WO2016097399A1 - Rastermikroskop - Google Patents

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WO2016097399A1
WO2016097399A1 PCT/EP2015/080724 EP2015080724W WO2016097399A1 WO 2016097399 A1 WO2016097399 A1 WO 2016097399A1 EP 2015080724 W EP2015080724 W EP 2015080724W WO 2016097399 A1 WO2016097399 A1 WO 2016097399A1
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image sensor
illumination beam
scanning
sample
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PCT/EP2015/080724
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Jonas FÖLLING
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Leica Microsystems Cms Gmbh
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Definitions

  • the invention relates to a scanning microscope with a lens that focuses an illumination beam on an object, a lens element upstream grid element, which is adjustable for time-varying deflection of the illumination beam to guide the focused illumination beam in a raster motion over the object, and a
  • Image sensor on which the lens possibly in connection with further optics one
  • Illuminated beam illuminated object emanates, wherein the image sensor has a plurality of individually readable by a control sensor elements over which the detection beam is guided in a movement corresponding to the raster movement of the focused illumination beam.
  • At least one illumination beam is focused onto a sample by means of an objective.
  • the objective is preceded by a raster element (such as, for example, one or more movable mirrors, an AOD, ie an Acousto Optical Deflector or the like), which deflects the illumination beam in such a way that that this on the sample the desired
  • the grid element comprises one or more mirrors whose tilting movement is converted by the optical imaging into a lateral movement of the light spot generated on the sample by the illumination beam.
  • the focused illumination beam thus scans the sample point by point.
  • the detection light emanating from the sample is then detected for each halftone dot. Finally, the detection signal thus detected is assembled into an image in a computing unit.
  • microscopy In the field of scanning microscopy confocal microscopy represents a particularly preferred microscopy method. The basic operation of this
  • the confocal microscope 10 has a light source, not shown in FIG.
  • Illuminating beam 12 on a dichroic beam splitter mirror 14 emits.
  • the beam splitter mirror 14 is designed to emit light at the wavelength of the
  • Illuminating beam 12 lets through.
  • the illumination beam 12 thus passes through the
  • Beam splitter mirror 14 and falls on a scanning mirror 16.
  • a scanning mirror 16 As in Figure 1 by the
  • the Abtastspiegel 16 is tilted. Due to the tilting movement of the scanning mirror 16, the illumination beam 12 is corresponding to the desired
  • the illumination beam 12 After reflection on the scanning mirror 16, the illumination beam 12 passes through a
  • the objective 22 finally focuses the illumination beam 12 onto a sample 24.
  • the tilting movement of the scanning mirror 16 causes the focused image to scan
  • Illumination beam 12 scans the sample 24 point by point.
  • the latter is designed to reflect light at the wavelength of the detection beam 26.
  • the beam splitter mirror 14 directs the
  • Detection beam 26 thus on a lens 28, which focuses the detection beam 26 on a confocal aperture plate 30.
  • a pinhole 30 is from the
  • Detection beam 26 filtered out all the light that comes from areas of the sample 24, which originates outside the light spot generated by the illumination beam 12 on the sample 24.
  • the light emanating from the sample 24 can thus be detected for each individual grid point and the detection signal thus generated can be combined to form an image.
  • An essential feature of the confocal microscope 10 according to FIG. 1 in the present context is that the detection beam 26 emanating from the sample 24 is directed back to the scanning mirror 16, so that the detection beam 26 is influenced in the same way by the scanning mirror 16 As a result, the detection beam 26 is fixedly incident on the image sensor 32, while the illumination beam 12 is detected by the scanning movement of the scanning mirror 16
  • the scanning mirror 16 in the confocal microscope according to FIG. 1 is arranged in a plane 36 which is one of those designated 38 in FIG. 1
  • Object level represents optically conjugate level.
  • Figure 1 are also a Intermediate image plane 40 and 42 shown.
  • the intermediate image plane 40 corresponds optically to the plane 36 and is optically conjugate to the object plane 38.
  • the intermediate image plane 42 corresponds optically to the object plane 38 and is optically conjugate to the plane 36.
  • the detection light can be divided into different detection channels as differentiated as possible by wavelength. This is necessary, for example, in order to separate the detection signals originating from different dyes as well as possible from each other.
  • different conditions in the sample can be detected by variations in the emission spectrum of a dye. If these variations can be measured by a well-resolved spectral detection, the user can reconstruct the different conditions in the sample.
  • FIG. 2 shows the confocal microscope 10 in a modification which permits spectral detection.
  • a dispersive element 44 is provided in the beam path downstream of the pinhole diaphragm 30, which decomposes the detection beam 26 into its different spectral components and supplies these components to the image sensor 32.
  • the image sensor 32 has a multiplicity of sensor elements which can be individually read out via a controller 34.
  • the various spectral components are illustrated in FIG. 2 by partial beams 26-1 to 26-7.
  • the dispersive element 44 is preceded by a converging lens 46, which bundles the detection beam 26 passing through the perforated diaphragm 30 onto the dispersive element 44.
  • the modification according to FIG. 2 utilizes the descanning principle used in the confocal microscope 10. Since the detection beam 26 leaves the pinhole 30 as a stationary beam, the various spectral components of the
  • Detection beam 26 regardless of the currently imaged grid point on the sample 24 by the dispersive element 44 spatially separated from each other in the manner illustrated in Figure 2. For example, via a diaphragm not shown in FIG. 2, exactly the spectral component of interest can then be filtered out of the detection beam 26 and supplied to the image sensor 32.
  • FIG. 3 shows a multiphoton microscope 50 in which a light source, not shown an illumination beam 52 on a tiltable Scanning mirror 54, on which the illumination beam 52 is reflected and then passes through a scanning lens 56 of focal length f3, a tube lens 58 of focal length f2, a dichroic beam splitter mirror 60 and finally a lens 62 of focal length f1 to focus on a sample 64 ,
  • a detection beam 66 emanating from the sample 64 illuminated with the focused illumination beam 52 passes back into the objective 62 and is then directed by the dichroic mirror 60 to an image sensor 68 which is coupled to a controller 70.
  • the scanning mirror 54 is located in a plane 72 which is optically conjugate to an image plane 74 in which the sample 64 is located.
  • FIG 3 further levels 76 and 78 are shown.
  • the level 76 represents a
  • Object level 74 corresponds and is optically conjugate to the level 72.
  • the detection beam 66 varies both in its angle of incidence and in its incidence on the image sensor 70 when the illumination beam 52 performs its raster motion on the sample 64.
  • the spectral detection according to FIG. 2 is therefore not applicable to the confocal microscope 50 according to FIG. 3, which operates on the non-descanned principle.
  • the object of the invention is a scanning microscope of the type mentioned so
  • the invention solves this problem by the scanning microscope with the features of claim 1.
  • a dispersive element of predetermined dispersion effect which separates the different spectral components of the detection beam spatially from one another on the image sensor, is provided in the scanning microscope.
  • the controller detects the time-varying adjustment of the raster element, assigns the spatially separated spectral components of the detection beam in consideration of this adjustment, the sensor elements of the image sensor taking into account the
  • the solution according to the invention provides for the spatial splitting of the detection beam, which is caused by the spectral separation by means of the dispersive element, to be separated from the spatial movement of the detection beam which is effected by the grid element.
  • the controller detects the present adjustment of the raster element, that is, for example, the tilt angle of a raster element forming the raster element
  • Scanning mirror assembly which may be formed of one or more mirrors.
  • the controller also takes into account the previously known dispersion effect of the dispersive element. Based on this information, namely the adjustment of the
  • dispersion effect of the dispersive element it may for example be kept in a memory, which is accessed by the controller, to the
  • the dispersive element is disposed in a plane that is optically conjugate to a plane in which the sample is disposed.
  • Element is preferably optically equivalent to a plane in which the grid element is arranged.
