロロメタン（5 ml）及びメタノール（2 ml）に溶かし、p-クロラニル（34.1 mg, 0.139 mmol, 1.1 eq.）を加え、室温で30分間撹拌した後、溶媒を減圧除去した。得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物29（11.7 mg, 0.0268 mmol, 21 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.65 (s, 6H), 1.94-2.01 (m, 2H), 2.46 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.50 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 6.77 (dd, 1H, J = 2.0, 8.7 Hz), 6.84 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 7.09 (d, 1H, J = 2.0 Hz), 7.15 (br s, 1H), 7.61-7.66 (m, 2H), 8.05 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 25.2, 31.7,33.6, 43.5, 114.1, 116.0, 122.2, 122.4, 141.4, 155.9, 159.6, 161.2, 176.6; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 323.17540, Found, 323.17538 (-0.0 mmu).
[化合物33の合成]
　以下のスキームに従って化合物33を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030

化合物32（1.1 mg, 0.00252 mmol, 1 eq.）をN,N-ジメチルホルムアミド（2 ml）に溶かし、0 °C下で3-アジドプロピルアミン（0.74 μl, 0.00756 mmol, 3 eq.）、 N,N-ジイソプロピルアミン（8.8 μl, 0.0504 mmol, 20 eq.）、及び O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（5.9 mg, 0.0155 mmol, 6.1 eq.）を加え、15分間撹拌した後、室温に戻してさらに13時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物33（1.0 mg, 0.00193 mmol, 77 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.66 (s, 6H), 1.76 (qui, 2H, J = 6.7 Hz), 1.99 (qui, 2H, J = 7.2 Hz), 2.35 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.27 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 3.35 (t, 2H, J = 6.7 Hz), 3.48 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 6.77 (dd, 1H, J = 2.1, 8.7 Hz), 6.83 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 7.09-7.11 (m, 2H), 7.11 (brs, 1H), 7.62-7.67 (m, 2H), 8.06 (s, 1H); 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 25.9, 29.7, 33.6, 33.8, 37.8, 40.4, 43.7, 43.7, 50.1, 114.1, 116.0, 122.2, 122.4, 141.5, 155.9, 159.5, 161.3, 175.1; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 405.24028, Found, 405.23991 (-0.4 mmu).
[化合物34の合成]
　以下のスキームに従って化合物34を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031

化合物32（1.15 mg, 0.00356 mmol, 1 eq.）及び化合物13（3.6 mg, 0.0133 mmol, 3.3 eq.）をN,N-ジメチルホルムアミド（1.5 ml）に溶かし、0 °C下で1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（4.5 mg, 0.0235 mmol, 6.6 eq.）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（2.0 mg, 0.0148 mmol, 4.2 eq.）、及びトリエチルアミン（4.96 μl, 0.0356, 10 eq.）を加え、10分間撹拌した後、室温に戻してさらに22時間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物34（1.3 mg, 0.00189 mmol, 72 %）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.62 (s, 6H), 1.98-2.05 (m, 2H), 2.40 (t, 2H, J = 7.0 Hz), 3.44-3.48 (m, 2H), 4.40 (s, 2H), 5.59 (s, 2H), 6.75-6.81 (m, 2H), 7.06-7.08 (m, 2H), 7.33 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.49 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.60-7.65 (m, 2H), 8.03 (s, 1H), 8.16 (s, 1H); HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 575.28775, Found, 575.28769 (-0.1 mmu).
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.62 (s, 6H, f), 1.98-2.05 (m, 2H, l), 2.40 (t, 2H, J = 7.0 Hz, m), 3.44-3.48 (m, 2H, k), 4.39 (s, 2H, o), 5.59 (s, 2H, r), 6.74-6.79 (m, 2H, c, h), 7.06-7.08 (m, 2H, b, i), 7.32 (d, 2H, J = 8.0 Hz, q), 7.48 (d, 2H, J = 8.0 Hz, p), 7.59-7.64 (m, 2H, d, g), 8.00 (s, 1H, t), 8.02 (s, 1H, e),; HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 575.28775, Found, 575.28769 (-0.1 mmu).
[化合物35の合成]
　以下のスキームに従って化合物35を合成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032

