WO2016125937A1 - Pdk2를 이용한 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법 및 상기 방법으로 스크리닝 된 치료제를 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Pdk2를 이용한 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법 및 상기 방법으로 스크리닝 된 치료제를 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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이선주
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Definitions

  • the present invention relates to a method for screening or preventing treatment of women's menopausal diseases using PDK2, and a pharmaceutical composition for preventing or treating women's menopausal diseases comprising the therapeutic agent screened by the above method as an active ingredient.
  • Menopause is a transitional period in which the gradual decline in ovarian function occurs, leading to a decrease or loss of physiological and sexual function. Menopause is a permanent stop of physiology that occurs after ovarian function is stopped as part of menopause. .
  • FSH foll iclular st imulating hormone
  • LH luteininzing hormone
  • menopausal disease cl imacteric disorder
  • postmenopausal syndrome menopausal syndrome
  • menopausal syndrome menopausal syndrome
  • menopausal syndrome menopausal syndrome
  • vascular changes there are five main symptoms: i) symptoms caused by vascular changes, ii) symptoms caused by musculoskeletal changes, ⁇ ⁇ urogenital changes, iv) symptoms caused by changes in the cranial nervous system, and V) general changes.
  • Symptoms due to vascular changes are mainly facial hot flashes, tachycardia, sweating or headache, and the symptoms caused by musculoskeletal changes include myalgia, joint pain or low back pain, and the symptoms caused by the genitourinary changes are urinary or urinary incontinence.
  • the symptoms caused by the brain nervous system changes include memory loss, depression, concentration loss and dizziness, and the general change of symptoms may include decreased vision or changes in skin and hair.
  • menopausal disease is an important risk that affects the life and health of women over a long period of time increases the risk of fatal disease, that is, osteoporosis or cardiovascular disease, such as women. Therefore, there is a need for the development of a therapeutic agent for menopausal diseases for the improvement of physical and mental health and quality of life of middle-aged women.
  • drug therapies such as hormone replacement therapy and nonsteroidal agents have been developed, and the most effective method so far is hormone replacement therapy.
  • PM Pyruvate dehydrogenase kinase is an enzyme that inactivates pyruvate dehydrogenase using ATP to inactivate its function and is distributed in the eukaryotic mitochondria.
  • the human PDK family consists of four allogeneic pathways, PDKl, PKD2, PDK3, and PDK4, which have been found to be important targets for the treatment of tumors, crab type 2 diabetes, fatty liver, etc.
  • PDK2 is effective in preventing or treating menopausal women's diseases.
  • osteoblast differentiation of PDK2 overexpressed is lower than the differentiation of osteoblasts, and when the PDK2 is defective in the menopausal animal model by ovarian resection, bone loss is protected by menopause It has been found possible to prevent or treat osteoporosis, one of the female diseases. Accordingly, the present invention has been completed in light of the fact that a substance that reduces the expression or activity of PDK2 can be usefully used for preventing or treating menopausal female diseases. Accordingly, it is an object of the present invention to provide a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for female menopausal diseases that inhibits the expression or activity of PDK2.
  • Another object of the present invention is to provide a method for screening a prophylactic or therapeutic agent for female menopausal diseases using cells expressing PKD2 or cells with increased PDK2 expression.
  • Another object of the present invention is the female menopausal disease is osteoporosis, high fever, hyperhidrosis, depression, insomnia, urinary incontinence, edema, facial relief, memory loss, headache, nervousness, dizziness, palpitations, tachycardia, nausea, joint pain, muscle pain, limbs It is to provide a method characterized in that at least one selected from the group consisting of depression and weight gain.
  • Another object of the present invention to provide a composition for promoting osteoblast differentiation comprising a PDK2 inhibitor as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is the female menopausal disease is osteoporosis, high fever, hyperhidrosis, depression, insomnia, incontinence, edema, hot flashes, memory loss, headache, neurosensitivity, dizziness, palpitations, tachycardia, nausea, joint pain, muscle pain, limbs It is to provide a composition characterized in that at least one selected from the group consisting of depression and weight gain.
  • the present invention provides a method for screening a test substance that reduces the expression or activity of PDK2 protein in comparison to a control step of ( a ) contacting a test substance to a cell and (b) a control group not contacting the test substance. It provides a method for screening a female menopausal disease prevention or treatment comprising a.
  • the present invention is to provide a method characterized in that the cell of step (a) is a cell expressing PDK2 or a cell with increased PDK2 expression.
  • the menopausal disease is osteoporosis, hyperthermia, hyperhidrosis, depression, insomnia, urinary incontinence, edema, hot flashes, memory loss headache, nervousness, dizziness, palpitations, tachycardia, nausea, It provides a method characterized in that the at least one selected from the group consisting of arthralgia, myalgia, hydrocephalus and weight gain.
  • the present invention provides a composition for promoting osteoblast differentiation comprising a PDK2 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition for preventing or treating female menopausal disease, including a PDK2 inhibitor as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition, characterized in that the PDK2 inhibitor is siRNA or ant i sense RNA for PDK2.
  • the present invention provides a composition, characterized in that the PDK2 has an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1.
  • the menopausal disease is osteoporosis, high fever, hyperhidrosis, depression, insomnia, urinary incontinence, edema, hot flashes, memory loss, headache, nervousness, dizziness, palpitations, tachycardia, nausea, It provides a composition characterized in that at least one selected from the group consisting of arthralgia, myalgia, hydrocephalus and weight gain.
  • the present invention will be described in detail.
  • the degree of osteoblast differentiation was observed by infecting PDK2 with a retrovirus in MC3T3E1, a mouse osteoblast cell line, to confirm the association between PDK2 and female menopausal disease. As a result, it was confirmed that the differentiation of cells was lowered in osteoblasts overexpressed with PDK2 compared to cells that were not (see Example 1).
  • primary differentiation priimary culture of bone marrow stem cells (bone marrow stromal cel l) of mice lacking PDK2 was observed.
  • bone marrow stem cells in primary cultures in mice lacking PDK2 have increased cell differentiation compared to bone marrow stem cells in primary cultures in mice in which PDK2 is normally expressed. tor) was also found to increase (see Examples 2 and 3).
  • PDK2 is deficient in mice and PDK2 is normally expressed.
  • the increase in body weight and bone mineral density were observed.
  • the present invention provides a female comprising the steps of: (a) contacting a test substance to a cell and (b) selecting a test substance that reduces the expression or activity of PDK2 protein as compared to a control group not contacting the test substance.
  • the cell is a cell expressing PDK2 or a cell in which the expression of PDK2 is increased, which may be a cell containing a gene encoding PDK2 or a cell intentionally introducing a gene encoding PDK2.
  • a method for introducing a gene encoding PDK2 into a cell any method known in the art may be used without limitation.
  • cells can be transfected with an expression vector comprising a polynucleotide encoding the PDK2 protein, or PDK2 can be infected with a retrovirus.
  • the cells may be osteoblasts, preferably MC3T3E1 cells, which are mouse osteoblasts.
  • the cells include all cells of animal origin, such as human or bovine, goat, pig mouse, rabbit, hamster, guinea pig, primary cells, secondary cells, immortalized cells, primary culture from animals (primary culture) ) Cells and the like can be used.
  • the test substance refers to an unknown substance used for screening to test whether to reduce the expression or activity of PDK2 protein.
  • the test substance is an antisense oligonucleotide, siRNA (short interfering RNA), shRNA (short hairpin RNA), RNAi and natural product extract complementarily binding to the mRNA of the PDK2 gene, a chemical Any one selected from the group consisting of, or any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics and antibodies complementarily binding to PDK2 protein can be used, but is not limited thereto.
  • the test substance After the test substance is contacted with the cell, the test substance is determined to be a woman's menopausal disease if it is determined that the expression level of PDK2 protein or the activity of PDK2 protein is decreased in the cells to which the test substance is contacted, compared to the control group without contact with the test substance. It can be determined as a prophylactic or therapeutic agent.
  • the method of confirming the expression or activity of PDK2 in the above may use the general techniques used to confirm the expression of the protein in the art.
  • the method may further include the step of selecting a test substance that inhibits bone mineral density reduction by administering the test substance selected through the steps (a) and (b) to the individual.
  • the subject may be a rat or a mouse, and may be an animal model in which female menopausal disease is induced by ovarian resection according to a method known in the art.
  • the method of administering the test substance to the subject may be used orally, transdermally, intravenously or intraperitoneally, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides a method characterized in that the cell of step (a) is a cell expressing PDK2 or a cell with increased expression of PDK2. It may be a cell originally containing a gene encoding PDK2 or a cell intentionally introducing a gene encoding PDK2.
  • any method known in the art may be used without limitation.
  • cells may be transfected with an expression vector comprising a polynucleotide encoding a PDK2 protein, or PDK2 may be infected with a retrovirus, but is not limited thereto.
  • the female menopausal disease but is not limited to osteoporosis, high fever, hyperhidrosis, depression, insomnia, incontinence, edema, facial relief, memory loss, headache, nervousness, dizziness, palpitations, tachycardia, nausea, joint pain, At least one selected from the group consisting of muscle pain, hand and foot, and weight gain is preferably characterized in that osteoporosis.
