WO2016106462A1

WO2016106462A1 - Generación de cuerpos celulares a través de deprivación de nutrientes y su uso para generar inmunidad antitumoral

Info

Publication number: WO2016106462A1
Application number: PCT/CL2015/050057
Authority: WO
Inventors: Claudio ACUÑA; Ximena LOPEZ; Marcelo CORTEZ; Javier MENA; Monica IMARAI
Original assignee: Universidad De Santiago De Chile
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2015-12-28
Publication date: 2016-07-07
Also published as: CL2014003615A1; BR112017014339A2

Abstract

Este invento se refiere a la obtención de cuerpos celulares derivados de líneas celulares. La técnica se basa en mantener las células en cultivo con supresión de medio. Esto se refiere a mantenerlas, durante un lapso de una semana, en un sobrenadante formado por PBS más antibióticos y antimicótico, en incubación a 37°C con 5% de CO ₂. Uso de los cuerpos celulares obtenidos para generar inmunidad antitumoral.

Description

Generación de cuerpos celulares a través de deprivación de nutrientes y su uso para generar inmunidad antitumoral

Campo del Invento

Este invento se refiere a la obtención de cuerpos celulares derivados de líneas celulares y su modificación para que sean más inmunogénicos. La técnica se basa en mantener las células en cultivo con supresión de medio. Esto se refiere a mantenerlas, durante un lapso de una semana, en un sobrenadante formado por PBS más antibióticos y antimicótico, en incubación a 37^<C con 5% de CO ₂- Esta acción lleva a la muerte de las células por un proceso que atribuimos a apoptosis o a autofagia. Una vez obtenidos estos restos celulares pueden ser centrifugados y mantenidos en el tiempo de forma estable. Por otro lado pueden ser modificados para aumentar la inmunogenicidad de estos cuerpos.

Antecedentes del invento

Este proceso lleva a la muerte de las células atribuible a apoptosis o a autofagia.

Existen variados métodos descritos para inducir apoptosis o autofagia en células, sin embargo, estos métodos son distintos al utilizado en este invento: a) Para el caso de la inducción de muerte celular a través de apoptosis, se ha descrito el uso de agentes químicos, por ejemplo, el butirato de sodio (Jun Qiu, et al (201 1 ). Growth of human prostate cáncer cells is significantly suppressed in vitro with sodium butyrate through apoptosis. Oncology Reports 27: 160-167), el alcaloide inhibidor de proteínas quinasas estaulosporina (Massimo Di Nicola, et al (2003) Dendritic cell viability is decreased after phagocytosis of apoptotic tumor cells induced by staurosporine or vaccinia virus infection. Haematologica 88(12):1396-1404), el glucocorticoide antiinflamatorio dexametasona (Abhay J. Bhatt, et al (2013). Dexamethasone Induces Apoptosis of Progenitor Cells in the Subventricular Zone and Dentate Gyrus of Developing Rat Brain. Journal of Neuroscience Research 91 :1 191 - 1202) y 2-metoxiestradiol, el cual puede producir tanto apoptosis como autofagia en varias líneas celulares cancerígenas (Anne E Theron, et al (2013) Molecular crosstalk between apoptosis and autophagy induced by a novel 2-methoxyestradiol analogue in cervical adenocarcinoma cells. Cáncer Cell International, 13:87) o agentes físicos como irradiación UVC de 10 a 15 J (Massimo Di Nicola, et al (2003) Dendritic cell viability is decreased after phagocytosis of apoptotic tumor cells induced by staurosporine or vaccinia virus infection. Haematologica 88(12):1396-1404).

