WO2016051006A1 - Método para el diagnóstico de artrosis - Google Patents

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WO2016051006A1
WO2016051006A1 PCT/ES2015/070717 ES2015070717W WO2016051006A1 WO 2016051006 A1 WO2016051006 A1 WO 2016051006A1 ES 2015070717 W ES2015070717 W ES 2015070717W WO 2016051006 A1 WO2016051006 A1 WO 2016051006A1
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peptide
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Francisco J. BLANCO GARCÍA
Cristina Ruiz Romero
Carolina FERNÁNDEZ COSTA
José Luís CAPELO MARTÍNEZ
Florentino FERNÁNDEZ RIVEROLA
Miguel REBOIRO JATO
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Servizo Galego De Saude (Sergas)
Universidade De Vigo
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    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
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    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/105—Osteoarthritis, e.g. cartilage alteration, hypertrophy of bone

Definitions

  • the present invention relates to a characteristic peptide pattern of subjects suffering from osteoarthritis and the use of said pattern in the diagnosis of said disease. Therefore, the present invention also relates to an in vitro diagnostic method and a kit for the implementation of said diagnostic method. Therefore, the invention pertains to the technical field of disease diagnosis, in particular the diagnosis of rheumatic diseases.
  • Osteoarthritis is a rheumatic pathology that damages the articular cartilage.
  • the joints are the components of the skeleton that allow us movement and, therefore, our functional autonomy, and are formed by the union of two bones through the joint capsule. Inside them, there is generally a fluid called synovial fluid that is produced by the synovial membrane.
  • synovial fluid that is produced by the synovial membrane.
  • the bony ends that join together to form the joint are covered by articular cartilage.
  • osteoarthritis is located in the cervical and lumbar spine, and in some joints of the shoulder and toes, the hip, the knee and the joint of the beginning of the big toe.
  • This rheumatic disease is not hereditary in the sense that there is no fixed inheritance pattern such as hemophilia, but it does have a genetic risk component that, together with other factors, can make it appear more easily in the subjects that have a family history.
  • osteoarthritis affects 10% of the general population, representing almost a quarter of the total number of patients treated at the rheumatologists' offices.
  • osteoarthritis are based on the evaluation of symptoms and the physical examination performed by the doctor on the patient.
  • the doctor values what The patient has symptoms, where they are located, how the pain is, in what circumstances it improves (with rest) or worsens (when going up or down stairs, when opening or closing taps ...), etc. It also asks about what others Diseases the patient suffers, what treatments he is receiving, and if he or a family member suffers or has suffered some type of previous rheumatic disease, trauma or joint injury.
  • Radiographs confirm the diagnosis of osteoarthritis, as the radiological changes typical of arthrosic processes can be verified in the joints. Radiology studies can determine the severity of osteoarthritis much more precisely.
  • osteoarthritis are products that are released from articular cartilage to synovial fluid, urine or blood during synthesis and destruction of cartilage. Some of them are products derived from keratan sulfate, chondroitin sulfate, hyaluronic acid or the oligomeric protein of the cartilaginous matrix (COMP).
  • keratan sulfate products that are released from articular cartilage to synovial fluid, urine or blood during synthesis and destruction of cartilage.
  • Some of them are products derived from keratan sulfate, chondroitin sulfate, hyaluronic acid or the oligomeric protein of the cartilaginous matrix (COMP).
  • keratan sulfate chondroitin sulfate
  • hyaluronic acid or the oligomeric protein of the cartilaginous matrix
  • the authors of the present invention have found that subjects suffering from osteoarthritis have a peptide pattern not present in healthy subjects, nor in subjects suffering from other types of rheumatic diseases, such as psoriatic arthritis (APS) and rheumatoid arthritis (RA), which makes said peptide pattern a useful tool for the specific diagnosis of osteoarthritis.
  • APS psoriatic arthritis
  • RA rheumatoid arthritis
  • the authors started from serum samples from patients diagnosed with osteoarthritis and performed a chemical depletion with dithiothrietol (DTT) and acetonitrile (ACN), then digest the proteins with ultrasound-accelerated trypsin . Next, the resulting peptides were retained at a commercial C18 tip and eluted with different amounts of ACN.
  • DTT dithiothrietol
  • ACN acetonitrile
  • each elution fraction was analyzed in quintuplicate by MALDI-TOF / TOF mass spectrometry (Example 1), obtaining the peptide masses characteristic of the peptide pattern present in subjects suffering from osteoarthritis.
  • the subsequent validation of the peptide pattern obtained (Example 2) confirmed the usefulness of this pattern in the diagnosis of osteoarthritis.
  • the invention relates to a peptide pattern, hereinafter, the peptide pattern of the invention, comprising the following peptides: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 1 1.
  • peptide pattern is understood as the set or group of peptides that are present in a biological sample of a subject and that is characteristic of its physiological state.
  • the peptide pattern described herein is characteristic of subjects suffering from osteoarthritis.
  • peptide is understood as the molecule formed by the union of several amino acids by means of peptide bonds and having approximately between 2 and 100 amino acids. For guidance, if the peptide comprises between about 2 and 15 amino acids, it is called an oligopeptide, and if it comprises between about 16 and 100 amino acids, it is called a polypeptide.
  • the peptide pattern of the invention has been obtained by MALDI-TOF / TOF mass spectrometry, whereby the peptides of the invention, in addition to being characterized by their specific sequence of Amino acids are also characterized by their mass / charge value and molecular weight [see Table 1], which are standard parameters of this type of technique.
  • Table 1 Mass / charge and molecular weight values obtained by mass spectrometry for each peptide within the peptide standard of the invention. Table 1 also shows the peptide sequence of the peptides comprising the pattern of the invention.
  • the peptide pattern of the invention further comprises at least one peptide selected from the group consisting of the peptides shown in Table 2, which are characterized both by their specific amino acid sequence, and by their value mass / load and its molecular weight.
  • the peptide pattern of the invention further comprises at least one peptide selected from the group consisting of the peptides shown in Table 3, which are characterized both by their specific amino acid sequence, and by their mass / load value and its molecular weight.
  • the peptides shown in Table 3 can be used in combination with the peptide pattern of the invention to differentiate between arthritic subjects and normal subjects.
  • the arthritic subjects show an increased presence of the peptides shown in Table 3 with respect to healthy control subjects.
  • Table 3 Sequences and values mass / charge and molecular weight obtained by mass spectrometry for each additional peptide that can be used in combination with the peptide pattern of the invention to differentiate between arthritic subjects and normal subjects.
  • the peptide pattern of the invention further comprises at least one peptide selected from the group consisting of the peptides shown in Table 4, which are characterized both by their specific amino acid sequence, and by their mass / load value and its molecular weight.
  • the peptides shown in Table 4 can be used in combination with the peptide pattern of the invention to differentiate between arthritic subjects and normal subjects.
  • the arthritic subjects show a decreased presence of the peptides shown in Table 4 with respect to healthy control subjects.
  • Table 4 Sequences and values mass / charge and molecular weight obtained by mass spectrometry for each additional peptide that can be used in combination with the peptide pattern of the invention to differentiate between arthrosic subjects and normal subjects.
  • peptides shown in Table 5 which are characterized by both their specific amino acid sequence, their mass / charge value and their molecular weight.
  • the peptides shown in Table 5 can be used in combination with the peptide pattern of the invention to differentiate between arthritic subjects from subjects suffering from rheumatoid arthritis.
  • Table 5 Sequences and values mass / charge and molecular weight obtained by mass spectrometry for each additional peptide that can be used in combination with the peptide pattern of the invention to differentiate between arthritic subjects from subjects suffering from rheumatoid arthritis.
  • the peptide pattern of the invention further comprises at least one peptide selected from the group consisting of the peptides shown in Table 6, which are characterized both by their specific amino acid sequence, and by their value mass / load and its molecular weight.
  • the peptides shown in Table 6 can be used in combination with the peptide pattern of the invention to differentiate between arthritic subjects from subjects suffering from psoriatic arthritis.
  • the invention also relates to the use of the peptide pattern of the invention as a diagnostic marker for osteoarthritis in a subject.
  • Another object described in the present invention relates to the simultaneous in vitro use of the expression level of the peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11, as a marker for obtaining useful data for the diagnosis and classification of rheumatic diseases in an individual.
  • the in vitro use of the peptide pattern of the invention is characterized in that it further comprises determining the level of expression of at least one of the peptides selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 12; S
  • the in vitro use of the peptide pattern of the invention is characterized in that rheumatic diseases are selected from any of the following: osteoarthritis, rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis.
  • Another aspect described in the present invention relates to a method of obtaining useful data, from now on we will call it the first method of the invention, for the diagnosis and classification of rheumatic diseases comprising:
  • the first method of the invention further comprises determining in step (b) the level of expression and / or the amount of at least one of the peptides selected from the list consisting of: SEQ ID NO: 12 ; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO:
  • the first method of the invention is characterized in that rheumatic diseases are selected from any of the following: osteoarthritis, rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis.
  • Another aspect described in the present invention relates to a method of diagnosis and classification of arthritic diseases, from here it will be referred to as the second method of the invention, which comprises steps (a) and (b) according to the first method of the invention, and also comprising:
  • step (c) compare the amounts obtained in step (b) for the peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 , SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO : 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53,
  • step (c) compare the amounts obtained in step (b) for the peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72 and SEQ ID NO
  • SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:
  • step (iv) an expression level and / or a significantly higher amount of the peptides from step (i), and an expression level and / or a significantly decreased amount of the peptides of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 74, detected in (b); or
  • step (v) an expression level and / or a significantly higher amount of the peptides from step (iii), and an expression level and / or a significantly decreased amount of the peptides of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 74, detected in (b); or
  • SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:
  • Another aspect described in the present invention relates to a method of diagnosis and classification of arthritic diseases, from here we will call it the fourth method of the invention, which comprises steps (a) and (b) according to the first method of the invention. , and which also includes:
  • step (c) compare the amounts obtained in step (b) for the peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO : 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 , SEQ ID NO: 59 and SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID
  • step (iii) an expression level and / or a significantly higher amount of the peptides of step (i) and the peptides of SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, S
  • step (iv) an expression level and / or a significantly higher amount of the peptides from step (i), and an expression level and / or a significantly decreased amount of the peptides of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 74, detected in (b); or
  • step (v) an expression level and / or a significantly higher amount of the peptides from step (iii), and an expression level and / or a significantly decreased amount of the peptides of SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 74, detected in (b); or
  • the reference amount is obtained from the expression values and / or constitutive amount of the peptide (s) described in the present invention, in a group of healthy subjects or individuals or, preferably, that do not have arthritic disease, or in a group of individuals presenting with arthrosis disease, as described for each of the methods described previously, and throughout this document.
  • the reference sample can be analyzed, for example, simultaneously or consecutively, together with the problem biological sample.
  • the comparison described in section (c) of the method of the present invention can be performed manually or assisted by a computer.
  • steps (b) and / or (c) are characterized in that the steps (b) and / or (c) can be totally or partially automated, for example, by means of a robotic sensor equipment for the detection of the quantity in step (b) or the computerized comparison in step (c).
  • sample is a biological fluid.
  • diagnosis means the procedure by which a particular disease, nosological entity, syndrome, or any health-disease condition is identified, by analyzing a series of clinical parameters or symptoms characteristic of said disease, and that distinguish it from other diseases with similar clinical conditions.
  • the disease, nosological entity or syndrome to be detected is osteoarthritis, and the clinical parameters is the peptide pattern of the invention.
  • rheumatic disease is understood as those disorders that generally affect the musculoskeletal and musculoskeletal system, preferably the joints, tendons, ligaments, bones and muscles.
  • rheumatic diseases are selected from any of the following: osteoarthritis, rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis.
  • osteoarthritis refers to a chronic joint disease caused by deterioration of the hyaline cartilage and osteoblastic hyperreactivity of the subchondral bone.
  • osteoarthritis and “osteoarthritis” are equivalent and can be used interchangeably therein.
  • osteoarthritis can be classified into idiopathic osteoarthritis and secondary osteoarthritis (Modified from Altman RC, Semin Arthritis Rheum 1991; 20: 40-47).
  • Idiopathic osteoarthritis (the origin of the disease is unknown) can be located, for example, on hands, feet, hips, spine, etc., or generalized, in which three or more joint areas, such as joints, are affected. Small and spine, large and spine joints, or mixed, which is a combination of the above.