  • the female menopausal disease refers to a symptom caused by a decrease in secretion of estrogen (female hormone) due to aging or malfunction of the ovary, or a disease caused by: i) a symptom caused by vascular change, ii) Symptoms of musculoskeletal changes, iii) Symptoms of urogenital changes, iv) Symptoms of changes in the nervous system and V) Symptoms of general changes. Symptoms due to the vascular changes are mainly facial hot flashes, high fever, tachycardia, hyperhidrosis, cold hands or feet, headaches, etc.
  • the symptoms caused by the musculoskeletal changes include myalgia, arthralgia or low back pain, the symptoms caused by the genitourinary changes are urinary Or urinary incontinence, and the symptoms caused by the cranial nervous system changes include memory loss, depression, concentration decline, insomnia, neurological hypersensitivity, nausea and dizziness, etc.
  • the symptoms caused by the general change are decreased vision, weight gain, skin and Hair changes and the like, but is not limited thereto.
  • the osteoporosis may include, but is not limited to, menopausal osteoporosis triggered by postmenopausal female hormone reduction, primary osteoporosis occurring with age, or osteoporosis due to ovarian extraction.
  • the present invention also provides a composition for promoting osteoblast differentiation comprising a PDK2 inhibitor as an active ingredient.
  • the PDK2 inhibitor is any one selected from the group consisting of chemicals, antisense oligonucleotides that complementarily bind to mRNA of the PDK2 gene, short interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), RNAi, and natural extracts, Any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics and antibodies that complementarily bind to PDK2 protein can be used, but is not limited thereto. Do not.
  • the composition may be a health functional food composition or a pharmaceutical composition for promoting osteoblast differentiation, but is not limited thereto.
  • compositions of this type can be prepared in various forms according to conventional methods known in the art.
  • a health food PDK2 of the present invention may be prepared in the form of tea, juice and drink for drinking, or granulated, encapsulated and powdered.
  • PDK2 of the present invention can be prepared in the form of a composition by mixing with PDK2 of the present invention and a known substance or active ingredient known to promote osteoblast differentiation.
  • composition of the present invention is effective in the prevention and improvement of diseases not caused by bone loss
  • the disease caused by bone loss is preferably any one selected from the group consisting of osteoporosis, rheumatoid spondylitis, periodontitis, but is not limited thereto. no.
  • composition of the present invention can also effectively work for bone loss caused by other diseases such as hyperparathyroidism, cumulative disease, chronic kidney disease, myeloma or antiepileptic drugs, all diseases due to bone loss known to those skilled in the art
  • the present invention also provides a method of contacting a cell with a test substance, (b) selecting a test substance that reduces the expression or activity of PDK2 protein as compared to a control group without contact with the test substance, and (c) It provides a method for screening osteoblast differentiation promoting material comprising the step of selecting a test substance to promote differentiation by contacting the test substance selected in step b) with osteoblasts.
  • the cell of step (a) is a cell expressing PDK2 or a cell in which the expression of PDK2 is increased, which may be a cell containing a gene encoding PDK2 or a cell intentionally introducing a gene encoding PDK2.
  • the method of introducing a gene encoding PDK2 into a cell can use any method known in the art without limitation.
  • transfecting cells with an expression vector comprising a polynucleotide encoding the PDK2 protein PDK2 can be infected with a retrovirus.
  • the cells may be osteoblasts, preferably MC3T3E1 cells, which are mouse osteoblasts.
  • the cells include all cells of animal origin, such as human or cattle, goat pigs, mice, rabbits, hamsters, guinea pigs, primary cells, secondary cells, immortalized cells, primary culture from animals Prepared cells and the like can be used.
  • the test substance refers to an unknown substance used for screening to test whether the osteoblast differentiation is promoted.
  • the test substance is any one selected from the group consisting of chemicals, antisense oligonucleotides complementary to the mRNA of PDK2 gene, short interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), RNAi and natural extracts, or PDK2 Any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics and antibodies that complementarily bind to proteins can be used, but is not limited thereto.
  • the method of confirming the expression or activity of PDK2 in step (b) may use the general techniques used for confirming the expression of the protein in the art.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • radioimmunoassay radioimmunoassay
  • sandwich assay western blot on polyacrylamide gel
  • immunoprecipitation assay complement fixation assay
  • Assays (FACS) protein chips, and combinations thereof may be used, but are not limited thereto.
  • the test substance is used for promoting osteoblast differentiation when it is confirmed that osteoblast differentiation is promoted in the cells to which the test substance is contacted, as compared with the control group without contacting the test substance. It can be determined as a substance.
  • the method for confirming the differentiation of osteoblasts may use the general techniques used to confirm the differentiation of osteoblasts in the art.
  • the present invention also provides a composition for preventing or treating female menopausal diseases, including a PDK2 inhibitor as an active ingredient.
  • the PDK2 inhibitor is any one selected from the group consisting of chemicals, antisense oligonucleotides complementary to the mRNA of PDK2 gene, short interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), RNAi, and natural extracts, or PDK2 Any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, and antibodies that complementarily bind to proteins can be used, but is not limited thereto.
  • compositions according to the present invention may contain the compositions of the present invention or their pharmaceutically acceptable salts alone or may further contain one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • Pharmaceutically acceptable carriers may further include, for example, carriers for oral administration or carriers for parenteral administration. Carriers for oral administration may include lactose, starch, cellulose derivatives, magnesium stearate, stearic acid and the like.
  • carriers for parenteral administration may include water, suitable oils, saline, aqueous glucose and glycols, and the like, and may further include stabilizers and preservatives. Suitable stabilizers include antioxidants such as sodium bisulfite, sodium sulfite or ascorbic acid.
  • Suitable preservatives include benzalkonium chloride, methyl- or propyl-paraben and chloro butanol.
  • Other pharmaceutically acceptable carriers may be referred to those described in the following literature (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, East on, PA, 1995).
  • the pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of female menopausal diseases of the invention can be administered to mammals including humans by any means. For example, it can be administered orally or parenterally.
  • Parenteral administration methods include, but are not limited to, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intradural, intracardiac, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, intestinal, topical, sublingual or rectal administration.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered transdermally.
  • transdermal administration refers to a cell or a pharmaceutical composition of the present invention.
  • Administration to the skin refers to the delivery of the active ingredient contained in the composition of the present invention into the skin.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be prepared in an injectable formulation,
  • compositions of the present invention may be formulated into a preparation for oral or parenteral administration according to the route of administration as described above.
  • preparations for oral administration the compositions of the present invention are formulated using powders, granules, tablets, pills, sugar tablets, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions, etc. using methods known in the art.
  • oral preparations can be obtained by tablets or dragees by combining the active ingredient with a solid brother and then grinding it, adding suitable auxiliaries and processing it into a granular mixture.
  • excipients examples include sugars and corn starch, wheat starch, rice starch and potato starch, including lactose, dextrose, sucrose, solbi, manny, xili, erysri and malty.
  • Layered such as starch, cellulose, methyl cellulose, sodium carboxymethyl cellulose and hydroxypropyl methyl- cellulose, and the like, such as cellulose, gelatin, polyvinylpyridone, and the like.
  • crosslinked polyvinylpyridone, agar, alginic acid or sodium alginate and the like may optionally be added as a disintegrant.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an anticoagulant, a lubricant, a humectant, a perfume, an emulsifier, and a preservative.
  • Formulations for parenteral administration may be formulated in the form of injections, creams, lotions, external ointments, oils, humectants, gels, aerosols and nasal inhalants in the art. These formulations are described in Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edit ion, 1975. Mack Publishing Company, East on, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour, a prescription generally known for all pharmaceutical chemistries. It is.
  • the total effective amount of the pharmaceutical composition comprising the PDK2 inhibitor of the present invention may be administered to a patient in a single dose, and is a long-term administration of a multiple dose (fract ionated treatment protocol). It can be administered by.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may vary the content of the active ingredient depending on the extent of the disease.
  • Preferably the preferred total dose of the pharmaceutical composition of the present invention is From about O.Olug to 1,000 mg, most preferably 0.1 ug to 100 mg per kg of patient body weight.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be adjusted in consideration of various factors such as the age, weight, health condition, severity of the disease, diet and excretion rate, as well as the route and frequency of treatment of the pharmaceutical composition.
  • an effective dosage for the specific use of the pharmaceutical composition of the present invention as a prophylactic or therapeutic agent for female menopausal diseases is determined by those skilled in the art. You will be able to decide.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited to its formulation, route of administration, and method of administration as long as the effect of the present invention is shown.
  • the present invention is also characterized in that the PDK2 inhibitor is siRNA or ant i sense RNA for PDK2.
  • a composition for preventing or treating menopausal diseases is provided by those skilled in the art.
  • the ant i sense RNA refers to RNA or a derivative thereof containing a nucleic acid sequence complementary to the sequence of a particular mRNA, and binds to the complementary sequence in the mRNA to inhibit the translation of the mRNA into a protein.
  • Antisense sequences of the invention refer to RNA sequences that are complementary to PDK2 mRNA and capable of binding to PDK2 mRNA, and that translate PDK2 mRNA, translocat ion, maturat ion, or any other overall biological function. May inhibit the essential activity for.
  • the length of the ant i sense RNA may be 6 to 100 bases, preferably 8 to 60 bases, more preferably 10 to 40 bases.
