WO2016035419A1 - 糖尿病性皮膚潰瘍治療のための多能性幹細胞 - Google Patents

糖尿病性皮膚潰瘍治療のための多能性幹細胞 Download PDF

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浩太郎 吉村
佳保里 木下
真理 出澤
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国立大学法人 東京大学
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Definitions

  • the present invention relates to a cell preparation in regenerative medicine. More specifically, a cell preparation containing pluripotent stem cells effective for the repair and regeneration of skin tissue in skin ulcers including skin ulcers caused by diabetes, and a method for treating skin ulcers using the pluripotent stem cells About.
  • Diabetes mellitus is a disease with a persistent hyperglycemic state, and is said to occur as a result of the action of various environmental factors and genetic factors. It is known that insulin is a major regulator of blood glucose, and hyperglycemia is caused by insulin deficiency or excessive factors that inhibit its action (eg, genetic predisposition, lack of exercise, obesity, stress, etc.). It has been. Diabetes is mainly caused by type I diabetes caused by a decrease in pancreatic insulin secretion function due to autoimmune diseases and the like, and a decrease in pancreatic insulin secretion function and insulin resistance due to pancreatic exhaustion associated with continuous high insulin secretion 2 Classified as type 2 diabetes.
  • Non-patent Document 1 Non-patent Document 1
  • the global market for anti-diabetic drugs is about 1 trillion yen in 2006. This is almost first in both market and population.
  • leg complications cause the most damage. 40-70% of total lower limb amputations are associated with diabetes mellitus, and indeed 85% of all diabetic-related lower limb amputations occur following leg ulcers. In patients with diabetes mellitus, the risk of developing chronic skin ulcers such as leg ulcers increases with long-term complications. Ulceration occurs as a result of ischemia and / or neuropathy. Local tissue ischemia is a major cause of development for diabetic ulcers. Similar to macrovascular disease, patients with diabetes are exposed to further threats to skin perfusion associated with non-conductive arteries in the course of damage to microcirculatory control mechanisms called atherosclerosis and small vessel disease.
  • neuropathy is a major complication of diabetes mellitus, with no well-established therapy for either symptomatic treatment or prevention of progressive decline in neurological function.
  • the effects of peripheral neuropathy are complex.
  • the mechanisms leading to neuronal damage in diabetes are still unresolved, but are said to be multifactorial, including genetic predisposition, metabolic and vascular abnormalities, and lack of perturbation of related growth factors.
  • Adipose tissue-derived stromal cells are known as such cells, and are considered to have the ability to differentiate not only into adipocytes and blood vessels but also into various lineages (Non-Patent Documents 2 to 4).
  • ASC Adipose tissue-derived stromal cells
  • Non-Patent Documents 2 to 4 As an example using this ASC, there is a report of making a diabetic mouse and trying to cure an ischemic wound (Non-Patent Document 5).
  • An example in which adipose tissue-derived regenerative cells are applied to clinical treatment of diabetic ulcers in the lower limbs of patients with peripheral arterial disorders has also been reported (Non-patent Document 6). However, the wound site has not been completely cured.
  • iPS cells such as Patent Document 1
  • a specific gene or a specific gene is identified in the dermal fibroblast fraction, which is a mesenchymal cell.
  • iPS cells have a high tumorigenic ability, and therefore there is an extremely high hurdle for clinical application.
  • pluripotent stem cells present in the mesenchymal cell fraction and expressing SSEA-3 (Stage-Specific Embryonic Antigen-3) as a surface antigen Differentiating Stress Enduring cells (Muse cells) are responsible for the pluripotency of the mesenchymal cell fraction, and have been found to be potentially applicable to disease treatment aimed at tissue regeneration (Patent Document 2; non-patent document 2) Patent Documents 9 to 12).
  • SSEA-3 Serial-Specific Embryonic Antigen-3
  • Patent Document 2 Non-patent document 2
  • Patent Documents 9 to 12 Patent Documents 9 to 12
  • An object of the present invention is to provide a new medical use using pluripotent stem cells (Muse cells) in regenerative medicine. More specifically, an object of the present invention is to provide a cell preparation for preventing and / or treating skin ulcer, which contains Muse cells.
  • the present inventors have found that by administering Muse cells to diabetic skin ulcer mice to the affected skin ulcers, the Muse cells reconstruct and repair the skin tissue, resulting in ulcer healing. It came to complete.
  • the present invention is as follows.
  • a cell preparation for preventing and / or treating skin ulcer comprising SSEA-3-positive pluripotent stem cells isolated from mesenchymal tissue or cultured mesenchymal cells in a living body.
  • the skin ulcer is selected from the group consisting of diabetic skin ulcer, decubitus ulcer, venous stasis ulcer, arterial ulcer, radiation ulcer, necrotizing fasciitis, and third degree burn ]
  • the pluripotent stem cells are CD34 negative, CD117 negative, CD146 negative, CD271 negative, NG2 negative, vWF negative, Sox10 negative, Snai1 negative, Slug negative, Tyrp1 negative, and Dct negative.
  • One or more pluripotent stem cells selected from the group consisting of epidermal keratinocytes, vascular endothelial cells, vascular pericytes, adipocytes, preadipocytes, dermal fibroblasts, and nerve sheath cells.
  • the present invention relates to a skin ulcer by means of a skin tissue regeneration mechanism in which a Muse cell is administered to a subject suffering from a skin ulcer and the Muse cell is differentiated into a cell constituting the skin tissue in the affected part. It is possible to suppress the progress of the skin and repair the skin tissue.
  • mice since the wound healing ability is originally high and the wound heals quickly, it is difficult to make the difference clear when evaluating the wound healing effect of the drug. Therefore, immunodeficient mice having diabetes, which is characterized by difficulty in wound healing, were used for evaluation of the wound healing effect.
  • streptozotocin STZ
  • STZ streptozotocin
  • mice were used for evaluation of the wound healing effect.
  • type I diabetes streptozotocin (STZ) was injected intraperitoneally into 5-week-old male SCID mice fasted for 24 hours. Three days after STZ administration (150 mg / kg), hyperglycemia (blood glucose> 300 mg / dl) was examined. When hyperglycemia was not observed, STZ administration (150 mg / kg) was performed again. A skin defect was created on the back of 9 week old DM-SCID mice.
  • STZ streptozotocin
  • MSCs are known to secrete growth factors required during the inflammatory and cell growth phases of wound healing. Therefore, the relative value of growth factor production in the Muse cell fraction and mesenchymal cell fraction (MSC) cultured for 48 hours under hypoxic (1% O 2 ) or normoxic (6% O 2 ) conditions was determined by ELISA. It was measured.
  • the cytokines (growth factors) measured were HGF, SDF-1, PDGF-BB, VEGF, EGF, TGF- ⁇ , NGF- ⁇ , SCF, bFGF, and TNF- ⁇ .
  • the Y axis shows the absorbance at 450 nm.
  • the present invention relates to a cell preparation for preventing and / or treating skin ulcer, which contains SSEA-3-positive pluripotent stem cells (Muse cells).
  • SSEA-3-positive pluripotent stem cells Muse cells
  • the present invention aims at prevention and / or treatment of skin ulcer using a cell preparation containing SSEA-3-positive pluripotent stem cells (Muse cells).
  • skin ulcer means an injury on the skin caused by a defect on the surface of the tissue (exposure of the dermis or subcutaneous tissue) usually caused by inflammation.
  • Skin ulcers that can be prevented and / or treated by the cell preparation of the present invention include, but are not limited to, diabetic skin ulcers, pressure ulcers, venous stasis ulcers, arterial ulcers, radiation ulcers, necrotizing fasciitis, third Degree burns etc. are included.
  • Diabetic skin ulcer is a very refractory skin ulcer caused by damage of vascular endothelial cells due to hyperglycemia, and examples thereof include diabetic foot ulcer and diabetic leg ulcer .
  • decubitus is meant a chronic ulcer caused by pressure applied to an area of skin for an extended period of time. This type of wound is often referred to as bedsores.
