WO2016088511A1 - アシル－ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法 - Google Patents

アシル－ａｃｐチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法 Download PDF

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達郎 尾崎
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Kao Corp
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    • C12Y301/02—Thioester hydrolases (3.1.2)
    • C12Y301/02014—Oleoyl-[acyl-carrier-protein] hydrolase (3.1.2.14), i.e. ACP-thioesterase

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a lipid using acyl-ACP thioesterase.
  • the present invention also relates to an acyl-ACP thioesterase used in the method, a gene encoding the same, and a transformant into which the gene has been introduced.
  • Fatty acids are one of the main constituents of lipids, and constitute lipids such as triacylglycerol produced by ester bonds with glycerin in vivo. In many animals and plants, fatty acids are also stored and used as energy sources. Fatty acids and lipids stored in animals and plants are widely used for food or industry. For example, derivatives of higher alcohols obtained by reducing higher fatty acids having about 12 to 18 carbon atoms are used as surfactants. Alkyl sulfate esters and alkylbenzene sulfonates are used as anionic surfactants. Polyoxyalkylene alkyl ethers, alkyl polyglycosides, and the like are used as nonionic surfactants.
  • surfactants are used as cleaning agents or disinfectants.
  • Alkylamine salts and mono- or dialkyl quaternary amine salts as derivatives of the same higher alcohol are routinely used for fiber treatment agents, hair rinse agents, disinfectants, and the like.
  • Benzalkonium-type quaternary ammonium salts are routinely used as bactericides and preservatives.
  • higher alcohols having about 18 carbon atoms are useful as plant growth promoters.
  • fatty acids and lipids are widely used, and therefore, attempts have been made to improve the productivity of fatty acids and lipids in vivo in plants and the like. Furthermore, since the use and usefulness of fatty acids depend on the number of carbon atoms, attempts have been made to control the number of carbon atoms of fatty acids, that is, the chain length. For example, a method of accumulating fatty acids having 12 carbon atoms by introducing acyl-ACP thioesterase derived from bay ( Umbellularia californica (California bay)) has been proposed (Patent Document 1, Non-Patent Document 1).
  • the present invention relates to a method for producing lipid, in which a transformant in which a gene encoding any one of the following proteins (A) to (C) is introduced into a host and lipid is collected from the culture.
  • a protein comprising the amino acid sequence of positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence at positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1 and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • C A protein having the amino acid sequence of the protein (A) or (B) and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the present invention also relates to the proteins (A) to (C) (hereinafter also referred to as the protein of the present invention or acyl-ACP thioesterase).
  • the present invention also relates to a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) (hereinafter also referred to as the gene of the present invention).
  • the present invention also relates to a transformant obtained by introducing a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) into a host.
  • the present invention relates to the provision of a method for producing a lipid, which improves the productivity of a medium chain fatty acid or a lipid comprising the same.
  • the present invention relates to a novel algae-derived acyl-ACP thioesterase that can be suitably used in the above-described method, and a gene encoding the same.
  • the present invention also relates to the provision of a transformant that promotes the expression of the gene and changes lipid productivity or fatty acid composition.
  • the present inventor has studied a new acyl-ACP thioesterase derived from algae. As a result, a novel acyl-ACP thioesterase and an acyl-ACP thioesterase gene encoding the same were found from cryptophyte. As a result of transformation using the acyl-ACP thioesterase gene, it was found that the content of specific fatty acids in the total fatty acid component in lipids was significantly improved in the transformants. The present invention has been completed based on these findings.
  • a novel acyl-ACP thioesterase, a gene encoding the same, and a transformant into which the gene is introduced can be provided.
  • the production method of the present invention using the transformant is excellent in productivity of medium-chain fatty acids or lipids comprising the same.
  • the production method of the present invention has 8 to 16 carbon atoms, preferably 8 to 14 carbon atoms, more preferably 10 to 14 carbon atoms, more preferably 12 to 14 carbon atoms, more preferably 12 and 14 carbon atoms, and more.
  • it is excellent in the productivity of fatty acids having 12 carbon atoms or lipids containing these as constituents.
  • the acyl-ACP thioesterase, gene encoding the same, transformant, and production method of the present invention can be suitably used for industrial production of fatty acids or lipids.
  • lipid includes simple lipids, complex lipids and derived lipids, and specifically includes fatty acids, fatty alcohols, hydrocarbons (alkanes, etc.), neutral lipids (triacylglycerols, etc.). , Wax, ceramide, phospholipid, glycolipid, sulfolipid and the like.
  • Cx: y in the notation of fatty acids and acyl groups constituting fatty acids means that the number of carbon atoms is x and the number of double bonds is y.
  • Cx represents a fatty acid or acyl group having x carbon atoms.
  • the identity of a base sequence and an amino acid sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, vol. 227, p. 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis assuming that Unit size to compare (ktup) is 2 using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win.
  • “stringent conditions” include, for example, Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W., et al. Russell., Cold Spring Harbor Laboratory Press].
  • a numerical range expressed using “to” means a range including numerical values described before and after “to” as a lower limit value and an upper limit value.
  • the “medium chain” means that the fatty acid or the fatty acid residue has 8 to 16 carbon atoms.
  • Acyl-ACP thioesterase The protein of the present invention is a protein having an amino acid sequence of at least 611 to 772 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a protein functionally equivalent to the protein.
  • Acyl-ACP (acyl carrier protein) thioesterase is an enzyme involved in the biosynthesis system of fatty acids and derivatives thereof (such as triacylglycerol (triglyceride)).
  • the enzyme contains acyl-ACP (an acyl group that is a fatty acid residue), which is an intermediate in the process of fatty acid biosynthesis, in plastids such as chloroplasts in plants and algae, and in the cytoplasm in bacteria, fungi, and animals.
  • acyl-ACP thioesterase activity refers to an activity of hydrolyzing the thioester bond of acyl-ACP.
  • proteins (A) to (C) include the following proteins (A) to (C).
  • a protein comprising the amino acid sequence of positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence at positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1 and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • C A protein having the amino acid sequence of the protein (A) or (B) and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of an acyl-ACP thioesterase (hereinafter also abbreviated as “GtTE”) derived from Guillardia theta , a kind of crypto algae.
  • GtTE acyl-ACP thioesterase
  • the genomic sequence information of Guildia seta has been made public, the function of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has not been known so far.
  • the present inventor has identified that the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an acyl-ACP thioesterase. Furthermore, when the present inventor compared the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences of other known acyl-ACP thioesterases, the sequence identity (homology) was very low.
  • the present inventor has determined that the region from position 611 to position 772 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is important for functioning as an acyl-ACP thioesterase, and is a region sufficient to exhibit acyl-ACP thioesterase activity. I found out. That is, a protein consisting of the amino acid sequence at positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1 and a protein containing the amino acid sequence have acyl-ACP thioesterase activity. Protein (A) consists of a region sufficient for this acyl-ACP thioesterase activity and functions as an acyl-ACP thioesterase.
  • Protein (B) consists of an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence at positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1, and has acyl-ACP thioesterase activity.
  • an amino acid sequence encoding an enzyme protein does not necessarily indicate enzyme activity unless the sequence of the entire region is conserved, and there are regions that do not affect enzyme activity even if the amino acid sequence changes. It is known to exist. In such a region that is not essential for enzyme activity, the original activity of the enzyme can be maintained even if a mutation such as amino acid deletion, substitution, insertion or addition is introduced.
  • a protein that retains acyl-ACP thioesterase activity and has a partially mutated amino acid sequence can also be used.
  • the identity with the amino acid sequence at positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and more than 95% Is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is further more preferable, 98% or more is further more preferable, and 99% or more is further more preferable.
  • the amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence at positions 611 to 772 in SEQ ID NO: 1 is one or several in the amino acid sequence at positions 611 to 772 in SEQ ID NO: 1. 1 or more, preferably 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, still more preferably 1 or more and 10 or less, still more preferably 1 or more and 8 or less, and even more preferably 1 or more 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, still more preferably 1 or more and 3 or less, and even more preferably 1 or 2 amino acids are deleted, substituted, inserted or added.
  • Examples include sequences.
  • Examples of a method for introducing mutation such as deletion, substitution, insertion, addition, etc. into the amino acid sequence include a method of introducing mutation into the base sequence encoding the amino acid sequence. A method for introducing a mutation into the base sequence will be described later.
  • the protein (C) contains the amino acid sequence of the protein (A) or (B) as part of its amino acid sequence, and exhibits acyl-ACP thioesterase activity.
  • the protein (C) may contain a sequence other than the amino acid sequence of the protein (A) or (B).
  • examples of the sequence other than the amino acid sequence of the protein (A) or (B) include, for example, any amino acid sequence other than the positions 611 to 772 in SEQ ID NO: 1, The identity with any amino acid sequence other than positions 611 to 772 in No.
  • 1 is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 96% or more, more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, more preferably 99% or more amino acid sequences, or one or several amino acids in these sequences, preferably 1 or more and 20 or less , More preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less More preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more 3 or less, more preferably 1 or 2, the amino acid deletion, substitution, insertion, or addition in the amino acid sequence, and the like.
  • the protein (C) is also preferably a protein comprising an amino acid sequence in which a signal peptide involved in protein transport or secretion is added to the amino acid sequence of the protein (A) or (B).
  • signal peptide addition include addition of a chloroplast translocation signal peptide to the N-terminus.
  • the protein (C) may be a protein comprising an amino acid sequence in which the N-terminal amino acid is deleted at any position from 1 to 610 of SEQ ID NO: 1. Furthermore, from the viewpoint of productivity of specific fatty acids, for example, medium chain fatty acids, the following proteins (C1) to (C20) are preferable as the protein (C).
  • C1 A protein comprising the amino acid sequence of positions 1 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C2 A protein comprising the amino acid sequence of positions 487 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C3 A protein comprising the amino acid sequence of positions 488 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C4 A protein comprising the amino acid sequence of positions 497 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C5 A protein comprising the amino acid sequence of positions 507 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C6 A protein comprising the amino acid sequence of positions 517 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C7 A protein comprising the amino acid sequence of positions 527 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C8 A protein comprising the amino acid sequence of positions 537 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C9 A protein comprising the amino acid sequence of positions 547 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C10 A protein comprising the amino acid sequence of positions 557 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C11 A protein comprising the amino acid sequence of positions 567 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • (C12) A protein comprising the amino acid sequence of positions 577 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C13) A protein comprising the amino acid sequence of positions 587 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C14) A protein comprising the amino acid sequence of positions 597 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C15) A protein comprising the amino acid sequence of positions 607 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C16) A protein comprising the amino acid sequence of positions 608 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • (C17) A protein comprising the amino acid sequence of positions 609 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C18 A protein comprising the amino acid sequence of positions 610 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • the identity with any one of the amino acid sequences of the proteins (C1) to (C18) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, more More preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more amino acid sequence, and a protein having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the protein (C) of the present invention is preferably the protein (C13), the protein (C14), the protein (C15), the protein (C16), the protein (C17), or the proteins (C13) to (C17).
  • the identity with any one amino acid sequence is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, and still more preferably 97 % Or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more of a protein having an acyl-ACP thioesterase activity, or any one of the proteins (C13) to (C17)
  • One or several amino acid sequences preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 Below, more preferably 1 or more, 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or
  • a protein has acyl-ACP thioesterase activity means that, for example, a DNA in which an acyl-ACP thioesterase gene is linked downstream of a promoter that functions in a host cell such as E. coli is introduced into a host cell that lacks the fatty acid degradation system. It can be confirmed by culturing under conditions where the introduced acyl-ACP thioesterase gene is expressed, and analyzing changes in the fatty acid composition in the host cell or culture solution using a method such as gas chromatography analysis. .
  • acyl-ACP thioesterase gene linked downstream of a promoter that functions in a host cell such as Escherichia coli into the host cell and culturing the cell under conditions such that the introduced acyl-ACP thioesterase gene is expressed.
  • Various acyls prepared by the method of Yuan et al. (Yuan L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, vol. 92 (23), p. 10639-10643).
  • -Acyl-ACP thioesterase activity can be measured by carrying out a reaction using ACP as a substrate.
  • a protein derived from a natural product can be obtained by isolation, purification, or the like from gillardia seta.
  • protein synthesis may be performed by chemical synthesis, or a recombinant protein may be produced by a gene recombination technique.
  • the acyl-ACP thioesterase gene described later can be used.
  • crypt algae such as guilardia seta can be obtained from a storage organization such as a private or public laboratory.
  • NCMA National Center for Marine Algae and Microbiota
  • CCMP National Center for Marine Algae and Microbiota
  • UTEX The culture collection of algae at University of Texas at Austin
  • NIES National Institute for Environmental Studies
  • CCAP Culture Collection of Algae and Protozoa
  • CSIRO Australian National Algae Culture Collection
  • the acyl-ACP thioesterase gene of the present invention is a gene encoding any one of the proteins (A) to (C).
  • Examples of the gene encoding any one of the proteins (A) to (C) include genes having the nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 is an example of a base sequence of a gene encoding a wild type acyl-ACP thioesterase derived from Guildia seta.
  • the base sequence from positions 1831 to 2316 of SEQ ID NO: 2 encodes the amino acid sequence from positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • nucleotide sequence of positions 2317 to 2319 in SEQ ID NO: 2 is a stop codon and does not correspond to an amino acid.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a base sequence subjected to codon optimization based on the amino acid sequence information of SEQ ID NO: 1 in accordance with the codon usage of E. coli.
  • the base sequence from position 1 to position 858 of SEQ ID NO: 3 encodes the amino acid sequence from position 487 to position 772 of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence of positions 373 to 858 of SEQ ID NO: 3 encodes the amino acid sequence of positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • the nucleotide sequence at positions 859 to 861 of SEQ ID NO: 3 is a stop codon and does not correspond to an amino acid.
  • a gene consisting of any one of the proteins (A) to (C) can be exemplified.
  • the present invention is not limited to these.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 373 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • a DNA encoding a protein consisting of a base sequence having 80% or more identity with the base sequence at positions 373 to 861 of SEQ ID NO: 3 and having acyl-ACP thioesterase activity;
  • DNA (b) from the viewpoint of acyl-ACP thioesterase activity, the identity with the nucleotide sequence of positions 1831 to 2319 of SEQ ID NO: 2 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and more than 95% Is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is further more preferable, 98% or more is further more preferable, and 99% or more is further more preferable.
  • the nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence of positions 1831 to 2319 of SEQ ID NO: 2 is one or several in the nucleotide sequence of positions 1831 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • 1 to 20 pieces more preferably 1 to 15 pieces, more preferably 1 to 10 pieces, more preferably 1 to 8 pieces, more preferably 1 to 5 pieces More preferred is a base sequence in which 1 to 4 or less, more preferably 1 to 3 or less, more preferably 1 or 2 bases are deleted, substituted, inserted or added.
  • DNA (e) from the viewpoint of acyl-ACP thioesterase activity, the identity with the nucleotide sequence at positions 373 to 861 of SEQ ID NO: 3 is preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and more than 95% Is more preferable, 96% or more is more preferable, 97% or more is further more preferable, 98% or more is further more preferable, and 99% or more is more preferable.
  • the nucleotide sequence having 80% or more identity with the nucleotide sequence of positions 373 to 861 of SEQ ID NO: 3 is one or several in the nucleotide sequence of positions 373 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • 1 to 20 pieces more preferably 1 to 15 pieces, more preferably 1 to 10 pieces, more preferably 1 to 8 pieces, more preferably 1 to 5 pieces More preferred is a base sequence in which 1 to 4 or less, more preferably 1 to 3 or less, more preferably 1 or 2 bases are deleted, substituted, inserted or added.
  • Examples of methods for introducing mutations such as deletion, substitution, insertion and addition into the base sequence include site-specific mutagenesis.
