WO2016056630A1 - 細胞培養バッグおよび細胞培養方法 - Google Patents

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WO2016056630A1
WO2016056630A1 PCT/JP2015/078671 JP2015078671W WO2016056630A1 WO 2016056630 A1 WO2016056630 A1 WO 2016056630A1 JP 2015078671 W JP2015078671 W JP 2015078671W WO 2016056630 A1 WO2016056630 A1 WO 2016056630A1
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cell culture
culture bag
tubular portions
tubular
cell
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PCT/JP2015/078671
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英章 香川
創一 小橋
山崎　英数
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富士フイルム株式会社
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    • C12M23/14—Bags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture bag and a cell culture method.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-295904 is made of a gas-permeable plastic, and is formed into a cylindrical shape, a square tube shape with a regular polygonal cross section, a spherical shape, or a hemispherical shape during culture. Cell culture vessels are described.
  • transplantation In order to treat liver disease, heart disease, etc. by cell transplantation, it is considered that transplantation of 1 ⁇ 10 9 or more differentiated cells is necessary for one patient. Therefore, it is essential to develop a mass culture technique for pluripotent stem cells.
  • the quality of the cultured cells becomes non-uniform even though they are cultured in the same cell culture bag.
  • the culture container described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2005-295904 the cell culture environment tends to be non-uniform between a plurality of cylinders formed by heat sealing.
  • the present invention has been made in view of the above points, and provides a cell culture bag and a cell culture method capable of ensuring the uniformity of the culture environment of cells to be cultured even when the cell culture scale is expanded. With the goal.
  • the cell culture bag according to the present invention has a plurality of tubular tubes having gas permeability in which a tube axis direction is oriented in a first direction and juxtaposed in a second direction intersecting the first direction and separated from each other by a partition wall. And a communication part having gas permeability that allows two adjacent tubular parts among the plurality of tubular parts to communicate with each other in an intermediate region between one end and the other end of the tubular part.
  • two or more communicating portions may be provided along the first direction in each of two adjacent tubular portions of the plurality of tubular portions.
  • the positions of the communicating portions in the first direction may be aligned between the two adjacent tubular portions. Further, the diameters of the tubular portions may be the same. Moreover, the diameter of a some tubular part and the diameter of a communicating part may be the same.
  • the cell culture bag of the present invention can be formed by bonding a gas permeable plastic film.
  • the partition wall can be formed by a plurality of seal portions formed on the plastic film. Further, at least one of the plurality of seal portions may have a through hole. The width of the through hole may change along the first direction. It is preferable that the film forming flow direction at the time of forming the plurality of plastic films coincides with the second direction.
  • the plurality of plastic films may transmit visible light.
  • three or more communicating portions may be provided along the first direction in each of two adjacent tubular portions of the plurality of tubular portions.
  • the diameter of each of the plurality of tubular portions is preferably 5 mm or more and 50 mm or less, and the length of each of the plurality of tubular portions in the tube axis direction is preferably 1000 mm or less.
  • the cell culture bag according to the present invention may further include a port communicating with each of the plurality of tubular portions on at least one end side in the first direction of each of the plurality of tubular portions.
  • the cell culture bag according to the present invention may further include a plurality of ports communicating with each of the plurality of tubular portions on each of the one end side and the other end side in the first direction of each of the plurality of tubular portions.
  • the cell culture bag is supported so that the tube axis direction of the plurality of tubular portions is along the vertical direction and at least one port is positioned on the lower side in the vertical direction, Cells are cultured by injecting a culture solution from a port located on the lower side in the vertical direction.
  • the culture solution may be added by injecting the culture solution from a port located on the lower side in the vertical direction.
  • the culture medium may be added so that the liquid level of the added culture medium reaches the height position of the communicating portion.
  • the cell culture bag is supported in a state in which the cell culture bag is curved in a direction intersecting the tube axis direction of the plurality of tubular portions so that the plurality of tubular portions are connected in a ring shape.
  • Cells may be cultured.
  • the outer periphery of the support column having hooks at a plurality of locations in the circumferential direction and the axial direction and having the axial direction oriented in the vertical direction is set, and the tube axis directions of the plurality of tubular portions are directed in the vertical direction.
  • the cell culture bag may be supported by the support column by wrapping the cell culture bag and inserting a hook into the through hole.
  • the cell culture bag may be housed in a sealed container to culture the cells.
  • cells may be cultured while the cell culture bag is kept stationary during the culture period.
  • the cell culture bag and the cell culture method according to the present invention it is possible to suppress a decrease in cell homogeneity associated with expansion of the culture scale.
  • FIG. 1 is a plan view showing a configuration of a cell culture bag 10 according to an embodiment of the present invention.
  • the cell culture bag 10 is formed by bonding two plastic films having flexibility and gas permeability by a technique such as heat sealing (thermocompression bonding). Note that one plastic film may be folded and bonded.
  • the plastic film preferably transmits visible light in order to allow visual observation of cells cultured in the cell culture bag 10.
  • the plastic film constituting the cell culture bag 10 for example, polyethylene or polypropylene can be suitably used.
  • the cell culture bag 10 has a plurality of tubular portions 11 separated from each other by a partition formed by the seal portions 13 and 14.
  • the seal portion refers to a portion where a plurality of films are bonded together.
  • the plurality of tubular portions 11 are juxtaposed in a direction intersecting the tube axis direction so that the tube axis directions are parallel to each other.
  • the tube axis direction refers to the extending direction of the tubular portion 11 having a tubular shape.
  • each tube axis direction of the tubular portion 11 is directed to the Y axis direction, and the plurality of tubular portions 11 are juxtaposed in the X axis direction orthogonal to the Y axis direction.
  • FIG. 1 each tube axis direction of the tubular portion 11 is directed to the Y axis direction, and the plurality of tubular portions 11 are juxtaposed in the X axis direction orthogonal to the Y axis direction.
  • the structure which the cell culture bag 10 has the six tubular parts 11 is illustrated, However, The number of the tubular parts 11 can be increased / decreased suitably according to a culture scale.
  • the cross-sectional shape of the tubular portion 11 is preferably circular, but may be elliptical or not completely circular.
  • the cell culture bag 10 has a plurality of communication portions 12 that allow each of two adjacent tubular portions 11 among the plurality of tubular portions 11 to communicate with each other in the intermediate region R of the tubular portion 11.
  • the intermediate region R is a region between one end and the other end of the tubular portion 11 in the tube axis direction. More specifically, for each pair of two tubular portions 11 adjacent to each other, a plurality of communication along the tube axis direction (Y-axis direction) of the tubular portion 11 between the two adjacent tubular portions 11.
  • a portion 12 is provided. In the example shown in FIG. 1, three communication portions 12 are provided at different positions in the Y-axis direction between the two adjacent tubular portions 11. It suffices that at least one communication portion 12 is provided in the middle along the tube axis direction (Y-axis direction).
  • the cross-sectional shape of the communication portion 12 is preferably circular, but may be elliptical or not completely circular.
  • the three communication portions 12 provided along the Y-axis direction between the two tubular portions 11 adjacent to each other.
  • the positions in are aligned between pairs. That is, the communicating portion 12, in the position Y 1, Y 2 and Y 3 in the Y-axis direction, are arranged so as to penetrate in a straight line a plurality of tubular portions 11 in the X-axis direction.
  • the diameters D 1 of the plurality of tubular parts 11 are the same, and the diameters D 2 of the communication parts 12 are the same as the diameters D 1 of the tubular parts 11.
  • Diameter D 1 and the diameter D 2 of the communicating portion 12 of the tubular portion 11 is preferably 5mm or more 50mm or less. If D 2 diameter D 1 and the communicating portion 12 of the tubular portion 11 is 50mm or less, the supply of gas to the radial center portion of the tubular portion 11 and the communicating portion 12 can be made enough. On the other hand, if the diameter D 2 of diameter D 1 and the communicating portion 12 of the tubular portion 11 above 5 mm, the flow of culture medium and cell suspension to be accommodated in the cell culture bag 10 in is ensured, a cell culture bag 10 The uniformity of the culture environment can be maintained.
  • the tubular portion 11 and the communication portion 12 having a diameter of 5 mm or more can be stably formed.
  • the diameters of the tubular part and the communication part are the diameters of the circle when the tubular part and the communication part are circular, and when the tubular part and the communication part are elliptical, the major axis (largest diameter) and minor axis of the ellipse.
  • the average value of (the smallest diameter) is used.
  • a tubular part and a communication part are not perfect circles, it is set as the average value of the diameter in the perimeter direction.
  • the diameters of the tubular portion and the communication portion change in the axial direction, the average value over the entire length is used.
  • the outer shape of the cell culture bag 10 is, for example, rectangular, and a seal portion 13 is formed along the outer edge of the rectangle. Further, the cell culture bag 10 has a plurality of seal portions 14 arranged in a lattice pattern inside the seal portion 13.
