WO2016030621A1 - Méthode de caractérisation d'un échantillon par imagerie par spectrométrie de masse - Google Patents

Méthode de caractérisation d'un échantillon par imagerie par spectrométrie de masse Download PDF

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WO2016030621A1
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texture
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Jonathan STAUBER
David BONNEL
Fabien PAMELARD
Gaël PICARD DE MULLER
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Imabiotech
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Definitions

  • the invention relates to a method for characterizing a sample using mass spectrometry imaging. More particularly, the invention proposes using imaging data obtained by mass spectrometry to extract and measure morphometric and / or texture data associated with the distribution of one or more ions in a sample. The invention also proposes using such morphometric and / or texture data to identify and / or select one or more molecules of interest in a sample.
  • the invention has applications in any field where the characterization of a sample or compound in a sample is useful / necessary.
  • the invention finds, for example, applications in the pharmaceutical field for identifying molecular markers in different biological tissues, or in the field of medical diagnosis, for identifying a type of tissue and / or cell in a sample.
  • the invention can be used in the field of quality control, to verify that parts have the desired characteristics.
  • Mass spectrometry is a widely known technique used in chemical and biochemical analysis to detect and identify molecules of interest in a sample.
  • molecular imaging by mass spectrometry has developed, allowing to visualize the distribution of molecules of interest directly in a sample.
  • Mass spectrometry (ISM) imaging brings together all imaging technologies that use an ionization source to locate molecular ions from a sample.
  • Multiple sources of ionization such as laser, ions, gas, liquid, solvent, plasma (single or combined sources), microwaves, electrons, which can be used in imaging mode, can be mentioned.
  • Mass spectrometry imaging is currently mainly used for the analysis of biological tissues. Indeed, it is possible thanks to the ISM to directly study the molecular composition of a tissue or a section thereof, without fluorescence labeling and without radioactivity.
  • ISM makes it possible to discriminate and identify ions detected directly on the sample.
  • ISM makes it possible to discriminate and identify ions detected directly on the sample.
  • ACP Principal Component Analysis
  • PLSA Long et al., J. Proteome Res, 2008. 7 (3): 969-78, D.
  • ISM data analysis methods are currently based on the study of intensity values associated with m / z ratios. More specifically, during the acquisition of an image of a sample by ISM, said sample is analyzed with a beam of the ionization source in order to record at each point of the sample an average of spectrum corresponding to the ions detected.
  • the set of recorded data is in the form of a matrix, with for each recording coordinate system a spectrum which contains on a column the different m / z ratios and in a second column the corresponding intensities.
  • the measurement of the intensity of this ion makes it possible, through image reconstruction software, to obtain the distribution of this ion (and therefore of the compound corresponding) taking into account the peak intensity with the recording coordinates and assigning to each point a pixel of color and / or defined color intensity.
  • it is also known to defocus the ionization source so as to analyze all or part of the sample in a single shot. The location is then obtained by means of a position detector (Luxemleid et al., Anal Chem 2004).
  • the invention proposes to use imaging data of a sample (Le., Positions, m / z ratios, intensities), conventionally obtained by mass spectrometry imaging, not only by taking into account the intensity values. associated with the ions of said sample, but taking into account the spatial arrangement of said ions in the sample, and measurements that characterize said spatial arrangement.
  • a sample is characterized according to the morphology of the distribution and associated measurements (morphometric data), and / or the texture of one or more ions in the sample.
  • the shapes and arrangement of the shapes associated with the presence of said ions in a sample provide additional information (surface, shape, volume, pattern, repetition, quantity, dispersion, and values derived from such information, such as their ratio, etc.) in relation to the information resulting from the spectral intensities. It is then possible to characterize a sample according to the shapes of at least one ion in said sample and / or the dimensions of these shapes and / or their arrangement in the sample. According to the invention, it is thus possible to differentiate two samples having similar or identical molecular profiles.
  • the invention proposes to characterize the morphometry and / or the texture of the distribution of one or more ions in a sample and to use these morphometric and texture data in addition to or in place of the spectral imaging data. . According to the invention, this characterization can be combined with methods for processing current imaging data taking into account intensities, for example, and more generally with any method of characterizing a sample, including optical, physical and color treatment. etc.
  • the subject of the invention is therefore a method for characterizing a sample by mass spectral imaging (ISM) according to which a spatial arrangement of at least one ion in said sample is characterized from the imaging data associated with said ion in terms of morphometry and / or texture.
  • ISM mass spectral imaging
  • the spatial arrangement of at least one ion in said sample is measured and / or quantified from ISM data, in order to identify shapes, arrangements of shapes, particular measurements and to characterize the distribution accordingly.
  • said ion in the sample by these morphometric characteristics and / or texture.
  • the invention also relates to a method for identifying a new molecule of interest in a sample, according to which
  • the invention also provides a method of identifying a sample by mass spectrometry imaging in which: i) A database, or model, is established with morphometric and / or texture data associated with a plurality of reference ions, obtained from several reference samples, said morphometric and / or texture data being representative of the spatial arrangement of said reference ions in said reference samples;
  • Morphometric and / or texture data associated with at least one ion are recorded in the sample to be identified;
  • Morphometric data and / or textures associated with the ions of the sample to be identified are compared with the morphometric data and / or textures associated with the reference ions contained in the database or the model.
  • Another object of the invention is a computer readable data medium comprising computer-executable instructions adapted to allow a computer system to execute at least one step of the method of characterizing a sample, and or at least one step of the method of identifying a sample and / or at least one step of the method of identifying a molecule of interest in a sample according to the invention.
  • Figure 1 Example of data sets acquired by mass spectrometry imagery for two samples (1A and 1B), where the blank is 0 and the black is a maximum value;
  • Figure 2 Example of morphological characterization of mass spectrometry imaging data of pulmonary tissue samples according to the invention, resulting in the identification of pathological pulmonary tissue (Airways fibrosées) compared to healthy tissue (Aiways sain);
  • Figure 3 Example morphometric airway enumeration by performing the method according to the invention to mass spectrometry imaging data sets of two airway samples of two fibrotic tissue;
  • Figure 4 Analysis and determination of the airway surface of rat lungs by extrapolation of morphological data obtained by the method according to the invention from the imaging data of said samples;
  • Figure 5 Representation of the distribution of two ions in a skin sample by mass spectrometry imaging and characterization of their spatial arrangement in the sample for the identification of tissues (eg epidermis and stratum corneum)
  • tissues eg epidermis and stratum corneum
  • FIG. 6 Schematic representation of the patterns and textures obtained from mass spectrometry imaging data sets of a section of biological tissue on a petri dish, by the method according to the invention applied to the counting and typing of cells in said section of biological tissue;
  • Figure 7 Schematic representation of different morphometric criteria for a target ion that can be used to discriminate between two regions of interest in samples A and B having means of identical intensities for said target ion, not allowing them to differentiate them alone. .
  • the distribution can thus vary in terms of number of objects, surface of the object, dispersion in the region of interest, shape, variability of the surface of an object to other, etc. ;
  • FIG. 8 Schematic representation of certain steps of the characterization and / or identification method according to the invention, resulting in the extraction of morphometric criteria for the ion having an m / z of 91.5895 in a sample: molecular image is subjected to segmentation to obtain a binary image which is processed to characterize the distribution of said ion in number of objects and surface of said objects;
  • Figure 9 Comparison for a reference tissue (control tissue) and a tissue of interest (treated tissue) of the m / z 718,505 distribution at the molecular image showing the intensity of the distribution and the image binary highlighting the surface difference of the distribution of said m / z.
  • the subject of the invention is therefore a method for characterizing a sample by mass spectral imaging (ISM) according to which a spatial arrangement of at least one ion in said sample is characterized from the imaging data associated with said ion in terms of morphometry and / or texture.
  • ISM mass spectral imaging
  • the distribution of the ion in the sample is no longer only characterized according to the intensity but also according to the forms / objects that this distribution draws and associated measures (surface, volume, etc.) and / or the arrangement of these forms / objects between them. It is then easily possible to discriminate two samples which, although having an identical average intensity for a given ion, have different morphometric and / or texture characteristics associated with said ion.
  • the method according to the invention can be applied to any type of sample that can be analyzed by a vacuum mass spectrometer (MALDI) or ambient atmosphere (LAESI, DESI), whether organic or inorganic, liquid or solid.
  • MALDI vacuum mass spectrometer
  • LAESI ambient atmosphere
  • DESI ambient atmosphere
  • the method according to the invention is particularly suitable for the characterization of biological tissues, of animal or vegetable origin.
  • tissue is generally meant a set of cells of the same origin and grouped into a functional unit to contribute to the same function.
  • a tissue may be an organ, an organ fragment, or a specific region of an organ, possibly comprising several sets of cells.
  • the tissue may be a tumor located within an organ.
  • the sample may consist of a histological section of tissue (s), of which regions of interest have optionally been characterized beforehand by staining and / or by their molecular signatures. More generally, the method according to the invention can be used to further characterize all or part of regions of interest of a sample previously identified by any method of the state of the art.
  • the method according to the invention can also be used to characterize biological fluids, such as blood, plasma, serum, saliva, cerebrospinal fluid, urine, etc.
  • the method according to the invention can also be used to characterize environmental samples, such as samples of soil, water, plants, etc.
  • the method according to the invention is used to characterize objects, such as electronic components, biomaterials, capsules, high-precision parts, etc.
  • characterizing a sample it is intended to associate distinctive / clean properties of said sample, said properties making it possible in particular to discriminate / identify it from other samples.
  • imaging data and more particularly spectra, are used to determine for a given ion the spatial arrangement that it takes in said sample.
  • the data associated with an m / z ratio characteristic of a given ion are used more particularly.
  • the expression "m / z ratio”, or “mass-to-charge ratio” denotes a physical quantity characteristic of an ion, where m represents the mass and z the valence of said ion.
  • mass spectrometry imaging a given ion can correspond to several m / z ratios.
  • the "spatial arrangement" or “distribution” of an ion or m / z ratio refers to the form (s) that the presence of said ion or m / z ratio in the sample indicates.
  • the spatial arrangement of the studied ion (s) is determined in such a way as to associate one or more shapes, dimensions, and so on.
  • the imaging data associated with the presence of at least one ion in the sample is used to define morphometric and / or texture data representative of the distribution of said ion in the sample, regardless of the variation of the intensities associated with said sample. ion in said sample.
  • the step of characterizing the spatial arrangement of at least one ion in the sample uses a pattern recognition and / or texture analysis method for segmenting the imaging data of said ion into regions of the region. distinct interests and / or draw outlines of patterns.
  • a technique of mathematical morphology such as the watershed technique, the Hough transform, especially in its generalized form, spatial dependence matrices of shades of gray, and so on.