  • a method using Splicing overlap extension (SOE) PCR Horton et al., Gene, 1989, vol. 77, p. 61-68
  • ODA method Hamoto- Gotoh et al., Gene, 1995, vol. 152, p. 271-276
  • Kunkel method Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, vol. 82, p. 488) Etc.
  • the target gene can also be obtained by performing enzyme activity evaluation and gene analysis by an appropriate method.
  • DNA (b) a DNA that hybridizes with a DNA comprising a base sequence complementary to DNA (a) under stringent conditions and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity is also preferable.
  • DNA (e) DNA that hybridizes with DNA comprising a base sequence complementary to DNA (d) under stringent conditions and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity is also preferable.
  • DNA (c) contains the base sequence of DNA (a) or (b) as part of its base sequence, and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the DNA (c) may contain a sequence other than the base sequence of the DNA (a) or (b).
  • sequences other than the base sequence of DNA (a) or (b) in the base sequence of DNA (c) include, for example, any base sequence other than positions 1831 to 2319 in SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 2 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 96%, with any nucleotide sequence other than positions 1831 to 2319 Or more, more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, or any nucleotide sequence other than positions 1831 to 2319 in SEQ ID NO: 2 Or several, preferably 1 to 20 or less, more preferably 1 to 15 or less, more preferably 1 to 10 or less, more preferably 1 to 8 or less, more preferably 1 to 5 or less, more preferably 1 to 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2 bases are deleted, substituted, inserted or added.
  • Base sequence and the like.
  • a base sequence encoding a signal peptide involved in protein transport or secretion is also preferable.
  • the signal peptide include those described for the protein (C). These sequences are preferably added to the 5 ′ end side of the base sequence of the DNA (a) or (b).
  • the DNA (c) may be a DNA consisting of a base sequence in which the 5 ′ end is deleted at any position from positions 1 to 1830 of SEQ ID NO: 2. Furthermore, from the viewpoint of productivity of specific fatty acids, for example, medium chain fatty acids, the following DNA (c1) to (c20) are preferable as the DNA (c).
  • c3 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1462 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c4) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1489 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • c5 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1519 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c6) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1549 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • c7 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1579 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c8) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1609 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • c9) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1639 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c10) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1669 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c11) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1699 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c12) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1729 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c13) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1759 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c14) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1789 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c15) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1819 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • the identity with any one of the base sequences of DNA (c1) to (c18) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, more More preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity DNA.
  • (c20) One or several, preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more in any one of the base sequences of DNA (c1) to (c18) 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2 DNA encoding a protein having a base sequence in which a single base is deleted, substituted, inserted, or added, and having acyl-ACP thioesterase activity. It has been confirmed by the present inventor that the gene consisting of any one of the DNAs (c1) to (c18) encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity.
  • DNA (f) encodes a protein having the base sequence of DNA (d) or (e) as part of its base sequence and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • DNA (f) may contain a sequence other than the base sequence of DNA (d) or (e).
  • Examples of the sequence other than the base sequence of DNA (d) or (e) in the base sequence of DNA (f) include, for example, any base sequence other than positions 373 to 861 in SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 3 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, and even more than any base sequence other than positions 373 to 861 Preferably, 97% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, or one or several nucleotide sequences in any base sequence other than positions 373 to 861 in SEQ ID NO: 3, preferably Is 1 or more, 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more and 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less.
  • base is deleted, substituted, inserted, or added in the nucleotide sequence, and the like.
  • base sequence a sequence other than the base sequence of the DNA (d) or (e)
  • a base sequence encoding a signal peptide involved in protein transport or secretion is also preferable.
  • the signal peptide include those described for the protein (C). These sequences are preferably added to the 5 ′ end side of the base sequence of DNA (d) or (e).
  • the DNA (f) may be a DNA consisting of a base sequence in which the 5 ′ end is deleted at any position from positions 1 to 372 of SEQ ID NO: 3. Furthermore, from the viewpoint of the productivity of specific fatty acids, for example, medium chain fatty acids, the following DNA (f1) to (f19) are preferable as the DNA (f).
  • f3 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 31 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • f6 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 121 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • f8 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 181 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • DNA sequences (f16) to (f17) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, more More preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity DNA.
  • DNA (f19) One or several, preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more, in any one of the base sequences of DNA (f1) to (f17) 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2
  • the method for obtaining the acyl-ACP thioesterase gene of the present invention is not particularly limited, and can be obtained by ordinary genetic engineering techniques.
  • a gene can be obtained by artificial synthesis based on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 3.
  • services such as Eurofin Genomics can be used for artificial gene synthesis.
  • it can be obtained by cloning from the Girardia Seta, for example, by the method described in Molecular Cloning-A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION [Joseph Sambrook, David W. Russell, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)]. it can.
  • the transformant of the present invention is a transformant in which expression of a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) is promoted.
  • the ability to produce lipids particularly the ability to produce medium-chain fatty acids or lipids comprising them (the production amount of medium-chain fatty acids or lipids comprising them, the total amount of fatty acids produced)
  • the proportion of chain fatty acids and the proportion of lipids comprising medium chain fatty acids in the total lipid produced) are significantly improved.
  • the fatty acid composition in the lipid is a specific lipid, particularly a medium chain fatty acid or a lipid comprising this, preferably a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms or a lipid comprising this.
  • the fatty acid having 8 to 14 carbon atoms or a lipid comprising the same more preferably a fatty acid having 10 to 14 carbon atoms or a lipid comprising the same, more preferably a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms Or a lipid comprising this as a constituent, more preferably a fatty acid having 12 and 14 carbon atoms or a lipid comprising this, more preferably a fatty acid having 12 carbons or a lipid comprising this as a constituent.
  • the transformant of this aspect significantly improves the productivity of medium-chain fatty acids or lipids comprising this as a constituent compared to the host itself.
  • the present invention using the transformant can be suitably used for lipid production.
  • the ability of acyl-ACP thioesterase to produce fatty acids or lipids can be measured by the method used in the examples.
  • those in which the expression of the gene encoding the target protein is promoted are also referred to as “transformants”, and those in which the expression of the gene encoding the target protein is not promoted are “host” or “ Also referred to as “wild strain”.
  • the method for promoting the expression of the acyl-ACP thioesterase gene can be appropriately selected from conventional methods. For example, a method of introducing the acyl-ACP thioesterase gene into a host, a method of modifying an expression control region (promoter, terminator, etc.) of the gene in a host having the acyl-ACP thioesterase gene on the genome, etc. Can be mentioned.
  • a method for promoting the expression of the gene by introducing the acyl-ACP thioesterase gene into the host will be described.
  • a transformant that can be preferably used in the present invention can be obtained by introducing a gene encoding an acyl-ACP thioesterase into a host by an ordinary genetic engineering method. Specifically, by preparing an expression vector or gene expression cassette capable of expressing a gene encoding acyl-ACP thioesterase in a host cell, and introducing the gene into a host cell to transform the host cell. Can be made.
  • the host of the transformant is not particularly limited and can be appropriately selected from those usually used.
  • microorganisms including algae and microalgae
  • plants, or animals can be used.
  • the host is preferably a microorganism or a plant, and more preferably a microorganism.
  • the microorganism may be either prokaryotic, eukaryotic, Escherichia (Escherichia) microorganism belonging to the genus microorganism belonging to Bacillus (Bacillus) genus Synechocystis (Synechocystis) microorganism of the genus, Synechococcus (Synechococcus) microorganisms of the genus Or eukaryotic microorganisms such as yeast and filamentous fungi can be used. Among them, from the viewpoint of the lipid productivity, E.
  • Escherichia coli is a microorganism belonging to Escherichia
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • red yeast is a microorganism belonging to yeast (Rhodosporidium toruloides), Or Mortierella sp.
  • which is a microorganism belonging to filamentous fungi is preferable, and Escherichia coli is more preferable.
  • algae belonging to the genus Chlamydomonas from the viewpoint of establishing genetic recombination techniques, algae belonging to the genus Chlamydomonas , algae belonging to the genus Chlorella , algae belonging to the genus Phaeodactylum , Or algae belonging to the genus Nannochloropsis are preferable, and algae belonging to the genus Nannochloropsis are more preferable.
  • Nannochloropsis gaditana Specific algae belonging to the genus Nannochloropsis are Nannochloropsis gaditana , Nannochloropsis salina , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis oceanica , Nannochloropsis oceanina , Examples thereof include Nannochloropsis atomus , Nannochloropsis maculata , Nannochloropsis granulata , Nannochloropsis sp., And the like. Among these, from the viewpoint of lipid productivity, Nannochloropsis oculata or Nannochloropsis gaditana is preferable, and Nannochloropsis oculata is more preferable.
  • the plant body is preferably Arabidopsis thaliana , rapeseed, coconut palm, palm, coffea, or jatropha, more preferably Arabidopsis , from the viewpoint of high lipid content in the seed.
  • a gene encoding acyl-ACP thioesterase can be introduced into a host, and the gene can be expressed in the host cell.
  • Any vector may be used.
  • a vector having an expression regulatory region such as a promoter or terminator according to the type of host to be introduced, and a vector having a replication origin or a selection marker can be used.
  • it may be a vector that autonomously grows and replicates outside the chromosome, such as a plasmid, or a vector that is integrated into the chromosome.
  • pBluescript II SK ( ⁇ ) or pMW218 / 219 is preferably used.
  • algae for example, pUC19 (manufactured by Takara Bio Inc.), P66 (Chlamydomonas Center), P-322 (Chlamydomonas Center), pPha-T1 (Yangmin Gong, et al., Journal of Basic Microbiology, 2011) , Vol.51, p.666-672), or pJET1 (manufactured by Cosmo Bio).
  • a host when the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, pUC19, pPha-T1, or pJET1 is preferably used.
  • a host When the host is an algae belonging to the genus Nannochloropsis, Oliver Kilian, et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2011, vol.
  • a host can also be transformed with a DNA fragment (gene expression cassette) comprising the gene, promoter and terminator of the present invention.
  • the DNA fragment include a DNA fragment amplified by PCR and a restriction enzyme-cleaved DNA fragment.
  • a pRI vector manufactured by Takara Bio Inc.
  • a pBI vector manufactured by Clontech
  • an IN3 vector manufactured by Implanta Innovations
  • the host is Arabidopsis thaliana
  • pRI vectors or pBI vectors are preferably used.
  • the type of promoter or terminator that regulates the expression of the gene encoding the target protein incorporated above can also be appropriately selected according to the type of host used.
  • a promoter that can be preferably used in the present invention for example, by adding lac promoter, trp promoter, tac promoter, trc promoter, T7 promoter, SpoVG promoter, isopropyl ⁇ -D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Promoters related to inducible derivatives, Rubisco operon (rbc), PSI reaction center protein (psaAB), PSII D1 protein (psbA), cauliflower mosaic virus 35SRNA promoter, housekeeping gene promoter (eg tubulin promoter, actin promoter, ubiquitin) Promoter), rapeseed-derived Napin gene promoter, plant-derived Rubisco promoter, violaxanthin / chlorophyll a-binding protein VCP1 gene promoter derived from the genus Nannochloropsis (
  • oleosin-like protein LDSP lipid droplet surface protein
  • the type of selectable marker for confirming that the gene encoding the target protein has been incorporated can be appropriately selected according to the type of host used.
  • Selectable markers that can be preferably used in the present invention include ampicillin resistance gene, chloramphenicol resistance gene, erythromycin resistance gene, neomycin resistance gene, kanamycin resistance gene, spectinomycin resistance gene, tetracycline resistance gene, blasticidin S Examples include drug resistance genes such as resistance genes, bialaphos resistance genes, zeocin resistance genes, paromomycin resistance genes, or hygromycin resistance genes. Furthermore, it is also possible to use a gene defect associated with auxotrophy as a selection marker gene.
  • Introduction of a gene encoding a target protein into the vector can be performed by a usual technique such as restriction enzyme treatment or ligation.
  • sequences useful for translation of the gene for example, sequences corresponding to a start codon and a stop codon can be appropriately supplemented.
  • the transformation method is not particularly limited as long as it is a method capable of introducing a target gene into a host. For example, a method using calcium ions, a general competent cell transformation method (J. Bacterial. 93, 1925 (1967)), a protoplast transformation method (Mol. Gen. Genet.
  • ⁇ Selection of transformant introduced with target gene fragment> can be performed by using a selection marker or the like.
  • the drug resistance gene acquired by the transformant as a result of introducing a vector-derived drug resistance gene into the host cell together with the target DNA fragment at the time of transformation can be used as an indicator.
  • the introduction of the target DNA fragment can also be confirmed by PCR method using a genome as a template.
  • “Expression regulatory region” refers to a promoter or terminator, and these sequences are generally involved in regulating the expression level (transcription level, translation level) of adjacent genes.
  • “Expression regulatory region” refers to a promoter or terminator, and these sequences are generally involved in regulating the expression level (transcription level, translation level) of adjacent genes.
  • medium chain fatty acid or a constituent component thereof can be obtained by modifying the expression regulatory region of the gene to promote the expression of the acyl-ACP thioesterase gene. The productivity of the lipid can be improved.
  • Examples of the method for modifying the expression regulatory region include promoter replacement.
  • the promoter of the gene hereinafter also referred to as “acyl-ACP thioesterase promoter”
  • acyl-ACP thioesterase promoter is replaced with a promoter having higher transcriptional activity, whereby acyl-ACP Expression of thioesterase gene can be promoted.
  • the promoter used for replacement of the acyl-ACP thioesterase promoter is not particularly limited, and is appropriately selected from those having higher transcription activity than the acyl-ACP thioesterase promoter and suitable for the production of medium-chain fatty acids or lipids comprising them. You can choose.
  • the above-described promoter modification can be performed according to a conventional method such as homologous recombination. Specifically, a linear DNA fragment containing upstream and downstream regions of the target promoter and containing another promoter instead of the target promoter is constructed, and this is incorporated into the host cell, and the target promoter of the host genome Two homologous recombination occurs at the upstream and downstream side of. As a result, the target promoter on the genome is replaced with another promoter fragment, and the promoter can be modified.
  • a method for modifying a target promoter by homologous recombination is described in, for example, Besher et al., Methods in molecular biology, 1995, vol. 47, p. Reference can be made to documents such as 291-302.
  • the transformant of the present invention has improved productivity of medium chain fatty acids or lipids comprising this as a constituent, compared to the host. Therefore, if the transformant of the present invention is cultured under appropriate conditions, and then the medium chain fatty acid or the lipid comprising this as a constituent component is recovered from the obtained culture, the medium chain fatty acid or the lipid comprising this constituent is obtained. Can be manufactured efficiently.
  • the method for producing a lipid of the present invention comprises a step of culturing a transformant introduced with a gene encoding acyl-ACP thioesterase under appropriate conditions to obtain a culture from the viewpoint of improving lipid productivity, and It is preferable to include a step of collecting lipid from the obtained culture.
  • culturing a transformant means culturing and growing a microorganism, algae, a plant, an animal, and cells and tissues thereof, and includes cultivating the plant in soil or the like.
  • the “culture” includes, in addition to the culture solution, the transformant itself after culturing and the like.
  • Culture conditions can be appropriately selected depending on the host of the transformant, and culture conditions generally used for the host can be used. From the viewpoint of lipid production efficiency, for example, glycerol, acetic acid, malonic acid, or the like may be added to the medium as a substrate of acyl-ACP thioesterase or a precursor involved in the fatty acid biosynthesis system.
  • a transformant using Escherichia coli as a host culturing in an LB medium or Overnight Express Instant TB Medium (Novagen) at 30 to 37 ° C. for 0.5 to 1 day can be mentioned.