Por otro lado, para inducir autofagia en células se pueden utilizar agentes como atorvastatina (Xinjian Peng (2013) Inhibition of Proliferation and Induction of Autophagy by Atorvastatin in PC3 Prostate Cáncer Cells Correlate with Downregulation of Bcl2 and Upregulation of miR-182 and p21 . PLoS One 8(8): e70442), resveratrol (Lake Li et al, (2013) Resveratrol modulates autophagy and NF-jB activity in a murine model for treating non-alcoholic fatty liver disease, in press) o rapamicina (Harada M et al (2008) Autophagy Activation by Rapamycin Eliminates Mouse Mallory-Denk Bodies and Blocks Their Proteasome Inhibitor-Mediated Formation. Hepatology, Vol. 47, No. 6). Sin embargo, lo más común es utilizar la deprivación de nutrientes. Existen publicaciones que hablan de modalidades para inducir autofagia utilizando este principio, sin embargo, la metodología que estos investigadores utilizan es distinta a la nuestra, por ejemplo, Liu WM y colegas, inducen autofagia de células tumorales de glioblastoma utilizando un medio de cultivo pobre en nutrientes basado en DMEM libre de L-glutamina suplementado con BSA al

1 % y libre de suero fetal bovino (Wei Michael Liu (2013) Lyn Facilitates

Glioblastoma Cell Survival under conditions of Nutrient Deprivation by

Promoting Autophagy. PLoS ONE 8(8): e70804) y Garufi y sus colaboradores utilizan medio DMEM libre de glucosa para producir autofagia de células de cáncer de colon (A Garufi et al (2013) Glucose restriction induces cell death in parental but not in homeodomain-interacting protein kinase 2-depleted RKO colon cáncer cells: molecular mechanisms and implications for tumor therapy.

Cell Death and Disease 4, e639).

Descripción del invento

El motivo de generar cuerpos celulares derivados de líneas tumorales, es producir un tratamiento para el cáncer y/o utilizar este tipo de muerte para generar donores de antígenos para tratamientos inmunológicos, o dada su alta inmunogenicidad ser utilizados como coadjuvantes en tratamientos veterinarios.

Uso antitumoral

El propósito a nivel biológico es activar al sistema inmune para que desencadene una respuesta que ataque al tumor. Esto se basa en que los tumores contienen proteínas diferentes (o mutadas) con respecto a aquellas presentes en el tejido normal o sobreexpresan ciertos genes, estos son los antígenos asociados a tumores (AATs). Estos pueden ser procesados y presentados por células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas, quienes a continuación producen la activación de linfocitos T helper y T citotóxicos. Posteriormente, los linfocitos T activados pueden producir respuestas directas o indirectas para inducir la muerte de células tumorales. Por lo tanto, al utilizar esta técnica para generar cuerpos celulares a partir de células tumorales que contengan AATs e inyectar a un paciente oncogénico con dicha preparación, la inyección contiene AATs que pueden desencadenar una respuesta inmune que permite atacar a las células que componen el tumor del paciente. El utilizar cuerpos celulares en el tratamiento de pacientes oncogénicos es una técnica innovadora, ya que la mayoría de las inmunoterapias contra el cáncer se basan en el uso de anticuerpos contra AATs, mientras que otros grupos de investigadores utilizan la inyección directa de AATs con adyuvantes (S. Hong et al (2012) Optimizing dendritic cell vaccine for immunotherapy in múltiple myeloma: tumour lysates are more potent tumour antigens tan idiotype protein to promote anti-tumour immunity. Clinical and Experimental Immunology, 170: 167-177). Por otro lado, existen técnicas inmunoterapéuticas mucho más distantes a ésta aproximación mediante cuerpos celulares, por ejemplo, otros grupos utilizan células dendríticas cargadas con AATs (Mervat El Ansary (2013). Immunotherapy by autologous dendritic cell vaccine in patients with advanced HCC. J Cáncer Res Clin Oncol 139:39-48). Tal es el caso de la empresa Oncobiomed, en conjunto con la Universidad de Chile en una investigación liderada por el Dr. Flavio Salazar, quienes desarrollaron una terapia para melanoma a base de células dendríticas, las cuales son cocultivadas con lisados de tres líneas celulares de melanoma. De esta manera, son educadas en el laboratorio y posteriormente reimplantadas a los pacientes, induciendo la generación de una respuesta inmune en contra del tumor. El Dr. Salazar ha reportado que su tratamiento induce una respuesta inmune antitumoral en más de un 60% de los pacientes, logrando resultados prometedores y estableciendo las terapias inmunes como buenas herramientas para combatir el cáncer (López M et al (2009) Prolonged Survival of Dendritic Cell-Vaccinated Melanoma Patients Correlates With Tumor- Specific Delayed Type IV Hypersensitivity Response and Reduction of Tumor Growth Factor β-Expressing T Cells. J Clin Oncol 27:945-952; Aguilera R et al (201 1 ). Heat- Shock Induction of Tumor-Derived Danger Signáis Mediates Rapid Monocyte Differentiation into Clinically Effective Dendritic Cells. Clin Cáncer Res 17:2474- 2483). Descripción de las Figuras