化合物32（2.3 mg, 0.00711 mmol, 1 eq.）及び化合物15（5.3 mg, 0.0237 mmol, 3.3 eq.）をN,N-ジメチルホルムアミド（2 ml）に溶かし、0 °C下で1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（3.2 mg, 0.0167 mmol, 2.3 eq.）、1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（3.0 mg, 0.0222 mmol, 3.1 eq.）、及びトリエチルアミン（9.9 μl, 0.0711, 10 eq.）を加え、15分間撹拌した後、室温に戻してさらに2日間撹拌した。溶媒を減圧除去し、得られた残渣をHPLCで精製し（溶離液A（H2O, 1 % アセトニトリル, 0.1 % トリフルオロ酢酸）、溶離液B（アセトニトリル, 1 % H2O）（A/B = 90/10 to 0/100 40 min））、目的化合物35（1.2 mg, 0.00187 mmol, 36 % yield）を得た。
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.29-1.43 (m, 4H), 1.563 (qui, 2H, J = 7.2 Hz), 1.66 (s, 6H), 1.69-1.77 (m, 2H), 2.00 (qui, 2H, J = 7.2 Hz), 2.36 (t, 2H, J = 7.2 Hz), 3.37-3.61 (m, 14H), 6.77 (dd, 1H, J = 2.0, 8.8 Hz), 6.84 (d, 1H, J = 7.6 Hz), 7.09-7.11 (m, 2H), 7.62-7.64 (m, 2H), 8.06 (s, 1H);　HRMS (ESI+): Calcd for [M]+, 528.29875, Found, 528.29876 (+0.0 mmu).
解離定数の算出
　本発明のプローブ化合物について、グルタチオン添加に伴う吸収スペクトル変化及び蛍光スペクトル変化を測定し、本発明のプローブ化合物とグルタチオンとの間の求核付加－解離平衡反応における解離定数を算出した。
　図１～５に、化合物２、５、１２、１４、１６の吸収スペクトル変化（左図）、蛍光スペクトル変化（中央図；励起波長：化合物２は５７０ｎｍ、化合物５、１４及び１６は６２０ｎｍ、化合物１２は６００ｎｍ）、及び吸光度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）をそれぞれ示す。測定は、プローブ化合物が１μＭの１％ＤＭＳＯ水溶液で行った。得られた解離定数の値を以下の表１－１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
　同様に、図６及び７に、化合物２８及び３２の吸収スペクトル変化（左図）、蛍光スペクトル変化（中央図；励起波長５３０ｎｍ）、及び吸光度及び蛍光強度のグルタチオン濃度依存性のプロット（右図）をそれぞれ示す。測定は、プローブ化合物が１μＭの１％ＤＭＳＯ水溶液で行った。得られた解離定数の値を以下の表１－２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034



　これら化合物の解離定数は、いずれも１～１００μＭの範囲であり、細胞内と同程度である数ｍＭのグルタチオン濃度下において、その大部分が無蛍光性求核付加体として存在することが分かった。このことは、蛍光を発光する未反応のプローブ化合物と、グルタチオンと反応して消光した化合物との存在比率がＳＭＬＭによる超解像蛍光イメージングに適した範囲内であることを示している。
反応速度の算出
　レーザーフラッシュフォトリシスにより、種々のグルタチオン濃度における本発明のプローブ化合物の過渡吸収の経時変化を測定することによって、本発明のプローブ化合物とグルタチオンとの間の求核付加－解離平衡反応における求核付加反応速度定数ｋ、求核付加反応速度時定数τを算出した。溶液条件は、１％ＤＭＳＯ水溶液、ｐＨ７．４（１０ｍＭ　ＮａＰｉバッファー）である。測定条件は２９５Ｋで、光源は１０ｍＪ/ｐｕｌｓｅのＸｅＣｌエキシマーレーザー（３０８ｎｍ）である。化合物２、５、１２、２８、及び３２について得られた結果をそれぞれ表２～６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038

Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　表２～表６の結果より、本発明のプローブ化合物は、グルタチオンとの間の求核付加がミリ秒オーダーの時定数で進行すること、及び、従来の１／１０以下の強度のレーザー照射下で超解像蛍光イメージングに適した蛍光明滅を示すことが明らかとなった。
蛍光量子収率の測定
　本発明のプローブ化合物について、蛍光量子収率を測定した。溶液条件は、プローブ化合物１μＭ、１％ＤＭＳＯ水溶液、ｐＨ７．４（２００ｍＭ　ＮａＰｉバッファー）である。化合物５、１２、１４、１６、１７、２８、及び３２について得られた結果を表７に示す。本発明のプローブ化合物は、ＳＭＬＭによる超解像蛍光イメージングに適した高い蛍光量子収率を示すことが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
超解像多色イメージング
　本発明のプローブ化合物でラベル化した抗体を用いて、細胞の超解像イメージングを行った。
１．抗体へのプローブのラベル化

　化合物５の末端にスクシンイミジルエステルを導入したプローブ化合物である化合物１７をＤＭＳＯに溶解し、１ｍＭ及び１０ｍＭのストック溶液を調製した。β－チューブリンの間接免疫染色のためのヤギ由来・抗マウス二次抗体（ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）及びＴｏｍ２０の間接免疫染色のためのヤギ由来・抗ウサギ二次抗体（ＩｇＧ、Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ社）をそれぞれ、０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）中で化合物１７と混和した（室温、３０分間）。プローブ化合物でラベル化した抗体を、溶離液としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４、ＧＩＢＣＯ社）を用いてＰＤ　ＭｉｎｉＴｒａｐ　ＴＭ　Ｇ－２５（ＧＥヘルスケア社）によって精製した。抗体に対するプローブ化合物の標識度（ＤＯＬ）として、プローブ化合物［ｍｏｌ］／抗体分子［ｍｏｌ］の比を算出した。ここで、プローブ化合物の濃度はプローブ化合物に由来する吸光度の測定値から算出し、抗体分子の濃度は、精製処理における抗体分子の損失はなかったものと仮定して、調製に使用した抗体分子の全量から算出した。超解像イメージング（ＳＭＬＭ）においては、標識度が２．１であるラベル化抗マウス抗体及び標識度が１．３であるラベル化抗ウサギ抗体を使用した。
　化合物２８の末端にアジド基を導入したプローブ化合物である化合物３３についても、同様に抗体へのラベル化を行った。化合物３３及びジベンゾシクロオクチン－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＤＢＣＯ－ＮＨＳ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）をそれぞれＤＭＳＯに溶解し、１０ｍＭのストック溶液を調製した。β－チューブリンの間接免疫染色のためのヤギ由来・抗マウス二次抗体（ＩｇＧ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を０．２Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ８．５）中でＤＢＣＯ－ＮＨＳと混和した（室温、３０分間）。ＤＢＣＯ－ＮＨＳでラベル化した抗体（ＤＢＣＯ－ＩｇＧ）を、溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＧＩＢＣＯ社）を用いてＰＤ　ＭｉｎｉＴｒａｐ　ＴＭ　Ｇ－２５（ＧＥヘルスケア社）によって精製した。次いで、得られたＤＢＣＯ－ＩｇＧを含む溶離液に、化合物３３のストック溶液を加え、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＧＩＢＣＯ社）中で混和した（室温、３０分間）。プローブ化合物でラベル化した抗体（ＤＢＣＯ－ＩｇＧ）を、溶離液としてＰＢＳ（ｐＨ７．４、ＧＩＢＣＯ社）を用いてＰＤ　ＭｉｎｉＴｒａｐ　ＴＭ　Ｇ－２５（ＧＥヘルスケア社）によって精製した。
抗体に対するプローブ化合物の標識度（ＤＯＬ）として、プローブ化合物［ｍｏｌ］／抗体分子［ｍｏｌ］の比を算出した。ここで、プローブ化合物の濃度はプローブ化合物に由来する吸光度の測定値から算出し、抗体分子の濃度は、精製処理における抗体分子の損失はなかったものと仮定して、調製に使用した抗体分子の全量から算出した。超解像イメージング（ＳＭＬＭ）においては、標識度が１．４であるラベル化抗体を使用した。