  • a transformant using Arabidopsis as a host it is cultivated for 1 to 2 months in soil under a temperature condition of 20 to 25 ° C. and under a light condition such as continuous irradiation with white light or a light period of 16 hours and a dark period of 8 hours. Can be mentioned.
  • the culture medium may be based on natural seawater or artificial seawater, or a commercially available culture medium may be used.
  • the medium include f / 2 medium, ESM medium, Daigo IMK medium, L1 medium, and MNK medium.
  • f / 2 medium, ESM medium, or Daigo IMK medium is preferable, f / 2 medium or Daigo IMK medium is more preferable, and f / 2 medium is further included. preferable.
  • nitrogen sources, phosphorus sources, metal salts, vitamins, trace metals, and the like can be appropriately added to the medium.
  • the amount of algae inoculated on the medium is not particularly limited, but is preferably 1 to 50% (vol / vol), more preferably 1 to 10% (vol / vol) per medium from the viewpoint of growth.
  • the culture temperature is not particularly limited as long as it does not adversely affect the growth of algae, but it is usually in the range of 5 to 40 ° C. From the viewpoint of promoting the growth of algae, improving the productivity of fatty acids, and reducing the production cost, the temperature is preferably 10 to 35 ° C, more preferably 15 to 30 ° C.
  • the light irradiation may be performed under conditions that allow photosynthesis, and may be artificial light or sunlight.
  • the illuminance upon light irradiation is preferably in the range of 100 to 50000 lux, more preferably in the range of 300 to 10000 lux, and still more preferably in the range of 1000 to 6000 lux, from the viewpoint of promoting the growth of algae and improving the productivity of fatty acids. It is. Further, the light irradiation interval is not particularly limited, but from the same viewpoint as described above, it is preferably performed in a light / dark cycle, and the light period in 24 hours is preferably 8 to 24 hours, more preferably 10 to 18 hours, More preferably, it is 12 hours.
  • the concentration of carbon dioxide in the gas is not particularly limited, but is preferably 0.03 (similar to atmospheric conditions) to 10%, more preferably 0.05 to 5%, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids. More preferably, it is 0.1 to 3%, and still more preferably 0.3 to 1%.
  • the concentration of the carbonate is not particularly limited. For example, when sodium bicarbonate is used, it is preferably 0.01 to 5% by mass, more preferably 0.05 to 2% by mass, from the viewpoint of promoting growth and improving the productivity of fatty acids.
  • the content is 0.1 to 1% by mass.
  • the culture time is not particularly limited, and may be performed for a long period of time (for example, about 150 days) so that algal bodies that accumulate lipids at a high concentration can grow at a high concentration.
  • the culture period is preferably 3 to 90 days, more preferably 3 to 30 days, and even more preferably 7 to 30 days.
  • culture cultivation may be any of aeration stirring culture, shaking culture, or stationary culture, and aeration stirring culture is preferable from the viewpoint of improving aeration.
  • a method for collecting lipid produced in the transformant a method usually used for isolating lipid components in a living body, for example, filtration, centrifugation, cell culture from the aforementioned culture or transformant
  • a lipid component is isolated and recovered by crushing, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, chloroform / methanol extraction method, hexane extraction method or ethanol extraction method.
  • oil can be recovered from the culture or transformant by pressing or extraction, and then subjected to general purification such as degumming, deoxidation, decolorization, dewaxing, and deodorization to obtain lipids. .
  • a fatty acid can be obtained by hydrolyzing the isolated lipid.
  • the method for isolating the fatty acid from the lipid component include a method of treating at a high temperature of about 70 ° C. in an alkaline solution, a method of treating with lipase, a method of decomposing using high-pressure hot water, and the like.
  • the acyl-ACP thioesterase of the present invention has high specificity for medium chain acyl-ACP, C12 to C16 acyl-ACP, particularly C12 acyl-ACP and C14 acyl-ACP.
  • medium chain fatty acids in the total fatty acid component for example, fatty acids having 8 to 16 carbon atoms, preferably fatty acids having 8 to 14 carbon atoms, more preferably fatty acids having 10 to 14 carbon atoms, more preferably carbon numbers.
  • the content of 12 to 14 fatty acids, more preferably 12 and 14 fatty acids, more preferably 12 fatty acids is increased.
  • the production method of the present invention using the transformant is suitable for lipid production, particularly medium chain fatty acids, preferably fatty acids having 8 to 16 carbon atoms, more preferably fatty acids having 8 to 14 carbon atoms, more preferably carbon numbers. It is suitably used for the production of fatty acids having 10 to 14 fatty acids, more preferably fatty acids having 12 to 14 carbon atoms, more preferably fatty acids having 12 and 14 carbon atoms, more preferably fatty acids having 12 carbon atoms, or lipids composed thereof. be able to.
  • the lipid produced in the production method of the present invention preferably contains a fatty acid or a fatty acid compound, and more preferably contains a fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, from the viewpoint of its availability.
  • the lipid produced in the production method of the present invention is preferably a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 8 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof.
  • the fatty acid having 10 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof more preferably a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 and 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof. More preferably, it contains a fatty acid having 12 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof.
  • the fatty acid contained in the lipid or its fatty acid ester compound is preferably a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof from the viewpoint of availability to a surfactant or the like, and a fatty acid having 8 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof.
  • a fatty acid having 10 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof is more preferable, a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof is more preferable, and a fatty acid having 12 or 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof is more preferable.
  • a C12 fatty acid or a fatty acid ester compound thereof is more preferable.
  • the fatty acid ester compound is preferably a simple lipid or a complex lipid, more preferably a simple lipid, and even more preferably triacylglycerol.
  • Fatty acids and lipids obtained by the production method of the present invention and transformants are used as food, as emulsifiers for cosmetics, detergents such as soaps and detergents, fiber treatment agents, hair rinse agents, or bactericides and preservatives. Can be used.
  • the present invention further discloses the following methods, transformants, proteins, and genes.
  • a method for producing lipid comprising culturing a transformant into which a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) is introduced into a host, and collecting the lipid from the culture.
  • a protein comprising the amino acid sequence of positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • B A protein comprising an amino acid sequence having 80% or more identity with the amino acid sequence at positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1 and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • C A protein having the amino acid sequence of the protein (A) or (B) and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • ⁇ 2> Fatty acid produced in the cells of the transformant or lipid comprising this as a constituent, comprising the step of introducing a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) into the host A way to increase productivity.
  • lipid is a medium-chain fatty acid or a lipid containing this as a constituent.
  • a medium-chain fatty acid produced in a cell of the transformant comprising a step of introducing a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) into the host to obtain a transformant,
  • a method for modifying a lipid composition which improves the productivity of lipids comprising this as a constituent component, and modifies the total fatty acids produced or the composition of fatty acids or lipids in the total lipids.
  • ⁇ 5> A method for producing lipid, comprising culturing a transformant in which expression of a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) is promoted, and collecting lipid from the culture.
  • ⁇ 6> A fatty acid produced in a cell of a transformant or a lipid comprising the same, comprising a step of promoting the expression of a gene encoding any one of the proteins (A) to (C). A way to increase productivity.
  • ⁇ 7> The method according to ⁇ 6>, wherein the lipid is a medium-chain fatty acid or a lipid comprising this as a constituent.
  • ⁇ 8> Medium chain fatty acids produced in cells of transformants by promoting the expression of a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) or lipids comprising the same
  • a method for modifying the composition of lipids which improves productivity and modifies the composition of fatty acids or lipids in total fatty acids or total lipids produced.
  • ⁇ 9> The method according to any one of ⁇ 5> to ⁇ 9>, wherein a gene encoding any one of the proteins (A) to (C) is introduced into a host to promote expression of the gene. Method.
  • the identity with the amino acid sequence at positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1 is 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 96% or more.
  • the protein (B) has one or several, preferably 1 to 20 and more preferably 1 to 15 amino acid sequences in the amino acid sequence at positions 611 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • ⁇ 12> The protein according to any one of the above ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the protein (C) is composed of an amino acid sequence in which the amino acid at the N-terminal side is deleted at any position of positions 1 to 610 of SEQ ID NO: 1.
  • the method described. ⁇ 13> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 9>, wherein the protein (C) is any one of the following proteins (C1) to (C20).
  • C1 A protein comprising the amino acid sequence of positions 1 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C2 A protein comprising the amino acid sequence of positions 487 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C3 A protein comprising the amino acid sequence of positions 488 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C4 A protein comprising the amino acid sequence of positions 497 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C5 A protein comprising the amino acid sequence of positions 507 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C6 A protein comprising the amino acid sequence of positions 517 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C7 A protein comprising the amino acid sequence of positions 527 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C8 A protein comprising the amino acid sequence of positions 537 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C9 A protein comprising the amino acid sequence of positions 547 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C10 A protein comprising the amino acid sequence of positions 557 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • (C11) A protein comprising the amino acid sequence of positions 567 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C12 A protein comprising the amino acid sequence of positions 577 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C13 A protein comprising the amino acid sequence of positions 587 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C14 A protein comprising the amino acid sequence of positions 597 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C15 A protein comprising the amino acid sequence of positions 607 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • (C16) A protein comprising the amino acid sequence of positions 608 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • C17 A protein comprising the amino acid sequence of positions 609 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • (C18) A protein comprising the amino acid sequence of positions 610 to 772 of SEQ ID NO: 1.
  • Identity with any one amino acid sequence of the proteins (C1) to (C18) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably Is a protein having an amino acid sequence of 96% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and still more preferably 99% or more, and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • ⁇ 14> The above ⁇ 1> to ⁇ 13, wherein the gene encoding any one of the proteins (A) to (C) is a gene consisting of any one of the following DNA (a) to (f): The method of any one of>.
  • DNA encoding a protein having acyl-ACP thioesterase activity More preferably 97% or more, more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more, and a DNA encoding a protein having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the DNA (b) has one or more, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 15, more preferably 1 or more nucleotide sequences in the DNA (a). 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2 Consisting of a base sequence in which a single base is deleted, substituted, inserted or added, and a DNA encoding a protein having acyl-ACP thioesterase activity, or a base sequence complementary to the DNA (a)
  • the method according to ⁇ 14> above which is a DNA that hybridizes with DNA under stringent conditions and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity.
  • DNA (c) comprises a base sequence deleted at the 5′-terminal side at an arbitrary position from positions 1 to 1830 of SEQ ID NO: 2.
  • DNA (c) is any one of the following DNA (c1) to (c20).
  • (c1) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • c2 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1459 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • c3 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1462 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c4) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1489 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • c5 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1519 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c6) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1549 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • c7 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1579 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c8) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1609 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • c9) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1639 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c10) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1669 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c11) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1699 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c12) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1729 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c13) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1759 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c14) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1789 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • (c15) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1819 to 2319 of SEQ ID NO: 2.
  • the identity with any one of the base sequences of DNA (c1) to (c18) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, more More preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity DNA.
  • (c20) One or several, preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more in any one of the base sequences of DNA (c1) to (c18) 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2 DNA encoding a protein having a base sequence in which a single base is deleted, substituted, inserted, or added, and having acyl-ACP thioesterase activity.
  • the DNA (e) has one or more, preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more, in the base sequence of the DNA (d). 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2 Consisting of a base sequence in which a single base is deleted, substituted, inserted or added, and a DNA encoding a protein having acyl-ACP thioesterase activity, or a base sequence complementary to the DNA (d)
  • the method according to ⁇ 14> above which is a DNA that hybridizes with DNA under stringent conditions and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity.
  • DNA (f) comprises a base sequence deleted at the 5′-terminal side at any position from positions 1 to 372 of SEQ ID NO: 3.
  • DNA (f) is any one of the following DNA (f1) to (f19).
  • (f1) DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 1 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • f2 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 4 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • f3 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 31 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • f6 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 121 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • f8 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 181 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 367 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • f17 DNA consisting of the nucleotide sequence of positions 370 to 861 of SEQ ID NO: 3.
  • the identity with any one of the DNA sequences (c1) to (f17) is 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, more More preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99% or more, and encodes a protein having acyl-ACP thioesterase activity DNA.
  • (f19) One or several, preferably 1 or more and 20 or less, more preferably 1 or more and 15 or less, more preferably 1 or more, in any one of the base sequences of DNA (f1) to (f17) 10 or less, more preferably 1 or more and 8 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, more preferably 1 or more and 4 or less, more preferably 1 or more and 3 or less, more preferably 1 or 2
  • ⁇ 21> The method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 20>, wherein a host of the transformant is a microorganism.
  • a host of the transformant is a microorganism.
  • the microorganism is Escherichia coli.
  • the microorganism is a microalgae.
  • the microalgae are algae belonging to the genus Nannochloropsis, preferably Nannochloropsis oculata.
  • the lipid is a medium chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 8 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof.
  • a fatty acid having 10 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof more preferably a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 and 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more
  • ⁇ 27> A gene encoding the protein according to ⁇ 26>.
  • ⁇ 28> A gene comprising any one of DNA (a) to (f) defined in any one of ⁇ 1> to ⁇ 25>.
  • ⁇ 29> A recombinant vector containing the gene according to ⁇ 27> or ⁇ 28>.
  • ⁇ 30> A transformant obtained by introducing the gene according to ⁇ 27> or ⁇ 28> or the recombinant vector according to ⁇ 29> into a host.
  • ⁇ 31> A method for producing a transformant, wherein the gene according to ⁇ 27> or ⁇ 28> or the recombinant vector according to ⁇ 29> is introduced into a host.
  • ⁇ 32> A transformant that promotes the expression of the gene according to ⁇ 27> or ⁇ 28>.
  • ⁇ 33> The transformant according to any one of ⁇ 30> to ⁇ 32> or a method for producing the transformant, wherein a host of the transformant is a microorganism.
  • ⁇ 34> The transformant according to ⁇ 33> or the method for producing the same, wherein the microorganism is Escherichia coli.
  • ⁇ 35> The transformant according to ⁇ 33> or the method for producing the same, wherein the microorganism is a microalgae.
  • ⁇ 36> The transformant according to ⁇ 35>, wherein the microalgae are algae belonging to the genus Nannochloropsis, preferably Nannochloropsis oculata, or a method for producing the same.
  • the lipid is a medium chain fatty acid or a fatty acid ester compound thereof, preferably a fatty acid having 8 to 16 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 8 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof.
  • the fatty acid having 10 or more and 14 or less, or a fatty acid ester compound thereof more preferably a fatty acid having 12 to 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably a fatty acid having 12 or 14 carbon atoms or a fatty acid ester compound thereof, more preferably.
  • Example 1 Acquisition of acyl-ACP thioesterase gene, transformation into E. coli, and production of lipid by transformant
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) of the protein with unknown function derived from Guildia seta registered as Accession No. XP_005824882 and the gene sequence (SEQ ID NO: 2) encoding the same were obtained.
  • this protein is also referred to as “GtTE”
  • the gene encoding the protein is also referred to as “GtTE gene”.
  • nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3 is used as the nucleotide sequence of positions 1459 to 2319 of SEQ ID NO: 2 (corresponding to positions 487 to 772 of SEQ ID NO: 1) in which codon optimization is performed in accordance with the codon usage of E. coli.
  • An array was obtained.
  • the gene consisting of the base sequence of SEQ ID NO: 3 was obtained using an artificial gene contract synthesis service provided by Operon Biotechnology.
  • GtTE gene expression plasmids in which the N-terminal region of SEQ ID NO: 1 was deleted at various lengths were constructed. PCR was performed using the plasmid GtTE_487 as a template, a primer pair consisting of any one of the primer numbers 8 to 23 shown in Table 1 and the primer number 6 primer, and the obtained gene fragment was obtained in the same manner as described above.
  • the plasmid GtTE_487 is constructed so as to remove the amino acid sequence at positions 1 to 486 on the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, and encodes the amino acid sequence at positions 487 to 772 of SEQ ID NO: 1 as the GtTE gene.