  • a “venous stasis ulcer” is caused by congestion of blood or other fluid from a defective vein.
  • arterial ulcer is meant necrotic skin in an area surrounding an artery with poor blood flow.
  • Rapid ulcer refers to an ulcer that occurs in irradiated skin.
  • “Necrotizing fasciitis” refers to a soft tissue infection in which necrosis rapidly expands with the superficial fascia as the mainstay of bacterial infection. “Third-degree burn” refers to the entire dermis, the subcutaneous tissue, and burns. According to the present invention, the cell preparation of the present invention is particularly effective for the prevention and / or treatment of diabetic skin ulcer.
  • Pluripotent stem cells The pluripotent stem cell used in the cell preparation of the present invention was found by Dezawa, one of the present inventors, in the human body and named “Muse (Multilineage-differentiating Stress Ending) cell”. It is. Muse cells can be obtained from bone tissue, skin tissue such as adipose tissue (Ogura, F., et al., Stem Cells Dev., Vol. 23, p. 717-728 (2014)) and dermal connective tissue. Also scattered in the connective tissue of each organ. In addition, this cell is a cell having the properties of both pluripotent stem cells and mesenchymal stem cells.
  • the cell surface markers “SSEA-3 (Stage-specific embryonic antigen-3)” and “ Identified as "CD105” double positive.
  • Muse cells or cell populations containing Muse cells can be separated from living tissues using, for example, these antigen markers as indicators.
  • a cell population containing Muse cells can be concentrated by hypoxia or long-term stress caused by proteases such as trypsin and dyspase. Details such as a method for separating Muse cells, an identification method, and characteristics are disclosed in International Publication No. WO2011 / 007900. Also, as reported by Wakao et al. (2011, supra), when mesenchymal cells are cultured from bone marrow, skin, etc.
  • SSEA-3 positive cells are CD105 It is known to be a positive cell. Accordingly, in the cell preparation of the present invention, when separating Muse cells from living mesenchymal tissue or cultured mesenchymal stem cells, the Muse cells can be purified and used simply with SSEA-3 as an antigen marker. .
  • pluripotent stem cells separated from living mesenchymal tissue or cultured mesenchymal tissue using SSEA-3 as an antigen marker which can be used in cell preparations for treating skin ulcers (Muse cells) or a cell population containing Muse cells may be simply referred to as “SSEA-3 positive cells”.
  • Muse cells or cell populations containing Muse cells can be obtained from living tissue (eg, using antibodies against the cell surface marker SSEA-3 alone, or both antibodies against SSEA-3 and CD105, respectively) , Mesenchymal tissue).
  • living tissue eg, using antibodies against the cell surface marker SSEA-3 alone, or both antibodies against SSEA-3 and CD105, respectively
  • Mesenchymal tissue e.g., Mesenchymal tissue.
  • “living body” means a living body of a mammal. In the present invention, the living body does not include embryos whose developmental stage is earlier than the fertilized egg or blastocyst stage, but includes embryos in the developmental stage after the blastocyst stage including the fetus and blastocyst.
  • Mammals include, but are not limited to, primates such as humans and monkeys, rodents such as mice, rats, rabbits, guinea pigs, cats, dogs, sheep, pigs, cows, horses, donkeys, goats, ferrets, etc. It is done. Muse cells used in the cell preparation of the present invention are clearly distinguished from embryonic stem cells (ES cells) and iPS cells in that they are separated from living tissues with a marker directly. “Mesenchymal tissue” refers to tissues such as bone, synovium, fat, blood, bone marrow, skeletal muscle, dermis, ligament, tendon, dental pulp, umbilical cord, umbilical cord blood, and tissues present in various organs.
  • Muse cells can be obtained from bone marrow, skin, or adipose tissue.
  • Muse cells may be separated from cultured mesenchymal cells such as fibroblasts and bone marrow mesenchymal stem cells using the separation means.
  • the Muse cell used may be autologous to the recipient who receives the cell transplant, or may be another family.
  • a Muse cell or a cell population containing a Muse cell can be separated from a living tissue using, for example, SSEA-3 positive and SSEA-3 and CD105 double positive as an index.
  • SSEA-3 positive and SSEA-3 and CD105 double positive are known to include various types of stem cells and progenitor cells.
  • Muse cells are not the same as these cells.
  • Such stem cells and progenitor cells include skin-derived progenitor cells (SKP), neural crest stem cells (NCSC), melanoblast (MB), perivascular cells (PC), endothelial progenitor cells (EP), adipose-derived stem cells (ADSC). ).
  • Muse cells can be isolated using “non-expression” of a marker unique to these cells as an index.
  • Muse cells are CD34 (EP and ADSC markers), CD117 (c-kit) (MB markers), CD146 (PC and ADSC markers), CD271 (NGFR) (NCSC markers), NG2 (PC marker), vWF factor (von Willebrand factor) (EP marker), Sox10 (NCSC marker), Snai1 (SKP marker), Slug (SKP marker), Tyrp1 (MB marker), and At least one of 11 markers selected from the group consisting of Dct (MB marker), for example 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 The non-expression of individual or eleven markers can be separated into indicators.
  • non-expression of CD117 and CD146 can be separated as an index
  • non-expression of CD117, CD146, NG2, CD34, vWF and CD271 can be separated as an index
  • the non-expression of 11 markers can be separated as an index.
  • the Muse cell having the above characteristics used in the cell preparation of the present invention is as follows: (I) low or no telomerase activity; (Ii) has the ability to differentiate into cells of any germ layer of the three germ layers; It may have at least one property selected from the group consisting of (iii) showing no neoplastic growth; and (iv) having a self-renewal capability.
  • the Muse cell used in the cell preparation of the present invention has all the above properties.
  • telomerase activity is low or absent means that, for example, when telomerase activity is detected using TRAPEZE XL telomerase detection kit (Millipore), it is low or cannot be detected.
  • “Low” telomerase activity means, for example, telomerase having a telomerase activity comparable to that of somatic human fibroblasts, or 1/5 or less, preferably 1/10 or less compared to Hela cells. It means having activity.
  • the Muse cell has the ability to differentiate into three germ layers (endoderm, mesodermal, and ectoderm) in vitro and in vivo, for example, induction culture in vitro Can be differentiated into hepatocytes, nerve cells, skeletal muscle cells, smooth muscle cells, bone cells, fat cells and the like. In addition, when transplanted to the testis in vivo, it may show the ability to differentiate into three germ layers.
  • Muse cells grow at a growth rate of about 1.3 days in suspension culture, but grow from 1 cell in suspension culture to form an embryoid body-like cell mass and stop growing in about 14 days. However, when these embryoid body-like cell masses are brought into an adhesion culture, cell proliferation is started again, and the proliferated cells spread from the cell masses. Furthermore, when transplanted to the testis, it has the property of not becoming cancerous for at least half a year.
  • a Muse cell has self-renewal (self-replication) ability.
  • self-renewal means that differentiation from cells contained in embryoid body-like cell clusters obtained by culturing in suspension culture from one Muse cell to trioderm cells can be confirmed, Bring the cells of embryoid body-like cell mass to suspension culture with one cell again to form the next generation embryoid body-like cell mass, from which again embryos in trioderm differentiation and suspension culture This means that a clot-like cell mass can be confirmed.
  • the self-renewal may be repeated once or multiple times.
  • the cell preparation of the present invention is not limited, but the Muse cell or the cell population containing Muse cell obtained in (1) above is treated with physiological saline or an appropriate buffer (for example, phosphorous). Acid buffered saline).
  • physiological saline or an appropriate buffer for example, phosphorous. Acid buffered saline.
  • the cells may be cultured before cell transplantation and grown until a predetermined cell concentration is obtained.
  • Muse cells do not become tumors. Therefore, even if cells collected from living tissue remain undifferentiated, there is a possibility of canceration. Low and safe.