  • optically equivalent is meant in this context that the two said planes correspond in a manner to each other optically, that the spatial variation of the illumination beam at the location of the grid element is translated into a corresponding spatial variation of the detection beam at the location of the dispersive element the spatial variation of the illumination beam at the location of the raster element in that the illumination beam varies in its angle of incidence, but not in its incident position, this also applies to the detection beam at the location of the dispersive element, ie also the detection beam varies its angle of incidence, but not its If the said optical equivalence is given in this sense, then it is particularly easy to realize the dispersive element suitably, since the incidence position of the detection beam at the dispersive element does not change.
  • the raster element guides the illumination beam in a first
  • the raster element is a single mirror that is rotated about a fixed axis to move the illumination beam preferably straight across the sample in the first scanning direction.
  • the grid element can additionally illuminate the illumination beam in one of the first
  • the raster element comprises, for example, two separate scanning mirrors, of which a first mirror, the raster movement in the first scanning direction and the second scanning mirror, the raster movement in the second
  • Scanned direction causes. However, it may also be provided a single scanning mirror, which is moved in both scanning directions.
  • the one scanning direction in which the illumination beam on the sample moves faster than in the other scanning direction will be referred to simply as a fast scanning direction. Accordingly, the other direction is referred to as a slow scan direction.
  • the dispersion effect of the dispersive element is predetermined such that the spectral components of the detection beam are spatially separated on the image sensor in a direction perpendicular to a direction in which the detection beam is passed over the image sensor when the illumination beam in the first Scanning over the sample is performed.
  • the dispersion effect of the dispersive element is predetermined such that the spectral components of the detection beam are spatially separated on the image sensor in a direction perpendicular to a direction in which the detection beam is passed over the image sensor when the illumination beam in the first Scanning over the sample is performed.
  • the dispersive element generates a "spectral fan" in which the spectral information is encoded in an angle information
  • the vertex of the scan angle of the raster element is preferably in the plane optically conjugate to the object plane, at the same time the scan angle is superimposed on the angle of the spectral splitting with respect to the slow scan direction, which means that in this embodiment the above-mentioned spectral fan is around that in the slow scan direction
  • the spectral fan tilts back and forth with the scan angle relative to the fast scan direction, and the tilting motion in the fast scan direction is perpendicular to the tilt egung in the slow
  • the dispersive element is located between the dispersive element and the image sensor detection optics, which bundles the spectrally split by the dispersive detection beam at each adjustment of the grid element in its entirety on the image sensor. Since it is to be ensured at all times that the detection beam, which performs a movement corresponding to the raster movement of the illumination beam on the image sensor and is also fanned out spatially by the dispersive element, falls in its entirety onto the image sensor, contributes a bundling detection optics of the aforementioned type at, not to let the image sensor too big.
  • the detection optics is a lens in whose focal plane the dispersive element is arranged.
  • Such an embodiment can be selected in particular when the image sensor is an area sensor.
  • the detection optics can also be designed to spectrally split
  • Detection beam at each adjustment of the locking element along a predetermined line to focus on the image sensor Detection beam at each adjustment of the locking element along a predetermined line to focus on the image sensor.
  • a line sensor can be used as the image sensor.
  • the detection optics comprises a crossed arrangement of three cylindrical lenses, the middle cylindrical lens of which
  • the spectrally split detection beam can be particularly easily bundled on a line sensor independently of the currently present adjustment of the raster element.
  • the controller may be configured to select at least one of the spectral components and to read only those sensor elements which are assigned to this selected spectral component. This allows a particularly efficient spectral detection.
  • the dispersive element is, for example, a prism or a grating. However, it is not limited to such embodiments.
  • an acousto-optical component such as an AOTF can also be used as a dispersive element.
  • the solution according to the invention can be used profitably in any type of scanning microscope, but in particular in microscopes that work according to the non-descanned method, ie in which the detection beam is coupled to the image sensor before it reaches the grid element.
  • a particularly preferred application is in multiphoton microscopy, in contrast to the confocal microscopy in favor of an improved signal-to-noise ratio is omitted, due to the detection beam to the grid element and then to pass through a pinhole. So will the
  • Multiphoton microscopy often used in strongly scattering samples. As a result, the detection light is scattered so much that it no longer seems to originate from the central focus area. Nevertheless, this light should be captured by the image sensor to achieve a better detection signal.
  • the invention provides a method for scanning microscopic imaging of a sample with the features of claim 15.
  • Figure 1 is a schematic representation of a conventional confocal microscope
  • FIG. 2 shows an embodiment of the confocal microscope according to FIG. 1 modified for the purpose of spectral detection
  • Figure 3 is a schematic representation of a conventional multiphoton microscope
  • Figure 4 is a schematic representation of an embodiment of the scanning microscope according to the invention.
  • Figure 5 is a schematic representation of a usable in the scanning microscope of the invention detection optics in various modifications.
  • FIG. 6 shows the detection optics according to FIG. 5 in another sectional view.
  • FIG. 4 shows a purely schematic representation of a scanning microscope 100, which operates on the non-descanned principle.
  • a light source not shown in FIG. 4 emits an illumination beam 102 onto a scanning mirror 104.
  • the scanning mirror 104 can be tilted for variable deflection of the illumination beam 102.
  • a first tilted position with a solid line and a second tilted position with a dashed line are shown purely schematically. Accordingly, in the beam path downstream of the
  • the reflected on the scanning mirror 104 illumination beam passes successively a scanning lens 106 of the focal length f3, a tube lens 108 of focal length f2, a dichroic beam splitter mirror 1 10 and an objective 1 12 of the focal length f 1, which focuses the illumination beam 102 on a sample 1 15.
  • a scanning lens 106 of the focal length f3 a tube lens 108 of focal length f2
  • a dichroic beam splitter mirror 1 10 and an objective 1 12 of the focal length f 1
  • an objective 1 12 of the focal length f 1 which focuses the illumination beam 102 on a sample 1 15.
  • two grid points are shown in Figure 4, in which the focused by the lens 1 12 illumination beam 102 converges respectively.
  • the dichroic beam splitter mirror 1 10 is designed so that it with the light Wavelength of the illumination or excitation beam 102, however, reflects light with the wavelength of the detection or fluorescence beam 1 14th
  • the detection beam 1 14 at the location of the dichroic beam splitter mirror 1 10 is coupled out of the beam path of the illumination beam 102.
  • the detection beam 1 14 is shown in Figure 4 for the two tilted positions of the scanning mirror 104 with a solid line and a dashed line.
  • the detection beam 1 14 After reflection at the dichroic beam splitter mirror 1 10, the detection beam 1 14 passes through two lenses 1 16, 1 18 and then falls on a dispersive element 120, which is arranged upstream of an image sensor 122.
  • the image sensor 122 has a plurality of
  • Sensor elements 124 which are individually readable by a controller 126.
  • the dispersive element 120 is arranged in an intermediate image plane 128, which is optically equivalent to a plane 130 in which the scanning mirror 104 is located.
  • Intermediate image plane 128 is also optically conjugate to one in FIG. 4 with 132
  • intermediate image plane 134 is a
  • the intermediate image plane 136 is optically equivalent to the object plane 132 and optically conjugate to the plane 130.
  • the detection beam 1 14 varies with tilting of the scanning mirror 104 only in its
  • the spatial variation of the detection beam 1 14 at the location of the dispersive element 120 corresponds to the extent of the spatial variation of the illumination beam 102 at the location of the scanning mirror 104.
  • the detection beam 1 14 is thus at the location of the dispersive element 120 stationary.
  • the dispersive element 120 has a predetermined dispersion effect, which results in the detection beam 1 14 being split into its different spectral components.
  • the spectral components are in the representation of Figure 4 in the form of partial beams 1 14-1 bis 1 14-7 illustrates. Again, the partial beams 1 14-1 to 1 14-7 for the two tilt positions of the scanning mirror 104 shown in FIG. 4 are shown once with solid lines and once with dashed lines.
  • the sub-beams 1 14-1 to 1 14-7 quasi form a spectral fan in which the spectral information in a
  • Angle information is encoded. This angle information is given by the angles at which the various sub-beams 1 14-1 to 1 14-7 emerge from the dispersive element 120 and then strike the individual sensor elements 124 of the image sensor 122.
  • the illumination beam 102 is intended to scan the sample 15 in two mutually perpendicular scanning directions. The sampling is done in one
  • the two scanning directions are translated in two respective directions on the image sensor 122. These respective directions are hereinafter also referred to as scanning directions for the sake of simplicity.