  • Secondary osteoarthritis is classified into congenital or developmental diseases (including, but not limited to, Gaucher disease, legg-calve disease, bone dysplasia, etc.), calcium deposition diseases (among which are included without limitation hydroxyapatite arthropathy, destructive arthropathy and calcium pyrophosphate deposition), in post-traumatic diseases, in bone and joint diseases (including, but not limited to avascular necrosis, rheumatoid arthritis, gouty arthritis, septic arthritis, Paget's disease, osteopetrosis , osteochondritis), and various diseases that have their origin in arthritis (including, but not limited to, Charcot joint, diabetes mellitus, acromegaly, hypothyroidism, hyperparathyroidism, Kashin-Beck disease, Caisson disease, etc. ).
  • osteoarthritis can also be classified using the radiological KELLGREN AND LAWRENCE (K / L) scale, which classifies osteoarthritis into 5 radiological degrees: Grade 0, I
  • Any of the diseases included in the classification of arthritic diseases including osteoarthritis, rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis, can be diagnosed and classified by using the peptide pattern of the invention.
  • RA rheumatoid arthritis
  • RA refers to an inflammatory disease of unknown etiology that is characterized by the involvement of diartrodial joints and the development of chronic synovitis that will lead progressively to joint destruction, functional disability and a significant deterioration in the quality of life of patients.
  • RA will also be characterized by a maintained systemic inflammatory process and the possibility of developing serious extra-articular manifestations that will often condition the prognosis of the disease.
  • psoriatic arthritis refers to a joint disease that occurs in some patients (approximately 10%) who suffer from psoriasis on the skin, which gives it peculiar characteristics. in terms of evolution and forecast.
  • the joint injury is inflammatory, that is, with pain, swelling, heat, difficulty of movement of the inflamed joint and the long possibility of deformation. It is a chronic disease, which evolves irregularly throughout life, with times of inactivity and times of inflammation and pain.
  • subject or “individual” means any animal, preferably a mammal, more preferably a primate, in particular, a human being, of any race, sex, age or physical condition. However, in a particular embodiment, the subject is a woman, more particularly, she is a woman with an age greater than 50 years.
  • the implementation of the methods of the invention described herein comprises determining the level of expression and / or the concentration or amount of the peptides of the invention, preferably comprising determining the presence or absence of the peptides comprising the peptide pattern of the invention in a biological sample from said subject or individual.
  • biological sample means any material of animal origin, in particular, human, which includes excreta (feces and urine), secretions (genital, respiratory, ...), blood or its components, tissues and organic fluids (biopsies, liquids: cerebrospinal, synovial, articular, ascites, ...), etc.
  • the sample from the subject is a biological fluid that, in another even more particular embodiment, is selected from the group consisting of blood, serum, plasma, synovial fluid and urine, more preferably, serum, plasma and synovial fluid.
  • the biological sample of the subject Once the biological sample of the subject has been obtained, it must be processed to obtain the peptides described in the present invention.
  • the biological sample can be treated to physically or mechanically disintegrate the tissue or cell structure, releasing the intracellular components in an aqueous or organic solution.
  • the proteins are isolated from the sample. Any of the techniques that exist in the state of the art to isolate proteins can be used in the present invention such as centrifugation, depletion, etc. Once the proteins are isolated, they are digested to obtain the peptide profile of the invention.
  • the protein fraction obtained with trypsin may or may not be digested, carrying out the enzymatic digestion of the proteins and obtaining peptides.
  • Trypsin is a peptidase enzyme, which breaks the peptide bonds of proteins by hydrolysis to form smaller peptides and amino acids. Trypsin is produced in the pancreas and secreted in the duodenum (part of the intestine), where it is essential for digestion.
  • the optimum pH is 8 and the optimum temperature is 37 ° C.
  • any technique known and used in the state of the art to isolate the peptide fraction from a biological sample can be used in the present invention.
  • the methods of the invention described herein are characterized in that the detection of expression levels and / or quantity or concentration of the peptides is performed by techniques widely known in the state of the art. Examples of such techniques include, but are not limited to, mass spectrometry, gas chromatography-mass spectrometry or liquid chromatography-mass spectrometry, flow cytometry, Western-blot or Western blotting, ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), RIA (radioimmunoassay), competitive EIA (competitive enzyme immunoassay), DAS-ELISA (sandwich ELISA with double antibody) and immunocytochemical and immunohistochemical techniques.
  • mass spectrometry gas chromatography-mass spectrometry or liquid chromatography-mass spectrometry
  • flow cytometry Western-blot or Western blotting
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • RIA radioimmunoassay
  • competitive EIA competitive enzyme immunoassay
  • Mass spectrometry is an analytical technique that elucidates chemical structures, based on the measurement of the mass / charge ratio of molecular species. The determinations require the generation of electrically charged species, which is achieved by different methodologies such as electronic impact, rapid atom bombardment (FAB), and the generation of bound ions. The measurement of the mass / charge ratio allows to know the exact molecular weight of the molecule.
  • Techniques derived from mass spectrometry that can also be employed in the context of the present invention include, but are not limited to, gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS).
  • the ELISA technique is an immunoassay technique in which an immobilized antigen is detected by an antibody bound to an enzyme capable of generating a detectable product as a color change or some other type.
  • antibody is broadly interpreted and includes polyclonal, monoclonal, multispecific antibodies and fragments thereof [F (ab ' ) 2, Fab, scFv, etc.], provided they are capable of recognizing to the antigen of interest, that is, to be able to bind peptides comprised within the peptide pattern of the invention.
  • the antibodies used in these assays may or may not be labeled.
  • markers include radioactive isotopes, enzymes, fluorophores, chemiluminescent reagents, enzyme substrates or cofactors, enzyme inhibitors, particles, dyes, etc.
  • Flow cytometry is a biophysical technology based on the use of laser light, in which the proteins bound to an antibody labeled and suspended in a fluid, pass through a very thin transparent tube on which a thin beam of laser light, the light transmitted and dispersed by the passage of proteins through the tube is collected by means of detection devices, allowing to detect and separate the proteins bound to the labeled antibodies.
  • the detection of the amount of the peptides described throughout this document can be carried out by any means known in the state of the art.
  • the detection of the levels or amount of said peptides can be carried out semi-quantitatively or quantitatively, thus allowing differentiation between different types of individuals, healthy or subjects suffering from osteoarthritis, rheumatoid arthritis or psoriatic astritis. In this way, a differential diagnosis can be established in individuals affected by the mentioned diseases, which allows them to subclassify them.
  • the measurement of the amount or concentration of these peptides can be carried out directly or indirectly.
  • Direct measurement refers to the measure of the quantity or concentration of the expression product thereof, based on a signal that is obtained directly from the expression of said peptides, and that is directly correlated with the number of proteins present in the analyzed samples.
  • This signal - which we can also refer to as an intensity signal - can obtained, for example, by measuring an intensity value of a chemical or physical property of said products.
  • the indirect measurement includes the measurement obtained from a secondary component or a biological measurement system (for example the measurement of cellular responses, ligands, "tags" or enzymatic reaction products).
  • Quantity refers to, but is not limited to, the absolute or relative amount of the peptides or molecules capable of detecting them, as well as any other value or parameter related to the same or that may be derived from them.
  • Said values or parameters comprise signal intensity values obtained from any of the physical or chemical properties of said expression products obtained by direct measurement. Additionally, said values or parameters include all those obtained by indirect measurement, for example, any of the measurement systems described elsewhere in this document.
  • kit of the invention which comprises the molecular tools necessary to detect the level of expression and / or quantification of the peptides described in the present invention, or any of its combinations, for the diagnosis and classification of rheumatic diseases.
  • the kit of the invention comprises the molecular tools necessary to detect the level of expression and / or quantification of the peptides of SEQ ID NO: 1 to 1 1.
  • the kit of the invention further comprises the molecular tools necessary to detect the level of expression and / or quantification of at least one of the sequence peptides: SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO:
  • said molecules capable of detecting the levels of expression and / or quantification of the peptides described in the present invention are preferably selected from any of the following: specific antibodies against the peptides comprising the peptide pattern of the invention or fragments thereof and oligonucleotides capable of hybridizing with the nucleotide sequence encoding the peptides described in the present invention.
  • said oligonucleotides are designed from a nucleotide sequence encoding the peptides described herein.
  • the kit of the invention is useful for the diagnosis and classification of rheumatic diseases in a subject or individual, wherein said rheumatic diseases are selected from any of the following: osteoarthritis, rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis.
  • the kit of the invention comprises secondary antibodies or positive and / or negative controls.
  • the kit can also include, without any limitation, buffers, protein extraction solutions, agents to prevent contamination, inhibitors of protein degradation, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit further comprises instructions for carrying out the methods of the invention.
  • kit is meant, in the context of the present invention, a product containing the different reagents to implement the method of the invention, packaged to allow transport and storage. Suitable materials for the packaging of the kit components include, without limitation, glass, plastic (polyethylene, polypropylene, polycarbonate and the like), bottles, vials, paper, envelopes and the like.
  • kits may contain instructions for the use of the various components found in the kit.
  • Said instructions may be in the form of printed material or in the form of an electronic support capable of storing instructions so that they can be read by a subject, such as electronic storage media (magnetic discs, tapes and the like), optical media (CD- ROM, DVD) and the like. Additionally or alternatively, the media may contain internet addresses that provide such instructions.
  • kits of the invention for obtaining useful data in the diagnosis and classification of rheumatic diseases, preferably osteoarthritis, rheumatoid arthritis and psoriatic arthritis, in a biological sample.
  • the biological sample is a biological fluid, preferably selected from the group consisting of blood, serum, plasma, synovial fluid and urine.
  • Figure 1 Diagrams of the principal component analysis (PCA) performed with the peptides of the invention obtained by the MALDI-TOF technique, for the group of arthritic patients (gray) and for the group of control patients (black), in Each percentage of elution.
  • the PCAs show that in all extraction conditions the classification of the samples is achieved in at least two planes.
  • Protein depletion was performed according to the protocol previously developed in our laboratory (Fernández-Costa et al., Proteome Se / 2012; 55). Each of the sera were subjected to a sequential depletion protocol that involves two precipitation stages: first with DTT and then with ACN, according to the protocol described by Kay et al. (Rapid Commun Mass Spectrom, 2008, 22: 3255-60), with minor modifications. Briefly, 2.2 ⁇ of 500 mM DTT was added to 20 ⁇ of serum and vortexed. Then, the sample was incubated 1 hour until the formation of a persistent viscous white precipitate, which was pelleted by centrifugation at 14,000 xg for 2 x 20 minutes.
  • the supernatant was transferred to a clean tube (LoBind, Eppendorf) and again depleted by the addition of 57% (v / v) acetonitrile, followed by two short vortex cycles and 10 minutes of ultrasound in an ultrasonic bath (SONOREX , Bandelin).
  • the protein precipitate formed was pelleted by centrifugation at 14,000 xg for 10 minutes, and the supernatant was transferred to a clean LoBind tube and evaporated to dryness using a vacuum centrifuge.
  • Ultrasonic digestion in solution was performed in accordance with the ultrafast proteolytic digestion protocol previously developed (HM Santos et al. J Proteome Res 2007.6: 3393-9).
  • the evaporated sample was resuspended in 20 ⁇ of 25mM ammonium bicarbonate (AmBi), 10 ⁇ of acetonitrile was added and mixed by vortexing and sonication for 1 minute (50% amplitude) in ultrasonic bath (SONOPULS HD 2200 with BB6 accessory, Bandelin). Protein cysteine residues were reduced with 2 ⁇ of 10 mM DTT 1 followed by vortex and 1 minute of sonication, and then blocked with 2 ⁇ of 600 mM IAA, vortex and 1 minute sonication.
  • AmBi ammonium bicarbonate
  • the digested samples were reconstituted in 30 ⁇ of 0.1% TFA (v / v), and 20 ⁇ g of digested were loaded onto a NuTip C18 (large) type tip. Peptide separation was performed according to the following protocol:
  • Binding the sample was aspirated and expelled 50 times, to allow the peptides to adsorb to the reverse phase material packaged at the tip.
  • Sequential elution 30 ⁇ of different percentages of ACN, from low to high concentration of ACN, was aspirated and expelled (20 times each). Sequential elution was performed with 4, 7, 10 and 14% (v / v) ACN. The eluates evaporated to dryness.
  • the mass data were exported according to the following characteristics: a) mass range: 500-4000 (Da); b) peak density: maximum 50 peaks per 200 Da; c) signal / noise ratio: minimum 20; d) minimum area: 100; e) maximum peaks / spot: 500.
  • the mass spectrum analysis for each sample corresponds to an average of 1,500 laser shots. Fragmentation spectra are acquired by selecting the precursors of interest in each MALDI-TOF mass map, with an average of 2,000 laser shots per spectrum. For fragmentation (MS / MS), all peaks with a signal-to-noise ratio (S / N)> 10 were included in the database search.