  • “Morphometric data” or “morphometric characteristics” means data / characteristics relating to the geometric shape or shapes, or patterns, formed by the the presence of the ion in the sample (or the ratio m / z associated with said ion), and / or their mathematical dimensions, such as a surface, a volume, a diameter, a radius, a length, a width , a thickness, etc. In some cases, the patterns may consist of writing elements, such as numbers, letters, words, and so on.
  • “texture data” or “texture characteristics” is meant data / characteristics relating to an arrangement of the patterns with each other in the sample, such as the number of repeated patterns, a distance, a dispersion between said patterns, etc. .
  • Reference sample means a sample of the same kind and / or origin as the sample of interest.
  • the reference sample consists of a biological tissue of the same nature from a control subject.
  • m / z ions or ratios of said sample it is possible to characterize the spatial arrangement of one or more m / z ions or ratios of said sample, taken together or separately.
  • a given pattern can be associated with the presence and distribution of several m / z ratios simultaneously taken into consideration.
  • different patterns for different m / z ratios in the same sample, simultaneously or sequentially According to the invention, these different m / z ratios can be representative of the same ion or of different ions.
  • the method according to the invention comprises a prior step of acquiring imaging data from which the morphometric and / or texture characteristics of at least one m / z ratio are determined.
  • the method according to the invention can be implemented with any known mass spectrometry imaging technique, and in particular MALDI, LDI, DESI, LESA, LAESI imaging ("Laser Ablation Electrospray Ionization"), DART ("Direct Analysis in Real Time “), SIMS, JEDI (" Jet Desorption Electrospray Ionization "), LAMMA (" Laser Microprobe Mass Analysis "), SMALDI (" Scanning Microprobe Matrix Assisted Laser Desorption Ionization ”) in combination with different types of analyzers, such as TOF ("Flight Time”), Orbitrap, FTICR ("Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance"), Quadripole ("single or triple”), ICP MS etc.
  • MALDI mass Ablation Electrospray Ionization
  • DART Direct Analysis in Real Time
  • SIMS SIMS
  • JEDI Jet Desorption Electrospray Ionization
  • LAMMA Laser Microprobe Mass Analysis
  • SMALDI Scanning Microprobe Matrix Assisted
  • the morphometric and / or texture characteristics associated with at least one ion directly on an ionic image of the sample, for example using MALDI imaging.
  • the morphometric and / or texture characteristics associated with the ions analyzed can be generated in the form of images reproducing the sample, so that their spatial arrangements can be visualized therein.
  • it is possible to superpose different images of the sample for example to simultaneously display data of several ions, and even histological or other data obtained by other methods of analysis such as optical microscopy, histological staining etc.
  • the method of characterizing a sample according to the invention comprises the steps of: a) acquiring data by ISM, for at least one ion in the sample; then b) Characterizing a spatial arrangement of said at least one ion in the sample from the data relating to the positions of said at least one ion, according to morphometric and / or texture characteristics.
  • said ion is characterized by its morphometric and texture characteristics, specific to said sample.
  • the same ion in another sample may have different morphometric and textural characteristics, even if the molecular profiles of the two samples are identical.
  • the method according to the invention makes it possible to acquire another degree of information for an ion in a sample, which can be taken into account alone or in combination with any other data / characteristic of the sample and / or the ion considered.
  • the method according to the invention makes it possible to simultaneously display all of these data / characteristics directly on the same ionic image of the sample.
  • the method of characterizing a sample according to the invention comprises the steps of: c) Segmenting sample imaging data into regions of interest representative of the molecular intensity profiles of the sample; and
  • Step c) consists in a segmentation of the sample according to the molecular profiles within said sample.
  • Each region of interest corresponds to a molecular profile obtained from the mass spectra of the sample.
  • Different spectral characteristics can be conventionally used to obtain the molecular profiles of said sample, and in particular the intensity of the peaks of the mass spectra, the signal-to-noise ratio (S / N), the peak area, and so on.
  • the image data associated with the selected region of interest are processed to characterize the spatial arrangement of the set of ions of said selected region of interest. It is the data of the set of ions in the region of interest that are taken into account and analyzed to identify the characteristic patterns and textures of said region of interest. Again, according to the invention, it is possible to reconstruct a digital image of the sample from these data so as to display the results directly on an image of the sample.
  • steps c) and d) can be implemented independently of steps a) and b), that is to say without implementation of steps a) and b).
  • steps a) and b) it is possible to successively implement steps a) and b), then c) and d), or conversely, so as to obtain different degrees of information in terms of morphometry and texture the ion or ions considered in the sample considered.
  • step d) it is possible to apply to several or all regions of interest identified in step c).
  • the method of characterization comprises the step of: e) Realizing a database (BDD) comprising morphometric and / or texture data of a plurality of ions in said sample.
  • BDD database
  • the characterization method comprises the step of: f) Creating a model comprising morphometric and / or texture data of a plurality of ions in said sample.
  • a plurality means two or more.
  • a “model” refers to a set of data, in this case characteristics derived from the sample, including intensity data, morphometric and / or texture data, etc., which have been modeled in particular. to define dependencies and / or relations between said data, and which is representative of the sample considered.
  • a “database” refers to a database in which a set of raw data is stored.
  • this database (BDD) or this model can be implemented (step g) with the ISM spectral data of at least one ion in said sample, and / or physicochemical, physiological and / or biological characteristics of the sample.
  • the database (BDD), or model is implemented with data obtained by a histological, chemical or other study of the sample, or an identical sample, to define different areas of interest .
  • Such a database (BDD), or model may be particularly useful for rapidly and automatically identifying a tissue, a region of a tissue, a cell type, a physiological state of a tissue, for example a healthy or pathological tissue, etc.
  • the database, or model can be used for identification and counting, or counting, cell in a biological sample.
  • the subject of the invention is also a method for identifying a sample by mass spectrometry imaging in which: i) A database or model is created with morphometric and / or texture data associated with at least one reference ion, obtained from several reference samples, said morphometric and / or texture data. being representative of the spatial arrangement of said at least one reference ion in said reference samples;
  • Morphometric and / or texture data (surface, volume, shape, pattern, repetition, etc.) associated with at least one ion are recorded in the sample to be identified;
  • Morphometric data and / or textures of step ii) are compared with the morphometric data and / or textures contained in the database, or the model, of step i).
  • step ii) an ion corresponding to an ion of the database or of the model is analyzed.
  • the database, or the model comprises morphometric and / or texture data associated or not with a plurality of reference ions.
  • a set of morphological data and textures for several ions is established so as to characterize in the most reliable manner each of the reference samples.
  • step iii) is carried out with an analysis of the similarities and / or the differences between the different sets of reference data and the sets of data of the sample to be identified, so as to select the one or more reference samples with similar or identical morphometric characteristics, thereby identifying the sample.
  • the method according to the invention may, for example, make it possible to identify the nature and / or origin of a biological tissue, a cell type, the stage of evolution of a disease, etc.
  • the invention also relates to a method for identifying a molecule of interest in a sample, according to which i) comparing morphometric and / or texture data associated with a plurality of ions in said sample with morphometric and / or texture data associated with a plurality of ions in a reference sample;
  • Such a method makes it possible to discover and identify a new molecule in a sample of interest.
  • the method of identifying a new molecule of interest in a sample of interest comprises, beforehand, a step of acquiring ISM data specific to said sample and characterizing the distribution of a sample of interest. or several ions by morphometric and / or texture characteristics.
  • the nature of the sample is known and it is desired to identify one or more markers specific to said sample, that is to say which are not present in the reference sample, or then that has morphometric characteristics and / or different textures compared to those they have in the reference sample ( Figure 7).
  • the morphometric characteristics taken into account for a given ion may for example be the number of objects, the average of the surface of the objects, the dispersion, the shape, the variability of the surfaces, etc.
  • a reference sample of the same nature and / or of the same type as the sample of interest is preferably used.
  • step i) can be implemented by querying a database (BDD) compiling a plurality of sets of reference data of the reference sample, or by comparing the data of the sample to a compiling model a plurality of reference data sets of the reference sample. .
  • BDD database
  • the corresponding ion (s) is associated therewith to go back to the molecule associated with each of the ions.
  • This method is particularly useful in the pharmaceutical or medical field, particularly for identifying new biomarkers.
  • the invention also relates to a computer readable data medium comprising instructions executable by the computer and adapted to allow a computer system to perform at least one step of the method of characterizing a sample according to the invention. and / or at least one step of the method of identifying a sample or a molecule of interest in a sample according to the invention.
  • the invention provides a computer program comprising program code instructions for performing all or part of the steps set forth above, when said program is run on a computer.
  • the computer program includes program code instructions for performing at least the step of characterizing the spatial arrangement of one or more ions in a sample of interest.
  • the computer-readable data carrier, or program, according to the invention comprises a database, or a model, comprising morphometric and / or texture data of at least one ion in at least one sample, and preferentially of a plurality of ions for a plurality of samples.
  • the method according to the invention can be used for the identification of markers, and in particular biomarkers. Indeed, in the case of biological samples, it is possible to identify variations of morphology present between two conditions (for example patient vs. healthy, treated vs. vehicle, exposed vs. unexposed, etc.). In particular, according to the invention, it is possible to study more particularly ions specifically present in a region of interest, previously identified by a macroscopic and / or microscopic study of the structure of the sample for example.
  • Filtering and molecular classification The method according to the invention can be used for molecular filtering purposes.
  • a particular morphometry for example, a star shape of X mm 2 of minimum area
  • a particular morphometry for example, a star shape of X mm 2 of minimum area
  • Such filtering can also be used to classify samples.
  • a resemblance score based on the intensity and shape information. It is possible to automatically recognize in a sample, such as a biological tissue, the presence of a given form which is for example characteristic of a physiological state. It then becomes possible to establish rankings based on more accurate and reliable scores than those based solely on the intensity criterion, which may vary according to sample preparation (matrix deposition, drying time, freezing, type of sample). tissue, etc.) contrary to the morphometric and texture characteristics that are preserved regardless of the chosen protocol.
  • BDD database
  • model compiling the specifications of several samples of the same population, such as several samples of the same biological tissue or biological tissues. same origin / nature. From such a database, or from such a model, it is easy to identify a new sample of the same population or to identify with certainty a sample in a population.
  • Figure 2 shows more particularly the results obtained from the morphometric characterization of the sets of imaging data obtained for the sample of healthy lung tissue and the fibrosed lung tissue sample.
  • two elliptical morphometries are identified, one of which has a ratio between the minor axis and the major axis tending towards a (fibrosed tissue).
  • the use of these morphometric signatures makes it possible to characterize two forms of airways, respectively healthy (oval type 1) and fibrotic (oval type 2).
  • the method according to the invention can also be used in the field of cell or bacterial counting, especially in the context of an environmental or health assessment.
  • cell wall molecules lipids, for example
  • the forms are isolated with a molecular factor, whereas up to now this has been done by optical signals, and especially by optical microscopy or flow cytometry.