  • the dispersive element 120 is designed so that the plane in which the detection beam 14 is spectrally split by the dispersive element 120 lies parallel to the slow scanning direction.
  • the plane of the spectral splitting in the representation according to FIG. 4 is given by the plane of the drawing.
  • the spectral fan formed by the dispersive element 120 formed of the sub-beams 1 14-1 to 1 14-7 moves in the drawing plane when the scanning mirror 14 is moved in the slow scanning direction. At the same time he tilts through the
  • Partial beams 1 14-1 to 1 14-7 formed spectral fan in the fast scanning direction perpendicular to the plane of Figure 4, when the scanning mirror in the fast
  • the controller 126 detects the present tilting of the scanning mirror 104 and determines therefrom, taking into account the predetermined dispersive effect of the dispersive element 120 those sensor elements 124, just a spectral portion of the detection beam to be considered. 1 14 in the form of one of the partial beams 1 14-1 to 1 14-7 received. These sensor elements 124 then read out the controller 126 at the respective time, at which time the spectral component of the
  • FIG. 5 shows, in a purely schematic representation, a detection optics 140 which is arranged between the dispersive element 120 and the image sensor 122.
  • Embodiment of Figure 4 can be supplemented by the detection optics 140.
  • the detection optics 140 is formed solely from a converging lens 142, which has a focal plane 144.
  • the converging lens 142 focuses the partial beams 1 14-1 to 1 14-7 corresponding to the spectral portions of the detection beam 1 14 onto the image sensor 122 so that they fall perpendicularly onto the image sensor 122.
  • the detection beam 1 14 split into the partial beams 1 14-1 to 1 14-7 in the x-z plane moves in the x-direction when the illumination beam 102 scans the sample 15 in the slow scanning direction.
  • it moves on the image sensor 122 in the y direction when the illumination beam 102 scans the sample 15 in the fast scanning direction.
  • the image sensor 122 is preferably formed as a surface sensor due to the above-described movements of the detection beam 1 14, in which the individual sensor elements 124 are arranged like a matrix in rows (x-direction) and columns (y-direction). Since the sensor elements 124 arranged in a certain column (y-direction) each receive the same spectral component, the signals read out from the sensor elements 124 of this column can be integrated in the spectral detection.
  • a line sensor may also be used as the image sensor 122.
  • the detection optics 140 is configured to focus the sub-beams 1 14-1 to 1 14-7 on a single line. This can be realized, for example, with an arrangement of three cylindrical lenses. Also for the embodiment is in
  • the lens 142 is designed as a cylindrical lens which has an effect on the detection beam 1 14 passing through it only in the x-z plane.
  • two further cylindrical lenses 144 and 146 are provided, of which the lens 144 is upstream and the lens 146
  • the cylindrical lenses 144 and 146 are arranged with their cylinder axes perpendicular to the central cylindrical lens 142.
  • the cylindrical lenses 144 and 146 influence the passing through them detection beam 1 14 refractive effect only in the yz plane, as the representation of Figure 6 illustrates that shows a yz-section through the detection optics 140.
  • the lenses shown in dashed lines thus act only on the axis oriented perpendicular to the plane of the drawing.
  • the lens spacings can be achieved so that the detection beam 1 14, which passes through this crossed arrangement of the cylindrical lenses 142, 144, 146, in the y direction only in its angle of incidence, not but varies in its incidence position. This allows the use of a line sensor, ie a single-line detector, which detects the total amount of light at all times.

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Abstract

Beschrieben ist ein Rastermikroskop (100) mit einem Objektiv (112), das einen Beleuchtungsstrahl (102) auf eine Probe (115) fokussiert, einem dem Objektiv (112) vorgeordneten Rasterelement (104), das zur zeitlich veränderlichen Ablenkung des Beleuchtungsstrahls (102) verstellbar ist, um den fokussierten Beleuchtungsstrahl (102) in einer Rasterbewegung über die Probe (115) zu führen, und einem Bildsensor (122), auf den das Objektiv (112) einen Detektionsstrahl (114) fokussiert, der von der mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl (102) beleuchteten Probe (115) ausgeht. Der Bildsensor (122) weist mehrere durch eine Steuerung (126) einzeln auslesbare Sensorelemente (124) auf, über die der Detektionsstrahl (114) in einer der Rasterbewegung des fokussierten Beleuchtungsstrahls (102) entsprechenden Bewegung geführt wird. Es ist ein dispersives Element (120) vorbestimmter Dispersionswirkung vorgesehen, das verschiedene spektrale Anteile des Detektionsstrahl (114) auf dem Bildsensor (122) räumlich voneinander trennt. Die Steuerung (126) erfasst die zeitlich veränderliche Verstellung des Rasterelementes (104), ordnet in Abhängigkeit dieser Verstellung den Sensorelementen (124) des Bildsensors (122) die spektralen Anteile des Detektionsstrahls (114) unter Berücksichtigung der vorbestimmten Dispersionswirkung des dispersiven Elementes (120) zu und liest die den jeweiligen spektralen Anteilen zugordneten Sensorelemente (124) aus.

Description

Rastermikroskop
Die Erfindung betrifft ein Rastermikroskop mit einem Objektiv, das einen Beleuchtungsstrahl auf ein Objekt fokussiert, einem dem Objektiv vorgeordneten Rasterelement, das zur zeitlich veränderlichen Ablenkung des Beleuchtungsstrahls verstellbar ist, um den fokussierten Beleuchtungsstrahl in einer Rasterbewegung über das Objekt zu führen, und einem
Bildsensor, auf den das Objektiv ggf. im Zusammenhang mit weiterer Optik einen
Detektionsstrahl abbildet bzw. fokussiert, der von dem mit dem fokussierten
Beleuchtungsstrahl beleuchteten Objekt ausgeht, wobei der Bildsensor mehrere durch eine Steuerung einzeln auslesbare Sensorelemente aufweist, über die der Detektionsstrahl in eine der Rasterbewegung des fokussierten Beleuchtungsstrahls entsprechenden Bewegung geführt wird.
In der Rastermikroskopie wird mindestens ein Beleuchtungsstrahl mittels eines Objektivs auf eine Probe fokussiert. Um den Beleuchtungsstrahl in einer Raster- oder Abtastbewegung über die Probe zu führen, ist dem Objektiv ein Rasterelement (wie z.B. einen oder mehrere bewegliche Spiegel, ein AOD, d.h. ein Acousto Optical Deflector o.ä.) vorgeordnet, das den Beleuchtungsstrahl derart ablenkt, dass dieser auf der Probe die gewünschte
Rasterbewegung ausführt. Üblicherweise umfasst das Rasterelement einen oder mehrere Spiegel, deren Kippbewegung durch die optische Abbildung in eine laterale Bewegung des auf der Probe durch den Beleuchtungsstrahl erzeugten Lichtpunktes umgesetzt wird. Der fokussierte Beleuchtungsstrahl rastert so die Probe Punkt für Punkt ab. Das von der Probe ausgehende Detektionslicht wird dann für jeden Rasterpunkt detektiert. Schließlich wird das so erfasste Detektionssignal in einer Recheneinheit zu einem Bild zusammengesetzt.
Auf dem Gebiet der Rastermikroskopie stellt die Konfokalmikroskopie ein besonders bevorzugtes Mikroskopieverfahren dar. Die grundlegende Funktionsweise dieses
Mikroskopieverfahrens wird im Folgenden unter Bezugnahme auf Figur 1 erläutert, in der ein allgemein mit 10 bezeichnetes Konfokalmikroskop rein schematisch dargestellt ist.