  • the plurality of tubular portions 11 and the plurality of communication portions 12 are partitioned by seal portions 13 and 14. That is, the partition portions of the tubular portion 11 and the communication portion 12 are formed by the seal portions 13 and 14.
  • the seal portions 13 and 14 can be formed using a technique such as heat sealing.
  • the seal portion 13 is provided with a through hole 15, and the through hole 15 may be used for supporting the cell culture bag 10.
  • the cell culture bag 10 has ports 16A and 16B provided on one end side and the other end side in the tube axis direction of the tubular portion 11.
  • the ports 16A and 16B have through holes (not shown) that allow the inside and the outside of the cell culture bag 10 to communicate with each other.
  • injection and discharge of a cell suspension or a culture solution, air removal from the cell culture bag 10, extraction of cells during culture, and the like can be performed via the ports 16A and 16B.
  • the ports 16A and 16B are inserted into the bag body so as to penetrate the seal portion 13 from one end side in the X-axis direction.
  • the port 16 ⁇ / b> A is inserted so that the tip portion thereof enters the end region 17 ⁇ / b> A of the cell culture bag 10.
  • the port 16B is inserted so that the tip portion thereof enters the end region 17B of the cell culture bag 10.
  • the end regions 17A and 17B are regions that communicate with each of the tubular portions 11 on one end side and the other end side in the tube axis direction (Y-axis direction) of the tubular portion 11, respectively.
  • the ports 16A and 16B are disposed between the plastic films when the plastic films constituting the cell culture bag 10 are bonded, for example, and are welded to the bag body when the plastic films are bonded by heat sealing or the like.
  • variety of the seal part 13 in the side by which the ports 16A and 16B are inserted is wider than the width
  • the cell culture bag 10 can be manufactured using a plastic film having flexibility and gas permeability.
  • the plastic film can be produced by a known production method such as a solution casting method or a melt extrusion molding method.
  • the direction (X-axis direction) in which the plurality of tubular portions 11 of the cell culture bag 10 are aligned coincides with the film forming flow direction (MD: Machine ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ Direction) when forming the plastic film.
  • MD Film forming flow direction
  • TD TransversevDirection
  • the gas permeability and other properties can be made uniform among the plurality of tubular portions 11 by making the direction in which the plurality of tubular portions 11 are arranged (X-axis direction) coincide with the film forming flow direction of the plastic film. It becomes possible. That is, the culture environment resulting from the film quality of the plastic film can be made uniform among the plurality of tubular portions 11.
  • the cell culture bag 10 can form a large-capacity culture space that can be applied to culture of cells of the order of 1 ⁇ 10 10 , for example, and the length of the tubular portion 11 in the tube axis direction (Y-axis direction) is For example, it is set to 500 mm to 700 mm.
  • the tube axis direction (Y) is preferably 1000 mm or less.
  • the cell culture bag 10 can be manufactured without joining the tube axis direction, and the film can be manufactured so that the pressure resistance of the film against the pressure of the culture solution is not insufficient.
  • the length in the direction orthogonal to the tube axis direction of the tubular part 11 (X-axis direction), that is, the direction in which the plurality of tubular parts 11 are arranged can be appropriately set according to the cell culture scale. , About 1000 mm to 1500 mm.
  • the culture solution that can be applied to the cell culture method according to the embodiment of the present invention is not particularly limited, and any culture solution can be applied.
  • a basic medium for mammalian cells for example, DMEM, DMEM / F-12, MEM, DME, RPMI1640, MCDB104, 199, MCDB153, L15, SkBM, Basal Medium, E8 base medium
  • It is a liquid medium such as a culture medium for maintaining stem cells, a basic medium for insect cells, a medium for yeast, a medium for bacteria, and the like.
  • the culture solution that can be applied to the cell culture method according to the embodiment of the present invention is a polymer compound that does not have cytotoxicity for the purpose of continuously floating cells and / or preventing excessive adhesion between cells. May be added.
  • the polymer compound added to the culture solution for the above purpose includes, for example, a polymer compound that adjusts the specific gravity of the culture solution, a polymer compound that adjusts the viscosity of the culture solution, and a high molecular compound that forms a three-dimensional network structure in the culture solution. Molecule.
  • polymers examples include cellulose, methylcellulose, carboxymethylcellulose, gellan gum, deacylated gellan gum, hyaluronic acid, alginic acid, carrageenan, xanthan gum, diutane gum, starch, pectin and other polysaccharides; collagen, gelatin and other proteins; And synthetic polymers such as polyethylene glycol and polyvinyl pyrrolidone.
  • the culture medium that can be applied to the cell culture method according to the embodiment of the present invention includes various components that can be generally added, for example, antibiotics such as penicillin and streptomycin; vitamins or vitamin derivatives such as ascorbic acid and retinoic acid; glucose and the like Sugar sources; amino acids; inorganic salts; serum, serum substitutes; proteins such as transferrin; hormones such as insulin; growth factors; differentiation inhibitors; antioxidants such as 2-mercaptoethanol and dithiothreitol; calcium ions and magnesium Metal ions such as ions, zinc ions, iron ions, copper ions, etc. may be added.
  • antibiotics such as penicillin and streptomycin
  • vitamins or vitamin derivatives such as ascorbic acid and retinoic acid
  • glucose and the like Sugar sources amino acids
  • inorganic salts such as transferrin
  • hormones such as insulin
  • growth factors growth factors
  • differentiation inhibitors antioxidants such as 2-mercaptoethanol and dithiothreitol
  • the cells to be cultured are not particularly limited, and are animal cells, plant cells, fungal cells, bacterial cells, protoplasts, established cell lines, artificially genetically modified Any cell such as a cell that has been subjected to can be targeted.
  • a cell to be cultured is a stem cell.
  • the stem cells are not particularly limited as long as they have self-replicating ability and differentiation ability, and may be pluripotent stem cells or somatic stem cells.
  • a pluripotent stem cell is a cell having self-renewal ability and pluripotency capable of differentiating into any of ectoderm, mesoderm and endoderm.
  • pluripotent stem cells embryonic stem cells (ES cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells), embryonic germ cells (EG cells), embryonic cancer Cells (embryonal carcinoma cells; EC cells), multipotent adult progenitor cells (MAP cells), adult pluripotent stem cells (APS cells), Muse cells (multi-lineage differentiating stress enduring cell).
  • somatic stem cells include mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, neural stem cells and the like.
  • cells to be cultured are somatic cells constituting the living body and precursor cells thereof. Specifically, lymphocytes, neutrophils, monocytes, megakaryocytes, macrophages, fibroblasts, basal cells, keratinocytes, epithelial progenitor cells, pericytes, endothelial cells, adipose precursor cells, myoblasts, osteoblasts Cells, chondrocytes, hepatocytes, pancreatic ⁇ cells, glial cells, and the like.
  • cells to be cultured include animal cells such as CHO, COS, HeLa, HepG2, C127, 3T3, BHK, HEK293, Bowes melanoma cells; insect cells such as Drosophila S2, Spodoptera Sf9; yeast, Aspergillus, etc. Fungal cells; bacterial cells such as Escherichia coli and Bacillus subtilis; plant cells and callus; These cells may be cells into which a protein expression vector has been introduced for the purpose of mass expression of proteins.
  • Cells of primary culture or subculture cultured in a culture vessel for small-scale culture such as dishes and flasks are collected from the culture vessel, suspended in the culture medium, and suspended in a cell so that a predetermined cell density is obtained. Prepare a suspension. A predetermined amount of this cell suspension is injected into the cell culture bag 10 of the present invention to culture cells.
  • the cell culture bag 10 is supported at the time of cell culture so that, for example, the tube axis direction of the tubular portion 11 is along the vertical direction. That is, in the culture method according to the present embodiment, the cell culture bag 10 is used in a so-called “vertically placed” state. At this time, for example, the port 16A and the end region 17A are arranged on the upper side in the vertical direction, and the port 16B and the end region 17B are arranged on the lower side in the vertical direction. For example, as shown in FIG. 2, the cell culture bag 10 is suspended from the support column by inserting a hook 32 provided on a support column (not shown) through a through-hole 15 provided in the seal portion 13. Supported.
  • the method for supporting the cell culture bag 10 is not limited to the above-described method. When the through-hole 15 is not provided in the cell culture bag 10, the cell culture bag 10 is supported using another support member or the like. The bag 10 may be supported.
  • the cell culture bag 10 is supported so as to be placed vertically, for example, at a temperature of 30 ° C. to 40 ° C. (preferably 37 ° C.) and a CO 2 concentration of 2%. Controlled to ⁇ 10% (preferably 5%) and contained in a sealed incubator 40.
