WO2016018117A1 - 면역억제활성 없이 신경재생활성이 유지되는 fk506 유도체 및 그의 용도 - Google Patents

면역억제활성 없이 신경재생활성이 유지되는 fk506 유도체 및 그의 용도 Download PDF

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권호정
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Definitions

  • the present invention relates to a FK506 derivative having no immunosuppressive activity and maintaining neuronal regeneration activity, a method for preparing the same, and a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurological disease including the same.
  • FK506 also known as tacrolimus or fujimycin, is a 23-member macrocyclic lactam that can be isolated from Streptomyces tsukubaensis .
  • FK506 and similar drugs are known to interact with cytoplasmic immunophilin proteins, called FK506-binding proteins (FKBPs), to modify several biochemical reactions (Kang, CB et al. , Neurosignals 2008).
  • FKBPs cytoplasmic immunophilin proteins
  • FK506 prevents clinically allograft rejection (Kino, H. et al., J. Antibiot. 1987; Kino, H. et al., J. Antibiot. 1987; Fung, JJ et al., Transplantation 2004), which is used as an immunosuppressive agent for treating autoimmune diseases such as atopy (Parsons, WH et al., Ann. NY Acad. Sci. 1993).
  • FK506 is a key enzyme in the signaling of T cell receptors and inhibits the activity of calcineurin, which inhibits T lymphocyte activity.
  • FK506 the chemical structure of FK506 is characterized by the effector region binding to calcineurin (Goulet, MT et al., Perspect. Drug Discov. 1994; Parsons, WH et al., Ann. NY Acad. Sci. 1993; Griffith, JP et al., Cell 1995), which can be divided into two types of binding sites that form complexes with FKBPs.
  • FKBP binding sites include pipecolate moiety, tricarbonyl group, cyclohexane ring and play an important role in complex formation with FKBP12 protein. This allows the remaining site of action to freely bind calcineurin to form a three-part conjugate.
  • FK506 binds to FKBP12 protein.
  • the complex can interact with calcineurin (Goulet, MT et al., Perspect. Drug Discov. 1994; Parsons, WH et al., Ann. NY Acad. Sci. 1993 ). Therefore, due to the interaction of the FK506-FKBPs complex with calcineurin, interleukin 2, which is mediated by T cell proliferation, is inhibited, resulting in immunosuppressive action.
  • FK506 is synthesized by PKS / NRPS (polyketide synthase / nonribosomal peptide synthetase) complex system.
  • the biosynthesis process proceeds with a starting material of DHCHC (4,5-dihydroxycyclohex-1-ene carboxylic acid) derived from chorismate, and the DHCHC is a two-molecule malonyl-CoA (malonyl-CoA), 10 steps with two molecules of methoxymalonyl-acyl carrier proteins (ACP), five molecules of methylmalonyl-CoA, and arylmalonyl-CoA (allylmalonyl-CoA) And condensation process (Andexer, JN et al., Proc.
  • the elongated material is condensed into a linear polyketide chain by the action of FfbL pipepelate from lysine and FkbP, NRPS, and cyclized to produce a macrolide ring.
  • the ring is further modified by the process after the PKS modification.
  • O-methylation occurs on carbon 31 by FkbM (S-adenosylmethionine (SAM) -dependent methyltransferase) or oxidation on carbon 9 by FkbD (P450 hydroxylase).
  • FK506 or derivatives thereof in addition to the immunosuppressive activity, antifungal (Nakagawa, H. et al, Clin. Drug Invest. 1996), anti-inflammatory (Migita, K. et al., Curr. Med. Chem. 2003) , Neuroprotective and neuronal regeneration effects (Gold, BG Expert Opin. Invest. Drugs 2000; Gold, BG et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999) have been reported. However, in spite of the pharmacological activity, immunosuppressive activity appears, which is difficult to use for general patients requiring an immune response.
  • the present inventors have made diligent efforts to identify the characteristics of various FK506s involved in the pathways following the PKS modification.
  • the novel FK506 derivative 9-deoxo-proyl-FK506 A method for producing 9-deoxo-prolyl-FK506 was identified and the FK506 derivative 9-deoxo-prolyl-FK506, 31-O-dimethyl-FK506 (31-O-demethyl-FK506), or 9-de It is confirmed that oxo-31-O-dimethyl FK506 (9-deoxo-31-O-demethylFK506) has a neuronal regeneration and neuroprotective effect without showing immunosuppressive activity and thus can be used for the treatment of neurological diseases. Completed.
  • the main object of the present invention is not immunosuppressive activity, any one selected from the group consisting of 31-O-dimethyl-FK506, 9-deoxo-31-O-dimethylFK506, or 9-deoxo-prolyl-FK506 It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of diseases of the nervous system, comprising the FK506 derivative of.
  • Another object of the present invention is fkbD To provide a method for preparing 9-deoxo-prolyl-FK506, comprising culturing a strain of Streptomyces sp.
  • Another object of the present invention is to provide 9-deoxo-prolyl-FK506, an isomer thereof or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is not immunosuppressive activity, any one selected from the group consisting of 31-O-dimethyl-FK506, 9-deoxo-31-O-dimethylFK506, or 9-deoxo-prolyl-FK506 It is to provide a composition for promoting nerve regeneration, comprising one FK506 derivative.
  • compositions comprising 9-deoxo-proyl-FK506, 31-O-dimethyl-FK506, or 9-deoxo-31-O-dimethylFK506 according to the present invention can promote neuronal regeneration and immunosuppressive activity None, can reduce side effects in the treatment of neurological diseases.
  • Figure 2 shows the results of ESI-MS / MS analysis of 9-deoxo-proyl-FK506, (A) shows the ESI-MS / MS fragment pattern, (B) shows the MS / MS spectrum.
  • FIG. 3A and 3B show NMR spectra of 9-deoxo-proyl-FK506 dissolved in CDCl 3 , FIG. 3A shows a 1 H NMR spectrum, and FIG. 3B shows a 13 C NMR spectrum.
  • FIGS 5A-5C show the results of COSY and HMBC analysis of 9-deoxo-prolyl-FK506,
  • FIG. 5A shows the COSY and major HMBC correlation of the compound, and
  • FIG. 5B dissolved in CDCl 3 .
  • FIG. 5C shows HMBC spectrum for 9-deoxo-proyl-FK506 dissolved in CDCl 3 .
  • Figure 6 shows the immunosuppressive activity of 9-deoxo-proyl-FK506 compared to FK506.
  • Figure 7a shows the neuronal regeneration activity of 9-deoxo-proyl-FK506 compared to FK506
  • Figure 7b shows neurites grown in PC12 cells treated with 9-deoxo-proyl-FK506.
  • Figure 9a shows the neuronal regeneration activity of 31-O-dimethyl-FK506 compared to FK506,
  • Figure 9b shows neurites grown in PC12 cells treated with 31-O-dimethyl-FK506.
  • FIG. 11A shows the neuronal regeneration activity of 9-deoxo-31-O-dimethylFK506 compared to FK506.
  • FIG. 11B shows neurites grown in PC12 cells treated with 9-deoxo-31-O-dimethylFK506. will be.
  • the present invention is a novel derivative of FK506 represented by the following formula (1), 9-deoxo-proyl-FK506 represented by the formula (2), isomers thereof or pharmaceutical Provide acceptable salts.
  • the present invention provides a method for producing the 9-deoxo-proyl-FK506.
  • the manufacturing method is fkbD (P450 hydroxylase) gene may be comprising the step of culturing the strain Streptomyces genus.
  • the FkbD enzyme which acts in the post-PKS modification process, is known to cause oxidation to carbon 9, but no association with the prolyl group has been reported.
  • the preparation method distributes the supernatant centrifuged from the culture medium of the fkbD gene deficient strain using ethyl acetate, and using 60% aqueous methanol, by preparative reversed-phase HPLC. Fractionation may be further included.
  • the method may further include performing semi-preparative reverse phase chromatography with 50% aqueous acetonitrile after the fractionation step.
  • the strain for producing 9-deoxo-proyl-FK506 may be a strain of the genus Streptomyces capable of producing FK506 in living organisms.
  • the strain is Streptomyces sp. KCTC 11604BP, Streptomyces kanamyceticus KCTC 9225 Streptomyces genus ATCC 55098, Actinomycetes No. 9993 ( Streptomyces tsukubaensis No.
  • Streptomyces genus ATCC 53770 Streptomyces genus 6260, Streptomyces genus 49A, Streptomyces genus 94128, Streptomyces glaucescens MTCC 5115 and Streptomyces genus BICC7522 It may be selected, but is not limited to any strain that can produce FK506 can be used.
  • the strain may be cultured in a medium containing nutrients that microorganisms can use.
  • Nutrients of the strain can be used without limitation, nutrients commonly used in the art, for example, can be cultured in a medium containing malonic acid, ethanol, methionine, carbon source and nitrogen source. .