  • the invention makes it possible to exceed the detection sensitivity limits obtained by the optical signals, but also the working speed, the precision (fewer false positives) and to increase the number of parameters simultaneously analyzed.
  • the cells can be enumerated and recognized on the basis of their morphology, while indicating the molecular profile as the metabolic activity of the identified cell. It is therefore possible to count multiple cell types, biological or histological and their physiological activity.
  • Figure 3 depicts automated morphometric counting on sets of imaging data obtained for airway samples from two fibrosed tissues. Automated detection of oval forms makes it possible to identify and enumerate the histological structures of interest (here the respiratory tract) without correlation with adjacent histological stains.
  • Kinetic study of morphometries The method according to the invention can also be used in the kinetic study of forms, in particular for monitoring the evolution over time of the morphometry (shape, surface, volume, etc.) of elements of interest (molecules, ions, m / z) in the sample.
  • morphometry shape, surface, volume, etc.
  • elements of interest molecules, ions, m / z
  • stages of evolution of the forms in a biological sample in agreement with other stage studies of the biological sample.
  • FIG. 4 illustrates the application of the method according to the invention to the study of the evolution of the constriction of airways in a fibrosed tissue. As shown, it is possible with the method of the invention to determine the surface of the airways over time and thus to follow the impact of fibrosis on the constriction of the airways.
  • Cell or tissue typing The method according to the invention can be used to identify cell types or tissue sub-structures in a plant or animal biological sample. This cell typing is made possible by the morphometries of each cell that are specific to them. Thus, depending on the cellular morphometries obtained, it is possible to determine the cellular type or types contained within one or more samples. Recently, instrumental developments have made it possible to lower the spatial resolution of MALDI imaging below 10 ⁇ . As for the SIMS technology, it is possible to obtain a resolution of less than 1 ⁇ in routine. Considering that the average size of a cell is 10-15 ⁇ , it can be considered that mass spectrometry imaging reaches a cellular resolution making it possible to discriminate them in molecular data sets.
  • Figure 5 illustrates the application of the method of the invention in the context of tissue typing on a section of skin tissue and without histological correlation.
  • the zones of the tissue (Stratum corneum and Epidermis) are identified thanks to their specific morphometries obtained after acquisition in ISM.
  • Figure 6 schematically illustrates the application of the method of the invention in the context of enumeration and cell typing directly on / in a biological sample and without histological correlation.
  • the cells of the sample tissue, solution or cell culture
  • ISM immunosuppression system
  • Example 1 Procedure for characterizing a sample or region of interest by combining spectral and spatial information.
  • the purpose of this example is to highlight the differences in information that may arise from the same set of imagery data acquired for a sample, depending on the fact that only the intensities data for a report are taken into account.
  • m / z given in said sample or the morphometric and texture characteristics associated with this ratio m / z.
  • step 3 can be implemented via the algorithm below: "As long as we have not traversed the entire image: Browse the image line by line
  • the test step 7 can for example be implemented by making an opening (Erosion ⁇ , followed by a dilation ⁇ ) by a structuring element (ES) having one or more properties to be tested. If the pixel addition of the opening by TES is non-zero, then the image / region has the property.
  • Example 2 Procedure for identifying peaks of interest and associated biomarkers from morphometric data
  • lungs of rats Five lungs of rats were used for this study. Three are derived from rats treated with bleomycin (Apollo Scientific, UK) by the airway (oropharyngeal aspiration route) at a dose of 1 mg / kg for seven days and two from saline-treated animals. similar for the same duration. All rats were Sprague Dawley, Cree: CD (SD) males. Both groups were sacrificed twenty-two days after the start of the experiment. The lungs were swollen with agarose, fixed in formalin with 10% neutral buffer solution and frozen at -80 ° C. The animal experiments were consistent with the 1986 Animais (Scientific Procedures) Act.
  • the matrix used was a solution of 9AA at 5 mg / mL in a solvent MeOH / H2O (4: 1 v: v); it was deposited in ten successive layers with a Suncollect automated depot (SunChrom GmBH, Friedrichsdorf, Germany).
  • the first layer was applied at a flow rate of 10 ⁇ / ⁇
  • the second layer at a flow rate of 20 ⁇ / ⁇ and the following at 30 ⁇ / ⁇ .
  • a MALDI-FTICR mass spectrometer (7T Solarix, Bruker Daltonics, Bremen, Germany) equipped with a SmartBeam II laser used at 80% output energy and a repetition rate of 1000 Hz was used to acquire mass in "full scan" mode for m / z between 100 and 1000 with a spatial resolution of 30 ⁇ and in negative mode. Each mass spectrum corresponds to the accumulation of 500 consecutive laser shots at the same location.
  • An internal calibration was made using the 9AA matrix as well as phospholipids between m / z 200 and 900.
  • the mass spectrometer was controlled by the use of FTMS Control 2.0 and Flexlmaging 4.0 software (Bruker Daltonics, Bremen, Germany).
  • the areas chosen for acquisition were pulmonary airways because bleomycin should induce changes.
  • the peaks of the transformed average spectrum of a condition exceeding a threshold are considered as peaks.
  • the transformation used was the subtraction of the median of the signal without the null values divided by the absolute deviation at the median of the signal without the null values multiplied by 1.4826. This gives an approximation of the signal-to-noise ratio at each point. The idea being that the noise follows a roughly normal distribution and that the real signal is present in less than half of the aggregated measurements in the medium spectrum, the elimination of null values was done because the signal appears to have undergone destructive wavelet compression by FTMS Control 2.0.
  • the threshold for this study is 1 to have as few false negatives as possible but excluding as much noise as possible.
  • the peak intensity image in the peak window is stretched in a grayscale palette having 8 bits of depth and then exported in JPEG format without compression.
  • the choice to use only one channel was made to facilitate visual inspection of the results.
  • Approximately 2000 ions to be imaged over 12 regions (6 in condition 1 and 6 in condition 2) were obtained.
  • Welch t-tests were made between the two conditions, one based on the number of objects per unit area and the other on the average area of objects per unit area.
  • the Welch t-test was chosen because it applies well to unpaired small samples and it is uncertain whether the variances of the two populations are equal.
  • a Mann-Whitney-Wilcoxon test could otherwise have been used.
  • biomarkers were identified as significantly different between the control condition and the treated condition based on the use of morphometric criteria, some of whose biomarkers are only identified using morphometric criteria.
  • a membrane component involved in apoptosis could be identified (m / z 718.505), which was not detectable by considering only intensities (NS: Not significant; *: significant difference)
  • a mathematical model was performed based on the identified potential biomarkers of the condition being treated. This model was used for exploratory purposes to classify test samples on the basis of extracted morphometric characters.
  • Example 3 Other Applications Numerous applications are possible, and may in particular be implemented using the steps described in Example 1 or Example 2.
  • the invention can be used in the medical and pharmaceutical field, to identify new biomarkers, for filtering and molecular classification, cell and morphological enumeration, study of the evolution over time of a disease or a treatment, cell or tissue typing, etc.
  • the invention finds applications in other fields, such as quality control, art, comparative and automated analysis of objects, the study of the composition of materials, etc.

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Abstract

L'invention concerne une méthode de caractérisation d'un échantillon par imagerie par spectrométrie de masse (ISM) selon laquelle on caractérise un arrangement spatial d'au moins un ion dans ledit échantillon à partir des données d'imagerie associées audit ion, en termes de morphologie et/ou de texture.

Description

Méthode de caractérisation d'un échantillon par imagerie par spectrométrie de masse
Domaine technique
L'invention concerne une méthode de caractérisation d'un échantillon utilisant l'imagerie par spectrométrie de masse. Plus particulièrement, l'invention propose d'utiliser des données d'imagerie obtenues par spectrométrie de masse pour extraire et mesurer des données morphométriques et/ou de texture associées à la distribution d'un ou plusieurs ions dans un échantillon. L'invention propose également d'utiliser de telles données morphométriques et/ou de texture pour identifier et/ou sélectionner une ou plusieurs molécules d'intérêt dans un échantillon.
D'une manière générale, l'invention trouve des applications dans tout domaine où la caractérisation d'un échantillon ou d'un composé dans un échantillon est utile/nécessaire. L'invention trouve par exemple des applications dans le domaine pharmaceutique pour identifier des marqueurs moléculaires dans différents tissus biologiques, ou dans le domaine du diagnostic médical, pour identifier un type de tissu et/ou de cellule dans un échantillon. De même, l'invention peut être utilisée dans le domaine du contrôle qualité, pour vérifier que des pièces présentent bien les caractéristiques souhaitées.
Etat de la technique
La spectrométrie de masse est une technique largement connue et utilisée en analyse chimique et biochimique, pour détecter et identifier des molécules d'intérêt dans un échantillon. Depuis quelques années, l'imagerie moléculaire par spectrométrie de masse s'est développée, permettant de visualiser la distribution de molécules d'intérêt directement dans un échantillon. L'imagerie par spectrométrie de masse (ISM) rassemble toutes les technologies d'imagerie utilisant une source d'ionisation permettant de localiser des ions moléculaires à partir d'un échantillon. On peut citer de multiples sources d'ionisation, telles que le Laser, des ions, du gaz, un liquide, un solvant, un plasma (sources seules ou combinées), micro-ondes, électrons, qui peuvent être utilisées en mode imagerie, telles que le DESI (« Desorption Electrospray Ionization »), le LAESI (« Laser Ablation Electrospray Ionization »), le MALDI (« Matrix Assisted Laser Desorption Ionization »), le SIMS (« Secondary ion Mass Spectrometry »), le MALDESI (Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization ») et le LESA (« Liquid Extraction Surface Analysis »), ICP-MSI (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry Imaging). L'imagerie par spectrométrie de masse est actuellement principalement utilisée pour l'analyse de tissus biologiques. En effet, il est possible grâce à l'ISM d'étudier directement la composition moléculaire d'un tissu ou d'une coupe de celui-ci, sans marquage par fluorescence et sans radioactivité. De plus, de par sa spécificité, ISM permet de discriminer et d'identifier des ions détectés directement sur l'échantillon. Ainsi, il est désormais courant d'utiliser ISM pour l'étude ou la recherche de marqueurs moléculaires endogènes dans des échantillons biologiques d'intérêt. Plus précisément, il est possible d'analyser directement la distribution d'une molécule connue en ciblant un ion ou son rapport masse sur charge (m/z). Il est également possible d'utiliser des outils statistiques, et notamment ACP (Analyse en Composantes Principales), PLSA, T-Test, ANOVA, ou autre, pour comparer au moins deux régions d'intérêt et ainsi identifier une ou plusieurs molécules spécifiques à l'une ou l'autre de ces régions (J. Stauber, et al., J Proteome Res, 2008. 7(3): p. 969-78 ; D. Bonnel et al., Anal Bioanal Chem, 2011). Il est également connu d'utiliser des méthodes de segmentation lors de l'analyse des spectres d'une image d'un échantillon, afin de classer les spectres en fonction de l'intensité des ions dudit échantillon. Ainsi, il est connu de caractériser un tissu biologique en fonction du profil d'intensité moléculaire des zones histologiques détectées (T. Alexandrov et al., J Cancer Res Clin Oncol, 2012. 139(1): p. 85-95 ; T. Alexandrov et al., J Proteomics, 2011. 75(1): p. 237-45). Il est alors possible de classifier des tissus en fonction de leurs profils moléculaires complets et non plus seulement en fonction du profil spectral de quelques marqueurs.