２．細胞固定及び免疫染色
　アフリカミドリザルの腎臓に由来するベロ細胞を、フェノールレッド不含かつＬ－グルタミン含有のダルベッコ改変イーグル培地（高グルコース）（ＧＩＢＣＯ社）にウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）及び１％ペニシリン-ストレプトマイシン溶液（和光純薬工業社）を添加した培地中で培養した（３７℃、５％ＣＯ２）。イメージングを行う前日に、当該細胞をＬａｂ－Ｔｅｋ　ＩＩ　８ウェルチャンバーのカバーガラス（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｃｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に播種した。以下に挙げる文献を参考に、固定と免疫染色を以下のとおり行った。
・M. Bates, G. T. Dempsey, K. H. Chen, X. Zhuang, Multicolor Super-Resolution Fluorescence Imaging via Multi-Parameter Fluorophore Detection. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical chemistry 13, 99-107 (2012)
・B. Huang, S. A. Jones, B. Brandenburg, X. Zhuang, Whole-cell 3D STORM reveals interactions between cellular structures with nanometer-scale resolution. Nature methods 5, 1047-1052 (2008)
・C. Dellagiacoma et al., Targeted photoswitchable probe for nanoscopy of biological structures. Chembiochem 11, 1361-1363 (2010)
・D. R. Whelan, T. D. Bell, Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters. Scientific reports 5, 7924 (2015)
　メタノールによる固定及びβ－チューブリンの免疫染色は以下のとおり行った。事前に３７℃に温めたＰＢＳで細胞を洗浄し、５ｍＭのグリコールエーテルジアミン四酢酸（ＥＧＴＡ）を含む－２０℃のメタノールで５～１０分間固定した。ＢＲＢ８０（１ｍＭの塩化マグネシウム及び１ｍＭのＥＧＴＡを含む８０ｍＭカリウムＰＩＰＥＳバッファー、ｐＨ６．８）で２～３回洗浄し、ブロッキングバッファー（１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）で２０分間ブロッキングした後、ブロッキングバッファーで希釈したマウス抗β－チューブリン抗体（ＴＵＢ２．１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔ４０２６、１／１００希釈）を加え、１時間振盪した。ＢＲＢ８０で５分間ずつ２回洗浄し、ブロッキングバッファーで２０分間ブロッキングした。次いで、ブロッキングバッファーで希釈したラベル化二次抗体（１０～２０μｇ／ｍＬ）で３０分間染色し、ＢＲＢ８０又はＰＢＳで５分間ずつ２回洗浄した。ＳＭＬＭイメージングを行う前に、バッファーを１～１０ｍＭのＧＳＨ（和光純薬工業社）を含む０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファーに置換した。
　パラホルムアルデヒド及びグルタルアルデヒドによる固定、及びβ－チューブリン及びＴｏｍ２０の免疫染色は以下のとおり行った。事前に３７℃に温めたＰＢＳで細胞を洗浄し、３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳで１０分間室温で固定した。直前に調製した０．１％水素化ホウ素ナトリウムのＰＢＳ溶液により、未反応のアルデヒド基及び固定操作の間に生成した蛍光性生成物を還元処理した。ＰＢＳで洗浄した後、ブロッキングバッファー（３％ＢＳＡ及び０．５％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００のＰＢＳ溶液）で２０分間ブロッキング及び膜透過処理した。