WO2016129583A1 - 乳酸脱水素酵素阻害剤およびそれを含有する抗てんかん剤 - Google Patents

乳酸脱水素酵素阻害剤およびそれを含有する抗てんかん剤 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a lactate dehydrogenase inhibitor and an antiepileptic agent containing isosafrole (or a derivative thereof) as an active ingredient.
  • Epilepsy is a neurological disorder caused by excessive excitation of brain electrical activity, and is diagnosed by characteristic brain waves (epileptic brain waves). Its prevalence is as high as about 1% of the total population. Drug therapy is mainly used as a method for treating epilepsy, and more than 20 types of epilepsy therapeutic agents are used in clinical settings (Non-patent Document 1). However, it is known that about 30% of epilepsy patients do not succeed with these existing antiepileptic drugs. Under such circumstances, there is a current need for a therapeutic drug for “refractory epilepsy” for which existing drugs do not work.
  • Epilepsy occurs due to excessive neural electrical excitement, so most of its therapeutic drugs target molecules that control electrical activity. Specifically, it is an ion channel, a synaptic receptor, and a neurotransmitter transporter (Non-patent Document 2).
  • “diet therapy” called ketogenic diet is effective for some epileptic patients to whom these existing drugs are not effective (Non-patent Document 3).
  • the antiepileptic mechanism by the ketone diet has been clarified one after another (Non-Patent Documents 4 to 6). That is, if a drug that acts on the energy metabolic pathway can be produced, it is promising as a therapeutic drug for intractable epilepsy.
  • Stilipentol was first developed as a brain disease drug (Patent Document 1), and later proved to be effective for Dravet's syndrome syndrome (a childhood epilepsy) that is one of intractable epilepsy (Non-patent Documents 7 and 8). .
  • Dravet's syndrome syndrome a childhood epilepsy
  • Non-patent Documents 7 and 8 Currently, it is used clinically as a drug for the treatment of Dravet syndrome in Europe (approved in 2007) and Japan (approved in 2012) under the trade name DeerCommit.
  • Dravet's syndrome has been successful, Stilpentol has not been successful in clinical trials for other epilepsy epilepsy (especially adult epilepsy) epilepsy (Non-patent Document 9).
  • Styripentol has an aromatic allyl alcohol structure and has a chemical structure not found in conventional antiepileptic drugs (Patent Document 1). Moreover, it is the only compound as an “antiepileptic agent having an inhibitory action on lactate dehydrase” (Patent Document 2). Antiepileptic agents that act on metabolic pathway (metabolic enzyme) are promising as therapeutic agents for intractable epilepsy. However, while stilipentol works for some childhood intractable epilepsy (Dravet syndrome) epilepsy, it has not been used for other intractable epilepsy.
  • an “antiepileptic agent” that is effective for refractory epilepsy in which styripentol does not work can be developed by maintaining the lactate dehydrogenase inhibitory activity and modifying the chemical structure of styripentol.
  • antiepileptic agents have a very high industrial utility value.
  • an object of the present invention is to provide an antiepileptic agent that has a “lactate dehydrogenase inhibitory action” and is effective for intractable epilepsy in which stilipentol does not work.
  • Patent Document 1 which characterizes styripentol (aromatic allyl alcohol), and the “3-position functional group group” reported in the prior art (Non-Patent Document 14).
  • Isosafrole CAS CAS: 120-58-1, 5- (1-propenyl) -1,3-benzodioxole, which is a substance obtained by removing hydroxy group and tertiary butyl group from position 3 of styripentol (See (II)) Focusing on cocoon.
  • the present invention provides the following invention.
  • R a represents a hydrogen atom, a halogen atom or an alkoxy group which may be substituted with a halogen atom
  • R b represents a hydrogen atom, a halogen atom, an alkoxy group or a nitro group which may be substituted with a halogen atom, or may have a substituent together with R c , R d or R g.
  • R c represents a hydrogen atom or a carboxyl group, or a group that forms a cyclic structure which may have a substituent together with R b , R e ⁇ R f or R g
  • R d represents a hydrogen atom or —X 11 —R 11 , or a group that forms a cyclic structure which may have a substituent together with R b or R g
  • X 11 represents an alkylene group, —NH—CO—, —CH 2 —NR 12 —CO— or —S—
  • R 11 represents an aryl group which may have a substituent, a carboxyl group, an alkyl group which may be substituted with a halogen atom, or a hydroxyalkyl group
  • R 12 represents a hydroxyalkyl group
  • R e , R f and R g are (I) all represent hydrogen atoms, (Ii) R e and R f
  • X 31 is a single bond and R 31 is an optionally substituted heterocyclic amino group, the single bond is bonded to an atom other than the nitrogen atom of the heterocyclic amino group.
  • X 32 represents a single bond or —CH 2 —CO—NH—, R 32 may be substituted with an aryl group which may have a substituent, a heteroaryl group which may have a substituent, a cycloalkyl group which may have a substituent or a halogen atom.
  • X 33 and X 34 each independently represents a single bond, an alkylene group, —CH 2 —CO—NH— or —SO 2 —;
  • R 33 and R 34 are each independently a hydrogen atom, an aryl group which may have a substituent, a heteroaryl group which may have a substituent, or an cycloalkyl which may have a substituent.
  • R 33 and R 34 have a substituent taken together with the nitrogen atom to which they are bonded via X 33 and X 34 is a single bond
  • R 35 , R 36 and R 37 each independently represents a hydrogen atom or —X 31 —R 31 , or a substituent formed integrally with R b , R c , R d, or R e ⁇ R f.
  • An antiepileptic agent comprising as an active ingredient the inhibitor of lactate dehydrogenase according to any one of [1] to [5].
  • Stilipentol is the only “anti-epileptic agent” that has a “lactate dehydrating enzyme inhibitory activity” (Patent Documents 1 and 2).
  • isosafrole as an “antiepileptic agent” having a second “lactate dehydrogenase inhibitory action”. This dramatically suppressed refractory epilepsy for which stilipentol was ineffective (medial temporal lobe epilepsy, an adult refractory epilepsy).
  • isosafrole and isosafrole derivatives are industrially available as antiepileptic drugs.
  • Hippocampal sclerosis model mouse pupae see Examples.
  • A Production method of hippocampal sclerosis model mouse.
  • B Forms of normal hippocampus (left) and hippocampus (right) with hippocampal sclerosis.
  • White arrows indicate the traces of the recording electrodes.
  • C Epilepsy waves (yajiri) recorded from hippocampal sclerosis model mice. Effects of stilipentol and isosafrole on epileptic waves in hippocampal sclerosis model mice (see Examples).
  • B Chemical structure of isosafrole (B 1 ) and action of isosafrole on epilepsy waves (B 2 ). Although almost no inhibitory action by styripentol is observed, isosafrole exhibits a marked antiepileptic action. Aggregated data on the inhibitory action of sodium oxamate, stilipentol, and isosafrole on epileptic waves in hippocampal sclerosis model mice (see Examples). Inhibitory effect of isosafrole on the enzyme activity of lactate dehydrogenase (LDH-1, LDH-5) (see Examples). The enzyme activity (control value) in the absence of isosafrole was set to 100%.
  • LDH-1, LDH-5 lactate dehydrogenase
  • FIG. 6 shows the concentration ( ⁇ M) ⁇ ⁇ that inhibits lactate dehydrogenase and the inhibition rate ⁇ ⁇ (% Inhibition) ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ (see Examples) for the compound having isosafrole in the mother nucleus structure shown in FIG.
  • the present invention provides a lactic acid dehydrogenase inhibitor described in the following (1), and a pharmaceutical product described in (2), which contains the same as an active ingredient.
  • Antiepileptic agent comprising as an active ingredient the inhibitor of lactate dehydrogenase described in (a) IV.
  • isosafrole has a chemical structure in which a 1-propenyl group is attached to the 5-position of 1,3-benzodioxole, which is an aromatic ring.
  • the formula (II) representing isosafrole represents a case where all of R a , R b , R c , R d , R e , R f , R g , and R h in the formula (III) are represented by hydrogen atoms. It corresponds to.
  • examples of compounds having isosafrole as a mother nucleus structure include, for example, modified propenyl groups and those obtained by attaching functional groups to 1,3-benzodioxole, which is an aromatic ring. It is done. However, it is not particularly limited as long as it is a compound having isosafrole as a mother nucleus structure and has a lactate dehydrogenase inhibitory action, and can be used as an antiepileptic agent.
  • Isosafrole and isosafrole analogs are compounds that can be represented by the formula (III). Although some stereoisomers may exist in the compound represented by the formula (III), any stereoisomer is included. In the present invention, a mixture of a plurality of stereoisomers (racemate) is used as an inhibitor of lactate dehydrogenase and as an active ingredient of an antiepileptic agent, but a purified product of any one of the stereoisomers is used. Good. Whether the racemate or each stereoisomer should be used should be determined appropriately by those skilled in the art by examining the effectiveness of each stereoisomer as necessary and taking purification costs into consideration. Can do.
  • R a represents a hydrogen atom, a halogen atom or an alkoxy group (—OR) optionally substituted with a halogen atom.
  • halogen atoms include fluorine (F), chlorine (Cl), bromine (Br), iodine (I) and the like.
  • alkoxy group examples include groups derived from lower alcohols having about 1 to 4 carbon atoms, such as methoxy group (—OCH 3 ) and ethoxy group (—OC 2 H 5 ).
  • methoxy group —OCH 3
  • ethoxy group —OC 2 H 5
  • some or all of the hydrogen atoms may be substituted with halogen atoms, or may not be substituted at all.
  • the alkyl group portion in the alkoxy group may be linear or branched.
  • R b represents a hydrogen atom, a halogen atom, an alkoxy group optionally substituted with a halogen atom or a nitro group (—NO 2 ), or has a substituent together with R c , R d or R g. Represents a group which forms a cyclic structure which may be formed.
  • R c represents a hydrogen atom or a carboxyl group (—COOH), or a group that forms a cyclic structure that may have a substituent together with R b , R e , R f, or R g. .
  • the carboxyl group may be in the form of a carboxylate anion (—COO ⁇ ).
  • R d represents a hydrogen atom or —X 11 —R 11 , or a group that forms a cyclic structure which may have a substituent together with R b or R g .
  • X 11 represents an alkylene group, —NH—CO—, —CH 2 —NR 12 —CO— or —S—.
  • alkylene group examples include divalent groups derived from a lower alkyl group having about 1 to 6 carbon atoms, such as a methylene group (—CH 2 —) and an ethylene group (—C 2 H 5 —).
  • R 11 represents an aryl group which may have a substituent, a carboxyl group, an alkyl group which may be substituted with a halogen atom, or a hydroxyalkyl group.
  • aryl group examples include a phenyl group (—C 6 H 5 ) and a naphthyl group (—C 10 H 9 ).
  • substituent of the aryl group examples include a halogen atom, an alkyl group which may be substituted with a halogen atom, an alkoxy group which may be substituted with a halogen atom, a hydroxy group, a thioalkoxy group (—SR), a carboxyl group Group, an aryl group which may have a substituent, a heteroaryl group which may have a substituent, a cycloalkyl group which may have a substituent, and the like.