  • Peptide sequencing was performed using ProteinPilot TM software (ABSciex), with the following parameters: (i) UniProt version: 2013_09, containing 540,958 sequence entries, (ii) Taxonomy: Homo sapiens, (iii) Enzyme: trypsin or without enzyme; (v) Fixed modifications: iodoacetamide. Only peptides identified with at least 70% confidence were reported.
  • Each spectrum was preprocessed using the following parameters: mass range from 500 to 4000 Da, maximum peak density: 10 peaks per 200 Da, minimum signal / noise ratio (S / N) of 10, minimum area of 100, number maximum peaks per spectrum: 120.
  • the peaks were aligned with a peptide mass tolerance of 150 ppm and, finally, a representative spectrum was created for each sample with those peaks present in at least 4 of the 5 spectral replicas of the sample. From each peak only its presence or absence in each spectrum was taken into account, discarding the use of its intensity beyond pre-processing.
  • the Fisher independence test was applied for comparisons between two groups and the X 2 independence test for comparisons between the four groups analyzed. Since these tests were performed on all detected peaks, it was applied subsequently the correction False Discovery Rate (FDR) of Benjamini-Hochberg in order to reduce the number of false positives.
  • FDR False Discovery Rate
  • PCA Principal Component Analysis
  • peptide pattern described in the present invention 20 serum samples were used from each of the patient groups included in the present study (OA: osteoarthritis, RA: rheumatoid arthritis, APS: psoriatic arthritis and N; control) and Using the techniques described in Example 1, the characteristic peptides of each of the study groups analyzed were detected. Briefly, we first selected the peptides that were detected significantly in one pathology with respect to the others based on the q value ⁇ 0.05 of the corrected Fisher test applied in pairs. And then the peptides that were detected significantly under two or more conditions were selected according to a value of ⁇ 0.05 of the corrected test of independence X 2 , as indicated above.
  • Table 7 Masses of the characteristic peptides that comprise the peptide pattern for the diagnosis of patients suffering from osteoarthritis (OA). The percentages indicate the presence of each peptide in the total samples analyzed for each patient group, APS: group of patients suffering from psoriatic arthritis; RA: group of patients suffering from rheumatoid arthritis; N: group of control subjects.
  • Peptides chosen as characteristic of osteoarthritis appear significantly more in the sera of arthritic donors than in the sera of control patients or patients suffering from APS or RA.
  • a set of peptides additional to the 11 peptides comprising the peptide pattern of the invention for the diagnosis of osteoarthritis were selected, to improve the classification of the samples.
  • peptides preferably serum samples, from arthritic donors.
  • Such peptides Additional data were selected from the data from the analysis of the 80 serum samples analyzed. In this case, being comparisons between pairs of conditions, the selected peptides were those for which a value of ⁇ 0.05 was obtained for the corrected Fisher test.
  • Table 8 shows the additional peptides that can be used in conjunction with the peptide pattern of the invention and that are capable of differentiating between arthritic subjects and normal subjects, who do not suffer from any arthritic pathology.
  • Table 9 shows the additional peptides that can be used in conjunction with the peptide pattern of the invention and that are also capable of differentiating between arthrosic subjects and normal subjects, who do not suffer from any arthritic pathology.
  • the difference between the data shown in Table 8 and Table 9 is that in Table 8 the arthritic subjects show a greater presence of said peptides, while the data shown in Table 9 show that the arthrosic subjects show a lower presence of said peptides compared to healthy control subjects.
  • Table 10 shows the additional peptides that can be used in conjunction with the peptide pattern of the invention and that are capable of differentiating between arthritic subjects from subjects suffering from rheumatoid arthritis. It is interesting to note that, as can be seen in said Table 10, subjects suffering from OA have a greater presence of peptides SEQ ID NO: 30, 59 and 69, compared to patients suffering from RA. In contrast, arthrosic subjects have a lower presence of peptides SEQ ID NO: 22, 23, 26, 31, 35, 39, 45, 46, 47, 48, 58, 61, 63, 66, 71, 72 and 73 , regarding subjects suffering from RA.
  • Table 11 shows the additional peptides that can be used together with the peptide pattern of the invention and that are capable of differentiating between subjects.
  • arthrosics of subjects suffering from psoriatic arthritis It is interesting to note that, as can be seen in said Table 1 1, subjects suffering from OA have a greater presence of peptides SEQ ID NO: 25, 29, 30, 59 and 69, compared to patients suffering from APS. In contrast, arthrosic subjects have a lower presence of peptides SEQ ID NO: 22, 26, 27, 31, 37, 39, 46, 47, 48, 49, 58, 66 and 79 compared to subjects suffering from PHC.
  • PCA Principal component analysis
  • peptides selected in the peptide profile described in the invention obtained from the samples of sera from the group of arthrosic patients and from the samples of the control group a principal component analysis (PCA) was performed, verifying that the samples are separated in at least two planes for all elution conditions, so that the peptides are able to differentiate between samples of arthritic donors and control subjects.
  • PCA principal component analysis
  • the PCA analysis and its visualization were performed using the RapidMiner v5.3 program (http: // rapid-i, com / content / view / 181/190 /), which configures the PCA algorithm to reduce the dimensionality of the data groups Up to 3 main components.

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Abstract

La presente invención se relaciona con un patrón peptídico característico de sujetos que padecen artrosis y el uso de dicho patrón peptídico en el diagnóstico de dicha enfermedad.Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con un método in vitrode diagnóstico y un kit para la puesta en práctica de dicho método.

Description

MÉTODO PARA EL DIAGNÓSTICO DE ARTROSIS
DESCRIPCIÓN
La presente invención se relaciona con un patrón de péptidos característico de sujetos que padecen artrosis y el uso de dicho patrón en el diagnóstico de dicha enfermedad. Por lo tanto, la presente invención también se relaciona con un método in vitro de diagnóstico y un kit para la puesta en práctica de dicho método de diagnóstico. Por tanto, la invención pertenece al campo técnico del diagnóstico de enfermedades, en particular, el diagnóstico de enfermedades reumáticas.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La artrosis es una patología reumática que lesiona el cartílago articular. Las articulaciones son los componentes del esqueleto que nos permiten el movimiento y, por tanto, nuestra autonomía funcional, y están formadas por la unión de dos huesos a través de la cápsula articular. En el interior de las mismas existe, generalmente, un fluido llamado líquido sinovial que es producido por la membrana sinovial. Los extremos óseos que se unen para formar la articulación están recubiertos por el cartílago articular.
Cuando este cartílago articular se lesiona, se produce dolor, rigidez e incapacidad funcional. Normalmente la artrosis se localiza en la columna cervical y lumbar, y en algunas articulaciones del hombro y de los dedos de las manos, la cadera, la rodilla y la articulación del comienzo del dedo gordo del pie.
Esta enfermedad reumática no es hereditaria en el sentido de que no hay un patrón de herencia fijo como puede ser el caso de la hemofilia, pero sí tiene un componente de riesgo genético que, junto con otros factores, puede hacer que aparezca con más facilidad en los sujetos que tienen una historia familiar. En España, la artrosis afecta al 10% de la población general, representando casi la cuarta parte del total de pacientes atendidos en las consultas de los reumatólogos.
Actualmente, el diagnóstico de la artrosis se basa en la evaluación de los síntomas y en la exploración física que realiza el médico al paciente. El médico valora qué síntomas tiene el enfermo, dónde se localizan, cómo es el dolor, en qué circunstancias mejora (con el reposo) o empeora (al subir o bajar escaleras, al abrir o cerrar grifos...), etc.. También interroga sobre qué otras enfermedades padece el enfermo, qué tratamientos está recibiendo, y si él o algún familiar padecen o han padecido algún tipo de enfermedad reumática, traumatismo o lesión articular previos.
Las radiografías permiten confirmar el diagnóstico de artrosis, al poderse constatar en las articulaciones los cambios radiológicos típicos de los procesos artrósicos. Mediante los estudios radiológicos se puede determinar de una forma mucho más precisa la severidad de la artrosis.
Los análisis de sangre no tienen ninguna utilidad para diagnosticar la artrosis. Todos los resultados que se determinan son siempre normales, incluyendo las denominadas "pruebas reumáticas", es decir, no llevan a pensar que dichos sujetos padecen la enfermedad. La única ventaja para llevar a cabo dichos análisis es para confirmar, con su normalidad, el diagnóstico de artrosis, descartando otras enfermedades reumáticas que sí producen algunas alteraciones en los análisis de laboratorio. Por ejemplo, en las artritis están alteradas la velocidad de sedimentación de la sangre, el factor reumatoide y otras pruebas reumáticas; en la gota, el ácido úrico está alto, etc. Hasta la actualidad, no se ha identificado ningún marcador diagnóstico en el suero o en el líquido sinovial de los pacientes que permita hacer un diagnóstico o un seguimiento de la enfermedad.
No obstante, se están realizando importante avances en el estudio de los denominados marcadores biológicos de la artrosis. Son productos que se liberan desde el cartílago articular al líquido sinovial, orina o sangre durante la síntesis y destrucción del cartílago. Algunos de ellos son productos derivados del queratán- sulfato, del condroitín sulfato, del ácido hialurónico o la proteína oligomérica de la matriz cartilaginosa (COMP). El aumento de los conocimientos sobre los marcadores bioquímicos de la artrosis permitiría un mejor diagnóstico y una intervención más temprana en el tratamiento de la enfermedad, además de facilitar el desarrollo de fármacos, iniciar las terapias mejoradas, permitir mejores opciones de medicamentos, ofrecer opciones de dosificación seguras y finalmente disminuir los costos de atención de salud. Por lo tanto, existe en el estado de la técnica la necesidad de identificar marcadores de artrosis que permitan un diagnóstico temprano de la enfermedad de una forma más sencilla, fiable y segura.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han descubierto que los sujetos que padecen artrosis presentan un patrón peptídico no presente en sujetos sanos, ni en sujetos que padecen otro tipo de enfermedades reumáticas, como la artritis psoriásica (APS) y la artritis reumatoide (AR), lo que convierte a dicho patrón peptídico en una herramienta útil para el diagnóstico específico de la artrosis. Para obtener el mencionado patrón, los autores partieron de muestras de suero procedentes de pacientes diagnosticados con artrosis y sobre el mismo llevaron a cabo una depleción química con ditiotrietol (DTT) y acetonitrilo (ACN), para después digerir las proteínas con tripsina acelerada con ultrasonidos. A continuación, los péptidos resultantes fueron retenidos en una punta comercial C18 y eluídos con diferentes cantidades de ACN. Finalmente, cada fracción de elución se analizó por quintuplicado mediante espectrometría de masas MALDI-TOF/TOF (Ejemplo 1), obteniendo las masas de los péptidos característicos del patrón peptídico presentes en sujetos que padecen artrosis. La posterior validación del patrón peptídico obtenido (Ejemplo 2), confirmó la utilidad de este patrón en el diagnóstico de la artrosis.
A continuación, se describen los diferentes aspectos inventivos desarrollados por los inventores.
Patrón peptídico de la invención y sus usos
Los autores de la presente invención han descubierto que pacientes con artrosis presentan un patrón peptídico característico el cuál no está presente ni en sujetos con enfermedades reumatoides distintas de la artrosis (como artritis psoriásica o artritis reumatoide) ni en sujetos sanos.
Por lo tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un patrón peptídico, de aquí en adelante, patrón peptídico de la invención, que comprende los siguientes péptidos: SEQ I D NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ I D NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 1 1.
En la presente invención se entiende por "patrón peptídico", al conjunto o grupo de péptidos que están presentes en una muestra biológica de un sujeto y que es característico de su estado fisiológico. En el contexto de la presente invención, el patrón peptídico aquí descrito es característico de sujetos que padecen artrosis.
En la presente invención se entiende por "péptido" a la molécula formada por la unión de varios aminoácidos mediante enlaces peptídicos y que presentan, aproximadamente, entre 2 y 100 aminoácidos. Orientativamente, si el péptido comprende entre aproximadamente 2 y 15 aminoácidos se denomina oligopéptido, y si comprende entre aproximadamente 16 y 100 aminoácidos se denomina polipéptido.
Tal como se muestra en los ejemplos incluidos en la presente descripción, el patrón peptídico de la invención ha sido obtenido mediante espectrometría de masas MALDI- TOF/TOF, por lo que los péptidos de la invención, además de estar caracterizados por su secuencia específica de aminoácidos, también están caracterizados por su valor masa/carga y su peso molecular [ver Tabla 1], los cuáles son parámetros estándar de este tipo de técnica.