次いで、ブロッキングバッファーで希釈したマウス抗β－チューブリン抗体（ＴＵＢ２．１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｔ４０２６、／１００希釈）及び／又はウサギ抗Ｔｏｍ２０抗体(Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ、ｓｃ１１４１５、１／５０希釈)を加え、３０分間振盪した。その後、試料を洗浄バッファー（０．２％ＢＳＡ及び０．１％　ＴｒｉｔｏｎＸ－１００のＰＢＳ溶液）で、１０分間ずつ３回洗浄した。ブロッキングバッファーで希釈したラベル化二次抗体（β－チューブリンでは１０～２０μｇ／ｍＬ；Ｔｏｍ２０では１０μｇ／ｍＬ）で３０分間染色した。洗浄バッファーで１０分間ずつ３回洗浄し、さらにＰＢＳで１０分間洗浄し、３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドを含むＰＢＳで室温で１０分間、後固定した。その後、ＰＢＳで３回洗浄した。ＳＭＬＭイメージングを行う前に、バッファーを１～１０ｍＭのＧＳＨ（和光純薬工業社）を含む０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファーに置換した。
３．ＳＭＬＭイメージング
　Ｎ－ＳＴＯＲＭ装置（ニコン社）を用いて、室温でＳＭＬＭイメージングを行った。プローブ化合物である化合物１７及び化合物３３の励起は、それぞれ６４７ｎｍ（４０～５００Ｗ／ｃｍ２）及び５６１ｎｍ（４０～５００Ｗ／ｃｍ２）のレーザー光を用いた全反射照明または全反射照明に近い遮光照明により行った。画像データは、１５ｍｓ／フレームまたは３０ｍｓ／フレームで記録し、画像統合ソフトウェア（ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ニコン社）により解析することで超解像度画像を構築した。超解像度画像の表示にあたっては、１５０フォトン以上又は２００フォトン以上が検出された輝点のみを表示した。
　化合物１７でラベル化した抗体を用いて、固定ベロ細胞中における微小管のＳＭＬＭイメージングを行った結果を図８に示す。図８ａにおける右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。図８ｂは、図８ａの平均化画像の上図（スケールバー：３μｍ）中の帯状領域における規格化された蛍光強度の横断プロファイル及び超解像度画像の上図（スケールバー：３μｍ）中の帯状領域における規格化された認識輝点数の横断プロファイルを示したものである。図８ｃは、図８ａの平均化画像の下図（スケールバー：１μｍ）中の枠内領域における規格化された蛍光強度の横断プロファイル及び超解像度画像の下図（スケールバー：１μｍ）中の枠内領域における規格化された認識輝点数の横断プロファイルを示したものである。図８ｄは、図８ａの超解像度画像の上図を構成する輝点に関してその位置決定精度の度数分布を示したものである。
　図８に示した結果は、化合物１７でラベル化した抗体を用いて、固定ベロ細胞中における微小管の超解像度イメージングを実証したものである。超解像度画像は、微小管の線幅及び近接する微小管どうしの分離において、平均化画像よりも高い空間分解能を示した。
　化合物３３でラベル化した抗体を用いて、固定ベロ細胞中における微小管のＳＭＬＭイメージングを行った結果を図９に示す。図９における右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。
　図９に示した結果は、化合物３３でラベル化した抗体を用いて、固定ベロ細胞中における微小管の超解像度イメージングを実証したものである。超解像度画像は、微小管の線幅及び近接する微小管どうしの分離において、平均化画像よりも高い空間分解能を示した。
　化合物１７でラベル化した抗体及び化合物３３でラベル化した抗体を組み合わせて用いることにより、固定ベロ細胞中における微小管及びミトコンドリアの２色でのＳＭＬＭイメージングを行った結果を図１０に示す。図１０における右図がＳＭＬＭによる超解像度画像であり、左図は比較として蛍光強度の平均化画像を示したものである。化合物３３でラベル化した抗体が緑色で示される微小管を染色しており、一方、化合物１７でラベル化した抗体は赤色で示されるミトコンドリアを染色している。これらの画像をマージすることによって、赤色及び緑色で示される２色での超解像画像が得られた。
　図１０の結果は、上記式（Ｉ）におけるＸの原子を変えた２種類の本発明のプローブ化合物を用いることによって、２色の超解像イメージングに適用できることを実証するものである。