Figura 1 : Protección antitumoral dada por las inmunizaciones con cuerpos celulares (AB, en gris) y cuerpos celulares más PMB y ATP (AB PMB ATP, en negro).

Figura 2. Análisis de los marcadores de superficie CD1 1 c, CD86, MHC de clase II y CCR7 en células dendríticas (DCs) de ratón C57BL/6 mediante citometría de flujo. En los histogramas representativos línea negra corresponde al control negativo (DCs no tratadas), mientras que la línea roja corresponde al tratamiento realizado en cada experimento: A) Control positivo, correspondiente a DCs estimuladas con LPS, donde se muestra un aumento esperable en los niveles de CD86 y MHC de clase II, a excepción de CD1 1 c y CCR7, los cuales no varían respecto al control negativo, B) DCs tratadas con cuerpos celulares (CC) en proporción 1 :1 y 2:1 , en donde se observa un comportamiento similar al presentado en el control positivo. Resultados representativos de 6 experimentos independientes.

Figura 3. Protección antitumoral dada por las inmunizaciones con cuerpos celulares modificados con DNCB en el modelo de cáncer de mama murino 4T1 . En la figura se puede observar que en el grupo de animales inmunizados con cuerpos celulares derivados de la línea celular 4T1 , modificados con DNCB (línea roja), se ve retrasado el crecimiento del tumor en comparación con el grupo control sin tratamiento (Linea negra).

Descripción detallada del Invento

En el laboratorio se desarrolló un procedimiento que permite obtener cuerpos celulares que tienen una alta capacidad para generar inmunidad antitumoral. El propósito de generar cuerpos celulares derivados de líneas tumorales, es producir un tratamiento para el cáncer.

En este sentido, se realizó un estudio preclínico en ratones en el modelo de melanoma maligno B16, para el cual se desarrolló un protocolo de inmunización a base de cuerpos celulares altamente inmunogénicos provenientes de células de dicho melanoma, los cuales se generaron a partir de la metodología descrita en el Ejemplo. Una vez generados los cuerpos celulares a partir de células B16, se llevó a cabo el protocolo de inmunización que consistió en una primera inmunización en ratones de la cepa C57BL/6 de 6 a 8 semanas, en el día denominado como 0. Esta inmunización consistió en una inyección subcutánea en la pata derecha con cuerpos celulares provenientes de 2x10⁴ células B16, cuerpos celulares provenientes de 2x10⁴ células B16 más PMB en una dosis de 20mg/Kg más ATP en una dosis de 50C^g/Kg o el vehículo (control) consistente en PBS estéril. El volumen total de inyección fue de 50μΙ_. Este protocolo de inmunización se repitió los días 7 y 14, posteriores a la primera inmunización (día 0). Al día 28 se realizó el desafío tumoral, el cual consistió en la inyección subcutánea de 10⁴ células B16 vivas en la pata izquierda de cada ratón, contenidas en un volumen final de 50μΙ_ de PBS estéril. Los ratones fueron observados diariamente, registrando su actividad, peso y aspecto de acuerdo a los parámetros de D.B.Morton y P.H.M. Griffiths. La aparición tumoral fue registrada y el tamaño tumoral fue monitoreado hasta un volumen de 0,5 cm³, momento en el cual los animales fueron sacrificados por dislocación cervical.