  • the culture of the collected Muse cells is not particularly limited, but can be performed in a normal growth medium (for example, ⁇ -minimal essential medium ( ⁇ -MEM) containing 10% calf serum). More specifically, referring to the above International Publication No. WO2011 / 007900, in the culture and proliferation of Muse cells, a medium, additives (for example, antibiotics, serum) and the like are appropriately selected, and Muse cells at a predetermined concentration are selected. A solution containing can be prepared.
  • a normal growth medium for example, ⁇ -minimal essential medium ( ⁇ -MEM) containing 10% calf serum.
  • the cell preparation of the present invention When the cell preparation of the present invention is administered to a human subject, about several ml of bone marrow fluid is collected from human iliac bone, and for example, bone marrow mesenchymal stem cells are cultured as adherent cells from the bone marrow fluid and effective.
  • the Muse cells can be isolated using the SSEA-3 antigen marker as an indicator, and autologous or other Muse cells can be prepared as cell preparations.
  • a cell population containing Muse cells can be concentrated and prepared as a cell preparation by stress such as hypoxia or protease.
  • the cells are cultured and expanded until an effective therapeutic amount is reached, and then autologous Muse cells can be prepared as a cell preparation.
  • Muse cells when using Muse cells in cell preparations, dimethyl sulfoxide (DMSO), serum albumin, etc. are included in the cell preparations to protect the cells, and antibiotics, etc., are included in the cell preparations to prevent bacterial contamination and growth. May be.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • other pharmaceutically acceptable ingredients for example, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspending agents, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives, physiological saline, etc.
  • Cells or components other than Muse cells contained in mesenchymal stem cells may be contained in the cell preparation.
  • Muse cells can also be used as pharmaceutical compositions containing various additives.
  • the number of Muse cells contained in the above-prepared cell preparation is determined based on the sex, age, weight, and affected area of the subject so that a desired effect (for example, skin tissue reconstruction) can be obtained in the treatment of skin ulcer. It can be appropriately adjusted in consideration of the state, the state of the cells used, and the like.
  • various effects of Muse cell transplantation were examined on an immunodeficient diabetic mouse model prepared by administration of streptozotocin (STZ). By administering SSEA3 positive cells to the affected area at 1.0 ⁇ 10 5 cells / head to about 20-30 g of SCID mice, a very excellent effect was obtained.
  • the cell preparation of the present invention can be used a plurality of times (for example, 2 to 10 times) at appropriate intervals (for example, twice a day, once a day, once a week) until a desired therapeutic effect is obtained. 2 times, once a week, once every two weeks, once a month, once every two months, once every three months, once every six months) Also good.
  • the therapeutically effective dose is preferably, for example, 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 7 cells per individual and 1 to 10 doses.
  • the total dose in one individual is not limited, but 1 ⁇ 10 3 cells to 1 ⁇ 10 8 cells, 1 ⁇ 10 4 cells to 5 ⁇ 10 7 cells, 2 ⁇ 10 4 cells to 2 ⁇ 10 7 cells, 5 ⁇ Examples include 10 4 cells to 5 ⁇ 10 6 cells, 1 ⁇ 10 5 cells to 1 ⁇ 10 6 cells, and the like.
  • a mouse diabetic skin ulcer model can be constructed and used. it can.
  • the mice used as the model are not limited, but generally include SCID mice and Balb / c mice.
  • a diabetic skin ulcer model can be created by intraperitoneally administering streptozotocin (STZ) to these mice.
  • STZ is a derivative of glucose and is used to damage pancreatic ⁇ cells and cause diabetes in animals.
  • the dosage of STZ is preferably 150 mg / kg per dose, and may be dosed multiple times.
  • the cell preparation of the present invention is a human-derived Muse cell, it has a heterogeneous relationship with the mouse to which the preparation is administered.
  • an immunosuppressant such as cyclosporine
  • mesenchymal cells which are the population of Muse cells, originally have strong immunosuppression, and Muse cells also have the same action. Therefore, in the present invention, it is not necessary to use an immunosuppressive agent in a mouse model that does not use an immunosuppressive agent other than SCID mice.
  • the cell preparation of the present invention can treat a patient's skin ulcer and reconstruct normal skin.
  • “reconstruct normal skin” means a state in which an affected part having a skin ulcer has been wound-healed and completely cured.
  • the reconstructed skin state is preferably a state in which the entire surface is covered with epithelial keratinocytes, and epithelialization is completed.
  • a dermis having a sufficient thickness is constructed under the epithelium. More preferably, skin appendages such as sweat glands and / or hair follicles are being regenerated.
  • various cytokines can be secreted from Muse cells by culturing Muse cells in a hypoxic state (for example, oxygen concentration of 1%) (see Example 3). Therefore, according to the present invention, there is provided a method for increasing the ability to produce at least one cytokine of VEGF, EGF, PDGF-BB, NGF- ⁇ , SCF, TNF- ⁇ , bFGF, and TGF- ⁇ .
  • the stromal vascular fraction (SVF) containing adipose-derived stem cells / stromal cells (ASC) was previously described (Yoshimura K, et al., J. Cell Physiol., Vol. 208, p. 64-76). (2006)) and isolated from aspirated fat.
  • a fat-derived stromal / stem cell-containing (ASC) cell pellet (corresponding to SVF) is cultured in a dish containing Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Nissan, Tokyo, Japan) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) did.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the proliferated hASC was subcultured using the same medium.
  • the second passage hASC was harvested with 0.25% trypsin containing 2 mM EDTA at 37 ° C. for 5 minutes and used to isolate Muse cells.
  • MACS mesenchymal cell fraction
  • Example 2 Preparation of an immunodeficient diabetic mouse model
  • SCID severe combined immunodeficient
  • C.B17 / Icr-scid, scid / scid was obtained from CLEA Japan, Inc. (Tokyo, Japan). All animal experiments were conducted with approval from the Institutional Animal Care and Use Committee at the University of Tokyo. After SCID mice are fasted for 24 hours, citrate buffered saline (pH 4.5) containing newly prepared streptozotocin (STZ; 150 mg / kg, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) is injected intraperitoneally. did.
  • Blood glucose levels were measured using a glucometer and test strip (Glucose Pilot, Aventir Biotech LLC, Carlsbad, Calif.) 3 days after STZ injection. Mice were considered diabetic (DM) if blood glucose levels were above 300 mg / dl. Mice that did not show hyperglycemia (> 300 mg / dl) were given a second STZ injection (150 mg / kg) and blood glucose levels were monitored 3 days later (FIG. 1A).
  • mice were individually anesthetized by intraperitoneal injection of pentobarbital (65 mg / kg). Two full-thickness skin wounds (diameter 6 mm in diameter) penetrating the dermal muscle layer using a disinfected circular biopsy punch (Kai Industries Co., Tokyo, Japan) after hair removal using an electric trimmer and hair removal cream ) was created on the back of the mouse.
  • mice Five experimental groups: wild-type mice, non-DM-SCID mice, DM-derived SCID mice, DM-induced SCID mice treated with the Muse cell population, and DM-induced SCID mice treated with the mesenchymal cell fraction (MSC). Got ready. Six mice in each group were used. Muse cells (1.0 ⁇ 10 5 cells / mouse) were mixed with 0.1 ml of crosslinked hyaluronic acid (Restylane, Q-MED, Uppsala, Sweden) and then injected subcutaneously around the wound. Macroscopically, the time to wound closure (days to complete epithelial regeneration) was examined. Wounds were taken sequentially on days 0, 3, 7, 10, and 14 using a conventional digital camera (IXY Digital 90, Canon, Tokyo, Japan). Photos were evaluated using image analysis software (Photoshop CS6, Adobe Systems, San Jose, Calif.) And the wound area was measured.
  • image analysis software Photoshop CS6, Adobe Systems, San Jose, Calif.