  • the ant i sense RNA may be synthesized in vitro in a conventional manner to be administered in vivo or to synthesize ant isense RNA in vivo.
  • synthesizing ant isense RNA in vitro is using RNA polymerase I.
  • One example of allowing ant isense RNA to be synthesized in vivo is to allow ant isense RNA to be transcribed using vectors with opposite origins of multiple cloning sites (MCS).
  • MCS multiple cloning sites
  • the ant isense RNA is preferably such that the translation proof codon is present in the sequence so as not to be translated into the peptide sequence.
  • the design of the ant isense RNA that can be used in the present invention can be easily produced according to methods known in the art with reference to the nucleotide sequence of the PDK2 gene.
  • the siRNA is a nucleic acid molecule capable of mediating RNA interference or gene silencing (See International Publication Nos. 00/44895, 01/36646, 99/32619, 01/29058, 99/07409 and 00/44914).
  • siRNA is provided as an efficient gene knock-down method or gene therapy method because it can inhibit the expression of the target gene.
  • Such siRNA for PDK2 can be easily prepared by those skilled in the art from gene sequences of known databases.
  • the present invention is also a woman menopausal disease is osteoporosis, high fever, hyperhidrosis, depression, insomnia, incontinence, edema, hot flashes, memory loss, headache, nervousness, dizziness, palpitations, tachycardia, nausea, joint pain, muscle pain, limbs It provides a composition for preventing or treating female menopausal diseases, characterized in that at least one selected from the group consisting of depression and weight gain.
  • the present invention also provides a composition, characterized in that the osteoporosis is osteoporosis triggered by ovarian resection.
  • the present invention provides a method for screening or preventing a woman's menopausal disease, an osteoblast differentiation promoting composition comprising a PDK2 inhibitor as an active ingredient, a method for screening a substance for promoting osteoblast differentiation, a PDK2 inhibitor as an active ingredient It provides a composition for preventing or treating menopausal diseases, including women.
  • Female menopausal disease prevention or treatment agent according to the present invention may be effective in preventing or treating female menopausal diseases such as osteoporosis by reducing the expression or activity of PDK2.
  • FIG. 1 is an experimental result confirming that osteoblast differentiation is inhibited in cells overexpressing PDK2 (A: PDB2 expression is confirmed by Western blot, B: ALP staining, C: vonKossa staining, D: bone formation Expression of genes).
  • Figure 2 is an experimental result confirming the differentiation of cells according to whether or not PDK2 expression by primary culture of bone marrow stem cells of the mouse (WT: bone marrow stem cells of wild type mice with PDK2 normal expression, PDK2 K0: PDK2 is missing Bone Marrow Stem Cells of Mouse, A: ALP staining, B: vonKossa staining, C: expression of osteogenic genes).
  • Figure 3 is an experimental result confirming the differentiation of the cells according to whether or not the expression of mouse bone marrow stem cells and their precursor f ibroblast PDK2 by ALP staining (WT: cells of wild-type mouse with PDK2 normal expression, PDK2 K0: PDK2 is Cells of missing mice, con: controls not inducing differentiation, di ffer: cells inducing differentiation, CFU-0: colony forming unit osteoblast, CFU ⁇ F: colony forming unit f ibroblast).
  • Figure 4 is an experimental result comparing the degree of body weight change and bone loss according to the expression of PDK2 in ovarian mice (WT ' : wild-type mouse with normal expression of PDK2, 2K0: mice lacking PDK2) , sham: mouse without ovarian resection, 0VX: mouse with ovarian resection, A: weight change, B: comparison of bone loss in the lumbar spine, C: comparison of bone loss in the femur).
  • WT ' wild-type mouse with normal expression of PDK2, 2K0: mice lacking PDK2
  • sham mouse without ovarian resection
  • 0VX mouse with ovarian resection
  • A weight change
  • B comparison of bone loss in the lumbar spine
  • C comparison of bone loss in the femur
  • FIG. 5 is an experimental result compared with a loss a micro CT in Trapani bay climb of the expression whether PDK2 in mice with ovariectomy is performed (WT: PDK2 is a normal expression there is a wild type mouse, 2K0: PDK2 the deficit Mice, sham: mice without ovarian resection, 0VX: mice with ovarian resection, BMD: bone mineral density.
  • Figure 6 is an experimental result comparing the degree of bone formation and bone loss according to the expression of PDK2 in mice undergoing ovarian resection (0C assay: osteocalcin assay, CTX assay: c— terminal telopept ide assay).
  • Figure 7 is an experimental result comparing the activity of osteoclasts induced by ovarian resection according to the expression of PDK2 (WT: wild-type mice with normal expression of PDK2, 2K0: mice lacking PDK2, sham: ovary Mice without resection, 0VX: mice with resection).
  • MC3T3E1 cells (MC3T3E1 Subclone 4, ATCC, CRL-2593TM) were incubated in a -MEM (Gibco, A1049001) with 1 FBS and antibiotics added. 3 X for differentiation of osteoblasts
  • RNA extraction and RT-PCR Real-time PCR
  • Total shock was extracted from the cells using the RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN, 74804) according to the manufacturer's instructions.
  • CDNA was synthesized using Quant iTect Reverse Transcript ion Kits (QIAGEN, Cat .205310) using 5 ug of total RNA according to the manufacturer's instructions and 25 using SYBR® Green (Appl ied Biosystem, Rf.4367659) reagent.
  • Real-time-PCR was performed with ⁇ 50ng of cDNA. More specifically, 25-50 ng of cDNA and 2 pm forward and reverse primers were mixed with a 5 ⁇ SYBR® Green Master mix to give a total of 10 / ⁇ Rx. vol.
  • PDK2 After infecting PDK2 to MC3T3E1 cells using Retrovirus, the expression of PDK2 was confirmed by Western blot (Fig. 1 ′ A). To compare osteoblast differentiation according to the expression of PDK2, ALP staining was performed 8 days after osteoblast differentiation, and von Kossa staining was observed on 35th day. It was confirmed that osteoblast differentiation was significantly suppressed in PDK2 overexpressed cells compared to pore (Fig. 1, after the induction of osteoblast differentiation to confirm the association between PDK2 and genes related to bone formation.
  • RT-PCR was performed on days 14, 21, and 28, and as time passed, the expression levels of ⁇ 2 (bone morphogenetic protein 2) and 0C (osteocalcin) were suppressed in cells overexpressing PDK2. 1, D. Based on the results, it can be seen that PDK2 has a function of inhibiting osteoblast differentiation.
  • Red blood cells of wild-type C57BL6 / J female mice expressing PDK2 and C57BL6 / J female mice lacking PDK2 were removed and then filtered with 70 nylon mash (BD Falcon, 352350) and ⁇ - with 10% FBS. Incubate for 3 days in ⁇ medium It was. Half of the medium was replaced three times for seven days. Bone marrow stem cells were incubated in ⁇ - ⁇ medium containing 10% FBS, b-gp 8 mM and ascorbic acid 50 // g / m, and the medium was changed every 3 days. On day 3, 4% paraformaldehyde cells were fixed and subjected to ALP staining using ALP solution (SIGMA, N ⁇ ⁇ 86).
  • the medium was incubated for 3 days. Half of the medium was replaced three times for seven days.
  • Bone marrow stem cells were cultured in ⁇ - ⁇ medium containing 10% FBS, b-gp 8 mM and ascorbic acid 50 g / m £, and the medium was changed every 3 days.
  • CFUs colony forming units
  • Wild type C57BL6 / J female mice with normal expression of PDK2 and C57BL6 / J female mice lacking PDK2 were bred and ovarian resection was performed in the art to induce female menopausal animal models. After ovarian resection, the animals were reared for 5 weeks and observed for weight change. Once a week, the animals were anesthetized with avert in and bone mineral density using Piximus instrument and software version 1.4 (GE. Lunar, Madison, WI). (bone mineral density, BMD) was measured.
  • mice lacking PDK2 BMD of the lumbar spine and femur was maintained at the same level as compared to the normal group even after ovarian resection (Fig. 4, B, C). Based on the above results, it can be seen that by suppressing the expression of PDK2, it is possible to prevent or treat female menopausal diseases such as weight gain and osteoporosis.
  • mice were dissected to separate the left femur, fixed with 43 ⁇ 4 formalin for 24 hours, and then fixed with 80% ethanol for microCT analysis.
  • histomorphometric analysis was performed using a Micro-CT system (eXplore Locus SP scanner.GE Healthcare). All morphometric parameters were measured using eXplore MicroView, version 2.2 (GE Healthcare).
  • mice with normal expression of PDK2 trabecula was significantly reduced in the ovarian resection group compared with the normal group, whereas in mice with PDK2 deficiency, ovarian resection was performed. It was confirmed that one mouse group and the normal group maintain the same level of trabecula (FIG. 5). On the basis of this, PDK2 can be suppressed to prevent or treat osteoporosis, one of the female menopausal diseases.
  • OC osteocalcin
  • CX Oterminal telo P ept ide
  • TUNEL staining was performed according to the manufacturer's instructions in a commercially available kit (Roche 11 684 795 910). What appeared to be green spheres under a fluorescence microscope was determined as positive reaction.
  • PDK2 is closely related to female menopausal disease, and suppressing the expression or activity of PDK2 may alleviate female menopausal disease, and screens for substances that inhibit the expression or activity of PDK2.