  • plasmid GtTE_497, plasmid GtTE_507, plasmid GtTE_517, plasmid GtTE_527, plasmid GtTE_537, plasmid GtTE_547, plasmid GtTE_557, plasmid GtTE_567, plasmid GtTE_577, plasmid GtTE_587, plasmid GtTE_597, plasmid GtTE_607, plasmid GtTE_608, plasmid GtTE_608, plasmid GtTE_608, plasmid GtTE_608, plasmid GtTE_608, plasmid GtTE_608, plasmid GtTE_608, plasmid GtTE_608, plasmid GtTE_608 GtTE_611 is N-terminal 1 to 496, 1 to 506, 1 to 516, 1 to 526, 1 to
  • the amino acid sequence at positions 1 to 29 on the N-terminal side of the LacZ protein derived from the plasmid vector pBluescriptII SK (-) is upstream of the site from which the N-terminal side of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 has been removed. It was constructed to express the fused protein.
  • the obtained colonies were inoculated into 2 mL of Overnight Express Instant TB Medium (Novagen) and cultured with shaking at 30 ° C. After 24 hours of culture, the lipid components contained in the culture solution were analyzed by the following method. As a negative control, the same experiment was performed for E. coli K27 strain transformed with the plasmid vector pBluescriptII SK (-).
  • Nitrogen gas was blown onto the resulting chloroform layer to dry it, 0.7 mL of 0.5N potassium hydroxide / methanol solution was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 1 mL of a methanol solution of 14% boron trifluoride (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 1 mL each of hexane and saturated saline was added and stirred vigorously. After standing at room temperature for 10 minutes or longer, the upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid methyl ester.
  • the fatty acid methyl ester was identified by subjecting the sample to gas chromatograph mass spectrometry analysis under the same conditions.
  • the amount of methyl ester of each fatty acid was quantified from the peak area of the waveform data obtained by gas chromatography analysis.
  • Each peak area was compared with the peak area of 7-pentadecanone, which is an internal standard, to correct between samples, and the amount of each fatty acid per liter of culture solution was calculated.
  • the sum total of each fatty acid amount was made into the total fatty acid amount, and the ratio of each fatty acid amount to the total fatty acid amount was calculated.
  • Table 3 The results are shown in Table 3.
  • TFA represents the total fatty acid content
  • Fatty Acid Composition (% TFA)” represents the ratio (weight percent) of each fatty acid to the total fatty acid.
  • Cx: y represents a fatty acid having x carbon atoms and y double bonds
  • C17: 0 ⁇ ” and “C19: 0 ⁇ ” are cis-9,10-methylenehexadecanoic acid ( cis-9,10-Methylen-hexadecanoic acid) and cis-11,12-methyleneoctadecanoic acid.
  • the strain into which any one of various GtTE gene expression plasmids was introduced had a higher total fatty acid content than the plasmid vector pBluescriptII SK (-) introduced strain (“pBS” in the table), which is a negative control.
  • the proportions of C12: 1 fatty acid, C12: 0 fatty acid, C14: 1 fatty acid, C14: 0 fatty acid, and C16: 1 fatty acid are greatly increased.
  • the ratio of C14 fatty acids (C14: 1 fatty acids, C14: 0 fatty acids) was significantly increased.
  • the total fatty acid amount (TFA) was also increased in these GtTE gene expression plasmid-introduced strains.
  • GtTE_587, GtTE_597, GtTE_607, GtTE_608 or GtTE_609 introduced strain, C12: 1 fatty acid, C12: 0 fatty acid, C14: 1 fatty acid, C14: 0 fatty acid, C16: 1 fatty acid increase, and total fatty acid amount increase was remarkable. From these results, it was confirmed that the proteins encoded by the genes introduced into various GtTE gene expression plasmids have acyl-ACP thioesterase activity.
  • these proteins markedly increased the ratio and production amount of C12 fatty acid and C14 fatty acid, they are considered to be acyl-ACP thioesterases having high specificity for C12 fatty acid and C14 fatty acid, particularly C14 fatty acid. . From the above results, it is recognized that a protein having at least the region from position 611 to position 772 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 exhibits acyl-ACP thioesterase activity.
  • Example 2 Transformation of Nannochloropsis oculata with GtTE gene and production of lipid with transformant (1) Construction of plasmid for expression of zeocin resistance gene Zeocin resistance gene (SEQ ID NO: 24) and literature (Randor Radakovits, et al., Nature Communications, DOI: 10.1038 / ncomms1688, 2012), the tubulin promoter sequence (SEQ ID NO: 25) derived from the Nannochloropsis gaditana CCMP526 strain was artificially synthesized.
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 26 and primer number 27 and the primer pair of primer number 28 and primer number 29 shown in Table 2, and the zeocin resistance gene and the tubulin promoter sequence were determined. Each was amplified. PCR was performed using the genome of Nannochloropsis oculata NIES2145 strain as a template and the primer pair of primer number 30 and primer number 31 shown in Table 2 to amplify the heat shock protein terminator sequence (SEQ ID NO: 32).
  • PCR was performed using the primer pair of primer number 33 and primer number 34 shown in Table 2 to amplify the plasmid vector pUC19.
  • GtTE gene expression plasmid PCR was performed using the GtTE gene artificially synthesized in Example 1 as a template and any one of primer numbers 35 to 39 shown in Table 2 and the primer pair of primer number 40.
  • GtTE gene fragments were obtained by deleting the 5 ′ base sequence of SEQ ID NO: 3 with various lengths.
  • the primer pair of primer number 41 and primer number 42, the primer pair of primer number 43 and primer number 44 shown in Table 2, and the primer pair of primer number 45 and primer number 46 PCR was performed using each primer pair to obtain an LDSP promoter sequence (SEQ ID NO: 47), a VCP1 chloroplast transfer signal sequence (SEQ ID NO: 48), and a VCP1 terminator sequence (SEQ ID NO: 49).
  • PCR was performed using the above-mentioned zeocin resistance gene expression plasmid as a template and the primer pair of primer number 50 and primer number 34 shown in Table 2, and a zeocin resistance gene expression cassette (tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat The fragment consisting of the shock protein terminator sequence) and the pUC19 sequence was amplified.
  • GtTE gene expression plasmids GtTE_488-Nanno, GtTE_527-Nanno, GtTE_587-Nanno, GtTE_597-Nanno and GtTE_607-Nanno, respectively.
  • These plasmids are the LDSP promoter sequence, the VCP1 chloroplast translocation signal in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, positions 488 to 772, 527 to 772, 587 to 772, 597 to 772, or 607 to 772. Insert sequence linked in the order of GtTE gene, VCP1 terminator sequence, tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat shock protein terminator sequence linked to the 5 'end of the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of the position, and pUC19 vector Consists of an array.
  • GtTE gene expression cassette (LDSP promoter sequence, VCP1 chloroplast transfer signal, N-terminal side 1 to 487 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1) GtTE gene, VCP1 terminator sequence, tubulin promoter sequence, zeocin resistance gene, heat, from which the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence at position 1, 1-526, 1-586, 1-596, or 1-606 is removed DNA fragments consisting of shock protein terminator sequences) were amplified. Each amplified fragment was purified using High Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Note that sterilized water was used for elution during purification, not the elution buffer included in the kit.
  • Nannochloropsis oculata strain NIES2145 were washed with a 384 mM sorbitol solution to completely remove salts, and used as host cells for transformation.
  • About 500 ng of the GtTE gene expression cassette amplified above was mixed with host cells, and electroporation was performed under the conditions of 50 ⁇ F, 500 ⁇ , and 2,200 v / 2 mm.
  • the mixture was applied to a 2 ⁇ g / mL zeocin-containing f / 2 agar medium, and cultured at 25 ° C. in a 0.3% CO 2 atmosphere under 12 h / 12 h light / dark conditions for 2 to 3 weeks.
  • those containing the GtTE gene expression cassette were selected by the PCR method.
  • Nitrogen gas was blown onto the resulting chloroform layer to dry it, 0.7 mL of 0.5N potassium hydroxide / methanol solution was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 30 minutes. Subsequently, 1 mL of 14% boron trifluoride methanol solution (manufactured by SIGMA) was added, and the temperature was kept constant at 80 ° C. for 10 minutes. Thereafter, 0.5 mL of hexane and 1 mL of saturated saline were added and stirred vigorously, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. The upper hexane layer was recovered to obtain a fatty acid methyl ester.
  • Nannochloropsis transformants into which the GtTE gene expression cassette was introduced (“GtTE_488-Nanno”, “GtTE_527-Nanno”, “GtTE_587-Nanno”, “GtTE_597-Nanno” in Table 4, In all of “GtTE — 607-Nanno”), the ratio of C10: 0 fatty acid, C12: 0 fatty acid, and C14: 0 fatty acid was increased as compared with the wild type strain (“WT” in Table 4).

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Abstract

【課題】中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法を提供する。 【解決手段】宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。 (A)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。 (B)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。 (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。

Description

アシル－ＡＣＰチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法
　本発明は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼを用いた脂質の製造方法に関する。また、本発明は当該方法に用いるアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ、これをコードする遺伝子、及び該遺伝子を導入した形質転換体に関する。
　脂肪酸は脂質の主要構成成分の１つであり、生体内においてグリセリンとのエステル結合により生成するトリアシルグリセロール等の脂質を構成する。また、多くの動植物において脂肪酸はエネルギー源として貯蔵され利用される物質でもある。動植物内に蓄えられた脂肪酸や脂質は、食用又は工業用として広く利用されている。
　例えば、炭素数１２～１８前後の高級脂肪酸を還元して得られる高級アルコールの誘導体は、界面活性剤として用いられている。アルキル硫酸エステル塩やアルキルベンゼンスルホン酸塩等は陰イオン性界面活性剤として利用されている。また、ポリオキシアルキレンアルキルエーテルやアルキルポリグリコシド等は非イオン性界面活性剤として利用されている。そしてこれらの界面活性剤は、いずれも洗浄剤又は殺菌剤に利用されている。同じ高級アルコールの誘導体としてアルキルアミン塩やモノ又はジアルキル４級アミン塩は、繊維処理剤や毛髪リンス剤又は殺菌剤等に日常的に利用されている。また、ベンザルコニウム型４級アンモニウム塩は殺菌剤や防腐剤として日常的に利用されている。さらに、炭素数１８前後の高級アルコールは植物の成長促進剤としても有用である。
　このように脂肪酸や脂質の利用は多岐にわたり、そのため植物等において生体内での脂肪酸や脂質の生産性を向上させる試みが行われている。さらに、脂肪酸の用途や有用性はその炭素数に依存するため、脂肪酸の炭素数、即ち鎖長を制御する試みも行われている。
　例えば、ゲッケイジュ（Umbellularia　californica（California　bay））由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼの導入により炭素数１２の脂肪酸を蓄積させる方法（特許文献１、非特許文献１）等が提案されている。
　近年、バイオ燃料生産に有用であるとして、藻類が注目を集めている。藻類は、バイオディーゼル燃料として利用可能な脂質を光合成によって生産でき、しかも食料と競合しないことから、次世代のバイオマス資源として注目されている。また、藻類は、植物に比べ、高い脂質生産・蓄積能力を有するとの報告もある。
　藻類の脂質合成メカニズムやそれを応用した生産技術について研究が始まってはいるが、未解明な部分も多い。例えば、上述のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼについても、現在のところ、藻類由来のものはほとんど報告されておらず、ナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属等でわずかに報告例があるのみである（例えば、特許文献２）。
国際公開第９２／２０２３６号 国際公開第２０１４／１０３９３０号
Voelker　TA，et　al.，Science，1992，vol．257(5066)，p．72-74
　本発明は、宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法に関する。
(A)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のタンパク質のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
　また、本発明は、前記タンパク質(A)～(C)（以下、本発明のタンパク質又はアシル－ＡＣＰチオエステラーゼともいう。）に関する。
　また、本発明は、前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子（以下、本発明の遺伝子ともいう。）に関する。
　また、本発明は、前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を宿主に導入してなる形質転換体に関する。
　本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の記載からより明らかになるであろう。
　本発明は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる、脂質の製造方法の提供に関する。
　また、本発明は、前記方法に好適に用いることができる、藻類由来の新規アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ、及びこれをコードする遺伝子の提供に関する。
　また、本発明は、前記遺伝子の発現を促進させ、脂質の生産性又は脂肪酸組成が変化した形質転換体の提供に関する。
　本発明者は、藻類由来の新たなアシル－ＡＣＰチオエステラーゼについて研究を行った。その結果、クリプト藻（cryptophyte）から新規のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ及びこれをコードするアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を見出した。そして、当該アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を用いて形質転換を行った結果、形質転換体において、脂質中の総脂肪酸成分における特定の脂肪酸の含有率が有意に向上することを見出した。
　本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
　本発明によれば、新規アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ、これをコードする遺伝子、及び当該遺伝子が導入されている形質転換体を提供することができる。当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性に優れる。特に、本発明の製造方法は炭素数８～１６、好ましくは炭素数８～１４、より好ましくは炭素数１０～１４、より好ましくは炭素数１２～１４、より好ましくは炭素数１２及び１４、より好ましくは炭素数１２の脂肪酸、又はこれらを構成成分とする脂質の生産性に優れる。
　本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ、これをコードする遺伝子、形質転換体、及び製造方法は、脂肪酸又は脂質の工業的生産に好適に用いることができる。
　本発明において「脂質」には、単純脂質、複合脂質及び誘導脂質が含まれ、具体的には、脂肪酸、脂肪族アルコール類、炭化水素類（アルカン等）、中性脂質（トリアシルグリセロール等）、ろう、セラミド、リン脂質、糖脂質、スルホ脂質等が含まれる。
　また本明細書において、脂肪酸や脂肪酸を構成するアシル基の表記において「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数がｘで二重結合の数がｙであることを表す。「Ｃｘ」は炭素原子数ｘの脂肪酸やアシル基を表す。
