WO2016127345A1 - 一种small RNA的文库构建及测序方法 - Google Patents

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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to the field of cancer diagnosis. More specifically, the invention relates to libraries of cancer-associated small RNAs.
  • Small RNA is an important class of in vivo regulatory molecules, including miRNA, piRNA and siRNA. Small RNA works through a variety of pathways, including mRNA degradation, translational inhibition, heterochromatin formation, and DNA removal to regulate growth and development of organisms, and even plays a key role in the development of diseases such as cancer.
  • the expression of Small RNA is quite different between cancer tissues and non-cancerous tissues, and specific expression of small RNA is associated with specific cancers. Therefore, small RNA can be used as a molecular marker for diagnosing cancer, such as derived from exosomes. (exosome) miR-21 can be used as a prognostic indicator for several cancers, and miR-21 is associated with miR-31 and esophageal cancer.
  • the expression and release of miRNAs in the exosomes can be controlled or the exosomes are carried to deliver molecules such as therapeutic miRNAs to target cells, targeted therapy for some cancers and diseases can be performed.
  • targeted therapy for some cancers and diseases can be performed.
  • the genome-wide small RNA map of the species can be obtained, including the mining of new small RNA molecules, the prediction and identification of the target genes, and the differences between samples.
  • Expression analysis, scientific applications such as Small RNA clustering and expression profiling.
  • CG sequencing is a new second-generation sequencing technology that uses high-density DNA nanochip technology to embed DNA nanospheres on a chip and anchor with non-continuous, non-chained probes (cPAL).
  • cPAL non-continuous, non-chained probes
  • Technology read sequences with higher throughput and low cost per genome sequencing To $1,000.
  • the CG library construction sequencing technology has the characteristics of low cost of construction, simple operation, short time, high success rate of database construction, fast sequencing, etc., and has high promotion value.
  • the invention describes a novel method for building small RNA, which can be used for library construction of small RNA from all sources, and the constructed small RNA CG library is suitable for second generation sequencing technology Complete Genomics (CG) sequencing. platform.
  • CG Complete Genomics
  • the invention provides a method of constructing a small RNA CG library, the method comprising the steps of:
  • the small RNA fragment is ligated to the 3' linker of the CG library and the 5' linker of the CG library;
  • RNA ligated to the 3' and 5' linkers of the CG library is reverse transcribed into cDNA
  • the small RNA CG library is a cancer small RNA CG library
  • the sample is a cancer sample.
  • 3' linker 5'-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCxxxxxxxxxxGAGCTTGTC T-3' (SEQ ID NO. 1) (where xxxxxxxxxx represents a 10 bp Barcode sequence, ie, a sequence for distinguishing different samples when multiple samples are mixed and sequenced)
  • 5' linker 5'-UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACUU-3' (SEQ ID NO. 2).
  • the reverse transcription primer RT-primer 5'-AGACAAGCTCxxxxxxxxxxxxGATCGGGCTTCG ACTGGA GAC-3' (SEQ ID NO. 3) (where xxxxxxxxxx represents a 10 bp Barcode sequence).
  • PCR amplification of the reverse transcription product uses primer ON0639: 5'-TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3' (SEQ ID NO. 4).
  • cyclization of single-stranded DNA uses ON1587: 5'-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3' (SEQ ID NO. 5).
  • SEQ ID NO. 1 is selected from the group consisting of SEQ ID NO. 6-9.
  • SEQ ID NO. 3 is selected from the group consisting of SEQ ID NO. 10-13. Wherein SEQ ID NO. 6-9 corresponds to SEQ ID NO. 10-13.
  • the invention provides a method for sequencing a small RNA CG library, the method comprising the steps of:
  • the small RNA CG library constructed in accordance with the first aspect of the invention was sequenced using a CG sequencing platform.
  • the small RNA CG library is a cancer small RNA CG library.
  • the small RNA library construction method adopted by the invention is applicable to the complete genome (Complete Genomics, CG) sequencing platform, and has high sequencing throughput, low cost of construction, simple operation, short time, high success rate of database construction and fast sequencing.