  • the present inventors have carried out a physicochemical analysis of a substance prepared by inactivating the fkbD gene of KCTC11604BP , a strain producing FK506, through inframe deletion by double cross-over homologous recombination. As a result of identification, the substance was confirmed to be 9-deoxo-prolyl-FK506, a novel derivative of FK506.
  • the compounds of the present invention may include isomers or pharmaceutically acceptable salts thereof.
  • Isomers refer to relationships of compounds having the same chemical formula, but not identical, and include, for example, structural isomers, geometric isomers, optical isomers (enantiomers), stereoisomers, and diastereomers of 9-deoxo-prolyl-FK506. Can be.
  • Pharmaceutically acceptable salts are concentrations that are relatively nontoxic and harmless to the patient, and any organic or inorganic side effects caused by these salts do not degrade the beneficial efficacy of 9-deoxo-prolyl-FK506. It can mean an addition salt.
  • the salt may be an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid.
  • Acid addition salts can be prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • the salt may be a pharmaceutically acceptable metal salt prepared using a base.
  • the compounds of the invention may be in the form of solvates or prodrugs, which are included within the scope of the invention.
  • Solvates may preferably include hydrates and ethanolates.
  • the compounds of the present invention may be synthesized according to methods commonly used in the art, and may be produced from mutants using, for example, the preparation method of the present invention.
  • the present invention is the 9-deoxo-proyl-FK506, 31-O-dimethyl-FK506 represented by the following formula (3), or 9- represented by the following formula (4)
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating a neurological disease including any one of FK506 derivatives selected from the group consisting of deoxo-31-O-dimethyl FK506.
  • FK506 is a key enzyme in the signaling of T cell receptors and inhibits the activity of calcineurin, which inhibits T lymphocyte activity, thereby clinically preventing allograft rejection and treating autoimmune diseases such as atopy. It is used as an immunosuppressant. In addition to immunosuppressive activity, it has been reported to have antifungal, anti-inflammatory, neuroprotective and neuronal regeneration effects. However, in spite of the pharmacological activity, immunosuppressive activity appears, which is difficult to use for general patients requiring an immune response.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may exhibit a desired neurological disease treatment effect without suppressing an immune response.
  • the neurological disease may be a neurodegenerative disease.
  • Degenerative neuropathy is a disease that causes various symptoms of degenerative changes in nerve cells of the central nervous system.
  • dementia Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and advanced nuclear palsy ( Progressive supranuclear palsy, Multiple system strophy, Olive-pontocerebellar atrophy (OPCA), Shy-Drager syndrome; Striatonigral degeneration, Huntington's disease, Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Essential tremor, Corticobasal ganlionic degeneration, Diffuse Rui Diffuse Lewy body disease, Parkin-ALS-dementia complex of Guam, or Pick's disease.
  • ALS Amyotrophic lateral sclerosis
  • Essential tremor Corticobasal ganlionic degeneration
  • Diffuse Rui Diffuse Lewy body disease Parkin-ALS-dementia complex of Guam, or Pick's disease.
  • the neurological disease may include, but is not limited to, epilepsy, stroke, stroke, ischemic brain disease, spinal cord injury disease, peripheral nerve disease, behavioral disorder, developmental disorder, mental retardation, Down syndrome, or schizophrenia. .
  • the neurological disease may be a disease caused by nerve cell damage or cell death.
  • 9-deoxo-proyl-FK506, 31-O-dimethyl-FK506, or 9-deoxo-31-O-dimethylFK506 promotes the proliferation of neurites in PC12 cells, leading to nerve regeneration. It was confirmed that it can be used for promoting nerve regeneration or preventing or treating neurological diseases.
  • prevention may mean any action of inhibiting or delaying the onset of a neurological disease by administering to the individual a composition for preventing or treating a neurological disease according to the present invention.
  • treatment may refer to any action to improve or benefit the symptoms of neurological disease by administering the composition of the present invention to a subject suspected of developing a neurological disease.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may also be used as a single agent, and may be prepared and used as a complex preparation, further including a drug known to have a recognized neurological-related disease effect, and formulated using a pharmaceutically acceptable carrier or excipient unit. It may be prepared in a dosage form or incorporated into a multi-dose container.
  • the term "pharmaceutically acceptable carrier” may refer to a carrier or diluent that does not interfere with the biological activity and properties of the compound to be injected without stimulating the organism.
  • the kind of the carrier usable in the present invention is not particularly limited, and any carrier can be used as long as it is a conventionally used and pharmaceutically acceptable carrier in the art.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol and the like. These may be used alone or in combination of two or more thereof.
  • the carrier may include a non-naturally occuring carrier.
  • ком ⁇ онентs such as antioxidants, buffers and / or bacteriostatic agents may be added and used, and diluents, dispersants, surfactants, binders, lubricants, and the like may be additionally added to provide a solution such as an aqueous solution, a suspension, an emulsion, or the like. It may be formulated into a use formulation, pills, capsules, granules or tablets.
  • compositions of the present invention may comprise a pharmaceutically effective amount of 9-deoxo-proyl-FK506, 31-O-dimethyl-FK506, or 9-deoxo-31-O-dimethylFK506.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, generally in an amount of 0.001 to 1000 mg / kg, preferably 0.05 The amount of to 200 mg / kg, more preferably 0.1 to 100 mg / kg may be administered once to several times daily.
  • the specific therapeutically effective amount for a particular patient is determined by the specific composition, including the type and extent of the reaction to be achieved, whether or not other agents are used in some cases, the age, weight, general health of the patient, It is desirable to apply differently depending on various factors and similar factors well known in the medical field, including sex and diet, time of administration, route of administration and rate of composition, duration of treatment, drugs used with or co-specific with the specific composition.
  • compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. And single or multiple administrations. In consideration of all the above factors, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect in a minimum amount without causing side effects, and can be easily determined by those skilled in the art.
  • the term "administration" refers to introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a patient in any suitable manner, the route of administration of the composition of the present invention being oral or parenteral as long as it can reach the target tissue. Administration can be via a variety of routes.
  • the mode of administration of the pharmaceutical composition according to the present invention is not particularly limited, and may be in accordance with methods commonly used in the art.
  • the composition may be administered by oral or parenteral administration.
  • the pharmaceutical compositions according to the invention may be prepared in various formulations depending on the desired mode of administration.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be administered, for example, 1 to 20 mg / kg, more preferably 1 to 10 mg / kg, per day to a mammal, including a human, of a pharmaceutical composition of the present invention,
  • the frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited, but may be administered once a day or several times in divided doses.
  • the present invention has no immunosuppressive activity, the 9-deoxo-proyl-FK506, 31-O-dimethyl-FK506, or 9-deoxo-31-O
  • a composition for promoting nerve regeneration comprising any one of FK506 derivatives selected from the group consisting of -dimethyl FK506.
  • the composition may be used as a composition for promoting the generation of protuberances of neurons in vitro.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a neurological disease comprising administering to the subject the pharmaceutical composition or a composition for promoting nerve regeneration.
  • the term "individual” may mean any animal, including a human, with or possibly having a neurological disease.
  • the animal may be a mammal such as, but not limited to, a human, a cow, a horse, a sheep, a pig, a goat, a camel, a antelope, a dog, a cat, and the like, which require treatment of similar symptoms.
  • the prophylactic or therapeutic method of the present invention may specifically include administering the composition in a pharmaceutically effective amount to an individual with or at risk of developing a neurological disease.
  • the term "administration" refers to introducing the pharmaceutical composition of the present invention to a patient in any suitable manner, the route of administration of the composition of the present invention being oral or parenteral as long as it can reach the target tissue. Administration can be via a variety of routes.
  • FkbD of Streptomyces spp. KCTC11604BP a strain that produces FK506 according to the method described in Ban, YH et al. (J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098) ⁇ fkbD in-frame strains were prepared by inactivating genes through inframe deletion by double cross-over homologous recombination.
  • KCTC 11604BP spores and the gene of the strain deleted in fkbD ⁇ - were subcultured from a spore of a frame ISP4 agar plates seed (seed) cultures were prepared from the R2YE culture medium. 50 mg of vegetative cells grown in seed cultures were inoculated into 50 ml R2YE medium in a 250 ml baffled flask and 6 days at 28 ° C. on an orbital shaker (fixed at 180 rpm). Incubated for
  • Tracking by MS / MS selects mass pairs specific to the selected analyte to detect transitions from parent ions, such as ammonium adducts, to product ions. It was performed in various reaction monitoring modes.
  • fractions were then subjected to semipreparative reversed-phase HPLC with a flow rate of 2 mL / min, mobile phase 50% aqueous acetonitrile to separate the fractions into two small fractions. Purification of the small fraction under the same column and the same HPLC conditions resulted in an amorphous white powder (7.4 mg, t R 90 min).
  • Optical rotation was measured with a Jasco P-1010 polarimeter using a 0.1 dm path length cell.