  • Example 3 Cytokine production assay (ELISA method) MSCs are known to secrete growth factors (eg, PDGF, bFGF, TGF- ⁇ , EGF, etc.) required during the inflammatory and cell growth phases of wound healing (Maxson, S., et al. , Stem Cells Transl. Med., Vol.1, p.142-149 (2012)). Therefore, Muse cell populations and MSCs were cultured in vitro under hypoxic conditions and normoxic conditions, and cytokines secreted into the culture medium were examined. The experiment was performed as follows.
  • growth factors eg, PDGF, bFGF, TGF- ⁇ , EGF, etc.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • SDF-1 stromal cell derived factor 1
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • PDGF-BB Platelet derived growth factor
  • NGF- ⁇ nerve growth factor- ⁇
  • SCF stem cell factor
  • TGF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • TGF- ⁇ transforming growth factor- ⁇
  • FIG. 2 shows the results of comparing the concentration of cytokines in the culture medium after 48 hours after adhesion culture of Muse cell population and MSC in normoxic (6% O 2 ) or hypoxic (1% O 2 ) conditions.
  • the Muse cell population released higher amounts of EGF, PDGF-BB, NGF- ⁇ , SCF, TNF- ⁇ , bFGF, and TGF- ⁇ compared to MSCs cultured at the same oxygen tension.
  • the concentrations of VEGF, EGF, PDGF-BB, NGF- ⁇ , SCF, TNF- ⁇ , bFGF, and TGF- ⁇ were higher in hypoxic conditions than in normoxic conditions, especially in the Muse cell population. .
  • Example 4 Wound healing streptozotocin (STZ) in DM-SCID mice injured pancreatic ⁇ cells and induced type I DM, but doses and methods of STZ have been reported previously (Schmidt, RE; , Et al., Am. J. Pathol., Vol.163, p.2077-2091 (2003), Lee, RH, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA., Vol. P. 17438-17443 (2006); Schmidt, RE, et al., Exp. Neurol., Vol. 209, p. 161-170 (2008)). When 200 mg / kg STZ was administered, SCID mice often died within 1 week of administration due to severe weight loss and metabolic abnormalities.
  • DM-derived SCID mice successfully prepared by 1 (9/29 mice; 31.0%) or 2 (13/29 mice; 44.8%) STZ injections was used for wound healing experiments for 30 days after the final STZ injection.
  • the wound sizes of DM-SCID mice treated with Muse cells and MSC were 51.05 ⁇ 7.2% and 74.0 ⁇ 6.6%, respectively (P ⁇ 0.0001).
  • DM-SCID mice treated with Muse cells promoted wound healing and appeared to be comparable to those in the WT group.
  • Example 5 Histological analysis Mouse skin samples were embedded in OCT compounds (Sakura Finetek, Tokyo, Japan), frozen in liquid nitrogen and stored at -80 ° C until sectioning. Cryosections (8 ⁇ m) were placed on slides, dried at room temperature for 20 minutes, fixed with 4% paraformaldehyde (in PBS) for 1 minute, and washed with PBS for 5 minutes. Slides were stained with hematoxylin and eosin (H & E) and processed for immunohistochemical analysis.
  • OCT compounds Sakura Finetek, Tokyo, Japan
  • -Diaminobenzidine Visualized by peroxidase reaction with tetrahydrochloride (DAB) Cryosections were incubated with the following primary antibodies for confocal laser microscopy: mouse anti-human mitochondria (1: 100 dilution, Abcam), rabbit anti-human 58K Golgi protein, rabbit anti-human-CK14 (1: 200 dilution, Abcam) or goat anti-human platelet endothelial cell binding molecule-1 (PECAM-1; 1:50 dilution, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
  • Sections were incubated with the following secondary antibodies: donkey anti-mouse IgG-Alexa 488, donkey anti-rabbit IgG-Alexa 680, or rabbit anti-goat IgG-Alexa 488 (all 1: 500 dilution, Invit ogen, Carlsbad, CA). Nuclei were counterstained with DAPI, a confocal microscope (C1si Nikon, Nikon, Tokyo, Japan) were tested using.
  • the cell preparation of the present invention can be applied to the skin ulcer affected part of a diabetic skin ulcer mouse model, whereby the skin tissue can be reconstructed and repaired, and can be applied to the treatment of diabetic skin ulcer.

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Abstract

　再生医療において、多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。本発明は、生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、皮膚潰瘍を治療するための細胞製剤を提供する。本発明の細胞製剤は、上記疾患の対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を皮膚潰瘍患部に投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が皮膚を構成する細胞に分化するという皮膚組織再生メカニズムに基づく。

Description

糖尿病性皮膚潰瘍治療のための多能性幹細胞
　本発明は、再生医療における細胞製剤に関する。より具体的には、糖尿病に起因した皮膚潰瘍を含む皮膚潰瘍における皮膚組織の修復及び再生に有効な多能性幹細胞を含有する細胞製剤、並びに該多能性幹細胞を用いた皮膚潰瘍の治療法に関する。
　糖尿病は、持続的な高血糖状態を伴う疾患であり、多種多様の環境因子と遺伝的因子とが作用した結果、生じると言われている。血糖の主要な調節因子はインスリンであり、高血糖は、インスリン欠乏、又はその作用を阻害する諸因子（例えば、遺伝的素因、運動不足、肥満、ストレス等）が過剰となって生じることが知られている。糖尿病は、主に、自己免疫疾患などによる膵インスリン分泌機能の低下によって生じるＩ型糖尿病、及び持続的な高インスリン分泌に伴う膵疲弊による膵インスリン分泌機能の低下やインスリン抵抗性が原因である２型糖尿病に分類される。我が国においては、糖尿病は現代の国民病であり、糖尿病患者の９５％以上（予備軍を含めると２，０００万人を超えると予測されている）は、インスリン非依存性糖尿病と言われており、生活様式の変化に伴い、患者数の増加が問題となっている。世界レベルでは、約２億人と推定され（非特許文献１）、世界の糖尿病治療薬の市場は、２００６年では約１兆円の規模である。これは、市場及び人口ともにほぼ第１位である。
