JP6042065B2 - 能動免疫療法のためのＴｈ１ワクチン接種プライミング - Google Patents

Description

本発明はワクチンの分野に関連し、そしてより特に治療ワクチン方法に関連する。詳しくは、本発明は、Ｔｈ１記憶を増加させるためにプライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）するための同種異系の細胞を含む薬学的組成物の使用のための方法に関連し、この記憶は後で活性化され得、そしてがんおよび感染性疾患ならびに他の加齢の疾患の能動免疫療法のためのアジュバントとして役立つ。

免疫系の力を利用し、慢性感染性疾患またはがんを処置することは、免疫療法の主要な目的である。ワクチン接種（別名、能動免疫療法）方法は、免疫系を活性化して侵入している病原体を特異的に認識させそしてこの病原体から保護するように設計される。２００年より永くにわたって、能動免疫療法のアプローチは、痘瘡、狂犬病、腸チフス、コレラ、悪疫（ｐｌａｇｕｅ）、麻疹、水痘、流行性耳下腺炎、灰白髄炎、Ｂ型肝炎、ならびに破傷風毒素およびジフテリア毒素を含む多数の感染性疾患を予防するため利用されてきた。

能動免疫療法の概念は現在、存在する腫瘍を処置するまたは腫瘍の再発を予防する意図で治療がんワクチンを開発するために応用されており、そして慢性ウイルス感染の処置に応用されている。しかしながら、存在する能動免疫療法の技術は、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｃ型肝炎およびがんのような、標的である現代の疾患の多くから保護することに成功していない。このことは、現行のワクチン接種技術は、正しい型の免疫応答を誘発し得ないことに部分的に起因している。

感染または他の抗原チャレンジに対して生成された免疫応答の型は、応答に関係する、ヘルパーＴ（Ｔｈ）細胞のサブセットによって一般に区別され得る。免疫応答は大まかに２つの型であるＴｈ１およびＴｈ２に分類され得る。Ｔｈ１免疫の活性化は、ウイルスのような細胞内感染物について最適化され、そして感染した細胞を溶解し得る、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞および細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の活性化を含み、他方、Ｔｈ２免疫応答は体液性（抗体）応答について最適化される。Ｔｈ１免疫の活性化はがん治療のために最も強く望まれ、そしてＴｈ２免疫応答は特異的な抗体の分泌に対してより指向され、そして腫瘍治療において相対的に価値がより少ない。先行技術のワクチン組成物は、Ｔｈ２応答または体液性免疫応答を誘発することに特化している。これらの応答はがんおよび大部分のウイルス性疾患に対して有効ではない。

がんの根絶および寛解の維持はＴｈ１免疫の活性化を必要とする。従って、能動免疫療法の目的の１つは、内在するＴｈ２応答をＴｈ１応答へと偏向させ得る方法を開発することである。しかしながら、腫瘍に対して潜在的に有効なＴｈ１免疫応答を発揮する、またはＴｈ１免疫応答を発揮するように治療によって免疫されているいくらかの患者において、腫瘍は影響を受けずに依然として増殖し続ける。

Ｔｈ１免疫患者におけるこのような有効性の欠如および腫瘍に対して生得の免疫応答が有効でないことは、腫瘍が免疫の攻撃を回避するための種々の戦略を利用する能力に起因するとされている。腫瘍によって利用されるこのようなイミュノアボイダンス（ｉｍｍｕｎｏａｖｏｉｄａｎｃｅ）機構は免疫系を寛容にし、そして能動免疫療法による抗腫瘍エフェクター機構の特異的なアップレギュレーションの後でさえ腫瘍が免疫の監視に妨げられずに増殖することを可能にする。従って、能動免疫療法の戦略は免疫調節の作用機構に加えて、腫瘍のイミュノアボイダンス機構に打ち勝つ戦略を必要とする。

腫瘍に対する自己寛容の確立は、自己免疫疾患を予防するように通常は利用される存在する自然免疫機構に関連すると考えられる。通常は有益なこの効果が腫瘍の免疫回避を担い得ることは、自己免疫を妨げる寛容機構の多くが免疫破壊を妨げるために腫瘍によって利用されるものと同じである、という観察によって支持される。「危険仮説（ｄａｎｇｅｒ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）」は、免疫系は主として非自己から自己を区別するものではないが、代わりに、抗原が免疫系に呈示される状況に依存してその抗原を認識しそして抗原に応答するように主に適応されていることを提案する。

アジュバントの使用は久しくワクチン組成物中の抗原に対する免疫応答に影響を与えるための戦略である。アルミニウム塩、およびスクアレンの水中油乳剤（ＭＦ５９）は、ヒトワクチンにおいて最も広く使用されるアジュバントである。しかしながら、これらのアジュバントは抗原に対するＴｈ２応答を優位に促進し、そして血清抗体の力価を高めることにおいて有効ではあるが、細胞免疫応答を有意に誘発しない。

本開示には、個体を同種異系抗原でプライミングして、Ｔｈ１表現型の、抗同種異系の記憶細胞を高い力価で生じさせるための組成物および方法が記載されている。その次に、プライミングされた、感染性疾患またはがんを有する個体に、アジュバントとして同じ同種異系抗原を用いた能動免疫療法が施され得る。プライミングされた個体における同種異系抗原の導入は、強力なアジュバント効果を有するＴｈ１サイトカインの著しいバースト（ｂｕｒｓｔ）を提供する。プライミング方法は中高年の個体が免疫の健康を維持する際に特に有益である。なぜなら個体は年齢が高まるにつれて、Ｔｈ１細胞の数がより低くなる傾向があるからである。

本明細書において記載された方法は、Ｔｈ１サイトカインを産生する生きている同種異系の細胞の投与によって、患者において循環中のＴｈ１細胞の数（「Ｔｈ１フットプリント」）を増加させる手段を提供する。同種異系の細胞は、免疫細胞によって処理（ｐｒｏｃｅｓｓ）されそして抗同種異系の免疫の発揮へと導く同種異系抗原を含む。同種異系の細胞がＴｈ１サイトカインを産生するように調製されるとき、このサイトカインは、同種異系抗原に対する免疫応答を引き起こしＴｈ１の方向に向けるアジュバントとして働き、従って、患者のＴｈ１フットプリントを増加させる。Ｔｈ１サイトカインを産生する同種異系の細胞を多数回注射することは、このＴｈ１フットプリントを引き上げる（ｂｏｏｓｔ）のに役立つ。

プライミングワクチン接種は、一般に中高年の患者のような、疾患に対する高い感受性を有する患者に施される。プライミングワクチン接種はまた、がんを有しているが寛解の状態にありそして微小残存病変を有し得るが腫瘍の完全なチャレンジは有しないかもしれない患者に施され得る。プライミングによって生成したＴｈ１フットプリントは、将来においていつでも、追加の抗原チャレンジの注射によって、Ｔｈ１方向に向けるサイトカインを産生するように患者の免疫系を活性化し得る。言い換えれば、この患者の免疫系はプライミングされており、そして待機モード（ｓｔａｎｄｂｙ ｍｏｄｅ）の状態にある。従って、プライミングされた患者が疾患を発症した場合、同種異系の細胞を含むワクチン組成物は単独でまたはこの疾患からの抗原と組み合わせて患者に投与され得る。Ｔｈ１フットプリントを生成するための患者のこのプライミングに続く（ｆｌｏｗｅｄ）、能動免疫療法は、免疫系に、より効果的に治療応答を生じさせる（ｍｏｕｎｔ）。存在する疾患を有する患者はまた、能動免疫療法に先立ってプライミングされ得る。

１つの局面において、本開示は、疾患に対するワクチン接種を患者に行う方法を含む。この方法は、この患者に同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞のプライミング組成物を投与してＴｈ１フットプリントを提供することを含み、ここでは、このプライミング組成物は、この患者がその疾患の症状を示していないときに投与される。

もう１つ局面において、本開示は、患者における疾患の再発を減らす方法を含む。この方法は、同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞および疾患関連抗原の、プライミング組成物を患者に投与することを含む。

さらなる局面において、本開示は、患者にＴｈ１フットプリントを生じさせて、免疫療法を活性化するためのアジュバントとして役立たせる方法を含む。この方法は、同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞を含むプライミング組成物を投与することを含み、ここでは、このプライミング組成物は、患者が疾患の症状を示していないときに投与される。

さらにもう１つの局面において、本開示は、患者の疾患を処置するための治療組成物を含む。この組成物は同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞を含み、ここでは、この治療組成物は、投与すると、患者において循環中のＴｈ１細胞の数を増加させる。

さらにもう１つの局面において、本開示は、処置後の、循環中のＴｈ１細胞の数を増加させることによって疾患を処置するための医薬の製造における、同種異系のＴｈ１記憶細胞を含有する組成物の使用を含む。