Das Konfokalmikroskop 10 hat eine in Figur 1 nicht gezeigte Lichtquelle, die einen
Beleuchtungsstrahl 12 auf einen dichroitischen Strahlteilerspiegel 14 aussendet. Der Strahlteilerspiegel 14 ist so ausgeführt, dass er Licht mit der Wellenlänge des
Beleuchtungsstrahls 12 durchlässt. Der Beleuchtungsstrahl 12 geht somit durch den
Strahlteilerspiegel 14 und fällt auf einen Abtastspiegel 16. Wie in Figur 1 durch den
Doppelpfeil angedeutet, ist der Abtastspiegel 16 kippbar. Durch die Kippbewegung des Abtastspiegels 16 wird der Beleuchtungsstrahl 12 entsprechend der gewünschten
Rasterbewegung abgelenkt. Nach Reflexion an dem Abtastspiegel 16 tritt der Beleuchtungsstrahl 12 durch eine
Abtastlinse 18 der Brennweite f3, eine Tubuslinse 20 der Brennweite f2 und ein Objektiv 22 der Brennweite f1 . Das Objektiv 22 fokussiert den Beleuchtungsstrahl 12 schließlich auf eine Probe 24. Durch die Kippbewegung des Abtastspiegels 16 rastert der fokussierte
Beleuchtungsstrahl 12 die Probe 24 Punkt für Punkt ab.
Ein in Figur 1 mit 26 bezeichneter Detektionsstrahl, der von einem mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl 12 beleuchteten Rasterpunkt ausgeht, gelangt zurück in das Objektiv 22 und durchläuft den vorstehend beschriebenen Strahlengang in entgegengesetzter Richtung, bis er auf den Strahlteilerspiegel 14 fällt. Letzterer ist so ausgebildet, dass er Licht mit der Wellenlänge des Detektionsstrahls 26 reflektiert. Der Strahlteilerspiegel 14 lenkt den
Detektionsstrahl 26 somit auf eine Linse 28, die den Detektionsstrahl 26 auf eine konfokal angeordnete Lochblende 30 fokussiert. Durch die Lochblende 30 wird aus dem
Detektionsstrahl 26 sämtliches Licht herausgefiltert, das aus Bereichen der Probe 24 stammt, die außerhalb des durch den Beleuchtungsstrahl 12 auf der Probe 24 erzeugten Lichtpunktes stammt. Das Licht, das die Lochblende 30 passiert, gelangt schließlich auf einen Bildsensor 32, der sich über eine Steuerung 34 auslesen lässt. Das von der Probe 24 ausgehende Licht kann so für jeden einzelnen Rasterpunkt detektiert und das so erzeugte Detektionssignal zu einem Bild zusammengesetzt werden.
Ein für das Konfokalmikroskop 10 nach Figur 1 im vorliegenden Kontext wesentliches Merkmal ist nun darin zu sehen, dass der von der Probe 24 ausgehende Detektionsstrahl 26 zurück auf den Abtastspiegel 16 geleitet wird, so dass der Detektionsstrahl 26 durch den Abtastspiegel 16 in gleicher Weise beeinflusst wird wie der Beleuchtungsstrahl 12. Dies hat zur Folge, dass der Detektionsstrahl 26 ortsfest auf den Bildsensor 32 fällt, während der Beleuchtungsstrahl 12 durch die Abtastbewegung des Abtastspiegels 16 eine
Rasterbewegung auf der Probe 24 ausführt. Der Detektionsstrahl 26 wird durch diese
Rückführung auf den Abtastspiegel 16 auf dem Bildsensor 32 gleichsam stationär gehalten. Stationär bedeutet in diesem Zusammenhang, dass zwar der Einfallswinkel, unter dem der Detektionsstrahl 26 auf den Bildsensor 32 fällt, variieren kann (im Ausführungsbeispiel gemäß Figur 1 ist dieser Einfallswinkel stationär), nicht jedoch der Ort des Lichteinfalls. Das Prinzip, den Detektionsstrahl 26 durch Rückführung auf das Rasterelement 16 auf dem Bildsensor 32 in vorstehend erläutertem Sinne stationär zu halten, wird auf dem
vorliegenden technischen Gebiet auch als„descanning" bezeichnet. Um ein solches „descanning" zu ermöglichen, ist bei dem Konfokalmikroskop nach Figur 1 der Abtastspiegel 16 in einer Ebene 36 angeordnet, die eine zu der in Figur 1 mit 38 bezeichneten
Objektebene optisch konjugierte Ebene darstellt. In Figur 1 sind ferner eine Zwischenbildebene 40 und 42 dargestellt. Die Zwischenbildebene 40 entspricht optisch der Ebene 36 und ist zur Objektebene 38 optisch konjugiert. Die Zwischenbildebene 42 entspricht optisch der Objektebene 38 und ist optisch konjugiert zur Ebene 36.
Für viele Anwendungen in der Mikroskopie ist es nun wichtig, eine möglichst kontinuierlich variable spektrale Detektion zu ermöglichen. Dies bedeutet, dass das Detektionslicht möglichst beliebig nach Wellenlängen differenziert in verschiedene Detektionskanäle unterteilt werden kann. Dies ist beispielsweise nötig, um die von verschiedenen Farbstoffen herrührenden Detektionssignale möglichst gut voneinander zu trennen. Ebenso lassen sich unterschiedliche Bedingungen in der Probe durch Variationen im Emissionsspektrum eines Farbstoffes erkennen. Sind diese Variationen durch eine gut aufgelöste spektrale Detektion messbar, so kann der Anwender die unterschiedlichen Bedingungen in der Probe rekonstruieren.
Eine solche Spektraldetektion ließe sich bei einem Konfokalmikroskop der in Figur 1 gezeigten Art vergleichsweise einfach realisieren. Hierzu wird auf Figur 2 verwiesen, die das Konfokalmikroskop 10 in einer Abwandlung zeigt, die eine Spektraldetektion ermöglicht. Bei der Abwandlung nach Figur 2 ist in dem Strahlengang lichtstromabwärts der Lochblende 30 ein dispersives Element 44 vorgesehen, das den Detektionsstrahl 26 in seine verschiedenen spektralen Anteile zerlegt und diese Anteile dem Bildsensor 32 zuführt. Der Bildsensor 32 weist eine Vielzahl von Sensorelementen auf, die sich über eine Steuerung 34 einzeln auslesen lassen. Die verschiedenen spektralen Anteile sind in Figur 2 durch Teilstrahlen 26- 1 bis 26-7 veranschaulicht. Dem dispersiven Element 44 ist eine Sammellinse 46 vorgeordnet, die den durch die Lochblende 30 tretenden Detektionsstrahl 26 auf das dispersive Element 44 bündelt.
Die Abwandlung nach Figur 2 macht sich das in dem Konfokalmikroskop 10 angewandte descanning-Prinzip zunutze. Da nämlich der Detektionsstrahl 26 die Lochblende 30 als stationärer Strahl verlässt, lassen sich die verschiedenen spektralen Anteile des
Detektionsstrahls 26 ungeachtet des gerade abgebildeten Rasterpunktes auf der Probe 24 durch das dispersive Element 44 leicht in der in Figur 2 veranschaulichten Weise räumlich voneinander trennen. Beispielsweise über eine in Figur 2 nicht gezeigte Blende kann dann exakt der interessierende spektrale Anteil aus dem Detektionsstrahl 26 herausgefiltert und dem Bildsensor 32 zugeführt werden.
Anders verhält es sich bei dem sogenannten„non-descanned"-Prinzip, wie es auf dem Gebiet der Fluoreszenzmikroskopie etwa bei einem Multiphotonenmikroskop in der in Figur 3 veranschaulichten Art zur Anwendung kommt. Figur 3 zeigt ein Multiphotonenmikroskop 50, bei dem eine nicht gezeigte Lichtquelle einen Beleuchtungsstrahl 52 auf einen kippbaren Abtastspiegel 54 richtet, an dem der Beleuchtungsstrahl 52 reflektiert wird und anschließend durch eine Abtastlinse 56 der Brennweite f3, eine Tubuslinse 58 der Brennweite f2, einen dichroitischen Strahlteilerspiegel 60 und schließlich ein Objektiv 62 der Brennweite f1 tritt, um auf eine Probe 64 fokussiert zu werden. Ein Detektionsstrahl 66, der von der mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl 52 beleuchteten Probe 64 ausgeht, gelangt zurück in das Objektiv 62 und wird dann durch den dichroitischen Spiegel 60 auf einen Bildsensor 68 gerichtet, der mit einer Steuerung 70 gekoppelt ist. Der Abtastspiegel 54 befindet sich in einer Ebene 72, die optisch konjugiert zu einer Bildebene 74 ist, in der sich die Probe 64 befindet. In Figur 3 sind weitere Ebenen 76 und 78 gezeigt. Die Ebene 76 stellt eine
Zwischenbildebene dar, die optisch der Ebene 72 entspricht und zur Objektebene 74 optisch konjugiert ist. Die Ebene 78 ist wiederum eine Zwischenbildebene, die optisch der
Objektebene 74 entspricht und zur Ebene 72 optisch konjugiert ist.