  • the present invention has high industrial applicability in that a prophylactic or therapeutic agent for disease can be searched and a composition containing a PDK2 inhibitor as an active ingredient can be used as a prophylactic or therapeutic agent for female menopausal diseases.

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Abstract

본 발명은 PDK2의 발현 또는 활성을 억제하여 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있는 물질의 스크리닝 방법 및 PDK2 저해제를 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환 예방또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
PDK2를 이용한 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법 및 상기 방법으로 스크리닝 된 치료제를 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
【가술분야】
본 발명은 PDK2를 이용한 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방 법 및 상기 방법으로 스크리닝 된 치료제를 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질 환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
【배경기술】
과학과 문명의 발달로 점차 인간의 평균 수명이 연장되어 노년층 인구의 증 가와 함께 중년이후의 삶이 길어지고 있고 실질적으로 현대 여성의 삶 중에서 1/3 을 폐경전후로 오는 갱년기로 보내게 되므로 이 시기의 삶의 질을 향상시키기 위한 노력들이 이루어지고 있다. 갱년기는 난소기능의 전반적이고 점진적인 감소가 일어나 생리적 기능 및 성 기능이 감소 내지 소실되는 과도기를 말하며， 갱년기의 한 과정으로 난소기능이 정 지된 후에 일어나는 생리의 영구적인 정지인 폐경 (menopause)이 오게 된다. 폐경이 오게 되면 에스트로겐 생성의 감소， 난포자극호르몬 (fol l iclular st imulat ing hormone, FSH) 및 황체호르몬 ( luteininzing hormone, LH)의 상승 등 호르몬의 변화 에 따른 여러 질환이 발생하게 된다. 상기 호르몬 변화에 따른 질환을 갱년기 질환 (cl imacteric disorder) , 폐경 기 질환 (postmenopausal syndrome) 또는 폐경기 증후군이라고도 불리며， 40대 내지 50대 여성에서 주로 나타난다. 즉, 갱년기 질환은 난소의 노화로 인한 에스트로겐 ( 여성호르몬)의 분비 감소에 기인하며 폐경을 전후로 약 2년 내지 10년에 걸쳐 나타 난다. 갱년기는 내분비 증후군의 일종으로 분리되며 난소기능의 전반적이고 점진적 인 감소가 일어나 생리적 기능 및 성기능이 감소 내지 소실되는 과도기를 말하며， 갱년기질환의 경우 주로 다섯가지 증상이 나타난다: i ) 혈관성 변화에 의한 증상， i i ) 근골격계 변화에 의한 증상, Π Ο 비뇨생식기 변화에 의한 증상， iv) 뇌신경계 변화에 의한 증상 및 V) 일반적 변화에 의한 증상으로 나누어진다. 상기 혈관성 변 화에 의한 증상은 주로 안면흥조， 빈맥， 발한 또는 두통 등이 있으며， 상기 근골격 계 변화에 의한 증상은 근육통， 관절통 또는 요통 등이 있고， 상기 비뇨생식기 변 화에 의한 증상은 빈뇨 또는 요실금 등아 있으며， 상기 뇌신경계 변화에 의한 증상 은 기억력 감퇴, 우을증， 집중력 감퇴 및 현기증 등이 있으며, 상기 일반적 변화에 의한 증상은 시력감퇴 또는 는 피부 및 모발의 변화 등이 있다. 상기 증상들은 정도의 차이가 있으나 폐경 전후 여성의 약 80%가 경험하고 있다고 보고되고 있다. 무엇보다도 주목할 만한 사실은 상기 갱년기 질환은 여성의 생명 및 건강에 영향을 미치는 중요한 변화가 장기간 걸쳐 진행됨으로써 여성의 건 강에 치명적인 질환 즉, 골다공증이나 심혈관계질환 등의 발생 위험성이 증가된다 는 것이다. 따라서, 중년 여성들의 신체적， 정신적 건강 증진 및 삶의 질의 개선을 위하 여 상기 갱년기 질환의 치료제의 개발이 요구되고 있다. 종래 이러한 갱년기 장애 치료를 위하여， 호르몬 대체요법， 비스테로이드계 제제 등의 약물치료법이 개발되었고， 지금까지 가장 효과적으로 알려진 방법은 호 르몬 대체요법이다. 그러나, 끊임없이 제기되는 암 발생에 관한 논쟁， 두통， 체중 증가 등의 부작용과 월경 재개 등의 부작용으로 인하여 호르몬 대체요법에 대한 거 부감이 증대되면서 이를 대체할 수 있는 치료법의 개발이 요구되고 있다. 한편, PM Pyruvate dehydrogenase kinase)는 ATP를 이용하여 피루빈산 탈수 소효소를 인산화 시킴으로써 그 기능을 불활성화 시키는 효소이며， 진핵생물의 미 토콘드리아에 분포되어 있다. 인간의 PDK 패밀리는 PDKl, PKD2, PDK3 및 PDK4 네 종류의 동종효로로 구성되어 있으며 , 이들은 종양， 게 2형 당뇨병， 지방간 등의 치 료에 있어서 중요한 타켓이 될 수 있음이 밝혀진 바 있다. 그러나， 아직까지 PDK2 가 갱년기 여성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있음에 대하여는 당업계에서 알려 진 바가 없다. 【발명의 상세한 설명】
【기술적 과제】
본 발명의 발명자들은 PDK2가 과별현되어 있는 조골세포에서 그렇지 않은 세 포에 비해 조골세포의 분화가 저하되어 있으며， 난소절제술에 의한 갱년기 동물모 델에서 PDK2가 결손되었을 때 골 손실이 방어가 되어 갱년기 여성 질환 중 하나인 골다공증의 예방 또는 치료가 가능함을 발견하였다. 이에， PDK2의 발현 또는 활성 을 감소시키는 물질이 갱년기 여성 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음에 착안하여 본 발명을 완성하였다. 따라서 본 발명의 목적은 PDK2의 발현 또는 활성을 억제하는 여성 갱년기 질 환의 예방또는 치료제를 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 PKD2를 발현하는 세포 또는 PDK2 발현이 증가된 세포 를 이용하여 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료제를 스크리닝 하는 방법을쎄공하 는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 여성 갱년기 질환은 골다공증， 고열， 다한증, 우을증， 불면증, 요실금， 부종， 안면흥조， 기억력 감퇴, 두통, 신경과민증， 현기 증, 심계항진, 빈맥， 메스꺼움, 관절통， 근육통, 수족넁증 및 체중 증가로 이루어 진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 PDK2 저해제를 유효성분으로 포함하는 조골세포 (osteoblast ) 분화 촉진용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목작은 PDK2의 발현 또는 활성을 억제하여 조골세포의 분화 를 촉진하는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 PDK2 저해제를 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 PDK2 저해제는 PDK2에 대한 siRNA 또는 ant i sense RNA인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 PDK2는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 상기 여성 갱년기 질환은 골다공증， 고열， 다한증, 우울증， 불면증, 요실금， 부종, 안면홍조, 기억력 감퇴， 두통， 신경과민증, 현기 증， 심계항진， 빈맥， 메스꺼움， 관절통， 근육통， 수족넁증 및 체중 증가로 이루어 진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공하는 것이다.