　さらに本明細書において、塩基配列及びアミノ酸配列の同一性は、Lipman-Pearson法（Science，1985，vol．227，p．1435-1441）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Winのホモロジー解析（Search　homology）プログラムを用いて、Unit　size　to　compare（ktup）を2として解析を行うことにより算出される。
　また本明細書において「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular　Cloning－A　LABORATORY　MANUAL　THIRD　EDITION［Joseph　Sambrook，David　W．Russell.，Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press］記載の方法が挙げられる。例えば、６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣの組成：０．１５Ｍ塩化ナトリウム、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、pH７．０）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート及び１００ｍｇ／ｍＬニシン精子ＤＮＡを含む溶液にプローブとともに６５℃で８～１６時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
　また、本明細書において、「～」を用いて表される数値範囲は、「～」前後に記載される数値を下限値および上限値として含む範囲を意味する。
　さらに本明細書において「中鎖」とは、脂肪酸又は脂肪酸残基の炭素数が８以上１６以下であることをいう。
　以下、本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ、これを用いた形質転換体及び脂質の製造方法について順に説明する。
１．アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ
　本発明のタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列中の少なくとも６１１位～７７２位までのアミノ酸配列を有するタンパク質、及び当該タンパク質と機能的に均等なタンパク質である。
　アシル－ＡＣＰ（アシルキャリヤープロテイン）チオエステラーゼは、脂肪酸やその誘導体（トリアシルグリセロール（トリグリセリド）等）の生合成系に関与する酵素である。当該酵素は、植物体や藻類では葉緑体等の色素体内において、細菌・真菌や動物体では細胞質内において、脂肪酸生合成過程の中間体であるアシル－ＡＣＰ（脂肪酸残基であるアシル基とアシルキャリヤープロテインとからなる複合体）のチオエステル結合を加水分解し、遊離の脂肪酸を生成する。アシル－ＡＣＰチオエステラーゼの作用によって、ＡＣＰ上での脂肪酸合成が終了し、切り出された脂肪酸はトリアシルグリセロール等の合成に供される。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼには、基質であるアシル－ＡＣＰを構成するアシル基（脂肪酸残基）の炭素原子数や不飽和結合数によって異なる反応特異性を示す複数のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼが存在していることが知られている。よってアシル－ＡＣＰチオエステラーゼは、生体内での脂肪酸組成を決める重要なファクターであると考えられている。
　本発明において、「アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性」とは、アシル－ＡＣＰのチオエステル結合を加水分解する活性をいう。
　本発明のタンパク質として、具体的には以下のタンパク質(A)～(C)が挙げられる。
(A)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
　配列番号１は、クリプト藻の１種であるグィラルディア・セータ（Guillardia　theta）由来のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ（以下、「ＧｔＴＥ」とも略記する）のアミノ酸配列である。
　グィラルディア・セータのゲノム配列情報は公開されているが、配列番号１に示すアミノ酸配列の機能はこれまで知られていなかった。本発明者は、配列番号１に示すアミノ酸配列からなるタンパク質が、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼであることを同定した。さらに、本発明者が、配列番号１のアミノ酸配列と他の公知のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼのアミノ酸配列を比較したところ、配列同一性（相同性）が非常に低かった。
　さらに、本発明者は、配列番号１のアミノ酸配列中、６１１位～７７２位の領域がアシル－ＡＣＰチオエステラーゼとして機能するために重要で、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示すために十分な領域であることを見出した。すなわち、配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質、及び当該アミノ酸配列を含むタンパク質は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する。
　タンパク質(A)は、このアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性にとって十分な領域からなり、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼとして機能する。
　タンパク質(B)は、配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有する。
　一般に、酵素タンパク質をコードしているアミノ酸配列は、必ずしも全領域の配列が保存されていなければ酵素活性を示さないというものではなく、アミノ酸配列が変化しても酵素活性に影響を与えない領域も存在することが知られている。このような酵素活性に必須でない領域においては、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は付加といった変異が導入されても酵素本来の活性を維持することができる。本発明においても、このようにアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性が保持され、かつアミノ酸配列が一部変異したタンパク質を用いることができる。
　タンパク質(B)において、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９６％以上がよりさらに好ましく、９７％以上がよりさらに好ましく、９８％以上がよりさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。
　また、タンパク質(B)において、配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列としては、配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列において１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、よりさらに好ましくは１個以上１０個以下、よりさらに好ましくは１個以上８個以下、よりさらに好ましくは１個以上５個以下、よりさらに好ましくは１個以上４個以下、よりさらに好ましくは１個以上３個以下、よりさらに好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
　なお、アミノ酸配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、アミノ酸配列をコードする塩基配列に変異を導入する方法が挙げられる。塩基配列に変異を導入する方法については、後述する。
　タンパク質(C)は、そのアミノ酸配列の一部として前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を含み、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示す。タンパク質(C)は、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列以外の配列を含んでいてもよい。
　タンパク質(C)を構成するアミノ酸配列中、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列以外の配列としては、例えば、配列番号１のうちの６１１位～７７２位以外の任意のアミノ酸配列、配列番号１のうちの６１１位～７７２位以外の任意のアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列、又はこれらの配列に１若しくは数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列、等が挙げられる。これらの配列は、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列のＮ末端側に付加されることが好ましい。
　また、タンパク質(C)として、前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列にタンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドが付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。シグナルペプチドの付加の例としては、葉緑体移行シグナルペプチドのＮ末端への付加等が挙げられる。
　前記タンパク質(C)として、配列番号１の１～６１０位の任意の位置でＮ末端側のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
　さらに、特定の脂肪酸、例えば中鎖脂肪酸の生産性の点からは、タンパク質(C)としては、下記タンパク質(C1)～(C20)が好ましい。
(C1)配列番号１の１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C2)配列番号１の４８７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C3)配列番号１の４８８位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C4)配列番号１の４９７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C5)配列番号１の５０７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C6)配列番号１の５１７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C7)配列番号１の５２７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C8)配列番号１の５３７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C9)配列番号１の５４７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C10)配列番号１の５５７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C11)配列番号１の５６７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C12)配列番号１の５７７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C13)配列番号１の５８７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C14)配列番号１の５９７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C15)配列番号１の６０７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C16)配列番号１の６０８位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C17)配列番号１の６０９位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C18)配列番号１の６１０位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C19)前記タンパク質(C1)～(C18)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C20)前記タンパク質(C1)～(C18)のいずれか１つのアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
　なお、前記タンパク質(C1)～(C18)がアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、本発明者により確認されている。
　本発明のタンパク質(C)として好ましくは、前記タンパク質(C13)、前記タンパク質(C14)、前記タンパク質(C15)、前記タンパク質(C16)、前記タンパク質(C17)、前記タンパク質(C13)～(C17)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質、又は前記タンパク質(C13)～(C17)のいずれか１つのアミノ酸配列に１若しくは数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である。
　タンパク質がアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することは、例えば、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結したＤＮＡを脂肪酸分解系が欠損した宿主細胞へ導入し、導入したアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で培養して、宿主細胞又は培養液中の脂肪酸組成の変化をガスクロマトグラフィー解析等の方法を用いて分析することにより、確認することができる。
　また、大腸菌等の宿主細胞内で機能するプロモーターの下流にアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を連結したＤＮＡを宿主細胞へ導入し、導入したアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子が発現する条件で細胞を培養した後、細胞の破砕液に対し、Yuanらの方法（Yuan　L，et　al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1995，vol．92(23)，p．10639-10643）によって調製した各種アシル－ＡＣＰを基質とした反応を行うことにより、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を測定することができる。
　本発明のタンパク質の取得方法については特に制限はなく、通常行われる化学的或いは遺伝子工学的手法等により得ることができる。例えば、グィラルディア・セータから単離、精製等することで天然物由来のタンパク質を取得することができる。また、化学合成によりタンパク質合成を行ってもよく、遺伝子組み換え技術により組換えタンパク質を作製してもよい。組換えタンパク質を作製する場合には、後述するアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を用いることができる。
　また、グィラルディア・セータ等のクリプト藻は、私的又は公的な研究所等の保存機関より入手することもできる。例えば、National　Center　for　Marine　Algae　and　Microbiota（NCMA：旧CCMP）、The　culture　collection　of　algae　at　University　of　Texas　at　Austin（UTEX）、独立行政法人国立環境研究所（NIES）、Culture　Collection　of　Algae　and　Protozoa（CCAP）、Australian　National　Algae　Culture　Collection（CSIRO）等から入手できる。
２．アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子
　本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子は、前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子である。
　タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の例として、配列番号２や配列番号３に示す塩基配列からなる遺伝子が挙げられる。
　配列番号２に示す塩基配列は、グィラルディア・セータ由来の野生型アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子の塩基配列の一例である。配列番号２の１８３１位～２３１６位の塩基配列は、配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列をコードする。なお、配列番号２の２３１７位～２３１９位の塩基配列は終止コドンであり、アミノ酸には対応していない。
　配列番号３に示す塩基配列は、配列番号１のアミノ酸配列情報に基づいて、大腸菌のコドン使用頻度に合わせてコドン最適化を施した塩基配列である。配列番号３の１位～８５８位の塩基配列は、配列番号１の４８７位～７７２位のアミノ酸配列をコードする。配列番号３の３７３位～８５８位の塩基配列は、配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列をコードする。なお、配列番号３の８５９位～８６１位の塩基配列は終止コドンであり、アミノ酸には対応していない。
　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の具体例として、下記ＤＮＡ(a)～(f)のいずれか１つからなる遺伝子が例示できる。しかし、本発明はこれらに限定されるものではない。
(a)配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(b)配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(d)配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(e)配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(f)前記ＤＮＡ(d)又は(e)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　ＤＮＡ(b)において、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列との同一性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９６％以上がよりさらに好ましく、９７％以上がよりさらに好ましく、９８％以上がよりさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。
　また、ＤＮＡ(b)において、配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列としては、配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列において１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列が挙げられる。
　ＤＮＡ(e)において、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性の点から、配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列との同一性は、８５％以上が好ましく、９０％以上がより好ましく、９５％以上がさらに好ましく、９６％以上がよりさらに好ましく、９７％以上がよりさらに好ましく、９８％以上がよりさらに好ましく、９９％以上がよりさらに好ましい。
　また、ＤＮＡ(e)において、配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列としては、配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列において１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列が挙げられる。
　塩基配列に欠失、置換、挿入、付加等の変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的な変異導入法が挙げられる。具体的な部位特異的変異の導入方法としては、Splicing　overlap　extension（SOE）PCR（Horton　et　al.，Gene，1989，vol．77，p．61-68）を利用した方法、ＯＤＡ法（Hashimoto-Gotoh　et　al.，Gene，1995，vol．152，p．271-276）、Kunkel法（Kunkel，T．A.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1985，vol．82，p．488）等が挙げられる。また、Site-Directed　Mutagenesis　System　Mutan-SuperExpress　Kmキット（タカラバイオ社）、Transformer　TM　Site-Directed　Mutagenesisキット（Clonetech社）、KOD-Plus-Mutagenesis　Kit（東洋紡社）等の市販のキットを利用することもできる。また、ランダムな遺伝子変異を与えた後、適当な方法により酵素活性の評価及び遺伝子解析を行うことにより目的遺伝子を取得することもできる。
　さらにＤＮＡ(b)として、ＤＮＡ(a)と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　同様に、ＤＮＡ(e)として、ＤＮＡ(d)と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも好ましい。
　ＤＮＡ(c)は、その塩基配列の一部として前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を含み、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。ＤＮＡ(c)は、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列以外の配列を含んでいてもよい。
　ＤＮＡ(c)の塩基配列中、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列以外の配列としては、例えば、配列番号２のうちの１８３１位～２３１９位以外の任意の塩基配列、配列番号２のうちの１８３１位～２３１９位以外の任意の塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列、又は配列番号２のうちの１８３１位～２３１９位以外の任意の塩基配列に１若しくは数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列、等が挙げられる。
　また、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列以外の配列としては、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列も好ましい。シグナルペプチドとしては、前記タンパク質(C)で述べたものが挙げられる。
　これらの配列は、前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列の5'末端側に付加されることが好ましい。
　前記ＤＮＡ(c)として、配列番号２の１～１８３０位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
　さらに、特定の脂肪酸、例えば中鎖脂肪酸の生産性の点からは、ＤＮＡ(c)としては、下記ＤＮＡ(c1)～(c20)が好ましい。
(c1)配列番号２の１位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c2)配列番号２の１４５９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c3)配列番号２の１４６２位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c4)配列番号２の１４８９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c5)配列番号２の１５１９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c6)配列番号２の１５４９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c7)配列番号２の１５７９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c8)配列番号２の１６０９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c9)配列番号２の１６３９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c10)配列番号２の１６６９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c11)配列番号２の１６９９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c12)配列番号２の１７２９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c13)配列番号２の１７５９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c14)配列番号２の１７８９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c15)配列番号２の１８１９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c16)配列番号２の１８２２位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c17)配列番号２の１８２５位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c18)配列番号２の１８２８位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c19)前記ＤＮＡ(c1)～(c18)のいずれか１つの塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c20)前記ＤＮＡ(c1)～(c18)のいずれか１つの塩基配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　なお、前記ＤＮＡ(c1)～(c18)のいずれか１つからなる遺伝子がアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードしていることは、本発明者により確認されている。
　ＤＮＡ(f)は、その塩基配列の一部として前記ＤＮＡ(d)又は(e)の塩基配列を含み、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードする。ＤＮＡ(f)は、前記ＤＮＡ(d)又は(e)の塩基配列以外の配列を含んでいてもよい。