  • the library sequencing method has a high promotion value, and can quickly and efficiently construct a small RNA library from the human body and subsequent sequencing analysis for early diagnosis of cancer and development of subsequent personalized targeted therapy.
  • the small RNA library constructed by the method of the invention adopts the CG 1adapter construction method, and has the characteristics of low construction cost, simple operation, short time, high success rate of database construction and fast sequencing.
  • the invention provides a novel method for building and sequencing small RNA, which can be used for constructing a small RNA library of all sources, and the constructed small RNA CG library is suitable for the second generation sequencing technology complete genomics (CG). Sequencing platform.
  • the construction of the DNA CG library already has a mature database construction scheme, and the construction of the small RNA CG library of the present invention is a relatively new library construction method, and the difference from the DNA CG library construction is mainly manifested in the following aspect:
  • Construction of the DNA CG library can be performed after single-strand separation after PCR amplification, and the construction of the small RNA CG library needs to be purified by non-denaturing PAGE gel to recover the PCR amplification product and then subjected to single-strand separation treatment.
  • the method of the present invention mainly includes the following two aspects:
  • the small RNA fragment is ligated to the 3' linker of the CG library,
  • the small RNA fragment is ligated to the 5' linker of the CG library,
  • RNA ligated to the 3' and 5' linkers of the CG library is reverse transcribed into cDNA.
  • 5' linker 5'-UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACUU-3' (SEQ ID NO. 2).
  • the reverse transcription primer RT-primer 5'-AGACAAGCTCxxxxxxxxxxxxGATCGGGCTTCG ACTGGA GAC-3' (SEQ ID NO. 3) (where xxxxxxxxxx represents a 10 bp Barcode sequence).
  • PCR amplification of the reverse transcription product uses primer ON0639: 5'-TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3' (SEQ ID NO. 4).
  • the cyclization of single-stranded DNA uses ON1587: 5'-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3' (SEQ ID NO. 5).
  • the initial sample of the library was the small RNA in the exosomes derived from the serum of 4 lung cancer patients.
  • RNA 3' linker RNA 5' linker
  • RT-primer ON0639, and ON1587
  • RT-primer 5'-AGACAAGCTCxxxxxxxxxxxxGATCGGGCTTCG ACTGGA GAC-3' (SEQ ID NO. 3) (where xxxxxxxxxx represents a 10 bp Barcode sequence)
  • RT-primers with 10 bp Barcode are used by Huada to design and synthesize them.
  • the sequences are:
  • ON1587 5'-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3' (SEQ ID NO. 5)
  • the small RNA fragment is ligated to the 3' linker of the CG library
  • the small RNA fragment is ligated to the 5' linker of the CG library.
  • the prepared Mix was added to the reaction product of the above (1) 5' linker, mixed, and then the mixture was added to the 3' joint annealing product of the above 1 (3), and reacted at 20 ° C for 1 hour in a Thermal cycler.
  • the purified PCR product was subjected to concentration determination using a Qubit dsDNA HS assay kit.
  • the library was quantified by Qubit TM ssDNA Assay Kit.
  • the ratio of Buffer to dye was 199:1.
  • votex and centrifuged for mixing Take two 190 ul of diluted dye working solution and add 10 ul of two standard votex and centrifuge. Mix and reserve, take 198ul diluted dye working solution to add 2ul sample, votex and centrifuge for Qubit instrument quantification
  • the 3' junctions of the small RNAs in the serum-derived exosomes of 4 lung cancer patients contained different Barcodes, so the four different sources of small RNA PCR can be expanded in the PAGE gel recovery step.
  • the product is pooled together for recovery and finally a CG hybrid library with 4 different initial samples pooled together.
  • the concentration of the mixed CG 1adapter library was greater than 7.5 fmol/ul and the volume was 20 ul, which met the concentration requirement for sequencing on the CG library (120 fmol required for CG library 1 sequencing sequencing make DNB).