  • cells are cultured while adding a culture solution stepwise. During the culture period, for example, every 12 hours or every 24 hours, a predetermined amount of the culture solution is added to the cell culture bag 10. During the culture period, the cell culture bag 10 is maintained in a stationary state.
  • the cell suspension is injected through the port 16B arranged on the lower side in the vertical direction.
  • the wall surface of the tubular portion 11 or the communication portion 12 is located above the liquid level after the cell suspension is injected.
  • the culture efficiency is reduced.
  • the tubular portion 11 or the communication portion 12 is located above the liquid level after the cell suspension is injected. The culture solution components and cells do not adhere to the wall surface, and a decrease in culture efficiency can be prevented.
  • the cell suspension when injecting the cell suspension through the port 16B arranged on the lower side in the vertical direction, it is assumed that the cell suspension is pressurized using a pump or the like. In the case where damage to the cell becomes a problem, the cell suspension may be injected through the port 16A arranged on the upper side in the vertical direction. In this case, the cell suspension can be introduced into the cell culture bag 10 without applying pressure by a pump or the like.
  • the culture solution when the culture solution is added to the cell culture bag 10 stepwise, the culture solution is injected through the port 16B arranged on the lower side in the vertical direction.
  • the culture medium By adding the culture medium via the port 16B, it is possible to prevent the culture medium component from adhering to the wall surface in the upper part of the liquid level after the addition of the culture liquid.
  • the specific gravity of the cells if the specific gravity of the cells is larger than the specific gravity of the culture solution, the cells are mixed with the culture solution by injecting additional culture solution from the lower side in the vertical direction. Can be promoted.
  • the cell culture method when the cell suspension is first injected into the cell culture bag 10 and when the culture solution is added stepwise, the liquid level reaches the upper communication portion 12. A cell suspension or culture fluid is injected.
  • the communication portion is disposed at a position Y 3 in the Y-axis direction 12 Inject the cell suspension to reach
  • the cell suspension contained in the respective tubular section 11 it is possible to flow with each other via a respective communication unit 12 disposed at a position Y 3.
  • the cell suspension or culture is so arranged that the liquid level reaches the upper communication portion 12.
  • the cell suspension and the culture liquid can be circulated through each communication portion 12. Thereby, localization of the cell density and culture solution component in the cell culture bag 10 can be suppressed.
  • the cell culture bag 10 has a plurality of tubular portions 11 having gas permeability separated from each other by a partition wall. As described above, by dividing the storage space inside the cell culture bag 10 into a plurality of tubular spaces, when the cell suspension or culture solution is stored inside the cell culture bag 10, the bottom of the cell culture bag 10 is expanded. Can be prevented. Thereby, gas can be supplied uniformly over the entire area inside the cell culture bag 10.
  • the pressure applied to the seal portions 13 and 14 is dispersed by dividing the accommodation space inside the cell culture bag 10 into a plurality of tubular spaces. Moreover, when expanding a culture scale, it can respond by increasing the number of the tubular parts 11. FIG. That is, according to the cell culture bag 10 according to the present embodiment, when the culture scale is expanded, the lack of pressure resistance of the cell culture bag does not become a problem, and can be suitably used for mass culture of cells.
  • a communicating portion 12 is provided in an intermediate region R between the two adjacent tubular portions 11. It has been. Thereby, it becomes possible for a cell suspension and a culture solution to mutually distribute between the some tubular parts 11, and the localization of the cell density in a cell culture bag 10 and a culture solution component can be suppressed. That is, according to the cell culture bag 10 which concerns on embodiment of this invention, the fall of the uniformity of a culture environment at the time of dividing
  • the number of the communication portions 12 provided along the tube axis direction of the tubular portion 11 is set to 2 or more, so that the culture solution is added stepwise.
  • mutual circulation between the tubular portions 11 of the added culture solution can be promoted.
  • the uniform quality of the cells cultured using the cell culture bag 10 is ensured, These cells can be considered the same lot. That is, cells that can be regarded as the same lot can be cultured, for example, on the order of 1 ⁇ 10 10 cells. Therefore, it is possible to contribute to the realization of treatment by, for example, cell transplantation, which requires a large amount of the same lot cells guaranteed to have uniform quality.
  • each diameter D 1 of the plurality of tubular portions 11 is the same, further, the diameter D 2 of the communicating portion 12, the diameter D 1 of the tubular portion 11 It is the same.
  • the culture environment between the plurality of tubular portions 11 can be made uniform.
  • the gas supply amounts at the radial center of the tubular portion 11 and the communication portion 12 can be made equal. It is assumed that the cells cultured in the cell culture bag 10 are distributed not only in the tubular portion 11 but also in the communication portion 12.
  • the diameter of the tubular part 11 and the communication part 12 By making the diameter of the tubular part 11 and the communication part 12 the same, the difference in the culture environment between the tubular part 11 and the communication part 12 can be eliminated. Thereby, the effect which obtains a homogeneous cell over the cell culture bag 10 whole is accelerated
  • the communication part 12 passes through the plurality of tubular parts 11 in a straight line in the X axis direction at the positions Y 1 , Y 2 and Y 3 in the Y axis direction. Has been placed. According to such a configuration, when applying the cell culture method in which the culture solution is added step by step, the effect of suppressing the cell density and the localization of the culture solution components in the cell culture bag 10 is promoted.
  • the cell culture bag 10 is used in “vertical placement” at the time of cell culture.
  • the contact area between the outer surface of the cell culture bag 10 and the gas introduced into the cell culture bag 10 can be maximized. Introduction of gas inside is promoted.
  • the cell suspension and the culture solution are injected through the port 16B arranged on the lower side in the vertical direction.
  • the port 16B arranged on the lower side in the vertical direction.
  • FIG. 4 is a plan view showing a configuration of a cell culture bag 10A according to another embodiment of the present invention.
  • the same or corresponding components as those in the cell culture bag 10 are given the same reference numerals, and duplicate descriptions are omitted.
  • each of the seal portions 14 is provided with a through hole 18.
  • the shape of the through hole 18 may be a rectangular shape along the wall surfaces of the tubular portion 11 and the communication portion 12 as shown in FIG. 4, for example, but is not limited thereto, and is, for example, a circular shape. May be.
  • Each of the through holes 18 can be used to support the cell culture bag 10A as described later.
  • FIG. 5 is a perspective view showing an example of a support state of the cell culture bag 10A during cell culture.
  • FIG. 6 is a perspective view showing an example of the configuration of the support column 30 that supports the cell culture bag 10A during cell culture.
  • the column 30 includes a columnar column 31 and a plurality of hooks 32 provided along the circumferential direction and the axial direction (longitudinal direction) of the column 31.
  • the support column 30 is arranged so that the axial direction of the column part 31 is along the vertical direction.
  • the cell culture bag 10A is arranged so as to surround the outer periphery of the support column 30 in a state where the tube axis direction of the tubular portion 11 is directed in the vertical direction.
  • the plurality of hooks 32 are inserted through all or part of the through holes 18 formed in the seal portion 14 of the cell culture bag 10A.
  • the cell culture bag 10 ⁇ / b> A is fixed to the support column 30 by being hooked on the hook 32 in the formation portion of the through hole 18.
  • the cell culture bag 10 ⁇ / b> A is supported in a state in which the plurality of tubular portions 11 are curved in a direction intersecting the tube axis direction of the plurality of tubular portions 11 such that the plurality of tubular portions 11 are arranged in a ring shape around the support column 30.
  • FIG. 7 is a horizontal sectional view of the cell culture bag 10A supported by the support column 30.
  • the load per hook insertion portion can be reduced by providing a plurality of portions through which the hook 32 is inserted. Further, in order to make the load in the insertion portion of the hook 32 uniform, the insertion portion of the hook 32 is biased in the tube axis direction of the tubular portion 11 and in the direction intersecting with this (that is, the direction in which the plurality of tubular portions 11 are arranged). It is preferable that they are arranged without any problem.
  • FIG. 8 to 14 are plan views showing the configuration of a cell culture bag according to another embodiment of the present invention.
  • the same or corresponding components as those in the cell culture bag 10 (see FIG. 1) are given the same reference numerals, and duplicate descriptions are omitted.
  • the communication portion 12 is disposed so as to penetrate the plurality of tubular portions 11 in a straight line in the X-axis direction at the positions Y 1 , Y 2 and Y 3 in the Y-axis direction.
  • the positions in the Y-axis direction of the communication portion 12 do not have to be aligned between pairs of two tubular portions 11 adjacent to each other. Also in this case, the cell suspension and the culture solution can be circulated between the plurality of tubular portions 11, and the uniformity of the culture environment can be ensured. Further, as a cell culture bag 10C shown in FIG. 9, the diameter D 2 of each of the communicating portion 12 is made larger than the diameter D 1 of the respective tubular portion 11, the cell suspension and culture, The mutual circulation between the plurality of tubular portions 11 is promoted, and the capacity of the cell culture bag can be made larger than that of the cell culture bag 10.