  • the number of substituents and the site where the substituent is introduced are arbitrary, and can be appropriately selected depending on the nature of the substituent.
  • alkyl groups include lower alkyl groups having about 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, and octyl groups.
  • the alkyl group may be linear (n-alkyl group) or branched (i-, sec-, tert-alkyl group).
  • some or all of the hydrogen atoms may be substituted with halogen atoms, or may not be substituted at all.
  • hydroxyalkyl group examples include groups derived from lower alcohols having about 1 to 4 carbon atoms, such as oxymethyl group (—CH 2 OH) and oxyethyl group (—C 2 H 5 OH).
  • the portion of the alkyl group in the hydroxyalkyl group may be linear or branched. The number and position of the hydroxy group in the hydroxyalkyl group are arbitrary.
  • R 12 represents a hydroxyalkyl group.
  • R 21 represents a hydroxy group or a group that forms a cyclic structure which may have a substituent together with R c or R g .
  • R 22 represents a nitro group or an aminocarbonyl group in which two hydrogen atoms bonded to a nitrogen atom may be independently substituted with an alkyl group.
  • R g represents a hydrogen atom, —X 31 —R 31 , —O—X 32 —R 32 , —N (—X 33 —R 33 ) (— X 34 —R 34 ), —CR 35 R 36 R 37 To express.
  • X 31 represents a single bond, an alkenylene group, —CH 2 —O—CH 2 —CO—NH—, —CH 2 —O—CH 2 —CO— or —CO—.
  • alkenylene groups include 1-propenylene group (—CH ⁇ CH—CH 2 —), 2-propenylene group (—CH—CH ⁇ CH 2 —) and the like, and lower alkenyl groups having about 2 to 6 carbon atoms. Examples thereof include a derived divalent group. The number and position of carbon-carbon double bonds are arbitrary.
  • R 31 may have an aryl group which may have a substituent, a heteroaryl group which may have a substituent, a cycloalkyl group which may have a substituent, or a substituent. It represents a good heterocyclic amino group, a hydroxy group, an alkoxy group optionally substituted with a halogen atom, or a hydroxyalkyl group. However, when X 31 is a single bond and R 31 is an optionally substituted heterocyclic amino group, the single bond is bonded to an atom other than the nitrogen atom of the heterocyclic amino group.
  • heteroaryl groups include pyridyl group (—C 5 H 5 N), pyrazinyl group (—C 4 H 3 N 2 ), triazinyl group (—C 3 H 2 N 3 ), tetrazinyl group (—C 2 HN). 4 ), pyrrolyl group (—C 4 H 4 N), thienyl group (—C 4 H 3 S), furanyl group (—C 4 H 3 O), 1,3-benzodioxole group, compound No. 26 And a group that Compound No. 34 has.
  • a substituent which a heteroaryl group has the number and position, it can say that it is the same as the substituent which the aryl group has.
  • Examples of the cycloalkyl group include those having about 1 to 6 carbon atoms such as cyclopropyl group, cyclobutyl group, cyclopentyl group, and cyclohexyl group.
  • the examples, number, and position of the substituent that the cycloalkyl group has are the same as the substituent that the aryl group has.
  • heterocyclic amino group examples include pyrrolidinyl group (—C 4 H 8 N), piperidinyl group (—C 5 H 10 N), piperazinyl group (—C 4 H 9 N 2 ), and compound No. 70. Group (see FIGS. 6-10).
  • substituents that the heterocyclic amino group may have the number and position thereof can be the same as those of the aryl group described above.
  • substituent include a phenyl group which may have a substituent (such as a halogen atom or a halogenated alkyl group).
  • X 32 represents a single bond or —CH 2 —CO—NH—.
  • R 32 may be substituted with an aryl group which may have a substituent, a heteroaryl group which may have a substituent, a cycloalkyl group which may have a substituent or a halogen atom. Represents a good alkyl group.
  • X 33 and X 34 each independently represents a single bond, an alkylene group, —CH 2 —CO—NH— or —SO 2 —.
  • R 33 and R 34 are each independently a hydrogen atom, an aryl group which may have a substituent, a heteroaryl group which may have a substituent, or an cycloalkyl which may have a substituent.
  • alkynyl group examples include lower alkynyl groups having about 2 to 6 carbon atoms such as 2,3-propynyl group (—CH 2 —C ⁇ CH).
  • the number and position of carbon-carbon triple bonds are arbitrary.
  • R g represented by —N (—X 33 —R 33 ) (— X 34 —R 34 ) forms a cyclic structure together with R b , R c , R d, or Re ⁇ R f.
  • one of —X 33 —R 33 or —X 34 —R 34 is linked to R b , R c , R d or R e ⁇ R f to form a cyclic structure and the other (particularly hydrogen
  • the form other than the atom may correspond to a substituent bonded to N contained in the cyclic structure (see Compound No. 57: FIG. 6-8 and Compound No. 91: FIG. 6-13).
  • -X 33 -R 33 and -X 34 -R 34 may be combined with R b , R c , R d or R e ⁇ R f to form a cyclic structure ( Compound No. 55: See FIGS. 6-7, including double bonds derived from R 33 and R 34 ).
  • R 35 , R 36 and R 37 each independently represent a hydrogen atom or —X 31 —R 31 , or have a substituent together with R b , R c , R d or R e ⁇ R f. Represents a group which forms a cyclic structure which may be formed.
  • R g represented by —CR 35 R 36 R 37 represents a group which forms a cyclic structure together with R b , R c , R d or R e ⁇ R f , R 35 , R 36 and One or two selected from R 37 are linked to R b , R c , R d or R e ⁇ R f to form a cyclic structure, and the remaining groups (particularly other than hydrogen atoms) are C contained in the cyclic structure.
  • Compound No. 54 see FIG. 6-7, including a double bond derived from R 35 and R 36 and a substituent derived from R 37
  • Compounds No. 59 and 60 see FIGS.
  • R g represented by —CR 35 R 36 R 37 is a group which forms a cyclic structure such as a condensed ring together with R b , R c , R d or R e ⁇ R f.
  • one or two members selected from R 35 , R 36 and R 37 are linked to R b , R c , R d or R e ⁇ R f as described above, and a part of the cyclic structure (of the condensed ring) And the remaining group may be linked to one of the atoms forming the skeleton of the cyclic structure to form a further part of the cyclic structure (the other of the condensed ring) (compound no. 61-65: See Fig. 6-9).
  • R h represents a hydrogen atom or a halogen atom.
  • R d is It represents a hydrogen atom or —X 11 —R 11 (a group that forms a cyclic structure together with R b is not represented).
  • R g is a hydrogen atom
  • R e and R f are also limited to hydrogen atoms. That is, the definition that R g is a hydrogen atom is intended to include isosafrole and derivatives thereof in which all of R e , R f, and R g are hydrogen atoms in the compound represented by formula (III).
  • the compound represented by the formula (III) does not include styripentol in which R e is a hydroxy group, R f is an alkyl group (t-butyl group), and R g is a hydrogen atom.
  • the compound represented by the formula (III) include the compounds (Nos. 1 to 94) listed in FIGS. 6-1 to 6-13.
  • compounds having a predetermined cyclic structure (ring bc, ring bd, ring bg, ring cef, ring cg, ring dg or ring efg) are Nos. 44 to 94 (see the following correspondence table), and the ring structure Compounds having no are No. 1 to 43.
  • Any one of compounds Nos. 1 to 94 and other compounds represented by the formula (III) can be obtained by a person skilled in the art or synthesized according to a known technique.
  • isosafrole which is close to the original structure of isosafrole, wherein all of R e , R f , and R g are hydrogen atoms, and R c and R d are also hydrogen atoms. Or its analog is mentioned. That is, the 3-position carbon atom of the propenyl group in formula (III), and the 1- and 2-position carbon atoms are not modified, and only the 1,3-benzodioxole portion is modified. Good compounds (R a , R b and R h may be other than a hydrogen atom) are preferred.
  • R e and R f taken together represent ⁇ O, ⁇ NR 21 or ⁇ CR 21 R 22
  • R g represents —X 31 —R 31 , —O
  • Embodiments representing —X 32 —R 32 , —N (—X 33 —R 33 ) (— X 34 —R 34 ) or —CR 35 R 36 R 37 are preferred, among which many compounds belong.
  • Particularly preferred are embodiments in which R e and R f together represent ⁇ O.
  • Specific examples of such isosafrole analogs are isosafrole and compounds Nos. 1-44.
  • R b and R c form a cyclic structure
  • the formula (III) can also be described as the following formula (III-bc).
  • the carbon atom on 1,3-benzodioxole to which R b was originally bonded and the carbon atom on the propenyl group to which R c was originally bonded are connected by dotted lines.
  • R bc represents a group in which R b and R c together form a cyclic structure (ring bc) which may have a substituent, and other symbols are defined by the formula (III) ).
  • R b and R d form a cyclic structure
  • the formula (III) can also be described as the following formula (III-bd).
  • the carbon atom on 1,3-benzodioxole to which R b was originally bonded and the carbon atom on the propenyl group to which R d was originally bonded are connected by dotted lines.
  • R bd represents a group in which R b and R d together form a cyclic structure (ring bd) which may have a substituent, and other symbols are defined by the formula (III ).
  • R b and R g form a cyclic structure
  • the formula (III) can also be described as the following formula (III-bg).
  • the carbon atom on 1,3-benzodioxole, to which R b was originally bonded, and the carbon atom on the propenyl group, to which R g was originally bonded, are connected by dotted lines.
  • R bg represents a group in which R b and R g together form a cyclic structure (ring bg) which may have a substituent, and other symbols are defined by the formula (III ).
  • the formula (III) can also be described as the following formula (III-cef).
  • the group R cef bonded to each of the carbon atoms on the propenyl group to which R c and R g were originally bound is represented by R c and R e ⁇ R f as a unit.
  • R c and R e ⁇ R f Represents a group that forms a cyclic structure (ring cef) that may have a substituent, and the definitions of the other symbols are the same as in formula (III).
  • the formula (III) can also be described as the following formula (III-cg).
  • the group R cg bonded to each of the carbon atoms on the propenyl group to which R c and R g were originally bonded is substituted with R c and R g together.
  • the group which forms the cyclic structure (ring cg) which may have a group is represented, and the definitions of other symbols are the same as in formula (III).
  • the formula (III) can also be described as the following formula (III-dg).
  • the group R dg bonded to each of the carbon atoms on the propenyl group to which R d and R g were originally bonded is substituted by R d and R g together.
  • the group which forms the cyclic structure (ring dg) which may have a group is represented, and the definitions of other symbols are the same as in formula (III).
  • the formula (III) can also be described as the following formula (III-efg).
  • a group R efg bonded to the same carbon atom on the propenyl group to which R e ⁇ R f and R g were originally bonded is represented by R e ⁇ R f and R g Represents a group forming a cyclic structure (ring efg) which may have a substituent together, and the definitions of the other symbols are the same as in formula (III).
  • R bc , R bd , R bg , R cef , R cg , R dg , and R efg form part of the skeleton of ring bc, ring bd, ring bg, ring cef, ring cg, ring dg, and ring efg, respectively.
  • the atom to be contained contains at least one carbon atom, nitrogen atom, oxygen atom or sulfur atom.