さらにもう１つの局面において、本開示は、腫瘍または病原体に対する、患者のためのワクチン組成物キットを含む。このキットはプライミング組成物および活性化組成物を含み、ここでは、このプライミング組成物およびこの活性化組成物は両方とも、同じ源からの、同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞を含有し、そしてここでは、このプライミング組成物は、投与すると、患者において循環中のＴｈ１細胞の数を増加させる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
処置後の、循環中のＴｈ１細胞の数を増加させることによって疾患を処置するための医薬の製造における、同種異系のＴｈ１記憶細胞を含有する組成物の使用。
（項目２）
前記組成物が１つまたはそれより多い疾患関連抗原を含む、項目１に記載の使用。
（項目３）
前記抗原が、生きている細胞全体または生物全体である、項目２に記載の使用。
（項目４）
前記抗原が、不活化された細胞全体、生物全体、またはそれらからの溶解産物である、項目２に記載の使用。
（項目５）
前記抗原が腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解産物である、項目２に記載の使用。
（項目６）
前記疾患ががんである、項目１に記載の使用。
（項目７）
前記疾患が感染性病原体に起因する、項目１に記載の使用。
（項目８）
前記疾患関連抗原が、同時に、別々に、または、前記同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞の処置後に投与される、項目２に記載の使用。
（項目９）
前記疾患関連抗原が前記同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞と組み合わせられる、項目１に記載の使用。
（項目１０）
同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞を含有する、患者の疾患を処置するための治療組成物であって、該治療組成物は、投与すると、患者において循環中のＴｈ１細胞の数を増加させる、組成物。
（項目１１）
１つまたはそれより多い疾患関連抗原をさらに含有する、項目１０に記載の組成物。
（項目１２）
前記抗原が、生きている細胞全体または生物全体である、項目１０に記載の組成物。
（項目１３）
前記抗原が、不活化された細胞全体、生物全体、またはそれらからの溶解産物である、項目１０に記載の組成物。
（項目１４）
前記抗原が腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解産物である、項目１０に記載の組成物。
（項目１５）
前記疾患ががんである、項目１０に記載の組成物。
（項目１６）
前記疾患が感染性病原体に起因する、項目１０に記載の組成物。

図１Ａは、アジュバントなしでのＢＣＬ１に対する免疫応答を示す棒グラフである。 図１Ｂは、アジュバントありでのＢＣＬ１に対する免疫応答を示す棒グラフである。 図２Ａは、０日目から６日目までの、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ４４における表現型推移のプロットを示す。 図２Ｂは、０日目、６日目、および活性化された際の、培養状態に置いているＣＤ４＋細胞中のＣＤ４０Ｌエフェクター分子の発現における、表現型の変化のプロットを示す。 図２Ｃは、０日目、６日目、および活性化された際の、培養状態に置いているＣＤ４＋細胞中のＣＤ２５の発現における、表現型の変化のプロットを示す。 図３Ａは、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞のサイトカイン産生の棒グラフである。 図３Ｂは、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞の免疫原性の棒グラフである。 図４は、同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞の保護（ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ）ワクチン接種能力、および腫瘍チャレンジに対する応答を示すプロットである。 図５は、同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞の治療ワクチン接種能力を示すプロットである。 図６は、プライミングおよび治療ブースターからの結果を示すプロットである。 図７Ａは、クライオアブレーション（ｃｒｙｏａｂｌａｔｉｏｎ）された全身性腫瘍モデルにおける応答を示すプロットである。 図７Ｂは、クライオアブレーションされた固形腫瘍モデルにおける応答を示すプロットである。 図７Ｃは、反対側（右側）の固形腫瘍の腫瘍増殖における応答を示すプロットである。 図７Ｄは、全身性腫瘍モデルの生存を示すプロットである。

本発明は、プライミングワクチン組成物、および能動免疫療法においてこのプライミングワクチン組成物を使用するための方法を含む。好ましくは、このプライミングワクチン組成物は、注射時に活性化される同種異系のＴｈ１記憶細胞を含む。この方法は、このプライミングワクチン組成物を投与して、正常な個体、または疾患にかかりやすい患者もしくは微小残存病変を有する患者にＴｈ１フットプリントを提供することを含む。その次に、これらの個体におけるそのＴｈ１フットプリントは、疾患の発症または再発のときに、同種異系のＴｈ１記憶細胞を含む、活性化ワクチン組成物を投与することによる能動免疫療法によって動員され得る。この活性化ワクチン組成物はまた、疾患関連抗原を含み得る。この活性化ワクチン組成物は、患者において治療Ｔｈ１免疫を誘発するように使用され得、他方、この組成物はまた、疾患病原体および腫瘍の、イミュノアボイダンス機構に打ち勝つための手段を提供し得る。患者のこのようなプライミングは、Ｔｈ１免疫の方向に向けるためのインサイチューの強力なアジュバントを有利に作り出す。従って、この患者が病原体またはがんチャレンジにさらされるとき、免疫系は、よりタイミングの良いおよびより有効な応答を生じさせ得る。

本発明は、生きている免疫細胞を含有するプライミングワクチン組成物を含み、その場合少なくとも一部はＴ細胞である。このＴ細胞は、好ましくは、Ｔｈ１表現型（ＩＦＮ−γを産生しそしてＩＬ−４を産生しないＣＤ４＋ Ｔ細胞）の記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋，ＣＤ６２Ｌ^Ｌｏ）であり、そして本明細書において「記憶細胞」または「Ｔｈ１記憶細胞（ｍｅｍｏｒｙ Ｔｈ１ ｃｅｌｌｓ）」と呼ばれる。このＴｈ１記憶細胞（ｍｅｍｏｒｙ Ｔｈ１ ｃｅｌｌｓ）は処方および患者への導入の時に活性化される。この活性化の好ましい方法は、このＴ細胞上でのＣＤ３表面分子およびＣＤ２８表面分子の架橋による。この活性化記憶Ｔ細胞は、好ましくは、活性化される際にＣＤ４０Ｌを発現し、そして多量の炎症性サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−α）を産生する。この活性化Ｔｈ１記憶細胞は、好ましくは、患者に対して同種異系である。いくつかの実施態様において、このプライミング組成物はまた、疾患関連抗原物質を含み得る。

活性化Ｔｈ１記憶細胞を有するこの組成物は、予防目的もしくは治療目的または両方の目的のために使用され得る。本明細書において記載されたこのプライミング組成物は、疾患の症状を少しも示していない個体に投与される場合、特に好ましい。より一層好ましいのは、症状を少しも示していないが疾患にかかりやすい患者にこのプライミング組成物を投与することである。このプライミング組成物はまた、疾患の早い段階における患者、またはがん患者の場合において、寛解の状態にある患者もしくは微小残存病変を有する患者に投与され得る。症状を示している患者へのこの組成物の適用もまた、本発明の範囲内にある。この組成物は、ワクチンについて従来用いられるまたは推奨される全ての経路を経由して投与され得、この経路は非経口経路、皮内経路、筋肉内経路、皮下経路、または粘膜経路を含む。その上、この組成物は骨内、鞘内、腹膜内または板内（ｉｎｔｒａｌａｍｉｎａｌｌｙ）に投与され得る。ある実施態様において、この組成物はまた、結節内（ｉｎｔｒａｎｏｄａｌｌｙ）または腫瘍内（ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）に投与され得る。

本発明の、プライミングワクチン接種の薬学的組成物は、生きている活性化免疫細胞を含み、それに関して少なくとも一部はＴ細胞である。この組成物はまた、疾患関連抗原を含み得る。疾患関連抗原は、本明細書において言及されるように、疾患を引き起こす病原体に関連する抗原、腫瘍からの細胞もしくは溶解産物、または疾患に関連する他の抗原を含む。本発明の、プライミングワクチンのこの薬学的組成物において使用される、活性化Ｔｈ１記憶細胞は、好ましくは、正常なドナーの血液に由来する。本発明における使用に適した細胞の処理および生産のための好ましい方法は、米国特許第７，４３５，５９２号および米国特許第７，４０２，４３１号ならびに公開された係属中の米国特許出願第２００５／０１９１２９１号にＨａｒ−Ｎｏｙによって記載され、これらの全体は本明細書において参考として援用される。

ワクチン組成物において使用されるＴｈ１記憶細胞の数は変わり得、そしてこの数はまた投与経路に依存し得る。プライミング組成物および活性化組成物は一般に約１×１０^６個と約１×１０^１０個との間の細胞を有する。好ましくは、これらの組成物は、これらの組成物が皮内または腫瘍内に投与される場合、約１×１０^６個と約１×１０^８個との間の細胞を有し、これらの組成物が腹膜内、骨内、または鞘内に投与される場合、約１×１０^７個と約１×１０^９個との間の細胞を有し、そしてこれらの組成物が静脈内に投与される場合、約１×１０^８個と約１×１０^１０個との間の細胞を有する。これらの範囲外のＴｈ１記憶細胞を有する組成物もまた本発明の範囲内にある。

同種異系のＴｈ１記憶細胞を含む組成物でプライミングされている患者は、一般に抗同種異系抗原免疫を生じる。その後の、同種異系の細胞の注射は、抗同種異系抗原の細胞のプールを活性化し得、この細胞のプールは免疫アボイダンス（ａｖｏｉｄａｎｃｅ）機構を無効にするために必要な炎症性サイトカインを放出し得る。