  • the above-mentioned cell culture bag 10 (refer FIG. 1) has the ports 16A and 16B in both the one end side and the other end side of the tubular-axis direction of the tubular part 11, it is not limited to this aspect. .
  • the port 16B may be provided only on one end side in the tube axis direction of the tubular portion 11.
  • the cell culture bag 10D is installed so that the port 16B is on the lower side in the vertical direction, and the cell suspension and culture solution are injected and discharged through the port 16B.
  • the configuration can be simplified as compared with the cell culture bag 10 described above.
  • the cell suspension and the culture solution can be injected and discharged through the ports 16A and 16B on the upper and lower sides in the vertical direction.
  • the degree of freedom in designing the route for injecting and discharging the culture solution can be increased.
  • the port 16B may be disposed in an intermediate region between one end and the other end of the tubular portion 11.
  • the ports 16A and 16B are inserted into the bag body from one end side in the X-axis direction, but the present invention is not limited to this mode.
  • the ports 16D, 16E, and 16F are inserted into the bag body from one end side in the Y-axis direction, and the ports 16G, 16H, and 16I are connected to the other end in the Y-axis direction. It may be inserted into the bag body from the side.
  • ⁇ 16L may be inserted into the bag body.
  • the ports 16A to 16L can be appropriately used for applications such as injection and discharge of a cell suspension and a culture solution, air bleeding from the cell culture bag 10, and extraction of cells during culture.
  • a plurality of ports 16A to 16L are provided, and a specific use is assigned to each port, thereby reducing the risk of contamination.
  • the width of the through hole 18 (length in the X-axis direction) is changed along the tube axis direction (Y-axis direction) of the tubular portion 11. You may let them.
  • the width in the X-axis direction of the seal portion 14 located on the lower side in the vertical direction may be wider than the width in the X-axis direction of the seal portion 14 located on the upper side in the vertical direction.
  • the width of the seal portion 14 located at the lowermost portion is lowered in the vertical direction. You may enlarge it. Further, as shown in FIG.
  • the width of the through hole 18 formed in the seal portion 14 located at the lowermost portion may be smaller than the width of the through hole 18 formed in the seal portion 14 located above. Good. Since the pressure applied to the seal portion 14 during cell culture increases downward in the vertical direction, the seal positioned on the lower side in the vertical direction is increased by increasing the width of the seal portion 14 positioned on the lower side in the vertical direction. The breakdown voltage of the portion 14 can be increased. In FIGS. 13 and 14, the width is expanded only for the seal portion 14 located at the lowermost portion, but the width may be increased similarly for the seal portion 14 above the lowermost portion.
  • the cell culture bag 10, 10A to 10H is an example of the cell culture bag in the present invention.
  • the tubular portion 11 is an example of a tubular portion in the present invention.
  • the communication part 12 is an example of the communication part in the present invention.
  • the seal portions 13 and 14 are examples of the seal portion in the present invention.
  • the through holes 15 and 18 are examples of the through holes in the present invention.
  • the ports 16A and 16B are examples of ports in the present invention.
  • the incubator 40 is an example of a sealed container in the present invention.
  • the column 30 is an example of a column in the present invention.

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Abstract

　細胞培養バッグ１０は、管軸方向が第１の方向に向けられるとともに第１の方向と交差する第２の方向に並置され且つ互いに隔壁で隔てられたガス透過性を有する複数の管状部１１と、複数の管状部１１のうち、互いに隣接する２つの管状部１１の各々を、前記管状部１１の一端と他端との間の中間領域Ｒにおいて連通させるガス透過性を有する連通部１２と、を備える。

Description

細胞培養バッグおよび細胞培養方法
　本発明は、細胞培養バッグおよび細胞培養方法に関する。
　従来、細胞の拡大培養には、主にステンレス製の培養槽が使用されていたが、洗浄バリデーションなどの負担が軽減できるプラスチック製の細胞培養バッグの導入が進んでいる。
　例えば、特開２００５－２９５９０４号公報には、ガス透過性を有するプラスチックからなり、培養時に容器壁が円筒状、横断面が正多角形の角筒状、球状および半球状のいずれかに形成される細胞の培養容器が記載されている。
　例えば、肝疾患や心疾患などを、細胞移植によって治療するためには、１×１０９個以上の分化細胞の移植がひとりの患者に必要であると考えられており、これを実現するためには、多能性幹細胞の大量培養技術の開発が不可欠となる。