【기술적 해결방법】
상기의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질을 접촉시키지 않은 대조군과 비교하여 PDK2 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 (a)단계의 세포는 PDK2를 발현하는 세포 또는 PDK2 발현이 증가된 세포인 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다. ' 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 여성 갱년기 질환은 골다공증， 고열， 다한증, 우을증, 불면증, 요실금， 부종, 안면홍조, 기억력 감퇴 두통， 신경과민증， 현기증, 심계항진， 빈맥, 메스꺼움, 관절통， 근육통, 수족넁증 및 체중 증가로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 PDK2 저해제를 유효성분으 로 포함하는 조골세포 (osteoblast ) 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 (a) 세포에 시험물질을 접촉시키는 단 계， (b) 시험물질을 접촉시키지 않은 대조군과 비교하여 PDK2 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 시험물질을 선별하는 단계 및 (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 시 험물질을 조골세포와 접촉시켜 분화가 촉진되는 시험물질을 선별하는 단계를 포함 하는조골세포 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 PDK2 저해제를 유효성분으 로 포함하는 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 PDK2 저해제는 PDK2에 대한 siRNA또는 ant i sense RNA인 것을 특징으로 하는조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 PDK2는 서열번호 1로 표시되는 아미노산서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 여성 갱년기 질환은 골다공증， 고열, 다한증， 우울증， 불면증, 요실금， 부종， 안면흥조, 기억력 감퇴， 두통, 신경과민증， 현기증， 심계항진， 빈맥， 메스꺼움， 관절통, 근육통, 수족넁증 및 체중 증가로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물을 제공한다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명에서는 PDK2와 여성 갱년기 질환과의 연관성을 확인하기 위해 마우스 조골세포주인 MC3T3E1에 PDK2를 레트로바이러스로 감염시켜 조골세포의 분화정도를 관찰하였다. 그 결과 PDK2가 과발현된 조골세포에서 그렇지 않은 세포에 비해 세포 의 분화가 저하되어 있음을 확인하였다 (실시예 1 참조) . 또한 본 발명에서는 PDK2가 결손되어 있는 마우스의 골수줄기세포 (bone marrow stromal cel l )를 일차배양 (pr imary culture)하여 그 분화정도를 관찰하였 다. 그 결과 PDK2가 결손되어 있는 마우스에서 일차배양 (primary culture)한 골수 줄기세포가 PDK2가 정상적으로 발현되고 있는 마우스에서 일차배양한 골수줄기세포 에 비해 세포의 분화가 증가되어 있고， 조골세포의 전구체 (progeni tor) 또한 증가 되어 있음을 확인하였다 (실시예 2 및 3 참조) . 또한 본 발명에서는 PDK2가 결손되어 있는 마우스와 PDK2가 정상적으로 발현 되고 있는 마우스에 난소절제술을 시행하여 갱년기 동물모델을 확립한 후, 체증 증 가, 골밀도 등을 관찰하였다. 그 결과 PDK2가 결손되어 있는 갱년기 동물 모델이 PDK2가 정상적으로 발현하고 있는 갱년기 동물 모델에 비해 체중 증가가 억제되어 있었으며, 골 손실도 적은 것을 확인하였다 (실시예 4 내지 7 참조) . 상기한 실시예의 결과를 토대로 PDK2가 갱년기 여성 질환과 밀접한 연관성이 있다는 것을 알 수 있었고， 결국 PDK2를 저해하는 물질이 갱년기 여성 질환의 예방 또는 치료에 효과가 있을 것임에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명은 (a) 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계 및 (b) 시험물질 을 접촉시키지 않은 대조군과 비교하여 PDK2 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키 는 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료제의 스 크리닝 방법을 제공한다. 상기 세포는 PDK2를 발현하는 세포 또는 PDK2의 발현이 증가된 세포이며， 이 는 본래 PDK2를 코딩하는 유전자를 포함하는 세포이거나 의도적으로 PDK2를 코딩하 는 유전자를 도입한 세포일 수 있다. PDK2를 코딩하는 유전자를 세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대， PDK2 단백질을 코딩하는 폴리튜클레오티드를 포함하는 발현백터로 세포를 형질감염시키거나， PDK2 를 retrovirus로 감염시킬 수 있다. 바람직한 하나의 구현예에 따르면， 상기 세포는 조골세포일 수 있으며, 바람 직하게는 마우스 조골세포주인 MC3T3E1 세포일 수 있다. 또한， 상기 세포는 인간 또는 소, 염소， 돼지ᅳ 생쥐 , 토끼， 햄스터， 기니 피그 등의 동물 기원의 모든 세포를 포함하며, 일차세포, 이차세포, 불멸화돤 세 포， 동물로부터 일차배양 (primary culture)된 세포 등을 이용할 수 있다. 상기 시험물질은 PDK2 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는지 여부를 검사 하기 위하여 스크리닝에 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학 물질， PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 을리고뉴클레오티드, siRNA( short interfering RNA) , shRNA( short hairpin RNA) , RNAi 및 천연물 추출물 로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이거나, PDK2 단백질에 상보적으로 결 합하는 화합물， 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어 느 하나를 이용할 수 있지만， 이에 제한되지는 않는다. 상기 시험물질을 세포에 접촉시킨 이후， 시험물질을 접촉시키지 않은 대조군 과 비교하여 시험물질이 접촉된 세포에서 PDK2 단백질의 발현량 또는 PDK2 단백질 의 활성이 감소되는 것으로 측정되면 상기 시험물질은 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료제로 판정될 수 있다. 상기에서 PDK2의 발현 또는 활성을 확인하는 방법은 당 분야에서 단백질의 발현 확인을 위해 사용되는 일반적인 기술들을 이용할 수 있다. 예를 들어， PDK2에 대한 항체를 이용한 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA) , 방사선 면역측정법 (radioimmunoassay) , 샌드위치 측정법 (sandwi ch assay) , 폴리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯， 면역침전 분석， 보체 고정분석， 유세포 분석법 (FACS) , 단백질 칩 및 이들의 조합이 이용될 수 있으나， 이에 제한되지는 않는다. 선택적으로는， 상기 (a) , (b) 단계를 거쳐 선별된 시험물질을 개체에 투여하 여 골밀도 감소가 저해되는 시험물질을 선별하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있 다. 이 경우， 상기 개체는 랫드 또는 마우스일 수 있으며， 당업계에서 공지된 방법 에 따라 난소절제술이 수행되어 여성 갱년기 질환이 유도돤 동물 모델일 수 있다. 개체에 상기 시험물질을 투여하는 방법은 경구투여， 경피투여, 정맥투여 또는 복강 투여 등이 이용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 상기 (a) 단계의 세포가 PDK2를 발현하는 세포 또는 PDK2의 발현이 증가된 세포인 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. 이는 본래 PDK2를 코딩하는 유전자를 포함하는 세포이거나 의도적으로 PDK2 를 코딩하는 유전자를 도입한 세포일 수 있다. PDK2를 코딩하는 유전자를 세포에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대， PDK2 단백질을 코딩하는 폴리튜클레오티드를 포함하는 발현백터로 세포를 형질감염시키 거나, PDK2를 retrovirus로 감염시킬 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 여성 갱년기 질환은， 이에 제한되는 것은 아니지만 골다공 증， 고열， 다한증, 우울증， 불면증， 요실금， 부종, 안면흥조， 기억력 감퇴， 두통， 신경과민증， 현기증, 심계항진， 빈맥, 메스꺼움, 관절통， 근육통， 수족넁증 및 체 증 증가로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이나， 바람직하게는 골다공증인 것을 특징으로 한다. 상기 여성 갱년기 질환이란, 난소의 노화 또는 기능상실로 인한 에스트로겐 ( 여성호르몬)의 분비 감소에 따라 나타나는 하기와 같은 증상， 또는 이로부터 유발 되는 질환을 의미한다: i ) 혈관성 변화에 의한 증상， i i ) 근골격계 변화에 의한 증 상， i i i ) 비뇨생식기 변화에 의한 증상， iv) 뇌신경계 변화에 의한 증상 및 V) 일 반적 변화에 의한 증상. 상기 혈관성 변화에 의한 증상은 주로 안면 흥조, 고열， 빈맥， 다한증， 수족 냉증 또는 두통 등이 있으며， 상기 근골격계 변화에 의한 증상은 근육통， 관절통 또는 요통 등이 있고， 상기 비뇨생식기 변화에 의한 증상은 빈뇨 또는 요실금 등이 있으며， 상기 뇌신경계 변화에 의한 증상은 기억력 감퇴, 우울증， 집중력 감퇴， 불 면증, 신경과민증， 메스꺼움 및 현기증 등이 있으며, 상기 일반적 변화에 의한 증 상은 시력감퇴, 체중 증가， 피부 및 모발의 변화 등을 들 수 있으나, 이에 제한되 는 것은 아니다. 상기 골다공증은 폐경 후 여성 호르몬 감소에 의해 촉발되는 갱년기성 골다 공증, 나이가 둁에 따라 발생하는 원발성 골다공증 또는 난소적출술에 따른 골다공 증 등을 들 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명은 또한 PDK2 저해제를 유효성분으로 포함하는 조골세포 (osteoblast ) 분화 촉진용 조성물을 제공한다. 상기 PDK2 저해제는 화학물질， PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 을리고뉴클레오티드, siRNA(short interfering RNA) , shRNA( short hairpin RNA) , RNAi 및 천연물 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이거나, PDK2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 이용할 수 있지만， 이에 제한되지는 않는다. 상기 조성물은 조골세포 분화 촉진용 건강기능성 식품 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있으나， 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물이 건강기능성 식품 조성물일 경우, 기능성 식품 (funct ional food) , 영양 보조제 (nutrit ional supplement ) , 건강식품 (health food) 및 식품 첨 가제 (food addit ives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면， 건강식품으로는 본 발명의 PDK2 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음 용하도록 하거나， 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한， 본 발명의 PDK2와 조골세포 분화 촉진 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 흔합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 조성물은 골 손실로 안한 질환의 예방 및 개선에 효과가 있으며， 상기 골 손실로 인한 질환으로는 골다공증, 류마티스 괄절염， 치주염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느하나인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 또 한, 본 발명의 조성물은 부갑상선항진증, 쿠성병, 만성신장질환， 골수종 또는 항간 질제 약물 복용 등 다른 질병으로 인한 골 손실에도 유효하게 작용할 수 있으며， 당업자에 알려진 골 손실로 인한 질환은 모두 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 ) 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계， (b) 시험물질을 접 촉시키지 않은 대조군과 비교하여 PDK2 단백질의 발현 또는 활성을 감소시키는 시 험물질을 선별하는 단계 및 (c) 상기 (b) 단계에서 선별된 시험물질을 조골세포와 접촉시켜 분화가 촉진되는 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 조골세포 분화 촉 진용 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. 