  • the mixed library was sequenced using CG 1adapter 12+19 double-end sequencing to measure 2 lanes (7.5 G/lane).
  • the CG hybrid library was sequenced and analyzed. The results showed that the data of the small RNA CG library in the serum-derived exosomes of 4 lung cancer patients in the mixed library were all larger than 60M reads. The data was found to be 55. A known small RNA containing 36 cancer-associated small RNAs. The results indicate that the small RNA derived from the serum exosome can be constructed into a CG library by using the CG 1adapter construction method with low cost, simple operation, short time and high success rate. The successful construction of the CG library is suitable for high sequencing throughput. , Complete sequencing of the complete genome (Complete Genomics, CG) sequencing platform. By analyzing the data of the Small RNACG library under the database sequencing method, some information about cancer-related small RNA can be obtained, which can lay a foundation for the early diagnosis of cancer and the development of subsequent personalized targeted therapy.

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Abstract

提供了一种small RNA文库的构建方法，其构建的small RNA 文库适用于第二代测序技术。

Description

一种small RNA的文库构建及测序方法 技术领域
本发明涉及癌症诊断领域。更具体而言，本发明涉及癌症相关small RNA的文库。
背景技术
近年来全球癌症发病形势严峻，发病率与死亡率呈持续上升趋势。国际癌症研究机构发表的《2014年世界癌症报告》显示，全球癌症发病数从2008年的1270万例上升至2012年的1410万例，并预计在未来20年达到每年2200万的水平，同期癌症死亡人数也将从每年820万飙升至1300万。而中国的癌症在2012年的发病个案几乎占了全球一半，高居第一位。早在国家癌症中心发布的《2012肿瘤登记年报》中显示，每年我国新发癌症病例约312万，每分钟有6人被诊断为恶性肿瘤；每年全国因癌症死亡病例约270万，每分钟有5人死于癌症。目前，我国居民因癌症死亡的几率是13％[1，2]，癌症对人类健康和生命的构成了极大的威胁。
20世纪以来，现代医学技术在癌症诊断和治疗方面取得了较大进步，但是仍然存在诊断不及时，治疗手段效果不佳等问题。临床研究表明，原位癌治愈率接近100％，I期肺癌患者的6年生存率达60％-90％，而IIIb和IV患者的5年生存率仅为5％-20％，这说明癌症的早期诊断是改善预后的关键。然而由于缺乏理想的早期诊断技术，肺癌的早期诊断率仅为14％左右[3]。因此亟需发展癌症早期诊断技术，以提高患者的生存率。此外，有效地医治癌症也能够极大地降低 癌症的死亡率。但是在癌症的治愈率上，发达国家已达65％，而我国仅有25％左右，且目前癌症的临床治疗癌症的方法主要是手术切除和放、化疗手段。放、化疗在杀死癌细胞的同时，给人体正常细胞也带来了严重的损伤。因此发展新的有效治疗技术十分必要。近年来，随着对肿瘤研究的不断深入，肿瘤的生物治疗及靶向治疗凭借其无创或微创特性，特异性和靶向性在肿瘤治疗中发挥越来越重要作用，成为肿瘤治疗的主攻方向。