　心臓疾患、腎不全及び失明などの多くの重症な合併症は、糖尿病に伴って個人に影響を及ぼすが、脚部合併症は最大の被害をもたらす。下肢の全切断の４０～７０％は、真性糖尿病に関係し、実際に、全ての糖尿病関連の下肢切断の８５％は、脚部潰瘍に続いて起こる。真性糖尿病を患っている患者では、長期の合併症に伴って、脚部の潰瘍などの慢性皮膚潰瘍を発症する危険度が増加する。潰瘍化は、虚血及び／又は神経障害の結果として起こる。局所的な組織の虚血は、糖尿病性潰瘍に対する主要な発症原因である。大血管疾患と同様に、糖尿病を有する患者は、アテローマ性動脈硬化や小血管疾患と呼ばれる微小循環制御機構の損傷の過程における非伝導性の動脈に関連した皮膚潅流に対する更なる脅威にさらされる。正常な状況下では、血流は傷害に反応して治癒を促進するために増加する。しかしながら、小血管疾患（及び虚血）が存在する場合、この反応は有意に鈍くなり、低流量中の微小循環における血栓症の傾向と共に、潰瘍の病因論において恐らくは重要であると考えられる。一方、神経障害は、その対症療法又は神経機能の進行性減退の予防のいずれかに対して、充分に確立された療法がなく、真性糖尿病の主要な合併症となっている。特に、末梢神経障害の影響は複雑である。糖尿病における神経の損傷へと導く機構は、いまだに解決されていないが、遺伝子的素因、代謝及び血管異常、並びに関係する増殖因子の摂動の欠如など、多元的なものであると言われている。
　上記のような難治性疾患に対して、多能性細胞を利用した再生医療が注目されている。このような細胞として脂肪組織由来間質細胞（ＡＳＣ）が知られ、脂肪細胞や血管のみならず多様な系統への分化能を有すると考えられている（非特許文献２～４）。このＡＳＣを用いた例としては、糖尿病マウスを作製し、虚血性創傷の治癒を試みた報告がある（非特許文献５）。また、末梢動脈障害を有する患者の下肢における糖尿病性潰瘍の臨床的治療に脂肪組織由来再生細胞を応用した例も報告されている（非特許文献６）。しかしながら、創傷部位が完治するには至っていない。
　また、成体から得られる分化能を有する細胞として、例えば、骨、軟骨、脂肪細胞、神経細胞、骨格筋等への分化能を有する間葉系細胞画分（ＭＳＣ）（非特許文献７及び８）が知られているが、これは様々な細胞を含む細胞群であり、その分化能の実体が分かっておらず、治療効果にバラつきが大きかった。また、成体由来の多能性幹細胞としてｉＰＳ細胞（特許文献１など）が報告されているが、ｉＰＳ細胞の樹立には、間葉系細胞である皮膚線維芽細胞画分に特定の遺伝子や特定の化合物を体細胞に導入するという極めて複雑な操作を必要とすることに加え、ｉＰＳ細胞が高い腫瘍形成能力を有することから、臨床応用への極めて高いハードルが存在している。
　本発明者らの一人である出澤の研究により、間葉系細胞画分に存在し、ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ－３）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｅｎｄｕｒｉｎｇ　ｃｅｌｌｓ；Ｍｕｓｅ細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っており、組織再生を目指した疾患治療に応用できる可能性があることが分かってきた（特許文献２；非特許文献９～１２）。しかしながら、皮膚潰瘍の予防及び／又は治療にＭｕｓｅ細胞を使用し、期待される治療効果が得られることを明らかにした例はない。
特許第４１８３７４２号公報 国際公開第２０１１／００７９００号
Ｓｔｕｍｖｏｌｌ．Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，Ｖｏｌ．３６５，ｐ．１３３３－１３４６（２００５） Ｒｅｈｍａｎ，Ｊ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１０９，ｐ．１２９２－１２９８（２００４） Ｐｌａｎａｔ－Ｂｅｎａｒｄ，Ｖ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１０９，ｐ．６５６－６６３（２００４） Ｍｉｒａｎｖｉｌｅ，Ａ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１１０，ｐ．３４９－３５５（２００４） Ｋｉｍ，Ｅ．Ｋ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｓｔ．Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ．，Ｖｏｌ．１２８，ｐ．３８７－３９４（２０１１） Ｍａｒｉｎｏ，Ｇ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１８５，ｐ．３６－４４（２０１３） Ｄｅｚａｗａ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，Ｖｏｌ．１１３，ｐ．１７０１－１７１０（２００４） Ｄｅｚａｗａ，Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．３０９，ｐ．３１４－３１７（２００５） Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ　Ｇｅｎｅ　Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１２，ｐ．６００－６０７（２００５） Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０７，ｐ．８６３９－８６４３（２０１０） Ｗａｋａｏ，Ｓ，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０８，ｐ．９８７５－９８８０（２０１１） Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏ．，Ｖｏｌ．８，ｐ．１３９１－１４１５（２０１３）
　本発明は、再生医療において、多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、Ｍｕｓｅ細胞を含む、皮膚潰瘍の予防及び／又は治療のための細胞製剤を提供することを目的とする。
　本発明者らは、糖尿病性皮膚潰瘍マウスに対して、Ｍｕｓｅ細胞を皮膚潰瘍患部に投与することにより、Ｍｕｓｅ細胞が、皮膚組織を再建及び修復し、潰瘍の治癒をもたらすことを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、以下の通りである。
　［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、皮膚潰瘍を予防及び／又は治療するための細胞製剤。
　［２］外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞が、濃縮された細胞画分を含む、上記［１］に記載の細胞製剤。
　［３］前記皮膚潰瘍が、糖尿病性皮膚潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈うっ血潰瘍、動脈性潰瘍、放射線潰瘍、壊死性筋膜炎、及び第３度熱傷からなる群から選択される、上記［１］及び［２］に記載の細胞製剤。
　［４］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、上記［１］～［３］に記載の細胞製剤。
　［５］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、上記［１］～［４］に記載の細胞製剤。
　［６］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、上記［１］～［５］に記載の細胞製剤。
　［７］前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、上記［１］～［６］に記載の細胞製剤。
　［８］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］～［７］に記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
　［９］前記多能性幹細胞が、表皮角化細胞、血管内皮細胞、血管周皮細胞、脂肪細胞、脂肪前駆細胞、皮膚線維芽細胞、及び神経鞘細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞に分化する能力を有する、上記［１］～［８］に記載の細胞製剤。
　本発明は、皮膚潰瘍を患っている対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を皮膚潰瘍患部に投与することにより、該患部でＭｕｓｅ細胞が皮膚組織を構成する細胞に分化するという皮膚組織再生メカニズムによって、皮膚潰瘍の進展を抑制し、皮膚組織を修復させることができる。
Ａ．一般にマウスにおいては元来、創傷治癒能力が高く、素早く創傷治癒してしまうため、薬剤の創傷治癒効果を評価する際に差異が明確になりにくい。そのため創傷治癒が進みにくいことが特徴である糖尿病を有する免疫不全マウスを創傷治癒効果の評価に用いた。Ｉ型糖尿病を誘導するために、２４時間絶食させた５週齢の雄性ＳＣＩＤマウスにストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を腹腔内注射した。ＳＴＺ投与（１５０ｍｇ／ｋｇ）から３日後に、高血糖（血中グルコース＞３００ｍｇ／ｄｌ）を調べた。高血糖が見られなかった場合、ＳＴＺ投与（１５０ｍｇ／ｋｇ）を再び行った。皮膚欠損を９週齢のＤＭ－ＳＣＩＤマウスの背部に作製した。Ｂ．典型的な血糖値の変化を示す。ほとんどのマウスは、１回又は２回のＳＴＺ注射により高血糖になった。 ＭＳＣは、創傷治癒における炎症期及び細胞増殖期に必要とされる増殖因子を分泌することが知られている。そこで、低酸素（１％Ｏ２）又は正常酸素（６％Ｏ２）条件で４８時間培養したＭｕｓｅ細胞画分及び間葉系細胞画分（ＭＳＣ）中の増殖因子産生の相対値をＥＬＩＳＡで測定した。測定したサイトカイン（増殖因子）は、ＨＧＦ、ＳＤＦ－１、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ－β、ＮＧＦ－β、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ、及びＴＮＦ－αであった。Ｙ軸は４５０ｎｍでの吸光度を示す。値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。＊：Ｐ＜０．０５。 皮膚欠損（直径６ｍｍ）の創傷治癒を１４日まで順次評価した。創傷領域を撮影し、元の創傷の大きさに対する創傷領域の割合（％）を、デジタル画像解析ソフトウェアを用いて計算した。ＳＣＩＤマウスでは、もともと、野生型マウス（ＷＴ）と比較してやや遅い創傷治癒が見られたが、ＳＴＺ誘導によるＤＭ－ＳＣＩＤマウスにおける創傷治癒はＳＣＩＤマウスよりも損なわれていた。創傷閉鎖は、Ｍｕｓｅ細胞集団で処理されたＤＭ－ＳＣＩＤマウスでは、未処理ＤＭ－ＳＣＩＤマウスよりも有意に速く、また、ＭＳＣで処理されたＤＭ－ＳＣＩＤマウスと比較して良好な創傷治癒を示した。＊Ｐ＜０．０５ Ｍｕｓｅ細胞又はＭＳＣで処理したＤＭ－ＳＣＩＤの創傷におけるヒトゴルジ複合体の免疫組織学的解析の結果を示す。ヒトゴルジ複合体陽性細胞（移植Ｍｕｓｅ細胞に匹敵する）が、１４日後に、Ｍｕｓｅ細胞及びＭＳＣで処理した双方の創傷領域の表皮及び上層で見られた。しかしながら、ヒトゴルジ複合体陽性細胞は、いずれの群においても周囲の無傷の領域では検出されなかった。Ｍｕｓｅ細胞処理試料では、ＭＳＣ処理試料よりも高頻度で移植ヒト細胞が検出された。 移植されたＭｕｓｅ細胞を特徴付けるために、ヒトゴルジ複合体及び分化マーカー（ＰＥＣＡＭ－１）の二重免疫組織化学的染色を行った。ヒトゴルジ複合体を発現するいくつかの細胞は、ＰＥＣＡＭ－１に陽性であったため、真皮内の血管内皮細胞への分化が示唆される。