상기 (a) 단계의 세포는 PDK2를 발현하는 세포 또는 PDK2의 발현이 증가된 세포이며, 이는 본래 PDK2를 코딩하는 유전자를 포함하는 세포이거나 의도적으로 PDK2를 코딩하는 유전자를 도입한 세포일 수 있다. PDK2를 코딩하는 유전자를 세포 에 도입하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있다. 예컨대， PDK2 단백질을 코딩하는 폴리튜클레오티드를 포함하는 발현백터로 세포를 형질감염 시키거나, PDK2를 retrovirus로 감염시킬 수 있다. 바람직한 하나의 구현예에 따르면, 상기 세포는 조골세포일 수 있으며, 바람 직하게는 마우스 조골세포주인 MC3T3E1 세포일 수 있다. 또한, 상기 세포는 인간 또는 소, 염소 돼지, 생쥐, 토끼， 햄스터, 기니 피그 등의 동물 기원의 모든 세포를 포함하며， 일차세포， 이차세포, 불멸화된 세 포， 동물로부터 일차배양 (primary culture)된 세포 등을 이용할 수 있다. 상기 시험물질은 조골세포의 분화를 촉진하는지 여부를 검사하기 위하여 스 크리닝에 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시험물질은 화학물질， PDK2 유전 자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드， siRNA(short interfering RNA) , shRNA( short hairpin RNA) , RNAi 및 천연물 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이거나， PDK2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합 물， 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 이 용할 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다. 상기에서 (b) 단계에서 PDK2의 발현 또는 활성을 확인하는 방법은 당 분야에 서 단백질의 발현 확인을 위해 사용되는 일반적인 기술들을 이용할 수 있다. 예를 들어， PDK2에 대한 항체를 이용한 효소결합 면역흡착 분석법 (ELISA) , 방사선 면역 측정법 (radioimmunoassay) , 샌드위치 측정법 (sandwich assay) , 플리아크릴아미드 겔 상의 웨스턴 블롯， 면역침전 분석, 보체 고정분석， 유세포 분석법 (FACS) , 단백 질 칩 및 이들의 조합이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 이후 상기 시험물질을 조골세포에 접촉시킨 이후， 시험물질을 접촉시키지 않 은 대조군과 비교하여 시험물질이 접촉된 세포에서 조골세포의 분화가 촉진되는 것 으로 확인되면 상기 시험물질은 조골세포 분화 촉진용 물질로 판정될 수 있다. 상기 조골세포의 분화촉진을 확인하는 방법은 당 분야에서 조골세포의 분화 를 확인하기 위해 사용되는 일반적인 기술들을 이용할 수 있다. 예를 들면， ALP 염 색법, vonKossa 염색법 또는 골 형성 유전자의 발현 측정 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명은 또한 PDK2 저해제를 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환 예 방또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 PDK2 저해제는 화학물질， PDK2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드， siRNA(short interfering RNA) , shRNA( short hairpin RNA) , RNAi 및 천연물 추출물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이거나, PDK2 단백질에 상보적으로 결합하는 화합물， 펩티드, 펩티드 미메틱스 및 항체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 이용할 수 있지만， 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 조성물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담 체, 부형제 또는 회석제를 추가로 함유할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여 용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스， 전분， 셀를로스 유 도체, 마그네슴 스테아레이트， 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투 여용 담체는 물， 적합한 오일， 식염수， 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황 산수소나트륨， 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다, 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드， 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로 부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수' 있다 (Remington ' s Pharmaceut ical Sciences , 19th ed. , Mack Publ ishing Company, East on, PA, 1995) . f 발명의 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 인간을 비 롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면， 경구 또는 비경구 적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나， 정맥 내， 근육내， 동맥내, 골수내， 경막내, 심장내, 경피, 피하， 복강내， 비강내， 장관, 국소， 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 본 발명 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를
30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법， 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다. 경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말， 과립， 정제， 환제, 당 의정제, 캡슐제, 액제， 겔제， 시럽제, 슬러리제， 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어， 경구용 제제는 활성성분을 고체 부 형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한후 과립 흔합물로 가공 함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈， 덱스트로즈， 수크로즈， 솔비를，만니를， 자일리를， 에리스리를 및 말티를 등을 포함 하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류， 셀를로즈, 메틸 셀를로즈, 나트륨 카르복시메틸셀를로오즈 및 하이드록시프로필메 틸-셀를로즈 등을 포함하는 셀를로즈류， 젤라틴， 폴리비닐피를리돈 등과 같은 층전 제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피를리돈, 한천, 알긴 산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가， 본 발명의 약 학적 조성물은 항웅집제, 윤활제， 습윤제 , 향료， 유화제 및 방부제 등을 추가로 포 함할 수 있다. 비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제， 크림제, 로션제， 외용연고 제, 오일제， 보습제， 겔제， 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방 법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방 서인 ¾·¾ (Remington ' s Pharmaceut ical Science , 15th Edit ion, 1975. Mack Publ ishing Company, East on, Pennsylvania 18042 , Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다. 본 발명의 PDK2 저해제를 포함하는 약학적 조성물 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며， 다중 투여량 (mult iple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fract ionated treatment protocol )에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리 할 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 kg 당 약 O.Olug 내지 1,000 mg, 가장 바람직하게는 0.1 ug 내지 100 mg일 수 있다. 그러나 상기 본 발명의 약학적 조성물의 용량은 약학적 조성물의 투 여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중， 건강 상태, 성별ᅤ 질환의 중 증도， 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결 정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 본 발명의 약학적 조성물을 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정 한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약 학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특 별히 제한되지 아니한다, 본 발명은 또한 상기 PDK2 저해제는 PDK2에 대한 siRNA 또는 ant i sense RNA 인 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환 예방또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 ant i sense RNA는 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고， mRNA 내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 본 발명의 안티센스 서열은 PDK2 mRNA에 상보적이고 PDK2 mRNA에 결합할 수 있는 RNA 서열을 의미하며， PDK2 mRNA의 번역， 세포질내로의 전위 (translocat ion) , 성숙 (maturat ion) 또는 다른 모든 전체 적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. ant i sense RNA의 길이는 6 내지 100 염기， 바람직하게는 8 내지 60 염기, 보 다 바람직하게는 10 내지 40 염기일 수 있다. 상기 ant i sense RNA는 통상의 방법으 로 시험관 내에서 합성되어 생체 내로 투여하거나 생체 내에서 ant isense RNA가 합 성되도록 할 수 있다. 시험관 내에서 ant isense RNA를 합성하는 한가지 예는 RNA 증합효소 I를 이용하는 것이다. 생체 내에서 ant isense RNA가 합성되도록 하는 한 가지 예는 다중클로닝부위 (MCS)의 기원이 반대 방향에 있는 백터를 사용하여 ant isense RNA가 전사되도록 하는 것이다. 상기 ant isense RNA는 서열 내에 번역 증지 코돈이 존재하도록 하여 펩타이드 서열로 번역되지 않도록 하는 것이 바람직 하다. 본 발명에서 이용될 수 있는 ant isense RNA의 디자인은 PDK2 유전자의 염기 서열을 참조하여 당업계에 공지된 방법에 따라 쉽게 제작할수 있다. 상기 siRNA는 RNA 방해 또는 유전자사일런싱을 매개할 수 있는 핵산 분자를 의미한다 (국제공개 특허번호 00/44895, 01/36646 , 99/32619 , 01/29058 , 99/07409 및 00/44914 참조) . siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적 인 유전자 넉다운 (knock-down) 방법으로서 또는 유전자치료 방법으로 제공된다. 이 와 같은 PDK2 대한 siRNA는 공지의 데이터베이스의 유전자 서열로부터 당업자가 공 지의 방법에 의해 쉽게 제조할수 있다.
본 발명은 또한 상기 여성 갱년기 질환은 골다공증， 고열, 다한증， 우울증， 블면증， 요실금， 부종, 안면흥조, 기억력 감퇴, 두통, 신경과민증, 현기증， 심계항 진， 빈맥, 메스꺼움, 관절통, 근육통， 수족넁증 및 체중 증가로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료용 조성 물을 제공한다. 본 발명은 또한 상기 골다공증은 난소절제술에 의해 촉발되는 골다공증인 것 을 특징으로 하는 조성물을 제공한다.