Tabla 1. Valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometría de masas para cada péptido comprendido dentro del patrón peptídico de la invención. En la Tabla 1 se muestra también la secuencia peptídica de los péptidos que comprenden el patrón de la invención.
Masa/carga Peso molecular SEQ ID
Secuencia peptídica (m/z) (Da) NO:
Péptido 01 1392,7526 1391 ,7526 1 QLTPYAQRMER
Péptido 02 1532,8060 1531 ,806 2 QKWEAEPVYVQR
Péptido 03 1758,9790 1757,979 3 ELQQRLEPYADQLR
Péptido 04 1910,0176 1909,0176 4 LHELQEKLSPLGEEMR
Péptido 05 2165, 1272 2164, 1272 5 QKLHELQEKLSPLGEEMR
Péptido 06 2180, 1445 2179, 1445 6 LHELQEKLSPLGEEMRDR
Péptido 07 2280, 1501 2279, 1501 7 DSFHLDEQFTVPVEMMQAR Masa/carga Peso molecular SEQ ID
Secuencia peptídica (m/z) (Da) NO:
Péptido 08 2291 ,2260 2290,226 8 ARAHVDALRTHLAPYSDELR
Péptido 09 2407,2880 2406,288 9 LHELQEKLSPLGEEMRDRAR
Péptido 10 2436,2922 2435,2922 10 QKLHELQEKLSPLGEEMRDR
Péptido 11 2663,4314 2662,4314 1 1 QKLHELQEKLSPLGEEMRDRAR
En una realización particular, el patrón peptídico de la invención comprende, además, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos que se muestran en la Tabla 2, que están caracterizados tanto por su secuencia específica de aminoácidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular.
Tabla 2. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometría de masas para cada péptido adicional que puede usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención.
Peso
Masa/carga SEQ ID
molecular Secuencia peptídica (m/z) NO:
(Da)
Péptido 12 871 ,502 870,502 12 VLNQELR
Péptido 13 896,490 895,490 13 YLTWASR
Péptido 14 961 ,627 960,627 14 GVTFLLRR
Péptido 15 980,529 979,529 15 VGYVSGWGR
Péptido 16 1019,604 1018,604 16 AFKAWAVAR
Péptido 17 1 108,588 1 107,588 17 LQTDLSEFR
Péptido 18 1 117,669 1 116,669 18 GFSPKDVLVR
Péptido 19 1 148,634 1 147,634 19 DAVSAAFKGLK
Péptido 20 1213,667 1212,667 20 WLQGSQELPR
Péptido 21 1237,674 1236,674 21 LETPDFQLFK
Péptido 22 1247,652 1246,652 22 LGMFNIQHCK
Péptido 23 1249,655 1248,655 23 LICQATGFSPR
Péptido 24 1255,716 1254,716 24 LRCLAPLEGAR
Péptido 25 1263,683 1262,683 25 LGMFNIQHCK
Péptido 26 1299,609 1298,609 26 WQEEMELYR
Péptido 27 1380,780 1379,780 27 VQPYLDDFQKK
Péptido 28 1403,749 1402,749 28 RLGMFNIQHCK
Péptido 29 1449,800 1448,800 29 VVAGVANALAHKYH
Péptido 30 1465,689 1464,689 30 DSGEGDFLAEGGGVR
Péptido 31 1467,852 1466,852 31 VEPLRAELQEGAR
Péptido 32 1470,813 1469,813 32 WLQGSQELPREK
Péptido 33 1502,810 1501 ,810 33 VCPFAGILENGAVR Peso
Masa/carga SEQ ID
molecular Secuencia peptídica (miz) NO:
(Da)
Péptido 34 1518,710 1517,710 34 ADSGEGDFLAEGGGVR
Péptido 35 1519,750 1518,750 35 ALYLQYTDETFR
Péptido 36 1568,914 1567,914 36 LAARLEALKENGGAR
Péptido 37 1569,907 1568,907 37 LAARLEALKENGGAR
Péptido 38 1585,846 1584,846 38 THLAPYSDELRQR
Péptido 39 1612,849 161 1 ,849 39 LLDNWDSVTSTFSK
Péptido 40 1641 ,892 1640,892 40 ITPN LAEFAFSLYR
Péptido 41 1641 ,892 1640,892 41 AGDFLEANYMNLQR
Péptido 42 1669,862 1668,862 42 VLGAFSDGLAHLDN LK
Péptido 43 1706,931 1705,931 43 QKVEPLRAELQEGAR
Péptido 44 1707,875 1706,875 44 YVMLPVADQDQCI R
Péptido 45 1736,970 1735,970 45 LSQRFPKAEFAEVSK
Péptido 46 1743,882 1742,882 46 YAASSYLSLTPEQWK
Péptido 47 1745,901 1744,901 47 YVGGQEHFAHLLI LR
Péptido 48 1771 ,885 1770,885 48 SLAELGGHLDQQVEEF
Péptido 49 1786,909 1785,909 49 GLPGPPDVPDHAAYHPF
Péptido 50 1810,992 1809,992 50 SYFEKSKEQLTPLI K
Péptido 51 1815,922 1814,922 51 DSGRDYVSQFEGSALGK
Péptido 52 1825,005 1824,005 52 I LGGHLDAKGSFPWQAK
Péptido 53 1834,946 1833,946 53 VM PICLPSKDYAEVGR
Péptido 54 1864,027 1863,027 54 EVQLVESGGGLVQPGGSLR
Péptido 55 1875,997 1874,997 55 VYACEVTHQGLSSPVTK
Péptido 56 1876,017 1875,017 56 VT LTC VA PLSGVDFQLR
Péptido 57 1884,000 1883,000 57 EIVLTQSPGTLSLSPGER
Péptido 58 1899,060 1898,060 58 FNKPFVFLMI EQNTK
Péptido 59 1906,873 1905,873 59 SEAEDASLLSFMQGYMK
Péptido 60 1922,877 1921 ,877 60 SEAEDASLLSFMQGYMK
Péptido 61 1932,038 1931 ,038 61 SLHTLFGDKLCTVATLR
Péptido 62 2012,01 1 201 1 ,01 1 62 TFGSGEADCGLRPLFEKK
Péptido 63 2020, 138 2019, 138 63 VLDAVRGSPAI NVAVHVFR
Péptido 64 2153, 1 12 2152, 1 12 64 SLEDKTERELLESYI DGR
Péptido 65 2186,092 2185,092 65 LYHSEAFTVNFGDTEEAKK
Péptido 66 2190, 132 2189, 132 66 CEGPI PDVTFELLREGETK
Péptido 67 2296,219 2295,219 67 TPGAAANLELIFVGPQHAGNYR
Péptido 68 2315, 195 2314, 195 68 QSN N KYAASSYLSLTPEQWK
Péptido 69 2344, 169 2343, 169 69 SEAEDASLLSFMQGYMKHATK
Péptido 70 2348,245 2347,245 70 AHVDALRTHLAPYSDELRQR
Péptido 71 2394,298 2393,298 71 LTPYADEFKVKI DQTVEELR
GAHGPRPDTVGQRGGSRPSPGPI
Péptido 72 2409,281 2408,281 72
R
GPPGLPGLKGDPGVPGLPGAKGE
Péptido 73 2565,322 2564,322 73
VGADGV
Péptido 74 2602,358 2601 ,358 74 AVPPNNSNAAEDDLPTVELQGVV Peso
Masa/carga SEQ ID
molecular Secuencia peptídica (miz) NO:
(Da)
PR
TVRTPGAAANLELI FVGPQHAGNY
Péptido 75 2652,448 2651 ,448 75
R
Péptido 76 2670,387 2669,387 76 DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLK
Péptido 77 2695,362 2694,362 77 QSNN KYAASSYLSLTPEQWKSHR
Péptido 78 2790,425 2789,425 78 YRSWVPHTFESELSDPVELLVAES
SASLHLPKLSITGTYDLKSVLGQLG
Péptido 79 2940,755 2939,755 79
ITK
En otra realización más particular, el patrón peptídico de la invención comprende, además, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos que se muestran en la Tabla 3, que están caracterizados tanto por su secuencia específica de aminoácidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los péptidos mostrados en la Tabla 3 pueden usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales. En otra realización más preferida, los sujetos artrósicos muestran una presencia incrementada de los péptidos mostrados en la Tabla 3 respecto a los sujetos control sanos.
Tabla 3. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometría de masas para cada péptido adicional que puede usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales.
Peso
Masa/carga SEQ ID
molecular Secuencia peptídica (miz) NO:
(Da)
Péptido 13 896,490 895,490 13 YLTWASR
Péptido 14 961 ,627 960,627 14 GVTFLLRR
Péptido 15 980,529 979,529 15 VGYVSGWGR
Péptido 16 1019,604 1018,604 16 AFKAWAVAR
Péptido 17 1 108,588 1 107,588 17 LQTDLSEFR
Péptido 18 1 1 17,669 1 1 16,669 18 GFSPKDVLVR
Péptido 19 1 148,634 1 147,634 19 DAVSAAFKGLK
Péptido 20 1213,667 1212,667 20 WLQGSQELPR
Péptido 21 1237,674 1236,674 21 LETPDFQLFK
Péptido 24 1255,716 1254,716 24 LRCLAPLEGAR
Péptido 28 1403,749 1402,749 28 RLGMFNIQHCK
Péptido 32 1470,813 1469,813 32 WLQGSQELPREK Peso
Masa/carga SEQ ID
molecular Secuencia peptídica (miz) NO:
(Da)
Péptido 33 1502,810 1501 ,810 33 VCPFAGI LENGAVR
Péptido 36 1568,914 1567,914 36 LAARLEALKENGGAR
Péptido 38 1585,846 1584,846 38 THLAPYSDELRQR
Péptido 40 1641 ,892 1640,892 40 ITPN LAEFAFSLYR
Péptido 41 1641 ,892 1640,892 41 AGDFLEANYMNLQR
Péptido 42 1669,862 1668,862 42 VLGAFSDGLAHLDN LK
Péptido 43 1706,931 1705,931 43 QKVEPLRAELQEGAR
Péptido 51 1815,922 1814,922 51 DSGRDYVSQFEGSALGK
Péptido 52 1825,005 1824,005 52 I LGGHLDAKGSFPWQAK
Péptido 53 1834,946 1833,946 53 VM PICLPSKDYAEVGR
Péptido 54 1864,027 1863,027 54 EVQLVESGGGLVQPGGSLR
Péptido 55 1875,997 1874,997 55 VYACEVTHQGLSSPVTK
Péptido 56 1876,017 1875,017 56 VT LTC VA PLSGVDFQLR
Péptido 57 1884,000 1883,000 57 EIVLTQSPGTLSLSPGER
Péptido 65 2186,092 2185,092 65 LYHSEAFTVNFGDTEEAKK
Péptido 67 2296,219 2295,219 67 TPGAAANLELIFVGPQHAGNYR
Péptido 68 2315, 195 2314, 195 68 QSN N KYAASSYLSLTPEQWK
Péptido 70 2348,245 2347,245 70 AHVDALRTHLAPYSDELRQR
TVRTPGAAANLELI FVGPQHAGNY
Péptido 75 2652,448 2651 ,448 75
R
Péptido 76 2670,387 2669,387 76 DEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLK
Péptido 77 2695,362 2694,362 77 QSNN KYAASSYLSLTPEQWKSHR
Péptido 78 2790,425 2789,425 78 YRSWVPHTFESELSDPVELLVAES
En otra realización más preferida, el patrón peptídico de la invención comprende, además, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos que se muestran en la Tabla 4, que están caracterizados tanto por su secuencia específica de aminoácidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los péptidos mostrados en la Tabla 4 pueden usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales. En otra realización preferida, los sujetos artrósicos muestran una presencia disminuida de los péptidos mostrados en la Tabla 4 respecto a los sujetos control sanos.
Tabla 4. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometría de masas para cada péptido adicional que puede usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales.
Figure imgf000010_0001
al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos que se muestran en la Tabla 5, que están caracterizados tanto por su secuencia específica de aminoácidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los péptidos mostrados en la Tabla 5 pueden usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos de sujetos que padecen artritis reumatoide.
Tabla 5. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometría de masas para cada péptido adicional que puede usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos de sujetos que padecen artritis reumatoide.