Small RNA是一类重要的体内调节分子，主要包括miRNA、piRNA和siRNA。Small RNA通过多种多样途径发挥作用，包括mRNA的降解、翻译抑制、异染色质形成以及DNA的去除来调控生物体的生长发育，甚至在癌症等相关疾病形成过程中也起着关键的作用。Small RNA在癌组织和非癌组织之间的表达存在很大的差异，且特定的small RNA表达异常与特定的癌症相关，因而small RNA可以用来作为诊断癌症的分子标记，如来源于外体(exosome)的miR-21可以作为几种癌症的预后指标，miR-21与miR-31和食道癌相关。此外，如果可以控制外体中miRNA的表达和释放或者利用外体携带发送一些具有治疗作用的miRNA等分子到靶细胞，则可以进行一些癌症和疾病的靶向治疗。通过构建small RNA文库以及对small RNA文库进行大规模的测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的small RNA图谱，实现包括新small RNA分子的挖掘，起作用靶基因的预测和鉴定，样品间差异表达分析，Small RNA聚类和表达谱分析等科学应用。
随着二代测序技术的发展，采用不同的文库构建技术构建的small RNA文库适用于不同的测序平台，如solexa测序平台、Ionproton测序平台。而完整基因组(Complete Genomics，CG)测序是一种新的二代测序技术，它采用高密度DNA纳米芯片技术，在芯片上嵌入DNA纳米球，用非连续、非连锁联合探针锚定(cPAL)技术读取序列，其具有更高的通量，且每个基因组测序的费用低 至1000美元。总之，CG文库构建测序技术具有建库成本低、操作简单、时间短、建库成功率高、测序快等特点，有很高的推广价值。
发明内容
本发明阐述的是一种新的small RNA的建库方法，可用于所有来源的small RNA的文库构建，构建的small RNA CG文库适用于第二代测序技术完整基因组(Complete Genomics，即CG)测序平台。
在第一方面，本发明提供了一种small RNA CG文库的构建方法，所述方法包括以下步骤：
1.提取样品的small RNA片段；
2.small RNA片段连接CG文库的3’接头和CG文库的5’接头；
3.连接上CG文库3’和5’接头的small RNA反转录成cDNA；
4.反转录产物的PCR扩增；
5.PCR扩增产物单链DNA的环化并回收环化产物；
6.文库质控和浓度测定。
在一个实施方案中，所述small RNA CG文库是癌症small RNA CG文库，所述样品是癌症样品。
在一个实施方案中，
3’接头：5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCxxxxxxxxxxGAGCTTGTC T-3’(SEQ ID NO.1)(其中xxxxxxxxxx表示10bp的Barcode序列，即多个样品混合上机测序时用于区分不同样品的序列)
5’接头：5’-UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACUU-3’(SEQ ID NO.2)。
在一个实施方案中，反转录的引物RT-primer： 5’-AGACAAGCTCxxxxxxxxxxGATCGGGCTTCG ACTGGA GAC-3’(SEQ ID NO.3)(其中xxxxxxxxxx表示10bp的Barcode序列)。
在一个实施方案中，反转录产物的PCR扩增使用引物ON0639：5’-TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’(SEQ ID NO.4)。
在一个实施方案中，单链DNA的环化使用ON1587：5’-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3’(SEQ ID NO.5)。
在一个实施方案中，SEQ ID NO.1选自SEQ ID NO.6-9。在一个实施方案中，SEQ ID NO.3选自SEQ ID NO.10-13。其中，SEQ ID NO.6-9与SEQ ID NO.10-13一一对应。
在第二方面，本发明提供了一种small RNA CG文库测序方法，所述方法包括以下步骤：
对本发明第一方面构建的small RNA CG文库用CG测序平台进行测序。
在一个实施方案中，所述small RNA CG文库是癌症small RNA CG文库。
本发明采用的small RNA文库构建方法适用于完整基因组(Complete Genomics，CG)测序平台，其测序通量高、建库成本低、操作简单、时间短、建库成功率高、测序快。该建库测序方法具有很高的推广价值，能够通过快速高效的构建来自人体的small RNA文库和后续的测序分析对癌症进行早期诊断以及发展后续个性化的靶向治疗。