Cependant, toutes les méthodes d'analyse de données d'ISM sont actuellement basées sur l'étude des valeurs d'intensité associées aux rapports m/z. Plus précisément, lors de l'acquisition d'une image d'un échantillon par ISM, on analyse ledit échantillon avec un faisceau de la source d'ionisation afin d'enregistrer en chaque point de l'échantillon une moyenne de spectre correspondant aux ions détectés. L'ensemble des données enregistrées se présente sous la forme d'une matrice, avec pour chaque cordonnée d'enregistrement un spectre qui contient sur une colonne les différents rapports m/z et dans une seconde colonne les intensités correspondantes. Par la suite, pour un ion particulier (i.e. un rapport m/z donné) correspondant à un composé particulier, la mesure de l'intensité de cet ion (ou l'intégrale de l'aire du pic) permet au travers de logiciels de reconstruction d'images d'obtenir la répartition de cet ion (et donc du composé correspondant) en prenant en compte l'intensité du pic avec les coordonnées d'enregistrement et en affectant à chaque point un pixel de couleur et/ou d'intensité de couleur définie. De manière alternative, il est également connu de défocaliser la source d'ionisation de manière à analyser tout ou partie de l'échantillon en un seul tir. La localisation est ensuite obtenue grâce à un détecteur de position (Luxembourg et coll, Anal. Chem 2004).
Cependant, il n'est pas possible de discriminer deux échantillons biologiques ayant les mêmes profils ou signatures spectrales, quand bien même ils présenteraient des organisations de tissus et/ou cellulaires différentes. Il est alors nécessaire de combiner l'analyse par ISM à une autre méthode d'analyse de l'échantillon telle qu'une coloration (immunohistochimie, historadiographie etc.), afin par exemple d'identifier des différences dans l'organisation tissulaire des deux échantillons. Résumé de l'invention
L'invention propose d'utiliser des données d'imagerie d'un échantillon (Le., positions, rapports m/z, intensités), obtenues classiquement par imagerie par spectrométrie de masse, non plus seulement en tenant compte des valeurs d'intensité associées aux ions dudit échantillon, mais en tenant compte de l'arrangement spatial desdits ions dans l'échantillon, et des mesures qui caractérisent ledit arrangement spatial.
Selon l'invention, on caractérise un échantillon en fonction de la morphologie de la distribution et des mesures associées (données morphométriques), et/ou de la texture d'un ou plusieurs ions dans l'échantillon. Les formes et l'agencement des formes associées à la présence desdits ions dans un échantillon permettent d'obtenir des informations supplémentaires (surface, forme, volume, motif, répétition, quantité, dispersion, et les valeurs qui dérivent de ces informations, tel que leur ratio, etc.) par rapport aux informations découlant des intensités spectrales. Il est alors possible de caractériser un échantillon en fonction des formes d'au moins un ion dans ledit échantillon et/ou des dimensions de ces formes et/ou de leur agencement dans l'échantillon. Selon l'invention, il est ainsi possible de différencier deux échantillons présentant des profils moléculaires similaires ou identiques. De même, il est possible d'identifier un échantillon sur la base de ses données morphométriques et/ou de texture, d'identifier des molécules d'intérêt dans un échantillon en ciblant par exemple des formes et/ou textures spécifiques, etc. Plus généralement, l'invention propose de caractériser la morphométrie et/ou la texture de la distribution d'un ou plusieurs ions dans un échantillon et d'utiliser ces données morphométriques et de texture en complément ou à la place des données d'imagerie spectrales. Selon l'invention, cette caractérisation peut être combinée aux méthodes de traitement des données d'imagerie actuelles tenant compte des intensités par exemple, et plus généralement à toute méthode de caractérisation d'un échantillon, y compris par traitement optique, physique, par coloration etc. L'invention a donc pour objet une méthode de caractérisation d'un échantillon par imagerie par spectrométrie de masse (ISM) selon laquelle on caractérise un arrangement spatial d'au moins un ion dans ledit échantillon à partir des données d'imagerie associées audit ion, en termes de morphométrie et/ou de texture.
Autrement dit, on mesure et/ou quantifie l'arrangement spatial d'au moins un ion dans ledit échantillon à partir de données d'ISM, afin d'identifier des formes, agencements de formes, mesures particulières et de caractériser en conséquence la distribution dudit ion dans l'échantillon par ces caractéristiques morphométriques et/ou de texture.
L'invention a également pour objet un procédé d'identification d'une nouvelle molécule d'intérêt dans un échantillon, selon lequel
i) on compare une pluralité de données morphométriques et/ou de texture associées à une pluralité d'ions dans ledit échantillon avec des données morphométriques et/ou de texture associées à une pluralité d'ions dans un échantillon de référence ;
ii) on identifie au moins un ion caractéristique de l'échantillon ;
iii) on identifie la molécule correspondant audit ion identifié à l'étape ii). L'invention propose également un procédé d'identification d'un échantillon par imagerie par spectrométrie de masse dans lequel: i) On établit une base de données, ou un modèle, avec des données morphométriques et/ou de texture associées à une pluralité d'ions de référence, obtenues à partir de plusieurs échantillons de référence, lesdites données morphométriques et/ou de texture étant représentatives de l'arrangement spatial desdits ions de référence dans lesdits échantillons de référence ;
ii) On enregistre des données morphométriques et/ou de texture associées à au moins un ion dans l'échantillon à identifier ;
iii) On compare des données morphométriques et/ou de textures associées aux ions de l'échantillon à identifier avec les données morphométriques et/ou de textures associées aux ions de référence contenues dans la base de données ou le modèle.
Un autre objet de l'invention consiste en un support de données lisible par ordinateur comprenant des instructions exécutables par l'ordinateur et adaptées pour permettre à un système informatique d'exécuter au moins une étape de la méthode de caractérisation d'un échantillon, et/ou au moins une étape du procédé d'identification d'un échantillon et/ou au moins une étape du procédé d'identification d'une molécule d'intérêt dans un échantillon selon l'invention. Brève description des figures
Figure 1 : Exemple de représentation de jeux de données acquis par imagerie par spectrométrie de masse pour deux échantillons (1A et 1B), où le blanc vaut 0 et le noir une valeur maximale ;
Figure 2: Exemple de caractérisation morphologique de données d'imagerie par spectrométrie de masse d'échantillons de tissus pulmonaires selon l'invention, aboutissant à l'identification de tissu pulmonaire pathologique (Airways fibrosés) comparativement à un tissu sain (Aiways sain) ;
Figure 3 : Exemple de dénombrement des voies aériennes par morphométrie par mise en oeuvre du procédé selon l'invention à des jeux de données d'imagerie par spectrométrie de masse de deux échantillons de voies aériennes (airways) de deux tissus fibrosés ; Figure 4 : Analyse et détermination de la surface des voies aériennes de poumons de rats par extrapolation de données morphologiques obtenues par le procédé selon l'invention à partir des données d'imagerie desdits échantillons ; Figure 5 : Représentation de la distribution de deux ions dans un échantillon de peau par imagerie par spectrométrie de masse et caractérisation de leur arrangement spatial dans l'échantillon pour l'identification de tissus (e.g. épiderme et stratum corneum)
Figure 6 : Représentation schématique des motifs et textures obtenues à partir des jeux de données d'imagerie par spectrométrie de masse d'une coupe de tissu biologique sur boite de Pétri, par le procédé selon l'invention appliqué au dénombrement et typage des cellules dans ladite coupe de tissu biologique ;
Figure 7 : Représentation schématique de différents critères morphométriques pour un ion cible qui peuvent être utilisés pour discriminer deux régions d'intérêt dans des échantillons A et B présentant des moyennes des intensités identiques pour ledit ion cible, ne permettant pas à elles seules de les différencier. Pour une même moyenne d'intensité pour un ion donné, la distribution peut ainsi varier en terme de nombre d'objets, surface de l'objet, dispersion dans la région d'intérêt, forme, variabilité des surface d'un objet à l'autre, etc. ;
Figure 8 : Représentation schématique de certaines étapes du procédé de caractérisation et/ou d'identification selon l'invention, aboutissant à l'extraction de critères morphométriques pour l'ion ayant un m/z de 91,5895 dans un échantillon : l'image moléculaire est soumise à une segmentation pour obtenir une image binaire qui est traitée de manière à caractériser la distribution dudit ion en nombre d'objets et surface desdits objets ;
Figure 9 : Comparaison pour un tissu de référence (tissu contrôle) et un tissu d'intérêt (tissu traité) de la distribution du m/z 718,505 au niveau de l'image moléculaire montrant l'intensité de la distribution et de l'image binaire mettant en avant la différence de surface de la distribution dudit m/z.
Exposé de l'invention
L'invention a donc pour objet une méthode de caractérisation d'un échantillon par imagerie par spectrométrie de masse (ISM) selon laquelle on caractérise un arrangement spatial d'au moins un ion dans ledit échantillon à partir des données d'imagerie associées audit ion, en termes de morphométrie et/ou de texture. Selon l'invention, la distribution de l'ion dans l'échantillon n'est plus seulement caractérisée en fonction de l'intensité mais également en fonction des formes / objets que dessine cette distribution et des mesures associées (surface, volume, etc.) et/ou de l'agencement de ces formes/objets entre eux. Il est alors aisément possible de discriminer deux échantillons qui, bien que présentant une intensité moyenne identique pour un ion donné, présentent des caractéristiques morphométriques et/ou de texture différentes associées audit ion.
La méthode selon l'invention peut s'appliquer à tout type d'échantillon pouvant être analysé par un spectromètre de masse sous vide (MALDI) ou atmosphère ambiant (LAESI, DESI), qu'il soit organique ou inorganique, liquide ou solide. Par exemple, la méthode selon l'invention est particulièrement adaptée à la caractérisation de tissus biologiques, d'origine animale ou végétale.
Par « tissu », on entend d'une manière générale un ensemble de cellules de même origine et regroupées en un ensemble fonctionnel pour concourir à une même fonction. Dans certains cas, un tissu peut s'entendre d'un organe, d'un fragment d'organe ou d'une région spécifique d'un organe, regroupant éventuellement plusieurs ensembles de cellules. Par exemple, le tissu peut être une tumeur localisée au sein d'un organe.