いくつかの実施態様において、プライミングワクチン組成物は、疾患にかかりやすい患者に投与され得る。この疾患は、中高年の患者においてよく生じる疾患であり得る。このプライミングワクチン組成物は、がんにかかりやすい患者、または感染性疾患（例えばＨＩＶ／ＡＩＤＳ、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペス（ｈｅｒｐｅｓ）、結核およびマラリア）にかかりやすい患者について有効であり得る。このプライミングワクチン組成物がこれらの患者に投与されるとき、それらの患者は抗同種異系抗原免疫を生じる。これらの患者の免疫系は、必要なときに活性化され得るＴｈ１フットプリントを有し得る。言い換えれば、この患者の免疫系は待機モードの状態にあり、そして抗原チャレンジに対する、より有効なＴｈ１応答のためにプライミングされている。この患者が特定の疾患の症状を生じるとき、以下に記載されるような活性化ワクチン組成物が投与され得る。

いくつかの実施態様において、プライミングワクチン接種は、がんのような疾患をすでに有しているが寛解の状態にある患者に施され得る。寛解の状態にある患者は微小残存病変（ＭＲＤ）をときどき有し得る。ＭＲＤの場合には、患者はがん細胞を依然として有しうるが、量において、この細胞は臨床的に症候的ではない。時間が過ぎると、このがん細胞は増殖し得、そしてその疾患の再発へと導き得る。活性化Ｔｈ１記憶細胞、および初期のがんの細胞からの１つまたはそれより多い抗原を含むプライミングワクチン接種は、寛解の状態にある患者に施され得てＴｈ１フットプリントを作り出し得る。この患者が再発のしるしを示すとき、活性化ワクチン組成物は投与され得、この組成物はこの活性化Ｔｈ１記憶細胞、および１つまたはそれより多い疾患関連抗原を含む。この患者は前にプライミングされたので、内在する抗同種異系抗原記憶はすぐに応答を生じさせ得て、本格的な抗原チャレンジとより効果的に戦い得る。

本発明に従うプライミングワクチン組成物は、寛解の状態にある患者に投与される場合、ただ１つの病原体またはがんに対する免疫化を意図した組成物（すなわち、この組成物はただ１つの病原体またはがんからの、１つまたはそれより多い抗原を含有する）であり得るか、またはそうでなければ、この組成物は、いくつかの異なる病原体またはがんに対する免疫化を意図した組成物であり得る（それゆえ、その組成物はワクチン組合せ物と言及される）。

活性化Ｔｈ１記憶細胞のアジュバント作用は、活性化Ｔｈ１細胞および疾患関連抗原が投与前に組み合わせられる場合、得られ得る。あるいは、この活性化Ｔｈ１記憶細胞は、この（複数の）疾患関連抗原と別に投与される。好ましくは、この活性化Ｔｈ１記憶細胞は、患者内への投与の前にこの疾患関連抗原と組み合わせられる。

腫瘍および疾患生物が免疫破壊を回避する能力を、無効にし得る炎症性の環境を維持するために、単独のまたは抗原と共に処方された活性化Ｔｈ１記憶細胞の、さらなる複数のブースター組成物が投与され得る。これらのブースター組成物は、好ましくは、少なくとも３日から７日離して投与され（ｍａｄｅ）得、そしてより好ましくは、７日から１４日離して投与され得る。必要とされる場合、さらなる複数のブースター組成物が月基準または年基準でこの患者に投与され得る。

上記薬学的組成物の抗原成分は、１つまたはそれより多い疾患関連抗原を含む。どの抗原源も処方において使用され得る。例えば、生きている細胞または生物はこれらの抗原の源となり（ｓｏｕｒｃｅ）得、この源となる物質（ｓｏｕｒｃｅ ｍａｔｅｒｉａｌ）は放射線照射（または他の不活化方法）で不活化され得、この源となる物質は細胞全体もしくは生物全体、またはそれらからの溶解産物として使用され得る。特に、腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解産物は、これらの抗原のための、細胞源物質として役立ち得る。この細胞源物質は、自己の細胞源もしくは同種異系の細胞源、または細胞系統に由来し得る。抗原源は２００９年５月１日に出願された米国特許出願第１２／４３４，１６８号において記載され、この出願は本明細書において参考として援用される。

上記の患者が特定の疾患の症状を生じるとき、活性化Ｔｈ１記憶細胞、および１つまたはそれより多い源の疾患関連抗原を有する活性化ワクチン組成物がこの患者に投与される。この患者の免疫系は活性化され得て、完全な規模のＴｈ１応答をすぐに生み出し得る。そしてこのように、この抗原に対する、より有効な応答が、この患者にすでにある抗同種異系抗原免疫に起因して生じ得る。

活性化ワクチン組成物は一般に、本明細書においてプライミングワクチン組成物について記載されるような、同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞を含む。この活性化組成物中の、患者に投与されるこの同種異系のＴｈ１記憶細胞は、好ましくは、このプライミング組成物において使用されるその同種異系のＴｈ１記憶細胞と同じ源からの、細胞である。患者に投与される同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞の数は、このプライミング組成物中の、投与される同種異系の細胞の数と、ほぼ同じであり得る。しかし、より多いまたはより少ない量の細胞であっても、活性化組成物における細胞の使用は本発明の範囲内にある。活性化ワクチン組成物はまた、本明細書において記載されるような疾患関連抗原を含み得る。この同種異系のＴｈ１細胞およびこの疾患関連抗原は、１つの活性化ワクチン組成物として、一緒に投与され得る。あるいは、この同種異系のＴｈ１細胞およびこの疾患関連抗原は、別々の組成物として投与され得る。

マウス−−５から６週齢の雌Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ−２^ｄ／ｄ）および雄Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ−２^ｂ／ｂ）のマウスをＨｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ−Ｈａｄａｓｓａｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｊｅｒｕｓａｌｅｍ，Ｉｓｒａｅｌから購入した。特定病原体未感染（ＳＰＦ）条件下ですべてのマウスを維持し、そして酸性化した水および食餌を自由に与えた。本研究はＨｅｂｒｅｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＡｎｉｍａｌ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。実験に配置された時、全てのマウスは６から８週齢であった。

ＢＣＬ１腫瘍モデル−−ＢＣＬ１はＢａｌｂ／ｃが起源の自然発生Ｂ細胞白血病／リンパ腫である。Ｂａｌｂ／ｃレシピエント内で連続継代することにより、このＢＣＬ１腫瘍系統をインビボで維持させる。これらの実験では、尾静脈を介して、０日目に、１００％のこれらのマウスにおいて致死的である２０００個のＢＣＬ１細胞を、動物に静脈内注入した。いくつかの実験では、１×１０^４個のＢＣＬ１をＢａｌｂ／ｃマウスの脇腹に皮下移植した。ＢＣＬ１は、この設定で、リンパ腫／プラズマ細胞腫に似る、速やかに増殖する固形の腫瘍を形成する。

同種異系のＴｈ１記憶細胞の調製−−同種異系のＴｈ１記憶細胞を調製した。手短に言えば、ＣＤ４＋細胞を雄のＣ５７ＢＬ／６の脾臓から単離し、ビーズ：ＣＤ４細胞の初期比が３：１の、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８コーティングを施した常磁性ビーズ（ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ細胞Ｅｘｐａｎｄｅｒビーズ，Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、２０ＩＵ／ｍＬの組換えマウス（ｒｍ）ＩＬ−２、２０ｎｇ／ｍＬ のｒｍＩＬ−７、１０ｎｇ／ｍＬのｒｍＩＬ−１２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）および１０μｇ／ｍＬの抗マウスＩＬ−４ ｍＡｂ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）とともに、１０％のＦＢＳと、ペニシリン−ストレプトマイシン−グルタミンと、可欠アミノ酸（ＮＥＡＡ）（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｓｒａｅｌ）と、３．３ｍＭのＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ；Ｓｉｇｍａ）とを含むＲＰＭＩ １６４０媒体（完全媒体）の中で、６日間培養した。６日間培養した後、これらのＣＤ４細胞を採取し、物理的な破壊および磁石上の通過によりビーズから外した。これらの細胞を新鮮なまま使用したか、または将来の使用のために液体窒素の中で保存した。使用に先立って、完全媒体の中で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングを施したナノビーズとともに、４時間インキュベートすることにより、これらの細胞を活性化した。

ワクチン接種−−０．１ｍｌのＨＢＳＳまたは完全媒体に懸濁したワクチン組成物をマウスに接種した。接種は、交互に足の肉趾の中、または毛をそった脇腹の皮膚の層の中のどちらかに行った。

ＢＣＬ１腫瘍抗原の調製−−ＢＣＬ１溶解産物、および放射線照射されたＢＣＬ１細胞を腫瘍抗原源として使用した。２ｍＬのＨＢＳＳに懸濁し、凍結（−８０℃の冷凍庫の中）−融解（３７℃の水槽）を３回繰り返すことで溶解した、１×１０^７個のＢＣＬ１細胞から複数バッチ分のＢＣＬ１溶解産物を得た。トリパンブルー染色を利用し、顕微鏡で全ての細胞が破壊されていることを確認した。溶解産物を、確実に均質な溶液にするためによく混合し、別々の０．２ｍｌの用量に分けた。これら用量のものを、使用する前に−８０℃で保存した。新鮮なＢＣＬ１細胞に２０Ｇｙで放射線照射し、処置して１時間以内に使用した。