  • Each ring (cyclic structure) is preferably a 5-membered ring, 6-membered ring, 7-membered ring, or a condensed ring thereof (Compound No. 59, 60: FIGS.
  • a hydrogen atom or a halogen atom may be bonded to each atom constituting the skeleton of the cyclic structure, or a substituent may be bonded.
  • substituent of the cyclic structure include the substituents exemplified as the substituent of the aryl group described above, an oxygen atom or a nitrogen atom bonded by a double bond (Compound Nos. 48-52: FIGS. 6-6 and 6-7).
  • Other relatively large substituents for example, the group represented as R 1 of Compound No. 45-47, 58: FIG. 6-6, represented as R 4 of Compound No. 48-52) Groups: FIGS. 6-6 to 6-7, Groups represented in Compound No. 55: FIGS.
  • the type of epilepsy targeted by the pharmaceutical product of the present invention is not particularly limited as long as it is epilepsy.
  • it is shown that it has an excellent antiepileptic effect on “inner temporal epilepsy associated with hippocampal sclerosis” which is an intractable epilepsy of adults.
  • Drugs are usually prepared as pharmaceutical compositions.
  • the pharmaceutical product of the present invention may contain other drugs or functional compounds as required in addition to the active ingredient.
  • pharmaceuticals containing other compounds that improve the pharmacokinetics of active ingredients can be considered.
  • the dosage form and administration method of the pharmaceutical are not particularly limited, and may be appropriate depending on the use of the pharmaceutical.
  • Examples of the administration method include oral preparations and injections. If it is an oral preparation, it can be selected from tablets, capsules, granules, powders, dry syrups and the like.
  • a preparation dissolved in an arbitrary diluent such as physiological saline or glucose solution can be considered.
  • the pharmaceutical product of the present invention may be administered in an appropriate amount and number of active ingredients, taking into consideration the purpose, age, sex, weight, severity of the disease, route of administration, etc. of the administration subject (patient).
  • a person skilled in the art such as a doctor or a pharmacist can determine the dose based on the condition of each patient.
  • kainate 0.8 nmol, 40 nL
  • a small amount of kainate 0.8 nmol, 40 nL
  • a metal electrode 200 ⁇ m diameter
  • epileptic EEG recording was implanted near the kainic acid injection site.
  • a small plastic U-frame was also attached to the head for head fixation necessary for in vivo electrical measurements. At least 2 weeks after the operation, epilepsy waves in the hippocampus were measured.
  • the head was fixed through a U-shaped frame, the epilepsy wave was amplified, measured through a bandpass filter (0.5-30 Hz), and taken into a computer using an AD converter.
  • a bandpass filter 0.5-30 Hz
  • AD converter Analog to digital converter
  • intraperitoneally administer styripentol (300 mg / kg), isosafrole (100-300 mg / kg), sodium oxamate (250-500 mg / kg), or physiological saline, Recorded for 1 hour.
  • Sodium oxamate was dissolved in water, and styripentol and isosafrole were dissolved in sodium carboxymethylcellulose (1%) and administered intraperitoneally.
  • lactate dehydrogenase Evaluation of inhibition of lactate dehydrogenase by isosafrole (FIG. 4): The activity of lactate dehydrogenase was measured by a general-purpose method based on light absorption of NADH. Lactic acid dehydrogenase is an enzyme that interconverts pyruvate and lactic acid. At that time, NADH and NAD are also interconverted. For lactate dehydrogenase activity from lactic acid to pyruvic acid, lactate (20 mM), NAD (200 ⁇ M) and lactate dehydrogenase were added, and the reaction rate of NADH ⁇ produced was measured.
  • lactate dehydrogenase The amount of lactate dehydrogenase is set so that the maximum rates of the two lactate dehydrogenases are almost the same.
  • LDH-1 Regarding the activity of lactate ⁇ pyruvate, LDH-1 is 0.0033 units / ml and LDH-5 is 0.01 units / Regarding the activity of ml, pyruvic acid ⁇ lactic acid, LDH-1 was 0.0017 units / ml and LDH-5 was 0.0033 units / ml. ⁇ ⁇
  • the inhibitory action of lactate dehydrogenase was examined by adding isosafrole (500 ⁇ M) to these enzyme reaction systems.
  • the absorbance at 492 nm in the background was measured with a plate reader (absorbance before the color reaction).
  • a plate reader absorbance before the color reaction.
  • INT changes color to INT formazan by diaphorase in the presence of NADH
  • the absorbance of INT formazan is measured with a plate reader (absorbance after color reaction).
  • the value obtained by subtracting the absorbance before the color development reaction from the absorbance after the color development reaction was calculated as “absorbance change value ( ⁇ A)”, and the inhibition rate was calculated from ⁇ A.
  • the calculation of inhibition rate (% Inhibition) ⁇ ⁇ is as follows. ⁇ A when the above reaction is performed in the presence of lactate dehydrogenase is ⁇ 0% control value '', ⁇ A when the above reaction is performed in the absence of lactate dehydrogenase is ⁇ 100% control value '' did. Under 0% control condition, low ⁇ A is shown because there is little NADH left by the LDH enzyme reaction. However, under 100% control condition, high ⁇ A is shown because LDH enzyme reaction does not occur. In the presence of a compound having isosafrole in the mother nucleus structure, the same reaction as the 0% control was performed, and the ⁇ A was defined as “ ⁇ A in the presence of the compound”.
  • the compound examined has no inhibitory effect on lactate dehydrogenase, it shows a low ⁇ A close to the 0% control value, and if it has an inhibitory effect, it shows a high ⁇ A close to the 100% control value.
  • the inhibition rate (%) 100 x ( ⁇ A-0% control value in the presence of compound) / (100% control value-0% control value) ⁇ , and the inhibition rate is 100% ( ⁇ 25%).
  • the compounds showing wrinkles are shown in FIGS. 6 and 7 as inhibitors of lactate dehydrogenase.
  • the compound ⁇ (No. 1-94, see Fig. 6) ⁇ ⁇ having isosafrole and isosafrole in the mother nucleus structure was obtained from the following. Isosafrole and compound No. 1 were obtained from Tokyo Kasei, compounds No. 2-5 and No. 7-9 were obtained from Sigma, and compound No. 6 was obtained from Bionet.
  • Compound No. 10-94 the compound library of the MEXT Drug Discovery Support Technology Platform was used.
  • the inhibition rate was calculated at each concentration from 500 ⁇ M to 10 ⁇ M as shown in FIG. For compound No.
  • the inhibition rate was calculated at 100, 50, 25, 10 ⁇ , and the minimum concentration at which the inhibition rate was 100 ⁇ 25% and the inhibition rate are shown in FIG.
  • the inhibition rate was calculated at 250 ⁇ M or 50 ⁇ M and the concentrations used and the inhibition rates are shown in FIG.
  • FIG. 2B 2 The aggregated data regarding these antiepileptic effects is shown in FIG.
  • Compound No. 1-44 is a compound in which various substituents are bonded to the 3-position carbon of the 1-propenyl group of isosafrole (FIGS. 6-1 to 6-6). Specifically, the following compounds are included. A carbonyl group is formed at the 3-position of the propenyl group (R e and R f of formula III are ⁇ O), and a substituent containing an aromatic ring is also bonded to the 3-position (R g of formula III is substituted or Compound (including unsubstituted aryl group or heteroaryl group) (No. 1-9, 11-13). Compound (No.
  • R 10 is a compound in which the hydroxy group of stylpentol is substituted with a carbonyl group, and one of the carbons of the tertiary butyl group is substituted with a hydroxy group.
  • various substituents are bonded in addition to the 5-position of the benzene ring of 1,3-benzodioxole of isosafrole (R a in formula III, R b or R h is other than a hydrogen atom).
  • a compound that binds to the quinuclidine structure via the CC bond at the 2nd and 3rd positions of the propenyl group (No. 59, 60).
  • a carbonyl group is formed at the 3-position of the propenyl group.
  • various substituents are bonded in addition to the 5-position of the benzene ring of 1,3-benzodioxole of isosafrole.
  • the C ⁇ CC bond at the 1-position to the 3-position of the 1-propenyl group of isosafrole forms part of the ring structure (R c of formula III and R e ⁇ R f Or a compound in which R c and R g are combined to form a cyclic structure (FIGS. 6-10 to 6-12; No. 69-87), or all or part of the 1-propenyl group of isosafrole
  • R b and R c , R b and R d or R b and R g in Formula III are combined to form a cyclic structure
  • a compound in which the C CC bond at the 1st to 3rd positions of the propenyl group forms part of an isoxazole structure (No. 69-81) or a compound that forms part of a thiophene structure (No. 82).
  • a compound in which the C CC bond at the 1st to 3rd positions of the propenyl group forms part of a bicyclic compound (No. 83-87).
  • a tricyclic compound in which nitrogen is bonded to the 3-position of the propenyl group and bonded to the 6-position of 1,3-benzodioxole No. 88-91).
  • a tricyclic compound in which sulfur is bonded to the 2-position of the propenyl group and bonded to the 6-position of 1,3-benzodioxole (No. 92).
  • a tricyclic compound in which nitrogen is bonded to position 1 of the propenyl group and bonded to position 6 of 1,3-benzodioxole via a carbon chain (No. 93, 94).
  • the inhibitory activity of lactate dehydrogenase was observed (FIG. 7).
  • isosafrole is an “antiepileptic agent” having “lactate dehydrogenase inhibitory action” and effective for intractable epilepsy to which stilpentol does not work. It has also been clarified that many compounds having isosafrole in the mother nucleus structure have an inhibitory action on lactate dehydrogenase.