本发明的方法构建的small RNA文库采用的是CG 1adapter建库方式，具有建库成本低，操作简单，时间短，建库成功率高，测序快等特点。
附图说明
图1.本实验的建库流程图。
具体实施方式
本发明提供了一种新的small RNA的建库和测序方法，可用于所有来源的small RNA文库的构建，构建的small RNA CG文库适用于第二代测序技术完整基因组(Complete Genomics，即CG)测序平台。
DNA CG文库的构建已经拥有一套成熟的建库方案，而本发明的small RNA CG文库的构建则是一种相对比较新的文库构建方式，与DNA CG文库构建的区别主要表现在以下几个方面：
1).DNA CG文库的构建需要对建库片段进行去磷酸化以及末端补平处理，而本发明的small RNA CG文库的构建无需此步骤，
2).DNA CG文库的构建方案中3’和5’接头是在同一个反应体系中，同时连接到建库片段的两端，而本发明的small RNA文库的构建3’和5’接头是分两个反应体系分别连接到建库片段的两端，且该3’和5’接头是华大针对small RNA自主设计合成的，
3.DNA CG文库的构建连上接头后需立刻进行缺口平移的反应再进行PCR扩增，而small RNA CG文库的构建无需进行缺口平移的反应，只需将连上接头的文库片段经反转录后再进行PCR扩增，
4.DNA CG文库的构建在PCR扩增后即可进行单链分离处理，而small RNA CG文库的构建则需先利用非变性PAGE胶纯化回收PCR扩增产物后再进行单链分离处理。
在一个具体的实施方案中，本发明的方法主要包括以下两个方面：
(一)small RNA CG文库的构建
1.small RNA片段连接CG文库的3’接头，
2.small RNA片段连接CG文库的5’接头，
3.连接上CG文库3’和5’接头的small RNA反转录成cDNA，
4.反转录产物的PCR扩增，
5.非变性PAGE胶(例如6％PAGE胶)纯化回收PCR扩增产物，
6.Qubit定量纯化回收后的PCR产物，
7.纯化回收后的PCR产物的单链分离，
8.单链DNA的环化，
9.酶切消化未环化的单链DNA，
10.纯化回收酶切消化后的产物(例如利用PEG32beads)，
11.文库质控和浓度测定；
(二)small RNA CG文库测序及下机数据分析，
1.small RNA CG文库CG测序平台上机测序，
2.small RNA CG文库下机数据的分析。
在一个实施方案中，
3’接头：5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCxxxxxxxxxxGAGCTTGTC T-3’(SEQ ID NO.1)(其中xxxxxxxxxx表示10bp的Barcode序列)
5’接头：5’-UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACUU-3’(SEQ ID NO.2)。
在一个实施方案中，反转录的引物RT-primer：5’-AGACAAGCTCxxxxxxxxxxGATCGGGCTTCG ACTGGA GAC-3’(SEQ ID NO.3)(其中xxxxxxxxxx表示10bp的Barcode序列)。
在一个实施方案中，反转录产物的PCR扩增使用引物ON0639：5’-TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’(SEQ ID NO.4)。
在一个实施方案中，单链DNA的环化使用ON1587： 5’-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3’(SEQ ID NO.5)。
实施例
本实施例中建库起始样本为4例肺癌患者血清来源的外体中的small RNA。先利用SBI公司的ExoQuickTMExosomes precipitation Solution对血清中的外体进行富集，然后再利用SBI公司的SearMir kit抽提外体中的small RNA，抽提的small RNA的浓度为0.162-0.424ng/ul，体积均为30ul。
本实施例中所用到的RNA 3’接头、RNA 5’接头、RT-primer、ON0639以及ON1587的具体序列如下：
1.3’接头：5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCxxxxxxxxxxGAGCTTGTC T-3’(SEQ ID NO.1)(其中xxxxxxxxxx表示10bp的Barcode序列即多个样品混合上机测序时用于区分不同样品的序列)，本实施例中用到4条带10bp Barcode的3’接头均是华大自主设计合成的，其序列分别为：