  • UV spectra were recorded with a Scinco S-3100 spectrophotometer and IR spectra were obtained with a Varian FTS-800 FTIR spectrometer.
  • NMR spectra were recorded at 500 MHz for 1 hour using a Varian INOVA 500 spectrometer ( 13 C, 125 MHz). Chemical shifts are expressed in ppm with tetramethylsilane (TMS) as an internal reference. All NMR data was processed using Mnova software (Mestrelab Research SL). Samples for NMR analysis were prepared by dissolving pure compounds in 250 ⁇ L of CDCl3 (Sigma) and then placed in 5-mm Shigemi Advanced NMR microtubes (Sigma) matching the solvent.
  • HR-ESI-MS data was collected using a Waters SYNAPT G2 mass spectrometer combined with UPLC.
  • HPLC purification was pre-separated on an Acme 9000 HPLC system (YL Instrument Co. Ltd., Korea) consisting of an SP930D gradient pump connected to a UV730D UV detector set (205 nm) and a CTS30 column oven set (50 ° C). It was performed using a Watchers 120 ODS-BP (250 ⁇ 10 mm, 5 ⁇ m) column.
  • HPLC grade solvents used in the experiment were purchased from J. T. Baker.
  • Example 2 Observation Results for Example 1
  • Figure 1 shows the HPLC-ESI-MS analysis of the culture extract of the ⁇ fkbD in - frame strain, the ammonium adduct ion peak at m / z 793.1, 13 minutes and m / z 807.1, 28 minutes.
  • the fragment ions shown in 776.1, 758.1, 740.1, and 547.9 shown in Fig. 2 the peaks appearing at m / z 793.1 and 13 minutes were predicted to be due to 9-deoxo-prolyl-FK506.
  • the chip pattern of 9-deoxo-prolyl-FK506 is similar to 9-deoxo-FK506 in that the distance between each chip ion is 14 Da.
  • 9-deoxo-proyl-FK506 has one less methylene group in the distinct C-1-C-24 membrane compared to 9-deoxo-FK506 and other 9-deoxo-FK506 derivatives.
  • the amorphous white solid ie 9-deoxo-prolyl-FK506, comprises proline.
  • characteristic signals of the FK506 skeleton were observed in the 1 H NMR spectrum analysis. Specifically, three doublets corresponding to the methyl group ( ⁇ H 0.95 / H 3 -38, 0.90 / H 3 -41, 0.75 / H 3 -39), two methyl singlets ( ⁇ H 1.67 / H3-40, 1.66 / H3-42), three methoxy singlets ( ⁇ H 3.40 / H3-45, 3.37 / H3-43, 3.36 / H3-44), and multiples of olefin protons ( ⁇ H 5.70 / H-36) It became.
  • the compound is ⁇ C 58.9 / C-2 ( ⁇ H 4.35 / H-2), 47.4 / C-6 ( ⁇ H 3.63 / H -6a, 3.54 / H-6b), 29.2 / C-3 ( ⁇ H 2.19 / H-3a, 1.98 / H-3b), 24.7 / C-4 ( ⁇ H 1.96 / H2-4), ie only 5 Since it shows two carbon signals, it can be confirmed that the compound has a proline residue instead of the pipecolate.
  • These proton signals show HMBC correlations for C-8 ( ⁇ C 171.8) and C-10 ( ⁇ C 98.6) (FIGS. 5A and 5C), with the compound being 9-like with 9-deoxo-FK506. It is shown that it is a deoxo-prolyl-FK506 derivative.
  • the COSY spectrum for the compound shows the remaining 4 spin systems and is linked based on the HMBC correlation (FIGS. 5A-5C).
  • the positions of the methyl and methoxy groups were determined as in FIG. 5A based on the relative HMBC correlation.
  • the compound was determined as 9-deoxo-prolyl-FK506.
  • 9-deoxo-prolyl-FK506 derivatives comprising a proline side branch in place of the general pipecolate ring.
  • the stereochemical structure of the compound is the same as that of the parent compound FK506.
  • fkbD from Streptomyces sp. KCTC11604BP The amorphous white powder isolated from the culture of the strain in which the gene was inactivated through in-frame deletion was determined as 9-deoxo-prolyl-FK506 with the following catabolistic properties.
  • (+)-MS / MS m / z 776.1, 758.1, 740.1, 547.9;
  • Relative immunosuppressive properties of the compound 9-deoxo-prolyl-FK506 compared to the actual FK506 were determined using Mo, SJ et al. (J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 976-985) using T lymphocytes. It was determined by the method described in). Briefly, CD3 / CD28-activated human T-cells were treated with the compound at a concentration of 0.1 nM for 16-20 hours and then the amount of interleukin-2 secretion was quantified.
  • Relative neuronal regeneration activity of this compound compared to the actual FK506 was determined by the method described in Mo, SJ et al. (J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 976-985) using rat PC12 cells (pheochromocytoma cells). .
  • Nerve growth factor (NGF; KOMA Biotech; 10 ng / ml) inducing neurite outgrowth in PC12 cells was treated for 96 hours. At this time 10 nM FK506 or 9-deoxo-prolyl-FK506 were treated or excluded together. The length of neurites was measured by a method described in Revill, W. P. et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002, 302, 1278-1285) using print photographs.
  • 9-deoxo-proyl-FK506 (indicated by 1) according to the present invention exhibits an excellent neural proliferation promoting effect.
  • A is an untreated cell
  • B is a cell treated with nerve growth factor only
  • C is a cell treated with nerve growth factor in the presence of FK506
  • D is a nerve growth factor treated in the presence of 9-deoxo-prolyl-FK506.
  • A is an untreated cell
  • B is a cell treated with nerve growth factor only
  • C is a cell treated with nerve growth factor in the presence of FK506
  • D is a nerve growth factor treated in the presence of 9-deoxo-prolyl-FK506.
  • A is an untreated cell
  • B is a cell treated with nerve growth factor only
  • C is a cell treated with nerve growth factor in the presence of FK506
  • D is a nerve growth factor treated in the presence of 9-deoxo-prolyl-FK506.
  • FIG. 9B A is an untreated cell, B is a cell treated only with nerve growth factor, C is a cell treated with nerve growth factor in the presence of FK506, and D is a cell treated with nerve growth factor in the presence of 31-O-dimethyl-FK506. It is shown.
  • Relative immunosuppressive properties of the compound 9-deoxo-31-O-dimethyl FK506 compared to the actual FK506 was determined in the same manner as in Example 3. (1).
  • FIG. 11B A is an untreated cell, B is a cell treated only with nerve growth factor, C is a cell treated with nerve growth factor in the presence of FK506, and D is nerve growth in the presence of 9-deoxo-31-O-dimethyl-FK506.
  • the cells treated with the factor are shown.
  • composition comprising 9-deoxo-proyl-FK506, 31-O-dimethyl-FK506, or 9-deoxo-31-O-dimethylFK506 according to the present invention can promote neuronal regeneration and immunosuppressive Inactivity, it can reduce side effects in treating neurological diseases.
  • composition according to the present invention can promote nerve regeneration and has no immunosuppressive activity, and thus can be effectively used for treating neurological diseases.

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Abstract

본 발명은 면역억제활성이 없고 신경재생활성은 유지되는 FK506 유도체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 9-데옥소-프로릴-FK506, 31-O-디메틸-FK506, 또는 9-데옥소-31-O-디메틸FK506을 포함하는 조성물은 신경 재생을 촉진할 수 있으며 면역억제활성이 없어, 신경계 질환 치료에 있어 부작용을 감소시킬 수 있다.

Description

면역억제활성 없이 신경재생활성이 유지되는 FK506 유도체 및 그의 용도
본 발명은 면역억제활성이 없고 신경재생활성은 유지되는 FK506 유도체, 이의 제조방법, 이를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
타크롤리무스(tacrolimus) 또는 푸지마이신(fujimycin)으로 알려진 FK506는 23원자의 대환식 락탐(23-member macrocyclic lactam)으로, 스트렙토마이시스 쯔꾸바엔시스(Streptomyces tsukubaensis)에서 분리될 수 있다. FK506 및 이와 유사한 약물은, FK506-결합 단백질(FK506-binding protein; FKBPs)로 일컬어지는 세포질 이뮤노필린 단백질(cytoplasmic immunophilin proteins)과 상호작용하여 여러 생화학 반응을 변형시킨다고 알려져 있다(Kang, C. B. et al., Neurosignals 2008).
특히 FK506는 임상적으로 동종이식편 거부반응을 방지하고(Kino, H. et al., J. Antibiot. 1987; Kino, H. et al., J. Antibiot. 1987; Fung, J. J. et al., Transplantation 2004), 아토피와 같은 자가면역질환을 치료하기 위한(Parsons, W. H. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1993) 면역억제제로 사용되고 있다. FK506는 T 세포 수용체의 신호전달에 있어 핵심효소이며 T 림프구 활성을 억제하는 칼시뉴린(calcineurin)의 활성을 억제한다.