Dans un exemple de mise en œuvre, l'échantillon peut consister en une coupe histologique de tissu(s), dont des régions d'intérêt ont éventuellement été caractérisées au préalable par coloration et/ou par leurs signatures moléculaires. Plus généralement, la méthode selon l'invention peut être utilisée pour caractériser davantage tout ou partie de régions d'intérêt d'un échantillon préalablement identifiées par toute méthode de l'état de la technique.
La méthode selon l'invention peut également être utilisée pour caractériser des liquides biologiques, tels que sang, plasma, sérum, salive, liquide céphalo-rachidien, urine, etc.
Dans le cas d'un échantillon liquide, il est possible de le sécher sur une surface afin de réaliser l'image SM de l'échantillon séché, et ensuite caractériser cet échantillon par la méthode décrite. II est autrement possible, notamment avec un système d'ISM dit à pression atmosphérique, d'analyser la surface d'un liquide ou d'un solvant.
La méthode selon l'invention peut également être utilisée pour caractériser des échantillons environnementaux, tels que des échantillons de terre, d'eau, de végétaux, etc. Dans un exemple de mise en œuvre, la méthode selon l'invention est utilisée pour caractériser des objets, tels que des composants électroniques, des biomatériaux, des capsules, des pièces de hautes précisions, etc.
Par « caractériser un échantillon », on entend associer des propriétés distinctives/propres audit échantillon, lesdites propriétés permettant notamment de le discriminer/identifier parmi d'autres échantillons.
Selon l'invention, on utilise des données d'imagerie, et plus particulièrement des spectres, pour déterminer pour un ion donné l'arrangement spatial qu'il prend dans ledit échantillon. Avantageusement, on utilise plus particulièrement les données associées à un rapport m/z, caractéristique d'un ion donné. Dans le contexte de l'invention, l'expression « rapport m/z », ou « rapport masse sur charge », désigne une quantité physique caractéristique d'un ion, où m représente la masse et z la valence dudit ion. En imagerie par spectrométrie de masse, un ion donné peut correspondre à plusieurs rapports m/z.
L' « arrangement spatial » ou « distribution » d'un ion ou d'un rapport m/z s'entend de la ou des formes que dessine la présence dudit ion ou rapport m/z dans l'échantillon.
Selon l'invention, on détermine l'arrangement spatial du ou des ions étudiés, de manière à lui/leur associer une ou plusieurs formes, des dimensions, etc. Les données d'imagerie associées à la présence d'au moins un ion dans l'échantillon sont utilisées pour définir des données morphométriques et/ou de texture représentatives de la distribution dudit ion dans l'échantillon, indépendamment de la variation des intensités associées audit ion dans ledit échantillon.
Avantageusement, l'étape de caractérisation de l'arrangement spatial d'au moins un ion dans l'échantillon utilise un procédé de reconnaissance de forme et/ou d'analyse de texture pour segmenter les données d'imagerie dudit ion en régions d'intérêt distinctes et/ou dessiner les contours de motifs. Par exemple, on utilise une technique de morphologie mathématique, telle que la technique de la ligne de partage des eaux, la transformée de Hough, notamment dans sa forme généralisée, des matrices de dépendance spatiales des tons de gris, etc.
Par « données morphométriques » ou « caractéristiques morphométriques », on entend des données/caractéristiques relatives à la ou les formes géométriques, ou motifs, formées par la présence de l'ion considéré dans l'échantillon (ou du rapport m/z associé audit ion), et/ou à leurs dimensions mathématiques, telles qu'une surface, un volume, un diamètre, un rayon, une longueur, une largeur, une épaisseur, etc. Dans certains cas, les motifs peuvent consister en des éléments d'écriture, tels que des chiffres, lettres, mots, etc. Par « données de texture » ou « caractéristiques de texture », on entend des données/caractéristiques relatives à un agencement des motifs entre eux dans l'échantillon, telles que le nombre de motifs répétés, une distance, une dispersion entre lesdits motifs, etc.
Par « échantillon de référence », on entend un échantillon de même nature et/ou origine que l'échantillon d'intérêt. Par exemple, lors de l'étude d'un tissu biologique d'un sujet d'intérêt, l'échantillon de référence consiste en un tissu biologique de même nature provenant d'un sujet témoin.
Selon l'invention, il est possible de caractériser l'arrangement spatial d'un ou plusieurs ions ou rapports m/z dudit échantillon, pris ensemble ou séparément. Ainsi, un motif donné peut être associé à la présence et distribution de plusieurs rapports m/z pris simultanément en considération. De manière alternative, il est possible de caractériser des motifs différents pour différents rapports m/z dans un même échantillon, simultanément ou séquentiellement. Selon l'invention, ces différents rapports m/z peuvent être représentatifs d'un même ion ou d'ions différents.
Dans un mode de réalisation, la méthode selon l'invention comprend une étape préalable d'acquisition de données d'imagerie à partir desquelles les caractéristiques morphométriques et/ou de texture d'au moins un rapport m/z sont déterminées.
La méthode selon l'invention peut être mise en œuvre avec toute technique d'imagerie par spectrométrie de masse connue, et notamment l'imagerie MALDI, LDI, DESI, LESA, LAESI (« Laser Ablation Electrospray Ionization »), DART (« Direct Analysis in Real Time »), SIMS, JEDI (« Jet Desorption Electrospray Ionization »), LAMMA (« Laser Microprobe Mass Analysis »), SMALDI (« Scanning Microprobe Matrix Assisted Laser Desorption Ionization ») en combinaison avec différents types d'analyseurs, tels que le TOF (« Temps de Vol »), Orbitrap, FTICR (« Résonance Cyclotronique des Ions à Transformée de Fourier »), Quadripole (« simple ou triple »), ICP MS etc. Dans un exemple de mise en œuvre particulier de l'invention, il est possible de visualiser les caractéristiques morphométriques et/ou de texture associées à au moins un ion directement sur une image ionique de l'échantillon, par exemple en utilisant l'imagerie MALDI. Plus précisément, les caractéristiques morphométriques et/ou de texture associées aux ions analysés peuvent être générées sous forme d'images reproduisant l'échantillon, de sorte que l'on peut y visualiser leurs arrangements spatiaux. Bien entendu, il est possible de superposer différentes images de l'échantillon, afin par exemple de visualiser simultanément des données de plusieurs ions, et même des données histologiques ou autres obtenues par d'autres méthodes d'analyse telles que la microscopie optique, la coloration histologique etc. Dans un mode de réalisation, la méthode de caractérisation d'un échantillon selon l'invention comprend les étapes consistant à : a) Acquérir des données par ISM, pour au moins un ion dans l'échantillon ; puis b) Caractériser un arrangement spatial dudit au moins un ion dans l'échantillon à partir des données relatives aux positions dudit au moins un ion, selon des caractéristiques morphométriques et/ou de texture.
A partir de l'arrangement spatial d'un ion dans un échantillon d'intérêt, on caractérise ledit ion par ses caractéristiques morphométriques et de texture, spécifiques dudit échantillon. Un même ion, dans un autre échantillon pourra présenter des caractéristiques morphométriques et de texture différentes, quand bien même les profils moléculaires des deux échantillons seraient identiques.
Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'acquérir un autre degré d'informations pour un ion dans un échantillon, qui peut être pris en compte seul ou en combinaison avec toute autre donnée/caractéristique de l'échantillon et/ou de l'ion considéré. Par exemple, il est possible d'analyser simultanément ou séquentiellement non seulement les caractéristiques morphométriques et de texture d'un ion d'intérêt, mais également tout ou partie de ses caractéristiques spectrales (intensité des pics des spectres de masse, rapport signal sur bruit (S/N), aire des pics, etc.).
Avantageusement, le procédé selon l'invention permet de visualiser simultanément l'ensemble de ces données/caractéristiques directement sur une même image ionique de l'échantillon. Dans un autre mode de réalisation, la méthode de caractérisation d'un échantillon selon l'invention comprend les étapes consistant à : c) Segmenter des données d'imagerie de l'échantillon en régions d'intérêt représentatives des profils d'intensité moléculaires de l'échantillon ; et
d) Caractériser un arrangement spatial des ions du profil moléculaire d'une région d'intérêt selon des caractéristiques morphométriques et/ou de texture.
L'étape c) consiste en une segmentation de l'échantillon en fonction des profils moléculaires au sein dudit échantillon. Chaque région d'intérêt correspond à un profil moléculaire obtenu à partir des spectres de masse de l'échantillon. Différentes caractéristiques spectrales peuvent être classiquement utilisées pour obtenir les profils moléculaires dudit échantillon, et notamment l'intensité des pics des spectres de masse, le rapport signal sur bruit (S/N), l'aire des pics, etc.
Une fois la ou les régions d'intérêt dans l'échantillon identifiées, on traite les données d'imageries associées à la région d'intérêt sélectionnée pour caractériser l'arrangement spatial de l'ensemble des ions de ladite région d'intérêt sélectionnée. Ce sont les données de l'ensemble des ions dans la région d'intérêt qui sont prises en compte et analysées pour identifier les motifs et textures caractéristiques de ladite région d'intérêt. Là encore, selon l'invention, il est possible de reconstruire une image numérique de l'échantillon à partir de ces données de manière à visualiser les résultats directement sur une image de l'échantillon.
Selon l'invention, les étapes c) et d) peuvent être mise en œuvre indépendamment des étapes a) et b), c'est-à-dire sans mise en œuvre des étapes a) et b). Dans un autre mode de réalisation particulier, il est possible de mettre en œuvre successivement les étapes a) et b), puis c) et d), ou inversement, de manière à obtenir différents degrés d'informations en termes de morphométrie et de texture du ou des ions considérés dans l'échantillon considéré. De même, il est possible d'appliquer l'étape d) à plusieurs ou toutes les régions d'intérêt identifiées dans l'étape c).
Dans un autre de mode de mise en œuvre de l'invention, la méthode de caractérisation comprend l'étape consistant à : e) Réaliser une base de données (BDD) comprenant des données morphométriques et/ou de texture d'une pluralité d'ions dans ledit échantillon.
De manière alternative, la méthode de caractérisation comprend l'étape consistant à : f) Créer un modèle comprenant des données morphométriques et/ou de texture d'une pluralité d'ions dans ledit échantillon.
Dans le contexte de l'invention, « une pluralité » signifie deux ou plus.
Un « modèle » s'entend d'un ensemble de données, dans le cas présent de caractéristiques issues de l'échantillon, notamment des données d'intensité, des données morphométriques et/ou de texture, etc., qui ont été modélisées notamment pour définir des dépendances et/ou relations entre lesdites données, et qui est représentatif de l'échantillon considéré. Une « base de données » désigne quant à elle une base dans laquelle est stocké un ensemble de données brutes.