5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCATAAGGCAGTGAGCTTGTC T-3’(SEQ ID NO.6)
5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCTTGATAGATTGAGCTTGTC T-3’(SEQ ID NO.7)
5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCCCTTCCTGGTGAGCTTGTC T-3’(SEQ ID NO.8)
5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCAATATCTCTCGAGCTTGTC T-3’(SEQ ID NO.9)
2.5’接头：5’-UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACUU-3’(SEQ ID NO.2)
3.RT-primer：5’-AGACAAGCTCxxxxxxxxxxGATCGGGCTTCG ACTGGA GAC-3’(SEQ ID NO.3)(其中xxxxxxxxxx表示10bp的Barcode序列)
本实施例中用到4条带10bp Barcode的RT-primer均是华大自主设计合成的，其序列分别为：
5’-AGACAAGCTCACTGCCTTATGATCGGGCTTCGACTGGAGAC-3’(SEQ ID NO.10)
5’-AGACAAGCTCAATCTATCAAGATCGGGCTTCGACTGGAGAC-3’(SEQID NO.11)
5’-AGACAAGCTCACCAGGAAGGGATCGGGCTTCGACTGGAGAC-3’(SEQID NO.12)
5’-AGACAAGCTCGAGAGATATTGATCGGGCTTCGACTGGAGAC-3’(SEQID NO.13)
4.ON0639：5’-TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’(SEQID NO.4)
5.ON1587：5’-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3’(SEQID NO.5)
本实施例具体的small RNA CG建库的步骤如下：
1.small RNA片段连接CG文库的3’接头
(1)反应体积及条件
试剂 体积(ul)
small RNA(无核酸酶) 5
10uM RNA 3’接头 1
总计 6
在Thermal cycler中70℃反应2min后立即放置于冰上
(2)Mix的配置及反应条件
Figure PCTCN2015072784-appb-000001
将配置好的Mix加入到(1)的反应产物中后混匀，Thermal cycler中25℃反应2小时，然后12℃保持
(3)3’接头退火
在(2)的反应产物中加入0.5ul 100uM RT-primer，混匀，然后Thermal cycler中75℃反应5min，37℃反应30min，25℃反应15min
2.small RNA片段连接CG文库的5’接头
(1)取新的RNase-free的PCR管，加入1ul 10uM RNA 5’接头，Thermal cycler中70℃反应2min，然后立即放置于冰上
(2)Mix的配置及反应条件
试剂 体积
10mM ATP 1
10U/ul T4RNA连接酶1(BioLabs) 1
40U/ul RNase抑制剂 0.5
总计 2.5
将配好的Mix加入到上述(1)5’接头的反应产物中，混匀，然后将该混合物加入到上文1(3)的3’接头退火产物中，Thermal cycler中20℃反应1小时
3.连接上CG文库3’和5’接头的small RNA反转录成cDNA
(1)反转录体系及反应条件
Figure PCTCN2015072784-appb-000002
Figure PCTCN2015072784-appb-000003
将配好10.5ul体系加入到第2步的反应产物中，混匀，Thermal cycler中42℃反应40min，70℃反应15min，然后12℃保持
4.反转录产物的PCR扩增
(1)PCR反应体系
Figure PCTCN2015072784-appb-000004
将配置好的25ul体系加入到上文3的反转录产物中，共50ul体系
(2)PCR反应条件
Figure PCTCN2015072784-appb-000005
Figure PCTCN2015072784-appb-000006
5.6％的非变性PAGE胶纯化回收PCR扩增产物
(1)20bp DNA ladder上样2ul，PCR产物里加入10ul 6x loading buffer混匀，180V恒压电泳