Peso
Masa/carga SEQ I D
molecular Secuencia peptídica (m/z) NO:
(Da)
Péptido 22 1247,652 1246,652 22 LGMFNIQHCK
Péptido 23 1249,655 1248,655 23 LICQATGFSPR
Péptido 26 1299,609 1298,609 26 WQEEMELYR
Péptido 30 1465,689 1464,689 30 DSGEGDFLAEGGGVR
Péptido 31 1467,852 1466,852 31 VEPLRAELQEGAR
Péptido 35 1519,75 1518,75 35 ALYLQYTDETFR
Péptido 39 1612,849 161 1 ,849 39 LLDNWDSVTSTFSK
Péptido 45 1736,97 1735,97 45 LSQRFPKAEFAEVSK
Péptido 46 1743,882 1742,882 46 YAASSYLSLTPEQWK Peso
Masa/carga SEQ ID
molecular Secuencia peptídica (m/z) NO:
(Da)
Péptido 47 1745,901 1744,901 47 YVGGQEHFAHLLILR
Péptido 48 1771 ,885 1770,885 48 SLAELGGHLDQQVEEF
Péptido 58 1899,060 1898,060 58 FNKPFVFLMIEQNTK
Péptido 59 1906,873 1905,873 59 SEAEDASLLSFMQGYMK
Péptido 61 1932,038 1931 ,038 61 SLHTLFGDKLCTVATLR
Péptido 63 2020, 138 2019, 138 63 VLDAVRGSPAI NVAVHVFR
Péptido 66 2190, 132 2189, 132 66 CEGPIPDVTFELLREGETK
Péptido 69 2344, 169 2343, 169 69 SEAEDASLLSFMQGYMKHATK
Péptido 71 2394,298 2393,298 71 LTPYADEFKVKIDQTVEELR
GAHGPRPDTVGQRGGSRPSPG
Péptido 72 2409,281 2408,281 72
PIR
GPPGLPGLKGDPGVPGLPGAKG
Péptido 73 2565,322 2564,322 73
EVGADGV
En otra realización particular, el patrón peptídico de la invención comprende, además, al menos un péptido seleccionado del grupo que consiste en los péptidos que se muestran en la Tabla 6, que están caracterizados tanto por su secuencia específica de aminoácidos, como por su valor masa/carga y su peso molecular. Los péptidos mostrados en la Tabla 6 pueden usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos de sujetos que padecen artritis psoriásica.
Tabla 6. Secuencias y valores masa/carga y peso molecular obtenidos por espectrometría de masas para cada péptido adicional que puede usarse en combinación con el patrón peptídico de la invención para diferenciar entre sujetos artrósicos de sujetos que padecen artritis psoriásica.
Figure imgf000011_0001
Figure imgf000012_0001
Los métodos y técnicas para obtener patrones peptídicos a partir de una muestra son ampliamente conocidos en el estado de la técnica, y serán explicados en detalle en la descripción del método de diagnóstico de la invención.
En otro aspecto, la invención también se relaciona con el uso del patrón peptídico de la invención como marcador de diagnóstico de artrosis en un sujeto.
Así, otro de los objetos descritos en la presente invención se refiere al uso in vitro simultáneo del nivel de expresión de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11 , como marcador para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y clasificación de enfermedades reumáticas en un individuo.
En una realización preferida, el uso in vitro del patrón peptídico de la invención se caracteriza por que comprende además la determinación del nivel de expresión de al menos uno de los péptidos seleccionados de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ I D NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 , SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 25, SEQ I D NO: 27, SEQ I D NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 79, o combinaciones de los mismos.
En otra realización preferida, el uso in vitro del patrón peptídico de la invención se caracteriza por que las enfermedades reumáticas se seleccionan de entre cualquiera de las siguientes: artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica.
Otro de los aspectos descritos en la presente invención se refiere a un método de obtención de datos útiles, de ahora en adelante lo denominaremos primer método de la invención, para el diagnóstico y clasificación de enfermedades reumáticas que comprende:
(a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo,
(b) detectar simultáneamente, en la muestra biológica aislada de (a), el nivel de expresión de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11.
En una realización preferida, el primer método de la invención, comprende además determinar en la etapa (b) el nivel de expresión y/o la cantidad de al menos uno de los péptidos seleccionados de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 , SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 79, o combinaciones de los mismos.
En otra realización preferida, el primer método de la invención, se caracteriza porque las enfermedades reumáticas se seleccionan de entre cualquiera de las siguientes: artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un método de diagnóstico y clasificación de enfermedades artrósicas, a partir de aquí se le denominará segundo método de la invención, que comprende las etapas (a) y (b) según el primer método de la invención, y que además comprende:
(c) comparar las cantidades obtenidas en la etapa (b) para los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, con una cantidad de referencia procedente de una muestra obtenida de un individuo control sano, y
(d) asignar al individuo de la etapa (a) al grupo de individuos que padece artrosis cuando presenta:
(i) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, detectados en (b), o
(ii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente inferior de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b); o
(iii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ I D NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente inferior de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b), en relación al nivel de expresión y/o a la cantidad de los mismos péptidos detectados en una muestra de referencia obtenida de un individuos control sano. Otro objeto de la presente invención se refiere a un método de diagnóstico y clasificación de enfermedades artrósicas, a partir de aquí tercer método de la invención, que comprende las etapas (a) y (b) según el primer método de la invención y que además comprende:
(c) comparar las cantidades obtenidas en la etapa (b) para los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71 , SEQ ID NO:72 y SEQ ID NO:73, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, con una cantidad de referencia procedente de una muestra obtenida de un individuo que padece artrosis, y
(d) asignar al individuo de la etapa (a) al grupo de individuos que padece artritis reumatoide cuando presentan:
(i) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71 , SEQ ID NO:72 y SEQ ID NO:73, , detectados en (b); o
(ii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, , detectados en (b); o
(iii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (i), y de los péptidos de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:
14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:
40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, detectados en (b); o
(iv) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (i), y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b); o
(v) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (iii), y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b); o
(vi) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ I D NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:
15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:
41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); o
(vii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ I D NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ I D NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74.SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); o
(viii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ I D NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ I D NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74.SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, en relación al nivel de expresión y/o a la cantidad de los mismos péptidos detectados en una muestra de referencia obtenida de un individuo que padece artrosis.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere a un método de diagnóstico y clasificación de enfermedades artrósicas, a partir de aquí lo denominaremos cuarto método de la invención, que comprende las etapas (a) y (b) según el primer método de la invención, y que además comprende:
(c) comparar las cantidades obtenidas en la etapa (b) para los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, con una cantidad de referencia procedente de una muestra obtenida de un individuo que padece artrosis, y
d) asignar al individuo de la etapa (a) al grupo de individuos que padece artritis psoriásica cuando presenta:
(i) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 79, detectados en (b); o
(ii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); o
(iii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (i) y de los péptidos de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, detectados en (b); o
(iv) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (i), y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b); o
(v) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (iii), y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b); o
(vi) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ I D NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ I D NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:
41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); o
(vii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ I D NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ I D NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); o
(viii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ I D NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); en relación al nivel de expresión y/o a la cantidad de los mismos péptidos detectados en una muestra de referencia procedente de un grupo de individuos que padecen artrosis.
La cantidad de referencia se obtiene a partir de los valores de expresión y/o cantidad constitutiva del/los péptidos descritos en la presente invención, en un grupo de sujetos o individuos sanos o, preferentemente, que no presentan enfermedad artrósica, o en un grupo de individuos que presentan enfermedad artrósica, según se describa para cada uno de los métodos descritos previamente, y a lo largo del presente documento. La muestra de referencia puede ser analizada, por ejemplo, simultánea o consecutivamente, junto con la muestra biológica problema. La comparación descrita en el apartado (c) del método de la presente invención puede ser realizada manualmente o asistida por ordenador.
En una realización más preferida de todos los métodos descritos en la presente invención, estos se caracterizan por que las etapas (b) y/o (c), pueden ser total o parcialmente automatizadas, por ejemplo, por medio de un equipo robótico sensor para la detección de la cantidad en el paso (b) o la comparación computerizada en el paso (c).
En otra realización más preferida de todos los métodos descritos en la presente invención, estos se caracterizan por que la muestra es un fluido biológico.
En la presente invención se entiende por "diagnóstico" al procedimiento por el cual se identifica una determinada enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad, mediante el análisis de una serie de parámetros clínicos o síntomas característicos de dicha enfermedad, y que la distinguen de otras enfermedades con cuadros clínicos semejantes. En la presente invención la enfermedad, entidad nosológica o síndrome a detectar es la artrosis, y los parámetros clínicos es el patrón peptídico de la invención.
En la presente invención, se entiende por enfermedad reumática a aquéllos trastornos que por lo general afectan al aparato locomotor y músculo-esquelético, preferentemente a las articulaciones, los tendones, los ligamentos, los huesos y los músculos. A efectos de la presente invención las enfermedades reumáticas se seleccionan de entre cualquiera de las siguientes: artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica.
A efectos de la presente invención el término "artrosis" o "osteoartritis" se refiere a una enfermedad articular crónica ocasionada por el deterioro del cartílago hialino e hiperreactividad osteoblástica del hueso subcondral. En la presente invención los términos "artrosis" y "osteoartritis" son equivalentes y pueden emplearse indistintamente a lo largo de la misma. Como sabe el experto en la materia, la artrosis puede clasificarse en artrosis idiopática y en artrosis secundaria (Modificada de Altman RC, Semin Arthritis Rheum 1991 ; 20:40-47). La artrosis idiopática (se desconoce el origen de la enfermedad) puede ser, localizada, por ejemplo, en manos, pies, caderas, columna, etc., o generalizada, en la que están afectadas tres o más áreas articulares, tales como las articulaciones pequeñas y la columna, las articulaciones grandes y columna, o mixta, que es una combinación de las anteriores. La artrosis secundaria se clasifica en enfermedades congénitas o del desarrollo (entre las que se incluyen, sin limitar a, la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de legg-calve, displasias óseas, etc.), enfermedades por depósito de calcio (entre las que se incluyen sin limitar artropatía por hidroxiapatita, artropatía destructiva y depósito de pirofosfato cálcico), en enfermedades postraumáticas, en enfermedades del hueso y articulares (entre las que se incluyen, sin limitar a necrosis avascular, artritis reumatoide, artritis gotosa, artritis séptica, enfermedad de Paget, osteopetrosis, osteocondritis), y enfermedades varias que tienen su origen en la artritis (entre las que se incluyen, sin limitar a, articulación de Charcot, diabetes mellitus, acromegalia, hipotiroidismo, hiperparatiroidismo, enfermedad de Kashin-Beck, enfermedad de Caisson, etc.). Por otro lado, la artrosis también puede clasificarse utilizando la escala KELLGREN Y LAWRENCE (K/L) radiológica, que clasifica a la artrosis en 5 grados radiológicos: Grado 0, I, II, III, y IV.
Cualquiera de las enfermedades incluidas dentro de la clasificación de enfermedades artrósicas, incluyendo la artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica, puede ser diagnosticada y clasificada mediante el empleo del patrón peptídico de la invención.
A efectos de la presente invención, el término "artritis reumatoide (AR)" se refiere a una enfermedad inflamatoria de etiología desconocida que se caracteriza por la afectación de las articulaciones diartrodiales y por el desarrollo de una sinovitis crónica que va a conducir de forma progresiva a la destrucción articular, a la incapacidad funcional y a un importante deterioro de la calidad de vida de los pacientes. Además de la afectación articular, la AR se va a caracterizar también por un proceso inflamatorio sistémico mantenido y por la posibilidad de desarrollar manifestaciones extra-articulares graves que a menudo van a condicionar el pronóstico de la enfermedad.
A efectos de la presente invención, el término "artritis psoriásica (APS)" se refiere a una enfermedad de las articulaciones que se presenta en algunos enfermos (aproximadamente un 10%) que padecen psoriasis en la piel, lo que le confiere unas características peculiares en cuanto a evolución y pronóstico. La lesión articular es inflamatoria, es decir, con dolor, hinchazón, calor, dificultad de movimiento de la articulación inflamada y a la larga posibilidad de deformación. Es una enfermedad crónica, que evoluciona irregularmente a lo largo de la vida, con épocas de inactividad y épocas de inflamación y dolor. En la presente invención se entiende por "sujeto" o "individuo" a cualquier animal, preferiblemente un mamífero, más preferiblemente un primate, en particular, un ser humano, de cualquier raza, sexo, edad o condición física. No obstante, en una realización particular, el sujeto es una mujer, más en particular, es una mujer con una edad superior a 50 años.
La puesta en práctica de los métodos de la invención aquí descritos comprende determinar el nivel de expresión y/o la concentración o cantidad de los péptidos de la invención, preferentemente, comprende determinar la presencia o ausencia de los péptidos que comprenden el patrón peptídico de la invención en una muestra biológica procedente de dicho sujeto o individuo.