FK506의 면역억제 활성의 기작에 대한 구체적인 연구를 살펴보면, FK506의 화학구조는 칼시뉴린에 결합하는 작용 부위(effector region)와(Goulet, M. T. et al., Perspect. Drug Discov. 1994; Parsons, W. H. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1993; Griffith, J. P. et al., Cell 1995), FKBPs와 복합체를 형성하는 결합 부위의 2가지로 나누어 질 수 있다. FKBP 결합 부위는 피페콜레이트 곁사슬(pipecolate moiety), 트리카르보닐 그룹(tricarbonyl group), 사이클로헥산 링을 포함하며, FKBP12 단백질과의 복합체 형성에 중요한 역할을 한다. 이는 나머지 부분인 작용 부위가 자유롭게 칼시뉴린과 결합할 수 있도록 함으로써 3부위로 된 결합체를 형성하도록 한다.
상기 면역억제 작용을 나타내기 위하여, 제일 처음으로 FK506이 FKBP12 단백질과 결합하는 것이 중요하다. 상기 2 부분으로 이루어진 복합체가 형성되면, 상기 복합체는 칼시뉴린과 상호작용할 수 있다(Goulet, M. T. et al., Perspect. Drug Discov. 1994; Parsons, W. H. et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 1993). 따라서, FK506-FKBPs 복합체의 칼시뉴린과의 상호 작용으로 인하여 T 세포 증식에 의해 매케된 인터루킨 2가 억제되어 면역억제 작용이 일어난다.
한편, FK506은 PKS/NRPS(polyketide synthase/nonribosomal peptide synthetase) 복합 시스템에 의해 합성된다. 상기 생합성 과정은 코리스메이트(chorismate)에서 유래한 DHCHC (4,5-dihydroxycyclohex-1-ene carboxylic acid)를 시작물질로 하여 진행되며, 상기 DHCHC는 2분자의 말로닐-CoA(malonyl-CoA), 2분자의 메톡시말로닐-아실 운반 단백질(methoxymalonyl-acyl carrier proteins; ACP), 5분자의 메틸말로닐-CoA(methylmalonyl-CoA), 및 아릴말로닐-CoA (allylmalonyl-CoA)를 이용한 10 단계의 축합과정을 거쳐 연장된다(Andexer, J. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2011; Mo, S. J. et al., J. Am. Chem. Soc. 2011). 상기 연장된 물질은, FfbL의 작용에 의해 라이신에서 유래한 피페콜레이트와, NRPS인 FkbP에 의해 선형 폴리케타이드 체인으로 축합되고, 매크롤라이드 고리를 생산하기 위하여 고리화 된다. 상기 고리는 PKS 변형 이후 과정에 의해 더욱 수정된다. 예를 들어 FkbM (S-adenosylmethionine (SAM)-dependent methyltransferase)에 의해 31번 탄소에 O-메틸화(O-methylation)가 일어나거나, FkbD (P450 hydroxylase)에 의해 9번 탄소에 산화(oxidation)가 일어날 수 있다(Motamedi, H. et al., J. Bacteriol. 1996; Shafiee, A. et al., J. Antibiot. 1997).
최근, 본 발명자들은 모든 FK506 생합성 중간체의 특성을 고려하여, PKS 변형 이후의 경로(post-PKS modification)가 2개의 독립적인 병렬적 경로를 포함하는 것으로 정립한바 있다(Ban, Y. H. et al., J. Nat. Prod. 2013).
한편, FK506 또는 그의 유도체는 상기 면역억제 활성 외에도, 항진균(Nakagawa, H. et al,, Clin. Drug Invest. 1996), 항염증(Migita, K. et al., Curr. Med. Chem. 2003), 신경보호 및 신경재생 효과(Gold, B. G. Expert Opin. Invest. Drugs 2000; Gold, B. G. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1999)가 보고된 바 있다. 그러나 상기 약리활성에도 불구하고 면역억제활성이 나타나므로 면역 반응을 필요로 하는 일반 환자에게는 사용하기 어렵다는 문제가 있었다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 PKS 변형 이후의 경로에 관여하는 여러 가지 FK506의 특성을 확인하고자 예의 연구 노력한 결과, FK506 생합성 유전자의 결손을 통해 신규한 FK506 유도체인 9-데옥소-프로릴-FK506 (9-deoxo-prolyl-FK506)을 생산하는 방법을 확인하였으며, FK506 유도체인 9-데옥소-프로릴-FK506, 31-O-디메틸-FK506(31-O-demethyl-FK506), 또는 9-데옥소-31-O-디메틸FK506(9-deoxo-31-O-demethylFK506)이 면역억제활성을 나타내지 않으면서도 신경 재생 및 신경보호 효과가 있어 이를 신경질환 치료 용도로 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 면역억제활성이 없으며, 31-O-디메틸-FK506, 9-데옥소-31-O-디메틸FK506, 또는 9-데옥소-프로릴-FK506으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 FK506 유도체를 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 fkbD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 9-데옥소-프로릴-FK506의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 9-데옥소-프로릴-FK506, 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 면역억제활성이 없으며, 31-O-디메틸-FK506, 9-데옥소-31-O-디메틸FK506, 또는 9-데옥소-프로릴-FK506으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 FK506 유도체를 포함하는, 신경 재생 촉진용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 9-데옥소-프로릴-FK506, 31-O-디메틸-FK506, 또는 9-데옥소-31-O-디메틸FK506을 포함하는 조성물은 신경 재생을 촉진할 수 있으며 면역억제활성이 없어, 신경계 질환 치료에 있어 부작용을 감소시킬 수 있다.
도 1은 fkbD 유전자를 인-프레임 결실을 통하여 비활성화시킨 균주(△fkbDin -frame 균주)에서 얻은 9-데옥소-프로릴-FK506의 HPLC ESI-MS 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 9-데옥소-프로릴-FK506의 ESI-MS/MS 분석결과를 나타낸 것으로, (A)는 ESI-MS/MS 조각 패턴을, (B)는 MS/MS 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3a 및 도 3b는 CDCl3에 용해된 9-데옥소-프로릴-FK506에 대한 NMR 스펙트럼 결과로, 도 3a는 1H NMR 스펙트럼, 도 3b는 13C NMR 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 CDCl3에 용해된 9-데옥소-프로릴-FK506에 대한 HSQC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 5a 내지 도 5c는 9-데옥소-프로릴-FK506의 COSY 및 HMBC 분석 결과를 나타낸 것으로, 도 5a는 상기 화합물의 COSY 및 주요 HMBC 상관관계를 도시한 것이고, 도 5b는 CDCl3에 용해된 9-데옥소-프로릴-FK506에 대한 COSY 스펙트럼을, 도 5c는 CDCl3에 용해된 9-데옥소-프로릴-FK506에 대한 HMBC 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 6은 FK506과 비교한 9-데옥소-프로릴-FK506의 면역억제활성을 나타낸 것이다.
도 7a는 FK506과 비교한 9-데옥소-프로릴-FK506의 신경 재생 활성을 나타낸 것이며, 도 7b는 9-데옥소-프로릴-FK506을 처리한 PC12 세포에서 자라난 신경 돌기를 나타낸 것이다.
도 8은 FK506과 비교한 31-O-디메틸-FK506의 면역억제활성을 나타낸 것이다.
도 9a는 FK506과 비교한 31-O-디메틸-FK506의 신경 재생 활성을 나타낸 것이며, 도 9b는 31-O-디메틸-FK506을 처리한 PC12 세포에서 자라난 신경 돌기를 나타낸 것이다.
도 10은 FK506과 비교한 9-deoxo-31-O-디메틸FK506의 면역억제활성을 나타낸 것이다.
도 11a는 FK506과 비교한 9-deoxo-31-O-디메틸FK506의 신경 재생 활성을 나타낸 것이며, 도 11b는 9-deoxo-31-O-디메틸FK506을 처리한 PC12 세포에서 자라난 신경 돌기를 나타낸 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 FK506의 신규한 유도체인, 하기 화학식 2로 표시되는 9-데옥소-프로릴-FK506, 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2015008031-appb-I000001
[화학식 2]
Figure PCTKR2015008031-appb-I000002
상기의 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 9-데옥소-프로릴-FK506의 제조방법을 제공한다.
일 예로 상기 제조방법은 fkbD (P450 hydroxylase) 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. PKS 변형 이후 과정에서 작용하는 FkbD 효소는 9번 탄소에 산화(oxidation)를 일으키는 것으로 알려져 있으나, 프로릴(prolyl) 기와의 연관성에 대해서는 보고된바 없다.