【유리한 효과】
이상 살펴본 바와 같이， 본 발명은 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료제의 스 크리닝 방법， PDK2 저해제를 유효성분으로 포함하는 조골세포 분화 촉진용 조성물， 조골세포 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법， PDK2 저해제를 유효성분으로 포함하 는 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료제는 PDK2의 발현 또는 활성을 감소시킴으로써 골다공 증 등 여성 갱년기 질환이 예방또는 치료에 효과적일 수 있다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 PDK2가 과발현되어 있는 세포에서 조골세포의 분화가 저해되어 있음을 확인한 실험 결과이다 (A: PDK2의 발현여부를 웨스턴 블롯으로 확인， B : ALP staining, C: vonKossa staining, D : 골형성 유전자의 발현) . 도 2는 마우스의 골수줄기세포를 일차배양하여 PDK2 발현 여부에 따른 세포의 분화정도를 확인한 실험 결과이다 (WT: PDK2가 정상 발현되어 있는 야생형 마우스의 골수줄기세포， PDK2 K0: PDK2가 결손되어 있는 마우스의 골수줄기세포, A: ALP staining, B: vonKossa staining, C: 골형성 유전자의 발현) . 도 3은 마우스 골수줄기세포와 이의 전구체인 f ibroblast의 PDK2 발현 여부에 따른 세포의 분화정도를 ALP staining으로 확인한 실험 결과이다 (WT: PDK2가 정상 발현되어 있는 야생형 마우스의 세포， PDK2 K0: PDK2가 결손되어 있는 마우스의 세 포， con: 분화를 유도하지 않은 대조군， di ffer : 세포의 분화를 유도한 군, CFU-0: colony forming unit osteoblast , CFUᅳ F: colony forming unit f ibroblast ) . 도 4는 난소 제술이 시행된 마우스에서 PDK2의 발현여부에 따른 체증변화 및 골 손실 정도를 비교한 실험 결과이다 (WT': PDK2가 정상 발현되어 있는 야생형 마우 스， 2K0: PDK2가 결손되어 있는 마우스, sham: 난소절제술이 시행되자 않은 마우 스, 0VX: 난소절제술이 시행된 마우스， A: 체중변화， B: 요추 (척추)의 골 손실 비 교， C: 대퇴골의 골 손실 비교) . , 도 5는 난소절제술이 시행된 마우스에서 PDK2의 발현여부에 따른 트라베클라 의 손실을 micro CT를 이용해 비교한 실험 결과이다 (WT: PDK2가 정상 발현되어 있 는 야생형 마우스, 2K0: PDK2가 결손되어 있는 마우스, sham: 난소절제술이 시행되 지 않은 마우스， 0VX: 난소절제술이 시행된 마우스， BMD: bone mineral density) . 도 6은 난소절제술이 시행된 마우스에서 PDK2의 발현여부에 따른 골 형성 및 골 손실 정도를 비교한 실험 결과이다 (0C assay: osteocalcin assay, CTX assay: c— terminal telopept ide assay) . 도 7은 난소절제술에 의해 유도된 파골세포의 활성정도를 PDK2의 발현여부에 따라 비교한 실험 결과이다 (WT: PDK2가 정상 발현되아 있는 야생형 마우스， 2K0: PDK2가 결손되어 있는 마우스, sham: 난소절제술이 시행되지 않은 마우스， 0VX: 난 소절제술이 시행된 마우스) .
【발명의 실시를 위한 형태】
이하， 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단， 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실 시예에 한정되는 것은 아니다. <실시예 1>
PDK2 발현여부에 따른 조골세포의 분화정도 평가 <!-!> MC3T3E1 세포배양 및 분화유도
MC3T3E1 세포 (MC3T3E1 Subclone 4， ATCC, CRL-2593TM)를 1 FBS 및 항생제 가 추가된 a -MEM(Gibco , A1049001)에서 배양하였다. 조골세포의 분화를 위해 3 X
105 의 세포를 35腿의 세포배양 멀티 플레이트에 분주한 후 7일 ~ 35일간 10mM b- glycerol phosphate 및 50 /g/ml의 ascorbic acid를 첨가한 α -ΜΕΜ 배지에서 배양하 였다. 골형성 유전자는 7일， 14일， 21일 및 28일째에 각각 측정하였고, ALP stainin은 7일~10일째 사이에 시행하였으며， von Kossa staining은 30일 ~ 35일째 사이에 시행하였다. 배지는 매 3일마다 교환하였다. Retrovirus를 이용하여 MC3T3E1 세포에 PDK2를 감염시켰다. ALP 염색과 von Kossa 염색법은 당업계에서 공 지된 방법에 따라 시행하였다.
<1-2> RNA추출 및 RT-PCR (Real-time PCR)
RNeasy® Lipid Tissue Mini Kit (QIAGEN, 74804)를 이용하여 제조자의 지시 에 따라 세포에서 총 腿를 추출하였다. Quant iTect Reverse Transcript ion Kits (QIAGEN, Cat .205310)을 이용하여 제조자의 지시에 따라 5ug의 총 RNA를 사용 하여 cDNA를 합성하였고, SYBR® Green (Appl ied Biosystem, Rf .4367659) 시약을 이용하여 25~50ng의 cDNA로 Real-t ime-PCR을 수행하였다. 좀 더 자세하게는 25~50ng의 cDNA 및 2 pm 의 forward 및 reverse 프라이머를 5ιΛ SYBR® Green Master mix와 흔합하여 총 10/ ^의 Rx. vol .으로 하였다. Vi iA™ 7 Real-Time PCR System(Li fe Technologies) 시스템에서 95°C에서 2 분 동안 init ial denaturat ion 후 95°C에서 15초 동안 denaturat ion 및 60°C에서 1 분 동안 aneal ing 과정을 40 cycle 반복하였다. Cycle이 반복되는 동안 방출된 형광이 시스템에서 그려지는 DNA 증폭곡선을 이용하여 상대적인 mRAN양을 비교하였으며, 실험에 이용한 primer는 하 기 표 1에 제시하였다. 표 1. RT-PCR, real t ime PCR 에 사용된 primer
Figure imgf000019_0001
36b4 acc tec ttc ttc cag get tt etc cag tct tta tea get gc
Retrovirus를 이용하여 MC3T3E1 세포에 PDK2를 감염시킨 후 PDK2가 발현되는 것을 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다 (도 1ᅳ A). PDK2의 발현여부에 따른 조골세포의 분화정도를 바교하기 위해， 조골세포 분화유도 후 8일째에 ALP 염색을 수행하였고， 35일째에 von Kossa 염색을 수행하여 관찰한 결과， PDK2가 발현되어 있지 않은 세 포와 비교해 PDK2가 과발현되어 있는 세포에서 조골세포의 분화가 현저히 억제되어 있는 것을 확인하였다 (도 1， Β,Ο. 골 형성과 관련이 있는 유전자와 PDK2의 연관성 을 확인하기 위해 조골세포 분화 유도 후 7일， 14일， 21일 및 28일째에 RT-PCR을 수행한 결과, 시간이 경과할수록 ΒΜΡ2 (bone morphogenet i c protein 2)와 0C (osteocalcin)의 발현량이 PDK2가 과발현되어 있는 세포에서 억제되어 있는 것을 확인하였다 (도 1, D). 상기 결과를 토대로, PDK2가 조골세포의 분화를 억제하는 기 능을 갖고 있다는 것을 확인할수 있다.
<실시예 2>
PDK2 발현여부에 따른 일차배양한 마우스 골수줄기세포의 분화정도 평가
PDK2가 정상적으로 발현되어 있는 야생형의 C57BL6/J 암컷 마우스와 PDK2가 결손되어 있는 C57BL6/J 암컷 마우스의 적혈구를 제거한 후 70 의 나일론 mash (BD Falcon, 352350)으로 필터링하여 10% FBS가 첨가된 α-ΜΕΜ배지에서 3일간 배양 하였다. 배지의 절반을 7일 동안 3회 교체하였다. 골수줄기세포를 10% FBS, b-gp 8 mM 및 ascorbic acid 50 //g/m가 포함된 α -ΜΕΜ 배지에서 배양하면서 배지를 매 3 일마다 교환하였다. 3일째에 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정한 후 ALP 용액 (SIGMA, Νο · 86)을 이용해 ALP 염색을 시행하였다. 14일째에 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정한 후 5¾ si lver ni trate 용액으로 von Kossa 염색을 시행하였다. 골 형성과 관련된 유전자의 발현정도를 RT-PCR을 통해 확인하였다. 골수즐기세포의 분화를 확인할 수 있는 ALP 염색과 von Kossa 염색 결과 PDK2가 정상적으로 발현되어 있는 마우스의 골수줄기세포와 비교해 PDK2가 결손된 마우스의 골수줄기세포에서 세포의 분화가 현저히 증가되어 있음을 확인하였다 (도 2 Α,Β) . 골 형성과 관련된 유전자의 발현량을 RT-PCR을 통해 확인한 결과， 골수줄기 세포의 배양 시간이 경과할수록 PDK2가 결손된 마우스에서 골 형성 관련 유전자들 의 발현이 야생형과 비교해 현저히 증가되어 있음을 확인하였다 (도 2 , C) . 상기 결 과를 토대로， PDK2가 결손되면 동물의 골수줄기세포의 분화가 증가되어 여성 갱년 기 질환 증 하나인 골다공증의 증상이 완화될 수 있음을 알 수 있었다.
<실시예 3>
PDK2 발현여부에 따른 조골세포 전구체의 분화정도 비교
PDK2가 정상적으로 발현되어 있는 야생형의 C57BL6/J 암컷 마우스와 PDK2가 결손되어 있는 C57BL6/J 암컷 마우스의 적혈구를 제거한 후 의 나일론 mash (BD Falcon, 352350)으로 필터링하여 10% FBS가 첨가된 α— MEM배지에서 3일간 배양 하였다. 배지의 절반을 7일 동안 3회 교체하였다. 골수줄기세포를 10% FBS, b-gp 8 mM 및 ascorbic acid 50 g/m£가 포함된 α -ΜΕΜ 배지에서 배양하면서 배지를 매 3 일마다 교환하였다. 콜로니 형성 유닛 (colony format ion uni ts , CFUs)의 형성을 관 찰하기 위해， 세포 배양 3일째 및 7일째에 세포를 고정하고 ALP 염색을 하여 CFU- 조골세포 (CFU-0B)를 검출하였다. 콜로니의 크기가 직격 1mm 이상인 것만을 카운팅 하였다. 동일한 플레이트를 2% 에탄을에 용해된 0.2% 크리스탈 바이을렛용액으로 1 시간동안 염색하여 CFU-섬유아세포 (CFU-f ibrobl ast , CFU-F)를 검출하였다. 플레이 트를 세척한후 자연 건조하였다. 콜로니의 직경이 1醒 이상인 것만 카운팅하였다. 조골세포의 전구체라고 할 수 있는 섬유아세포의 분화정도를 평가한 결과, PDK2가 결손되어 있는 마우스에서 일차배양된 섬유아세포의 분화가 PDK2가 정상적 으로 발현되어 있는 야생형 마우스와 비교해 현저히 증가되어 있음을 확인하였다 ( 도 3) .