　細胞の培養スケールの拡大を図るには、細胞培養バッグの容積を大きくする必要がある。しかしながら、細胞培養バッグの容積を単純に大きくしただけでは、細胞懸濁液や培養液を細胞培養バッグ内部に収容したときに、細胞培養バッグの底部が膨張し、細胞培養バッグの中心部へのガス供給が不十分となる。また、大量の培養液を収容した場合には細胞培養バッグの強度不足が問題となる。これらの問題を解消する方法として、細胞培養バッグの収容空間を複数の領域に分割することが考えられる。しかしながら、この場合には、分割された複数の領域相互間での細胞懸濁液および培養液の流通が阻害され、分割された複数の領域間で細胞の培養環境が不均一となるおそれがある。その結果、同じ細胞培養バッグ内で培養されたにもかかわらず、培養された細胞の品質が不均一となるおそれがある。例えば、特開２００５－２９５９０４号公報に記載の培養容器によれば、ヒートシールにより形成された複数の円筒間で細胞の培養環境は不均一となり易い。このように、従来の細胞培養バッグにおいては、細胞移植による治療の実現に必要とされる、均一な品質であることが保証された大量の同一ロット細胞を培養することが困難であった。
　本発明は、上記した点に鑑みてなされたものであり、細胞培養スケールを拡大した場合でも培養する細胞の培養環境の均一性を確保することができる細胞培養バッグおよび細胞培養方法を提供することを目的とする。
　本発明に係る細胞培養バッグは、管軸方向が第１の方向に向けられるとともに第１の方向と交差する第２の方向に並置され且つ互いに隔壁で隔てられたガス透過性を有する複数の管状部と、複数の管状部のうち、互いに隣接する２つの管状部の各々を、管状部の一端と他端との間の中間領域において連通させるガス透過性を有する連通部と、を備える。
　本発明に係る細胞培養バッグにおいて、複数の管状部のうちの互いに隣接する２つの管状部の各々において、第１の方向に沿って連通部が２以上設けられていてもよい。
　本発明に係る細胞培養バッグにおいて、連通部の第１の方向における位置が、互いに隣接する２つの管状部の各々の間で揃えられていてもよい。また、管状部の径は各々同じであってもよい。また、複数の管状部の径と、連通部の径が同じであってもよい。
　本発明の細胞培養バッグは、ガス透過性を有するプラスチックフィルムを貼り合わせて形成され得る。この場合、プラスチックフィルムに形成された複数のシール部によって隔壁が形成され得る。また、複数のシール部のうちの少なくとも１つに貫通孔を有していてもよい。貫通孔の幅は、第１の方向に沿って変化していてもよい。複数のプラスチックフィルムの製膜時の製膜流れ方向が第２の方向と一致していることが好ましい。また、複数のプラスチックフィルムは、可視光を透過するものであってもよい。
　本発明に係る細胞培養バッグにおいて、複数の管状部のうちの互いに隣接する２つの管状部の各々において、第１の方向に沿って連通部が３以上設けられていてもよい。複数の管状部の各々の径は、５ｍｍ以上５０ｍｍ以下であることが好ましく、複数の管状部の各々の管軸方向の長さは、１０００ｍｍ以下であることが好ましい。
　本発明に係る細胞培養バッグは、複数の管状部の各々の第１の方向における少なくとも一端側において、複数の管状部の各々と連通するポートを更に含み得る。また、本発明に係る細胞培養バッグは、複数の管状部の各々の第１の方向における一端側および他端側のそれぞれにおいて、複数の管状部の各々と連通する複数のポートを更に含み得る。
　本発明に係る細胞培養方法においては、複数の管状部の管軸方向が鉛直方向に沿い且つ少なくとも１つのポートが鉛直方向下側に位置するように細胞培養バッグを支持し、細胞懸濁液または培養液を、鉛直方向下側に位置するポートから注入して細胞の培養を行う。
　本発明の細胞培養方法においては、鉛直方向下側に位置するポートから培養液を注入することにより培養液の追加を行ってもよい。この場合において、追加後の培養液の液面が、連通部の高さ位置に達するように培養液の追加を行ってもよい。
　本発明に係る細胞培養方法においては、複数の管状部が環状に連なるように複数の管状部の管軸方向と交差する方向に細胞培養バッグを湾曲させた状態で前記細胞培養バッグを支持して細胞の培養を行ってもよい。
　本発明に係る細胞培養方法においては、周方向および軸方向の複数箇所にフックを備え且つ軸方向が鉛直方向に向けられた支柱の外周を、複数の管状部の管軸方向が鉛直方向に向けられた細胞培養バッグで囲み、貫通孔にフックを挿通させることにより、細胞培養バッグを支柱で支持して細胞の培養を行ってもよい。
　本発明に係る細胞培養方法においては、細胞培養バッグを密閉容器内に収容して細胞の培養を行ってもよい。
　本発明に係る培養方法においては、培養期間中、細胞培養バッグを静置状態に維持して細胞の培養を行ってもよい。
　本発明に係る細胞培養バッグおよび細胞培養方法によれば、培養スケールの拡大に伴う細胞の均質性の低下を抑制することが可能となる。
本発明の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。 本発明の実施形態に係る培養期間中における細胞培養バッグの設置状態を示す斜視図である。 本発明の実施形態に係る細胞懸濁液を注入後における細胞培養バッグの平面図である。 本発明の実施形態に係る培養液の追加後における細胞培養バッグの平面図である。 本発明の実施形態に係る培養液の追加後における細胞培養バッグの平面図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養時における細胞培養バッグの支持状態の一例を示す斜視図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養バッグを支持する支柱の構成の一例を示す斜視図である。 本発明の実施形態に係る支柱によって支持された細胞培養バッグの水平断面図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。
　以下、本発明の実施形態の一例を図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。
　図１は、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０の構成を示す平面図である。細胞培養バッグ１０は、一例として、可撓性およびガス透過性を有する２枚のプラスチックフィルムを、ヒートシール（熱圧着）などの手法により貼り合せることにより形成される。なお、１枚のプラスチックフィルムを折り返して、貼り合せてもよい。また、プラスチックフィルムは、細胞培養バッグ１０内で培養される細胞の目視による観察を可能とするために、可視光を透過することが好ましい。細胞培養バッグ１０を構成するプラスチックフィルムとして、例えば、ポリエチレンやポリプロピレンなどを好適に用いることができる。
　細胞培養バッグ１０は、シール部１３、１４により形成される隔壁によって互いに隔てられた複数の管状部１１を有する。ここで、シール部とは複数枚のフィルム同士が貼り合わされている部分のことをいう。複数の管状部１１は、管軸方向が互いに平行となるように、管軸方向と交差する方向に並置されている。なお、管軸方向とは、管状を呈する管状部１１の伸長方向をいう。図１において、管状部１１の各々の管軸方向は、Ｙ軸方向に向けられており、複数の管状部１１は、Ｙ軸方向と直交するＸ軸方向に並置されている。なお、図１において、細胞培養バッグ１０が６つの管状部１１を有する構成が例示されているが、管状部１１の数は、培養スケールに応じて適宜増減することが可能である。
　なお、管状部１１の断面の形状は円形であることが好ましいが、楕円形であってもよく、また完全な円形でなくてもよい。
　細胞培養バッグ１０は、複数の管状部１１のうち、互いに隣接する２つの管状部１１の各々を、管状部１１の中間領域Ｒにおいて連通させる複数の連通部１２を有する。なお、中間領域Ｒは、管状部１１の管軸方向における一端と他端との間の領域である。より具体的には、互いに隣接する２つの管状部１１からなるペア毎に、互いに隣接する２つの管状部１１の間に、管状部１１の管軸方向（Ｙ軸方向）に沿って複数の連通部１２が設けられている。なお、図１に示す例では、互いに隣接する２つの管状部１１の間の、Ｙ軸方向における異なる位置に、３つの連通部１２が設けられているが、互いに隣接する２つの管状部１１の間には、管軸方向（Ｙ軸方向）に沿って少なくとも１つの連通部１２が設けられていればよい。
　なお、連通部１２の断面の形状は円形であることが好ましいが、楕円形であってもよく、また完全な円形でなくてもよい。
　本実施形態において、互いに隣接する２つの管状部１１からなるペアの各々において、互いに隣接する２つの管状部１１の間に、Ｙ軸方向に沿って設けられた３つの連通部１２のＹ軸方向における位置が、ペア間で揃えられている。すなわち、連通部１２は、Ｙ軸方向における位置Ｙ１、Ｙ２およびＹ３において、複数の管状部１１をＸ軸方向に一直線に貫くように配置されている。また、本実施形態において、複数の管状部１１の径Ｄ１は各々同じとされ、更に、連通部１２の各々の径Ｄ２は、管状部１１の径Ｄ１と同一とされている。管状部１１の径Ｄ１および連通部１２の径Ｄ２は、５ｍｍ以上５０ｍｍ以下であることが好ましい。管状部１１の径Ｄ１および連通部１２のＤ２が５０ｍｍ以下であれば、管状部１１および連通部１２の径方向中心部へのガスの供給を十分にすることができる。一方、管状部１１の径Ｄ１および連通部１２の径Ｄ２を５ｍｍ以上にすれば、細胞培養バッグ１０内に収容される培養液および細胞懸濁液の流通が確保され、細胞培養バッグ１０内における培養環境の均一性を保つことができる。また、プラスチックフィルムをヒートシールによって貼り合わせて細胞培養バッグ１０を形成する際に、５ｍｍ以上の径を有する管状部１１および連通部１２を安定的に形成することができる。
　なお、管状部および連通部の径とは、管状部および連通部が円形である場合はその円の直径であり、楕円形である場合には、その楕円の長径（最も大きい径）と短径（最も小さい径）の平均値とする。また、管状部および連通部が完全な円形でない場合にはその全周方向での径の平均値とする。さらに、管状部および連通部の径が軸方向で変化する場合はその全長における平均値とする。
　細胞培養バッグ１０の外形は、例えば、矩形状とされ、矩形の外縁に沿って、シール部１３が形成されている。また、細胞培養バッグ１０は、シール部１３の内側において、格子状に配列された複数のシール部１４を有する。複数の管状部１１および複数の連通部１２は、シール部１３および１４によって領域が区画されている。すなわち、シール部１３および１４によって管状部１１および連通部１２の隔壁が形成されている。シール部１３および１４は、例えばヒートシールなどの手法を用いて形成され得る。