モノクローナル抗体−−次のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を表面表現型分析（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）に使用した：抗ｍＣＤ４−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５（ＩｇＧ２ａ）；アイソタイプの対照であるラットＩｇＧ２ａ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；抗ｍＣＤ６２Ｌ−ＡＰＣ（ＩｇＧ２ａ）；アイソタイプの対照であるラットＩｇＧ２ａ−ＡＰＣ；抗ｍＣＤ４５ＲＢ−ＰＥ（ＩｇＧ２ａ）；アイソタイプの対照であるラットＩｇＧ２ａ−ＰＥ；抗ｍＣＤ８ａ−ＦＩＴＣ（ＩｇＧ２ａ）；アイソタイプの対照であるラットＩｇＧ２ａ−ＦＩＴＣ；抗ｍＣＤ４４−ＦＩＴＣ（ＩｇＧ２ｂ）；アイソタイプの対照であるラットＩｇＧ２ｂ−ＦＩＴＣ；抗ｍＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）−ＰＥ（ＩｇＧ）；アイソタイプの対照であるラットＩｇＧ−ＰＥ；抗ｍＣＤ２５−ＡＰＣ（ＩｇＧ１）；アイソタイプの対照であるラットＩｇＧ１−ＡＰＣ；抗ｍＣＤ３ｅ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（ＩｇＧ）；アイソタイプの対照であるアルメニアンハムスターＩｇＧ−ＰＥＲＣＰ−Ｃｙ５．５（すべてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）からのものである）。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ−−免疫したマウスからの脾臓細胞の単個細胞懸濁液を調製した。２×１０^６個の生きた細胞が２４ウェルプレートのウェルの中の２ｍｌの完全媒体で培養されるように、これらの細胞を分けた。それぞれのウェルの脾臓細胞に検査抗原をパルス適用した（ｐｕｌｓｅｄ）。完全媒体の中に懸濁した、凍結融解された溶解産物として、この検査抗原を調製した。未処置の同質遺伝子的なマウスからの、ＢＣＬ１、同種異系のＴｈ１細胞、または脾臓細胞のいずれかの１×１０^７個の細胞からの溶解産物を、それぞれのウェルにパルス適用した。加湿したＣＯ_２インキュベーターの中で、３７℃で２４時間、パルス適用したウェルを培養した。２４時間後、非接着性細胞を採取し、洗浄し、数を数えた。その次に、抗ＩＦＮ−γおよび抗ＩＬ−４プレコーティングを施したプレート（ｅＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）上で、１ウェルにつき１００，０００個の生きた細胞の割合で、これらの細胞を３つ組で培養し、２０ＩＵ／ｍｌのｒｍＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充した完全媒体の中で、さらに２０時間、インキュベートした。ＰＨＡで活性化した、同質遺伝子的なマウスからの新鮮な脾臓細胞をそれぞれのプレートに対する陽性の対照として使用した（データは示さない）。これらのプレートを、製品の使用説明書に従って顕色し、自動化した画像解析システム上で読み取った。

低温免疫療法（ｃｒｙｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）の腫瘍モデル−−両側固形腫瘍モデル、および全身性疾患を伴う固形腫瘍モデルの、２つの腫瘍モデルを低温免疫療法プロトコールに使用した。この両側固形腫瘍モデルは、０日目に１×１０^４個のＢＣＬ１腫瘍細胞を毛をそった脇腹の両側に皮下注射したマウスからなっていた。この全身性疾患を伴う固形腫瘍モデルについては、マウスに、０日目に１×１０^４個のＢＣＬ１の、左脇腹への単一の皮下接種を行い、その上２０００個のＢＣＬ１を静脈内注入した。

クライオアブレーション−−（液体窒素中に維持して）凍結したピンセットを１０秒間腫瘍に軽く押し付けることで、麻酔をかけたマウス（塩酸ケタミン、１００ｍｇ／ｋｇ、腹膜内）にクライオアブレーション処置を施した。腫瘍は処置時には１６−２５ｍｍ^２であった。完全な腫瘍塊が氷状の球体に覆われた。ワクチン接種の前に、処置した領域の完全な融解を確実に行うために、１時間後に腫瘍内処置を行った。

統計学−−二元配置（ｔｗｏ−ｗａｙ）ＡＮＯＶＡを使用して、サイトカインレベル、ＥＬＩＳＰＯＴ応答頻度、および腫瘍体積の変化における有意差を決めた。０．０５未満のＰ値を有意であるとみなした。ログランクおよびハザード比分析を使用して、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を比較した（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。６０日より長く生存した動物をこの分析から除いた。

アジュバントあり、またはなしでのＢＣＬ１ワクチン接種に対する免疫応答。（図１Ａおよび図１Ｂ）アジュバントなしの（図１Ａ）、または１×１０^３個のＣＤ３／ＣＤ２８架橋した同種異系のＴｈ１細胞（ａｌｌｏ Ｔｈ１）をアジュバントとして混合した（図１Ｂ）、凍結融解したＢＣＬ１腫瘍溶解産物（ｆ／ｔ ＢＣＬ１）もしくは放射線照射したＢＣＬ１（ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１）の、皮内へのワクチン接種を、Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に、１週間おきに４回行った。最初の接種に続いて５週目に、動物を屠殺し、脾臓を採取し、脾臓細胞の単個細胞懸濁培養物に、ｆ／ｔ ＢＣＬ１、もしくは対照としてナイーブＢａｌｂ／ｃマウスからのｆ／ｔ脾臓細胞を、パルス適用した。２４時間後、非接着性Ｔ細胞を取り出して、３つ組みで、抗ＩＦＮ−γおよび抗ＩＬ−４コーティングを施したＥＬＩＳＰＯＴプレートのウェル１つ当たり１×１０^５個の細胞の割合で、培養した。２０時間の培養の後、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４スポットを顕色し、コンピューター支援ビデオ画像分析により、数を数えた。それぞれの棒は、１０^５個のＴ細胞中の、３つ組みの平均スポット数±ＳＥを表す。図１Ａおよび図１Ｂ上のアステリスク（＊）は、対照と比較して、および括弧（］）を付けた値の間で、有意差があること（ｐ＜０．０５）を示し、ｎ．ｓ．は有意でない（ｐ＞０．０５）ことを示す（ＡＮＯＶＡ両側検定）。

ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞の特徴付け。（図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃ）ポジティブセレクションしたＣ５７ＢＬ／６由来ＣＤ４＋ Ｔ細胞を０日目に、ｒｍＩＬ−１２、ｒｍＩＬ−７、ｒｍＩＬ−２および中和抗ＩＬ−４ ｍＡｂを補充したｃＲＰＭＩの中で培養状態に置いて、３：１のビーズ：細胞比で、ＣＤ３／ＣＤ２８結合Ｔ細胞Ｅｘｐａｎｄｅｒビーズ（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で活性化した。この細胞を３日目から６日目まで毎日分け、追加のＴ細胞Ｅｘｐａｎｄｅｒビーズ、ｒｍＩＬ−７、ｒｍＩＬ−２、および抗ＩＬ−４ ｍＡｂを補充した。６日目に、この細胞を採取し、ＣＤ３／ＣＤ２８結合ナノビーズで活性化した。０日目から６日目までの、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ６２Ｌ、およびＣＤ４４における表現型シフトを図２Ａに示す。黒色で埋めた領域はアイソタイプ対照を表す。黒色の線は０日目のＣＤ４＋細胞の表現型である。灰色で埋めた領域は、ＣＤ３／ＣＤ２８ナノビーズ活性化前の、６日目の細胞の表現型であり、灰色の線はＣＤ３／ＣＤ２８ナノビーズ活性化後の表現型を表す。図２Ｂは、６日目に採取したＣＤ３／ＣＤ２８ナノビーズ活性化前後の細胞と比較した、０日目に培養状態に置いたＣＤ４＋細胞中のＣＤ４０Ｌエフェクター分子の発現における、表現型の変化を示す。活性化した細胞だけが、顕著な量のこのエフェクター分子を発現した。図２Ｃは、ＣＤ３／ＣＤ２８ナノビーズ活性化の前および後の６日目の細胞と比較した、０日目のＣＤ４＋細胞中のＣＤ２５発現における、表現型の変化を表す。活性化した６日目の細胞の表現型は、ＣＤ４＋，ＣＤ６２Ｌｌｏ，ＣＤ４５ＲＢｈｉ，ＣＤ４４ｈｉ，ＣＤ４０Ｌ＋，ＣＤ２５＋であった。

ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞の、サイトカイン産生（図３Ａ）および免疫原性（図３Ｂ）。６時間目の細胞培養物からの上清中の、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４サイトカイン産生をＥＬＩＳＡで分析した。ＩＬ−１２（１日目から３日目のみ）、ＩＬ−７およびＩＬ−２の存在下で、６日間培養したＣ５７ＢＬ／６からポジティブセレクションしたＣＤ４細胞は、６０から１００倍に拡張し、ＣＤ４５ＲＢｈｉ、ＣＤ４４ｈｉエフェクター／記憶細胞に分化した。これらの細胞を６日目に採取し、洗浄し、そしてＣＤ３／ＣＤ２８ナノビーズで再活性化し、６時間培養し、そしてＥＬＩＳＡでの分析（図３Ａ：新鮮な活性化Ｔｈ１）のために上清を集めた。これらの結果と、最初に液体窒素中で凍結し、それから後で融解して、ＣＤ３／ＣＤ２８ナノビーズで活性化した、同じ６日目に採取した細胞の、６時間目の培養物からの上清とを比較した（図３Ａ：融解した活性化Ｔｈ１）。比較のために、ポジティブセレクションしたＣＤ４細胞（０日目に培養状態に置いたのと同じもの）のサンプルからの上清を、３：１のビーズ：細胞比で、ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ細胞Ｅｘｐａｎｄｅｒビーズで活性化し、６時間培養した（図３Ａ：ＣＤ４ナイーブ）。６日目に採取した細胞からの上清はまた、６時間、ＣＤ３／ＣＤ２８活性化なしで培養した（図３Ａ：新鮮な非活性化Ｔｈ１）。