　ＤＮＡ(f)の塩基配列中、前記ＤＮＡ(d)又は(e)の塩基配列以外の配列としては、例えば、配列番号３のうちの３７３位～８６１位以外の任意の塩基配列、配列番号３のうちの３７３位～８６１位以外の任意の塩基配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列、又は配列番号３のうちの３７３位～８６１位以外任意の塩基配列に１若しくは数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列、等が挙げられる。
　また、前記ＤＮＡ(d)又は(e)の塩基配列以外の配列としては、タンパク質の輸送や分泌に関与するシグナルペプチドをコードする塩基配列も好ましい。シグナルペプチドとしては、前記タンパク質(C)で述べたものが挙げられる。
　これらの配列は、前記ＤＮＡ(d)又は(e)の塩基配列の5'末端側に付加されることが好ましい。
　前記ＤＮＡ(f)として、配列番号３の１～３７２位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなるＤＮＡであってもよい。
　さらに、特定の脂肪酸、例えば中鎖脂肪酸の生産性の点からは、ＤＮＡ(f)としては、下記ＤＮＡ(f1)～(f19)が好ましい。
(f1)配列番号３の１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f2)配列番号３の４位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f3)配列番号３の３１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f4)配列番号３の６１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f5)配列番号３の９１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f6)配列番号３の１２１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f7)配列番号３の１５１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f8)配列番号３の１８１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f9)配列番号３の２１１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f10)配列番号３の２４１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f11)配列番号３の２７１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f12)配列番号３の３０１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f13)配列番号３の３３１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f14)配列番号３の３６１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f15)配列番号３の３６４位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f16)配列番号３の３６７位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f17)配列番号３の３７０位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f18)前記ＤＮＡ(f1)～(f17)のいずれか１つの塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(f19)前記ＤＮＡ(f1)～(f17)のいずれか１つの塩基配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
　なお、前記ＤＮＡ(f1)～(f17)のいずれか１つからなる遺伝子がアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードしていることは、本発明者により確認されている。
　本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得方法としては、特に制限されず、通常の遺伝子工学的手法により得ることができる。例えば、配列番号１に示すアミノ酸配列又は配列番号２や３に示す塩基配列に基づいて、人工合成により遺伝子を取得することができる。遺伝子の人工合成は、例えば、ユーロフィンジェノミクス社等のサービスを利用することができる。また、グィラルディア・セータからクローニングによって取得することもでき、例えば、Molecular　Cloning－A　LABORATORY　MANUAL　THIRD　EDITION［Joseph　Sambrook，David　W.　Russell，Cold　Spring　Harbor　Laboratory　Press（2001）］記載の方法等により行うことができる。
３．形質転換体
　本発明の形質転換体は、前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させた形質転換体である。
　当該形質転換体では、脂質の生産能、特に中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産能（中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産量、生産される全脂肪酸に占める中鎖脂肪酸の割合、生産される全脂質に占める中鎖脂肪酸を構成成分とする脂質の割合）が有意に向上する。また、当該形質転換体では、宿主と比べ、脂質中の脂肪酸組成（生産される全脂肪酸に対する特定の脂肪酸の割合、生産される全脂質に占める特定の脂肪酸を構成成分とする脂質の割合）が変化する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、特定の脂質、特に中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、好ましくは炭素数８以上１６以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素数８以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素数１０以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、より好ましくは炭素数１２以上１４以下の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、よりさらに好ましくは炭素数１２及び１４の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、よりさらに好ましくは炭素数１２の脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質、の生産に好適に用いることができる。
　さらに、本態様の形質転換体は、宿主自体に比べ、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が有意に向上する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明は、脂質の生産に好適に用いることができる。
　なお、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼの脂肪酸又は脂質の生産能については、実施例で用いた方法により測定することができる。また本明細書において、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させたものを「形質転換体」ともいい、目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を促進させていないものを「宿主」又は「野生株」ともいう。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させる方法としては、常法より適宜選択することができる。例えば、前記アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主に導入する方法、前記アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域（プロモーター、ターミネーター等）を改変する方法、などが挙げられる。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　本発明で好ましく用いることができる形質転換体は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を、通常の遺伝子工学的方法によって宿主に導入することで得られる。具体的には、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主細胞中で発現させることのできる発現ベクターや遺伝子発現カセットを調製し、これを宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させることにより作製できる。
　形質転換体の宿主としては特に限定されず、通常用いられるものより適宜選択することができる。例えば、微生物（藻類や微細藻類を含む）、植物体、又は動物体を用いることができる。製造効率及び得られた脂質の利用性の点から、宿主は微生物又は植物体であることが好ましく、微生物であることがより好ましい。
　前記微生物は原核生物、真核生物のいずれであってもよく、エシェリキア（Escherichia）属に属する微生物、バシラス（Bacillus）属に属する微生物、シネコシスティス（Synechocystis）属の微生物、シネココッカス（Synechococcus）属の微生物等の原核生物、又は酵母や糸状菌等の真核微生物を用いることができる。なかでも、脂質生産性の観点から、エシェリキア属に属する微生物である大腸菌（Escherichia　coli）、バシラス属に属する微生物である枯草菌（Bacillus　subtilis）、酵母に属する微生物である赤色酵母（Rhodosporidium　toruloides）、又は糸状菌に属する微生物であるモルチエレラ・エスピー（Mortierella　sp．）が好ましく、大腸菌がより好ましい。
　前記藻類や微細藻類としては、遺伝子組換え手法が確立している観点から、クラミドモナス（Chlamydomonas）属に属する藻類、クロレラ（Chlorella）属に属する藻類、ファエオダクティラム（Phaeodactylum）属に属する藻類、又はナンノクロロプシス属に属する藻類が好ましく、ナンノクロロプシス属に属する藻類がより好ましい。ナンノクロロプシス属に属する藻類として具体的には、ナンノクロロプシス・オキュラータ、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Nannochloropsis　gaditana）、ナンノクロロプシス・サリナ（Nannochloropsis　salina）、ナンノクロロプシス・オセアニカ（Nannochloropsis　oceanica）、ナンノクロロプシス・アトムス（Nannochloropsis　atomus）、ナンノクロロプシス・マキュラタ（Nannochloropsis　maculata）、ナンノクロロプシス・グラニュラータ（Nannochloropsis　granulata）、ナンノクロロプシス・エスピー（Nannochloropsis　sp．）、等が挙げられる。なかでも、脂質生産性の観点から、ナンノクロロプシス・オキュラータ、又はナンノクロロプシス・ガディタナが好ましく、ナンノクロロプシス・オキュラータがより好ましい。
　前記植物体としては、種子に脂質を高含有する観点から、シロイヌナズナ（Arabidopsis　thaliana）、ナタネ、ココヤシ、パーム、クフェア、又はヤトロファが好ましく、シロイヌナズナがより好ましい。
　遺伝子発現用プラスミドベクター又は遺伝子発現カセットの母体となるベクター（プラスミド）としては、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を宿主に導入することができ、宿主細胞内で当該遺伝子を発現させることができるベクターであればよい。例えば、導入する宿主の種類に応じたプロモーターやターミネーター等の発現調節領域を有するベクターであって、複製開始点や選択マーカー等を有するベクターを用いることができる。また、プラスミド等の染色体外で自立増殖・複製するベクターであってもよいし、染色体内に組み込まれるベクターであってもよい。
　具体的なベクターとしては、微生物を宿主とする場合には、例えば、pBluescript（pBS）　II　SK(-)（Stratagene社製）、pSTV系ベクター（タカラバイオ社製）、pUC系ベクター（宝酒造社製）、pET系ベクター（タカラバイオ社製）、pGEX系ベクター（GEヘルスケア社製）、pCold系ベクター（タカラバイオ社製）、pHY300PLK（タカラバイオ社製）、pUB110（Mckenzie，T.　et　al.,（1986）,Plasmid　15（2）；p.93-103）、pBR322（タカラバイオ社製）、pRS403（ストラタジーン社製）、又はpMW218/219（ニッポンジーン社製）が挙げられる。特に、宿主が大腸菌の場合は、pBluescript　II　SK(-)、又はpMW218/219が好ましく用いられる。
　藻類を宿主とする場合には、例えば、pUC19（タカラバイオ社製）、P66（Chlamydomonas　Center）、P-322（Chlamydomonas　Center）、pPha-T1（Yangmin　Gong，et　al.，Journal　of　Basic　Microbiology，2011，vol．51，p．666-672参照）、又はpJET1（コスモ・バイオ社製）が挙げられる。特に、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合は、pUC19、pPha-T1、又はpJET1が好ましく用いられる。また、宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合には、Oliver　Kilian，et　al. ，Proceedings　of　the　National　Academy　of　Sciences　of　the　United　States　of　America，2011，vol．108(52)記載の方法を参考にして、本発明の遺伝子、プロモーター及びターミネーターからなるＤＮＡ断片（遺伝子発現カセット）を用いて宿主を形質転換することもできる。このＤＮＡ断片としては、例えば、ＰＣＲにより増幅したＤＮＡ断片や制限酵素切断ＤＮＡ断片が挙げられる。
　植物細胞を宿主とする場合には、例えば、pRI系ベクター（タカラバイオ社製）、pBI系ベクター（クロンテック社製）、又はIN3系ベクター（インプランタイノベーションズ社製）が挙げられる。特に、宿主がシロイヌナズナの場合は、pRI系ベクター又はpBI系ベクターが好ましく用いられる。
　また、前記に組み込んだ目的のタンパク質をコードする遺伝子の発現を調整するプロモーターやターミネーターの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができるプロモーターとしては、例えば、lacプロモーター、trpプロモーター、tacプロモーター、trcプロモーター、T7プロモーター、SpoVGプロモーター、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導可能な誘導体に関するプロモーター、Rubiscoオペロン（rbc）、PSI反応中心タンパク質（psaAB）、PSIIのD1タンパク質（psbA）、カリフラワーモザイクウイルス35SRNAプロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター（例えば、チューブリンプロモーター、アクチンプロモーター、ユビキチンプロモーター等）、ナタネ由来Napin遺伝子プロモーター、植物由来Rubiscoプロモーター、ナンノクロロプシス属由来のビオラキサンチン／クロロフィルａ結合タンパク質ＶＣＰ１遺伝子のプロモーター（VCP1プロモーター、VCP2プロモーター）（国際公開第２０１４／１０３９３０号）、又はナンノクロロプシス属由来のオレオシン様タンパクＬＤＳＰ（lipid　droplet　surface　protein）遺伝子のプロモーター（Astrid　Vieler，et　al.，PLOS　Genetics,　2012;8(11):e1003064．Doi：10.1371）が挙げられる。
　また、目的のタンパク質をコードする遺伝子が組み込まれたことを確認するための選択マーカーの種類も、使用する宿主の種類に応じて適宜選択することができる。本発明で好ましく用いることができる選択マーカーとしては、アンピシリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、ブラストサイジンＳ耐性遺伝子、ビアラホス耐性遺伝子、ゼオシン耐性遺伝子、パロモマイシン耐性遺伝子、又はハイグロマイシン耐性遺伝子等の薬剤耐性遺伝子が挙げられる。さらに、栄養要求性に関連する遺伝子の欠損等を選択マーカー遺伝子として使用することも可能である。
　目的のタンパク質をコードする遺伝子の前記ベクターへの導入は、制限酵素処理やライゲーション等の通常の手法によって行うことができる。また、発現ベクターを構築する際には、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子に加え、当該遺伝子の翻訳に有用な配列、例えば開始コドンや終止コドンに相当する配列等を適宜補うことができる。
　形質転換方法としては、宿主に目的遺伝子を導入しうる方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオンを用いる方法、一般的なコンピテントセル形質転換方法（J．Bacterial．93，1925（1967））、プロトプラスト形質転換法（Mol．Gen．Genet．168，111（1979））、エレクトロポレーション法（FEMS　Microbiol．Lett．55，135（1990））又はLP形質転換方法（T．Akamatsu，et　al.，Archives　of　Microbiology，1987，146，p.353-357；T．Akamatsu，et　al.，Bioscience，Biotechnology，and　Biochemistry，2001，65，4，p.823-829）等を用いることができる。宿主がナンノクロロプシス属に属する藻類の場合、Randor　Radakovits，et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012、に記載のエレクトロポレーション法を用いて形質転換を行うこともできる。
　目的遺伝子断片が導入された形質転換体の選択は、選択マーカー等を利用することで行うことができる。例えば、ベクター由来の薬剤耐性遺伝子が、形質転換時に目的ＤＮＡ断片とともに宿主細胞中に導入された結果、形質転換体が獲得する薬剤耐性を指標に行うことができる。また、ゲノムを鋳型としたＰＣＲ法等によって、目的ＤＮＡ断片の導入を確認することもできる。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子をゲノム上に有する宿主において、当該遺伝子の発現調節領域を改変して、前記遺伝子の発現を促進させる方法について説明する。
　「発現調節領域」とは、プロモーターやターミネーターを示し、これらの配列は一般に隣接する遺伝子の発現量（転写量、翻訳量）の調節に関与している。ゲノム上に前述のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主においては、当該遺伝子の発現調節領域を改変して前記アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることで、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させることができる。
　発現調節領域の改変方法としては、例えばプロモーターの入れ替えが挙げられる。ゲノム上に前述のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子を有する宿主において、当該遺伝子のプロモーター（以下、「アシル－ＡＣＰチオエステラーゼプロモーター」ともいう）を、より転写活性の高いプロモーターに入れ替えることで、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることができる。
　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼプロモーターの入れ替えに用いるプロモーターとしては特に限定されず、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼプロモーターよりも転写活性が高く、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産に適したものから適宜選択することができる。
　前述のプロモーターの改変は、相同組換えなどの常法に従い行うことができる。具体的には、標的とするプロモーターの上流、下流領域を含み、標的プロモーターに代えて別のプロモーターを含む直鎖状のDNA断片を構築し、これを宿主細胞に取り込ませ、宿主ゲノムの標的プロモーターの上流側と下流側とで２回交差の相同組換えを起こす。その結果、ゲノム上の標的プロモーターが別のプロモーター断片と置換され、プロモーターを改変することができる。
　このような相同組換えによる標的プロモーターの改変方法は、例えば、Besher　et　al.，Methods　in　molecular　biology，1995，vol．47，p．291-302等の文献を参考に行うことができる。
４．脂質の製造方法
　本発明の形質転換体は、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性が、宿主と比較して向上している。したがって、本発明の形質転換体を適切な条件で培養し、次いで得られた培養物から中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を回収すれば、中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質を効率よく製造することができる。
　本発明の脂質の製造方法は、脂質の生産性向上の観点から、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼをコードする遺伝子を導入した形質転換体を適切な条件にて培養して培養物を得る工程、及び得られた培養物から脂質を採取する工程を含むことが好ましい。
　なお、本発明において形質転換体を培養するとは、微生物、藻類、植物体、動物体、及びそれらの細胞や組織を培養、生育することをいい、植物体を土壌等で栽培することも含まれる。ここで「培養物」とは、培養液の他に、培養等した後の形質転換体そのものも含まれる。
　培養条件は、形質転換体の宿主に応じて適宜選択することができ、その宿主に対して通常用いられる培養条件を使用できる。
　また、脂質の生産効率の点から、培地中に、例えばアシル－ＡＣＰチオエステラーゼの基質或いは脂肪酸生合成系に関与する前駆物質としてグリセロール、酢酸、又はマロン酸等を添加してもよい。
　一例として、大腸菌を宿主として用いた形質転換体の場合、ＬＢ培地又はOvernight　Express　Instant　TB　Medium（Novagen社）で、３０～３７℃、０．５～１日間培養を行うことが挙げられる。
　また、シロイヌナズナを宿主として用いた形質転換体の場合、土壌で温度条件２０～２５℃、白色光を連続照射又は明期１６時間・暗期８時間等の光条件下で１～２か月間栽培を行うことが挙げられる。
　形質転換の宿主が藻類の場合、培地は天然海水又は人工海水をベースにしたものを使用してもよいし、市販の培養培地を使用してもよい。具体的な培地としては、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、ダイゴＩＭＫ培地、Ｌ１培地、ＭＮＫ培地、等を挙げることができる。なかでも、脂質の生産性向上及び栄養成分濃度の観点から、ｆ／２培地、ＥＳＭ培地、又はダイゴＩＭＫ培地が好ましく、ｆ／２培地、又はダイゴＩＭＫ培地がより好ましく、ｆ／２培地がさらに好ましい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上のため、培地に、窒素源、リン源、金属塩、ビタミン類、微量金属等を適宜添加することができる。培地に接種する藻類の量は特に限定されないが、生育性の点から、培地当り１～５０％（vol/vol）が好ましく、１～１０％（vol/vol）がより好ましい。培養温度は、藻類の増殖に悪影響を与えない範囲であれば特に制限されないが、通常、５～４０℃の範囲である。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、好ましくは１０～３５℃であり、より好ましくは１５～３０℃である。
　また、藻類の培養は、光合成ができるよう光照射下で行うことが好ましい。光照射は、光合成が可能な条件であればよく、人工光でも太陽光でもよい。光照射時の照度としては、藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から、好ましくは１００～５００００ルクスの範囲、より好ましくは３００～１００００ルクスの範囲、さらに好ましくは１０００～６０００ルクスの範囲である。また、光照射の間隔は、特に制限されないが、前記と同様の観点から、明暗周期で行うことが好ましく、２４時間のうち明期が好ましくは８～２４時間、より好ましくは１０～１８時間、さらに好ましくは１２時間である。
　また、藻類の培養は、光合成ができるように二酸化炭素を含む気体の存在下、又は炭酸水素ナトリウムなどの炭酸塩を含む培地で行うことが好ましい。気体中の二酸化炭素の濃度は特に限定されないが、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０３（大気条件と同程度）～１０％が好ましく、より好ましくは０．０５～５％、さらに好ましくは０．１～３％、よりさらに好ましくは０．３～１％である。炭酸塩の濃度は特に限定されないが、例えば炭酸水素ナトリウムを用いる場合、生育促進、脂肪酸の生産性向上の観点から０．０１～５質量％が好ましく、より好ましくは０．０５～２質量％、さらに好ましくは０．１～１質量％である。
　培養時間は特に限定されず、脂質を高濃度に蓄積する藻体が高い濃度で増殖できるように、長期間（例えば１５０日程度）行なってもよい。藻類の生育促進、脂肪酸の生産性向上、及び生産コストの低減の観点から、培養期間は、好ましくは３～９０日間、より好ましくは３～３０日間、さらに好ましくは７～３０日間である。なお、培養は、通気攪拌培養、振とう培養又は静置培養のいずれでもよく、通気性の向上の観点から、通気攪拌培養が好ましい。
　形質転換体において産生された脂質を採取する方法としては、通常生体内の脂質成分等を単離する際に用いられる方法、例えば、前述の培養物や形質転換体から、ろ過、遠心分離、細胞の破砕、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、クロロホルム／メタノール抽出法、ヘキサン抽出法、又はエタノール抽出法等により脂質成分を単離、回収する方法が挙げられる。より大規模な場合は、培養物や形質転換体より油分を圧搾又は抽出により回収後、脱ガム、脱酸、脱色、脱蝋、脱臭等の一般的な精製を行い、脂質を得ることができる。このように脂質成分を単離した後、単離した脂質を加水分解することで脂肪酸を得ることができる。脂質成分から脂肪酸を単離する方法としては、例えば、アルカリ溶液中で７０℃程度の高温で処理をする方法、リパーゼ処理をする方法、又は高圧熱水を用いて分解する方法等が挙げられる。
　本発明のアシル－ＡＣＰチオエステラーゼは、中鎖アシル－ＡＣＰ、Ｃ１２～Ｃ１６アシル－ＡＣＰ、特にＣ１２アシル－ＡＣＰとＣ１４アシル－ＡＣＰに対する特異性が高い。本発明の形質転換体では、総脂肪酸成分における中鎖脂肪酸、例えば炭素数８～１６の脂肪酸、好ましくは炭素数８～１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１０～１４の脂肪酸、より好ましく炭素数１２～１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２と１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２の脂肪酸、の含有率が増加する。そのため、当該形質転換体を用いた本発明の製造方法は、脂質生産、特に中鎖脂肪酸、好ましくは炭素数８～１６の脂肪酸、より好ましくは炭素数８～１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１０～１４の脂肪酸、より好ましく炭素数１２～１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２及び１４の脂肪酸、より好ましくは炭素数１２の脂肪酸、又はこれを構成成分とする脂質の生産に好適に用いることができる。