Ainsi, il est possible d'obtenir un ensemble de jeux de données, c'est-à-dire de motifs, dimensions, arrangements etc., propre à un échantillon ou type d'échantillon, ou un modèle. Selon l'invention, cette base de données (BDD) ou ce modèle peut être implémentée (étape g) avec les données spectrales d'ISM d'au moins un ion dans ledit échantillon, et/ou des données physicochimiques, physiologiques et/ou biologiques propres audit échantillon. Par exemple, la base de données (BDD), ou le modèle, est implémentée avec des données obtenues par une étude histologique, chimique ou autre, de l'échantillon, ou d'un échantillon identique, afin de définir différentes zones d'intérêt. Une telle base de données (BDD), ou modèle, peut être particulièrement utile pour identifier rapidement et de manière automatisée un tissu, une région d'un tissu, un type cellulaire, un état physiologique d'un tissu par exemple sain ou pathologique, etc. De même, la base de données, ou le modèle, peut être utilisée pour l'identification et le comptage, ou dénombrement, cellulaire dans un échantillon biologique. L'invention a également pour objet un procédé d'identification d'un échantillon par imagerie par spectrométrie de masse dans lequel: i) On établit une base de données, ou on crée un modèle, avec des données morphométriques et/ou de texture associées à au moins un ion de référence, obtenues à partir de plusieurs échantillons de référence, lesdites données morphométriques et/ou de texture étant représentatives de l'arrangement spatial dudit au moins un ion de référence dans lesdits échantillons de référence ;
ii) On enregistre des données morphométriques et/ou de texture (surface, volume, forme, motif, répétition, etc.) associées à au moins un ion dans l'échantillon à identifier;
iii) On compare des données morphométriques et/ou de textures de l'étape ii) avec les données morphométriques et/ou de textures contenues dans la base de données, ou le modèle, de l'étape i).
Selon l'invention, à l'étape ii) on analyse un ion correspondant à un ion de la base de données, ou du modèle. Avantageusement, la base de données, ou le modèle, comprend des données morphométriques et/ou de texture associées ou non à une pluralité d'ions de référence.
L'ensemble des caractéristiques et définitions décrites ci-dessus en lien avec la méthode de caractérisation d'un échantillon s'appliquent mutatis mutandis audit procédé d'identification.
Avantageusement, pour chaque échantillon de référence, on établit un jeu de données morphologiques et de textures pour plusieurs ions de manière à caractériser de la manière la plus fiable possible chacun des échantillons de référence.
Selon l'invention, on procède à l'étape iii) à une analyse des similitudes et/ou des différences entre les différents jeux de données de référence et les jeux de données de l'échantillon à identifier, de manière à sélectionner le ou les échantillons de référence présentant des caractéristiques morphométriques similaires ou identiques, et par là à identifier l'échantillon.
Le procédé selon l'invention peut par exemple permettre d'identifier la nature et/ou l'origine d'un tissu biologique, un type cellulaire, le stade d'évolution d'une maladie, etc. L'invention a aussi pour objet un procédé d'identification d'une molécule d'intérêt dans un échantillon, selon lequel i) on compare des données morphométriques et/ou de texture associées à une pluralité d'ions dans ledit échantillon avec des données morphométriques et/ou de texture associées à une pluralité d'ions dans un échantillon de référence ;
ii) on identifie au moins un ion caractéristique de l'échantillon, avantageusement absent de l'échantillon de référence ;
iii) on identifie la molécule correspondant audit ion identifié à l'étape précédente.
Un tel procédé permet de découvrir et d'identifier une nouvelle molécule dans un échantillon d'intérêt.
Dans un mode de réalisation, le procédé d'identification d'une nouvelle molécule d'intérêt dans un échantillon d'intérêt comprend au préalable une étape d'acquisition de données d'ISM propres audit échantillon et de caractérisation de la distribution d'un ou plusieurs ions par des caractéristiques morphométriques et/ou de texture.
L'ensemble des caractéristiques et définitions décrites ci-dessus en lien avec la méthode de caractérisation d'un échantillon s'appliquent mutatis mutandis au présent procédé d'identification d'une molécule.
Selon ce mode de réalisation de l'invention, la nature de l'échantillon est connue et on souhaite identifier un ou des marqueurs propres audit échantillon, c'est-à-dire qui ne sont pas présents dans l'échantillon de référence, ou alors qui présente(nt) des caractéristiques morphométriques et/ou de textures différentes par rapport à celles qu'ils ont dans l'échantillon de référence (figure 7). Les caractéristiques morphométriques prises en compte pour un ion donné peuvent par exemple être le nombre d'objets, la moyenne de la surface des objets, la dispersion, la forme, la variabilité des surfaces, etc. On utilise donc préférentiellement un échantillon de référence de même nature et/ou de même type que l'échantillon d'intérêt.
Avantageusement, l'étape i) peut être mise en œuvre en interrogeant une base de données (BDD) compilant une pluralité de jeux de données de référence de l'échantillon de référence, ou en comparant les données de l'échantillons à un modèle compilant une pluralité de jeux de données de référence de l'échantillon de référence. . Une fois le ou les données morphométriques et/ou de textures distinctives de l'échantillon d'intérêt identifiées, on y associe le ou les ions correspondants afin de remonter à la molécule associée à chacun des ions.
Ce procédé est particulièrement utile dans le domaine pharmaceutique ou médical, notamment pour identifier de nouveaux biomarqueurs.
L'invention a également pour objet un support de données lisible par ordinateur comprenant des instructions exécutables par l'ordinateur et adaptées pour permettre à un système informatique d'exécuter au moins une étape de la méthode de caractérisation d'un échantillon selon l'invention, et/ou au moins une étape du procédé d'identification d'un échantillon ou d'une molécule d'intérêt dans un échantillon selon l'invention.
Ainsi, l'invention propose un programme d'ordinateur comprenant des instructions de code de programme pour l'exécution de tout ou partie des étapes exposées ci-dessus, lorsque ledit programme est exécuté sur un ordinateur.
Avantageusement, le programme d'ordinateur comprend des instructions de code de programme pour exécuter au moins l'étape de caractérisation de l'arrangement spatiale d'un ou plusieurs ions dans un échantillon d'intérêt.
Avantageusement, le support de données lisible par ordinateur, ou programme, selon l'invention comporte une base de données, ou un modèle, comprenant des données morphométriques et/ou de texture d'au moins un ion dans au moins un échantillon, et préférentiellement d'une pluralité d'ions pour une pluralité d'échantillons.
Recherche de marqueurs
Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour l'identification de marqueurs, et notamment des biomarqueurs. En effet, dans le cas d'échantillons biologiques, il est possible d'identifier des variations de morphologie présentes entre deux conditions (par exemple malade vs sain, traité vs véhicule, exposé vs non exposé, etc.). Notamment, selon l'invention, il est possible d'étudier plus particulièrement des ions spécifiquement présents dans une région d'intérêt, préalablement identifiée par une étude macroscopique et/ou microscopique de la structure de l'échantillon par exemple.
Une fois les caractéristiques morphométriques et/ou de texture obtenues, et si après étude statistique les formes associées aux ions étudiés sont considérées comme significativement différentes, il suffit de remonter de manière classique à la ou les masse(s) moléculaire(s) d'intérêt(s) associées. Après interrogation des bases de données spécialisées, la ou les molécule(s) correspondantes peuvent être identifiées. Pour cela, différents tests statistiques différentiels peuvent être utilisés, afin de se baser sur la morphologie des éléments de distributions moléculaires et non seulement sur l'intensité. On peut notamment utiliser le test de Fischer, test z, test de Student, test de Welch, test de Student apparié, ANOVA, test de Dunett, test de Tukey, test de Kruskal-Wallis, test de Wilcoxon-Mann-Whitney, test signé des rangs de Wilcoxon, MANOVA, etc.
Filtrage et classification moléculaire Le procédé selon l'invention peut être utilisé à des fins de filtrage moléculaire.
Par exemple, il est possible de sélectionner, de manière arbitraire ou non, une morphométrie particulière (par exemple, une forme en étoile de X mm2 de surface minimale) pour effectuer un filtre moléculaire dans un échantillon. Ainsi, seuls les ions qui entrent dans le(s) critère(s) défini(s) sont sélectionnés. Il est alors possible d'identifier des molécules ayant le même impact de forme que celui recherché.
Un tel filtrage peut également permettre de classifier des échantillons. Ainsi, par le procédé de l'invention, il est possible de donner un score de ressemblance en se basant sur les informations d'intensités et de formes. Il est possible de reconnaître automatiquement dans un échantillon, tel qu'un tissu biologique, la présence d'une forme donnée qui est par exemple caractéristique d'un état physiologique. Il devient alors possible d'établir des classements à base de scores plus précis et fiables que ceux basés uniquement sur le critère intensité, qui peut lui varier suivant la préparation de l'échantillon (dépôt de matrice, temps de dessiccation, congélation, type de tissu, etc.) contrairement aux caractéristiques morphométriques et de texture qui sont préservées quel que soit le protocole choisi.
Selon l'invention, il est avantageusement possible de constituer une base de données (BDD), ou un modèle, compilant les spécifications de plusieurs échantillons d'une même population, tels que plusieurs échantillons d'un même tissu biologique ou de tissus biologiques de même origine/nature. A partir d'une telle base de données, ou d'un tel modèle, il est aisé d'identifier un nouvel échantillon d'une même population ou d'identifier avec certitude un échantillon dans une population.
Par exemple, il est possible de caractériser un échantillon de tissu pulmonaire comme étant fibrosé comparativement à un échantillon de tissu pulmonaire sain. La figure 2 montre plus particulièrement les résultats obtenus à partir de la caractérisation morphométrique des jeux de données d'imagerie obtenus pour l'échantillon de tissu pulmonaire sain et l'échantillon de tissu pulmonaire fibrosé. Selon le procédé de l'invention, on identifie deux morphométries en forme d'ellipse dont l'une présente un rapport entre le petit axe et le grand axe tendant vers un (Tissu fibrosé). L'utilisation de ces signatures morphométriques permet de caractériser deux formes de voies respiratoires (airways), respectivement saine (Ovale type 1) et fibrosée (Ovale type 2).
De manière similaire, il est possible de caractériser des échantillons inorganiques, tels que des composants électroniques, des pièces automobiles ou autres, notamment afin d'effectuer un contrôle qualité.
Comptage cellulaire et dénombrement morphométri ue
Le procédé selon l'invention peut également être utilisé dans le domaine du comptage cellulaire ou bactérien, notamment dans le cadre d'une évaluation environnementale ou de santé. À cet effet, il est possible de sélectionner en imagerie par spectrométrie de masse des molécules spécifiques de la paroi cellulaire (les lipides par exemple), afin de mettre en relief les objets à compter.
Avec le procédé selon l'invention, on isole les formes avec un facteur moléculaire, alors que jusqu'à présent cela est réalisé par signaux optiques, et notamment par microscopie optique ou cytométrie de flux. L'invention permet de dépasser les limites de sensibilité de détection obtenues par les signaux optiques, mais également de vitesse de travail, de précision (moins de faux positifs) et à augmenter le nombre de paramètres simultanément analysés. Selon l'invention, les cellules peuvent être dénombrées et reconnues sur la base de leur morphologie, tout en indiquant le profil moléculaire comme l'activité métabolique de la cellule identifiée. Il est donc possible de dénombrer de multiples types cellulaires, biologiques ou histologiques et leur activité physiologique.