これらの細胞組成物の免疫原性をＥＬＩＳＰＯＴで検査した（図３Ｂ）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する、１×１０^４個の、新鮮な活性化Ｔｈ１細胞、新鮮な非活性化Ｔｈ１細胞、もしくはポジティブセレクションしたＣＤ４細胞（対照）を、同種異系のＢａｌｂ／ｃマウスに、４週間にわたり、１週間に１回皮下接種した。５週目の間に、これらのマウス（ｎ＝３）を屠殺し、脾臓を取り出し、そして脾臓細胞の単個細胞培養物を立ち上げた（ｅｓｔａｂｌｉｓｈ）。この培養物に、凍結／融解したＣＤ５７ＢＬ／６脾臓細胞の溶解産物をパルス適用し、２４時間培養した。その次に非接着性Ｔ細胞画分を採取し、洗浄し、そして１×１０^５個の細胞を、３つ組みで、抗ＩＦＮ−γもしくは抗ＩＬ−４コーティングを施したＥＬＩＳＰＯＴプレートに移して、さらに２０時間、２０ＩＵのｒｍＩＬ−２の存在下で培養した。それぞれの棒は、３つ組みの平均スポット数±ＳＥを表す。

保護ワクチン接種および腫瘍チャレンジ。ＢＣＬ１腫瘍に対してワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線（それぞれのグループにつきｎ＝８）。（図４）０日目に、全てのマウスに２０００個のＢＣＬ１細胞を静脈内注入した。腫瘍チャレンジに先立って、−２２日目、−１５日目、−８日目、および−１日目に、媒体のみ（対照）、１×１０^４個の同種異系のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞（Ｔｈ１のみ）、放射線照射したＢＣＬ１を混合した１×１０^４個の同種異系のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞（ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１＋Ｔｈ１）、もしくは凍結／融解したＢＣＬ１腫瘍溶解産物を混合した１×１０^４個の同種異系のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞（ｆ／ｔ ＢＣＬ１＋Ｔｈ１）のいずれかを、マウスに皮内接種した。対照マウスの生存期間（ｓｕｒｖｉｖａｌ）の中央値は２１日であった。ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１のみ（生存期間の中央値＝２０．５日）もしくはｆ／ｔ ＢＣＬ１のみ（生存期間の中央値＝２０．０日）のワクチン接種は、対照と比較して生存期間に有意に影響しなかった。Ｔｈ１のみの前処置は、平均２４日へと有意に生存期間を延長した（ハザード比＝３．１４）。アジュバントとしてＴｈ１を用いてｉｒｒａｄ ＢＣＬ１をワクチン接種することは、生存期間に有意な効果がなかった（平均生存期間＝２２日）。ｆ／ｔ ＢＣＬ１とＴｈ１との混合は、５０％のマウスが致死腫瘍チャレンジにおいて生存する結果となり、生存期間の中央値は４６日であった（ハザード比＝６．０８）。

治療ワクチン接種。０日目に２０００個のＢＣＬ１が静脈内に注入されたＢａｌｂ／ｃマウス（１グループにつきｎ＝６）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。（図５）１日目、８日目、および１５日目に、１×１０^４個の同種異系ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞のみ（Ｔｈ１）、もしくはＴｈ１を混合した、１×１０^６個のＢＣＬ１のｆ／ｔ溶解産物（ｆ／ｔＢＣＬ１＋Ｔｈ１）の、いずれかの、皮内注射をマウスに行った。対照マウスは平均１９．５日生存した。Ｔｈ１のみをワクチン接種されたマウスは、対照より有意に長く生存し、平均２６日生存した（ログランク：ｐ＝０．００１；ハザード比：３．９８１）。ｆ／ｔＢＣＬ１＋Ｔｈ１をワクチン接種されたマウスもまた、対照マウスより有意に長く生存し、平均生存期間は３４日であり（ログランク：ｐ＝０．００１；ハザード比：３．９８１）、そしてそれはＴｈ１のみのグループに比べて有意に異ならなかった。

治療ブースターを用いたプライミング。ＢＣＬ１腫瘍に対してワクチン接種されたＢａｌｂ／ｃマウスの、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線（それぞれのグループにつきｎ＝８）。（図６）０日目に全てのマウスに２０００細胞のＢＣＬ１を静脈内注入した。腫瘍チャレンジに先立って、−２２日目、−１５日目、−８日目、および−１日目に、媒体のみ（対照）、１×１０^４個の同種異系のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞（Ｔｈ１）、または凍結／融解したＢＣＬ１腫瘍溶解産物を混合した、１×１０^４個のＴｈ１（Ｔｈ１＋ｆ／ｔ ＢＣＬ１プライミング）の、いずれかを皮内接種することで、マウスをプライミングした。７日目に、Ｔｈ１のみ、もしくはｆ／ｔ ＢＣＬ１を混合したＴｈ１の、いずれかを用いて、いくつかのマウスに治療ブースターの皮内接種を施した。対照マウスは中央値２０日生存した。Ｔｈ１のみのワクチン接種は、中央値２３日へと、有意に生存期間を延長する結果となった（ログランク：ｐ＝０．０１１；ハザード比：２．４７８）。Ｔｈ１のみのワクチン接種に続いてＴｈ１ブースターを施すことで、対照と比較して、有意な生存の利益（生存期間の中央値＝２５日）（ログランク：ｐ＜０．０００１；ハザード比＝３．９１５）が生じ、Ｔｈ１のみと比較して有意な生存（ログランク：ｐ＝０．０３、ハザード比＝２．３３７）が生じた。アジュバントとしてＴｈ１を用いた、ｆ／ｔ ＢＣＬ１のワクチン接種（Ｔｈ１＋ｆ／ｔ ＢＣＬ１プライミング）によりプライミングされたマウスは、生存期間の中央値が５７．５日であり、５０％のマウスが致死チャレンジにおいて生存した。Ｔｈ１＋ｆ／ｔ ＢＣＬ１でプライミングされ、Ｔｈ１ブースターを施されたマウスは、７５％が致死チャレンジにおいて生存した。Ｔｈ１細胞のみでプライミングされ、ｆ／ｔ ＢＣＬ１＋Ｔｈ１を用いた治療ブースター注射を施されたマウスは、対照と比較して有意な生存の利益を有し、生存期間の中央値は４６日であり（ログランク：ｐ＜０．０００１；ハザード比＝５．６３３）、３７．５％のマウスが致死チャレンジにおいて生存した。

低温免疫療法への固形腫瘍および全身性腫瘍の応答。固形腫瘍モデルにおいて、０日目に、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、両側の毛をそった脇腹への、１×１０^４個のＢＣＬ１腫瘍細胞の皮下接種を施した。全身性腫瘍モデルにおいて、０日目に、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、１×１０^４個のＢＣＬ１腫瘍細胞の左脇腹への接種、および尾静脈を介した２０００個のＢＣＬ１の静脈への接種を施した。１４日目に、左側の腫瘍塊の全ての観察できた腫瘍のクライオアブレーションを単独で（ｃｒｙｏのみ）、もしくは腫瘍内を同種異系のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞（Ｔｈ１）とともに（ｃｒｙｏ＋Ｔｈ１）、またはクライオアブレーションなしで、腫瘍内をＴｈ１細胞のみで（Ｔｈ１のみ）、処置された全身性腫瘍モデル（図７Ａ）および固形腫瘍モデル（図７Ｂ）マウス（それぞれのグループにつきｎ＝８）のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線。対照マウスは、全身性モデルにおいては中央値２１日、固形腫瘍モデルにおいては２８．５日、生存した。ｃｒｙｏ＋Ｔｈ１処置は、全身性モデルにおいて、有意な生存の利益を生じた（ログランク：ｐ＝０．００５９；ハザード比＝３．１９４）。固形腫瘍モデルにおける生存の利益は有意ではなかった（ｎ．ｓ．）。全てのマウスに対して、７日目に、１×１０^５個のＴｈ１の静脈内注入を加えて、同じ実験を繰り返した。図７Ｃは、このプロトコールを用いて処置されたマウスについて、反対側にある未処置の腫瘍塊の腫瘍増殖曲線を示す。ｃｒｙｏ＋Ｔｈ１で処置されたマウスの４０％は疾患が治癒した。結局疾患で死んだ、もう一方の６０％のマウスにおいて、反対側の腫瘍の増殖は有意に抑制された（ｐ＜０．０１）。全身性腫瘍モデル（図７Ｄ）における、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。腫瘍内をＴｈ１細胞のみで処置されたマウスは、平均２８日生存し、そしてそれは、平均１９日生存した対照マウスより有意に長かった（ログランク：ｐ＜０．０００１；ハザード比＝４．２９１）。ｃｒｙｏ＋Ｔｈ１で処置されたマウスの４０％は９０日より長く生存した。