Im Unterschied zum Konfokalmikroskop 10 nach den Figuren 1 und 2 wird bei dem
Multiphotonenmikroskop 50 der Detektionsstrahl 66 durch den dichroitischen
Strahlteilerspiegel 60 aus dem auf den Abtastspiegel 54 führenden Strahlengang
ausgekoppelt und direkt dem Bildsensor 70 zugeführt, bevor er den Abtastspiegel 54 erreicht. Dementsprechend variiert der Detektionsstrahl 66 sowohl in seinem Einfallswinkel als auch in seinem Einfallsort auf dem Bildsensor 70, wenn der Beleuchtungsstrahl 52 seine Rasterbewegung auf der Probe 64 ausführt. Die spektrale Detektion nach Figur 2 ist somit auf das Konfokalmikroskop 50 nach Figur 3, das nach dem non-descanned-Prinzip arbeitet, nicht anwendbar.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein Rastermikroskop eingangs genannter Art so
weiterzubilden, dass es eine einfache und zuverlässige spektrale Detektion eines auf einen Bildsensor fallenden Detektionsstrahls ermöglicht.
Die Erfindung löst diese Aufgabe durch das Rastermikroskop mit den Merkmalen des Anspruchs 1 .
Erfindungsgemäß ist in dem Rastermikroskop ein dem Bildsensor vorgeordnetes dispersives Element vorbestimmter Dispersionswirkung vorgesehen, das verschiedene spektrale Anteile des Detektionsstrahls auf dem Bildsensor räumlich voneinander trennt. Die Steuerung erfasst die zeitlich veränderliche Verstellung des Rasterelementes, ordnet in Abhängigkeit dieser Verstellung den Sensorelementen des Bildsensors die räumlich voneinander getrennten spektralen Anteile des Detektionsstrahl unter Berücksichtigung der
vorbestimmten Dispersionswirkung des dispersiven Elementes zu und liest die den jeweiligen spektralen Anteilen zugeordneten Sensorelemente aus, um die spektral aufgelöste Erfassung des Detektionsstrahls zu ermöglichen. Die erfindungsgemäße Lösung sieht vor, die räumliche Aufspaltung des Detektionsstrahls, die durch die spektrale Trennung mithilfe des dispersiven Elementes bewirkt wird, von der räumlichen Bewegung des Detektionsstrahls zu trennen, die von dem Rasterelement bewirkt wird. Hierzu erfasst die Steuerung die gerade vorliegende Verstellung des Rasterelementes, also beispielsweise den oder die Kippwinkel einer das Rasterelement bildenden
Abtastspiegelanordnung, die aus einem oder mehreren Spiegeln gebildet sein kann. Die Steuerung berücksichtigt ferner die vorbekannte Dispersionswirkung des dispersiven Elementes. Anhand dieser beiden Informationen, nämlich der Verstellung des
Rasterelementes und der Dispersionswirkung des dispersiven Elementes, ist es der
Steuerung zu jedem Zeitpunkt möglich, eine exakte Zuordnung zwischen den
Sensorelementen und den verschiedenen spektralen Anteilen des auf den Bildsensor fallenden Detektionsstrahls vorzunehmen. Die Art und Weise, wie die Steuerung die zeitlich veränderliche Verstellung des Rasterelementes erfasst, ist in keiner Weise beschränkt. So ist es beispielsweise denkbar, dass das Rasterelement selbst eine entsprechende
Information beispielsweise über einen Winkelgeber direkt an die Steuerung ausgibt. Ebenso kann aber auch ein eigener Sensor vorgesehen sein, der die aktuelle Verstellung des Rasterelementes erfasst und der Steuerung mitteilt. Was die vorbekannte
Dispersionswirkung des dispersiven Elementes betrifft, so kann diese beispielsweise in einem Speicher vorgehalten werden, auf den die Steuerung zugreift, um die
Dispersionswirkung bei der spektralen Detektion in Anrechnung zu bringen.
Vorzugsweise ist das dispersive Element in einer Ebene angeordnet, die optisch konjugiert zu einer Ebene ist, in der die Probe angeordnet ist. Die Ebene, in der das dispersive
Element angeordnet ist, ist vorzugsweise optisch äquivalent zu einer Ebene, in der das Rasterelement angeordnet ist. Mit„optisch äquivalent" ist in diesem Kontext gemeint, dass die beiden genannten Ebenen in einer Weise einander optisch entsprechen, dass die räumliche Variation des Beleuchtungsstrahls am Ort des Rasterelementes in eine entsprechende räumliche Variation des Detektionsstrahls am Ort des dispersiven Elementes übersetzt wird. Besteht etwa die räumliche Variation des Beleuchtungsstrahls am Ort des Rasterelementes darin, dass der Beleuchtungsstrahl zwar in seinem Einfallswinkel, nicht jedoch in seiner Einfallsposition variiert, so gilt dies auch für den Detektionsstrahl am Ort des dispersiven Elementes, d.h. auch der Detektionsstrahl variiert seinen Einfallswinkel, nicht jedoch seine Einfallsposition. Ist in diesem Sinne die genannte optische Äquivalenz gegeben, so ist es besonders einfach, das dispersive Element geeignet zu realisieren, da sich die Einfallsposition des Detektionsstrahls am dispersiven Element nicht ändert. Vorzugsweise führt das Rasterelement den Beleuchtungsstrahl in einer ersten
Abtastrichtung über die Probe. In diesem Fall ist das Rasterelement beispielsweise ein einzelner Spiegel, der um eine feste Achse gedreht wird, um den Beleuchtungsstrahl vorzugsweise geradlinig in der ersten Abtastrichtung über die Probe zu bewegen.
Das Rasterelement kann den Beleuchtungsstrahl zusätzlich in einer zur ersten
Abtastrichtung senkrechten zweiten Abtastrichtung über die Probe führen, wobei die Bewegung des Beleuchtungsstrahls in der ersten Abtastrichtung schneller als in der zweiten Abtastrichtung ist. In dieser Ausführung umfasst das Rasterelement beispielsweise zwei separate Abtastspiegel, von denen ein erster Spiegel die Rasterbewegung in der ersten Abtastrichtung und der zweite Abtastspiegel die Rasterbewegung in der zweiten
Abtastrichtung bewirkt. Es kann jedoch ebenso ein einziger Abtastspiegel vorgesehen sein, der in beiden Abtastrichtungen bewegt wird. Diejenige Abtastrichtung, in der sich der Beleuchtungsstrahl auf der Probe schneller als in der anderen Abtastrichtung bewegt, wird im Folgenden einfach als schnelle Abtastrichtung bezeichnet. Dementsprechend wird die andere Richtung als langsame Abtastrichtung bezeichnet.