En la presente invención se entiende por "muestra biológica" a cualquier material de origen animal, en particular, humano, que incluye excretas (heces y orina), secreciones (genitales, respiratorias, ... ), sangre o sus componentes, tejidos y fluidos orgánicos (biopsias, líquidos: cefalorraquídeo, sinovial, articular, ascítico, ... ), etc. En una realización particular de los métodos de la invención, la muestra procedente del sujeto es un fluido biológico que, en otra realización todavía más particular, se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, líquido sinovial y orina, más preferentemente, suero, plasma y líquido sinovial.
Una vez que se ha obtenido la muestra biológica del sujeto, ésta debe ser procesada para obtener los péptidos descritos en la presente invención. Así, la muestra biológica se puede tratar para disgregar de forma física o mecánica la estructura del tejido o la célula, liberando los componentes intracelulares en una solución acuosa u orgánica. Una vez hecho esto, las proteínas son aisladas de la muestra. Cualquiera de las técnicas que existen en el estado de la técnica para aislar proteínas puede ser empleada en la presente invención como por ejemplo, centrifugación, depleción, etc. Una vez aisladas las proteínas, se procede a la digestión de las mismas para obtener el perfil péptido de la invención.
Una vez obtenida la fracción peptídica, dependiendo de la técnica utilizada para el análisis de su expresión, se puede o no digerir la fracción proteica obtenida con tripsina, llevando a cabo la digestión enzimática de las proteínas y obteniendo péptidos. La tripsina es una enzima peptidasa, que rompe los enlaces peptídicos de las proteínas mediante hidrólisis para formar péptidos de menor tamaño y aminoácidos. La tripsina es producida en el páncreas y secretada en el duodeno (parte del intestino), donde es esencial para la digestión. El pH óptimo es 8 y la temperatura óptima es 37 °C. A efectos de la presente invención, cualquier técnica conocida y utilizada en el estado de la técnica para aislar la fracción peptídica a partir de una muestra biológica, puede ser utilizada en la presente invención.
En otra realización más preferida, los métodos de la invención aquí descritos se caracterizan por que la detección de los niveles de expresión y/o cantidad o concentración de los péptidos se realiza mediante técnicas ampliamente conocidas en el estado de técnica. Ejemplos de dichas técnicas incluyen, sin limitar a, espectrometría de masas, cromatografía de gases-espectrometría de masas o cromatografía liquida-espectrometría de masas, citometría de flujo, Western-blot o transferencia Western, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS- ELISA (ELISA sandwich con doble anticuerpo) y técnicas inmunocitoquímicas e inmunohistoquímicas.
La espectrometría de masas es una técnica analítica que permite elucidar estructuras químicas, basada en la medición de la relación masa/carga de especies moleculares. Las determinaciones requieren de la generación de especies cargadas eléctricamente, lo cual se logra por diferentes metodologías como pueden ser el impacto electrónico, el bombardeo de átomos rápidos (FAB), y la generación de iones enlazados. La medición de la relación masa/carga permite conocer el peso molecular exacto de la molécula. Técnicas derivadas de la espectrometría de masas que también pueden emplearse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitarse a, la cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS) y cromatografía liquida- espectrometría de masas (LC-MS).
La técnica ELISA (acrónimo del inglés Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro tipo. En la presente invención, el término "anticuerpo" es interpretado de forma amplia e incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, multiespecíficos y fragmentos de los mismos [F(ab')2, Fab, scFv, etc.], siempre que sean capaces de reconocer al antígeno de interés, es decir, que sean capaces de unirse a los péptidos comprendidos dentro del patrón peptídico de la invención. Ejemplos de anticuerpos que pueden emplearse en el contexto de la presente invención incluyen, sin limitarse a, anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos totalmente humanos, etc. Los anticuerpos que se emplean en estos ensayos pueden estar marcados o no. Ejemplos ilustrativos de marcadores que se pueden utilizar incluyen isótopos radiactivos, enzimas, fluoróforos, reactivos quimioluminiscentes, sustratos enzimáticos o cofactores, inhibidores enzimáticos, partículas, colorantes, etc.
La citometría de flujo es una tecnología biofísica basada en la utilización de luz láser, en la que las proteínas unidas a un anticuerpo marcado y suspendidas en un fluido, atraviesan un finísimo tubo transparente sobre el que incide un delgado rayo de luz láser, la luz transmitida y dispersada por el paso de las proteínas a través del tubo se recoge por medio de unos dispositivos de detección, permitiendo detectar y separar las proteínas unidas a los anticuerpos marcados.
La detección de la cantidad de los péptidos descritos a lo largo del presente documento puede realizarse por cualquier medio conocido en el estado de la técnica. Así, la detección de los niveles o cantidad de dichos péptidos puede llevarse a cabo de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, permitiendo así diferenciar entre los diferentes tipos de individuos, sanos o sujetos que padecen artrosis, artritis reumatoide o astritis psoriásica. De esta manera, se puede establecer un diagnóstico diferencial en individuos afectados por las enfermedades mencionadas, que permite subclasificarlos.
La medida de la cantidad o la concentración de estos péptidos, preferiblemente de manera semi-cuantitativa o cuantitativa, puede ser llevada a cabo de manera directa o indirecta. La medida directa se refiere a la medida de la cantidad o la concentración del producto de expresión de los mismos, basada en una señal que se obtiene directamente de la expresión de dichos péptidos, y que está correlacionada directamente con el número de proteínas presentes en las muestras analizadas. Dicha señal - a la que también podemos referirnos como señal de intensidad - puede obtenerse, por ejemplo, midiendo un valor de intensidad de una propiedad química o física de dichos productos. La medida indirecta incluye la medida obtenida de un componente secundario o un sistema de medida biológica (por ejemplo la medida de respuestas celulares, ligandos, "etiquetas" o productos de reacción enzimática).
El término "cantidad", tal y como se utiliza en la descripción, se refiere pero no se limita, a la cantidad absoluta o relativa de los péptidos o de las moléculas capaces de detectarlos, así como a cualquier otro valor o parámetro relacionado con los mismos o que pueda derivarse de éstos. Dichos valores o parámetros comprenden valores de intensidad de la señal obtenidos a partir de cualquiera de las propiedades físicas o químicas de dichos productos de expresión obtenidos mediante medida directa. Adicionalmente, dichos valores o parámetros incluyen todos aquellos obtenidos mediante medida indirecta, por ejemplo, cualquiera de los sistemas de medida descritos en otra parte del presente documento.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit o dispositivo, de aquí en adelante "kit de la invención", que comprende las herramientas moleculares necesarias para detectar el nivel de expresión y/o cuantificación de los péptidos descritos en la presente invención, o cualquiera de sus combinaciones, para el diagnóstico y clasificación de enfermedades reumáticas.
En una realización más preferida, el kit de la invención comprende las herramientas moleculares necesarias para detectar el nivel de expresión y/o cuantificación de los péptidos de SEQ ID NO: 1 a 1 1.
En otra realización más preferida aún, el kit de la invención comprende además, las herramientas moleculares necesarias para detectar el nivel de expresión y/o cuantificación de al menos uno de los péptidos de secuencias: SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 , SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, o combinaciones de los mismos.
En una realización más preferida del kit, dichas moléculas capaces de detectar los niveles de expresión y/o cuantificación de los péptidos descritos en la presente invención, se seleccionan preferentemente de entre cualquiera de los siguientes: anticuerpos específicos contra los péptidos que comprenden el patrón peptídico de la invención o fragmentos de los mismos y oligonucleótidos capaces de hibridar con la secuencia nucleotídica que codifica para los péptidos descritos en la presente invención.
En una realización preferida, dichos oligonucleótidos están diseñados a partir de una secuencia nucleotídica que codifica para los péptidos descritos en el presente documento.
En una realización preferida, el kit de la invención es útil para el diagnóstico y clasificación de enfermedades reumáticas en un sujeto o individuo, donde dichas enfermedades reumáticas se seleccionan de entre cualquiera de las siguientes: artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica.
Los términos "patrón peptídico", "péptidos" y "anticuerpo" ya han sido descritos y explicados en la sección anterior y son aplicables al presente aspecto inventivo.
En otra realización preferida, el kit de la invención comprende anticuerpos secundarios o controles positivos y/o negativos. El kit además puede incluir, sin ningún tipo de limitación, tampones, soluciones de extracción de proteínas, agentes para prevenir la contaminación, inhibidores de la degradación de las proteínas, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. Preferiblemente, el kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo los métodos de la invención. Por "kit" se entiende, en el contexto de la presente invención, un producto que contiene los diferentes reactivos para poner en práctica el método de la invención, empaquetados para permitir su transporte y almacenamiento. Materiales adecuados para el empaquetamiento de los componentes del kit incluyen, sin limitar a, cristal, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, sobres y similares.
Adicionalmente, los kits pueden contener instrucciones para el empleo de los distintos componentes que se encuentran en el kit. Dichas instrucciones pueden encontrarse en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico capaz de almacenar instrucciones de forma que puedan ser leídas por un sujeto, tales como medios de almacenamientos electrónicos (discos magnéticos, cintas y similares), medios ópticos (CD-ROM, DVD) y similares. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de internet que proporcionen dichas instrucciones.
Otro aspecto descrito en la presente invención se refiere al uso del kit de la invención para la obtención de datos útiles en el diagnóstico y clasificación de enfermedades reumáticas, preferentemente, artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica, en una muestra biológica. En una realización más preferida, la muestra biológica es un fluido biológica, preferentemente que se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, líquido sinovial y orina.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1 : Diagramas de los análisis de componentes principales (PCA) realizados con los péptidos de la invención obtenidos mediante la técnica de MALDI-TOF, para el grupo de pacientes artrósicos (gris) y para el grupo de pacientes control (negro), en cada porcentaje de elución. Los PCAs muestran que en todas las condiciones de extracción la clasificación de las muestras se consigue en al menos dos planos.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
Ejemplo 1. MATERIAL Y MÉTODOS
1.1 Reactivos
DL-ditiotreitol (DTT≥99%)
lodoacetamida (IAA≥99%)
Ácido trifluoroacético (TFA≥99%, para LC-MS)
Acetonitrilo (ACN, LC-MS CHROMASOLV)
Agua (LC-MS CHROMASOLV)
Bicarbonato amónico (≥99 %)
Tripsina (grado de secuenciación, Roche)
NuTips large 10-200 μΙ, C-18 (Glygen, Columbia, EE.UU.)
a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid puriss., para MALDI-MS (Fluka, Alemania)
Mezcla de calibración 1 , 4700 Proteomics Analyzer (ABSciex, Framingham, MA,
EE.UU.)
1.2. Muestras de suero
Las muestras de suero humano se obtuvieron de donantes anónimos en el Complejo Hospitalario Universitario de A Coruña, España. Todos los pacientes firmaron el consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el comité de ética local en Galicia (España). Se escogieron 40 muestras de suero de donantes artrósicos (OA), 40 muestras de suero de donantes diagnosticados con artritis reumatoide (AR), 40 muestras de donantes diagnosticados con artritis psoriásica (APS) y 40 muestras de suero de donantes sin ninguna de las anteriores patologías, es decir, son sujetos que no presentan ningún tipo de patología reumática. Este último grupo es el grupo control (N). Se emplearon 20 sueros de cada grupo de pacientes para la búsqueda del patrón peptídico característico de cada patología. Posteriormente, se emplean los otros 20 sueros restantes de cada grupo de pacientes como muestras ciegas para comprobar la validez del patrón peptídico de la invención. Las muestras de suero se almacenaron a -80 °C hasta su procesamiento.
1.3. Depleción secuencial de proteínas en suero
La depleción de proteínas se realizó de acuerdo con el protocolo desarrollado previamente en nuestro laboratorio (Fernández-Costa et al., Proteome Se/ 2012; 55). Cada uno de los sueros fueron sometidos a un protocolo de depleción secuencial que implica dos etapas de precipitación: primero con DTT y a continuación con ACN, de acuerdo con el protocolo descrito por Kay et al. (Rapid Commun Mass Spectrom, 2008, 22: 3255-60), con pequeñas modificaciones. Brevemente, 2,2 μΙ de DTT 500 mM se añadieron a 20 μΙ de suero y se agitaron en vórtex. A continuación, la muestra se incubó 1 hora hasta la formación de un precipitado blanco viscoso persistente, que se sedimentó por centrifugación a 14,000 xg durante 2 x 20 minutos. El sobrenadante se transfirió a un tubo limpio (LoBind, Eppendorf) y se deplecionó de nuevo mediante la adición de 57 % (v/v) acetonitrilo, seguido de dos ciclos de vórtex breve y 10 minutos de ultrasonidos en un baño de ultrasonidos (SONOREX, Bandelin). El precipitado de proteína formado se sedimentó por centrifugación a 14,000 xg durante 10 minutos, y el sobrenadante se transfirió a un tubo limpio LoBind y se evaporó a sequedad empleando una centrífuga de vacío.