結果
ＢＣＬ１免疫原性−−Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける、ＢＣＬ１ワクチン接種に対するネイティブの免疫応答を特徴付けし、アジュバントを加えることの生物学的効果を分析するためのベースライン（ｂａｓｅｌｉｎｅ）として役立たせた。ＢＣＬ１は長年にわたりインビボで連続して継代されているので、現行のＢＣＬ１クローンは、同質遺伝子的なＢａｌｂ／ｃマウスにアジュバントなしで投与される場合、「イミュノエディティング（ｉｍｍｕｎｏｅｄｉｔｉｎｇ）」に起因して、非免疫原性であると証明されることになる。

放射線照射されたＢＣＬ１全体（ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１）もしくはＢＣＬ１の凍結融解された溶解産物（ｆ／ｔ ＢＣＬ１）のいずれかである、ＢＣＬ１の２つのワクチン調製物の免疫原性を、アジュバントなし（図１Ａ）、またはアジュバントとして１×１０^３個のＣＤ３／ＣＤ２８架橋同種異系のＴｈ１細胞（ａｌｌｏ Ｔｈ１）を混合して（図１Ｂ）、検査した。「危険仮説」は、ｆ／ｔ ＢＣＬ１溶解産物の調製物は、ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１調製物より免疫原性があることを予想している。ｆ／ｔ ＢＣＬ１およびｉｒｒａｄ ＢＣＬ１調製物の免疫原性を検査するために、４週間にわたり、１週間につき１回、Ｂａｌｂ／ｃマウスに、０．２ｍｌのＨＢＳＳ中でこれらを皮内（ｉ．ｄ．）へ投与した。

アジュバントなしの、ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１およびｆ／ｔ ＢＣＬ１の両方のワクチン接種は、有意な腫瘍特異的な免疫応答を誘発し得た（図１Ａ参照）。ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１のワクチン接種後の、腫瘍特異的なＴ細胞の平均頻度（ＩＬ−４＋ＩＦＮ−γスポット）は、１／６４であり、そしてそれはｆ／ｔ ＢＣＬ１ワクチン接種後の平均頻度である１／２２７より、有意に高かった（３．５倍）。両方のワクチン接種のプロトコールは、対照の平均頻度である１／３３３３と比較して、応答するＴ細胞を有意に高い頻度で生じた（ｐ＜０．００１）。

両方のワクチン調製物は、Ｔｈ２（ＩＬ−４）に偏った、腫瘍特異的なＴ細胞の応答を引き起こした。ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１ワクチン接種に対して応答した、Ｔ細胞ＩＬ−４の平均頻度は、１／９３であり、そしてＩＦＮ−γ応答は有意に低く（ｐ＜０．００１）、１／２０８であった。ｆ／ｔ ＢＣＬ１ワクチン接種されたマウス中の、ＩＬ−４応答物の平均頻度は、ＩＦＮ−γ応答の平均頻度である１／７６９より、有意に高く（ｐ＜０．０１）、１／３２２であった。ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１ワクチン接種されたマウス中のＩＦＮ−γ応答物の平均頻度は、ｆ／ｔ ＢＣＬ１ワクチン接種されたマウスと比べて、有意に異ならなかった。

ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１もしくはｆ／ｔ ＢＣＬ１がワクチン接種されたマウスのいずれも、２０００個のＢＣＬ１細胞が尾静脈を介して静脈内に投与された、致死チャレンジにおいて生存し得ず（図４参照）、このことは、両方のＢＣＬ１ワクチン接種プロトコールに対する有意な免疫応答は、保護的ではなかったことを示している。

ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞の特徴付け−−最初に、表面表現型（図２Ａ−Ｃ）、サイトカイン産生プロファイル（図３Ａ）、および同種異系のＢａｌｂ／ｃマウスに週１回の皮内注射を４回行った後の免疫応答（図３Ｂ）について、Ｃ５７ＢＬ／６由来ＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞を特徴付けした。

ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ４４、ＣＤ２５、およびＣＤ４０Ｌの表面発現を分析し、０日目のＣＤ４＋源の細胞のＦＡＣＳ分析（ＦＡＣＳ）により、６日間の培養の間の細胞の分化を特徴付けし、そしてこの染色パターンを、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋による活性化の前および後、６日間培養した後採取された同じ細胞と、比較した。結果は図２Ａに示す。

脾臓細胞から、０日目にポジティブセレクションされたＣＤ４＋細胞は、ＣＤ６２Ｌ^ｈｉ、ＣＤ４４^ｈｉと染色されたが、ＣＤ６２Ｌ^ｈｉ表現型からＣＤ６２Ｌ^ｌｏ表現型に変わった。従って、６日目のＣＤ３／ＣＤ２８架橋細胞は、ＣＤ４＋、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏ、ＣＤ４５ＲＢ^ｈｉ、ＣＤ４４^ｈｉの表現型を発現した。

表現型の上で、マウス記憶細胞は通常はＣＤ６２Ｌ^ｌｏ、ＣＤ４５ＲＢ^ｌｏ、ＣＤ４４^ｈｉである。本発明者らの培養方法により産生された細胞の、ＣＤ６２Ｌ^ｌｏ，ＣＤ４５ＲＢ^ｌｏ，ＣＤ４４^ｈｉ表現型は、以前から、自己免疫疾患および同種異系移植拒絶と結び付けて考えられている、記憶／エフェクター細胞と同じ表現型を発現する。

６日目の細胞をＣＤ３／ＣＤ２８架橋により４時間活性化することは、９．２７％から６７．６５％へとＣＤ４０Ｌを発現する細胞の数の有意な増加（図２Ｂ）を引き起こし、そしてこのことは、６３．０９％から９１．５２％へとＣＤ２５を発現する細胞が増加したこと（図２Ｃ）と相互に関連した。

これらのＣＤ３／ＣＤ２８活性化されたＣＤ４^＋，ＣＤ６２Ｌ^ｌｏ，ＣＤ４５ＲＢ^ｈｉ，ＣＤ４４^ｈｉ，ＣＤ４０Ｌ^＋，ＣＤ４０Ｌ^＋，ＣＤ２５^＋記憶／エフェクター細胞（ｎ＝６バッチ）の検査を、新鮮なままの６日目に採取された細胞、もしくは液体窒素中で凍結され、融解され、そして活性化された、６日目に採取された細胞が、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋により活性化された後のサイトカイン産生について、行った。活性化された０日目のＣＤ４＋細胞、および活性化されなかった新鮮なままの６日目に採取された細胞を、比較のために含めた（図３参照）。

新鮮な活性化ＣＤ４＋記憶／エフェクター細胞は、多大な量のＩＦＮ−γ（４２１０±１６９．７ｐｇ／ｍｌ／６ｈ）およびごくわずかのＩＬ−４（５２．３３±６．８ｐｇ／ｍｌ／６ｈ）を発現したことから、これらの細胞はＴｈ１記憶細胞に属するものとされる。これらのＴｈ１記憶細胞を活性化に先立って液体窒素中で凍結し、そしてその後融解し、活性化するとき、これらは、Ｔｈ１表現型を維持するが、新鮮な細胞より約２９％少ないＩＦＮ−γおよびＩＬ−４を発現する（２９８５±１７３．５ｐｇ／ｍｌ／６ｈのＩＦＮ−γ、および３７．２±６．９５ｐｇ／ｍｌ／６ｈのＩＬ−４）。非活性化Ｔｈ１記憶細胞は、ごくわずかの量のサイトカインを産生した（１３±６．７ｐｇ／ｍｌ／６ｈのＩＦＮ−γ；８．８±３．６ｐｇ／ｍｌ／６ｈのＩＬ−４）。通常のＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞の単個細胞懸濁物からポジティブセレクションにより単離された、源のＣＤ４＋細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８結合マイクロビーズ（ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ）を用いた活性化の際に、Ｔｈ２に偏ってサイトカインを産生した（２５４±５０．２ｐｇ／ｍｌ／６ｈ ＩＬ−４；５３．５±１１．４ｐｇ／ｍｌ／６ｈ ＩＦＮ−γ）。

これらのデータは、この培養条件によって、Ｔｈ２に偏ったＣＤ４＋ナイーブ細胞が生じ、強く極性化した（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）Ｔｈ１記憶／エフェクター細胞に分化することを実証する。そしてこの細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋の際にＣＤ４０Ｌを発現し、そして通常と異なる（ｕｎｕｓｕａｌ）ＣＤ６２Ｌ^ｌｏ、ＣＤ４５ＲＢ^ｈｉ、ＣＤ４４^ｈｉ記憶表現型を発現する。

同種異系のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞に対する免疫応答−−同種異系のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞が、１型免疫（Ｔｙｐｅ １ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の促進のためのアジュバント活性を与える能力を特徴付けるために、研究を行い、Ｃ５７ＢＬ／６由来Ｔｈ１記憶細胞は、それ自身の同種異系抗原に対する１型免疫を同種異系のＢａｌｂ／ｃ宿主（ｈｏｓｔｓ）において、誘発し得るかどうかを決めた。マウスに、１×１０^４個のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞、または１×１０^４個のＣＤ３／ＣＤ２８架橋のないＴｈ１記憶細胞を、０．１ｍｌのｃＲＰＭＩ中で、皮内投与した。ｃＲＰＭＩのみ（ａｌｏｎｇ）の接種を対照として用いた。マウス（ｎ＝６）に、４週間にわたり、１週間につき１回、接種した。