Vorzugsweise ist die Dispersionswirkung des dispersiven Elementes derart vorbestimmt, dass die spektralen Anteile des Detektionsstrahls auf dem Bildsensor in einer Richtung räumlich voneinander getrennt werden, die senkrecht zu einer Richtung ist, in die der Detektionsstrahl über den Bildsensor geführt wird, wenn der Beleuchtungsstrahl in der ersten Abtastrichtung über die Probe geführt wird. Bei dieser Ausgestaltung ist also die
Ebene, in der der Detektionsstrahl durch das dispersive Element spektral aufgespalten wird, parallel zur langsamen Abtastrichtung. Das dispersive Element erzeugt durch die spektrale Aufspaltung gleichsam einen„spektralen Fächer", in dem die Spektralinformation in einer Winkelinformation codiert ist. Indem die Lichtanteile unterschiedlicher Wellenlänge das dispersive Element mit unterschiedlichen Austrittswinkeln verlassen, wird also die spektrale Information in eine Winkelinformation übersetzt. Da der Scheitelpunkt des Abtastwinkels des Rasterelementes vorzugsweise in der zur Objektebene optisch konjugierten Ebene liegt, ist gleichzeitig der Abtastwinkel bezogen auf die langsame Abtastrichtung dem Winkel der spektralen Aufspaltung überlagert. Dies bedeutet, dass in dieser Ausführungsform der vorstehend genannte spektrale Fächer um den auf die langsame Abtastrichtung bezogenen Abtastwinkel hin- und herkippt. Gleichzeitig kippt der spektrale Fächer auch mit dem auf die schnelle Abtastrichtung bezogenen Abtastwinkel hin und her. Die Kippbewegung in der schnellen Abtastrichtung verläuft senkrecht zur Kippbewegung in der langsamen
Abtastrichtung und ist somit von dieser entkoppelt. In einer besonders bevorzugten Ausführung befindet sich zwischen dem dispersiven Element und dem Bildsensor eine Detektionsoptik, die den durch das dispersive Element spektral aufgespalteten Detektionsstrahl bei jeder Verstellung der Rasterelementes in seiner Gesamtheit auf dem Bildsensor bündelt. Da zu jedem Zeitpunkt zu gewährleisten ist, dass der Detektionsstrahl, der eine der Rasterbewegung des Beleuchtungsstrahls entsprechende Bewegung auf dem Bildsensor ausführt und zudem durch das dispersive Element räumlich aufgefächert wird, in seiner Gesamtheit auf den Bildsensor fällt, trägt eine bündelnde Detektionsoptik vorstehend genannter Art dazu bei, den Bildsensor nicht zu groß werden zu lassen.
In einer Ausführungsform ist die Detektionsoptik eine Linse, in deren Brennebene das dispersive Element angeordnet ist. Eine solche Ausführungsform kann insbesondere dann gewählt werden, wenn der Bildsensor ein Flächensensor ist.
Die Detektionsoptik kann auch ausgebildet sein, den spektral aufgespalteten
Detektionsstrahl bei jeder Verstellung des Rastelementes längs einer vorgegebenen Linie auf den Bildsensor zu bündeln. In diesem Fall kann ein Liniensensor als Bildsensor verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Detektionsoptik eine gekreuzte Anordnung von drei Zylinderlinsen, deren mittlere Zylinderlinse einen
brechungswirksamen Schnitt aufweist, der in einer ersten Ebene liegt, während die brechungswirksamen Schnitte der beiden anderen Zylinderlinsen in einer zur ersten Ebene senkrechten zweiten Ebene liegen. Mit einer solchen Zylinderlinsenanordnung lässt sich der spektral aufgespaltete Detektionsstrahl besonders einfach unabhängig von der gerade vorliegenden Verstellung des Rasterelementes auf einen Liniensensor bündeln.
Die Steuerung kann ausgebildet sein, mindestens einen der spektralen Anteile auszuwählen und nur diejenigen Sensorelemente auszulesen, die diesem ausgewählten spektralen Anteil zugeordnet sind. Dies ermöglicht eine besonders effiziente Spektraldetektion.
Das dispersive Element ist beispielsweise ein Prisma oder ein Gitter. Es ist jedoch nicht auf solche Ausführungsformen beschränkt. Beispielsweise kann auch ein akustooptisches Bauelement wie etwa ein AOTF als dispersives Element eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäße Lösung lässt sich gewinnbringend in jeder Art von Rastermikroskop anwenden, insbesondere jedoch in Mikroskopen, die nach dem non-descanned-Verfahren arbeiten, d.h. in denen der Detektionsstrahl auf den Bildsensor ausgekoppelt wird, bevor er das Rasterelement erreicht. Eine besonders bevorzugte Anwendung legt in der der Multiphotonenmikroskopie, bei der im Unterschied zur Konfokalmikroskopie zugunsten eines verbesserten Signal-Rausch- Verhältnisses darauf verzichtet wird, den Detektionsstrahl auf das Rasterelement zurückzuführen und anschließend durch eine Lochblende zu leiten. So wird die
Multiphotonenmikroskopie häufig in stark streuenden Proben angewandt. Dies hat zur Folge, dass das Detektionslicht so stark gestreut wird, dass es gar nicht mehr aus dem zentralen Fokusbereich zu stammen scheint. Dennoch sollte dieses Licht durch den Bildsensor aufgefangen werden, um ein besseres Detektionssignal zu erreichen.
Ferner sieht der Erfindung ein Verfahren zur rastermikroskopischen Abbildung einer Probe mit den Merkmalen des Anspruchs 15 vor.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
Figur 1 eine schematische Darstellung eines herkömmlichen Konfokalmikroskops;
Figur 2 eine zum Zwecke der Spektraldetektion abgewandelte Ausführungsform des Konfokalmikroskops nach Figur 1 ;
Figur 3 eine schematische Darstellung eines herkömmlichen Multiphotonenmikroskops;
Figur 4 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels des erfindungsgemäßen Rastermikroskops;
Figur 5 eine schematische Darstellung einer bei dem erfindungsgemäßen Rastermikroskop verwendbaren Detektionsoptik in verschiedenen Abwandlungen; und
Figur 6 die Detektionsoptik nach Figur 5 in einer anderen Schnittansicht.
Figur 4 zeigt in einer rein schematischen Darstellung ein Rastermikroskop 100, das nach dem non-descanned-Prinzip arbeitet. Bei dem Rastermikroskop 100 sendet ein in Figur 4 nicht gezeigte Lichtquelle einen Beleuchtungsstrahl 102 auf einen Abtastspiegel 104. Wie durch den Doppelpfeil in Figur 4 angedeutet, ist der Abtastspiegel 104 zur variablen Ablenkung des Beleuchtungsstrahls 102 kippbar. In Figur 4 sind rein schematisch eine erste Kippstellung mit durchgezogener Linie und eine zweite Kippstellung mit einer gestrichelten Linie dargestellt. Dementsprechend ist in dem Strahlengang lichtstromabwärts des
Abtastspiegels 104 der Beleuchtungsstrahl 102 für die erste Kippstellung mit
durchgezogener Linie und für die zweite Kippstellung mit gestrichelter Linie dargestellt. Der an dem Abtastspiegel 104 reflektierte Beleuchtungsstrahl durchläuft nacheinander eine Abtastlinse 106 der Brennweite f3, eine Tubuslinse 108 der Brennweite f2, einen dichroitischen Strahlteilerspiegel 1 10 und ein Objektiv 1 12 der Brennweite f 1 , der den Beleuchtungsstrahl 102 auf eine Probe 1 15 fokussiert. Entsprechend den beiden Kippstellungen des Abtastspiegels 104 sind in Figur 4 zwei Rasterpunkte gezeigt, in denen der durch das Objektiv 1 12 fokussierte Beleuchtungsstrahl 102 jeweils zusammenläuft.
Ein Detektionsstrahl 1 14, der von der mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl 102 beleuchteten Probe 1 15 ausgeht, gelangt zurück in das Objektiv 1 12 und fällt anschließend auf den dichroitischen Strahlteilerspiegel 1 10. Der dichroitische Strahlteilerspiegel 1 10 ist so ausgeführt, dass er Licht mit der Wellenlänge des Beleuchtungs- bzw. Anregungsstrahls 102 durchlässt, jedoch Licht mit der Wellenlänge des Detektions- bzw. Fluoreszenzstrahls 1 14 reflektiert. Somit wird der Detektionsstrahl 1 14 am Ort des dichroitischen Strahlteilerspiegels 1 10 aus dem Strahlengang des Beleuchtungsstrahls 102 ausgekoppelt. Wiederum ist der Detektionsstrahl 1 14 in Figur 4 für die beiden Kippstellungen des Abtastspiegels 104 mit einer durchgezogenen Linie und mit einer gestrichelten Linie dargestellt.