다른 일 예로 상기 제조방법은 fkbD 유전자 결손 균주의 배양액을 원심분리한 상등액을 에틸아세테이트를 이용하여 분배하고, 60% 수성 메탄올을 사용하여, 프레퍼레티브 역상 크로마토그래피(preparative reversed-phase HPLC)에 의해 분획하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또 다른 일 예로, 상기 분획 단계 후 50% 수성 아세토니트릴(acetonitrile)로 반-프레퍼레티브 역상 크로마토그래피하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
한편, 상기 9-데옥소-프로릴-FK506를 제조하기 위한 균주는 생물체 내에서 FK506를 생산할 수 있는 스트렙토마이세스 속 균주일 수 있다. 예를 들어 상기 균주는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCTC 11604BP, 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) KCTC 9225 스트렙토마이세스 속 ATCC 55098, 방선균 No. 9993(Streptomyces tsukubaensis No. 9993), 스트렙토마이세스 속 ATCC 53770, 스트렙토마이세스 속 6260, 스트렙토마이세스 속 49A, 스트렙토마이세스 속 94128, 스트렙토마이세스 글라우세센스(Streptomyces glaucescens) MTCC 5115 및 스트렙토마이세스 속 BICC7522로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 FK506를 생산할 수 있는 균주라면 어느 것이든지 사용할 수 있다.
상기 균주는 미생물이 사용할 수 있는 영양원을 포함하는 배지에서 배양될 수 있다. 균주의 영양원으로는 당업계에서 통상적으로 사용되는 영양원을 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들어, 말로닉산(malonic acid), 에탄올, 메치오닌(methionine), 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다.
본 발명자들은 FK506를 생산하는 균주인 스트렙토마이시스 속 KCTC11604BP의 fkbD 유전자를 이중교차 상동 재조합(double cross-over homologous recombination)에 의한 인프레임(inframe) 결실을 통하여 비활성화하여 제조되는 물질을 이화적 분석을 이용하여 동정한 결과, 상기 물질이 FK506의 신규한 유도체인 9-데옥소-프로릴-FK506임을 확인하였다.
분석된 9-데옥소-프로릴-FK506의 이화적 특성은 다음과 같다: (a) 비정형 흰색 분말; (b) 비선광도(Specific Rotation): [a]23 D = 1.64 (c=0.1, 메탄올); (c) UV 흡수 스펙트럼(메탄올): λmax 가 (log e) 227 nm (2.0); (d) IR 흡수 스펙트럼(film): νmax 가 3450, 2960, 1750, 1640, 1170, 1050 cm-1; (e) 1H, 13C-NMR: 표 1로 표시; (f) (+)-ESI-MS: m/z 793.1 [M + NH4]+; (+)-MS/MS: m/z 776.1, 758.1, 740.1, 547.9; (+)-HR-ESI-MS: m/z 776.4940 [M + H]+ ; 및 (g) 분자식 및 분자량: C43H70NO11, 776.4949.
하나의 구체예로서, 본 발명의 화합물은 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함할 수 있다.
이성질체란 화학식은 같으나 동일하지는 않은 화합물의 관계를 의미하며, 예를 들어 9-데옥소-프로릴-FK506의 구조 이성질체, 기하 이성질체, 광학 이성질체(거울상이성질체), 입체이성질체, 부분 입체이성질체를 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 염은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서, 이 염에 기인한 부작용이 9-데옥소-프로릴-FK506의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미할 수 있다. 예를 들어 상기 염은 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염일 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 동 몰량의 화합물 및 물중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조된 것일 수 있다. 이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 염은 염기를 사용하여 제조된 약학적으로 허용가능한 금속염일 수 있다.
또 하나의 구체예로서, 본 발명의 화합물은 용매화물 또는 전구약물(pro-drug) 형태일 수 있으며, 이는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 용매화물은 바람직하게는 수화물 및 에탄올화물을 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 합성할 수 있으며, 일 예로 본 발명의 제조방법을 사용하여 변이주로부터 생산할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 9-데옥소-프로릴-FK506, 하기 화학식 3으로 표시되는 31-O-디메틸-FK506, 또는 하기 화학식 4로 표시되는 9-데옥소-31-O-디메틸FK506으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 FK506 유도체를 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 3]
Figure PCTKR2015008031-appb-I000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2015008031-appb-I000004
FK506는 T 세포 수용체의 신호전달에 있어 핵심효소이며 T 림프구 활성을 억제하는 칼시뉴린(calcineurin)의 활성을 억제하므로, 임상적으로 동종이식편 거부반응을 방지하고 아토피와 같은 자가면역질환을 치료하기 위한 면역억제제로 사용되고 있다. 또한 면역억제 활성 외에도, 항진균, 항염증, 신경보호 및 신경재생 효과가 있다고 보고된 바 있다. 그러나 상기 약리활성에도 불구하고 면역억제활성이 나타나므로 면역 반응을 필요로 하는 일반 환자에게는 사용하기 어렵다는 문제가 있었다.
본 발명자들은 CD3/CD28-활성화한 인간 T-세포에 9-데옥소-프로릴-FK506, 31-O-디메틸-FK506, 또는 9-데옥소-31-O-디메틸FK506를 처리한 결과, 정상군에 이를 정도로 인터루킨-2의 분비가 현저히 증가한 것을 확인하였다. 또한 상기 FK506 유도체가 우수한 신경 재생 활성을 나타냄을 확인하였다. 따라서 본 발명에 따른 약학 조성물은 면역 반응을 억제하지 않으면서도 원하는 신경계 질환 치료 효과를 나타낼 수 있다.
일 예로 상기 신경계 질환은 퇴행성 신경질환일 수 있다. 퇴행성 신경 질환은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러 가지 증상을 유발하는 질환을 의미하는 것으로, 예를 들어 치매, 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨 병(Parkinson's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(Multiple system strophy), 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(Olivopontocerebellar atrophy: OPCA), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome); 선조체-흑질 퇴행증 (Striatonigral degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis;ALS), 본태성 진전증(Essential tremor), 피질-기저핵 퇴행증(Corticobasal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨스-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam) 또는 픽병(Pick's disease)일 수 있다.
다른 일 예로 상기 신경계 질환은 간질, 중풍, 뇌졸중, 허혈성 뇌질환, 척수 손상 질환, 말초신경질환, 행동 장애, 발달장애, 정신 지체, 다운증후군 또는 정신분열증을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 일 예로 상기 신경계 질환은 신경세포 손상 또는 세포 사멸 등을 원인으로 하는 질환일 수 있다.
본 발명자들은 9-데옥소-프로릴-FK506, 31-O-디메틸-FK506, 또는 9-데옥소-31-O-디메틸FK506가 PC12 세포에서 신경돌기의 증식을 촉진하여 신경의 재생을 유도하므로, 이를 신경 재생 촉진 용도 또는 신경계 질환 예방 또는 치료 용도로 사용할 수 있음을 확인하였다.
본 발명에서 사용되는 용어, "예방"이란, 본 발명에 따른 신경계 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 개체에 투여하여 신경계 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"란, 본 발명의 상기 조성물을 신경계 질환 발병 의심 개체에 투여하여 신경계 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 단일제제로도 사용할 수 있고, 공인된 신경 관련 질환 효과를 가진다고 알려진 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있으며, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다. 상기 담체는 비자연적 담체 (non-naturally occuring carrier)를 포함할 수 있다.
또한, 필요한 경우 항산화제, 완충액 및/또는 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가하여 사용할 수 있으며, 희석제, 분산제, 계면 활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제 등으로 제제화하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 유효한 양의 9-데옥소-프로릴-FK506, 31-O-디메틸-FK506, 또는 9-데옥소-31-O-디메틸FK506을 포함할 수 있다. 본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 일반적으로 0.001 내지 1000 mg/kg의 양, 바람직하게는 0.05 내지 200 mg/kg, 보다 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 본 발명의 목적상, 특정 환자에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여할 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용을 유발하지 않으면서 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여 방식은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방식에 따를 수 있다. 상기 투여 방식의 비제한적인 예로, 조성물을 경구 투여 또는 비경구 투여 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 목적하는 투여 방식에 따라 다양한 제형으로 제작될 수 있다.
본 발명의 약학조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 포유동물에 하루 동안 1 내지 20 mg/kg, 보다 바람직하게는 1 내지 10mg/kg으로 투여할 수 있고, 본 발명의 조성물의 투여빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 면역억제활성이 없으며, 상기 9-데옥소-프로릴-FK506, 31-O-디메틸-FK506, 또는 9-데옥소-31-O-디메틸FK506으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 FK506 유도체를 포함하는, 신경 재생 촉진용 조성물을 제공한다.