最初のワクチン接種の後、５週目の間に、マウスを屠殺し、そして脾臓を取り出し、そして以前のように、ＥＬＩＳＰＯＴ分析のために単個細胞懸濁物を調製した。結果を図３Ｂに示す。

同種異系のＣＤ４細胞（０日目）のみのワクチン接種は、１／３４８のＴ細胞という、ベースラインである同種異系の免疫応答平均頻度（ＩＦＮ−γ＋ＩＬ−４）を生じた。ＣＤ３／ＣＤ２８架橋のない同種異系のＴｈ１細胞（６日目）は、１／２６８のＴ細胞という応答平均頻度を生じた。そしてこの頻度は、ＣＤ４細胞のみと比べて有意に異ならなかった。しかしながら、同種異系のＴｈ１細胞のＣＤ３／ＣＤ２８架橋は、１／３４という同種異系抗原特異的なＴ細胞の平均頻度を生じた。そしてこの頻度は、同種異系のＣＤ４細胞および非活性化同種異系のＴｈ１細胞の応答頻度より、有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。

同種異系のＣＤ４細胞および非活性化同種異系のＴｈ１記憶細胞に対する免疫応答は、歪んで（ｓｋｅｗｅｄ）Ｔｈ２免疫を生じ、他方、ＣＤ３／ＣＤ２８架橋同種異系のＴｈ１記憶細胞は、強く極性化したＴｈ１応答を誘発した。ＣＤ４細胞ワクチン接種は、１／１８１というＩＬ−４産生するＴ細胞の平均頻度を生じ、そしてこの頻度は、１／４１６７というＩＦＮ−γ産生するＴ細胞の平均頻度より、有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。非活性化同種異系のＴｈ１記憶細胞は、１／１４７というＩＬ−４応答するＴ細胞の平均頻度を誘発し、そしてこの頻度は、１／１５８７というＩＦＮ−γ応答するＴ細胞の平均頻度より、有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。同質遺伝子的な脾臓細胞対照は、検出することができる、適応免疫応答（ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を誘発しなかった（結果は示さない）。

保護ワクチン接種およびチャレンジ−−同種異系のＴｈ１細胞が、アジュバントとして役立ち得て、ＢＣＬ１腫瘍の致死チャレンジからマウスを保護するかどうかを決めるために、凍結／融解したＢＣＬ１溶解産物（ｆ／ｔ ＢＣＬ１）または放射線照射されたＢＣＬ１細胞（ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１）のいずれかのワクチン混合物を調製し、単独（対照）または１×１０^４個の同種異系のＴｈ１細胞と混合して、使用した。腫瘍抗原源のない同種異系のＴｈ１細胞のみを対照として用いた。マウス（それぞれのグループにおいてｎ＝８）に、−２２日目、−１５日目、−８日目、および−１日目に、１週間おきに、４回のワクチン調製物の皮内接種を受けさせた。媒体のみの注射を対照として用いた。０日目に、全てのワクチン接種されたマウスに、２０００個のＢＣＬ１細胞の、致死静脈内チャレンジを受けさせた。

マウスを生存について追跡した（図４参照）。媒体のみの対照マウスの生存期間の中央値は、２１日であった。ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１、ｆ／ｔ ＢＣＬ１、または同種異系のＴｈ１のみのいずれかのワクチン接種は、腫瘍チャレンジからの保護を生じなかった。興味深いことに、同種異系のＴｈ１のみのワクチン接種は、保護的ではなかったが、チャレンジされたマウスの生存期間を平均２４日へと有意に延長した（ハザード比＝３．１４）。ｉｒｒａｄ ＢＣＬ１＋ＴＨ１細胞の組成物のワクチン接種は、生存期間に影響せず（生存期間の中央値＝２２日）、保護を与えなかった。ｆ／ｔ ＢＣＬ１＋Ｔｈ１細胞のワクチン接種によって、４６日という生存期間の中央値が生じ（ハザード比＝６．０８）、５０％のマウスが致死腫瘍チャレンジにおいて生存した。

治療ワクチンプロトコール−−上記のデータは、腫瘍のなかった（ｔｕｍｏｒ ｆｒｅｅ）時にワクチン接種され、その次に致死用量の腫瘍でチャレンジされた動物における、ｆ／ｔ ＢＣＬ１およびアジュバントとして用いられた同種異系のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞のワクチン接種の保護的な効果を実証した。この保護的な効果はまた、治療効果を与え得るかどうかを決めるために、前もって存在する（ｐｒｅ−ｅｘｉｓｔｉｎｇ）腫瘍を有したマウスにおける、ワクチン接種プロトコールを調べた。

４回の、１週間につき１回の皮内接種（２８日）に続く、３５日目の腫瘍チャレンジを、以前の保護ワクチン接種プロトコールは含んでいた。マウスは、致死ＢＣＬ１注入の１９日から２２日後に疾患で死ぬので、このワクチン接種スケジュールを本発明者らのモデルにおける治療設定に移すことはできなかった。従って、マウス（それぞれのグループにつきｎ＝６）に、０日目に、静脈内への致死用量の２０００個のＢＣＬ１細胞を受けさせ、そして１日目、８日目、および１５日目に、１×１０^４個の同種異系のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞のみ（Ｔｈ１）、または同種異系のＴｈ１を混合した１×１０^６個のＢＣＬ１のｆ／ｔ溶解産物（ｆ／ｔ ＢＣＬ１＋Ｔｈ１）のいずれかの皮内への治療ワクチン接種を受けさせた。同じスケジュールで媒体のみの接種を対照として役立たせた。結果は図５に示す。

対照マウスは平均１９．５日生存した。興味深いことに、どの腫瘍抗原源もなしで、Ｔｈ１のみをワクチン接種されたマウスは、対照より有意に長く生存し、平均２６日生存した（ログランク：ｐ＝０．００１；ハザード比：３．９８１）。ｆ／ｔ ＢＣＬ１＋Ｔｈ１をワクチン接種されたマウスはまた、対照マウスより有意に長く生存し、平均生存期間は３４日であったが（ログランク：ｐ＝０．００１；ハザード比：３．９８１）、これは同種異系のＴｈ１のみのグループと比べて有意に異ならなかった。これら治療ワクチン接種プロトコールのいずれを用いても、マウスは治癒しなかった。

プライミングおよび治療ブースターワクチン接種−−治療ワクチンプロトコールにおいてどのマウスも治癒しなかったので、ＢＣＬ１腫瘍が注入されたマウスの、１９日から２２日の寿命は、速やかに増殖する腫瘍を圧倒し得る適応免疫応答を発揮するのに、十分な時間ではなかった。従って、検査を実施し、腫瘍チャレンジに先立って同種異系のＴｈ１を含むワクチン接種を用いてプライミングされたマウスは、治療ワクチン接種に対してもっとよく応答するかどうかを決めた。これらの実験において、−２２日目、−１５日目、−８日目、および−１日目に、媒体のみ（対照）、１×１０^４個の同種異系のＣＤ３／ＣＤ２８架橋Ｔｈ１細胞（Ｔｈ１）、または凍結／融解したＢＣＬ１腫瘍溶解産物を混合した１×１０^４個のＴｈ１（Ｔｈ１＋ｆ／ｔ ＢＣＬ１プライミング）のいずれかの皮内接種により、マウスをプライミングした。０日目に全てのマウスに２０００個のＢＣＬ１を注入した。７日目に、１×１０^４個のＴｈ１のみ、またはｆ／ｔ ＢＣＬ１を混合した１×１０^４個のＴｈ１のいずれかの、皮内治療ブースター接種をいくつかのマウスに施した。結果を図６に示す。

対照マウスは中央値２０日生存した。再びＴｈ１のみでプライミングすることによって、中央値２３日へと有意な生存期間の延長が生じた（ログランク：ｐ＝０．０１１；ハザード比：２．４７８）。Ｔｈ１のみを用いたプライミングに続くＴｈ１治療ブースターによって、対照と比較して有意な生存の利益（生存期間の中央値＝２５日）が生じ（ログランク：ｐ＜０．０００１；ハザード比＝３．９１５）、そしてＴｈ１プライミングのみと比較して有意な生存を生じた（ログランク：ｐ＝０．０３；ハザード比＝２．３３７）。アジュバントとしてＴｈ１を用いたｆ／ｔ ＢＣＬ１のワクチン接種（Ｔｈ１＋ｆ／ｔ ＢＣＬ１プライミング）によりプライミングされたマウスは、生存期間の中央値が５７．５日であり、５０％のマウスが致死チャレンジにおいて生存し、本発明者らの以前の実験において同じ結果を得た（図４参照）。Ｔｈ１＋ｆ／ｔ ＢＣＬ１でプライミングされ、Ｔｈ１治療ブースターを投与されたマウスは、致死チャレンジ後７５％が生存した。Ｔｈ１細胞のみでプライミングされ、ｆ／ｔ ＢＣＬ１＋Ｔｈ１を用いた治療ブースター注射を施されたマウスは、対照と比較して有意な生存の利益を有し、生存期間の中央値は４６日であり（ログランク：ｐ＜０．０００１；ハザード比＋５．６３３）、そして３７．５％のマウスが致死チャレンジにおいて生存した。