La figure 3 décrit le dénombrement automatisé par morphométrie sur des jeux de données d'imagerie obtenus pour des échantillons de voies aériennes (airways) de deux tissus fibrosés. La détection automatisée des formes ovales permet d'identifier et dénombrer les structures histologiques d'intérêt (ici les voies respiratoires) sans corrélation avec des colorations histologiques adjacentes.
Étude cinétique des morphométries Le procédé selon l'invention peut également être utilisé dans l'étude cinétique de formes, notamment pour suivre l'évolution dans le temps de la morphométrie (forme, surface, volume...) d'éléments d'intérêt (molécules, ions, m/z) dans l'échantillon. Il est notamment possible de mettre en évidence un changement de morphométrie, par exemple le grossissement ou rétrécissement, d'une région d'intérêt dans le temps. II est également possible d'envisager des stades d'évolutions des formes dans un échantillon biologique, en accord avec d'autres études de stades de l'échantillon biologique. Par exemple, il est possible via le procédé de l'invention de donner des courbes de surface en fonction d'une ou plusieurs masses cibles dans le temps. Si des paliers ou stades spécifiques sont identifiés (variation de morphométrie, paliers, oscillation de formes...), ils peuvent potentiellement être corrélés à des stades connus de l'échantillon biologique (par exemple, changement de grade d'un tissu cancéreux).
La figure 4 illustre l'application du procédé selon l'invention à l'étude de l'évolution de la constriction de voies aériennes dans un tissu fibrosé. Comme cela est représenté, il est possible avec le procédé de l'invention de déterminer la surface des voies aériennes au cours du temps et donc de suivre l'impact de la fibrose sur la constriction des voies aériennes.
Typage cellulaire ou tissulaire Le procédé selon l'invention peut être utilisé pour identifier des types cellulaires ou des sous structures tissulaires dans un échantillon biologique végétal ou animal. Ce typage cellulaire est rendu possible grâce aux morphométries de chaque cellule qui leurs sont spécifiques. Ainsi en fonction des morphométries cellulaires obtenues, il est possible de déterminer le ou les types cellulaires contenus au sein d'un ou plusieurs échantillons. Depuis peu, des développements instrumentaux ont permis de descendre la résolution spatiale de l'imagerie MALDI en dessous de 10 μιη. La technologie SIMS quant à elle permet d'obtenir une résolution inférieure à 1 μιη en routine. En considérant que la taille moyenne d'une cellule est de 10-15 μιη, on peut considérer que l'imagerie par spectrométrie de masse atteint une résolution cellulaire permettant de les discriminer dans des jeux de données moléculaires. La figure 5 illustre l'application du procédé de l'invention dans le cadre du typage tissulaire sur une coupe de tissu de peau et sans corrélation histologique. Les zones du tissu (Stratum corneum et Epiderme) sont identifiées grâce à leurs morphométries spécifiques obtenues après acquisition en ISM.
De même, la figure 6 illustre de manière schématique l'application du procédé de l'invention dans le cadre du dénombrement et du typage cellulaire directement sur / dans un échantillon biologique et sans corrélation histologique. Les cellules de l'échantillon (tissu, solution ou culture cellulaire) sont typées grâce à leurs morphométries spécifiques obtenues après acquisition en ISM. Exemples
L'invention va maintenant être décrite plus en détail à l'aide d'exemples précis. Ces exemples sont donnés à titre illustratif et nullement limitatif de l'invention.
Exemple 1 : Procédure pour caractériser un échantillon ou une région d'intérêt en combinant des informations spectrales et spatiales.
Le présent exemple a pour but de mettre en évidence les différences d'informations susceptibles de découler d'un même jeu de données d'imagerie acquises pour un échantillon, selon que l'on prend en compte les seules données liées aux intensités pour un rapport m/z donné dans ledit échantillon ou les caractéristiques morphométriques et de texture associées à ce rapport m/z.
Une fois les données d'imagerie par spectrométrie de masse (positions, rapport m/z, intensités) d'un échantillon acquises, par toute méthode connue, on procède par exemple selon les étapes ci-dessous :
1/ Charger les images obtenues à partir des données d'imagerie ; 2/ Déterminer un seuil pour binariser les images en utilisant, par exemple, la méthode d'Otsu
3/ Labelliser et compter des objets via un algorithme non optimisé
4/ Récupération du nombre de positions non nulles dans une variable
5/ Récupération du nombre de pixels de l'objet ou de l'image dans une variable
6/ Calcul de l'intensité moyenne dans une variable 11 Tests pour déterminer si un objet possède au moins certaines propriétés de forme
De manière simplifiée, l'étape 3 peut être mise en œuvre via l'algorithme ci-dessous : « Tant que l On n 'a pas parcouru l 'image en entier : Parcourir l'image ligne par ligne
Si on rencontre un pixel non nul (on appartient à un objet)
Parcours de son voisinage et des voisinages de voisinage en 8
connexités pour mettre les pixels de l'objet à 0 Incrémentation du compteur d'objets
Fin du parcours de voisinage
Fin du pixel non nul
Fin du parcours de ligne
Fin de l 'algorithme » L'étape 7 de test peut par exemple être mise en œuvre en faisant une ouverture (Erosion ε, suivi d'une dilatation δ) par un élément structurant (ES) présentant une ou des propriétés à tester. Si l'addition de pixel de l'ouverture par TES est non nulle, alors l'image/la région possède la propriété.
Ouverture : A B = (A Çy B) φ B Erosion : A Q B = {z€ E\BS Ç . }, ¾ = {& + € B}f fz€ E
Dilatation : A B ~ {z€
Figure imgf000022_0001
- x€ B} Résultats
Les étapes décrites ci-dessus ont été appliquées à des données d'imagerie acquises classiquement pour 2 segments (figure 1) présentant chacun une longueur de 6 pixels, en continu (figure 1A) ou en fragmenté (figure 1B) et une intensité moyenne identique sur ces 6 pixels. Alors que la prise en compte des seules intensités ne permet pas de différencier les deux segments, la caractérisation morphologique et de texture obtenue par le procédé selon l'invention permet de mettre en évidence les différences entre les deux segments (tableau 1).
Tableau 1 : Caractéristiques découlant des données d'imagerie
Figure imgf000023_0001
Exemple 2 : Procédure pour l'indentification de pics d'intérêt et de biomargueurs associés à partir de données morphométriaues
Matériel & méthode Les animaux :
Cinq poumons de rats ont été utilisés pour cette étude. Trois proviennent de rats ayant subis un traitement à la bléomycine (Apollo Scientific, UK) par les voies aériennes (oropharyngeal aspiration route) à une dose de 1 mg/kg pendant sept jours et deux proviennent d'animaux ayant reçu une solution saline de manière similaire pour la même durée. Tous les rats étaient des Sprague Dawley, Cri :CD (SD) mâles. Les deux groupes ont été sacrifiés vingt-deux jours après le début de l'expérience. Les poumons ont été gonflés à agarose, fixé dans du formol avec 10% de solution tampon neutre et congelés à -80°C. Les expériences animales étaient conformes à l'Animais (Scientific Procédures) Act de 1986.
Préparation pour acquisition d'images par spectrométrie de masse (SM) : Pour l'acquisition des images, des lames ITO ont été achetées auprès de Delta Technologies (Loveland, USA) et ont été recouvertes avec de la 9-aminoacridine (9AA). Des sections de tissus frais avec une épaisseur de 12 μηι ont été obtenues en utilisant un cryostat microm HM560 (Thermo Scientific, Allemagne) à -35°C et montées sur les lames ITO. De plus, des sections d'homogénat de reins de rat dopés en drogue avec une épaisseur de 10 μιη ont été déposés sur les même lames afin de servir de contrôle qualité pour l'évaluation de la reproductibilité et de la variabilité. Les lames ont été retirées du cryostat après une heure puis desséchées pendant 20 minutes avant d'être finalement conservées à -80°C jusqu'à utilisation.
La matrice utilisée était une solution de 9AA à 5 mg/mL dans un solvant MeOH/H20(4 : 1 v :v) ; elle a été déposée en dix couches successives avec un appareil de dépôt automatisé Suncollect (SunChrom GmBH, Friedrichsdorf, Allemagne). La première couche a été appliquée à un débit de 10 μί/ιηίη, la seconde couche à un débit de 20 μί/ιηίη et les suivantes à 30 μί/ιηίη.
Acquisition des images SM :
Un spectromètre de masse MALDI-FTICR (7T Solarix, Bruker Daltonics, Brème, Allemagne) équipé d'un laser SmartBeam II utilisé à une énergie de sortie de 80% et un taux de répétition de 1000 Hz a été utilisé pour acquérir les filtres de masse en mode "full scan" pour les m/z compris entre 100 et 1000 avec une résolution spatiale de 30 μιη et en mode négatif. Chaque spectre de masse correspond à l'accumulation de 500 tirs laser consécutifs au même endroit. Une calibration interne a été faite en utilisant la matrice de 9AA ainsi que des phospholipides compris entre les m/z 200 et 900. Le spectromètre de masse était contrôlé par l'utilisation des logiciels FTMS Control 2.0 et Flexlmaging 4.0 (Bruker Daltonics, Brème, Allemagne).
Les régions choisies pour acquisitions étaient des voies aériennes pulmonaires car la bléomycine devrait y induire des changements.
La détection de pics :
Sont considérés comme pics les maxima du spectre moyen transformé d'une condition dépassant un seuil. La transformation utilisée a été la soustraction de la médiane du signal sans les valeurs nulles divisé par la déviation absolue à la médiane du signal sans les valeurs nulles multipliée par 1,4826. Cela donne une approximation du rapport signal sur bruit en chaque point. L'idée étant que le bruit suit une distribution à peu près normale et que le vrai signal est présent dans moins de la moitié des mesures agrégées dans le spectre moyen, l'élimination des valeurs nulles a été fait car le signal semble avoir subi une compression par ondelette destructive par FTMS Control 2.0. D'autres manières d'approximer le bruit ont été testées (par exemple, la même mesure mais faite localement, ou la distance à d'un pic à une gaussienne censée le représenter) mais n'ont pas donné de résultats meilleurs pour les seuils faibles. Le seuil retenu pour cette étude est de 1 pour avoir le moins de faux négatifs que possible mais excluant le plus de bruit possible.