　本発明は、ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、皮膚潰瘍を予防及び／又は治療するための細胞製剤に関する。本発明を以下に詳細に説明する。
１．適用疾患
　本発明は、ＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤を用いて、皮膚潰瘍の予防及び／又は治療を目指す。ここで、「皮膚潰瘍」とは、通常は炎症による組織表面の欠損（真皮又は皮下組織の露出）が原因の皮膚上の傷害を意味する。本発明の細胞製剤によって予防及び／又は治療可能な皮膚潰瘍には、限定されないが、糖尿病性皮膚潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈うっ血潰瘍、動脈性潰瘍、放射線潰瘍、壊死性筋膜炎、第３度熱傷などが含まれる。「糖尿病性皮膚潰瘍」とは、高血糖による血管内皮細胞の損傷に起因した、非常に難治性の皮膚潰瘍であって、例えば、糖尿病性足部潰瘍、糖尿病性下腿部潰瘍が例示される。「褥瘡」とは、皮膚の領域に長期間かけられた圧が原因となった慢性潰瘍を意味する。この種の創傷はしばしば床ずれとも呼ばれる。「静脈うっ血潰瘍」は、欠陥静脈からの血液又は他の液体のうっ血によって起こる。「動脈性潰瘍」とは、血流が悪い動脈周囲の領域における壊死皮膚を意味する。「放射線潰瘍」とは、放射線照射を受けた皮膚に生じる潰瘍を指す。「壊死性筋膜炎」とは、浅層筋膜を細菌感染の主座として急速に壊死が拡大する軟部組織感染症を指す。また、「第３度熱傷」とは、真皮全層、皮下組織にまで及び火傷を意味する。本発明によれば、本発明の細胞製剤は、特に糖尿病性皮膚潰瘍の予防及び／又は治療に有効である。
２．細胞製剤
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
　本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ　Ｓｔｒｅｓｓ　Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｄｅｖ．，Ｖｏｌ．２３，ｐ．７１７－７２８（２０１４））や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ－３（Ｓｔａｇｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ａｎｔｉｇｅｎ－３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。また、低酸素、又はトリプシンやジズパーゼ等のプロテアーゼによる長時間のストレスによりＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を濃縮することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ－３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。したがって、本発明における細胞製剤においては、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ－３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。なお、本明細書においては、皮膚潰瘍を治療するための細胞製剤において使用され得る、ＳＳＥＡ－３を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ－３陽性細胞」と記載することがある。
　簡単には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ－３に対する抗体を単独で用いて、又はＳＳＥＡ－３及びＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。
　上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ－３陽性、及びＳＳＥＡ－３とＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ－ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。
　また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下： 
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ　ＸＬ　ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ　ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。
（２）細胞製剤の調製及び使用
　本発明の細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞濃度が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα－最少必須培地（α－ＭＥＭ））において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号を参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から数ｍｌ程度の骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞を分離できる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。または、低酸素やプロテアーゼ等のストレスによりＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を濃縮して細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ－３の抗原マーカーを指標として分離後、有効な治療量に達するまで細胞を培養して増やした後、自家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。
　また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）や間葉系幹細胞に含まれるＭｕｓｅ細胞以外の細胞又は成分を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。このように、Ｍｕｓｅ細胞は、各種添加物を含む医薬組成物として使用することも可能である。
　上記で調製される細胞製剤中に含有するＭｕｓｅ細胞数は、皮膚潰瘍の治療において所望の効果（例えば、皮膚組織の再構築など）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。後述する実施例３～５においては、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）投与によって作製した免疫不全糖尿病マウスモデルに対して、Ｍｕｓｅ細胞移植による各種の効果を検討した。約２０～３０ｇのＳＣＩＤマウスに対して、ＳＳＥＡ３陽性細胞を１．０×１０５細胞／頭で患部に投与することにより、非常に優れた効果が得られた。この結果から哺乳動物一個体あたり３．３～５×１０６細胞／ｋｇを体重換算した細胞量を投与することで優れた効果が得られることが期待される。なお、対象とする個体はマウス、ヒトを含むがこれに限定されない。また、本発明の細胞製剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２～１０回）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回）をおいて患部又は静脈内に投与されてもよい。したがって、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり１×１０３細胞～１×１０７細胞で１～１０回の投与量が好ましい。一個体における投与総量としては、限定されないが、１×１０３細胞～１×１０８細胞、１×１０４細胞～５×１０７細胞、２×１０４細胞～２×１０７細胞、５×１０４細胞～５×１０６細胞、１×１０５細胞～１×１０６細胞などが挙げられる。
３．マウス糖尿病性皮膚潰瘍モデルの作製とＭｕｓｅ細胞による治療効果
　本明細書においては、本発明の細胞製剤による皮膚潰瘍の治療効果を検討するためにマウス糖尿病性皮膚潰瘍モデルを構築し、使用することができる。該モデルとして使用されるマウスには、限定されないが、一般的に、ＳＣＩＤマウス、Ｂａｌｂ／ｃマウスが挙げられる。糖尿病性皮膚潰瘍モデルは、これらのマウスにストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を腹腔内投与することによって作製され得る。ＳＴＺは、グルコースの誘導体であって、膵臓のβ細胞に損傷を与え、動物に糖尿病を発症させるために使用されている。本発明によれば、ＳＴＺの投薬量は、１回あたり、好ましくは１５０ｍｇ／ｋｇであり、複数回投薬されてもよい。
　本発明の細胞製剤はヒト由来のＭｕｓｅ細胞であるため、該製剤を投与されるマウスとは異種の関係にある。通常、モデル動物において異種の細胞等が投与される実験では、異種細胞の生体内で拒絶反応を抑制するために、異種細胞の投与前又は同時に免疫抑制剤（シクロスポリンなど）が投与される。これまでに、本発明者らは、Ｍｕｓｅ細胞の母集団である間葉系細胞が元々強い免疫抑制を有し、Ｍｕｓｅ細胞も同様の作用を有することを見出している。したがって、本発明においては、ＳＣＩＤマウス以外で、免疫抑制剤を使用していないマウスモデルにおいて免疫抑制剤を使用しなくてもよい。
　本発明の実施形態では、本発明の細胞製剤は、患者の皮膚潰瘍を治療し、正常な皮膚を再構築することができる。ここで、「正常な皮膚を再構築する」とは、皮膚潰瘍を有する患部が、創傷治癒し、完治した状態を意味する。再構築された皮膚の状態は、表面が全て上皮角化細胞で被覆された状態であって、上皮化が完了していることが好ましい。さらに、上皮の下に十分な厚さを持つ真皮が構築されていることがさらに好ましい。より好ましくは、さらに汗腺及び／又は毛包などの皮膚付属器が再生されている状態である。