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Abstract

　本発明は、既存の抗てんかん薬が効かない難治性てんかんを抑えることができる乳酸脱水素酵素阻害剤、およびそれを含有する抗てんかん剤を提供する。本発明に係る乳酸脱水素酵素阻害剤は、式 (III) で表わされる化合物、すなわちイソサフロールまたはイソサフロールを母核構造として有する化合物を含有し、本発明に係る抗てんかん剤は、それらの化合物を有効成分とする。

Description

乳酸脱水素酵素阻害剤およびそれを含有する抗てんかん剤
　本発明は、イソサフロール（もしくはその誘導体）を有効成分とする乳酸脱水素酵素阻害剤および抗てんかん剤に関する。
　てんかんは、脳の電気活動の過剰興奮によって生じる神経疾患であり、特徴的な脳波(てんかん脳波) によって診断される。その有病率は、総人口の約１％と高い。てんかんの治療法としては薬物治療が主であり、２０種類以上のてんかん治療薬が臨床現場で使用されている (非特許文献１)。しかしながら、約３割のてんかん患者に対し、これら既存のてんかん治療薬が奏功しないことが知られている。このような背景により、既存薬が効かない「難治性てんかん」に対する治療薬が、現在必要とされている。
　てんかんは、過剰な神経電気興奮が原因で起きるため、その治療薬も電気活動を制御する分子を標的にするものが殆どである。具体的には、イオンチャネル、シナプス受容体、神経伝達物質トランスポーターである (非特許文献２)。一方、これらの既存薬が効かないてんかん患者の一部に対して、ケトン食療法と呼ばれる「食事療法」が効果的であることが、臨床的に知られている (非特許文献３)。最近になって、ケトン食による抗てんかん機構が次々と明らかにされている (非特許文献４～６)。すなわち、エネルギー代謝経路に作用する薬ができれば、難治性てんかん治療薬として有望である。
　抗てんかん薬の一つに、スチリペントール（CAS: 49763-96-4, 4-ジメチル-1-[(3,4-メチレンジオキシ)-フェニル]-1-ペンテン-3-オール, 下記式(I)参照) がある。スチリペントールは最初、脳疾患薬として開発され (特許文献１)、その後難治性てんかんの一つであるDravet 症候群 (小児てんかんの一つ) に効くことが明らかにされた (非特許文献７，８)。現在、Dravet症候群の治療薬として、ヨーロッパ (2007年承認) と日本 (2012年承認) で、ディアコミットという商品名で臨床使用されている。しかしながら、Dravet症候群には成功したものの、それ以外のてんかん (特に成人てんかん) に対して、スチリペントールは臨床試験で成功していないのが現状である (非特許文献９)。
　最近、スチリペントールが、乳酸脱水素酵素 (lactate dehydrogenase; LDH) の阻害剤であることが報告されている (特許文献２)。乳酸脱水素酵素とは、「エネルギー代謝経路上」に存在し、乳酸とピルビン酸を相互変換する「代謝酵素」である。乳酸脱水素酵素阻害剤自体は、これまで、主に抗マラリア薬開発 (非特許文献１０，１１)、および抗ガン剤開発 (非特許文献１２，１３) を目的として作られてきた。しかしながら、これらの乳酸脱水素酵素阻害剤が、抗てんかん作用を持つかどうかは不明である。すなわち、現段階において、スチリペントールは「乳酸脱水素酵素阻害作用」を持つ唯一の「抗てんかん剤」である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
米国特許3910959 国際公開WO2014/115764
Sirven et al, Mayo Clin Proc 87: 879-889, 2012 Meldrum et al, Neurotherapeutics 4: 18-61, 2007 Neal et al, Lancet Neurol 7: 500-506, 2008 Ma et al, J Neurosci 27: 3618-3625, 2007 Juge et al, Neuron 68: 99-112, 2010 Masino et al, J Clin Invest 121: 2679-2683, 2011 Perez et al, Epilepsia 40: 1618-1626, 1999 Chiron et al, Lancet 356: 1638-1642, 2000 Chiron, Neurotherapeutics 4: 123-125, 2007 Deck et al, J Med Chem 41: 3879-3887, 1998 Cameron et al, J Biol Chem 279: 31429-31439, 2004 Granchi et al, J Med Chem 54: 1599-1612, 2011 Farabegoli et al, Eur J Pharm Sci 47: 729-738, 2012 Aboul-Enein et al, Eur J Med Chem 47: 360-369, 2012 Riban et al, Neuroscience 112: 101-111, 2002 Houser, Brain Res 535: 195-204, 1990 Shen et al, Epilepsy Res 7: 40-48, 1990
　スチリペントールは、芳香族アリルアルコール構造を有しており、従来の抗てんかん薬にはない化学構造を持つ (特許文献１)。しかも、「乳酸脱水酵素阻害作用を持つ抗てんかん剤」として、唯一の化合物である (特許文献２)。代謝経路 (代謝酵素) に作用する抗てんかん剤は、難治性てんかん治療薬として有望である。しかしながら、スチリペントールは、一部の小児難治性てんかん (Dravet 症候群) には効くものの、それ以外の難治性てんかんには使用されていない。すなわち、乳酸脱水素酵素阻害活性を維持し、スチリペントールの化学構造を改変することで、スチリペントールが効かない難治性てんかんにも効く「抗てんかん剤」が開発可能であると期待される。そして、このような抗てんかん剤は、産業的利用価値が非常に高い。
　しかしながら、どのように化学構造を改変すれば、スチリペントールが効かない難治性てんかんに効くようになるかは、現在の技術レベルで想定するのは容易ではない。そこで本発明では、「乳酸脱水素酵素阻害作用」を持ち、スチリペントールが効かない難治性てんかんにも効く抗てんかん剤を提供することを課題とする。
　本発明者らは、スチリペントール (芳香族アリルアルコール) を特徴づける“3位のヒドロキシ基”(特許文献１) や従来技術で報告されている“3位の官能基群”(非特許文献１４) が、むしろ不必要という仮説を立てた。そこで、スチリペントールの3位からヒドロキシ基と3級ブチル基を除いた物質であるイソサフロール (CAS: 120-58-1, 5-(1-プロペニル)-1,3-ベンゾジオキソール, 下記式(II)参照) に着目した。本発明者らは今回、このイソサフロールが乳酸脱水素酵素の阻害作用を持つことを明らかにした。さらに、スチリペントールとは化学構造が全く異なる「イソサフロールを母核構造に持つ乳酸脱水素酵素の阻害剤」を数多く同定した。しかも、スチリペントールでは抑えることができない成人難治性てんかん (海馬硬化症に伴う内側側頭葉てんかん) を、イソサフロール等の乳酸脱水素酵素の阻害剤が顕著に抑えることを見出し、本発明を完成させた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　本発明は、一つの側面において、以下の発明を提供するものである。
　［１］
　式 (III) で表される化合物を含有する乳酸脱水素酵素の阻害剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　式（III）中、
　Ｒaは、水素原子、ハロゲン原子またはハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基を表し、
　Ｒbは、水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基またはニトロ基を表すか、Ｒc、ＲdまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表し、
　Ｒcは、水素原子またはカルボキシル基を表すか、Ｒb、Ｒe・ＲfまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表し、
　Ｒdは、水素原子または－Ｘ11－Ｒ11を表すか、ＲbまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表し、
　　Ｘ11はアルキレン基、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＨ2－ＮＲ12－ＣＯ－または－Ｓ－を表し、
　　Ｒ11は、置換基を有していてもよいアリール基、カルボキシル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基、またはヒドロキシアルキル基を表し、
　　Ｒ12は、ヒドロキシアルキル基を表し、
　Ｒe、ＲfおよびＲgは、
　（i）全てが水素原子を表すか、
　（ii）ＲeおよびＲfが一緒になって、＝Ｏ、＝ＮＲ21または＝ＣＲ21Ｒ22を表し、Ｒgは、水素原子、－Ｘ31－Ｒ31、－Ｏ－Ｘ32－Ｒ32、－Ｎ(－Ｘ33－Ｒ33)(－Ｘ34－Ｒ34)、－ＣＲ35Ｒ36Ｒ37を表し、
　　Ｒ21はヒドロキシ基を表すか、ＲcまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表し、
　　Ｒ22は、ニトロ基、または窒素原子に結合した水素原子がアルキル基で置換されていてもよいアミノカルボニル基を表し、
　　Ｘ31は、単結合、アルケニレン基、－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＨ－、－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＯ－または－ＣＯ－を表し、
　　Ｒ31は、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよい複素環式アミノ基、ヒドロキシ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基、またはヒドロキシアルキル基を表し、
　ただし、Ｘ３１が単結合であり、Ｒ３１が置換基を有していてもよい複素環式アミノ基である場合は、当該単結合は当該複素環式アミノ基の窒素原子以外の原子と結合しており、
　　Ｘ32は、単結合または－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＨ－を表し、
　　Ｒ32は、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基またはハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を表し、
　Ｘ33およびＸ34はそれぞれ独立して、単結合、アルキレン基、－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＨ－または－ＳＯ2－を表し、
　Ｒ33およびＲ34はそれぞれ独立して、水素原子、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、ヒドロキシルアルキル基、カルボキシル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基またはアルキニル基を表すか、Ｒb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表すか、Ｒ33およびＲ34はそれらが単結合であるＸ３３およびＸ３４を介して結合している窒素原子と共に一体となって置換基を有していてもよい複素環式アミノ基を表し、
　Ｒ35、Ｒ36およびＲ37はそれぞれ独立して、水素原子または－Ｘ31－Ｒ31を表すか、、Ｒb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表し、
　Ｒhは、水素原子またはハロゲン原子を表す、
　ただし、RbとRcが一体となった環状構造、RbとRdが一体となった環状構造、RbとRgが一体となった環状構造、RcとRe・Rfが一体となった環状構造、RcとRgが一体となった環状構造、RdとRgが一体となった環状構造、Re・RfとRgが一体となった環状構造は、多くとも１つだけしか、式（III）中に形成されない。
　［２］
　前記式（III）で表される化合物が、Ｒc、Ｒd、Ｒe、Ｒf、Ｒgのすべてが水素原子である化合物である、［１］に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤。
　［３］