Les images exportées :
Pour chaque pic détecté, correspondant à un biomarqueur potentiel, et pour chaque région imagée, l'image de l'intensité maximale dans la fenêtre du pic est étirée dans une palette en niveau de gris ayant 8 bits de profondeur puis est exportée au format JPEG sans compression. Le choix de n'utiliser qu'un seul canal a été fait pour faciliter l'inspection visuelle des résultats. Environ 2000 ions à imager sur 12 régions (6 dans la condition 1 et 6 dans la condition 2) ont été obtenus. Caractérisation morphologique :
Pour chaque image :
Pour essayer de débruiter l'image, une ouverture est faite sur l'image en niveau de gris en utilisant un élément structurant de taille 2 x 2, suivie par une fermeture utilisant le même élément structurant : / = (((0 θ 5ι) Θ 5ι) Θ B2) θ B2, O étant l'image originale en niveau de gris, dans notre cas Β = B2 = B l'élément structurant, un masque booléen de valeurs varies centre au coin inférieur droit, les valeurs manquantes ont été obtenues par duplication de la ligne ou colonne la plus proche.
L'image est ensuite binarisée par l'application de la méthode d'Otsu (dans notre cas avec un seuil unique) : la maximisation de η = σ|/σ avec σ| = ω0ω1(μ1— μ0)2 et σ = ∑[=1(i - μτ) * i, avec ω0 = ∑=1 Pi, ω1 = 1 - ω0, μ0 = ∑=1 ipi/ ω0, μί =∑L i=k+1 ipi/ ωι> Vi =
Figure imgf000025_0001
Pi = 1 Pour une image contenant N pixels, L niveaux de gris et έ le nombre de pixels prenant la valeur de niveau de gris i; Avant ou après cela, la surface de l'image en pixel est calculée ;
Puis, le nombre d'objets dans l'image binarisée est compté en utilisant le cardinal de l'ensemble des labels utilisés pour créer l'image labellisée telle que décrite dans Rosenfeld et Pfaltz (1996) en 4 connexité ; Finalement, la surface moyenne des objets par unité de surface est établie. Comparaison :
Deux tests t de Welch ont été faits entre les deux conditions, l'un basé sur le nombre d'objets par unité de surface et l'autre sur la surface moyenne des objets par unité de surface. Le test t de Welch a été retenu car il s'applique bien à des échantillons de petite taille non appariés et qu'il n'est pas certain que les variances des deux populations soient égales. Un test de Mann- Whitney-Wilcoxon aurait autrement pu être utilisé.
200 biomarqueurs ont été identifiés comme significativement différents entre la condition contrôle et la condition traitée sur la base d'utilisation de critères morphométriques, dont certains biomarqueurs ne sont identifiés qu'en utilisant les critères morphométriques. Comme cela est représenté à la figure 9, un composant membranaire impliqué dans apoptose a pu être identifié (m/z 718.505), qui n'était pas détectable en ne tenant compte que des intensités (NS : Non significatif ; * : différence significative)
Modélisation :
Un modèle mathématique a été réalisé sur la base des biomarqueurs potentiels identifiés de la condition traitée. Ce modèle a été utilisé à des fins exploratoires pour classifier des échantillons tests sur la base des caractères morphométriques extraits.
La présente étude pourrait être poursuivie pour :
Normaliser les données ;
Faire de l'identification de pics afin d'associer une molécule à un pic ;
Faire de l'interprétation biologique ; Faire de la classification / de l'apprentissage automatique (« machine learning ») en utilisant par exemple des plateformes nuagiques (« cloud »).
Exemple 3 : Autres applications De très nombreuses applications sont envisageables, et peuvent notamment être mise en œuvre en utilisant les étapes décrites à l'exemple 1 ou l'exemple 2. Par exemple, comme cela a été exposé ci-dessus, l'invention peut être utilisée dans le domaine médical et pharmaceutique, pour identifier de nouveaux biomarqueurs, pour le filtrage et la classification moléculaire, le dénombrement cellulaire et morphologique, l'étude de l'évolution dans le temps d'une maladie ou d'un traitement, le typage cellulaire ou tissulaire, etc. Selon l'invention, il est également possible, à partir des surfaces et/ou volumes de distribution d'un ion dans un échantillon, de quantifier de manière relative ou absolue ledit ion dans ledit échantillon. Bien entendu, l'invention trouve des applications dans d'autres domaines, tels que le contrôle qualité, l'art, l'analyse comparée et automatisée d'objets, l'étude de la composition de matériaux, etc.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'identification par imagerie par spectrométrie de masse (ISM) d'une molécule d'intérêt dans un échantillon d'intérêt, selon lequel i) On analyse un arrangement spatial d'une pluralité d'ions dans l'échantillon d'intérêt à partir de données d'ISM desdits ions dans ledit échantillon pour déterminer des caractéristiques morphométriques et/ou de texture associées auxdits ions dans ledit échantillon ;
ii) On compare les caractéristiques morphométriques et/ou de texture associées à la pluralité d'ions dans ledit échantillon d'intérêt avec des données morphométriques et/ou de texture associées à une pluralité d'ions dans un échantillon de référence ;
iii) On identifie au moins un ion caractéristique de l'échantillon ;
iv) On identifie la molécule correspondant audit ion identifié à l'étape iii).
2. Procédé d'identification d'une molécule dans un échantillon selon la revendication 1, selon lequel les caractéristiques morphométriques définissent un ou des motifs et des dimensions associées audit motif.
3. Procédé d'identification d'une molécule dans selon la revendication 1 ou 2, selon lequel les caractéristiques de texture définissent un agencement des motifs dans ledit échantillon.
4. Procédé d'identification d'une molécule dans un échantillon selon l'une des revendications précédentes, comprenant l'étape additionnelle selon laquelle on visualise les caractéristiques morphométriques et/ou de texture associées à au moins un ion directement sur une image de l'échantillon.
5. Procédé d'identification d'une molécule dans un échantillon selon l'une des revendications précédentes, selon lequel l'étape d'analyse de l'agencement spatial dudit au moins un ion est réalisée par mise en œuvre d'un procédé de reconnaissance de forme et/ou d'analyse de texture.
6. Procédé d'identification d'une molécule dans un échantillon selon l'une des revendications précédentes, comprenant l'étape préalable selon laquelle on acquiert des données par ISM, pour une pluralité d'ions dans l'échantillon.
7. Procédé d'identification d'une molécule dans un échantillon selon l'une des revendications précédentes, comprenant l'étape selon laquelle on réalise une base de données (BDD) ou un modèle comprenant des caractéristiques morphométriques et/ou de texture d'une pluralité d'ions dans ledit échantillon d'intérêt.
8. Procédé d'identification d'une molécule dans un échantillon selon la revendication 7, comprenant l'étape additionnelle selon laquelle on implémente la base de données (BDD) ou le modèle avec les données spectrales d'ISM d'au moins un ion dans ledit échantillon d'intérêt, et/ou des données physicochimiques, physiologiques et/ou biologiques propres audit échantillon d'intérêt.
9. Utilisation de données d'imagerie par spectrométrie de masse (ISM) d'au moins un ion dans un échantillon pour déterminer des caractéristiques morphométriques et/ou des caractéristiques de texture dudit ion, de manière à caractériser ledit échantillon par l'arrangement spatial dudit ion dans ledit échantillon.
10. Méthode de caractérisation d'un échantillon par imagerie par spectrométrie de masse (ISM) selon laquelle on caractérise un arrangement spatial d'au moins un ion dans ledit échantillon à partir des données d'imagerie associées audit ion, en termes de caractéristiques morphométrie et/ou de texture.
11. Méthode de caractérisation d'un échantillon par ISM selon la revendication 10, comprenant les étapes selon lesquelles :
a) On acquiert des données par ISM, pour au moins un ion dans l'échantillon ;
b) On caractérise un arrangement spatial dudit au moins un ion dans l'échantillon à partir des données relatives aux positions dudit au moins un ion dans ledit échantillon par des caractéristiques morphométriques et/ou de texture.
12. Méthode de caractérisation d'un échantillon par ISM selon la revendication 10 ou 11, comprenant les étapes selon lesquelles :
c) on segmente des données d'imagerie de l'échantillon en régions d'intérêt représentatives des profils d'intensités moléculaires de l'échantillon ; et d) on caractérise un arrangement spatial des ions du profil moléculaire d'une région d'intérêt par des caractéristiques morphométrique et/ou de texture dudit profil moléculaire.
13. Méthode de caractérisation d'un échantillon par ISM selon l'une des 10 à 12, comprenant l'étape selon laquelle :
e) on réaliser une base de données (BDD) ou un modèle, comprenant des caractéristiques morphométriques et/ou de texture d'une pluralité d'ions dans ledit échantillon.
14. Méthode de caractérisation d'un échantillon par ISM selon la revendication 13, comprenant l'étape additionnelle selon laquelle :
f) on implémente la base de données (BDD) ou le modèle avec les données spectrales d'ISM d'au moins un ion dans ledit échantillon, et/ou des données physicochimiques, physiologiques et/ou biologiques propres audit échantillon.
15. Utilisation d'une base de données ou d'un modèle obtenu selon la méthode de caractérisation de la revendication 13 ou 14, pour l'identification d'un tissu, d'une région d'un tissu, d'un type cellulaire, d'un état physiologique (sain ou pathologique) d'un tissu ou le comptage cellulaire dans un échantillon biologique.
16. Procédé d'identification d'un échantillon par imagerie par spectrométrie de masse dans lequel:
i) On caractérise l'arrangement spatial d'au moins un ion dans l'échantillon à identifier à partir de données d'ISM dudit ion dans ledit échantillon pour identifier des caractéristiques morphologiques et/ou des caractéristiques de texture dudit ion dans ledit échantillon à identifier ;
ii) On enregistre les caractéristiques morphométriques et/ou de texture obtenues à l'étape i) ;
iii) On compare les caractéristiques morphométriques et/ou de textures associées audit au moins un ion de l'échantillon à identifier avec des données morphométriques et/ou de textures associées à un ion de référence.
17. Procédé d'identification d'un échantillon par ISM selon la revendication 16, comprenant l'étape additionnelle selon laquelle on établit une base de données ou un modèle avec des données morphométriques et/ou de texture associées à au moins un ion de référence, obtenues à partir de plusieurs échantillons de référence, lesdites données morphométriques et/ou de texture étant représentatives de l'arrangement spatial dudit au moins un ion de référence dans lesdits échantillons de référence, l'étape iii) étant mise en œuvre en comparant les caractéristiques morphométriques et/ou de textures associées audit au moins un ion de l'échantillon à identifier avec les données de la base de données ou du modèle.
18. Support de données lisible par ordinateur comprenant des instructions exécutables par l'ordinateur, adaptées pour permettre à un système informatique d'exécuter au moins une étape du procédé d'identification d'une molécule d'intérêt dans un échantillon selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, et/ou au moins une étape de la méthode de caractérisation d'un échantillon selon les revendications 10 à 14, et/ou au moins une étape du procédé d'identification d'un échantillon selon la revendication 16 ou 17.
19. Support de données lisible par ordinateur selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comporte une base de données comprenant des données morphologiques et/ou de texture d'au moins un ion dans au moins un échantillon.
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