　本発明の別の態様によれば、Ｍｕｓｅ細胞を低酸素状態（例えば、酸素濃度１％）において培養することによって、Ｍｕｓｅ細胞から各種サイトカインを分泌させることができる（実施例３参照）。したがって、本発明によれば、少なくともＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＮＧＦ－β、ＳＣＦ、ＴＮＦ－α、ｂＦＧＦ、及びＴＧＦ－βのいずれか１つのサイトカインの産生能を上げる方法が提供される。
　以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
実施例１：ヒトＭｕｓｅ細胞の調製
（１）ヒト組織のサンプリング及び細胞単離
　東京大学医学系研究科の倫理委員会の承認を得て、インフォームドコンセントを得た５人の女性非肥満患者（年齢＝２６．６±８．７、ＢＭＩ＝２１．５±２．０）の腹部及び／又は太ももから脂肪吸引手術により脂肪吸引物を入手した。脂肪由来幹細胞／間質細胞（ＡＳＣ）を含む間質血管画分（ＳＶＦ）は、既述のように（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．２０８，ｐ．６４－７６（２００６）参照）、吸引した脂肪から単離した。簡潔には、吸引脂肪組織をＰＢＳで洗浄し、シェーカー上、３７℃で３０分間、０．０７５％のコラゲナーゼを含有するＰＢＳ中で消化した。成熟脂肪細胞及び結合組織を遠心分離によってペレットから分離した。細胞ペレットを再懸濁し、１００μｍ、７０μｍ、及び４０μｍのメッシュでろ過し、溶血した。脂肪由来間質／幹細胞を含有する（ＡＳＣ）細胞ペレット（ＳＶＦに相当）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｎｉｓｓｕｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を含むディッシュで培養した。培養から約２週間後、増殖したｈＡＳＣを同培地を用いて継代培養した。二代目の継代培養ｈＡＳＣを２ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．２５％トリプシンを用いて、３７℃で５分間かけて回収し、Ｍｕｓｅ細胞の単離に使用した。
（２）Ｍｕｓｅ細胞の単離
　ＳＳＥＡ－３陽性のＭｕｓｅ細胞を回収するために、磁気活性型細胞ソーティング装置（ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｃｅｌｌ　ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ））（ａｕｔｏＭＡＣＳ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ　Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。Ｍｕｓｅ細胞はその表面にＳＳＥＡ－３を発現するので、フィコエリトリン（ＰＥ）（１：３希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）及び抗ＰＥマイクロビーズ（１：２希釈、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）と結合した抗ＳＳＥＡ－３抗体をＭｕｓｅ細胞のＭＡＣＳ分離に用いた。マイクロビーズで標識した標的細胞を、磁場内でトラップし、その後陽性画分として回収した。磁気カラムに結合しなかった細胞溶液は、陰性画分として回収した。Ｍｕｓｅ細胞をより良く精製するために、非常に遅い速度で細胞溶液を２回磁気カラムにかけるＭＡＣＳプログラムを使用した。得られた陽性細胞画分をＭｕｓｅ細胞集団とし、一方、陰性細胞画分を間葉系細胞画分（ＭＳＣ）として、以下の実施例において使用した。
実施例２：免疫不全糖尿病マウスモデルの作製
　５週齢の雄性重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（Ｃ．Ｂ１７／Ｉｃｒ－ｓｃｉｄ，ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ）をＣＬＥＡ　Ｊａｐａｎ，Ｉｎｃ．（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から購入した。全ての動物実験は、東京大学の施設内動物管理使用委員会からの承認を得て実施した。ＳＣＩＤマウスを２４時間絶食させた後に、新たに調製したストレプトゾトシン（ＳＴＺ；１５０ｍｇ／ｋｇ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有するクエン酸緩衝食塩水（ｐＨ４．５）を腹腔内に注射した。血中グルコースレベルを、ＳＴＺ注射後３日目に、グルコメーター及び試験片（Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｐｉｌｏｔ，Ａｖｅｎｔｉｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈ　ＬＬＣ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて測定した。血中グルコースレベルが３００ｍｇ／ｄｌ超であると、マウスは糖尿病（ＤＭ）を有するとした。高血糖（＞３００ｍｇ／ｄｌ）を示さなかったマウスには、二回目のＳＴＺ注射（１５０ｍｇ／ｋｇ）を行い、その３日後に血中グルコースレベルをモニターした（図１Ａ）。
　皮膚創傷の治癒を評価するために、皮膚欠損を既述のように（Ｇａｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｄ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｗｏｕｎｄ　Ｒｅｐａｉｒ　Ｒｅｇｅｎ．，Ｖｏｌ．１２，ｐ．４８５－４９２（２００４）；Ｔｅｐｐｅｒ，Ｏ．Ｍ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，Ｖｏｌ．１０，２３３７／ｄｂ０９－０１８５参照）、マウスの背部に作製した。簡潔に言うと、マウスを個々にペントバルビタール（６５ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射により麻酔した。電気トリマー及び脱毛クリームを使用して除毛した後、消毒した円形の生検パンチ（Ｋａｉ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ　Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して、皮筋層を貫通する２つの全層皮膚創傷（直径６ｍｍ）をマウスの背に作成した。創傷の収縮を避けるために、ドーナツ形状のシリコンスプリント（内径及び外径は各９及び１５ｍｍ；１．０ｍｍの厚さのシリコンラバーシート、Ｋｙｏｗａ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｓａｉｔａｍａ，Ｊａｐａｎ）をあてて、６－０ナイロンの縫合糸を用いて固定した（図１Ａ）。密封包帯（Ｐｅｒｍｅ－ｒｏｌｌ，Ｎｉｔｔｏ　Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）を、創傷の乾燥及びかさぶた形成を防止するために使用した。
　５つの実験群：野生型マウス、非ＤＭ－ＳＣＩＤマウス、ＤＭ誘導ＳＣＩＤマウス、Ｍｕｓｅ細胞集団で処理したＤＭ誘導ＳＣＩＤマウス、及び間葉系細胞画分（ＭＳＣ）で処理したＤＭ誘導ＳＣＩＤマウス、を準備した。各群６匹のマウスを用いた。Ｍｕｓｅ細胞（１．０×１０５細胞／マウス）を０．１ｍｌの架橋ヒアルロン酸（Ｒｅｓｔｙｌａｎｅ，Ｑ－ＭＥＤ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）と混合した後、創傷周辺の皮下に注射した。巨視的に、創傷閉鎖までの時間（完全な上皮再生までの日数）を調べた。創傷は、通常のデジタルカメラ（ＩＸＹ　Ｄｉｇｉｔａｌ　９０，Ｃａｎｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、０、３、７、１０、及び１４日目に順次撮影した。写真を画像解析ソフトウェア（Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ　ＣＳ６，Ａｄｏｂｅ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ　Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて評価し創傷面積を測定した。
実施例３：サイトカイン産生アッセイ（ＥＬＩＳＡ法）
　ＭＳＣは、創傷治癒における炎症期及び細胞増殖期に必要とされる増殖因子（例えば、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ－β、ＥＧＦなど）を分泌することが知られている（Ｍａｘｓｏｎ，Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ　Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．１，ｐ．１４２－１４９（２０１２））。そこで、インビトロにおいて、低酸素条件下及び正常酸素条件下で、Ｍｕｓｅ細胞集団及びＭＳＣを培養し、培養液中に分泌されるサイトカインについて検討した。実験を以下の通りに行った。４．０×１０５個のＭｕｓｅ細胞集団及びＭＳＣを６０ｍｍディッシュに播種し、血清不含有のＤＭＥＭ中で、低酸素（１％Ｏ２）又は正常酸素（６％Ｏ２）条件において培養した。４８時間後、培養培地を回収し、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘ－ＧＶ　ｆｉｌｔｅｒ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を用いてろ過した。肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）及び間質細胞由来因子１（ＳＤＦ－１）（両者ともＲ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）についてはＥＬＩＳＡキット、並びに血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ－ＢＢ）、神経成長因子－β（ＮＧＦ－β）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び形質転換増殖因子－β（ＴＧＦ－β）（Ｓｉｇｎｏｓｉｓ　＃ＥＡ－１１０１，Ｓａｎｔａ　Ｃｌａｒａ，ＣＡ）についてはサイトカインアレイキットを用いて、分泌されたサイトカイン量を比較検討した。吸光度を、分光光度法により無限マイクロプレートリーダー（Ｍ１０００，Ｔｅｃａｎ　Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて４５０ｎｍで測定した。