1.4. Digestión en solución
La digestión ultrasónica en solución se realizó de acuerdo con el protocolo de digestión proteolítica ultrarrápida desarrollado previamente (HM Santos et al. J Proteome Res 2007,6:3393-9). La muestra evaporada se resuspendió en 20 μΙ de bicarbonato amónico 25mM (AmBi), se añadieron 10 μΙ de acetonitrilo y se mezcló mediante vórtex y sonicación durante 1 minuto (50% de amplitud) en baño de ultrasonidos (SONOPULS HD 2200 con accesorio BB6, Bandelin). Los residuos de cisteína de las proteínas se redujeron con 2 μΙ de DTT 1 10 mM seguido de vórtex y 1 minuto de sonicación, y a continuación se bloqueó con 2 μΙ de IAA 600 mM, vórtex y 1 minuto sonicación. Para inactivar la IAA se añadieron a la muestra 10 μΙ de DTT 110 mM. Después, la muestra se diluyó hasta un volumen final de 200 μΙ con AmBi 12,5 mM, y se añadió tripsina de acuerdo con un ratio 1 :20 (p/p) de tripsina:proteína. La digestión se llevó a cabo en el aparato de ultrasonidos durante 5 minutos a un 50% amplitud. Finalmente, se añadieron 2 μΙ de ácido fórmico al 50% (v/v) para parar la reacción enzimática. El suero digerido se evaporó a sequedad en una centrífuga de vacío.
1.5. Elución secuencial mediante NuTips (separación de péptidos)
Las muestras digeridas se reconstituyeron en 30 μΙ de TFA al 0,1 % (v/v), y 20 μg de digerido se cargaron en una punta de tipo NuTip C18 (large). La separación de los péptidos se realizó de acuerdo con el siguiente protocolo:
Acondicionado: se aspiró y expulsó 5 veces 30 μΙ de una solución de ACN al 60-80% (v/v) y TFA al 0, 1 % (v/v), y se lavó 3 veces con TFA al 0, 1 %.
Unión: se aspiró y expulsó la muestra 50 veces, para permitir que los péptidos se adsorbieran al material de fase reversa empaquetado en la punta.
Elución secuencial: se aspiró y expulsó (20 veces cada uno) 30 μΙ de diferentes porcentajes de ACN, de baja a alta concentración de ACN. La elución secuencial se realizó con 4, 7, 10 y 14% (v/v) de ACN. Los eluidos se evaporaron a sequedad.
1.6. Análisis mediante espectrometría de masas
Las muestras evaporadas se resuspendieron en 6 μΙ de TFA al 0,1 % (v/v), y 1 μΙ de cada muestra se depositó por quintuplicado en una placa para MALDI (placa de 384 puntos recubierta de Teflón®), y se dejó secar al aire a temperatura ambiente, Posteriormente, se añadieron a las muestras secas de péptidos 1 μΙ de una solución de 3 mg/ml de ácido a-ciano-4-hidroxicinámico en TFA al 0,1 % (v/v) y 50% (v/v) ACN, y se dejó secar de nuevo.
Las muestras se analizaron en modo de ion positivo usando un espectrómetro de masas MALDI-TOF/TOF 4800 Proteomics Analyzer (ABSciex, Framingham, MA, EE.UU.), equipado con un láser Nd:YAG (λ=355 nm) y el programa 4000 Series Explorer™ (ABSciex). La calibración interna, adquisición de datos, procesamiento e interpretación se llevaron a cabo según lo recomendado por el fabricante. Todos los espectros de masas deben ser calibrados externamente empleando una mezcla de péptidos estándar (ABSciex). Los datos de masas se exportaron de acuerdo con las siguientes características: a) rango de masas: 500 - 4000 (Da); b) densidad de picos: máximo 50 picos por 200 Da; c) relación señal/ruido: mínimo 20; d) área mínima: 100; e) picos máximos/spot: 500.
El análisis del espectro de masas para cada muestra corresponde a un promedio de 1.500 disparos de láser. Los espectros de fragmentación se adquieren mediante la selección de los precursores de interés en cada mapa de masas MALDI-TOF, con un promedio de 2.000 disparos de láser por espectro. Para la fragmentación (MS/MS), todos los picos con un ratio señal/ruido (S/N)>10 se incluyeron en la búsqueda en bases de datos.
La secuenciación de péptidos se realizó mediante el software ProteinPilot™ (ABSciex), con los siguientes parámetros: (i) Versión UniProt: 2013_09, que contiene 540,958 entradas de secuencia, (ii) Taxonomía: Homo sapiens, (iii) Enzima: tripsina o sin enzima; (v) Modificaciones fijas: iodoacetamida. Sólo se informó de los péptidos identificados con al menos un 70 % de confianza.
1.7. Análisis bioinformático
Cada espectro se pre-procesó empleando los siguientes parámetros: rango de masas de 500 a 4000 Da, densidad de picos máxima: 10 picos por 200 Da, relación señal/ruido mínimo (S/N) de 10, área mínima de 100, número máximo de picos por espectro: 120. Los picos se alinearon con una tolerancia de la masa del péptido de 150 ppm y, finalmente, se creó un espectro representativo para cada muestra con aquellos picos presentes en al menos 4 de las 5 réplicas espectrales de la muestra. De cada pico sólo se tuvo en cuenta su presencia o ausencia en cada espectro, descartándose el uso de su intensidad más allá del pre-procesamiento.
Con el objetivo de identificar picos diferencialmente expresados en los distintos grupos se aplicó el test de independencia de Fisher para comparaciones entre dos grupos y el test de independencia X2 para comparaciones entre los cuatro grupos analizados. Dado que estos tests se realizaron sobre todos los picos detectados, se aplicó posteriormente la corrección False Discovery Rate (FDR) de Benjamini-Hochberg con el fin de reducir el número de falsos positivos.
Mediante el uso de Análisis de Componentes Principales (Principal Component Analysis, PCA) se analizó gráficamente la separación entre las muestras de distintas condiciones.
Por último, con el objetivo de comprobar la utilidad de los péptidos que comprenden el patrón peptídico descrito en la presente invención para el diagnóstico de artritis, se evaluó el rendimiento de clasificadores automáticos entrenados únicamente con la información de estos péptidos sobre un conjunto de muestras ciegas.
Ejemplo 2. RESULTADOS
2.1. Obtención del patrón peptídico característico de la artrosis
Para la obtención del patrón peptídico descrito en la presente invención se utilizaron 20 muestras de suero de cada uno de los grupos de pacientes incluidos en el presente estudio (OA: artrosis, AR: artritis reumatoide, APS: artritis psoriásica y N; control) y mediante las técnicas descritas en el Ejemplo 1 se detectaron los péptidos característicos de cada uno de los grupos de estudio analizados. Brevemente, primero se seleccionaron los péptidos que se detectan de forma significativa en una patología con respecto a las otras en base al valor q < 0,05 del test de Fisher corregido aplicado por parejas. Y después se seleccionaron los péptidos que se detectan de forma significativa en dos o más condiciones de acuerdo con un valor q < 0,05 del test de independencia X2 corregido, como se ha indicado anteriormente.
Mediante dicha metodología se identificaron un total de 11 péptidos que se expresaban de forma significativa en el grupo de pacientes artrósicos respecto al resto de grupos incluidos en el estudio. Este patrón peptídico específico permite distinguir las muestras de los sujetos con artrosis (OA) de las muestras de sujetos control (N), e incluso de las muestras de los sujetos que padecen otras enfermedades reumáticas, como la artritis psoriásica (APS) y la artritis reumatoide (AR). Dicho conjunto de 11 péptidos que forman el patrón peptídico de la invención, se muestran en la Tabla 7.
Tabla 7: Masas de los péptidos característicos que comprenden el patrón peptídico para el diagnóstico de pacientes que padecen artrosis (OA). Los porcentajes indican la presencia de cada péptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes, APS: grupo de pacientes que padecen artritis psoriásica; AR: grupo de pacientes que padecen artritis reumatoide; N: grupo de sujetos control.
Figure imgf000035_0001
Los péptidos escogidos como característicos de artrosis aparecen significativamente más en los sueros de donantes artrósicos que en los sueros de los pacientes control o de los pacientes que padecen APS o AR.
2.2. Péptidos adicionales específicos para el diagnóstico de otras patologías como AR y APS
Además de la detección del patrón peptídico descrito en la invención, mediante los métodos descritos previamente se seleccionaron un conjunto de péptidos adicionales a los 11 péptidos que comprenden el patrón peptídico de la invención para el diagnóstico de la artrosis, para mejorar la clasificación de las muestras, preferentemente muestras de suero, de donantes artrósicos. Dichos péptidos adicionales se seleccionaron de los datos procedentes del análisis de las 80 muestras de suero analizadas. En este caso, al tratarse de comparaciones entre parejas de condiciones, los péptidos seleccionados fueron aquellos para los que se obtuvo un valor q < 0,05 para el test de Fisher corregido.
En la Tabla 8 se muestran los péptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el patrón peptídico de la invención y que son capaces de diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales, que no padecen ninguna patología artrósica.
Tabla 8. Masas de los péptidos adicionales al patrón peptídico de la invención, útiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (OA) de sujetos que no padecen ninguna patología artrósica. Los porcentajes indican la presencia de cada péptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes. m/z SEQ ID No. OA (n=20) N (n=20)
896,490 13 65% 5%
961 ,627 14 70% 15%
980,529 15 70% 20%
1019,604 16 65% 10%
1108,588 17 50% 0%
1117,669 18 55% 5%
1148,634 19 75% 15%
1213,667 20 60% 5%
1237,674 21 50% 0%
1255,716 24 50% 0%
1403,749 28 45% 0%
1470,813 32 70% 5%
1502,810 33 65% 5%
1568,914 36 75% 20%
1585,846 38 50% 10%
1641 ,892 40 85% 35%
1641,892 41 85% 35%
1669,862 42 80% 45%
1706,931 43 70% 5%
1815,922 51 60% 10%
1825,005 52 80% 30%
1834,946 53 45% 5%
1864,027 54 75% 25% m/z SEQ ID No. OA (n=20) N (n=20)
1875,997 55 75% 20%
1876,017 56 75% 20%
1884,000 57 65% 20%
2186,092 65 60% 10%
2296,219 67 80% 20%
2315,195 68 75% 30%
2348,245 70 95% 30%
2652,448 75 70% 5%
2670,387 76 50% 15%
2695,362 77 95% 40%
2790,425 78 55% 15%
Alternativamente, en la Tabla 9 se muestran los péptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el patrón peptídico de la invención y que también, son capaces de diferenciar entre sujetos artrósicos y sujetos normales, que no padecen ninguna patología artrósica. La diferencia entre los datos mostrados en la Tabla 8 y la Tabla 9 radica en que en la Tabla 8 los sujetos artrósicos muestran una mayor presencia de dichos péptidos, mientras que los datos mostrados en la Tabla 9 ponen de manifiesto que los sujetos artrósicos muestran una menor presencia de dichos péptidos respecto a los sujetos control, sanos.
Tabla 9. Masas de los péptidos adicionales al patrón peptídico de la invención, útiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (OA) de sujetos que no padecen ninguna patología artrósica. Los porcentajes indican la presencia de cada péptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes, m/z SEQ ID No. OA (n=20) N (n=20)
871 ,502 12 0% 30%
1518,710 34 15% 55%
1810,992 50 5% 40%
1922,877 60 5% 50%
2012,011 62 40% 80%
2153,112 64 30% 90%
2602,358 74 35% 65% En la Tabla 10 se muestran los péptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el patrón peptídico de la invención y que son capaces de diferenciar entre sujetos artrósicos de sujetos que padecen artritis reumatoide. Es interesante destacar que, como se puede apreciar en dicha Tabla 10, los sujetos que padecen OA presentan una mayor presencia de los péptidos SEQ ID NO: 30, 59 y 69, respecto a los pacientes que padecen AR. En cambio, los sujetos artrósicos presentan una menor presencia de los péptidos SEQ ID NO: 22, 23, 26, 31 , 35, 39, 45, 46, 47, 48, 58, 61 , 63, 66, 71 , 72 y 73, respecto a los sujetos que padecen AR.