La inmunización con estos cuerpos celulares permite que alrededor del 20% de los animales no tenga aparición de tumores, una vez que éstos han sido inmunizados y posteriormente inyectados subcutáneamente con células B16 vivas, mientras que la totalidad de los animales no inmunizados tienen aparición tumoral entre el día 13 al día 25 post inyección de células tumorales. Además, los cuerpos celulares de melanoma retrasan la aparición de tumores, observándose que el 80% de los ratones inmunizados desarrollan tumores entre los días 18 y 30 aproximadamente. Esto, sumado al uso de dos compuestos adyuvantes (el antibiótico Polimixina B y el nucleotido ATP) que aumentan la capacidad terapéutica de los cuerpos celulares, constituye un tratamiento que protege a un 49% de los animales ante el desarrollo de un tumor, mientras que en los animales que sí desarrollan tumores, observamos que estos aparecieron entre los días 29 y 34 aproximadamente, retrasando la aparición tumoral (Figura 1 ).

Sumado a las evidencias anteriores, en el laboratorio evaluamos si los cuerpos celulares son capaces de producir la activación de células dendríticas (DCs), unas células del sistema inmune que son capaces de reconocer antígenos (ya sea provenientes de patógenos o en este caso de células tumorales) y desencadenar la activación subsecuente de linfocitos T helper y T citotóxicos, los cuales tienen una gran capacidad de inducir la muerte de células tumorales. Para evaluar esto, generamos células dendríticas a partir de precursores de médula ósea de ratones de la cepa C57BL/6 y las tratamos con cuerpos celulares provenientes de células HEK293, y luego de un día, determinamos que tienen el potencial de producir una activación de células dendríticas, ya que aumenta la expresión de los marcadores de activación de células CD86 y MHC de clase II (Figura 2). Además de lo mencionado anteriormente, existen evidencias de que la inmunización con células tumorales, autólogas (Berd D., et. al. (2001 ) Int. J. Cáncer) o heterólogas (Vilella R., et. al. (2003). Int. J. cáncer), modificadas con haptenos y posteriormente sometidas a irradiación, son capaces de aumentar la sobrevida de pacientes con melanoma y generar regresión de la metástasis pulmonar. En investigaciones de Berd et. Al. y Vilella et. Al. Utilizaron dinitrofluorbenceno

(DNFB) para generar vacunas contra el melanoma a partir de células tumorales. Por otra parte, se ha visto que el tratamiento tópico con dinitroclorobenceno (DNCB), es capaz de generar una regresión en el crecimiento de melanoma maligno cutáneo (von Nida J., Quirk C, (2003). Australasian Journal of Dermatology). Debido a esto es que propusimos probar en el modelo de cáncer de mama murino 4T1 , la modificación con DNCB de cuerpos celulares derivados de esta línea tumoral de manera de inducir una respuesta inmune contra éste cáncer.

Para corroborar esta idea, llevamos a cabo un modelo preclínico en ratonas de la cepa Balb/c. El grupo destinado a ser inmunizado con cuerpos celulares modificados con DNCB (CC-DNCB), fue previamente sensibilizado directamente en la piel del lomo del animal con DNCB al 2%. Dentro del proceso, al séptimo día post sensibilización los animales fueron desafiados con 2,5 x 10⁵ células 4T1 mOVA vivas en 100 μΙ_ de PBS. A partir del día 1 post desafío, los animales fueron revisados diariamente para detectar la aparición del tumor y medir el crecimiento de este. Los días 7, 14 y 21 post desafío, los ratones fueron inmunizados con 100 μΙ_ de suspensión de CC-DNCB derivados de 10⁵ células 4T1 mOVA, en PBS.