　シール部１３には、貫通孔１５が設けられ、貫通孔１５は、細胞培養バッグ１０の支持に使用されてもよい。
　細胞培養バッグ１０は、管状部１１の管軸方向における一端側および他端側に設けられたポート１６Ａおよび１６Ｂを有する。ポート１６Ａおよび１６Ｂは、細胞培養バッグ１０の内部と外部とを連通させる貫通孔（図示せず）を有する。例えば、細胞懸濁液や培養液の注入および排出、細胞培養バッグ１０内のエア抜き、培養中の細胞の抜き取りなどは、ポート１６Ａおよび１６Ｂを介して行うことが可能である。本実施形態において、ポート１６Ａおよび１６Ｂは、Ｘ軸方向の一端側からシール部１３を貫くようにしてバッグ本体に挿入されている。ポート１６Ａは、その先端部分が、細胞培養バッグ１０の端部領域１７Ａに入り込むように挿入されている。同様に、ポート１６Ｂは、その先端部分が、細胞培養バッグ１０の端部領域１７Ｂに入り込むように挿入されている。なお、端部領域１７Ａおよび１７Ｂは、それぞれ、管状部１１の管軸方向（Ｙ軸方向）の一端側および他端側において管状部１１の各々と連通する領域である。ポート１６Ａおよび１６Ｂは、例えば、細胞培養バッグ１０を構成するプラスチックフィルムの貼り合せを行う際に、プラスチックフィルムの間に配置され、ヒートシールなどによるプラスチックフィルムの貼り合せにおいてバッグ本体に溶着される。なお、図１に示すように、ポート１６Ａおよび１６Ｂが挿入される側の辺におけるシール部１３の幅は、他の辺におけるシール部１３の幅よりも広いことが好ましい。これにより、シール部１３の強度が確保されるとともに、ポート１６Ａおよび１６Ｂの脱落を防止することができる。
　細胞培養バッグ１０は、上記したように、可撓性およびガス透過性を有するプラスチックフィルムを用いて製造することができる。プラスチックフィルムは、溶液流延法や溶融押出成型法などの公知の製法によって製造され得る。ここで、細胞培養バッグ１０の複数の管状部１１が並ぶ方向（Ｘ軸方向）は、プラスチックフィルムの製膜時における製膜流れ方向（ＭＤ：Ｍａｃｈｉｎｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）と一致していることが好ましい。一般的に、プラスチックフィルムの製膜流れ方向（ＭＤ）における膜質は、これと直交する幅方向（ＴＤ：Ｔｒａｎｓｖｅｒｓｅ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ）における膜質と比較して均一性が高い。従って、複数の管状部１１が並ぶ方向（Ｘ軸方向）を、プラスチックフィルムの製膜流れ方向と一致させることで、ガス透過性やその他の性質を複数の管状部１１間で均一とすることが可能となる。すなわち、プラスチックフィルムの膜質に起因する培養環境を複数の管状部１１間で均一とすることができる。
　細胞培養バッグ１０は、例えば１×１０１０個オーダの細胞の培養に適用可能な大容量の培養空間を形成し得るものであり、管状部１１の管軸方向（Ｙ軸方向）における長さは、例えば５００ｍｍ～７００ｍｍとされる。細胞培養バッグ１０を構成するプラスチックフィルムの製造適性や、細胞培養バッグ１０を後述する「縦置き」で使用した場合のシール部１３および１４の耐圧を考慮すると、管状部１１の管軸方向（Ｙ軸方向）における長さは１０００ｍｍ以下であることが好ましい。１０００ｍｍ以下であれば、細胞培養バッグ１０を管軸方向に対して継ぎ合わせることなく製作でき、培養液の圧力に対するフィルムの耐圧が不足しないように製作できる。一方、管状部１１の管軸方向と直交する方向（Ｘ軸方向）、すなわち複数の管状部１１が並ぶ方向における長さは、細胞の培養スケールに応じて適宜設定することが可能であり、例えば、１０００ｍｍ～１５００ｍｍ程度とすることができる。
　以下において、細胞培養バッグ１０を用いた本発明の実施形態に係る細胞培養方法の一例について説明する。
　本発明の実施形態に係る細胞培養方法に適用し得る培養液は、特に制限されず、あらゆる培養液を適用することができる。具体的には、哺乳動物細胞用の基本培地（例えば、DMEM、DMEM/F-12、MEM、DME、RPMI1640、MCDB104、199、MCDB153、L15、SkBM、Basal Medium、E8 base medium）、市販品の幹細胞維持用培養液、昆虫細胞用の基本培地、酵母用培地、細菌用培地、等の液体培地である。
　本発明の実施形態に係る細胞培養方法に適用し得る培養液は、細胞を継続的に浮遊させる目的、及び／又は、細胞同士の過度の密着を防ぐ目的で、細胞毒性を有しない高分子化合物が添加されていてもよい。上記目的で培養液に添加される高分子化合物は、例えば、培養液の比重を調整する高分子化合物、培養液の粘度を調整する高分子化合物、培養液中で三次元ネットワーク構造を形成する高分子、である。このような高分子としては、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、ダイユータンガム、デンプン、ペクチン等の多糖類；コラーゲン、ゼラチン等のタンパク質；ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子；などが挙げられる。
　本発明の実施形態に係る細胞培養方法に適用し得る培養液は、一般に添加可能な各種の成分、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；無機塩；血清、血清代替物；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；増殖因子；分化抑制因子；２－メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン等の金属イオン；などが添加されていてもよい。
　本発明の実施形態に係る細胞培養方法において、培養の対象となる細胞は、特に制限されず、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、プロトプラスト、樹立された細胞株、人為的に遺伝子改変が施された細胞、等のあらゆる細胞が対象となり得る。
　培養対象となる細胞の一例は、幹細胞である。幹細胞は、自己複製能と分化能とを有する細胞であれば特に制限されず、多能性幹細胞でもよく、体性幹細胞でもよい。
　多能性幹細胞は、自己複製能と、外胚葉、中胚葉および内胚葉のいずれにも分化し得る多分化能とを有する細胞である。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell；ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（multi-lineage differentiating stress enduring cell）などが挙げられる。
　体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞などが挙げられる。
　培養対象となる細胞の他の例は、生体を構成する体細胞、及びその前駆細胞である。具体的には、リンパ球、好中球、単球、巨核球、マクロファージ、線維芽細胞、基底細胞、ケラチノサイト、上皮前駆細胞、周皮細胞、内皮細胞、脂肪前駆細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、肝実質細胞、膵β細胞、グリア細胞、等が挙げられる。
　培養対象となる細胞の他の例は、CHO、COS、HeLa、HepG2、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowesメラノーマ細胞等の動物細胞；ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞；酵母、アスペルギルス等の真菌細胞；大腸菌、枯草菌等の細菌細胞；植物細胞、カルス；などである。これらの細胞は、タンパク質の大量発現を目的にタンパク質発現ベクターが導入された細胞であってもよい。
　ディッシュ、フラスコ等の少量培養用の培養容器を用いて培養された初代培養または継代培養の細胞を、培養容器から回収し、培養液に懸濁し、所定の細胞密度となるように、細胞懸濁液を調製する。この細胞懸濁液を、本発明の細胞培養バッグ１０に所定量注入して細胞の培養を行う。
　細胞培養バッグ１０は、細胞培養時において、例えば、管状部１１の管軸方向が鉛直方向に沿うように支持される。すなわち、本実施形態に係る培養方法において、細胞培養バッグ１０は、所謂「縦置き」状態で使用される。このとき、例えば、ポート１６Ａ、端部領域１７Ａが鉛直方向上側、ポート１６Ｂおよび端部領域１７Ｂが鉛直方向下側となるように配置される。細胞培養バッグ１０は、培養時において、例えば、図２に示すように、図示しない支柱に設けられたフック３２をシール部１３に設けられた貫通孔１５に挿通させることにより、上記支柱に吊り下げられた状態で支持される。なお、細胞培養バッグ１０を支持する方法は、上記の方法に限定されるものではなく、細胞培養バッグ１０に貫通孔１５が設けられていない場合には、他の支持部材等を用いて細胞培養バッグ１０を支持してもよい。
　細胞培養バッグ１０は、細胞培養時において、図２に示すように、縦置きとなるように支持された状態で、例えば、温度３０℃～４０℃（好ましくは３７℃）且つＣＯ２濃度２％～１０％（好ましくは５％）に制御され且つ密閉されたインキュベータ４０内に収容される。本実施形態に係る細胞培養方法においては、培養液を段階的に追加しながら細胞の培養を行う。培養期間中、例えば１２時間毎あるいは２４時間毎に、培養液を所定量ずつ細胞培養バッグ１０に追加する。培養期間中、細胞培養バッグ１０は、静置状態に維持される。
　本実施形態に係る細胞培養方法においては、鉛直方向下側に配置されたポート１６Ｂを介して細胞懸濁液の注入が行われる。鉛直方向上側に配置されたポート１６Ａを介して細胞懸濁液の注入を行った場合には、細胞懸濁液の注入後における液面よりも上方部分において、管状部１１または連通部１２の壁面に培養液成分や細胞が付着し、培養効率が低下してしまうおそれがある。鉛直方向下側に配置されたポート１６Ｂを介して細胞懸濁液の注入を行った場合には、細胞懸濁液の注入後における液面よりも上方部分において、管状部１１または連通部１２の壁面に培養液成分や細胞が付着することはなく、培養効率の低下を防止できる。なお、鉛直方向下側に配置されたポート１６Ｂを介して細胞懸濁液の注入を行う場合には、ポンプ等を用いて細胞懸濁液を加圧することが想定されるが、加圧による細胞へのダメージが問題となる場合には、鉛直方向上側に配置されたポート１６Ａを介して細胞懸濁液の注入を行ってもよい。この場合には、ポンプ等による加圧を行うことなく細胞懸濁液を細胞培養バッグ１０内に導入することが可能である。