　前記式 (III) で表される化合物が、下記式（II）で表されるイソサフロールである、［１］に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　［４］
　前記式（III）で表される化合物が、RbとRcが一体となった前記環状構造、RbとRdが一体となった前記環状構造、RbとRgが一体となった前記環状構造、RcとRe・Rfが一体となった前記環状構造、RcとRgが一体となった前記環状構造、RdとRgが一体となった前記環状構造、およびRe・RfとRgが一体となった前記環状構造のいずれも形成されていない化合物である、［１］に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤。
　［５］
　式（III）で表される化合物が、RbとRcが一体となった前記環状構造、RbとRdが一体となった前記環状構造、RbとRgが一体となった前記環状構造、RcとRe・Rfが一体となった前記環状構造、RcとRgが一体となった前記環状構造、RdとRgが一体となった前記環状構造、およびRe・RfとRgが一体となった前記環状構造のいずれか一つが形成されている化合物である、［１］に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤。
　［６］
　［１］～［５］のいずれか一項に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤を有効成分とする抗てんかん剤。
　スチリペントールは、「乳酸脱水酵素阻害作用」を持つ唯一の「抗てんかん剤」である (特許文献１,２)。しかし、スチリペントールは、一部の小児難治性てんかん (Dravet 症候群) にしか、臨床的に有効でない。我々は、第二の「乳酸脱水素酵素阻害作用」を持つ「抗てんかん剤」として、新たにイソサフロールを見出した。これは、スチリペントールが効かない難治性てんかん（成人難治性てんかんである内側側頭葉てんかん）を劇的に抑制した。さらに、イソサフロールを母核構造に持つ、数多くの乳酸脱水素酵素の阻害剤も見出した。すなわち、イソサフロールおよびイソサフロールの誘導体は、てんかん治療薬として産業利用可能である。
海馬硬化症モデルマウス (実施例参照)。Ａ：海馬硬化症モデルマウスの作製法。Ｂ：正常な海馬 (左) と海馬硬化症を呈する海馬 (右) の形態。白矢印は記録電極の跡を示す。Ｃ：海馬硬化症モデルマウスから記録されるてんかん波 (矢尻)。 海馬硬化症モデルマウスのてんかん波に対するスチリペントールとイソサフロールの作用 (実施例参照）。Ａ：スチリペントールの化学構造 (Ａ1) と、てんかん波に対するスチリペントールの作用 (Ａ2)。Ｂ：イソサフロールの化学構造 (Ｂ1) と、てんかん波に対するイソサフロールの作用 (Ｂ2)。スチリペントールによる抑制作用はほとんど観察されないが、イソサフロールは顕著なてんかん抑制作用を示す。 海馬硬化症モデルマウスのてんかん波に対する、オキサミド酸ナトリウム、スチリペントール、イソサフロールの抑制作用に関する集計データ (実施例参照）。 乳酸脱水素酵素 (LDH-1, LDH-5) の酵素活性に対する、イソサフロールの阻害作用 (実施例参照)。イソサフロールが存在しなかった場合の酵素活性（コントロール値）を 100% とした。すなわち、0% は乳酸脱水素酵素が完全に阻害されていることを示す。 乳酸脱水素酵素 (LDH-5) の酵素活性に対する、イソサフロールの阻害作用に関する濃度依存性データ (実施例参照）。イソサフロールの構造式を上段に示す。グラフの縦軸は阻害率 (% Inhibition) であり、100% は乳酸脱水素酵素が完全に阻害されており、0% は全く阻害されていないことを示す。阻害率の算出は、実施例を参照。イソサフロールは、乳酸脱水素酵素を500 μM では阻害するが、250 μM では阻害しない。 イソサフロールより乳酸脱水素酵素の阻害作用が強い、イソサフロールを母核構造に持つ化合物 (実施例参照)。250 μM以下で阻害率 (% Inhibition) が 100% (±25%) を示す化合物を示している。 図６で示したイソサフロールを母核構造に持つ化合物に関する、乳酸脱水素酵素を阻害した濃度 (μM) とその阻害率 (% Inhibition) (実施例参照)。
　本発明は、以下の (a)に記載の乳酸脱水素酵素阻害剤、およびそれを有効成分とする (b) に記載の医薬品を提供する。
　(a) イソサフロールまたはイソサフロールを母核構造として有する化合物（本明細書において「イソサフロール類縁体」と呼ぶこともある。）を含有する乳酸脱水素酵素の阻害剤。
　(b) (a) に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤を有効成分とする抗てんかん剤。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　イソサフロールは、式 (II) で示すように、芳香環である1,3-ベンゾジオキソールの5位に、1-プロペニル基が付いた化学構造を持つ。なお、イソサフロールを表す式（II）は、式（III）においてＲa、Ｒb、Ｒc、Ｒd、Ｒe、Ｒf、Ｒg、Ｒhのすべてが水素原子で表される場合に相当する。
　一方、イソサフロールを母核構造として有する化合物（イソサフロール類縁体）としては、例えばプロペニル基を改変したものや、芳香環である1,3-ベンゾジオキソールに官能基を付けたものが挙げられる。しかしながら、イソサフロールを母核構造として有する化合物で、乳酸脱水素酵素阻害作用を持つものであれば特に限定されるものではなく、抗てんかん剤として用いることができる。
　イソサフロールおよびイソサフロール類縁体は、式 (III) で表すことのできる化合物である。式（III）で表される化合物にはいくつかの立体異性体が存在する場合があるが、どの立体異性体も包含される。本発明では、乳酸脱水素酵素の阻害剤として、さらに抗てんかん剤の有効成分として、複数の立体異性体の混合物（ラセミ体）を用いても、いずれかの立体異性体の精製物を用いてよい。ラセミ体および各立体異性体のいずれを用いるべきかは、必要に応じて各立体異性体の有効性を試験したり、精製コストを勘案したりしながら、当業者であれば適切に判断することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　式（III）に含まれる記号の定義は次の通りである。ある記号の定義において用いられた用語（例えば、Ｒaにおけるハロゲン原子）の具体例およびその他の説明は、他の記号の定義において用いられた同一の用語（例えば、Ｒbにおけるハロゲン原子）についても同様に当てはまる。
　Ｒaは、水素原子、ハロゲン原子またはハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基（－ＯＲ）を表す。
　ハロゲン原子の例としては、フッ素（Ｆ）、塩素（Ｃｌ）、臭素（Ｂｒ）、ヨウ素（Ｉ）などが挙げられる。
　アルコキシ基の例としては、メトキシ基（－ＯＣＨ3）、エトキシ基（－ＯＣ2Ｈ5）など、炭素数が１～４程度の低級アルコールに由来する基が挙げられる。アルコキシ基は、一部または全部の水素原子がハロゲン原子で置換されていてもよいし、全く置換されていなくてもよい。アルコキシ基中のアルキル基の部分は、直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。
　Ｒbは、水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基またはニトロ基（－ＮＯ2）を表すか、Ｒc、ＲdまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表す。
　Ｒcは、水素原子またはカルボキシル基（－ＣＯＯＨ）を表すか、Ｒb、Ｒe・ＲfまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表す。
　カルボキシル基は、カルボキシラートアニオン（－ＣＯＯ-）の状態であってもよい。
　Ｒdは、水素原子または－Ｘ11－Ｒ11を表すか、ＲbまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表す。
　Ｘ11はアルキレン基、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＨ2－ＮＲ12－ＣＯ－または―Ｓ－を表す。
　アルキレン基の例としては、メチレン基（－ＣＨ2－）、エチレン基（－Ｃ2Ｈ5－）など、炭素数が１～６程度の低級アルキル基に由来する２価の基が挙げられる。
　Ｒ11は、置換基を有していてもよいアリール基、カルボキシル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基、またはヒドロキシアルキル基を表す。
　アリール基の例としては、フェニル基（－Ｃ6Ｈ5）、ナフチル基（－Ｃ10Ｈ9）が挙げられる。
　アリール基が有する置換基の例としては、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基、ヒドロキシ基、チオアルコキシ基（－ＳＲ）、カルボキシル基、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基などが挙げられる。置換基の個数および置換基が導入される部位は任意であり、置換基の性質によって適宜選択することができる。
　アルキル基の例としては、メチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基、ペンチル基、オクチル基など、炭素数が１～６程度の低級アルキル基が挙げられる。アルキル基は、直鎖状（ｎ－アルキル基）でも、分岐鎖状（ｉ－、ｓｅｃ－、ｔｅｒｔ－アルキル基）でもよい。アルキル基は、一部または全部の水素原子がハロゲン原子で置換されていてもよいし、全く置換されていなくてもよい。
　ヒドロキシアルキル基の例としては、オキシメチル基（－ＣＨ2ＯＨ）、オキシエチル基（－Ｃ2Ｈ5ＯＨ）など、炭素数が１～４程度の低級アルコールに由来する基が挙げられる。ヒドロキシアルキル基中のアルキル基の部分は、直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。ヒドロキシアルキル基中のヒドロキシ基の個数および部位は任意である。
　Ｒ12は、ヒドロキシアルキル基を表す。
　ＲeおよびＲfは、それぞれが単独で、互いに独立して、水素原子、ヒドロキシ基またはハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を表すか、一緒になって、＝Ｏ、＝ＮＲ21、＝ＣＲ21Ｒ22を表す。
　Ｒ21はヒドロキシ基を表すか、ＲcまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表す。
　Ｒ22は、ニトロ基、または窒素原子に結合した２つの水素原子が互いに独立してアルキル基で置換されていてもよいアミノカルボニル基を表す。
　Ｒgは、水素原子、－Ｘ31－Ｒ31、－Ｏ－Ｘ32－Ｒ32、－Ｎ(－Ｘ33－Ｒ33)(－Ｘ34－Ｒ34)、－ＣＲ35Ｒ36Ｒ37を表す。
　Ｘ31は、単結合、アルケニレン基、－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＨ－、－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＯ－または－ＣＯ－を表す。
　アルケニレン基の例としては、1－プロペニレン基（－ＣＨ＝ＣＨ－ＣＨ2－）、２－プロペニレン基（－ＣＨ－ＣＨ＝ＣＨ2－）など、炭素数が２～６程度の低級アルケニル基に由来する２価の基が挙げられる。炭素－炭素二重結合の数および位置は任意である。
　Ｒ31は、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよい複素環式アミノ基、ヒドロキシ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基、またはヒドロキシアルキル基を表す。
　ただし、Ｘ３１が単結合であり、Ｒ３１が置換基を有していてもよい複素環式アミノ基である場合は、当該単結合は当該複素環式アミノ基の窒素原子以外の原子と結合している（この規定は、－Ｘ３１－Ｒ３１が、後述するような「Ｒ３３およびＲ３４はそれらが単結合であるＸ３３およびＸ３４を介して結合している窒素原子と共に一体となって置換基を有していてもよい複素環式アミノ基を表す」場合の－Ｎ(－Ｘ３３－Ｒ３３)(－Ｘ３４－Ｒ３４)と重複することを避けるためのものである）。
　ヘテロアリール基の例としては、ピリジル基（－Ｃ5Ｈ5Ｎ）、ピラジニル基（－Ｃ4Ｈ3Ｎ2）、トリアジニル基（－Ｃ3Ｈ2Ｎ3）、テトラジニル基（－Ｃ2ＨＮ4）、ピロリル基（－Ｃ4Ｈ4Ｎ）、チエニル基（－Ｃ4Ｈ3Ｓ）、フラニル基（－Ｃ4Ｈ3Ｏ）、１，３－ベンゾジオキソール基、化合物No.26が有する基、化合物No.34が有する基が挙げられる。ヘテロアリール基が有する置換基の例、個数および位置については、前述したアリール基が有する置換基と同様のことがいえる。