일 예로 상기 조성물은 인 비트로(in vitro)에서 신경세포의 돌기 생성을 촉진하는 조성물로 사용될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위한 또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 약학 조성물 또는 신경 재생 촉진용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 신경계 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "개체"란, 신경계 질환이 발병되었거나 발병할 가능성이 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 이와 유사한 증상의 치료를 필요로 하는 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 상기 예방 또는 치료 방법은 구체적으로, 신경계 질환이 발병하였거나 발병할 위험이 있는 개체에 상기 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 재료의 준비 방법 및 조건
(1) 변이체의 제조 및 배양 조건
Ban, Y. H. 외(J. Nat. Prod. 2013, 76, 1091-1098)에 기재된 방법에 따라 FK506를 생산하는 균주인 스트렙토마이시스 속 KCTC11604BP의 fkbD 유전자를 이중교차 상동 재조합(double cross-over homologous recombination)에 의한 인프레임(inframe) 결실을 통하여 비활성화하여 △fkbDin-frame 균주를 제조하였다.
KCTC 11604BP 균주의 포자와 상기 유전자 결실된 △fkbDin - frame의 포자를 ISP4 아가 플레이트에서 계대배양하였고 씨드(seed) 배양은 R2YE 배양액에서 준비하였다. 씨드(seed) 배양에서 성장한 영양 세포(vegetative cell) 50mg를 250ml 바플드 플라스크(baffled flask)에 들어있는 50ml R2YE 배지에 접종하고, 오르비탈 쉐이커(orbital shaker, 180 rpm 고정)에서 28℃로 6일 동안 배양하였다.
(2) 추출 및 분리
상기 △fkbDin - frame 균주의 배양액 4L를 원심분리하고, 상등액을 에틸아세테이트를 이용하여 2회 용매-용매 분배(solvent-solvent partition) 하였다. 에틸아세테이트에 용해된 층을 분리하고, 감압 하에서 증발시켜 어두운 붉은 색의 추출물을 수득하였다. 상기 추출물을 유속 2 mL/min으로 하고 이동상으로는 60% 수성 메탄올을 사용하여, 프레퍼레티브 역상 크로마토그래피(preparative reversed-phase HPLC)에 의해 분획하고 HPLC-ESI-MS 분석을 진행하였다.
HPLC-ESI-MS/MS 스펙트럼은 ACQUITY UPLC BEH C18 컬럼 (50 x 2.1 mm, 1.7 μm; Waters) 을 이용하였으며, Micromass Quattro micro MS와 직접 연결된 Waters 2695 분리 모듈로 구성되는 Waters/Micromass Quattro 마이크로 MS 인터페이스로 기록하였다.
MS/MS에 의한 추적은, 암모늄 부가물(ammonium adduct)과 같은 선구이온(parent ion)으로부터의 생성이온(product ion)으로의 변이를 감지하기 위하여, 선택된 분석체에 특이적인 질량 짝을 선택하는 다양한 반응 모니터링 모드에서 수행되었다.
이후 상기 분획물을 2개의 소분획물로 분리하기 위하여, 유속 2 mL/min, 이동상 50% 수성 아세토니트릴(acetonitrile)로 반-프레퍼레티브 역상 크로마토그래피(semipreparative reversed-phase HPLC)를 진행하였다. 동일한 칼럼 및 동일한 HPLC 조건 하에서 상기 소분획물을 정제한 결과, 비정형의 흰색 분말이 나타났다(7.4 mg, tR 90 min).
(3) 데이터 측정 방법
광학 회전은 0.1 dm 경로 길이 셀을 이용하여 Jasco P-1010 polarimeter로 측정하였다.
UV 스펙트럼은 Scinco S-3100 분광계(spectrophotometer)로 기록하였고, IR 스펙트럼은 Varian FTS-800 FTIR 분광계로 얻었다.
NMR 스펙트럼은 Varian INOVA 500 분광계(13C, 125 MHz)를 이용하여 1시간 동안 500 MHz로 하여 기록하였다. 화학 시프트는(Chemical shifts)은 테트라메틸실란(TMS)를 내부 레퍼런스로 하여 ppm으로 나타내었다. 모든 NMR 데이터의 가공은 Mnova 소프트웨어(Mestrelab Research S.L.)를 이용하였다. NMR 분석을 위한 샘플은 CDCl3 (Sigma) 250 μL에 순수 화합물을 용해시켜 준비한 후, 용매와 부합하는 5-mm Shigemi 어드밴스드 NMR 마이크로튜브(Sigma)에 위치시켰다.
HR-ESI-MS 데이터는 UPLC와 결합된 Waters SYNAPT G2 질량분석기를 이용하여 수집하였다. HPLC 정제는 UV730D UV 디텍터 세트(205nm)와 CTS30 컬럼 오븐 세트(50℃)가 연결된 SP930D 기울기용리 펌프(gradient pump)로 이루어진 Acme 9000 HPLC 시스템 (YL Instrument Co. Ltd., Korea) 상의 준-예비분리 Watchers 120 ODS-BP (250 x 10 mm, 5 μm) 컬럼을 이용하여 수행하였다. 실험에 사용한 HPLC grade 용매는 J. T. Baker 사에서 구매하였다.
실시예 2. 상기 실시예 1에 대한 관측 결과
상기 비정형의 흰색 고체에 대한 분석 결과는 하기와 같다.
(1) HPLC-ESI-MS
도 1은 △fkbDin - frame 균주의 배양 추출물의 HPLC-ESI-MS 분석 결과로, m/z 793.1, 13분과 m/z 807.1, 28분에서 암모늄 부가물 이온 피크가 나타났다. 따라서 도 2에 도시된 776.1, 758.1, 740.1, 547.9에서 나타난 토막 이온(fragment ion)을 볼 때, m/z 793.1, 13분에서 나타나는 피크는 9-데옥소-프로릴-FK506에 의한 것으로 예측하였다. 각 토막 이온 간의 간격이 14Da이라는 점에서 9-데옥소-프로릴-FK506의 토막 패턴은 9-deoxo-FK506과 유사하다. 그러나 9-데옥소-FK506에서 특유의 C-1-C-24 토막 이온은 m/z 561.9에서 나타난 반면, 본 발명의 9-데옥소-프로릴-FK506의 경우 m/z 547.9에서 나타났다. 이는 9-데옥소-프로릴-FK506이 9-deoxo-FK506 및 다른 9-deoxo-FK506 유도체에 비해 특유의 C-1-C-24 토막에서 메틸렌 기를 1개 적게 갖고 있음을 암시하는 것이다.
따라서, 상기 비정형의 흰색 고체, 즉 9-데옥소-프로릴-FK506이 프롤린을 포함하는 것으로 판단하였다.
(2) 1D- 및 2D-NMR
1D- 및 2D-NMR 데이터
위치 δC δH , m (J in Hz) 1H-1H COSY HMBC
1 169.9
2 58.9 4.35, dd (8, 3) H-3a, H-3b C-1, C-3, C-4, C-6
3 29.2 2.19, m1.98, m H-2, H-4H-2 C-1, C-2, C-4, C-6C-1, C-2, C-6
4 24.7 1.96, m H-6a, H-6b, H-3a C-3, C-6
5
6 47.4 3.63, m3.54, m H-4H-4 C-2, C-3, C-4C-2, C-3, C-4
7
8 171.8
9 39.2 2.64, d (15)2.56, d (15) H-9bH-9a C-8, C-10C-8, C-10
10 98.6
11 38.6 1.61, m H-12a, H-38 C-10
12 32.7 1.99, m1.55, m H-11, H-13H-13 C-10, C-13, C-14, C-38C-10, C-13, C-38
13 74.6 3.40, (overlapped) H-12a, H-12b, H-14 C-14, C-43
14 71.0 3.84, dd (10, 2.5) H-13, H-15 C-10, C-12, C-13
15 77.1 3.53, m H-14, H-16a, H-16b
16 36.4 1.46, m1.35, m H-15H-15, H-17 C-17, C-19C-17, C-19
17 25.6 1.61, (overlapped) H-39, H-16b, H-18a
18 49.0 2.33, m1.69, m H-17 C-17, C-19, C-20, C-39
19 141.1
20 121.9 5.01, overlapped H-21 C-18, C-21, C-22, C-40
21 53.4 3.36, overlapped H-20, H-35a, H-35b C-22, C-20, C-35, C-36
22 214.0a
23 44.0 2.69, dd (17, 2)2.34, dd (17, 7) H-23bH-23a, H-24 C-22, C-24C-22, C-24, C-25
24 69.1 4.02, dd (7, 3) H-23b, H-25 C-22, C-26, C-41
25 41.2 1.81, m (3) H-24, H-26, H-41
26 78.0 5.17, d (2.5) H-25 C-1, C-24, C-25, C-27, C-28, C-41, C-42
27 132.4
28 129.7 4.98, (overlapped) H-29 C-26, C-27, C-29, C-30, C-34, C-42
29 35.0 2.27, m H-28, H-30a, H-30b, H-34a, H-34b C-30
30 34.9 2.05, m0.97, (overlapped) H-29, H-30b, H-31H-29, H-30a, H-31 C-31C-31
31 84.4 2.99, ddd (8.5, 4.5, 2.5) H-30a, H-30b, H-32 C-32, C-45
32 73.7 3.40, (overlapped) H-31, H-33a, H-33b
33 31.4 1.98, m1.35, m H-32, H-33b, H-34a, H-34bH-32, H-33a, H-34a, H-34b
34 30.8 1.61, m 1.04, m H-29, H-33a, H-33b, H-34bH-29, H-33a, H-33b, H-34a
35 35.7 2.45, m (7)2.25, m H-36, H-21H-36, H-21 C-20, C-21, C-22, C-36, C-37C-20, C-21, C-22, C-36, C-37
36 135.6 5.70, ddt (17, 10, 7) H-35a, H-35b, H-37 C-21, C-35
37 116.7 5.00, br s H-36 C-35, C-36
38 17.1 0.95, d (6.5) H-11 C-10, C-11, C-12
39 19.0 0.75, d (6.5) H-17 C-16, C-17, C-18
40 15.7 1.67b, s C-19, C-20
41 10.0 0.90, d (6.5) H-25 C-24, C-25, C-26
42 14.4 1.66b, s C-27, C-28
43 56.3 3.37b, s C-13
44 57.8 3.36b, s C-15
45 56.7 3.40, s C-31
10-OH 6.76, s C-8, C-9
상기 표 1 및 도 3a에 도시된 것과 같이, 1H NMR 스펙트럼 분석결과, FK506 골격의 특징적인 신호가 관찰되었다. 구체적으로 메틸기에 상응하는 3개의 더블릿(δH 0.95/H3-38, 0.90/H3-41, 0.75/H3-39), 2개의 메틸 싱글렛(δH 1.67/H3-40, 1.66/H3-42), 3개의 메톡시 싱글렛(δH 3.40/H3-45, 3.37/H3-43, 3.36/H3-44), 올레핀 프로톤의 멀티플렛(δH 5.70/H-36)이 관찰되었다.