La aparición del tumor en ambos grupos (inmunizados y control sin tratar) fue alrededor del día 4 post desafío, sin embargo, en el grupo de animales inmunizados con CC-DNCB, se ve retrasado el crecimiento del tumor en comparación con el grupo control sin tratamiento (figura 3). EJEMPLO

Generación de cuerpos celulares derivados de líneas celulares adherentes de mamíferos

Todos los procedimientos asociados a la generación de cuerpos celulares derivados de líneas celulares adherentes de mamíferos se realizan en una campana de bioseguridad, con el fin de mantener la esterilidad. Las células de las que se desea producir cuerpos celulares se siembran de manera homogénea en una placa de cultivo. Por lo general se siembran en una placa con una superficie de 100mm² y se agregan 10mL del medio de cultivo apropiado, sin embargo, las superficies de las placas de cultivo y los volúmenes pueden modificarse dependiendo de los requerimientos experimentales. El medio se suplementa con penicilina 100unidades/mL, estreptomicina 10C^g/mL y suero fetal bovino a la concentración requerida por el tipo celular. A continuación, las células se almacenan en una incubadora de CO₂ a una temperatura constante de 37^<C y 5% de CO ₂. Como son adherentes, alrededor de 4 horas posteriores a la siembra (dependiendo del tipo celular), las células están adheridas a la placa de cultivo. Se observa diariamente el crecimiento celular, y cuando la placa llega a confluencia, es decir, cuando las células han proliferado tanto, que ocupan la totalidad de la superficie de la placa, se procede a generar los cuerpos celulares. Para generar los cuerpos celulares, se debe retirar el medio de cultivo de la placa y se debe lavar la misma dos veces con buffer fosfato salino PBS (NaCI 137mM, KCI 2,7mM, Na₂HPO₄ 10mM, KH₂PO₄ 2mM; pH 7,4), y a continuación, agregar 4 ml_ de buffer PBS con gentamicina 10C^g/ml_ y fungizona 25μg/mL. A continuación, se almacena la placa durante una semana en una incubadora de CO2 a una temperatura constante de 37^<C y 5% de CO 2- Una vez pasado este tiempo, se obtienen cuerpos celulares en suspensión, provenientes de la línea celular cultivada. Para generar los cuerpos celulares modificados con DNCB, se debe realizar el mismo procedimiento mencionado anteriormente, y luego de la obtención de los cuerpos celulares, estos son modificados según el protocolo descrito por Miller y Claman (Miller S., Claman H., (1976). The Journal of Immunology.). En breve, los cuerpos celulares se mantienen en una suspensión de 5 x 10⁶ células/mL en PBS. A continuación, se les agrega DNCB 5Mm en PBS, en una razón de 100μΙ_ por cada imL de solución. La reacción se deja durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego los cuerpos celulares se centrifugan y lavan con 2 veces con 20 volúmenes de PBS.

Los animales inmunizados son previamente sensibilizados con DNCB 2% directamente en la piel del lomo del animal dos semanas antes de la primera inmunización.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de obtención de cuerpos celulares, CARACTERIZADO porque comprende

sembrar las células de manera homogénea en una placa de cultivo; suplementar el medio con penicilina 100unidades/ml_, estreptomicina 10C^g/ml_ y suero fetal bovino a la concentración requerida por el tipo celular; almacenar las células en una incubadora de CO2 a una temperatura constante de 37^<C y 5% de CO ₂. dejar que las células proliferen ocupando la totalidad de la placa; retirar el medio de cultivo de la placa y lavar la misma dos veces con buffer fosfato salino PBS (NaCI 137mM, KCI 2,7mM, Na₂HPO₄ 10mM, KH₂PO₄ 2mM; pH 7,4); agregar 4 mL de buffer PBS con gentamicina 10C^g/ml_ y fungizona 25μg/mL; almacenar la placa durante una semana en una incubadora de CO₂ a una temperatura constante de 37^<C y 5% de CO 2.

2. Procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1 , CARACTERIZADO porque luego de la obtención de los cuerpos celulares, además comprende: modificar los cuerpos celulares ; mantener en una suspensión de 5 x 10⁶ células/mL en PBS; adicionar DNCB 5Mm en PBS, en una razón de 100μΙ_ por cada mL de solución; dejar la reacción durante 30 minutos a temperatura ambiente y

Centrifugar los cuerpos celulares y lavado.

3. Uso de cuerpos celulares generados a partir de células B16, CARACTERIZADO porque sirve para generar inmunidad antitumoral.