　本発明の製造方法において製造される脂質は、その利用性の点から、脂肪酸又は脂肪酸化合物を含んでいることが好ましく、脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含んでいることがさらに好ましい。具体的には本発明の製造方法において製造される脂質は、好ましくは炭素数が８以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が８以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１０以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは１２以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２及び１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数が１２の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む。脂質中に含まれる脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物は、界面活性剤等への利用性から、炭素数８～１６の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物が好ましく、炭素数８～１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素数１０～１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素数１２～１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素数１２及び１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましく、炭素数１２の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物がより好ましい。
　脂肪酸エステル化合物は、生産性の点から、単純脂質又は複合脂質が好ましく、単純脂質がさらに好ましく、トリアシルグリセロールがさらにより好ましい。
　本発明の製造方法、形質転換体により得られる脂肪酸や脂質は、食用として用いる他、化粧品等の乳化剤、石鹸や洗剤等の洗浄剤、繊維処理剤、毛髪リンス剤、又は殺菌剤や防腐剤として利用することができる。
　上述した実施形態に関し、本発明はさらに以下の方法、形質転換体、タンパク質、遺伝子を開示する。
＜１＞　宿主に前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。
(A)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
＜２＞　宿主に前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入する工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる方法。
＜３＞　前記脂質が中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質である、前記＜２＞記載の方法。
＜４＞　宿主に前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜５＞　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現が促進されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。
＜６＞　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させる工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる方法。
＜７＞　前記脂質が中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質である、前記＜６＞記載の方法。
＜８＞　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子の発現を促進させて、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
＜９＞　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を宿主に導入して前記遺伝子の発現を促進させる、前記＜５＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１０＞　前記タンパク質(B)において、配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、より好ましくは９９％以上である、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１１＞　前記タンパク質(B)が、配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、よりさらに好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質である、前記＜１＞～＜１０＞のいずれか１項記載の方法。
＜１２＞　前記タンパク質(C)が、配列番号１の１～６１０位の任意の位置でＮ末端側のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなる、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
＜１３＞　前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)～(C20)のいずれか１つである、前記＜１＞～＜９＞のいずれか１項記載の方法。
(C1)配列番号１の１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C2)配列番号１の４８７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C3)配列番号１の４８８位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C4)配列番号１の４９７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C5)配列番号１の５０７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C6)配列番号１の５１７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C7)配列番号１の５２７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C8)配列番号１の５３７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C9)配列番号１の５４７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C10)配列番号１の５５７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C11)配列番号１の５６７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C12)配列番号１の５７７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C13)配列番号１の５８７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C14)配列番号１の５９７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C15)配列番号１の６０７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C16)配列番号１の６０８位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C17)配列番号１の６０９位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C18)配列番号１の６１０位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C19)前記タンパク質(C1)～(C18)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
(C20)前記タンパク質(C1)～(C18)のいずれか１つのアミノ酸配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
＜１４＞　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ(a)～(f)のいずれか１つからなる遺伝子である、前記＜１＞～＜１３＞のいずれか１項記載の方法。
(a)配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(b)配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(d)配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(e)配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、より好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(f)前記ＤＮＡ(d)又は(e)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１５＞　前記ＤＮＡ(b)が、前記ＤＮＡ(a)の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ(a)と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、である、前記＜１４＞項記載の方法。
＜１６＞　前記ＤＮＡ(c)が、配列番号２の１～１８３０位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなる、前記＜１４＞項記載の方法。
＜１７＞　前記ＤＮＡ(c)が、下記ＤＮＡ(c1)～(c20)のいずれか１つである、前記＜１４＞項記載の方法。
(c1)配列番号２の１位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c2)配列番号２の１４５９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c3)配列番号２の１４６２位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c4)配列番号２の１４８９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c5)配列番号２の１５１９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c6)配列番号２の１５４９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c7)配列番号２の１５７９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c8)配列番号２の１６０９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c9)配列番号２の１６３９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c10)配列番号２の１６６９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c11)配列番号２の１６９９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c12)配列番号２の１７２９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c13)配列番号２の１７５９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c14)配列番号２の１７８９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c15)配列番号２の１８１９位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c16)配列番号２の１８２２位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c17)配列番号２の１８２５位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c18)配列番号２の１８２８位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(c19)前記ＤＮＡ(c1)～(c18)のいずれか１つの塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(c20)前記ＤＮＡ(c1)～(c18)のいずれか１つの塩基配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜１８＞　前記ＤＮＡ(e)が、前記ＤＮＡ(d)の塩基配列に、１若しくは複数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１若しくは２個、の塩基が欠失、置換、挿入、若しくは付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、又は前記ＤＮＡ(d)と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、である、前記＜１４＞項記載の方法。
＜１９＞　前記ＤＮＡ(f)が、配列番号３の１～３７２位の任意の位置で5'末端側が欠失した塩基配列からなる、前記＜１４＞項記載の方法。
＜２０＞　前記ＤＮＡ(f)が、下記ＤＮＡ(f1)～(f19)のいずれか１つである、前記＜１４＞項記載の方法。
(f1)配列番号３の１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f2)配列番号３の４位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f3)配列番号３の３１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f4)配列番号３の６１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f5)配列番号３の９１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f6)配列番号３の１２１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f7)配列番号３の１５１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f8)配列番号３の１８１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f9)配列番号３の２１１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f10)配列番号３の２４１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f11)配列番号３の２７１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f12)配列番号３の３０１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f13)配列番号３の３３１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f14)配列番号３の３６１位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f15)配列番号３の３６４位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f16)配列番号３の３６７位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f17)配列番号３の３７０位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
(f18)前記ＤＮＡ(c1)～(f17)のいずれか１つの塩基配列との同一性が８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、よりさらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９６％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、よりさらに好ましくは９８％以上、よりさらに好ましくは９９％以上、の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
(f19)前記ＤＮＡ(f1)～(f17)のいずれか１つの塩基配列に１又は数個、好ましくは１個以上２０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、より好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上８個以下、より好ましくは１個以上５個以下、より好ましくは１個以上４個以下、より好ましくは１個以上３個以下、より好ましくは１又は２個、の塩基が欠失、置換、挿入、又は付加された塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
＜２１＞　前記形質転換体の宿主が微生物である、前記＜１＞～＜２０＞のいずれか１項記載の方法。
＜２２＞　前記微生物が大腸菌である、前記＜２１＞項記載の方法。
＜２３＞　前記微生物が微細藻類である、前記＜２１＞項記載の方法。
＜２４＞　前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜２３＞項記載の方法。
＜２５＞　前記脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素数８以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数８以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数１０以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数１２以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数１２及び１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数１２の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、前記＜１＞～＜２４＞のいずれか１項記載の製造方法。
＜２６＞　前記＜１＞～＜２５＞のいずれか１項で規定した、タンパク質(A)～(C)。
＜２７＞　前記＜２６＞項記載のタンパク質をコードする遺伝子。
＜２８＞　前記＜１＞～＜２５＞のいずれか１項で規定した、ＤＮＡ(a)～(f)のいずれか１つからなる遺伝子。
＜２９＞　前記＜２７＞又は＜２８＞項記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
＜３０＞　前記＜２７＞若しくは＜２８＞項記載の遺伝子、又は前記＜２９＞項記載の組換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
＜３１＞　前記＜２７＞若しくは＜２８＞項記載の遺伝子、又は前記＜２９＞項記載の組換えベクターを宿主に導入する、形質転換体の作製方法。
＜３２＞　前記＜２７＞又は＜２８＞項記載の遺伝子の発現を促進させた形質転換体。
＜３３＞　前記形質転換体の宿主が微生物である、前記＜３０＞～＜３２＞のいずれか１項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３４＞　前記微生物が大腸菌である、前記＜３３＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３５＞　前記微生物が微細藻類である、前記＜３３＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３６＞　前記微細藻類がナンノクロロプシス属に属する藻類、好ましくはナンノクロロプシス・オキュラータ、である、前記＜３５＞項記載の形質転換体又はその作製方法。
＜３７＞　脂質を製造するための、前記＜２６＞～＜３６＞のいずれか１項記載のタンパク質、遺伝子、組換えベクター、形質転換体、又は形質転換体の作製方法により得られた形質転換体の使用。
＜３８＞　前記脂質が、中鎖脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、好ましくは炭素数８以上１６以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数８以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは１０以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数１２以上１４以下の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数１２及び１４の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物、より好ましくは炭素数１２の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、前記＜３７＞項記載の使用。
　以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。ここで、本実施例で用いるプライマーの塩基配列を表１及び２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例１　アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得、大腸菌への形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）グィラルディア・セータ由来アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の取得
　National　Center　for　Biotechnology　Information（NCBI）のタンパクデータベースに、Accession　No.　XP_005824882として登録されているグィラルディア・セータ由来の機能未知タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）及びこれをコードする遺伝子配列（配列番号２）を取得した。以下、このタンパク質を「GtTE」ともいい、当該タンパク質をコードする遺伝子を「GtTE遺伝子」ともいう。
　次いで、配列番号２の１４５９～２３１９位の塩基配列（配列番号１の４８７～７７２位に相当）を、大腸菌のコドン使用頻度に合わせてコドン最適化を施した塩基配列として、配列番号３の塩基配列を取得した。なお、配列番号３の塩基配列からなる遺伝子は、オペロンバイオテクノロジー社の提供する人工遺伝子受託合成サービスを利用して取得した。
（２）GtTE遺伝子発現プラスミドの構築
　配列番号３の塩基配列からなる、人工合成遺伝子を鋳型として、表１に示すプライマー番号４及びプライマー番号５のプライマー対を用いたＰＣＲにより、配列番号３の塩基配列からなるGtTE遺伝子を取得した。
　また、プラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)（Stratagene社製）を鋳型として、表１に示すプライマー番号６及びプライマー番号７のプライマー対を用いたＰＣＲによりpBluescriptII　SK(-)を増幅し、制限酵素DpnI（東洋紡社製）処理により鋳型の消化を行った。
　これら２つの断片を、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した後に、In-Fusion　HD　Cloning　Kit（Clontech社製）を用いて融合し、常法に従い大腸菌ＤＨ５α株のコンピテントセル（タカラバイオ社製）への形質転換、プラスミド抽出、及びクローニング断片の塩基配列確認を行い、GtTE遺伝子発現プラスミドGtTE_487を構築した。
　同様に、配列番号１のＮ末端領域を種々の長さで削除した複数のGtTE遺伝子発現プラスミドを構築した。
　前記プラスミドGtTE_487を鋳型とし、表１に示すプライマー番号８～２３のいずれか１つと、プライマー番号６のプライマーとのプライマー対を用いてＰＣＲを行い、得られた遺伝子断片を前記の方法と同様にして精製・融合し、GtTE遺伝子発現プラスミドGtTE_497、GtTE_507、GtTE_517、GtTE_527、GtTE_537、GtTE_547、GtTE_557、GtTE_567、GtTE_577、GtTE_587、GtTE_597、GtTE_607、GtTE_608、GtTE_609、GtTE_610、及びGtTE_611をそれぞれ構築した。
　なお、プラスミドGtTE_487は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側１～４８６位のアミノ酸配列を除去するよう構築され、GtTE遺伝子として、配列番号１の４８７位～７７２位のアミノ酸配列をコードする塩基配列及び終止コドンに対応する配列番号３の１位～８６１位の塩基配列を有する。同様に、プラスミドGtTE_497、プラスミドGtTE_507、プラスミドGtTE_517、プラスミドGtTE_527、プラスミドGtTE_537、プラスミドGtTE_547、プラスミドGtTE_557、プラスミドGtTE_567、プラスミドGtTE_577、プラスミドGtTE_587、プラスミドGtTE_597、プラスミドGtTE_607、プラスミドGtTE_608、プラスミドGtTE_609、プラスミドGtTE_610、及びプラスミドGtTE_611は、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側１～４９６位、１～５０６位、１～５１６位、１～５２６位、１～５３６位、１～５４６位、１～５５６位、１～５６６位、１～５７６位、１～５８６位、１～５９６位、１～６０６位、１～６０７位、１～６０８位、１～６０９位、又は１～６１０位のアミノ酸配列をそれぞれ除去するように構築した。さらに、これらのプラスミドは、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側を除去した部位の上流に、プラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)由来のLacZタンパク質のＮ末端側１位～２９位のアミノ酸配列が融合したタンパク質を発現させるように構築した。
（３）GtTE遺伝子発現プラスミドの大腸菌への導入