Nach Reflexion an dem dichroitischen Strahlteilerspiegel 1 10 durchläuft der Detektionsstrahl 1 14 zwei Linsen 1 16, 1 18 und fällt anschließend auf ein dispersives Element 120, das einem Bildsensor 122 vorgeordnet ist. Der Bildsensor 122 weist eine Vielzahl von
Sensorelementen 124 auf, die durch eine Steuerung 126 einzeln auslesbar sind.
Das dispersive Element 120 ist in einer Zwischenbildebene 128 angeordnet, die optisch äquivalent zu einer Ebene 130 ist, in der sich der Abtastspiegel 104 befindet. Die
Zwischenbildebene 128 ist zudem optisch konjugiert zu einer in Figur 4 mit 132
bezeichneten Objektebene, in der sich die Probe 1 15 befindet. In Figur 4 sind ferner Zwischenbildebenen 134, 136 und 138 dargestellt. Die Zwischenbildebene 134 ist eine
Ebene, die optisch äquivalent zur Ebene 130 und optisch konjugiert zur Objektebene 132 ist. Die Zwischenbildebene 136 ist wie auch die Zwischenbildebene 138 optisch äquivalent zur Objektebene 132 und optisch konjugiert zur Ebene 130.
Da die Zwischenbildebene 128, in der sich das dispersive Element 120 befindet, optisch äquivalent zur Ebene 130 ist, in der der Abtastspiegel 104 angeordnet ist, variiert der Detektionsstrahl 1 14 mit Verkippen des Abtastspiegels 104 lediglich in seinem
Einfallswinkel, nicht jedoch in seiner Einfallsposition am Ort des dispersiven Elementes 120. Die räumliche Variation des Detektionsstrahls 1 14 am Ort des dispersiven Elementes 120 entspricht insoweit der räumlichen Variation des Beleuchtungsstrahls 102 am Ort des Abtastspiegels 104. Der Detektionsstrahl 1 14 ist also am Ort des dispersiven Elementes 120 stationär.
Das dispersive Element 120 hat eine vorbestimmte Dispersionswirkung, die dazu führt, dass der Detektionsstrahl 1 14 in seine verschiedenen spektralen Anteile aufgespalten wird. Die spektralen Anteile sind in der Darstellung nach Figur 4 in Form von Teilstrahlen 1 14-1 bis 1 14-7 veranschaulicht. Wiederum sind die Teilstrahlen 1 14-1 bis 1 14-7 für die beiden in Figur 4 dargestellten Kippstellungen des Abtastspiegels 104 einmal mit durchgezogenen Linien und einmal mit gestrichelten Linien dargestellt.
Wie man der Darstellung nach Figur 4 entnehmen kann, bilden die Teilstrahlen 1 14-1 bis 1 14-7 gleichsam einen spektralen Fächer, in dem die Spektralinformation in einer
Winkelinformation codiert ist. Diese Winkelinformation ist durch die Winkel gegeben, unter denen die verschiedenen Teilstrahlen 1 14-1 bis 1 14-7 aus dem dispersiven Element 120 austreten und dann auf die einzelnen Sensorelemente 124 des Bildsensors 122 treffen.
In der Ausführungsform nach Figur 4 soll der Beleuchtungsstrahl 102 die Probe 1 15 in zwei zueinander senkrechten Abtastrichtungen abtasten. Dabei erfolgt die Abtastung in einer
Richtung schneller als in der anderen Richtung. Die beiden Abtastrichtungen werden in zwei entsprechende Richtungen auf dem Bildsensor 122 umgesetzt. Diese entsprechenden Richtungen werden im Folgenden der Einfachheit halber auch als Abtastrichtungen bezeichnet.
In dem Ausführungsbeispiel nach Figur 4 ist das dispersive Element 120 so ausgeführt, dass die Ebene, in der der Detektionsstrahl 1 14 durch das dispersive Element 120 spektral aufgespalten wird, parallel zur langsamen Abtastrichtung liegt. Dabei ist die Ebene der spektralen Aufspaltung in der Darstellung nach Figur 4 durch die Zeichenebene gegeben. Somit bewegt sich der durch das dispersive Element 120 gebildete, aus den Teilstrahlen 1 14-1 bis 1 14-7 gebildete spektrale Fächer in der Zeichenebene, wenn der Abtastspiegel 1 14 in der langsamen Abtastrichtung bewegt wird. Gleichzeitig kippt der durch die
Teilstrahlen 1 14-1 bis 1 14-7 gebildete spektrale Fächer in der schnellen Abtastrichtung senkrecht zur Zeichenebene nach Figur 4., wenn der Abtastspiegel in der schnellen
Abtastrichtung bewegt wird.
Um eine spektral aufgelöste Erfassung des Detektionsstrahls 1 14 zu ermöglichen, erfasst die Steuerung 126 die gerade vorliegende Verkippung des Abtastspiegels 104 und ermittelt daraus unter Berücksichtigung der vorgegebenen dispersiven Wirkung des dispersiven Elementes 120 diejenigen Sensorelemente 124, die gerade einen zu betrachtenden spektralen Anteil des Detektionsstrahls 1 14 in Form eines der Teilstrahlen 1 14-1 bis 1 14-7 empfangen. Diese Sensorelemente 124 liest die Steuerung 126 dann zum jeweiligen Zeitpunkt aus, um zu diesem Zeitpunkt den betrachteten spektralen Anteil des
Detektionsstrahls 1 14 zu erfassen. Figur 5 zeigt in einer rein schematischen Darstellung eine Detektionsoptik 140, die zwischen dem dispersiven Element 120 und dem Bildsensor 122 angeordnet ist. Das
Ausführungsbeispiel nach Figur 4 kann durch die Detektionsoptik 140 ergänzt werden.
In einer ersten Ausführungsform ist die Detektionsoptik 140 allein aus einer Sammellinse 142 gebildet, die eine Brennebene 144 aufweist. Die Sammellinse 142 bündelt die den spektralen Anteilen des Detektionsstrahls 1 14 entsprechenden Teilstrahlen 1 14-1 bis 1 14-7 so auf den Bildsensor 122, dass diese senkrecht auf den Bildsensor 122 fallen. In dem Beispiel nach Figur 5 bewegt sich der in der x-z-Ebene in die Teilstrahlen 1 14-1 bis 1 14-7 aufgespaltene Detektionsstrahl 1 14 in x-Richtung, wenn der Beleuchtungsstrahl 102 die Probe 1 15 in der langsamen Abtastrichtung abtastet. Demgegenüber bewegt er sich auf dem Bildsensor 122 in y-Richtung, wenn der Beleuchtungsstrahl 102 die Probe 1 15 in der schnellen Abtastrichtung abtastet. In dieser Ausführungsform ist der Bildsensor 122 infolge der vorstehend beschriebenen Bewegungen des Detektionsstrahls 1 14 vorzugsweise als Flächensensor ausgebildet, in dem die einzelnen Sensorelemente 124 matrixartig in Zeilen (x-Richtung) und Spalten (y-Richtung) angeordnet sind. Da die in einer bestimmten Spalte (y-Richtung) angeordneten Sensorelemente 124 jeweils den gleichen spektralen Anteil empfangen, können die aus den Sensorelementen 124 dieser Spalte ausgelesenen Signale bei der spektralen Detektion integriert werden.
Anstelle eines Flächensensors kann auch ein Liniensensor als Bildsensor 122 verwendet werden. In diesem Fall ist die Detektionsoptik 140 so ausgebildet, dass sie die Teilstrahlen 1 14-1 bis 1 14-7 auf eine einzelne Linie fokussiert. Die lässt sich beispielsweise mit einer Anordnung aus drei Zylinderlinsen realisieren. Auch für die Ausführungsform wird im
Folgenden auf Figur 5 Bezug genommen. Die Linse 142 ist in diesem Fall als Zylinderlinse ausgebildet, die den durch sie hindurchtretenden Detektionsstrahl 1 14 nur in der x-z-Ebene brechungswirksam beeinflusst. Zudem sind zwei weitere Zylinderlinsen 144 und 146 vorgesehen, von denen sich die Linse 144 lichtstromaufwärts und die Linse 146
lichtstromabwärts der mittleren Zylinderlinse 142 befindet. Die Zylinderlinsen 144 und 146 sind mit ihren Zylinderachsen senkrecht zur mittleren Zylinderlinse 142 angeordnet.