(2)制作套管：用火烧注射器针头在500ul的EP管底部扎小孔，然后放入2ml EP管中，并用保鲜膜缠好2ml管子的盖子以及盖子与管体相连处
(3)将切好的目的片段PAGE胶放入扎有小孔的500ul的EP管中，室温12000rpm离心2min，破碎PAGE胶块
(4)在破碎的PAGE胶块中加入0.3M NaCl，然后恒温混匀仪中350rpm，25℃，2小时
(5)将混匀后的混合液转移到spin-x 0.45um滤柱中，4℃，13000rpm离心5min
(6)在滤液中依次加入1/10体积的3M醋酸钠，2ul 5mg/ml的糖原，2-3倍体积的无水乙醇，然后-80℃沉淀1小时
(7)4℃，13000rpm离心30min，然后加入1ml 80％乙醇轻轻弹起沉淀进行洗涤
(8)4℃，13000rpm离心5min，室温晾干后加入22ul elution buffer溶解沉淀
6.Qubit定量纯化回收后的PCR产物
利用Qubit dsDNA HS assay kit对纯化回收后的PCR产物进行浓度测定。
7.纯化回收后的PCR产物的单链分离
(1)将上述elution buffer溶解的DNA样品加1xTE至总体积为60ul
(2)提前准备以下试剂：将100％Tween 20稀释成0.5％Tween 20，Streptavidin Beads涡旋混匀
(3)提前15min配置1x BBB(Bead Binding Buffer，110mM Tris-HCl，200mM NaCl)/0.5％Tween20Mix、1x BWB(Bead Wash Buffer，10mM Tris-HCl，40mM NaCl)/0.5％Tween20Mix、0.1M NaOH，配置方法如下：
a.1X BBB/0.5％Tween20Mix
试剂 体积(ul)
1X BBB 30
0.5％Tween20 0.3
总计 30.3
b.1X BWB/0.5％Tween20Mix
试剂 体积(ul)
1X BWB 2000
0.5％Tween20 20
总计 2020
c.0.1M NaOH
试剂 体积(ul)
0.5M NaOH 5.2
水 20.8
总计 26
(4)采用如下方法洗涤Streptavidin Beads(与生物素B连接)
a.每个样品取30ul Streptavidin Beads加入到1.5ml EP管中，然后再加入4倍体积的1XBBB，混匀后置于磁力架上静止吸附，调整EP管的方向，使 得beads在1XBBB洗液中前后游动(转动EP管2次)，弃上清液后，重复上述操作一次
b.取出不粘管加入1倍体积(30ul)1X BBB/Tween Mix悬浮，混匀后室温静置
(5)向60ulPCR产物样品中加入20ul 4XBBB混匀，然后转移到上步骤含有30ul 1X BBB/0.5％Tween20Mix溶解的beads的不粘管中混匀，此110ul混合物室温下结合15-20min，中间轻轻弹匀一次
(6)将上述不粘管磁力架放置3-5min，弃去上清液，用1ml的1XBWB/0.5％Tween20Mix洗涤2次，方法同Streptavidin Beads的洗涤方法
(7)向上述beads中加入26ul 0.1M NaOH，吹打混匀后放置10min，再置于磁力架上3-5min，取上清到新的PCR管中
(8)向上述PCR管中加入13ul 0.3M MOPS，混匀备用，此步骤产物可以冻存于-20℃
8.单链DNA的环化
(1)向上一步得到的39ul的样品中加入10ul的20uM ON1587
(2)Mix配置及反应条件
试剂 体积(ul)
水 4.2
10x TA Buffer(LK1) 6
100mM ATP 0.6
600U/ul连接酶 0.2
总计 11
将该Mix震荡充分混匀后离心，然后加入到(1)的混合液，震荡10s混匀，瞬时离心后
37℃反应1.5小时
9.酶切消化未环化的单链DNA
(1)Mix配置及反应条件
试剂 体积(ul)
10x TA Buffer(LK1) 1
20U/ul ExoI 3
200U/ul ExoIII 1
总计 5
将该Mix震荡充分混匀后离心，然后加入到上一步环化产物中，震荡10s混匀，瞬时离心后37℃反应30min
(2)酶切30min完成后向样品中加入2.5ul 500mM EDTA终止酶反应
10.利用PEG32beads纯化回收酶切消化后的产物
(1)将上述酶切反应产物转移到新的1.5ml不粘管中，加入84.5ul的PEG32beads/0.5％Tween20(PEG32beads∶0.5％Tween20＝100∶1)，室温结合15min，期间吹打混匀一次
(2)不粘管置于磁力架3-5min后弃去上清
(3)700ul 75％乙醇洗涤两次，洗涤时将不粘管前后方向反转，使得beads在乙醇中游动，每次洗涤游动2-3次