　本実施形態に係る細胞培養方法においては、培養液を細胞培養バッグ１０に段階的に追加する際にも、鉛直方向下側に配置されたポート１６Ｂを介して培養液の注入が行われる。ポート１６Ｂを介して培養液の追加を行うことにより、培養液の追加後における液面よりも上方部分において、培養液成分の壁面への付着を防止することが可能となる。また、浮遊培養法により細胞の培養を行う場合において、細胞の比重が培養液の比重よりも大きい場合には、鉛直方向下側から培養液を追加注入することで、細胞と培養液との混合を促進させることが可能となる。
　本実施形態に係る細胞培養方法においては、細胞懸濁液を最初に細胞培養バッグ１０に注入する際および培養液を段階的に追加する際に、液面が上位の連通部１２に達するように、細胞懸濁液または培養液の注入が行われる。
　例えば、細胞培養バッグ１０に細胞懸濁液を最初に注入する際には、図３Ａに示すように、液面Ｓの高さが、Ｙ軸方向における位置Ｙ３に配置された各連通部１２に達するように細胞懸濁液を注入する。これにより、各管状部１１内に収容された細胞懸濁液は、位置Ｙ３に配置された各連通部１２を介して相互に流通することが可能となる。
　次に、培養を開始してから、所定時間が経過した後に、図３Ｂに示すように、液面Ｓの高さが、Ｙ軸方向における位置Ｙ２に配置された各連通部１２に達するように培養液を追加する。その後、更に所定時間が経過した後に、図３Ｃに示すように、液面Ｓの高さがＹ軸方向における位置Ｙ１に配置された各連通部１２に達するように培養液を更に追加する。このように、液面Ｓの高さが、上位の連通部１２に達するように、培養液の追加を行うことで、追加された培養液は、各連通部１２を介して相互に流通することが可能となる。
　このように、細胞懸濁液を最初に細胞培養バッグ１０に注入する際および培養液を段階的に追加する際に、液面が上位の連通部１２に達するように、細胞懸濁液または培養液の注入を行うことで、細胞懸濁液および培養液は、各連通部１２を介して相互に流通することが可能となる。これにより、細胞培養バッグ１０内における細胞密度や培養液成分の局在化を抑制することができる。
　以上の説明から明らかなように、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０は、互いに隔壁で隔てられたガス透過性を有する複数の管状部１１を有する。このように細胞培養バッグ１０内部の収容空間を複数の管状の空間に分割することで、細胞懸濁液や培養液を細胞培養バッグ１０内部に収容したときに、細胞培養バッグ１０の底部の膨張を防止することができる。これにより、細胞培養バッグ１０内部の全域に亘り均一にガスを供給することが可能となる。
　また、細胞培養バッグ１０内部の収容空間を複数の管状の空間に分割することで、シール部１３および１４への加圧が分散される。また、培養スケールを拡大する場合には、管状部１１の数を増やすことで対応することが可能である。すなわち、本実施形態に係る細胞培養バッグ１０によれば、培養スケールを拡大する場合に、細胞培養バッグの耐圧不足が問題となることはないので、細胞の大量培養に好適に用いることができる。
　また、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０において、互いに隣接する２つの管状部１１からなるペアの各々において、互いに隣接する２つの管状部１１の間の中間領域Ｒに連通部１２が設けられている。これにより、複数の管状部１１間で細胞懸濁液および培養液が相互に流通することが可能となり、細胞培養バッグ１０内における細胞密度や培養液成分の局在化を抑制することができる。すなわち、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０によれば、細胞培養バッグの収容空間を複数の領域に分割した場合における培養環境の均一性の低下を抑制することができる。また、互いに隣接する２つの管状部からなるペアの各々において、管状部１１の管軸方向に沿って設けられる連通部１２の数を２以上とすることで、段階的に培養液を追加する培養方法を適用する場合に、追加された培養液の管状部１１間での相互流通を促進させることができる。
　本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０によれば、管状部１１間で培養環境を均一とすることができるため、細胞培養バッグ１０を用いて培養された細胞の均一な品質が担保され、これらの細胞を同一ロットとみなすことができる。つまり、同一ロットとみなすことができる細胞を、例えば、１×１０１０個オーダで培養することで可能となる。従って、均一な品質であることが保証された大量の同一ロット細胞を必要とする、例えば細胞移植による治療の実現に寄与することができる。
　また、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０において、複数の管状部１１の各々の径Ｄ１は同一とされ、更に、各連通部１２の径Ｄ２は、管状部１１の径Ｄ１と同一とされている。このように、複数の管状部１１の各々の径を同一とすることで、複数の管状部１１間での培養環境を均一とすることができる。また、管状部１１と連通部１２の径を同一とすることにより、管状部１１および連通部１２の径方向中心部におけるガス供給量を等しくすることができる。細胞培養バッグ１０内で培養される細胞は、管状部１１のみならず連通部１２にも分布することが想定される。管状部１１と連通部１２の径を同一とすることにより、管状部１１と連通部１２との間での培養環境の相違をなくすことができる。これにより、細胞培養バッグ１０全体に亘り均質な細胞を得る効果が促進される。
　また、本発明の実施形態に係る細胞培養バッグ１０において、連通部１２は、Ｙ軸方向における位置Ｙ１、Ｙ２およびＹ３において、複数の管状部１１をＸ軸方向に一直線に貫くように配置されている。このような構成によれば、段階的に培養液を追加する細胞培養方法を適用する場合において、細胞培養バッグ１０内における細胞密度や培養液成分の局在化を抑制する効果が促進される。
　また、本発明の実施形態に係る細胞培養方法によれば、細胞培養時において細胞培養バッグ１０は「縦置き」で使用される。細胞培養バッグ１０を「縦置き」で使用することにより、細胞培養バッグ１０の外表面と、細胞培養バッグ１０内部に導入されるガスとの接触面積を最大化させることができ、細胞培養バッグ１０内部へのガスの導入が促進される。
　また、本実施形態に係る細胞培養方法においては、鉛直方向下側に配置されたポート１６Ｂを介して細胞懸濁液および培養液の注入が行われる。これにより、細胞培養バッグ１０の、細胞懸濁液および培養液の注入後における液面よりも上方部分における、培養液成分や細胞の付着を防止することができ、培養効率の低下を抑制することができる。
　図４は、本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグ１０Ａの構成を示す平面図である。なお、図４において、上記の細胞培養バッグ１０（図１参照）と同一または対応する構成部分には同一の参照符号を付与し、重複する説明は省略する。細胞培養バッグ１０Ａにおいて、シール部１４の各々には貫通孔１８が設けられている。貫通孔１８の形状は、例えば、図４に示すように、管状部１１および連通部１２の壁面に沿った矩形状とすることができるが、これに限定されるものではなく、例えば円形であってもよい。貫通孔１８の各々は、後述するように、細胞培養バッグ１０Ａの支持に使用することができる。
　図５は、細胞培養時における細胞培養バッグ１０Ａの支持状態の一例を示す斜視図である。図６は、細胞培養時において細胞培養バッグ１０Ａを支持する支柱３０の構成の一例を示す斜視図である。
　支柱３０は、円柱状の柱部３１と、柱部３１の周方向および軸方向（長手方向）に沿って設けられた複数のフック３２を有する。細胞培養時において、支柱３０は、柱部３１の軸方向が鉛直方向に沿うように配置される。細胞培養時において、細胞培養バッグ１０Ａは、管状部１１の管軸方向が鉛直方向に向けられた状態で、支柱３０の外周を囲むように配置される。このとき、複数のフック３２が、細胞培養バッグ１０Ａのシール部１４に形成された貫通孔１８の全部または一部に挿通される。すなわち、細胞培養バッグ１０Ａは、貫通孔１８の形成部においてフック３２に引っ掛けられることにより支柱３０に固定される。細胞培養バッグ１０Ａは、複数の管状部１１が、支柱３０を中心として環状に連なるように、複数の管状部１１の管軸方向と交差する方向に湾曲した状態で支持される。
　図７は、支柱３０によって支持された細胞培養バッグ１０Ａの水平断面図である。細胞培養バッグ１０Ａにおいて、フック３２を挿通させる箇所を複数とすることで、フック３２の挿通部１箇所あたりの加重を小さくすることができる。また、フック３２の挿通部における加重を均一とするために、フック３２の挿通部が、管状部１１の管軸方向およびこれと交差する方向（すなわち、複数の管状部１１が並ぶ方向）において偏りなく配置されていることが好ましい。
　このように、細胞培養バッグ１０Ａを環状に湾曲させることにより、複数の管状部１１を直線状に連ねる場合と比較して、省スペース化を実現することができる。また、細胞培養バッグ１０Ａを支柱３０を用いて縦置きで支持することにより、細胞培養バッグ１０Ａの外表面と、細胞培養バッグ１０Ａ内部に導入されるガスとの接触面積を最大化させることができ、細胞培養バッグ１０Ａ内部へのガスの導入が促進される。また、貫通孔１８を複数とすることで、フック３２の挿通部１箇所あたりの加重を小さくすることができるので、培養スケールの拡大に対応することが可能となる。
　図８～図１４は、本発明の他の実施形態に係る細胞培養バッグの構成を示す平面図である。なお、図８～図１４において、上記の細胞培養バッグ１０（図１参照）と同一または対応する構成部分には同一の参照符号を付与し、重複する説明は省略する。上記した細胞培養バッグ１０（図１参照）において、連通部１２は、Ｙ軸方向における位置Ｙ１、Ｙ２およびＹ３において、複数の管状部１１をＸ軸方向に一直線に貫くように配置されているが、この態様に限定されるものではない。例えば、図８および図９に示す細胞培養バッグ１０Ｂおよび１０Ｃのように、連通部１２のＹ軸方向における位置が、互いに隣接する２つの管状部１１からなるペア間で揃っていなくてもよい。この場合においても、複数の管状部１１間で細胞懸濁液および培養液を相互に流通させることが可能であり、培養環境の均一性を確保することが可能である。また、図９に示す細胞培養バッグ１０Ｃのように、連通部１２の各々の径Ｄ２を、管状部１１の各々の径Ｄ１よりも大きくすることで、細胞懸濁液および培養液の、複数の管状部１１間での相互流通が促進されるとともに細胞培養バッグの容量を細胞培養バッグ１０よりも大きくすることができる。