　シクロアルキル基の例としては、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基など、炭素数が１～６程度のものが挙げられる。シクロアルキル基が有する置換基の例、個数および位置については、前述したアリール基が有する置換基と同様のことがいえる。
　複素環式アミノ基の例としては、ピロリジニル基（－Ｃ4Ｈ8Ｎ）、ピペリジニル基（－Ｃ5Ｈ10Ｎ）、ピペラジニル基（－Ｃ4Ｈ9Ｎ2）、化合物No.70が有する基（図６－１０参照）が挙げられる。複素環式アミノ基が有していてもよい置換基の例、個数および位置については、前述したアリール基が有する置換基と同様のことがいえる。例えば、複素環式アミノ基がピペラジニル基の場合、その置換基の例としては、置換基（ハロゲン原子、ハロゲン化アルキル基等）を有していてもよいフェニル基が挙げられる。
　Ｘ32は、単結合または－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＨ－を表す。
　Ｒ32は、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基またはハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を表す。
　Ｘ33およびＸ34はそれぞれ独立して、単結合、アルキレン基、－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＨ－または－ＳＯ2－を表す。
　Ｒ33およびＲ34はそれぞれ独立して、水素原子、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、ヒドロキシルアルキル基、カルボキシル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基またはアルキニル基を表すか、Ｒb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表すか、Ｒ33およびＲ34はそれらが単結合であるＸ３３およびＸ３４を介して結合している窒素原子と共に一体となって置換基を有していてもよい複素環式アミノ基を表す。
　アルキニル基の例としては、２，３－プロピニル基（－ＣＨ2－Ｃ≡ＣＨ）など、炭素数が２～６程度の低級アルキニル基が挙げられる。炭素－炭素三重結合の数および位置は任意である。
　－Ｎ(－Ｘ33－Ｒ33)(－Ｘ34－Ｒ34)で表されるＲgが、Ｒb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと一体となって環状構造を形成する基を表す場合、－Ｘ33－Ｒ33または－Ｘ34－Ｒ34の一方がＲb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと連結して環状構造を形成し、もう一方（特に水素原子以外）はその環状構造に含まれるＮに結合した置換基に相当するような形態であってもよいし（化合物No.57：図６－８および化合物No.91：図６－１３参照）、－Ｘ33－Ｒ33および－Ｘ34－Ｒ34が一緒にＲb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと一体となって環状構造を形成するような形態であってもよい（化合物No.55：図６－７参照、Ｒ33およびＲ34に由来する二重結合を含む）。
　Ｒ35、Ｒ36およびＲ37はそれぞれ独立して、水素原子または－Ｘ31－Ｒ31を表すか、Ｒb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表す。
　－ＣＲ35Ｒ36Ｒ37で表されるＲgが、Ｒb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと一体となって環状構造を形成する基を表す場合、Ｒ35、Ｒ36およびＲ37から選ばれる１つまたは２つがＲb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと連結して環状構造を形成し、残る基（特に水素原子以外）はその環状構造に含まれるＣに結合した置換基に相当するような形態であってもよい（化合物No.54：図６－７参照、Ｒ35およびＲ36に由来する二重結合と、Ｒ37に由来する置換基を含む。化合物No.59および60：図６－８参照、Ｒ35およびＲ36それぞれに由来するキヌクリジン構造内の２本の結合を含む）。また、同じく－ＣＲ35Ｒ36Ｒ37で表されるＲgが、Ｒb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと一体となって、縮合環のような環状構造を形成する基を表す場合、Ｒ35、Ｒ36およびＲ37から選ばれる１つまたは２つが上述したようにＲb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと連結して環状構造の一部（縮合環の一方）を形成し、残る基がその環状構造の骨格を形成する原子の一つに連結して環状構造のさらなる一部（縮合環の他方）を形成する基を表してもよい（化合物No.61-65：図６－９参照）。
　Ｒhは、水素原子またはハロゲン原子を表す。
　ただし、RbとRcが一体となった環状構造、RbとRdが一体となった環状構造、RbとRgが一体となった環状構造、RcとRe・Rf（＝ＮＲ21または＝ＣＲ21Ｒ22のＲ21）が一体となった環状構造、RcとRg（－Ｎ(－Ｘ33－Ｒ33)(－Ｘ34－Ｒ34)のＲ33またはＲ34、あるいは－ＣＲ35Ｒ36Ｒ37のＲ35、Ｒ36またはＲ37）が一体となった環状構造、RdとRgが一体となった環状構造、Re・RfとRgが一体となった環状構造は、多くとも１つだけしか、式（III）中に形成されない。つまり、例えば、RbとRcが一体となった環状構造と、RbとRdが一体となった環状構造が同時に形成されることはなく、前者が形成される場合は、Rdは水素原子または－Ｘ11－Ｒ11を表す（Rbと一体となって環状構造を形成する基は表さない）ことになる。
　また、Rgが水素原子のときは、ReおよびRfも水素原子に限る。つまり、Rgが水素原子であるという規定は、式（III）で表される化合物に、Re、RfおよびRgすべてが水素原子であるイソサフロールおよびその誘導体を包含するためのものであり、式（III）で表される化合物には、Reがヒドロキシ基、Rfがアルキル基（ｔ－ブチル基）、Rgが水素原子という組み合わせによるスチリペントールは包含されない。
　式（III）で表される化合物の具体例としては、図６－１～６－１３の掲載した化合物（No. 1～94）が挙げられる。このうち、所定の環状構造（環ｂｃ、環ｂｄ、環ｂｇ、環ｃｅｆ、環ｃｇ、環ｄｇまたは環ｅｆｇ）を有する化合物はNo. 44～94であり（下記の対応表参照）、環状構造を有さない化合物はNo. 1～43である。化合物No. 1～94およびその他の式（III）で表される化合物はいずれも、当業者であれば、入手したり、公知の手法にしたがって合成したりすることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　本発明における好ましい実施形態の一つとして、イソサフロール本来の構造に近い、Ｒe、Ｒf、Ｒgのすべてが水素原子である、さらにはＲcおよびＲdも水素原子である、イソサフロールまたはその類縁体が挙げられる。つまり、式（III）中のプロペニル基の３位の炭素原子、さらには１位および２位の炭素原子は修飾されておらず、1,3-ベンゾジオキソールの部分のみ修飾されていてもよい（Ｒa、Ｒb、Ｒhが水素原子以外であってもよい）化合物が好ましい。
　本発明における好ましい実施形態の一つとして、ＲeおよびＲfが一緒になって、＝Ｏ、＝ＮＲ21または＝ＣＲ21Ｒ22を表し、Ｒgが、－Ｘ31－Ｒ31、－Ｏ－Ｘ32－Ｒ32、－Ｎ(－Ｘ33－Ｒ33)(－Ｘ34－Ｒ34)または－ＣＲ35Ｒ36Ｒ37を表している実施形態が好ましく、なかでも多くの化合物が属する、ＲeおよびＲfが一緒になって＝Ｏを表している実施形態が特に好ましい。
　本発明における好ましい実施形態の一つとして、式（III）において、RbとRcが一体となった環状構造、RbとRdが一体となった環状構造、RbとRgが一体となった環状構造、RcとRe・Rfが一体となった環状構造、RcとRgが一体となった環状構造、RdとRgが一体となった環状構造、Re・RfとRgが一体となった環状構造、いずれも形成されていないイソサフロール類縁体が挙げられる。このようなイソサフロール類縁体の具体例は、イソサフロールおよび化合物No.1～44である。
　本発明における好ましい実施形態の一つとして、式（III）において、RbとRcが一体となった環状構造、RbとRdが一体となった環状構造、RbとRgが一体となった環状構造、RcとRe・Rfが一体となった環状構造、RcとRgが一体となった環状構造、RdとRgが一体となった環状構造、Re・RfとRgが一体となった環状構造、いずれかが形成されているイソサフロール類縁体が挙げられる。
　ＲbとＲcが環状構造を形成する場合、式（III）は下記式（III-bc）のように記載することもできる。式（III-bc）中、本来Ｒbが結合していた1,3-ベンゾジオキソール上の炭素原子と本来Ｒcが結合していたプロペニル基上の炭素原子のそれぞれに点線で結ばれている基Ｒbcは、ＲbおよびＲcが一体となって置換基を有していてもよい環状構造（環ｂｃ）を形成している基を表し、その他の記号の定義は式（III）と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　ＲbとＲdが環状構造を形成する場合、式（III）は下記式（III-bd）のように記載することもできる。式（III-bd）中、本来Ｒbが結合していた1,3-ベンゾジオキソール上の炭素原子と本来Ｒdが結合していたプロペニル基上の炭素原子のそれぞれに点線で結ばれている基Ｒbdは、ＲbおよびＲdが一体となって置換基を有していてもよい環状構造（環ｂｄ）を形成している基を表し、その他の記号の定義は式（III）と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　ＲbとＲgが環状構造を形成する場合、式（III）は下記式（III-bg）のように記載することもできる。式（III-bg）中、本来Ｒbが結合していた1,3-ベンゾジオキソール上の炭素原子と本来Ｒgが結合していたプロペニル基上の炭素原子のそれぞれに点線で結ばれている基Ｒbgは、ＲbおよびＲgが一体となって置換基を有していてもよい環状構造（環ｂｇ）を形成している基を表し、その他の記号の定義は式（III）と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　ＲcとＲe・Ｒfが環状構造を形成する場合、式（III）は下記式（III-cef）のように記載することもできる。式（III-cef）中、本来ＲcおよびＲgが結合していたプロペニル基上の炭素原子のそれぞれに点線で結ばれている基Ｒcefは、ＲcおよびＲe・Ｒfが一体となって置換基を有していてもよい環状構造（環ｃｅｆ）を形成している基を表し、その他の記号の定義は式（III）と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　ＲcとＲgが環状構造を形成する場合、式（III）は下記式（III-cg）のように記載することもできる。式（III-cg）中、本来ＲcおよびＲgが結合していたプロペニル基上の炭素原子のそれぞれに点線で結ばれている基Ｒcgは、ＲcおよびＲgが一体となって置換基を有していてもよい環状構造（環ｃｇ）を形成している基を表し、その他の記号の定義は式（III）と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　ＲdとＲ g が環状構造を形成する場合、式（III）は下記式（III-dg）のように記載することもできる。式（III-dg）中、本来ＲdおよびＲgが結合していたプロペニル基上の炭素原子のそれぞれに点線で結ばれている基Ｒdgは、ＲdおよびＲgが一体となって置換基を有していてもよい環状構造（環ｄｇ）を形成している基を表し、その他の記号の定義は式（III）と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　Ｒe・ＲfとＲgが環状構造を形成する場合、式（III）は下記式（III-efg）のように記載することもできる。式（III-efg）中、本来Ｒe・ＲfおよびＲgが結合していたプロペニル基上の同一の炭素原子に点線で結ばれている基Ｒefgは、Ｒe・ＲfおよびＲgが一体となって置換基を有していてもよい環状構造（環ｅｆｇ）を形成している基を表し、その他の記号の定義は式（III）と同様である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　Ｒbc、Ｒbd、Ｒbg、Ｒcef、Ｒcg、Ｒdg、Ｒefgはそれぞれ、環ｂｃ、環ｂｄ、環ｂｇ、環ｃｅｆ、環ｃｇ、環ｄｇ、環ｅｆｇの骨格の一部を形成する原子として、炭素原子、窒素原子、酸素原子または硫黄原子を少なくとも１個含む。各環（環状構造）は、好ましくは、五員環、六員環、七員環、あるいはそれらの縮合環（化合物No. 59, 60：図６－８（キヌクリジン構造）、化合物61-65, 66-68：図６－９、化合物86, 87：図６－１２参照）またはスピロ環（化合物No. 94：図６－１３参照）である。環状構造の骨格をなす原子同士は、単結合、二重結合または三重結合のいずれで結合していてもよく、環状構造は芳香族性であっても非芳香族性であってもよい。