Tabla 10. Masas de los péptidos adicionales al patrón peptídico de la invención, útiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (OA) de sujetos que padecen artritis reumatoide (AR). Los porcentajes indican la presencia de cada péptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes.
Figure imgf000038_0001
En la Tabla 11 se muestran los péptidos adicionales que pueden utilizarse junto con el patrón peptídico de la invención y que son capaces de diferenciar entre sujetos artrosicos de sujetos que padecen artritis psoriásica. Es interesante destacar que, como se puede apreciar en dicha Tabla 1 1 , los sujetos que padecen OA presentan una mayor presencia de los péptidos SEQ ID NO: 25, 29, 30, 59 y 69, respecto a los pacientes que padecen APS. En cambio, los sujetos artrosicos presentan una menor presencia de los péptidos SEQ ID NO: 22, 26, 27, 31 , 37, 39, 46, 47, 48, 49, 58, 66 y 79 respecto a los sujetos que padecen APS.
Tabla 11. Masas de los péptidos adicionales al patrón peptídico de la invención útiles para clasificar y diagnosticar a pacientes que padecen artrosis (OA) de sujetos que padecen artritis psoriásica (APS). Los porcentajes indican la presencia de cada péptido en el total de las muestras analizadas para cada grupo de pacientes.
Figure imgf000039_0001
2.3. Análisis de componentes principales (PCA).
Con los péptidos seleccionados en el perfil peptídico descrito en la invención obtenidos de las muestras de sueros del grupo de pacientes artrosicos y de las muestras del grupo control se realizó un análisis de componentes principales (PCA), comprobando que las muestras se separan en al menos dos planos para todas las condiciones de elución, con lo que los péptidos son capaces de diferenciar entre muestras de donantes artrósicos y sujetos control.
Antes de realizar el PCA, se creó un grupo de datos único para cada porcentaje de elución (4%, 7%, 10% y 14%), con el espectro representativo de cada muestra. Los espectros de cada grupo de datos se convirtieron en vectores 1 s y Os, donde 1 significa presencia de pico y 0 significa ausencia de pico.
El análisis PCA y su visualización se realizaron usando el programa RapidMiner v5,3 (http://rapid-i,com/content/view/181/190/), que configura el algoritmo PCA para reducir la dimensionalidad de los grupos de datos hasta 3 componentes principales.
Estos resultados se muestran en la Figura 1.
2.4. Comprobación del clasificador con muestras ciegas
Se comprobó la utilidad de los péptidos que comprenden el patrón peptídico descrito en la presente invención para el diagnóstico de artrosis en un grupo de pacientes del que no se conocía la patología que padecían (muestras ciegas). Las muestras de dichos pacientes (n=79) se procesaron de la misma manera que se ha descrito anteriormente en materiales y métodos.
Utilizando el conjunto de datos descrito en la sección 2.1 se evaluaron una serie de clasificadores automáticos mediante la herramienta de aprendizaje automático Weka 3.7 (http://www.cs.waikato.ac.nz/ml/weka/). Estos clasificadores fueron entrenados con las distintas combinaciones posibles de los datos de cada elución. Esta evaluación se hizo utilizando el esquema de validación cruzada conocido como Leave-One-Out sobre dos problemas distintos: /) clasificación de muestras de todas las condiciones y /'/) clasificación de las muestras que presentan una condición relacionada con una patológica (grupos AR, APS y OA). Como resultado de esta evaluación se seleccionó como mejor clasificador para el problema de clasificar todas las condiciones a la implementación LibSVM del algoritmo Support Vector Machine (SVM) con kernel Radial Basis Function (RBF) entrenado con los datos de los porcentajes de elución 7% y 10% y combinado con un optimizador de parámetros basado en una búsqueda en rejilla (algoritmo GridSearch) configurado para buscar el valor óptimo del parámetro "cost" entre los valores 2"5, 2"3, 2"1 , 21 , 23, 25, 27, 29, 211 , 213 y 215, y del parámetro "gamma" entre los valores 2"15, 2"13, 2"11 , 2"9, 2"7, 2"5, 2"3, 2"1 , 21 y 23. Por otro lado, se seleccionó como mejor clasificador para el problema de clasificar las condiciones patológicas al clasificador Artificial Neural Network (ANN) entrenado con los datos del porcentaje 10%.
Con estos clasificadores entrenados con el conjunto de datos descrito en la sección 2.1 se realizó la clasificación del conjunto de datos de muestras ciegas. En el caso del clasificador SVM-RBF para el problema de todas las condiciones, el poder de clasificación fue moderado, al presentar un porcentaje de aciertos ligeramente superior al 60% y un valor del estadístico Kappa de Cohén (kappa) aproximado de 0,48. Por otro lado, el clasificador ANN para el problema de las condiciones patológicas mostró unos resultados superiores, con un porcentaje de aciertos próximo al 75% y un valor de kappa de 0,619. Los resultados de la clasificación se muestran en la Tabla 12.
Tabla 12: Clasificadores automáticos creados mediante el uso del patrón peptídico descrito en la presente invención obtenido a partir de muestras de suero analizadas de cada grupo de pacientes (n= 20 para cada grupo de pacientes). Conds.: condiciones, Cías.: clasificador, Elu.: porcentajes de elución, %Ac: porcentaje de aciertos, K: kappa global, Cond.: condición, Sen.: sensibilidad por condición, Esp.: especificidad por condición, n: muestras por condición, N: total de muestras, DC: diagnóstico correcto, DCP: diagnóstico correcto por patología.
Conds. Cías. Elu. %Ac. K Cond. Sen. Esp. n N DC DCP
APS 0,80 0,93 20 16
SVM-
7% AR 1 ,00 0,92 19 19
Todas RBF- 60,76 0,477 79 48
10%
OPT OA 0,45 0,75 20 9
N 0,20 0,88 20 4
APS 0,55 0,90 20 1 1
Patologías ANN 10% 74,58 0,619 AR 0,89 0,38 19 59 44 17
OA 0,80 0,23 20 16

Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso in vitro simultáneo del nivel de expresión y/o de la cantidad de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ I D NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ I D NO: 7, SEQ I D NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ I D NO: 10 y SEQ ID NO: 1 1 , como marcador para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y clasificación de enfermedades reumáticas en un individuo.
2. Uso in vitro según la reivindicación 1 caracterizado por que comprende además la determinación del nivel de expresión y/o cantidad de al menos uno de los péptidos seleccionados de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO:13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 , SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 79, o combinaciones de los mismos.
3. Uso in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde las enfermedades reumáticas se seleccionan de entre cualquiera de las siguientes: artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica.
4. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico y clasificación de enfermedades reumáticas que comprende:
(a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y
(b) detectar simultáneamente, en la muestra biológica aislada de (a), el nivel de expresión y/o la cantidad de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ I D NO: 3, SEQ I D NO: 4, SEQ I D NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 1 1.
Método según la reivindicación 4, que además comprende determinar en la etapa (b) el nivel de expresión y/o la cantidad de al menos uno de los péptidos seleccionados de la lista que consiste en: SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ I D NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ I D NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ I D NO: 69, SEQ ID NO: 71 , SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 79, o combinaciones de los mismos.
Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5 dónde las enfermedades reumáticas se seleccionan de entre cualquiera de las siguientes: artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica.
Método de diagnóstico y clasificación de enfermedades artrósicas, que comprende las etapas (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que además comprende:
(c) comparar las cantidades obtenidas en la etapa (b) para los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ I D NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ I D NO: 8, SEQ I D NO: 9, SEQ I D NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ I D NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO:
40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ I D NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ I D NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, con una cantidad de referencia procedente de una muestra obtenida de un individuo control sano, y
(d) asignar al individuo de la etapa (a) al grupo de individuos que padece artrosis cuando presenta:
(i) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ I D NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO:
41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ I D NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, detectados en (b), o
(ii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente inferior de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b); o
(iii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ I D NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ I D NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente inferior de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b), en relación al nivel de expresión y/o a la cantidad de los mismos péptidos detectados en una muestra de referencia obtenida de un individuos control sano.
8. Método de diagnóstico y clasificación de enfermedades artrósicas, que comprende las etapas (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que además comprende:
(c) comparar las cantidades obtenidas en la etapa (b) para los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ I D NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ I D NO: 8, SEQ I D NO: 9, SEQ I D NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71 , SEQ ID NO:72 y SEQ ID NO:73, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ I D NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ I D NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, con una cantidad de referencia procedente de una muestra obtenida de un individuo que padece artrosis, y
(d) asignar al individuo de la etapa (a) al grupo de individuos que padece artritis reumatoide cuando presentan: (i) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31 , SEQ ID NO:35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:61 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:71 , SEQ ID NO:72 y SEQ ID NO:73, , detectados en (b); o
(ii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ I D NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, , detectados en (b); o
(iii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (i), y de los péptidos de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ I D NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ I D NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, detectados en (b); o
(iv) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (i), y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ I D NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b); o
(v) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (iii), y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ I D NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b); o
(vi) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ I D NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ I D NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); o
(vii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ I D NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ I D NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74.SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); o
(viii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ I D NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ I D NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ I D NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ I D NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74.SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, en relación al nivel de expresión y/o a la cantidad de los mismos péptidos detectados en una muestra de referencia obtenida de un individuo que padece artrosis.
9. Método de diagnóstico y clasificación de enfermedades artrósicas, que comprende las etapas (a) y (b) según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que además comprende:
(c) comparar las cantidades obtenidas en la etapa (b) para los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ I D NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ I D NO: 8, SEQ I D NO: 9, SEQ I D NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 46, SEQ I D NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ I D NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ I D NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, con una cantidad de referencia procedente de una muestra obtenida de un individuo que padece artrosis, y
(d) asignar al individuo de la etapa (a) al grupo de individuos que padece artritis psoriásica cuando presenta:
(i) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ I D NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 79, detectados en (b); o
(ii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ I D NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); o
(iii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (i) y de los péptidos de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ I D NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, detectados en (b); o
(iv) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (i), y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ I D NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b); o
(v) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de la etapa (iii), y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ I D NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, detectados en (b); o
(vi) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ I D NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); o (vii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ I D NO: 3, SEQ I D NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 1 1 , y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ I D NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); o
(viii) un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente superior de los péptidos de SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 , SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 , SEQ I D NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77 y SEQ ID NO: 78, y un nivel de expresión y/o una cantidad significativamente disminuida de los péptidos de SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 50, SEQ I D NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64 y SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 69, detectados en (b); en relación al nivel de expresión y/o a la cantidad de los mismos péptidos detectados en una muestra de referencia procedente de un grupo de individuos que padecen artrosis.
10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4-9, donde las etapas (b) y/o (c) pueden ser total o parcialmente automatizadas.
1 1. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 10, donde la muestra es un fluido biológico.
12. Método según la reivindicación 1 1 , donde el fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, líquido sinovial y orina.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 12 donde la detección de los niveles de expresión y/o cuantificación de los péptidos se realiza mediante espectrometría de masas, ELISA, array, microarray, citometría de flujo, espectrometría de masas, cromatografía de gases-espectrometría de masas o cromatografía liquida-espectrometría de masas.
14. Kit o dispositivo para el diagnóstico y clasificación de enfermedades reumáticas, que comprende las herramientas moleculares necesarias para detectar el nivel de expresión y/o cuantificación simultánea de los péptidos de SEQ ID NO: 1 a 1 1.
15. Kit según la reivindicación 14, que además comprende las herramientas moleculares necesarias para detectar el nivel de expresión y/o cuantificación de al menos uno de los péptidos de secuencias: SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 , SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61 , SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71 , SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 79, o combinaciones de los mismos.
16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 14-15 caracterizado por que las herramientas moleculares capaces de detectar el nivel de expresión y/o cuantificación de los péptidos se seleccionan de entre cualquiera de las siguientes: anticuerpos o fragmentos de los mismos y oligonucleótidos capaces de hibridar con las secuencias nucleotídicas que codifican para los péptidos.
17. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 16 dónde las enfermedades reumáticas se seleccionan de entre cualquiera de las siguientes: artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica.
18. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 14-17, para la obtención de datos útiles en el diagnóstico y clasificación de enfermedades reumáticas en una muestra biológica.
19. Uso del kit según la reivindicación 18 donde la muestra biológica es una muestra de fluido biológico.
20. Uso del kit según la reivindicación 19 donde la muestra de fluido biológico se selecciona del grupo que consiste en sangre, suero, plasma, líquido sinovial y orina.
21. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, donde las enfermedades reumáticas se seleccionan de entre cualquiera de las siguientes: artrosis, artritis reumatoide y artritis psoriásica.
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