　前記の各種GtTE遺伝子発現プラスミドを用いて、大腸菌突然変異株であるK27株（fadD88）（Overath　et　al，Eur．J．Biochem．7，559-574，1969）をコンピテントセル形質転換法により形質転換した。形質転換処理をしたK27株を50μg/mLアンピシリンナトリウム含有ＬＢ寒天培地（Bacto　Trypton　1%、Yeast　Extract　0.5%、NaCl　1%、Agar　1.5%）に播種して30℃で一晩静置し、得られたコロニーを、2mLのOvernight　Express　Instant　TB　Medium（Novagen社）に接種し、30℃で振とう培養した。培養２４時間後、培養液に含まれる脂質成分を、下記方法にて解析した。なお、陰性対照として、プラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)で形質転換した大腸菌K27株についても同様に実験を行った。
（４）培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノン（メタノール溶液）50μLを添加後、クロロホルム0.5mL、メタノール1mL及び2N塩酸10μLを培養液に添加して激しく攪拌し、10分間以上放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl　0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
　得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5N水酸化カリウム／メタノール溶液0.7mLを添加し、80℃で30分間恒温した。続いて14%三フッ化ホウ素のメタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて10分間恒温した。その後、ヘキサン、飽和食塩水を各1mL添加し激しく撹拌し、室温にて10分間以上放置後、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
キャピラリーカラム：DB-1　MS（30m×200μm×0.25μm、J＆W　Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
カラム内流量：1.0mL/分
昇温プログラム：100℃（1分間）→10℃／分→300℃（5分間）
平衡化時間：1分間
注入口：スプリット注入（スプリット比：100:1）
圧力：14.49psi，104mL/分
注入量：1μL
洗浄バイアル：メタノール・クロロホルム
検出器温度：300℃
　また、脂肪酸メチルエステルの同定は、同サンプルを同条件でガスクロマトグラフ質量分析解析に供することにより行った。
　ガスクロマトグラフィー解析により得られた波形データのピーク面積より、各脂肪酸のメチルエステル量を定量した。各ピーク面積を、内部標準である7-ペンタデカノンのピーク面積と比較することで試料間の補正を行い、培養液1Lあたりの各脂肪酸量を算出した。さらに、各脂肪酸量の総和を総脂肪酸量とし、総脂肪酸量に占める各脂肪酸量の割合を算出した。
　結果を表３に示す。なお下記の表において、「ＴＦＡ」は総脂肪酸量を、「脂肪酸組成（％ＴＦＡ）」は総脂肪酸の重量に対する各脂肪酸の重量の割合（重量パーセント）を示す。また「Ｃｘ：ｙ」とあるのは、炭素原子数ｘで二重結合数がｙの脂肪酸を表し、「Ｃ１７：０Δ」及び「Ｃ１９：０Δ」はそれぞれcis-9,10-メチレンヘキサデカン酸（cis-9,10-Methylen-hexadecanoic　acid）及びcis-11,12-メチレンオクタデカン酸（cis-11,12-Methylen-octadecanoic　acid）を表す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３から明らかなように、各種GtTE遺伝子発現プラスミドのいずれか１つを導入した株では、陰性対照であるプラスミドベクターpBluescriptII　SK(-)導入株（表中「pBS」）と比べ、総脂肪酸に占めるＣ１２：１脂肪酸、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：１脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：１脂肪酸の割合が大きく増加した。特に、Ｃ１４脂肪酸（Ｃ１４：１脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸）の割合が顕著に増加した。さらに、これらGtTE遺伝子発現プラスミドの導入株では、総脂肪酸量（ＴＦＡ）も増加していた。特に、プラスミドGtTE_587、GtTE_597、GtTE_607、GtTE_608、又はGtTE_609導入株で、Ｃ１２：１脂肪酸、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：１脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸、Ｃ１６：１脂肪酸の増加、及び総脂肪酸量の増加が顕著であった。
　これらの結果から、各種GtTE遺伝子発現プラスミドに導入した遺伝子がコードするタンパク質は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有することが確認された。また、これらのタンパク質はＣ１２脂肪酸及びＣ１４脂肪酸の割合及び生産量を顕著に増加させたことから、Ｃ１２脂肪酸やＣ１４脂肪酸、特にＣ１４脂肪酸に高い特異性を持つアシル－ＡＣＰチオエステラーゼであると考えられる。
　以上の結果から、配列番号１で示されるアミノ酸配列中、少なくとも６１１位～７７２位の領域を有するタンパク質は、アシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を示すと認められる。
実施例２　GtTE遺伝子によるナンノクロロプシス・オキュラータの形質転換、及び形質転換体による脂質の製造
（１）ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドの構築
　ゼオシン耐性遺伝子（配列番号２４）、及び文献（Randor　Radakovits，et　al.，Nature　Communications，DOI:10.1038/ncomms1688，2012）記載のナンノクロロプシス・ガディタナCCMP526株由来チューブリンプロモーター配列（配列番号２５）を人工合成した。合成したＤＮＡ断片を鋳型として、表２に示すプライマー番号２６及びプライマー番号２７のプライマー対、並びにプライマー番号２８及びプライマー番号２９のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子及びチューブリンプロモーター配列をそれぞれ増幅した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表２に示すプライマー番号３０及びプライマー番号３１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、ヒートショックプロテインターミネーター配列（配列番号３２）を増幅した。
　さらに、プラスミドベクターpUC19（タカラバイオ社製）を鋳型として、表２に示すプライマー番号３３及びプライマー番号３４のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、プラスミドベクターpUC19を増幅した。
　これら４つの増幅断片をそれぞれ制限酵素DpnI（東洋紡社製）にて処理し、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製）を用いて精製した。その後、得られた４つの断片をIn-Fusion　HD　Cloning　Kit（Clontech社製）を用いて融合し、ゼオシン耐性遺伝子発現用プラスミドを構築した。
　なお、本プラスミドは、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順に連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（２）GtTE遺伝子発現用プラスミドの構築
　実施例１で人工合成したGtTE遺伝子を鋳型として、表２に示すプライマー番号３５～３９のいずれか１つと、プライマー番号４０のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、配列番号３の5'側の塩基配列を種々の長さで削除したGtTE遺伝子断片を取得した。
　また、ナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株のゲノムを鋳型として、表２に示すプライマー番号４１及びプライマー番号４２のプライマー対、プライマー番号４３及びプライマー番号４４のプライマー対、並びにプライマー番号４５及びプライマー番号４６のプライマー対をそれぞれ用いたＰＣＲを行い、LDSPプロモーター配列（配列番号４７）、VCP1葉緑体移行シグナル配列（配列番号４８）及びVCP1ターミネーター配列（配列番号４９）を取得した。
　さらに、前述のゼオシン耐性遺伝子発現プラスミドを鋳型として、表２に示すプライマー番号５０及びプライマー番号３４のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、ゼオシン耐性遺伝子発現カセット（チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列）及びpUC19配列からなる断片を増幅した。
　配列番号３の5'側の塩基配列を種々の長さで削除したGtTE遺伝子断片それぞれと、LDSPプロモーター、VCP1葉緑体移行シグナル、VCP1ターミネーターの増幅断片、及びゼオシン耐性遺伝子発現カセットとpUC19配列からなる増幅断片を、前述の方法と同様の方法にて融合し、GtTE遺伝子発現用プラスミドGtTE_488-Nanno、GtTE_527-Nanno、GtTE_587-Nanno、GtTE_597-Nanno、GtTE_607-Nanno、をそれぞれ構築した。
　なお、これらのプラスミドは、LDSPプロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナルを配列番号１に示すアミノ酸配列の４８８～７７２位、５２７～７７２位、５８７～７７２位、５９７～７７２位、若しくは６０７～７７２位のアミノ酸配列をコードする塩基配列の５’末端側に連結させたGtTE遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列の順で連結したインサート配列と、pUC19ベクター配列からなる。
（３）GtTE遺伝子発現カセットのナンノクロロプシス・オキュラータへの導入
　前述のGtTE遺伝子発現用プラスミド（GtTE_488-Nanno、GtTE_527-Nanno、GtTE_587-Nanno、GtTE_597-Nanno、GtTE_607-Nanno）をそれぞれ鋳型として、表２に示すプライマー番号４１及びプライマー番号３１のプライマー対を用いたＰＣＲを行い、GtTE遺伝子発現カセット（LDSPプロモーター配列、VCP1葉緑体移行シグナル、配列番号１に示すアミノ酸配列のＮ末端側１～４８７位、１～５２６位、１～５８６位、１～５９６位、若しくは１～６０６位のアミノ酸配列をコードする塩基配列を除去したGtTE遺伝子、VCP1ターミネーター配列、チューブリンプロモーター配列、ゼオシン耐性遺伝子、ヒートショックプロテインターミネーター配列からなるＤＮＡ断片）をそれぞれ増幅した。
　増幅した断片をそれぞれ、High　Pure　PCR　Product　Purification　Kit（Roche　Applied　Science社製)を用いて精製した。なお、精製の際の溶出には、キットに含まれる溶出バッファーではなく、滅菌水を用いた。
　約1×109細胞のナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株を、384mMのソルビトール溶液で洗浄して塩を完全に除去し、形質転換の宿主細胞として用いた。上記で増幅したGtTE遺伝子発現カセット約500ngを宿主細胞に混和し、50μF、500Ω、2,200v/2mmの条件でエレクトロポレーションを行った。
　ｆ／２液体培地（NaNO3　75mg、NaH2PO4・2H2O　6mg、ビタミンB12　0.5μg、ビオチン　0.5μg、チアミン　100μg、Na2SiO3・9H2O　10mg、Na2EDTA・2H2O　4.4mg、FeCl3・6H2O　3.16mg、FeCl3・6H2O　12μg、ZnSO4・7H2O　21μg、MnCl2・4H2O　180μg、CuSO4・5H2O　7μg、Na2MoO4・2H2O　7μg／人工海水1L）にて２４時間回復培養を行った。その後に、2μg/mLのゼオシン含有ｆ／２寒天培地に塗布し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて2～3週間培養した。得られたコロニーの中から、GtTE遺伝子発現カセットを含むものをＰＣＲ法により選抜した。
（４）培養液中の脂質の抽出及び構成脂肪酸の分析
　選抜した株を、ｆ／２培地の窒素濃度を15倍、リン濃度を5倍に増強した培地（以下、「Ｎ１５Ｐ５培地」という）20mLに播種し、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて4週間振盪培養し、前培養液とした。前培養液2mLを、Ｎ１５Ｐ５培地18mLに植継ぎ、25℃、0.3%CO2雰囲気下、12h/12h明暗条件にて３週間振盪培養した。
　なお、陰性対照として、野生株であるナンノクロロプシス・オキュラータNIES2145株についても同様に実験を行った。
　培養液1mLに、内部標準として1mg/mLの7-ペンタデカノン（メタノール溶液）を50μL添加後、クロロホルム0.5mL及びメタノール1mLを培養液に添加して激しく攪拌し、10分間放置した。その後さらに、クロロホルム0.5mL及び1.5%KCl　0.5mLを添加して攪拌し、3,000rpmにて5分間間遠心分離を行い、パスツールピペットにてクロロホルム層（下層）を回収した。
　得られたクロロホルム層に窒素ガスを吹き付けて乾固し、0.5N水酸化カリウム／メタノール溶液0.7mLを添加し、80℃で30分間恒温した。続いて14%三フッ化ホウ素メタノール溶液（SIGMA社製）1mLを添加し、80℃にて10分間恒温した。その後、ヘキサン0.5mL、及び飽和食塩水1mLを添加し激しく撹拌し、室温にて10分間放置し、上層であるヘキサン層を回収して脂肪酸メチルエステルを得た。
　下記に示す測定条件下で、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィー解析に供した。
＜ガスクロマトグラフィー条件＞
分析装置：7890A（Agilent　technology社製）
キャピラリーカラム：DB-WAX（10m×100μm×0.10μm、J＆W　Scientific社製）
移動相：高純度ヘリウム
オーブン温度：100℃　保持0.5分→100～250℃（20℃/min昇温）→250℃　保持3分（ポストラン：1分）
注入口温度：300℃
注入方法：スプリット注入（スプリット比：50：1）
注入量：5μＬ
洗浄バイアル：メタノール
検出方法：ＦＩＤ
検出器温度：350℃
　脂肪酸メチルエステルの同定及び定量は、実施例１と同様の方法で行った。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４から明らかなように、GtTE遺伝子発現カセットを導入したナンノクロロプシス形質転換体（表４中の「GtTE_488-Nanno」、「GtTE_527-Nanno」、「GtTE_587-Nanno」、「GtTE_597-Nanno」、「GtTE_607-Nanno」）のいずれにおいても、野生株（表４中の「WT」）と比べ、Ｃ１０：０脂肪酸、Ｃ１２：０脂肪酸、Ｃ１４：０脂肪酸の割合が増加していた。さらに、これらのうち２種類の形質転換体（「GtTE_587-Nanno」及び「GtTE_597-Nanno」）においては、野生株では全く検出されないＣ８：０脂肪酸も検出された。さらに、これらすべての形質転換体において、中鎖脂肪酸（Ｃ８～Ｃ１４脂肪酸）の生産量が野生株と比べて増加していた。
　以上のように、本発明で規定するアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ遺伝子の発現を促進させることで、中鎖脂肪酸の生産性及び生産される全脂肪酸の生産性を向上させた形質転換体を作製することができる。そしてこの形質転換体を培養することで、中鎖脂肪酸の生産性を向上させることができる。
　本発明をその実施態様とともに説明したが、我々は特に指定しない限り我々の発明を説明のどの細部においても限定しようとするものではなく、添付の請求の範囲に示した発明の精神と範囲に反することなく幅広く解釈されるべきであると考える。
　本願は、2014年12月5日に日本国で特許出願された特願2014-246573に基づく優先権を主張するものであり、これはここに参照してその内容を本明細書の記載の一部として取り込む。

Claims (20)

  1. 　宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が導入されている形質転換体を培養し、培養物から脂質を採取する、脂質の製造方法。
    (A)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (B)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  2. 　宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入する工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させる方法。
    (A)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (B)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  3. 　宿主に下記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子を導入して形質転換体を得る工程を含む、形質転換体の細胞内で生産される中鎖脂肪酸又はこれを構成成分とする脂質の生産性を向上させ、生産される全脂肪酸又は全脂質中の脂肪酸又は脂質の組成を改変する、脂質の組成の改変方法。
    (A)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (B)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  4. 　前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)～(C20)のいずれか１つである、請求項１～３のいずれか１項記載の方法。
    (C1)配列番号１の１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C2)配列番号１の４８７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C3)配列番号１の４８８位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C4)配列番号１の４９７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C5)配列番号１の５０７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C6)配列番号１の５１７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C7)配列番号１の５２７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C8)配列番号１の５３７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C9)配列番号１の５４７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C10)配列番号１の５５７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C11)配列番号１の５６７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C12)配列番号１の５７７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C13)配列番号１の５８７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C14)配列番号１の５９７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C15)配列番号１の６０７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C16)配列番号１の６０８位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C17)配列番号１の６０９位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C18)配列番号１の６１０位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C19)前記タンパク質(C1)～(C18)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C20)前記タンパク質(C1)～(C18)のいずれか１つのアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  5. 　前記タンパク質(A)～(C)のいずれか１つをコードする遺伝子が、下記ＤＮＡ(a)～(f)のいずれか１つからなる遺伝子である、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
    (a)配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
    (b)配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    (c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    (d)配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
    (e)配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    (f)前記ＤＮＡ(d)又は(e)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  6. 　前記宿主が微生物である、請求項１～５のいずれか１項記載の方法。
  7. 　前記微生物が大腸菌である、請求項６記載の方法。
  8. 　前記微生物が微細藻類である、請求項６記載の方法。
  9. 　前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項８記載の方法。
  10. 　前記脂質が炭素数１２の脂肪酸又はその脂肪酸エステル化合物を含む、請求項１～９のいずれか１項記載の方法。
  11. 　下記タンパク質(A)～(C)。
    (A)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (B)配列番号１の６１１位～７７２位のアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C)前記タンパク質(A)又は(B)のアミノ酸配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  12. 　前記タンパク質(C)が下記タンパク質(C1)～(C20)のいずれか１つである、請求項１１記載のタンパク質。
    (C1)配列番号１の１位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C2)配列番号１の４８７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C3)配列番号１の４８８位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C4)配列番号１の４９７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C5)配列番号１の５０７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C6)配列番号１の５１７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C7)配列番号１の５２７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C8)配列番号１の５３７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C9)配列番号１の５４７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C10)配列番号１の５５７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C11)配列番号１の５６７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C12)配列番号１の５７７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C13)配列番号１の５８７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C14)配列番号１の５９７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C15)配列番号１の６０７位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C16)配列番号１の６０８位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C17)配列番号１の６０９位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C18)配列番号１の６１０位～７７２位のアミノ酸配列からなるタンパク質。
    (C19)前記タンパク質(C1)～(C18)のいずれか１つのアミノ酸配列との同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
    (C20)前記タンパク質(C1)～(C18)のいずれか１つのアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質。
  13. 　請求項１１又は１２記載のタンパク質をコードする遺伝子。
  14. 　下記ＤＮＡ(a)～(f)のいずれか１つからなる遺伝子。
    (a)配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列からなるＤＮＡ。
    (b)配列番号２の１８３１位～２３１９位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    (c)前記ＤＮＡ(a)又は(b)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    (d)配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列からなるＤＮＡ。
    (e)配列番号３の３７３位～８６１位の塩基配列との同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
    (f)前記ＤＮＡ(d)又は(e)の塩基配列を有し、かつアシル－ＡＣＰチオエステラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  15. 　請求項１３又は１４記載の遺伝子を含有する組換えベクター。
  16. 　請求項１３若しくは１４記載の遺伝子、又は請求項１５記載の組換えベクターを、宿主に導入してなる形質転換体。
  17. 　前記宿主が微生物である、請求項１６記載の形質転換体。
  18. 　前記微生物が大腸菌である、請求項１７記載の形質転換体。
  19. 　前記微生物が微細藻類である、請求項１７記載の形質転換体。
  20. 　前記微細藻類がナンノクロロプシス（Nannochloropsis）属に属する藻類である、請求項１９記載の形質転換体。
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