(4)室温下晾干加入27ul TE/0.5％Tween20(TE∶0.5％Tween20＝500∶1)，室温结合15min，中间混匀一次
(5)将上清转移到新的1.5ml EP管中，最终得到产物即为CG文库
11.文库质控和浓度测定
(1)该文库用QubitTM ssDNA Assay Kit定量，Buffer与染料比例为199∶1 混匀后votex并离心混合备用，取两份190ul稀释后染料工作液分别加入10ul的两种标准品votex并离心混合备用，取198ul稀释后染料工作液加入2ul样品，votex后并离心进行Qubit仪器定量
(二)small RNA CG文库测序及下机数据分析
1.small RNA CG文库CG测序平台上机测序
在文库构建过程中，4例肺癌患者血清来源的外体中的small RNA所加的3’接头分别包含不同的Barcode，因此在PAGE胶回收步骤中可以将这四例不同来源的small RNA PCR扩增产物pooling在一起进行回收，最后形成一个具有4个不同初始样本pooling在一起的CG混合文库。该混合CG 1adapter文库的浓度大于7.5fmol/ul，体积为20ul，达到CG文库上机测序的浓度要求(CG文库1adapter测序make DNB需要120fmol)。该混合文库采用CG 1adapter 12+19双端测序，测2条lane(7.5G/lane)。
2.small RNA CG文库下机数据的分析。
该CG混合文库经测序后进行数据分析，分析结果显示该混合文库中4例肺癌患者血清来源的外体中的small RNA CG文库测序得到的数据量均大于60M reads，数据经比对分析发现55个已知的small RNA，且其中包含有36条与癌症相关的small RNA。该结果表明来源于血清外体中的small RNA可以采用成本低、操作简单、时间短、建库成功率高的CG 1adapter建库方式构建成CG文库，构建成功的CG文库适用于测序通量高、测序快的完整基因组(Complete Genomics，CG)测序平台。通过对该建库测序方式的Small RNACG文库下机数据分析，可以得到一些与癌症相关的small RNA的信息，可以为癌症的早期诊断以及发展后续个性化的靶向治疗奠定基础。

Claims (10)

  1. 一种small RNA CG文库的构建方法，所述方法包括以下步骤：
    (1)提取样品的small RNA片段；
    (2)small RNA片段连接CG文库的3’接头和CG文库的5’接头；
    (3)连接上CG文库3’和5’接头的small RNA反转录成cDNA；
    (4)反转录产物的PCR扩增；
    (5)PCR扩增产物单链DNA的环化并回收环化产物；
    (6)文库质控和浓度测定。
  2. 权利要求1的方法，所述small RNA CG文库是癌症small RNA CG文库，所述样品是癌症样品，所述癌症优选是肺癌。
  3. 权利要求1或2的方法，所述3’接头是SEQ ID NO.1：5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGATCxxxxxxxxxxGAGCTTGTC T-3’，其中xxxxxxxxxx表示10bp的Barcode序列，并且/或者所述5’接头是SEQ ID NO.2：5’-UCCUAAGACCGCUUGGCCUCCGACUU-3’。
  4. 权利要求3的方法，其中SEQ ID NO.1选自SEQ ID NO.6-9。
  5. 权利要求1-3任一项的方法，所述反转录的引物RT-primer是SEQ ID NO.3：5’-AGACAAGCTCxxxxxxxxxxGATCGGGCTTCG ACTGGA GAC-3’(其中xxxxxxxxxx表示10bp的Barcode序列)。
  6. 权利要求5的方法，其中SEQ ID NO.3选自SEQ ID NO.10-13。
  7. 权利要求1-6任一项的方法，所述反转录产物的PCR扩增使用引物SEQ ID NO.4：5’-TCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’。
  8. 权利要求1-7任一项的方法，所述单链DNA的环化使用SEQ ID NO.5：5’-TCGAGCTTGTCTTCCTAAGACCGC-3’。
  9. 一种small RNA CG文库测序方法，所述方法包括以下步骤：
    对权利要求1-8任一项构建的small RNA CG文库用CG测序平台进行测序。
  10. 权利要求9的方法，所述small RNA CG文库是癌症small RNA CG文库。
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