Claims (14)

  1. 以下の式（Ｉ）で表される化合物
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001

    〔式中、
    Ｘは、酸素原子又はＣ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）を表し（ここで、Ｒａ及びＲｂは、それぞれ独立に水素原子、又はアルキル基を表す）；
    Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいアリールを表し（ただし、Ｒ１がフェニル基の場合、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置に置換基を有しない）；
    Ｒ２及びＲ３は、それぞれ独立に、水素原子、ヒドロキシル基、ハロゲン原子、それぞれ置換されていてもよいアルキル基、スルホ基、カルボキシル基、エステル基、アミド基及びアジド基よりなる群から独立に選択される１～３個の同一又は異なる置換基を表し；
    Ｒ４及びＲ５は、それぞれ独立に水素原子又は置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ４）（Ｒ５）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ４又はＲ５がアルキル基である場合、それぞれＲ２と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい）；及び、
    Ｒ６及びＲ７は、それぞれ独立に水素原子もしくは置換されていてもよいアルキル基を表し、又は、Ｎ（Ｒ６）（Ｒ７）がアミド基もしくはカルバメート基を形成する（ここで、Ｒ６又はＲ７がアルキル基である場合、それぞれＲ３と一緒になって、それらが結合する窒素原子を含む環構造を形成してもよい。）〕
    又はその塩を含む超解像蛍光イメージング用プローブであって、
    式（Ｉ）で表される化合物又はその塩が、－ＳＨ基を含有する求核性化合物との間で求核付加－解離平衡反応を行うことを特徴とする、
    該超解像蛍光イメージング用プローブ。
  2. 前記求核付加－解離平衡反応が、Ｒ１が結合する炭素原子において行われる、請求項１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  3. 前記求核付加－解離平衡反応における解離定数が、０．１μＭ～１０ｍＭの範囲内であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  4. 前記求核付加－解離平衡反応における求核付加反応速度定数が、中性条件の水系溶液中において、１～１．０ｘ１０６ｓ－１であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  5. Ｘが、Ｃ（Ｒａ）（Ｒｂ）又はＳｉ（Ｒａ）（Ｒｂ）である、請求項１～４のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  6. Ｒａ及びＲｂが、いずれもメチル基である、請求項５に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  7. Ｒ１は、水素原子又は置換されていてもよいフェニル基である（ただし、当該フェニル基のベンゼン環における２位又は６位の位置に置換基を有しない）、請求項１～６のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  8. Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれも水素原子である、請求項１～７のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  9. Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７が、いずれもメチル基である、請求項１～７のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  10. Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６及びＲ７のうち少なくとも１つが、生体分子と共有結合又は非共有結合によって結合し得るラベル化置換基を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  11. 前記－ＳＨ基を含有する化合物が、システイン残基を有する化合物である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  12. 前記－ＳＨ基を含有する化合物が、グルタチオンである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
  13. 式（Ｉ）で表される化合物が以下の群から選択される化合物である、請求項１に記載の超解像蛍光イメージング用プローブ。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  14. 請求項１～１３のいずれか１項に記載の超解像蛍光イメージング用プローブを用いる超解像蛍光イメージング方法であって、
    生体分子にプローブ分子を結合させ、－ＳＨ基を含有する化合物の存在下でレーザー光を照射して前記プローブ分子からの蛍光発光を撮影した画像データを取得し、一定の時間間隔でこれを繰り返して得られた複数の前記画像データを解析したうえで重ね合わせることによって、前記生体分子の構造に対する超高解像のイメージ画像を得ることを含む、該方法。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108362671A (zh) * 2018-02-23 2018-08-03 银川高新区广煜科技有限公司 检测半胱氨酸的方法
CN112028874A (zh) * 2020-09-10 2020-12-04 苏州富德兆丰生化科技有限公司 艾立替尼的合成方法
CN114728908A (zh) * 2019-11-08 2022-07-08 静冈县公立大学法人 化合物或其盐