　環状構造の骨格をなす各原子には、水素原子またはハロゲン原子が結合していてもよいし、置換基が結合していてもよい。環状構造が有する置換基としては、例えば前述したアリール基の置換基として例示した置換基、二重結合で結合した酸素原子または窒素原子（化合物No.48-52：図６－６および６－７参照）、その他の比較的大きな置換基（例えば、化合物No.45-47, 58のR1として表されている基：図６－６、化合物No.48-52のR4として表されている基：図６－６～６－７、化合物No.55に表されている基：図６－７、化合物No.58に表されている基：図６－８、化合物No. 61, 64のＲ3として表されている基：図６－９参照）が結合していてもよい。そのような置換基に相当する部分（枝分かれ部分）もＲbc、Ｒbd、Ｒbg、Ｒcef、Ｒcg、Ｒdg、Ｒefgそれぞれが表す基の一部に含まれる。
　本発明の医薬品の対象となるてんかんの種類は、てんかんであれば特に限定されるものではない。実施例では、その一例として、成人の難治性てんかんである「海馬硬化症に伴う内側側頭葉てんかん」に対して、優れた抗てんかん作用を有することを示している。
　医薬品は通常、医薬組成物として調整される。本発明の医薬品は、有効成分に加え、必要に応じてその他の薬剤もしくは機能性化合物を含有してもよい。たとえば、有効成分の体内動態を改善する他の化合物を含んだ医薬品等が考えられる。また、医薬品を調整するために必要な賦形剤、希釈剤、添加剤等を含有してもよい。
　医薬品の剤形、投与方法は特に限定されるものでなく、医薬品の用途に応じて適切なものとすればよい。投与方法としては、経口剤や注射剤等が例として挙げられる。経口剤であれば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、ドライシロップ等から選択することが可能である。また、注射剤であれば、任意の希釈剤 (生理食塩水やブドウ糖液等) で溶解した製剤が考えられる。
　本発明の医薬品は、目的、投与対象 (患者) の年齢、性別、体重、疾患の重篤度、投与経路等を考慮しながら、適切な有効成分量および回数で投与すればよい。医師や薬剤師等の当業者であれば、各患者の状態を踏まえ、投与量を決定することができる。
　方法
　海馬硬化症モデルマウスの作製と測定 (図１～図３)：海馬硬化症モデルマウスの作製は、過去の文献に従って行った (非特許文献１５)。6-7週令のICRマウスを実験に用いた。マウスをケタミン (100 mg/kg) とキシラジン (20 mg/kg) 混合液によって十分に麻酔をかけた後、脳定位固定装置にセットした。頭部の海馬上方から微小ガラス電極とハミルトンシリンジを用いて、てんかん誘発のために微量のカイニン酸 (0.8 nmol, 40 nL) を背側海馬（ブレグマの後方に 1.6 mm, 中心線から側方に 1.6 mm, 脳表面から深さ 1.4 mm）に注入し、次にてんかん脳波記録のための金属電極（200 μm径）をカイニン酸注入部位付近に埋め込んだ。さらに、in vivo 電気測定に必要な頭部固定のために、小型のプラスチック製U字枠も頭部に取り付けた。手術から２週間以上経過後、海馬におけるてんかん波を測定した。頭部は、U字枠を介して固定し、てんかん波は増幅され、バンドパスフィルター (0.5-30 Hz) を介して測定し、ADコンバータを用いてコンピュータに取り込んだ。ベースライン脳波を30分間測定後、スチリペントール (300 mg/kg)、イソサフロール (100-300 mg/kg)、オキサミド酸ナトリウム (250-500 mg/kg)、もしくは生理食塩水を腹腔内投与し、１時間記録した。オキサミド酸ナトリウムは水に溶かし、スチリペントールとイソサフロールはカルボキシルメチルセルロースナトリウム (1%) に溶かして腹腔内投与した。データ解析において、0.5 mV 以上の振幅を持つ高振幅のてんかん波を投与前30分間と投与後30分間でそれぞれカウントし、投与前のてんかん波の数で規格化することにより薬効を評価した。海馬硬化症による形態変化の観察では、脳を 300 μmでスライスした後、10% ホルマリンで固定し、0.05% のクレシルバイオレットで染色した。
　イソサフロールによる乳酸脱水素酵素の阻害評価 (図４)：乳酸脱水素酵素の活性は、NADHの光吸収に基づく汎用的手法により測定した。乳酸脱水素酵素は、ピルビン酸と乳酸を相互変換する酵素である。その際、NADHとNADも相互変換する。乳酸からピルビン酸への乳酸脱水素酵素活性では、乳酸 (20 mM) とNAD (200 μM) と乳酸脱水素酵素を加え、生成される NADH の反応速度を測定した。一方、ピルビン酸から乳酸への乳酸脱水素酵素活性では、ピルビン酸 (1.0 mM) とNADH (200 μM) と乳酸脱水素酵素を加え、減少する NADH の反応速度を測定した。両反応ともに、100 mM のリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.3) で 37℃ の条件下で行い、NADH が持つ 340 nm の光吸収に関して吸光光度計を用いて 30秒間隔で3.5分間測定することにより、反応速度を求めた。乳酸脱水素酵素として、２種類のヒト乳酸脱水素酵素（human LDH-1, LDH-5）で検討した。乳酸脱水素酵素量は、２つの乳酸脱水素酵素の最大速度がほぼ同じになるように設定し、乳酸→ピルビン酸の活性に関しては LDH-1 が 0.0033 units/ml でLDH-5 が 0.01 units/ml、ピルビン酸→乳酸の活性に関しては LDH-1 が 0.0017 units/ml で LDH-5 が 0.0033 units/ml とした。 これらの酵素反応系に対し、イソサフロール (500 μM) を加えることにより、乳酸脱水素酵素の阻害作用を検討した。
　イソサフロールを母核構造に持つ乳酸脱水素酵素阻害剤の同定 (図５～図７)：NADH の吸光は紫外領域 (340 nm) であり、その波長を吸収する化合物は多いため、化合物ライブラリを用いたスクリーニングには適していない。そこで、ピルビン酸から乳酸への乳酸脱水素酵素活性を評価するために、まずはピルビン酸 (100 μM)、NADH (100 μM) と乳酸脱水素酵素 (human LDH-5, 0.015 U/mL) を加え、100 mM のリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.3) 中で 37℃ 条件下で60分間反応させた (LDH酵素反応, 200 μL/well)。この段階でまず、バックグラウンドの 492 nm の吸光度をプレートリーダーで測定した (発色反応前の吸光度）。次に、LDH酵素反応で残った NADH 量を測定するために、diaphorase (25 U/mL) と INT (5 mM) を溶かした発色溶液を 100 μL/well 加え、100 mM のリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.3) 中で 37℃ 条件下で10分間反応させた (発色反応)。INT は NADH 存在下、diaphorase により INT formazan に変化して発色するため、INT formazan が持つ 492 nm の吸光度をプレートリーダーで測定した (発色反応後の吸光度)。各化合物自身が有する吸光の影響を排除するため、発色反応後の吸光度から発色反応前の吸光度を減じた値を「吸光度変化値 (ΔA)」として計算し、ΔAから阻害率を計算した。
　阻害率 (% Inhibition) の計算は、以下の通りである。乳酸脱水素酵素が存在する条件下で上記反応を行ったときのΔAを「0%コントロール値」、乳酸脱水素酵素が無い条件で上記反応を行ったときのΔAを「100%コントロール値」とした。0%コントロール条件下では、LDH酵素反応により残ったNADHが少ないため低いΔAを示すが、100%コントロール条件下ではLDH酵素反応が起こらないため高いΔAを示す。そして、イソサフロールを母核構造に持つ化合物が存在する状況下で 0%コントロールと同じ反応を行い、そのΔAを「化合物存在下でのΔA」とした。もし、調べた化合物に乳酸脱水素酵素の阻害作用が無ければ、0%コントロール値に近い低いΔA を示し、その阻害作用があれば100%コントロール値に近い高いΔA を示す。具体的には、阻害率 (%) ＝ 100 × (化合物存在下でのΔA － 0%コントロール値) / (100％コントロール値 － 0%コントロール値) とし、その阻害率が100% (±25%) を示した化合物を乳酸脱水素酵素の阻害剤として、図６と図７に記載した。
　イソサフロールおよびイソサフロールを母核構造に持つ化合物 (No.1-94, 図６参照) は、以下から入手した。イソサフロールと化合物 No.1 は東京化成から、化合物 No.2-5 及び No.7-9 は Sigma から、化合物 No.6 は Bionet より入手した。また化合物 No.10-94 は、文部科学省創薬等支援技術基盤プラットフォームの化合物ライブラリを用いた。イソサフロールに関しては、図５に示すように 500 μM から 10 μM の各濃度にて阻害率を算出した。化合物 No.1-9 に関しては、100, 50, 25, 10 μM で阻害率を算出し、阻害率が100±25% を示す最低濃度とその阻害率を図７に示した。また化合物 No.10-94 に関しては、250 μM もしくは 50 μM で阻害率を算出し、用いた濃度とその阻害率を図７に示した。
　結果
　海馬硬化症を伴う内側側頭葉てんかんは、成人の代表的な難治性てんかん (既存の薬が効かないてんかん) である。まず、過去の文献 (非特許文献１５) に従い、微量のカイニン酸を海馬に投与し、海馬硬化症モデルマウスを作製した (図１Ａ)。カイニン酸投与から２週間以上経つと、海馬では形態的変化が観察され、ピラミダル神経細胞層は細くなり (図１Ｂ； ＣＡ１)、歯状回領域は肥大化した (図１Ｂ； ＤＧ)。これは、既に報告されている海馬硬化症モデルマウスと同じ所見であり (非特許文献１５）、ヒト海馬硬化症で見られる症状に類似している (非特許文献１６）。また、その海馬から記録を行うと、自発的に生じる高振幅のてんかん波が観察された (図１Ｃ； 矢尻)。すなわち、この海馬硬化症モデルマウスは、従来研究での報告通り慢性てんかんモデルである。
　そこで次に、この海馬硬化症モデルマウスに対して、スチリペントールもしくはイソサフロールを腹腔内投与し、抗てんかん作用を調べた。小児抗てんかん薬であるスチリペントール (図２Ａ1) から、３位のヒドロキシ基と３級ブチル基を除いたのがイソサフロールである (図２Ｂ1)。スチリペントール (300 mg/kg) を腹腔内投与しても、てんかん波はほとんど抑えられなかった (図２Ａ2)。これは、スチリペントールが小児てんかん (Dravet 症候群) に対する抗てんかん薬としてのみ使用されているのと一致する。
　一方で、イソサフロール (300 mg/kg) を腹腔内投与すると、てんかん波が顕著に抑えられることが分かった（図２Ｂ2）。これらの抗てんかん作用に関する集計データを、図３に示す。まず、乳酸脱水素酵素阻害剤として良く知られたオキサミド酸ナトリウムを腹腔内投与したところ、500 mg/kg において弱い抗てんかん作用を示した (図３； saline, n = 7; 250 mg/kg, n = 7; 500 mg/kg, n = 7)。従来研究により、スチリペントールをラットに 300 mg/kg で腹腔投与すると、薬物誘導性 (ペンチレンテトラゾール誘導性）の急性てんかん発作を抑制し、その時の血漿濃度は 20-100 μg/ml (85-427 μM) であると報告されている (非特許文献１７）。しかしながら、スチリペントールを300 mg/kg で腹腔投与しても、この海馬硬化症モデルマウスに対して抗てんかん作用をわずかしか示さなかった (図３； n = 8)。一方で、イソサフロールを腹腔内投与すると、200-300 mg/kg で顕著な抗てんかん作用が観察された (図３； 100 mg/kg, n = 8; 200 mg/kg, n = 8; 300 mg/kg, n = 8)。これらの結果は、イソサフロールが難治性てんかんモデルマウスにも効く抗てんかん剤であることを示している。