<실시예 4>
난소절제숨이 시행된 마우스에서 PDK2발현여부에 따른 체중변화 및 골흡수
PDK2가 정상적으로 발현되어 있는 야생형의 C57BL6/J 암컷 마우스와 PDK2가 결손되어 있는 C57BL6/J 암컷 마우스를 사육하며 당업계에서 통상적인 방법으로 난 소절제술을 시행하여 여성 갱년기 동물 모델을 유도하였다. 난소절제술을 시행한 후 5주간 동물을 사육하며 체증변화를 관찰하였고， 매주 1회 동물을 avert in으로 마취한 후 Piximus instrument 및 소프트웨어 버전 1.4 (GE. Lunar , Madison, WI ) 를 이용하여 골 미네랄 밀도 (bone mineral density, BMD)를 측정하였다.
( i ) PDK2가 정상적으로 발현되어 있는 야생형 마우스의 경우 난소절제술을 시행한 군에서 정상군과 비교해 체중이 증가하는 경향을 나타내어， 난소절제술로 유도된 여성 갱년기 질환 증 하나인 체중 증가현상을 확인하였다. 이에 반해, PDK2 가 결손된 마우스의 경우, 난소절제술을 시행한 후에도 정상군과 체중이 동일하게 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4, A) , ( i i ) PDK2가 정상적으로 발현되어 있는 야생형 마우스의 경우 난소절제술을 시행한군에서 정상군과 비교해 요추와 대퇴골 의 BMD가 감소하는 경향을 나타내어， 난소절제술로 유도된 여성 갱년기 질환 중 하 나인 골다공증 현상을 확인하였다. 이에 반해， PDK2가 결손되어 있는 마우스의 경 우, 난소절제술을 시행한 후에도 정상군과 비교해 요추와 대퇴골의 BMD가 동일한 수준으로 유지되는 것을 확인할 수 있었다 (도 4， B,C) . 상기한 결과를 토대로， PDK2 의 발현을 억제하여 체중 증가， 골다공증 등 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료가 가능함을 알 수 있다.
<실시예 5>
난소절제술이 시행된 마우스에서 PDK2 발현여부에 따른 트라베큼라 손심 경 향 평가 마우스를 해부하여 왼쪽 대퇴골을 분리하고 4¾ 포르말린으로 24시간 고정한 후 80% 에탄올로 고정액을 교환하여 MicroCT 분석을 하였다. 동물 뼈의 삼차원적 구조를 분석하기 위해 Micro-CT 시스템 (eXplore Locus SP scanner . GE Healthcare)을 이용해 조직형태계측 분석 (histomorphometric analysis)을 수행하 였다. 모든 형태계측 파라미터들은 eXplore MicroView, 버전 2.2(GE Healthcare)를 이용해 측정하였다.
PDK2가 정상적으로 발현되어 있는 야생형 마우스의 경우， 난소절제술을 시행 한 마우스군에서 정상군과 비교해 트라베클라가 현격하게 감소되어 있는 것을 볼 수 았는 반면, PDK2가 결손되어 있는 마우스의 경우 난소절제술을 시행한 마우스군 과 정상군이 동등한 정도의 트라베클라 수준을 유지하고 있음을 확인할 수 있었다 ( 도 5) . 이를 토대로, PDK2를 억제하여 여성 갱년기 질환 중 하나인 골다공증의 예방 또는 치료가 가능함을 알 수 있었다.
<실시예 6>
난소점제숨이 시행된 마우스에서 PDK2 발현여부에 따른 골 형성 및 골 흡수 지표의 평가 골 형성의 지표인 osteocalcin(OC)과 골 흡수의 지표인 Oterminal teloPept ide(CTX)의 측정을 통해 PDK2 발현여부에 따른 골 형성 및 골 흡수의 정도 를 평가하였다. 난소절제술이 시행된 마우스에서 골 형성의 지표인 0C의 혈증 함량을 측정한 결과， PDK2가 정상작으로 발현되어 있는 야생형 마우스군에 비해 PDK2가 결손되어 있는 마우스군에서 0C의 혈중함량이 더 많이 증가되어 있는 것을 확인하였다 (도 6， A) , 또한， 골 흡수의 지표인 CTX의 혈중 함량을 측정한 결과, PDK2가 정상적으로 발현되어 있는 야생형 마우스군에 비해 PDK2가 결손되어 있는 마우스군에서 CTX의 혈중함량이 감소되어 있는 것을 확인하였다 (도 6， B) , 상기 결과는 PDK2의 발현이 억제되면， 골 형성은 증가되고 골 흡수는 감소된다는 것을 보여주는 것으로， PDK2 를 억제하면 여성 갱년기 질환 중 하나인 골다공증의 예방 또는 치료가 가능할 수 있음을 알수 있다. <실시예 7>
난소절제술이 시행된 마우스에서 PDK2발현여부에 따른파골세포의 활성정도 魁
TUNEL 염색을 통해 파골세포의 활성정도를 평가하였다. TUNEL 염색은 상업적 으로 구매할 수 있는 키트 (Roche 11 684 795 910)로 제조자의 지시에 따라 진행하 였다. 형광 현미경을 통해 녹색구로 보이는 것을 양성반웅으로 판정하였다.
PDK2가 정상적으로 발현되어 있는 야생형 마우스의 경우， 난소절제술을 시행 한 마우스군에서 정상군과 비교해 파골세포의 활성이 증가된 것을 볼 수 있으나， PDK2가 결손되어 있는 마우스의 경우， 난소절제술을 시행한 마우스군에서 정상군과 비교해 파골세포의 활성이 동등한 정도로 낮게 유지됨을 확인할 수 있었다 (도 7) . 상기 결과를 종합적으로 평가해 보았을 때, PDK2의 발현 또는 활성을 억제하면 여 성 갱년기 질환이 완화됨을 알수 있다.
[산업상 이용가능성 ]
이상 살펴본 바와 같이， PDK2가 여성 갱년기 질환과 밀접한 관련이 있으며, PDK2의 발현 또는 활성을 억제하면 여성 갱년기 질환이 완화될 수 있는 바， PDK2의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 물질을 스크리닝 함으로써 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료제를 탐색할 수 있으며， PDK2 저해제를 유효성분으로 포함하는 조성 물이 여성 갱년기 질환의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있다는 점에서 본 발명은 산업상 이용가능성이 높다.
【서열목록 프리텍스트】

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
하기 단계를 포함하는 여성 갱년기 질환 예방또는 치료제의 스크리닝 방법:
(a) 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 시험물질을 접촉시키지 않은 대조군과 비교하여 PDK2 단백질의 발현 또 는 활성을 감소시카는 시험물질을 선별하는 단계
【청구항 2】
제 1항에 있어서， 상기 (a) 단계의 세포는 PDK2를 발현하는 세포 또는 PDK2 발현이 증가된 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
[청구항 3】
제 1항또는 계 2항에 있어서， 상기 여성 갱년기 질환은 골다공증, 고열 다한 증， 우울증， 불면증, 요실금， 부종， 안면흥조， 기억력 감퇴, 두통， 신경과민증, 현 기증， 심계항진, 빈맥， 메스꺼움， 관절통, 근육통， 수족넁증 및 체중 증가로 이루 어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 4】 .
PDK2 저해제를 유효성분으로 포함하는 조골세포 (osteoblast ) 분화 촉진용 조 성물.
【청구항 5】
하기 단계를 포함하는조골세포 분화 촉진용 물질의 스크리닝 방법 :
(a) 세포에 시험물질을 접촉시키는 단계;
(b) 시험물질을 접촉시키지 않은 대조군과 비교하여 PDK2 단백질의 발현 또 는 활성을 감소시키는 시험물질을 선별하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 선별된 시험물질을조골세포와 접촉시켜 분화가 촉진 되는 시험물질을 선별하는 단계.
【청구항 6]
PDK2 저해제를 유효성분으로 포함하는 여성 갱년기 질환 예방 또는 치료용 조성물.
【청구항 7]
제 6항에 있어서, 상기 PDK2 저해제는 PDK2에 대한 siRNA또는 ant i sense RNA 인 것을 특징으로 하는조성물.
【청구항 8】
제 6항에 있어서, 상기 PDK2는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
[청구항 9】
제 6항 내지 계 8항 증 어느 한 항에 있어서, 상기 여성 갱년기 질환은 골다공 증， 고열, 다한증, 우을증， 불면증， 요실금, 부종, 안면흥조, 기억력 감퇴, 두통， 신경과민증， 현기증， 심계항진， 빈맥, 메스꺼움, 관절통, 근육통, 수족넁증 및 체 중 증가로 이루어진 군에서 선택된 하나이상인 것을 특징으로 하는조성물.
【청구항 10】 .
제 9항에 있어서, 상기 골다공증은 난소절제술에 의해 촉발되는 골다공증인 것을 특징으로 하는 조성물.
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