Demnach beeinflussen die Zylinderlinsen 144 und 146 den durch sie hindurchtretenden Detektionsstrahl 1 14 brechungswirksam nur in der y-z-Ebene, wie die Darstellung nach Figur 6 veranschaulicht, die einen y-z-Schnitt durch die Detektionsoptik 140 zeigt. In den Figuren 5 und 6 wirken also die jeweils gestrichelt dargestellten Linsen nur auf die senkrecht zur Zeichenebene orientierte Achse. Durch eine geeignete Wahl der Linsenabstände lässt sich so erreichen, dass der Detektionsstrahl 1 14, der durch diese gekreuzte Anordnung der Zylinderlinsen 142, 144, 146 tritt, in y-Richtung nur noch in seinem Einfallswinkel, nicht jedoch in seiner Einfallsposition variiert. Dies erlaubt den Einsatz einen Liniensensors, d.h. eines einzeiligen Detektors, der zu jedem Zeitpunkt die gesamte Lichtmenge detektiert.

Claims

Patentansprüche
Rastermikroskop mit
einem Objektiv (1 12), das einen Beleuchtungsstrahl (102) auf eine Probe (1 15) fokussiert,
einem dem Objektiv (1 12) vorgeordneten Rasterelement (104), das zur zeitlich veränderlichen Ablenkung des Beleuchtungsstrahls (102) verstellbar ist, um den fokussierten Beleuchtungsstrahl (102) in einer Rasterbewegung über die Probe (1 15) zu führen, und
einem Bildsensor (122), auf den das Objektiv (1 12) einen Detektionsstrahl (1 14) abbildet, der von der mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl (102) beleuchteten Probe (1 15) ausgeht,
wobei der Bildsensor (122) mehrere durch eine Steuerung (126) einzeln auslesbare Sensorelemente (124) aufweist, über die der Detektionsstrahl (1 14) in einer der Rasterbewegung des fokussierten Beleuchtungsstrahls (102) entsprechenden Bewegung geführt wird,
gekennzeichnet durch ein dem Bildsensor (122) vorgeordnetes dispersives Element (120) vorbestimmter Dispersionswirkung, das verschiedene spektrale Anteile des Detektionsstrahl (1 14) auf dem Bildsensor (122) räumlich voneinander trennt, wobei die Steuerung (126) zur spektral aufgelösten Erfassung des Detektionsstrahls (1 14) die zeitlich veränderliche Verstellung des Rasterelementes (104) erfasst, in Abhängigkeit dieser Verstellung den Sensorelementen (124) des Bildsensors (122) die räumlich voneinander getrennten spektralen Anteile des Detektionsstrahls (1 14) unter Berücksichtigung der vorbestimmten Dispersionswirkung des dispersiven Elementes (120) zuordnet und die den jeweiligen spektralen Anteilen zugordneten Sensorelemente (124) ausliest.
Rastermikroskop nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das das dispersive Element (120) in einer Ebene (128) angeordnet ist, die optisch konjugiert zu einer Ebene (132) ist, in der die Probe (1 15) angeordnet ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ebene (128), in der das dispersive Element (120) angeordnet ist, optisch äquivalent zu einer Ebene (130) ist, in der das Rasterelement (104) angeordnet ist. Rastermikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass das Rasterelement (104) den Beleuchtungsstrahl (102) in einer ersten Abtastrichtung über die Probe (1 15) führt.
Rastermikroskop nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das
Rasterelement (104) den Beleuchtungsstrahl (102) zusätzlich in einer zur ersten Abtastrichtung senkrechten zweiten Abtastrichtung über die Probe (1 15) führt, wobei die Bewegung des Beleuchtungsstrahls (102) in der ersten Abtastrichtung schneller als in der zweiten Abtastrichtung ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Dispersionswirkung des dispersiven Elementes (120) derart vorbestimmt ist, dass die spektralen Anteile des Detektionsstrahl (1 14) auf dem Bildsensor (122) in einer Richtung räumlich voneinander getrennt werden, die senkrecht zu einer Richtung ist, in die der Detektionsstrahl (1 14) über den Bildsensor (122) geführt wird, wenn der Beleuchtungsstrahl (102) in der ersten Abtastrichtung über die Probe (1 15) geführt wird.
Rastermikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch eine zwischen dem dispersiven Element (120) und dem Bildsensor (122)
angeordnete Detektionsoptik (140), die den durch das dispersive Element (120) spektral aufgespaltenen Detektionsstrahl (1 14) bei jeder Verstellung des
Rasterelementes (104) in seiner Gesamtheit auf den Bildsensor (122) bündelt.
Rastermikroskop nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die
Detektionsoptik eine Linse ist, in deren Brennebene das dispersive Element (120) angeordnet ist.
Rastermikroskop nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionsoptik (140) ausgebildet ist, den spektral aufgespaltenen Detektionsstrahl (1 14) bei jeder Verstellung des Rasterelementes (104) längs einer vorgegebenen Linie auf den Bildsensor (122) zu bündeln.
Rastermikroskop nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die
Detektionsoptik (140) eine gekreuzte Anordung von drei Zylinderlinsen (142, 144, 146) umfasst, deren mittlere Zylinderlinse (142) einen brechungswirksamen Schnitt aufweist, der in einer ersten Ebene liegt, während die brechungswirksamen Schnitte der beiden anderen Zylinderlinsen (144, 146) in einer zur ersten Ebene senkrechten zweiten Ebene liegen.
1 1 . Rastermikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Steuerung (126) mindestens einen der spektralen Anteile auswählt und nur diejenigen Sensorelemente (124) ausliest, die diesem
ausgewählten spektralen Anteil zugeordnet sind.
12. Rastermikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, das der Bildsensor (122) ein Flächensensor oder ein Liniensensor ist.
13. Rastermikroskop nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, das das dispersive Element (120) ein Prisma oder ein Gitter ist. 14. Rastermikroskop nach einem vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es zur spektral aufgelösten Erfassung des Detektionsstrahls (1 14) im non- descanned-Verfahren ausgebildet.
15. Verfahren zur rastermikroskopischen Abbildung einer Probe (1 14), bei dem
ein Beleuchtungsstrahl (102) mittels eines Objektivs (1 12) auf die Probe (1 14) fokussiert wird,
ein dem Objektiv (1 12) vorgeordnetes Rasterelement (104) zur zeitlich
veränderlichen Ablenkung des Beleuchtungsstrahls (102) verstellt wird, um den fokussierten Beleuchtungsstrahl (102) in einer Rasterbewegung über die Probe (1 14) zu führen, und
mittels des Objektivs (1 12) ein Detektionsstrahl (1 14), der von der mit dem
fokussierten Beleuchtungsstrahl (102) beleuchteten Probe (1 14) ausgeht, auf Bildsensor (122) fokussiert wird,
wobei der Bildsensor (122) mehrere durch eine Steuerung (126) einzeln auslesbare Sensorelemente (124) aufweist, über die der Detektionsstrahl (1 14) in einer der Rasterbewegung des fokussierten Beleuchtungsstrahls (102) entsprechenden Bewegung geführt wird,
dadurch gekennzeichnet, dass verschiedene spektrale Anteile des Detektionsstrahls (1 14) auf dem Bildsensor (122) mittels eines dem Bildsensor (122) vorgeordneten dispersiven Elementes (120) vorbestimmte Dispersionswirkung räumlich voneinander getrennt werden,
wobei zur spektral aufgelösten Erfassung des Detektionsstrahls (1 14) mittels der Steuerung (126) die zeitlich veränderliche Verstellung des Rasterelementes (104) erfasst wird, in Abhängigkeit dieser Verstellung den Sensorelementen (124) des Bildsensors (122) die räumlich voneinander getrennten spektralen Anteile des Detektionsstrahls (1 14) unter Berücksichtigung der vorbestimmten
Dispersionswirkung des dispersiven Elementes (120) zugeordnet werden und die den jeweiligen spektralen Anteilen zugeordneten Sensorelemente (124) ausgelesen werden.
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