　また、上記した細胞培養バッグ１０（図１参照）は、管状部１１の管軸方向の一端側と他端側の双方に、ポート１６Ａ、１６Ｂを有するが、この態様に限定されるものではない。図１０に示す細胞培養バッグ１０Ｄのように、管状部１１の管軸方向の一端側にのみポート１６Ｂが設けられていてもよい。細胞培養時において、細胞培養バッグ１０Ｄは、ポート１６Ｂが鉛直方向下側となるように設置され、ポート１６Ｂを介して細胞懸濁液および培養液の注入および排出等が行われる。このように、管状部１１の管軸方向の一端側にのみポート１６Ｂを設けることで、上記した細胞培養バッグ１０と比較して構成を簡略化することができる。一方、細胞培養バッグ１０によれば、鉛直方向上側および鉛直方向下側のポート１６Ａおよび１６Ｂを介して細胞懸濁液および培養液の注入および排出等を行うことができるので、細胞懸濁液および培養液の注入・排出の経路の設計自由度を高めることができる。なお、ポート１６Ｂを、管状部１１の一端と他端の間の中間領域に配置してもよい。
　また、上記した細胞培養バッグ１０（図１参照）は、ポート１６Ａおよび１６Ｂが、Ｘ軸方向の一端側からバッグ本体に挿入されているが、この態様に限定されるものではない。例えば、図１１に示す細胞培養バッグ１０Ｅのように、ポート１６Ｄ、１６Ｅおよび１６Ｆを、Ｙ軸方向の一端側からバッグ本体に挿入するとともに、ポート１６Ｇ、１６Ｈおよび１６Ｉを、Ｙ軸方向の他端側からバッグ本体に挿入してもよい。また、例えば、図１２に示す細胞培養バッグ１０Ｆのように、Ｙ軸方向の一端側および他端側、Ｘ軸方向の一端側および他端側、細胞培養バッグ１０Ｆのコーナ部から複数のポート１６Ａ～１６Ｌをバッグ本体に挿入してもよい。ポート１６Ａ～１６Ｌは、例えば、細胞懸濁液および培養液の注入、排出、細胞培養バッグ１０内のエア抜き、培養中の細胞の抜き取り等の用途に適宜使用され得る。図１１および図１２に示す細胞培養バッグ１０Ｅおよび１０Ｆのように、複数のポート１６Ａ～１６Ｌを設け、それぞれに特定の用途を割り当てることにより、コンタミネーションのリスクを低減することができる。
　また、図１３および図１４に示す細胞培養バッグ１０Ｇおよび１０Ｈのように、貫通孔１８の幅（Ｘ軸方向の長さ）を、管状部１１の管軸方向（Ｙ軸方向）に沿って変化させてもよい。換言すれば、鉛直方向下側に位置するシール部１４のＸ軸方向における幅を、鉛直方向上側に位置するシール部１４のＸ軸方向における幅よりも広くしてもよい。例えば、図１３に示すように、最下部に位置するシール部１４に形成される貫通孔１８の形状を逆三角形とすることにより、最下部に位置するシール部１４の幅を、鉛直方向下方に向けて拡大してもよい。また、図１４に示すように、最下部に位置するシール部１４に形成される貫通孔１８の幅を、上方に位置するシール部１４に形成される貫通孔１８の幅よりも狭くしてもよい。細胞培養時においてシール部１４に印加される圧力は、鉛直方向下方に向けて大きくなるため、鉛直方向下側に位置するシール部１４の幅を拡大することで、鉛直方向下側に位置するシール部１４の耐圧を高めることができる。なお、図１３および図１４では、最下部に位置するシール部１４のみ幅を拡大しているが、最下部よりも上方のシール部１４についても同様に幅の拡大を行ってもよい。
　なお、細胞培養バッグ１０、１０Ａ～１０Ｈは、本発明における細胞培養バッグの一例である。管状部１１は、本発明における管状部の一例である。連通部１２は、本発明における連通部の一例である。シール部１３および１４は、本発明におけるシール部の一例である。貫通孔１５および１８は、本発明における貫通孔の一例である。ポート１６Ａおよび１６Ｂは、本発明におけるポートの一例である。インキュベータ４０は、本発明における密閉容器の一例である。支柱３０は本発明における支柱の一例である。
　なお、２０１４年１０月８日に出願された日本国特許出願２０１４－２０６９８８の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。また、本明細書に記載された全ての文献、特許出願および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (23)

  1. 　管軸方向が第１の方向に向けられるとともに前記第１の方向と交差する第２の方向に並置され且つ互いに隔壁で隔てられたガス透過性を有する複数の管状部と、
    　前記複数の管状部のうち、互いに隣接する２つの管状部の各々を、前記管状部の一端と他端との間の中間領域において連通させるガス透過性を有する連通部と、
    　を備える細胞培養バッグ。
  2. 　前記複数の管状部のうちの互いに隣接する２つの管状部の各々において、前記第１の方向に沿って前記連通部が２以上設けられている
    　請求項１に記載の細胞培養バッグ。
  3. 　前記連通部の前記第１の方向における位置が、前記複数の管状部のうちの互いに隣接する２つの管状部の各々の間で揃えられている
    　請求項２に記載の細胞培養バッグ。
  4. 　前記管状部の径は各々同じである
    　請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
  5. 　前記複数の管状部の径と、前記連通部の径が同じである
    　請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
  6. 　ガス透過性を有するプラスチックフィルムを貼り合わせて形成された
    　請求項１から請求項５のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
  7. 　前記プラスチックフィルムに形成された複数のシール部によって前記隔壁が形成されている
    　請求項６に記載の細胞培養バッグ。
  8. 　前記複数のシール部のうちの少なくとも１つに貫通孔を有する
    　請求項７に記載の細胞培養バッグ。
  9. 　前記貫通孔の幅は、前記第１の方向に沿って変化している
    　請求項８に記載の細胞培養バッグ。
  10. 　前記プラスチックフィルムの製膜時の製膜流れ方向が前記第２の方向と一致している
    　請求項６から請求項９のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
  11. 　前記プラスチックフィルムは、可視光を透過する
    　請求項６から請求項１０のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
  12. 　前記複数の管状部のうちの互いに隣接する２つの管状部の各々において、前記第１の方向に沿って前記連通部が３以上設けられている
    　請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
  13. 　前記複数の管状部の各々の径は、５ｍｍ以上５０ｍｍ以下である
    　請求項１から１２のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
  14. 　前記複数の管状部の各々の管軸方向の長さは、１０００ｍｍ以下である
    　請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
  15. 　前記複数の管状部の各々の前記第１の方向における少なくとも一端側において、前記複数の管状部の各々と連通するポートを更に含む
    　請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
  16. 　前記複数の管状部の各々の前記第１の方向における一端側および他端側のそれぞれにおいて、前記複数の管状部の各々と連通する複数のポートを更に含む
    　請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の細胞培養バッグ。
  17. 　請求項１５または請求項１６に記載の細胞培養バッグを用いた細胞培養方法であって、
    　前記複数の管状部の管軸方向が鉛直方向に沿い且つ少なくとも１つの前記ポートが鉛直方向下側に位置するように前記細胞培養バッグを支持し、
    　細胞懸濁液または培養液を鉛直方向下側に位置する前記ポートから注入して細胞の培養を行う
    　細胞培養方法。
  18. 　培養液を鉛直方向下側に位置する前記ポートから注入して培養液の追加を行う
    　請求項１７に記載の細胞培養方法。
  19. 　追加後の培養液の液面が、前記連通部の高さ位置に達するように培養液の追加を行う
    　請求項１８に記載の細胞培養方法。
  20. 　前記複数の管状部が環状に連なるように前記複数の管状部の管軸方向と交差する方向に前記細胞培養バッグを湾曲させた状態で前記細胞培養バッグを支持して細胞の培養を行う
    　請求項１７から請求項１９のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  21. 　請求項８に記載の細胞培養バッグを用いた細胞培養方法であって、
    　周方向および軸方向の複数箇所にフックを備え且つ軸方向が鉛直方向に向けられた支柱の外周を、前記複数の管状部の管軸方向が鉛直方向に向けられた前記細胞培養バッグで囲み、前記貫通孔に前記フックを挿通させることにより、前記細胞培養バッグを前記支柱で支持して細胞の培養を行う
    　細胞培養方法。
  22. 　前記細胞培養バッグを密閉容器内に収容して細胞の培養を行う
    　請求項１７から請求項２１のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
  23. 　培養期間中、前記細胞培養バッグを静置状態に維持して細胞の培養を行う
    　請求項１７から請求項２１のいずれか１項に記載の細胞培養方法。
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