Ｔｈ１プライミング／Ｔｈ１＋ｆ／ｔ ＢＣＬ１ブースターグループについてのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線の形状は、致死ＢＣＬ１注射後同様にマウスが治癒する結果となった他のグループと比較して、異なる。Ｔｈ１＋ｆ／ｔ ＢＣＬ１プライミング後生存しなかった、５０％のマウス、および致死チャレンジにおいて生存しなかった、Ｔｈ１＋ｆ／ｔ ＢＣＬ１プライミング／Ｔｈ１ブースターグループの２５％は、直ちに白血病のしるしを示し（触診可能な脾腫および有意な重量増加）、そして非常に早く、平均２４日の時にこの疾患で死んだ。対照的に、同様に明らかな白血病を有したが対照マウスより有意に長く生存したマウスサブセット（６２．５％）、および外見上は治癒し、そして決して白血病のしるしを示さなかった、別のサブセット（３７．５％）を、Ｔｈ１プライミング＋ｆ／ｔ ＢＣＬ１処置グループは含んでいた。

低温免疫療法−−治療ワクチン接種の効能をさらに向上させることを試みるために、壊死によるインサイチューの腫瘍死（ｔｕｍｏｒ ｄｅａｔｈ）は、本発明者らの他の凍結融解した溶解産物の調製物より強力な適応免疫応答を与えると、仮定した。壊死により死滅した細胞（Ｎｅｕｒｏｔｉｃａｌｌｙ ｋｉｌｌｅｄ ｃｅｌｌｓ）は、ＤＣの供給および成熟の原因である、窮迫（ｄｉｓｔｒｅｓｓ）の内因性シグナルを活性化することが知られており、このシグナルは、健康なまたはアポトーシスで（ａｐｏｐｔｏｔｉｃａｌｌｙ）死んだ細胞により生成されず、そして本発明者らの溶解産物の調製物には欠けている可能性がある刺激である。その上、これらの刺激への未熟なＤＣの暴露は、局所および全身（ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ）のＴｈ１免疫の開始に重要な、成熟シグナルを提供する。

壊死によりインサイチューの死を引き起こすために、クライオアブレーションプロトコールを用いた。クライオアブレーション手術は、臨床（ｃｌｉｎｉｃ）に移すことができる手法であり、そしてこの手術は組織壊死を誘導し得る、十分にねらいが定められ（ｗｅｌｌ−ａｉｍｅｄ）および制御された方法であることが示されている。クライオアブレーションは、（凍結された組織の自己の抗原に対して特異的な免疫学的応答を生成し得る）抗原刺激を誘発することが知られている。

クライオアブレーション（ｃｒｙｏｂｌａｔｉｏｎ）について皮下腫瘍が利用可能であった２つの腫瘍モデルを立ち上げた。固形腫瘍モデルにおいては、Ｂａｌｂ／ｃマウスに０日目に、１×１０^４個のＢＣＬ１腫瘍細胞の、毛をそった脇腹の両側への皮下接種を施した。全身性腫瘍モデルにおいては、Ｂａｌｂ／ｃマウスに０日目に、左脇腹へ１×１０^４個のＢＣＬ１腫瘍細胞の接種物（ｉｎｏｃｕｌｏｕｓ）および尾静脈を介して静脈内へ２０００個のＢＣＬ１の接種物を投与した。その次に、固形腫瘍が１６ｍｍ^２より広い面積へと増殖した後、１４日目に、これらの動物（１グループにつきｎ＝８）の左側の腫瘍を、クライオアブレーション（ｃｒｙｏｂｌａｔｉｏｎ）のみ、腫瘍内への１×１０^３個の同種異系のＣＤ３／Ｃｄ２８架橋Ｔｈ１記憶細胞と共にクライオアブレーション（ｃｒｙｏｂｌａｔｉｏｎ）（Ｔｈ１）、Ｔｈ１細胞のみ、または対照として腫瘍内への完全媒体のみを用いて処置した。結果を図７Ａおよび図７Ｂに示す。

全身性腫瘍モデル（図７Ａ）において、対照マウスの平均生存期間は２１日であった。クライオアブレーション（ｃｒｙｏｂｌａｔｉｏｎ）のみおよびＴｈ１のみで処置されたマウスの生存期間は、対照と比べて異ならなかった。しかしながら、クライオアブレーション（ｃｒｙｏｂｌａｔｉｏｎ）の腫瘍内Ｔｈ１処置との組み合わせによって、平均２８．５日へと有意に延長した生存期間を生じた（ログランク：ｐ＝０．００５７；ハザード比：３．１９４）。固形腫瘍モデル（図７Ｂ）において、対照マウスの平均生存期間は２８日であった。このモデルにおいて検査された処置はどれも、有意な生存の利益を提供しなかった。

このクライオアブレーション（ｃｒｙｏｂｌａｔｉｏｎ）プロトコールによって、その処置の結果治癒したマウスは生じなかったことから、本発明者らは処置を改変し、全てのマウスについて７日目に１×１０^５個の同種異系のＴｈ１の静脈内注入を含ませた。０日目にＢＣＬ１が、致死させるように（ｌｅｔｈａｌｌｙ）注射されたマウスにおいて、７日目に１×１０^５個の同種異系のＴｈ１細胞を静脈内注入することによって有意な生存の利益が生じることが、以前に示されている。この処置は治癒する能力のある（ｐｏｔｅｎｔｉａｌｌｙ ｃｕｒａｔｉｖｅ）適応免疫応答を発揮するためのより長い時間を提供し、そして従って、低温免疫療法（ｃｒｙｏｕｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）を施されたマウスの生存期間に影響する、と仮定した。その上、この処置は、同種異系抗原免疫についてプライミングし、前に（図６）生存の利益を提供することが示されている。

これらの研究の結果を図７Ｃ（固形腫瘍モデル）および図７Ｄ（全身性腫瘍モデル）に示す。固形腫瘍モデルにおいて、カリパスを用いた腫瘍の最も長い幅および長さの測定により、腫瘍の面積を決めた。クライオアブレーション（ｃｒｙａｂｌａｔｉｏｎ）による左側の腫瘍の完全なアブレーション（ａｂｌａｔｉｏｎ）の後、反対側にある未処置の腫瘍塊だけを測定した。反対側のみの腫瘍増殖曲線、ならびにクライオアブレーション（ｃｒｙｏｂｌａｔｉｏｎ）および腫瘍内への同種異系のＴｈ１の組み合わせ（ｃｒｙｏ＋Ｔｈ１）で処置されたマウス。組み合わせ治療を用いて処置されたマウスの４０％は、腫瘍の証拠なく生存した。反対側にある腫瘍の面積は、生存した４０％のマウスおよび結局疾患で死んだ６０％の、応答を別々に示すように提示されている。反対側にある腫瘍の増殖は、結局疾患で死んだ、６０％のマウスにおいて有意に抑制された（ｐ＜０．０１）。全身性腫瘍モデル（図７Ｄ）において、腫瘍内への同種異系のＴｈ１細胞のみで処置されたマウスは平均２８日生存した。この生存は平均１９日生存した対照マウスより有意に長かった（ログランク：ｐ＜０１０００１；ハザード比＝４．２９１）。ｃｒｙｏ＋Ｔｈ１で処置されたマウスの４０％は９０日より長く生存した。

本発明は好ましい実施態様を参照して記載されてきたが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく形態および詳細において変更が行われ得ることを当業者は認識する。

Claims (6)

1. 疾患に対して感受性がある患者、または、該疾患の症状を示していない患者において循環中のＴｈ１細胞の数を増加させることによって該疾患を予防するために、該疾患に対して感受性がある患者、または、該疾患の症状を示していない患者をプライミングするための医薬の製造における、同種異系のＴｈ１記憶細胞を含有する組成物の使用であって、該医薬は、該疾患に関連する１つまたはそれより多い抗原と組み合わせて投与されることを特徴とし、該疾患ががんであり、該抗原が凍結融解され不活化された腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解産物である、使用。
2. 前記抗原が、前記医薬の投与と同時に、別々に、または該医薬の投与後に投与されることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
3. 前記抗原が前記同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞と組み合わせられる、請求項１に記載の使用。
4. 疾患を予防するために、該疾患に対して感受性がある患者、または、該疾患の症状を示していない患者をプライミングするための組成物であって、同種異系のＴｈ１記憶細胞を含有し、該組成物は、該患者において循環中のＴｈ１細胞の数を増加させ、該組成物は、該疾患に関連する１つまたはそれより多い抗原と組み合わせて投与されることを特徴とし、該疾患ががんであり、該抗原が凍結融解され不活化された腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解産物である組成物。
5. 同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞を含有する組成物、および該疾患に関連する１つまたはそれより多い抗原を含有する組成物を含む、疾患を予防するために、該疾患に対して感受性がある患者、または、該疾患の症状を示していない患者をプライミングするための組み合わせ医薬であって、該組み合わせ医薬は、投与されると、該患者において循環中のＴｈ１細胞の数を増加させ、該疾患ががんであり、該抗原が凍結融解され不活化された腫瘍細胞または腫瘍細胞溶解産物である、組み合わせ医薬。
6. 前記抗原が、前記同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞の投与と同時に、別々に、または該同種異系の活性化Ｔｈ１記憶細胞の投与後に投与されることを特徴とする、請求項５に記載の組み合わせ医薬。

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