　次に、イソサフロールにも乳酸脱水素酵素の阻害作用があるかどうか、酵素活性測定により調べた。イソサフロールが存在しない時の乳酸脱水素の酵素活性を１００％とし、イソサフロール (500 μM) 存在下における酵素活性を評価した。乳酸脱水素酵素は、２つのサブユニット (LDHA と LDHB) で構成されており、LDHAのみで構成されるのが LDH-5 であり、LDHB のみで構成されるのが LDH-1 である。まず、乳酸からピルビン酸への乳酸脱水素酵素活性に対するイソサフロールの作用を検討したところ、human LDH-1, LDH-5 ともにイソサフロールが阻害作用を示すことが分かった (図４, Lactate→Pyruvate； LDH-1, n = 4; LDH-5, n = 4）。さらに、ピルビン酸から乳酸への乳酸脱水素酵素活性に関し、イソサフロールの作用を検討した。すると、human LDH-1, LDH-5 ともに、ピルビン酸→乳酸方向の酵素活性も阻害され、しかもその阻害効果が強いことも見出した (図４, Pyruvate→Lactate； LDH-1, n = 5; LDH-5, n = 6）。これらの結果は、イソサフロールが乳酸脱水素酵素の阻害剤であることを示している。
　最後に、イソサフロールを母核構造にもつ化合物の中から、乳酸脱水素酵素の阻害作用を持つものを探索した。まず、イソサフロールの各濃度において、乳酸脱水素酵素 (LDH-5) の阻害率を調べたところ、500 μM では乳酸脱水素酵素を阻害するが、250 μM では阻害しないことが分かった (図５)。そこで、イソサフロールを母核構造に持ち、イソサフロールよりも強い乳酸脱水素酵素の阻害剤を探索した。その結果、250 μM 以下で乳酸脱水素酵素をほぼ完全に阻害する「イソサフロールを母核構造に持つ化合物」として、以下94化合物を同定した (図６, 図７)。
　94化合物の詳細は以下の通りである (図６)。まず化合物 No.1-44 は、イソサフロールの1-プロペニル基の3位の炭素に、各種置換基が結合した化合物である (図６－１～６－６)。具体的には以下の化合物が含まれる。プロペニル基の3位でカルボニル基を形成し（式IIIのＲeおよびＲfが＝Ｏであり）、3位に芳香環を含む置換基も結合している（式IIIのＲgが置換または無置換のアリール基またはヘテロアリール基を含む）化合物 (No.1-9, 11-13)。プロペニル基の3位でオキシム基を形成し（式IIIのＲeおよびＲfが＝ＮＲ21であり）、芳香環も結合している化合物 (No.14)。プロペニル基の3位でエステル結合を形成している（式IIIのＲgが－Ｏ－Ｘ32－Ｒ32である）化合物 (No.15-17)。プロペニル基の3位でアミド結合を形成している（式IIIのＲgが－Ｎ(－Ｘ33－Ｒ33)(－Ｘ34－Ｒ34)である）化合物 (No.18-39)。プロペニル基の3位でカルボニル基を形成するだけでなく、1位や2位に各種置換基が結合した（式IIIのＲcおよびＲdが水素原子以外である）化合物 (No.40-43)。プロペニル基の3位の炭素を介し、ウラシル構造と結合する（ＲeおよびＲfが一緒になって＝ＣＲ21Ｒ22を表し、かつＲe・ＲfとＲgが一体となって環状構造を形成している）化合物 (No.44)。また、化合物No.10は、スチリペントールのヒドロキシ基をカルボニル基と置換し、3級ブチル基の炭素の1つをヒドロキシ基に置換した化合物である。加えて、化合物 No.1-44 の幾つかは、イソサフロールの1,3-ベンゾジオキソールのベンゼン環の5位以外にも、各種置換基が結合している（式IIIのＲa、ＲbまたはＲhが水素原子以外である）。
　次に化合物 No.45-68 は、イソサフロールの1-プロペニル基の2位と3位のC-C結合が、環構造の一部を形成する（式IIIのＲdとＲgが一体となって環状構造を形成している）化合物である (図６－６～６－９)。具体的には以下の化合物が含まれる。プロペニル基の2位と3位の C-C 結合を介し、5員環と結合する化合物 (No.45-58)。5員環の構成元素は炭素だけでなく、窒素・酸素・硫黄からなる複素環も含まれる。なお、化合物 No.45-58全てに関し、プロペニル基の3位でカルボニル基を形成している。また、プロペニル基の2位と3位の C-C 結合を介し、キヌクリジン構造と結合する化合物 (No.59,60)。プロペニル基の2位と3位の C-C 結合を介し、五員環と六員環からなる縮合環と結合する化合物 (No.61-68)。なお、化合物 No.61-68全てに関し、プロペニル基の3位でカルボニル基を形成している。加えて、化合物 No.45-68 の幾つかは、イソサフロールの1,3-ベンゾジオキソールのベンゼン環の５位以外にも、各種置換基が結合している。
　さらに、化合物 No.69-94 は、イソサフロールの1-プロペニル基の1位から3位のC=C-C結合が、環構造の一部を形成する（式IIIのＲcとＲe・ＲfもしくはＲcとＲgが一体となって環状構造を形成している）化合物 (図６－１０～６－１２; No.69-87)、またはイソサフロールの1-プロペニル基の全てもしくは一部により、三環式化合物を形成する（式IIIのＲbとＲc、ＲbとＲdもしくはＲbとＲgが一体となって環状構造を形成している）化合物である (図６－１２～６－１３; No.88-94)。具体的には以下の化合物が含まれる。プロペニル基の1位から3位の C=C-C 結合が、イソオキサゾール構造の一部を形成する化合物 (No.69-81) や、チオフェン構造の一部となっている化合物 (No.82)。プロペニル基の1位から3位の C=C-C 結合が、二環式化合物の一部を形成する化合物 (No.83-87)。さらに、プロペニル基の3位に窒素が結合し、それが1,3-ベンゾジオキソールの6位と結合した三環式化合物 (No.88-91)。プロペニル基の2位に硫黄が結合し、それが1,3-ベンゾジオキソールの6位と結合した三環式化合物 (No.92)。プロペニル基の1位に窒素が結合し、炭素鎖を介して1,3-ベンゾジオキソールの6位と結合した三環式化合物 (No.93,94)。以上94化合物において、乳酸脱水素酵素の阻害活性が観察された (図７)。
　上記のことより、イソサフロールが「乳酸脱水素酵素阻害作用」を持ち、スチリペントールが効かない難治性てんかんに効く「抗てんかん剤」であることが明らかとなった。また、イソサフロールを母核構造に持つ化合物の数多くが、乳酸脱水素酵素の阻害作用を有することも明らかとなった。

Claims (6)

  1. 　式 (III) で表される化合物を含有する乳酸脱水素酵素の阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　式（III）中、
    　Ｒaは、水素原子、ハロゲン原子またはハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基を表し、
    　Ｒbは、水素原子、ハロゲン原子、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基またはニトロ基を表すか、Ｒc、ＲdまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表し、
    　Ｒcは、水素原子またはカルボキシル基を表すか、Ｒb、Ｒe・ＲfまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表し、
    　Ｒdは、水素原子または－Ｘ11－Ｒ11を表すか、ＲbまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表し、
    　　Ｘ11はアルキレン基、－ＮＨ－ＣＯ－、－ＣＨ2－ＮＲ12－ＣＯ－または－Ｓ－を表し、
    　　Ｒ11は、置換基を有していてもよいアリール基、カルボキシル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基、またはヒドロキシアルキル基を表し、
    　　Ｒ12は、ヒドロキシアルキル基を表し、
    　Ｒe、ＲfおよびＲgは、
    　（i）全てが水素原子を表すか、
    　（ii）ＲeおよびＲfが一緒になって、＝Ｏ、＝ＮＲ21または＝ＣＲ21Ｒ22を表し、Ｒgが、－Ｘ31－Ｒ31、－Ｏ－Ｘ32－Ｒ32、－Ｎ(－Ｘ33－Ｒ33)(－Ｘ34－Ｒ34)または－ＣＲ35Ｒ36Ｒ37を表し、
    　　Ｒ21はヒドロキシ基を表すか、ＲcまたはＲgと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表し、
    　　Ｒ22は、ニトロ基、または窒素原子に結合した水素原子がアルキル基で置換されていてもよいアミノカルボニル基を表し、
    　　Ｘ31は、単結合、アルケニレン基、－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＨ－、－ＣＨ2－Ｏ－ＣＨ2－ＣＯ－または－ＣＯ－を表し、
    　　Ｒ31は、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、置換基を有していてもよい複素環式アミノ基、ヒドロキシ基、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルコキシ基、またはヒドロキシアルキル基を表し、
    　ただし、Ｘ３１が単結合であり、Ｒ３１が置換基を有していてもよい複素環式アミノ基である場合は、当該単結合は当該複素環式アミノ基の窒素原子以外の原子と結合しており、
    　　Ｘ32は、単結合または－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＨ－を表し、
    　　Ｒ32は、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基またはハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基を表し、
    　Ｘ33およびＸ34はそれぞれ独立して、単結合、アルキレン基、－ＣＨ2－ＣＯ－ＮＨ－または－ＳＯ2－を表し、
    　Ｒ33およびＲ34はそれぞれ独立して、水素原子、置換基を有していてもよいアリール基、置換基を有していてもよいヘテロアリール基、置換基を有していてもよいシクロアルキル基、ヒドロキシルアルキル基、カルボキシル基、ハロゲン原子で置換されていてもよいアルキル基またはアルキニル基を表すか、Ｒb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表すか、Ｒ33およびＲ34はそれらが単結合であるＸ３３およびＸ３４を介して結合している窒素原子と共に一体となって置換基を有していてもよい複素環式アミノ基を表し、
    　Ｒ35、Ｒ36およびＲ37はそれぞれ独立して、水素原子または－Ｘ31－Ｒ31を表すか、、Ｒb、Ｒc、ＲdまたはＲe・Ｒfと一体となって置換基を有していてもよい環状構造を形成する基を表し、
    　Ｒhは、水素原子またはハロゲン原子を表す。
    　ただし、RbとRcが一体となった環状構造、RbとRdが一体となった環状構造、RbとRgが一体となった環状構造、RcとRe・Rfが一体となった環状構造、RcとRgが一体となった環状構造、RdとRgが一体となった環状構造、Re・RfとRgが一体となった環状構造は、多くとも１つだけしか、式（III）中に形成されない。
  2. 　前記式（III）で表される化合物が、Ｒc、Ｒd、Ｒe、Ｒf、Ｒgのすべてが水素原子である化合物である、請求項１に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤。
  3. 　前記式 (III) で表される化合物が、下記式（II）で表されるイソサフロールである、請求項２に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  4. 　前記式（III）で表される化合物が、RbとRcが一体となった前記環状構造、RbとRdが一体となった前記環状構造、RbとRgが一体となった前記環状構造、RcとRe・Rfが一体となった前記環状構造、RcとRgが一体となった前記環状構造、RdとRgが一体となった前記環状構造、およびRe・RfとRgが一体となった前記環状構造のいずれも形成されていない化合物である、請求項１に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤。
  5. 　式（III）で表される化合物が、RbとRcが一体となった前記環状構造、RbとRdが一体となった前記環状構造、RbとRgが一体となった前記環状構造、RcとRe・Rfが一体となった前記環状構造、RcとRgが一体となった前記環状構造、RdとRgが一体となった前記環状構造、およびRe・RfとRgが一体となった前記環状構造のいずれか一つが形成されている化合物である、請求項１に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の乳酸脱水素酵素の阻害剤を有効成分とする抗てんかん剤。
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