　Ｍｕｓｅ細胞集団及びＭＳＣを正常酸素（６％Ｏ２）又は低酸素（１％Ｏ２）条件において接着培養し、４８時間後の培養培地中のサイトカインの濃度を比較した結果を図２に示す。Ｍｕｓｅ細胞集団は、同じ酸素圧で培養したＭＳＣに比べ、より多くの量のＥＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＮＧＦ－β、ＳＣＦ、ＴＮＦ－α、ｂＦＧＦ、及びＴＧＦ－βを放出した。さらに、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、ＰＤＧＦ－ＢＢ、ＮＧＦ－β、ＳＣＦ、ＴＮＦ－α、ｂＦＧＦ、及びＴＧＦ－βの濃度は、特にＭｕｓｅ細胞集団において、正常酸素条件に比べ低酸素条件下の方が高かった。
実施例４：ＤＭ－ＳＣＩＤマウスにおける創傷治癒
　ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）は、膵臓β細胞を損傷し、Ｉ型ＤＭを誘導したが、ＳＴＺの投与用量及び方法がこれまでの報告（Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．，Ｖｏｌ．１６３，ｐ．２０７７－２０９１（２００３）；Ｌｅｅ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．１０３，ｐ．１７４３８－１７４４３（２００６）；Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｒ．Ｅ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．２０９，ｐ．１６１－１７０（２００８）参照）と異なっていた。２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを投与すると、ＳＣＩＤマウスは、重度の体重減少及び代謝異常により投与の１週間以内に死亡することが多かった。しかしながら、絶食から２４時間後のＳＣＩＤマウスに１５０ｍｇ／ｋｇのＳＴＺを注射すると、比較的一貫して高血糖を誘導することができ、ＤＭ状態（＞３００ｍｇ／ｄｌの血中グルコース）が３０日超続いた（図１Ｂ）。１回（２９匹中９匹のマウス；３１．０％）又は２回（２９匹中１３匹のマウス；４４．８％）のＳＴＺ注射による調製に成功したＤＭ誘導ＳＣＩＤマウス（ＤＭ－ＳＣＩＤ）を、最終ＳＴＺ注射から３０日間、創傷治癒実験に用いた。
　野生型（ＷＴ）マウス（ｎ＝６）又は非ＤＭ－ＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）と比較した場合、ＤＭ－ＳＣＩＤマウスでは、創傷治癒が有意に遅延した（図３）。ＷＴ及び非ＤＭ－ＳＣＩＤマウスは、７日目にそれぞれ５６．９±１２．０％及び６７．５±６．５％の創傷サイズを示したが、一方、ＤＭ－ＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）は、９５．４±３．１％の創傷サイズを示した（ＷＴ　ｖｓ．ＤＭ－ＳＣＩＤ；Ｐ＜０．０００１）。また、１４日目でも、ＤＭ－ＳＣＩＤマウスは、ＷＴ又は非ＤＭ－ＳＣＩＤマウスよりも大きい創傷サイズを示した。従って、ＤＭ－ＳＣＩＤマウスは、創傷治癒障害を有する免疫不全の動物モデルであることが確認された。
　ＤＭ－ＳＣＩＤマウスにおける皮膚創傷は、Ｍｕｓｅ細胞集団又はＭＳＣを皮下注射することにより処理した。Ｍｕｓｅ細胞で処理したＤＭ－ＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）は、ＭＳＣで処理したＤＭ－ＳＣＩＤマウス（ｎ＝６）よりも優れた創傷治癒を示した。７日目では、Ｍｕｓｅ細胞及びＭＳＣで処理したＤＭ－ＳＣＩＤマウスの創傷サイズはそれぞれ５１．０５±７．２％及び７４．０±６．６％であった（Ｐ＜０．０００１）。１４日目では、Ｍｕｓｅ細胞で処理したＤＭ－ＳＣＩＤマウスでは完全に創傷が治癒したが、ＭＳＣで処理したＤＭ－ＳＣＩＤマウスの創傷サイズは３０．３±６．７％であった（Ｐ＝０．０２３５）。Ｍｕｓｅ細胞で処理したＤＭ－ＳＣＩＤマウスでは、創傷治癒が促進し、ＷＴ群のものに匹敵するようであった。
実施例５：組織学的分析
　マウス皮膚試料は、ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ　Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）に包埋し、液体窒素中で凍結し、切片化するまで－８０℃で保存した。凍結切片（８μｍ）をスライド上に置き、２０分間室温で乾燥させ、１分間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で固定し、ＰＢＳで５分間洗浄した。スライドをヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、免疫組織化学分析用に処理した。
　免疫組織化学分析を、既述のように（Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．１０７，ｐ．８６３９－８６４３（２０１０参照）実施した。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）反応を介してヒトゴルジタンパク質を検出するために、切片を０．３％過酸化水素を含むメタノールで３０分間処理し、内因性ペルオキシダーゼ活性を不活性化し、ウサギ抗ヒト５８Ｋゴルジタンパク質（１：１００希釈、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）及びロバ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰ（１：５００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ　ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ　Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）で順次インキュベートした。ヒト５８Ｋゴルジタンパク質の発現は、３，３’－ジアミノベンジジンテトラヒドロクロライド（ＤＡＢ）を用いたペルオキシダーゼ反応によって可視化した。共焦点レーザー顕微鏡観察用に、凍結切片を、以下の一次抗体と共にインキュベートした：マウス抗ヒトミトコンドリア（１：１００希釈、Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ヒト５８Ｋゴルジタンパク質、ウサギ抗ヒト－ＣＫ１４（１：２００希釈、Ａｂｃａｍ）又はヤギ抗ヒト血小板内皮細胞結合分子－１（ＰＥＣＡＭ－１；１：５０希釈、Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ　Ｃｒｕｚ，ＣＡ）。次に、切片を、以下の二次抗体と共にインキュベートした：ロバ抗マウスＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８、ロバ抗ウサギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ６８０、又はウサギ抗ヤギＩｇＧ－Ａｌｅｘａ４８８（すべて１：５００希釈、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）。核はＤＡＰＩで対比染色し、共焦点顕微鏡（Ｃ１ｓｉ　Ｎｉｋｏｎ，Ｎｉｋｏｎ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて検査した。
　ヒトゴルジ複合体の免疫組織学的解析により、１４日目には、Ｍｕｓｅ細胞集団及びＭＳＣで処理したそれぞれの試料において、創傷領域の表皮及び真皮上層で、移植細胞が検出されることが示された。しかしながら、ヒトゴルジ複合体＋細胞は、周囲の無傷の領域では見られなかった（図４）。また、注入ヒアルロン酸の沈着は、皮下層で検出された。さらに、真皮内のいくつかのヒトゴルジ複合体＋細胞は、ｈ－ＰＥＣＡＭ－１にも陽性であった（図５）。これらのデータは、移植Ｍｕｓｅ細胞は表皮及び真皮のいずれにおいても生存し、表皮角化細胞及び血管内皮細胞に分化し得ることを示唆している。
　本発明の細胞製剤は、糖尿病性皮膚潰瘍マウスモデルの皮膚潰瘍患部に投与することにより、皮膚組織を再建及び修復させることができ、糖尿病性皮膚潰瘍の治療に応用することができる。
　本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。

Claims (9)

  1. 　生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞を含む、皮膚潰瘍を予防及び／又は治療するための細胞製剤。
  2. 　外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ－３陽性の多能性幹細胞が、濃縮された細胞画分を含む、請求項１に記載の細胞製剤。
  3. 　前記皮膚潰瘍が、糖尿病性皮膚潰瘍、褥瘡性潰瘍、静脈うっ血潰瘍、動脈性潰瘍、放射線潰瘍、壊死性筋膜炎、及び第３度熱傷からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の細胞製剤。
  4. 　前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  5. 　前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  6. 　前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  7. 　前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞製剤。
  8. 　前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞製剤：
    （ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
    （ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
    （ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
    （ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
  9. 　前記多能性幹細胞が、表皮角化細胞、血管内皮細胞、血管周皮細胞、脂肪細胞、脂肪前駆細胞、皮膚線維芽細胞、及び神経鞘細胞からなる群から選択される１つ以上の細胞に分化する能力を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞製剤。
PCT/JP2015/067789 2014-09-05 2015-06-19 糖尿病性皮膚潰瘍治療のための多能性幹細胞 WO2016035419A1 (ja)

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