또한 도 3b에 도시된 것과 같이, 13C NMR 스펙트럼 분석결과, 13C NMR 스펙트럼의 42개의 탄소 신호 및 HMBC 스펙트럼의 1개의 카보닐 탄소를 볼 때, 모두 43개의 탄소가 있는 것으로 예상된다. 그러나 상기 화합물(9-데옥소-프로릴-FK506)과 9-데옥소-FK506의 NMR 데이터를 주의 깊게 비교하여 보면, 9-데옥소-FK506의 피페콜레이트 곁가지(C-2-C-6)에 대응하는 상기 화합물의 신호가 이동한 것을 알 수 있다.
또한 상기 1H, 13C, 및 도 4에 도시된 HSQC 스펙트럼 분석 결과, 상기 화합물은 δC 58.9/C-2(δH 4.35/H-2), 47.4/C-6(δH 3.63/H-6a,3.54/H-6b), 29.2/C-3 (δH 2.19/H-3a, 1.98/H-3b), 24.7/C-4 (δH 1.96/H2-4), 즉, 단지 5개의 탄소 신호를 나타내고 있으므로, 피페콜레이트 대신 상기 화합물은 프롤린 잔기를 갖고 있는 것을 확인할 수 있다.
상기 화합물의 프롤린 잔기의 존재는 도 5a 내지 도 5c에 도시된 COSY 및 HMBC 분석을 통해서도 확인할 수 있다. δH 4.35 내지 δH 3.54 에서의 COSY의 크로스피크는 H-2/H-3/H-4/H-6 연결을 제공하였다. 나아가, δH 4.35/H-2, 2.19/H-3a, 1.98/H-3b 에서의 프로톤 신호와 δC 169.9/C-1 에서의 카보닐 에스테르 탄소 신호 사이에서, 그리고 δH 3.63/H-6a, 3.54/H-6b에서의 프로톤 신호와 δC 58.9/C-2, 29.2/C-3 에서의 탄소 신호 사이에서 주요한 HMBC 상관관계가 나타났다.
도 4에 나타난 것과 같이, HSQC 스펙트럼은 δH 2.64 (d, J = 15 Hz), 2.56 (d, J = 15 Hz)에서의 프로톤 신호들이 δC 39.2에서의 탄소 신호와 상관관계가 있음을 보여준다. 이러한 프로톤 신호들은 C-8 (δC 171.8)과 C-10 (δC 98.6)에 대한 HMBC 상관관계를 보여주는 것이며(도 5a 및 도 5c), 상기 화합물이 9-데옥소-FK506과 유사한 9-데옥소-프로릴-FK506 유도체임을 보여주는 것이다.
한편, 상기 화합물에 대한 COSY 스펙트럼은 잔여 4 스핀 시스템(remaining 4 spin systems)을 보여주며, HMBC 상관관계를 토대로 연결된다(도 5a 내지 도 5c). 메틸 및 메톡시기의 위치는 상대적인 HMBC 상관관계를 기초로 하여 도 5a와 같이 결정되었다.
따라서, 상기 화합물을 9-데옥소-프로릴-FK506으로 결정하였다. 본 발명자들은 9-데옥소-FK506 유도체 중 최초로, 일반적인 피페콜레이트 고리 대신 프롤린 곁가지를 포함하는 유도체를 확인한 것이다. 또한 상기 화합물의 입체화학구조는 모 화합물인 FK506와 동일하다.
(3) HR - ESI - MS
상기 비정형의 흰색 고체에 대하여 HR-ESI-MS 분석한 결과, m/z 776.4940에서 [M + H]+ 이온을 얻었으며, 이는 분자식인 C43H70NO11(calcd m/z 776.4949)과 일치하게 나타났다.
(+)- ESI - MS
m/z 793.1 [M + NH4]+;(+)-MS/MS:m /z 776.1, 758.1, 740.1, 547.9
(+)- HR - ESI - MS
m/z 776.4940 [M + H]+ (calcd for C43H70NO11,776.4949).
상기 결과를 바탕으로, 스트렙토마이시스 속 균주 KCTC11604BP로부터 fkbD 유전자를 인-프레임 결실을 통하여 비활성화시킨 균주의 배양액에서 분리된 비정형의 흰색 분말은 하기와 같은 이화적 특성을 지녀 9-데옥소-프로릴-FK506으로 결정하였다.
(a) 비정형 흰색 분말;
(b) 비선광도(Specific Rotation): [a]23 D = 1.64 (c=0.1, 메탄올);
(c) UV 흡수 스펙트럼(메탄올): λmax 가 (log e) 227 nm (2.0);
(d) IR 흡수 스펙트럼(film): νmax 가 3450, 2960, 1750, 1640, 1170, 1050 cm-1;
(e) 표 1로 표시되는 1H, 13C-NMR
(f) (+)-ESI-MS: m/z 793.1 [M + NH4]+;
(+)-MS/MS: m/z 776.1, 758.1, 740.1, 547.9;
(+)-HR-ESI-MS: m/z 776.4940 [M + H]+ ;
(g) 분자식 및 분자량: C43H70NO11,776.4949.
실시예 3. 9- 데옥소 - 프로릴 -FK506의 활성 분석
(1) 인비트로 ( In vitro ) T-세포 활성 분석
실제 FK506와 비교한 상기 화합물 9-데옥소-프로릴-FK506의 상대적인 면역억제 특성은 T 림프구(lymphocytes)을 사용하여 Mo, S. J. 외(J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 976-985)에 기재된 방법으로 결정하였다. 간략하게는, CD3/CD28-활성화한 인간 T-세포에 상기 화합물을 0.1 nM 농도로 16에서 20시간 동안 처리한 후 인터루킨-2의 분비량을 정량하였다.
그 결과, 도 6에 도시된 것과 같이, CD3/CD28-활성화한 인간 T-세포에 FK506를 처리한 경우 인터루킨-2의 분비가 CD3/CD28-활성화 하지 않은 세포만큼 감소하여 면역억제 활성이 높게 나타나는 반면, 본 발명에 따른 9-데옥소-프로릴-FK506 (1로 표시)을 CD3/CD28-활성화한 인간 T-세포에 처리한 경우 정상군에 이를 정도로 인터루킨-2의 분비가 현저히 증가한 것을 확인하였다. 즉, 모체인 FK506와 그의 유도체가 면역억제 활성을 나타내는 것과 정반대의 결과를 나타낸 것이다.
(2) 신경 재생 활성 분석
실제 FK506와 비교한 상기 화합물의 상대적인 신경 재생 활성은 래트 PC12 세포(pheochromocytoma cell)를 이용하여 Mo, S. J. 외(J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 976-985)에 기재된 방법으로 결정하였다. 상기 PC12 세포에 신경돌기 증식을 유도하는 신경 성장 인자(NGF; KOMA Biotech; 10 ng/ml)를 96시간 동안 처리하였다. 이 때 10 nM FK506 또는 9-데옥소-프로릴-FK506을 함께 처리 또는 제외하였다. 신경돌기의 길이는 인화된 사진을 이용하여 Revill, W. P. 외(J. Pharmacol. Exp. Ther. 2002, 302, 1278-1285)에 기재된 방법으로 측정하였다.