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101776551B1 (ko) 2016-11-30 2017-09-11 한국생명공학연구원 Ａｌｐ 검출용 근적외선 형광 프로브 및 이의 제조방법
RU2019120813A (ru) * 2016-12-27 2021-01-11 Профюэсей, Инк. Сенсоры глюкозы, оптически активные в ближней ик-области
CN107033879B (zh) * 2017-04-26 2019-03-29 许昌学院 一种用于检测谷胱甘肽的荧光探针及其制备方法和应用
KR20210040953A (ko) 2018-06-27 2021-04-14 프로퓨사 인코퍼레이티드 근적외선 글루코스 센서
EP3633009A1 (en) * 2018-10-03 2020-04-08 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Use of a substituted or unsubstituted polycyclic aromatic hydrocarbon compound for high-resolution microscopy
CN114106031B (zh) * 2021-10-29 2024-02-23 四川大学 一种检测牙髓状态的次氯酸荧光探针
CN119350307A (zh) * 2024-11-07 2025-01-24 上海泓博智源医药股份有限公司 选择性的细胞核atp小分子探针及其制备方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012111818A1 (ja) * 2011-02-18 2012-08-23 国立大学法人 東京大学 蛍光プローブ
WO2013126816A1 (en) * 2012-02-23 2013-08-29 Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of Portland State University Selective detection of thiols
WO2014106957A1 (ja) * 2013-01-07 2014-07-10 国立大学法人 東京大学 非対称Ｓｉローダミン及びロドールの合成
JP2014157150A (ja) * 2013-01-18 2014-08-28 Univ Of Tokyo 超解像蛍光イメージング用プローブ
WO2015129705A1 (ja) * 2014-02-28 2015-09-03 国立大学法人 東京大学 グルタチオン検出用蛍光プローブ

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9156986B2 (en) * 2003-04-03 2015-10-13 Enzo Life Sciences, Inc. Multisignal labeling reagents and processes and uses therefor
US7776613B2 (en) 2006-08-07 2010-08-17 President And Fellows Of Harvard College Sub-diffraction image resolution and other imaging techniques
EP2748173B1 (en) * 2011-08-26 2016-11-23 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (EPFL) EPFL-TTO Cell permeable, fluorescent dye
EP3502693A1 (en) * 2014-05-16 2019-06-26 Life Technologies Corporation Cell tracking reagents and their methods of use

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012111818A1 (ja) * 2011-02-18 2012-08-23 国立大学法人 東京大学 蛍光プローブ
WO2013126816A1 (en) * 2012-02-23 2013-08-29 Oregon State Board Of Higher Education On Behalf Of Portland State University Selective detection of thiols
WO2014106957A1 (ja) * 2013-01-07 2014-07-10 国立大学法人 東京大学 非対称Ｓｉローダミン及びロドールの合成
JP2014157150A (ja) * 2013-01-18 2014-08-28 Univ Of Tokyo 超解像蛍光イメージング用プローブ
WO2015129705A1 (ja) * 2014-02-28 2015-09-03 国立大学法人 東京大学 グルタチオン検出用蛍光プローブ

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108362671A (zh) * 2018-02-23 2018-08-03 银川高新区广煜科技有限公司 检测半胱氨酸的方法
CN114728908A (zh) * 2019-11-08 2022-07-08 静冈县公立大学法人 化合物或其盐
US12551578B2 (en) 2019-11-08 2026-02-17 Shizuoka Prefectural University Corporation Compound or salt thereof
CN112028874A (zh) * 2020-09-10 2020-12-04 苏州富德兆丰生化科技有限公司 艾立替尼的合成方法
CN112028874B (zh) * 2020-09-10 2021-12-24 苏州富德兆丰生化科技有限公司 艾立替尼的合成方法

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