그 결과, 도 7a 및 도 7b에 도시된 것과 같이, 본 발명에 따른 9-데옥소-프로릴-FK506(1로 표시)은 우수한 신경 돌기 증식 촉진 효과를 나타냄을 확인하였다. 도 7b에서 A는 무처리 세포, B는 신경 성장 인자만을 처리한 세포, C는 FK506 존재 하에 신경 성장 인자를 처리한 세포, D는 9-데옥소-프로릴-FK506 존재 하에 신경 성장 인자를 처리한 세포를 나타낸 것이다.
한편, 면역 억제와 신경재생 활성은 각각 다른 기작, 즉 FKBP12의 결합체 또는 FKBP52의 결합체를 통하여 발생하게 된다(Gold, B. G. Expert Opin. Invest. Drugs 2000, 9, 2331-42). 따라서 FKBP12와 결합체를 형성하는 능력이 감소되어 면역억제 활성이 감소되어도, FKBP52의 결합을 억제하지는 않으므로, 신경재생 활성은 유지될 수 있다. 이는 하기의 31-O-디메틸-FK506 및 9-데옥소-31-O-디메틸FK506에 대해서도 동일하게 적용됨을 확인하였다.
실시예 4. 31-O-디메틸- FK506 에 대한 활성 분석
(1) 인비트로 ( In vitro ) T-세포 활성 분석
실제 FK506와 비교한 31-O-디메틸-FK506의 상대적인 면역억제 특성은 상기 실시예 3. (1)과 동일한 방법으로 결정하였다.
그 결과, 도 8에 도시된 것과 같이, CD3/CD28-활성화한 인간 T-세포에 FK506를 처리한 경우 인터루킨-2의 분비가 CD3/CD28-활성화 하지 않은 세포만큼 감소하여 면역억제 활성이 높게 나타나는 반면, 본 발명에 따른 31-O-디메틸-FK506 (2로 표시)을 CD3/CD28-활성화한 인간 T-세포에 처리한 경우 정상군에 이를 정도로 인터루킨-2의 분비가 현저히 증가한 것을 확인하였다. 즉, 모체인 FK506와 그의 유도체가 면역억제 활성을 나타내는 것과 정반대의 결과를 나타낸 것이다.
(2) 신경 재생 활성 분석
실제 FK506와 비교한 31-O-디메틸-FK506의 상대적인 신경 재생 활성의 결정 및 측정은 상기 실시예 3. (2)과 동일하게 진행하였다.
그 결과, 도 9a 및 도 9b에 도시된 것과 같이, 본 발명에 따른 31-O-디메틸-FK506 (2로 표시)은 우수한 신경 돌기 증식 촉진 효과를 나타냄을 확인하였다. 도 9b에서 A는 무처리 세포, B는 신경 성장 인자만을 처리한 세포, C는 FK506 존재 하에 신경 성장 인자를 처리한 세포, D는 31-O-디메틸-FK506 존재 하에 신경 성장 인자를 처리한 세포를 나타낸 것이다.
실시예 5. 9- 데옥소 -31-O- 디메틸FK506 에 대한 활성 분석
(1) 인비트로 ( In vitro ) T-세포 활성 분석
실제 FK506와 비교한 상기 화합물 9-데옥소-31-O-디메틸FK506의 상대적인 면역억제 특성은 상기 실시예 3. (1)과 동일한 방법으로 결정하였다.
그 결과, 도 10에 도시된 것과 같이, CD3/CD28-활성화한 인간 T-세포에 FK506를 처리한 경우 인터루킨-2의 분비가 CD3/CD28-활성화 하지 않은 세포만큼 감소하여 면역억제 활성이 높게 나타나는 반면, 본 발명에 따른 9-데옥소-31-O-디메틸-FK506 (3으로 표시)을 CD3/CD28-활성화한 인간 T-세포에 처리한 경우 정상군에 이를 정도로 인터루킨-2의 분비가 현저히 증가한 것을 확인하였다. 즉, 모체인 FK506와 그의 유도체가 면역억제 활성을 나타내는 것과 정반대의 결과를 나타낸 것이다.
(2) 신경 재생 활성 분석
실제 FK506와 비교한 9-데옥소-31-O-디메틸FK506의 상대적인 신경 재생 활성의 결정 및 측정은 상기 실시예 3. (2)과 동일하게 진행하였다.
그 결과, 도 11a 및 도 11b에 도시된 것과 같이, 본 발명에 따른 9-데옥소-31-O-디메틸-FK506 (3으로 표시)은 우수한 신경 돌기 증식 촉진 효과를 나타냄을 확인하였다. 도 11b에서 A는 무처리 세포, B는 신경 성장 인자만을 처리한 세포, C는 FK506 존재 하에 신경 성장 인자를 처리한 세포, D는 9-데옥소-31-O-디메틸-FK506 존재 하에 신경 성장 인자를 처리한 세포를 나타낸 것이다.
따라서, 본 발명에 따른 9-데옥소-프로릴-FK506, 31-O-디메틸-FK506, 또는 9-데옥소-31-O-디메틸FK506을 포함하는 조성물은 신경 재생을 촉진할 수 있으며 면역억제활성이 없어, 신경계 질환 치료에 있어 부작용을 감소시킬 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따른 조성물은 신경 재생을 촉진할 수 있으며 면역억제활성이 없어, 신경계 질환 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

Claims (10)

  1. 면역억제활성이 없으며, 31-O-디메틸-FK506 (31-O-demethyl-FK506), 9-데옥소-31-O-디메틸FK506 (9-deoxo-31-O-demethylFK506), 또는 하기의 화학식 2로 표시되는 9-데옥소-프로릴-FK506 (9-deoxo-prolyl-FK506) 으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 FK506 유도체를 포함하는, 신경계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2015008031-appb-I000005
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 신경 재생을 촉진하는 것인, 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 신경계 질환은 퇴행성 신경질환인 것인, 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 FK506에 비하여 인터루킨-2의 분비를 증가시키는 것인, 약학 조성물.
  5. fkbD 유전자가 결손된 스트렙토마이세스 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는, FK506 유도체의 제조방법으로,
    상기 FK506 유도체는 하기 화학식 2로 표시되는 9-데옥소-프로릴-FK506인 것인, 제조방법.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2015008031-appb-I000006
  6. 제5항에 있어서,
    상기 균주는 FK506를 생산하는 균주인 것인, 제조방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 균주는 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp.) KCTC 11604BP, 스트렙토마이세스 카나마이세티쿠스(Streptomyces kanamyceticus) KCTC 9225 스트렙토마이세스 속 ATCC 55098, 방선균 No. 9993(Streptomyces tsukubaensis No. 9993), 스트렙토마이세스 속 ATCC 53770, 스트렙토마이세스 속 6260, 스트렙토마이세스 속 49A, 스트렙토마이세스 속 94128, 스트렙토마이세스 글라우세센스(Streptomyces glaucescens) MTCC 5115 및 스트렙토마이세스 속 BICC7522로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 9-데옥소-프로릴-FK506의 제조방법.
  8. 하기 화학식 2로 표시되는 9-데옥소-프로릴-FK506, 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용가능한 염.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2015008031-appb-I000007
  9. 제8항에 있어서,
    상기 9-데옥소-프로릴-FK506는 하기의 이화적 특성을 가진 것인, 9-데옥소-프로릴-FK506, 그의 이성질체 또는 약제학적으로 허용가능한 염:
    (a) 비정형 흰색 분말;
    (b) 비선광도(Specific Rotation): [a]23 D = 1.64 (c=0.1, 메탄올);
    (c) UV 흡수 스펙트럼(메탄올): λmax 가 (log e) 227 nm (2.0);
    (d) IR 흡수 스펙트럼(film): νmax 가 3450, 2960, 1750, 1640, 1170, 1050 cm-1;
    (e) 1H, 13C-NMR: 표 1로 표시;
    (f) (+)-ESI-MS: m/z 793.1 [M + NH4]+;
    (+)-MS/MS: m/z 776.1, 758.1, 740.1, 547.9;
    (+)-HR-ESI-MS: m/z 776.4940 [M + H]+ ; 및
    (g) 분자식 및 분자량: C43H70NO11, 776.4949.
  10. 면역억제활성이 없으며, 31-O-디메틸-FK506 (31-O-demethyl-FK506), 9-데옥소-31-O-디메틸FK506 (9-deoxo-31-O-demethylFK506), 또는 하기의 화학식 2로 표시되는 9-데옥소-프로릴-FK506(9-deoxo-prolyl-FK506)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 FK506 유도체를 포함하는, 신경 재생 촉진용 조성물.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2015008031-appb-I000008
PCT/KR2015/008031 2014-08-01 2015-07-31 면역억제활성 없이 신경재생활성이 유지되는 fk506 유도체 및 그의 용도 WO2016018117A1 (ko)

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