WO2016010225A1 - 세포 재분화를 이용하여 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법 - Google Patents

세포 재분화를 이용하여 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
WO2016010225A1
WO2016010225A1 PCT/KR2015/001530 KR2015001530W WO2016010225A1 WO 2016010225 A1 WO2016010225 A1 WO 2016010225A1 KR 2015001530 W KR2015001530 W KR 2015001530W WO 2016010225 A1 WO2016010225 A1 WO 2016010225A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
astaxanthin
cysts
microalgae
cyst
mature
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/KR2015/001530
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이규복
오유관
쿠마 라마사미프라빈
이지예
주국택
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Korea Institute of Energy Research KIER
Original Assignee
Korea Institute of Energy Research KIER
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Korea Institute of Energy Research KIER filed Critical Korea Institute of Energy Research KIER
Publication of WO2016010225A1 publication Critical patent/WO2016010225A1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently extracting astaxanthin from microalgae, and more particularly, to re-differentiate microalgae (microalgae cells) to obtain microalgae with a weakened cell wall, thereby accumulating high concentrations of microalgae in microalgae.
  • the present invention relates to a method for extracting taraxanthin more efficiently.
  • Astaxanthin (3,3'-dihydroxy- ⁇ , ⁇ '-carotene-4,4'-dione), a red ketocarotenoid, is produced only by plants and microalgae, and is synthesized in animals. This is a kind of unsaturated isoprene derivative that is impossible to supply from outside. Astaxanthin is contained in large amounts of red algae, and also in red or yellow tropical fish or crustaceans that feed it.
  • the astaxanthin can protect the skin from ultraviolet radiation, improve the regression of the macula associated with aging (AMD), protect against cancer caused by chemicals, and increase the high-density lipoprotein. It has the advantage of strengthening the immune system. In particular, it has an excellent ability to protect membrane phospholipids and other lipids from peroxidation, and its antioxidant capacity is about 20 times better than beta-carotene or other carotenoids and about 500 times higher than vitamin E, the most widely known antioxidant. .
  • astaxanthin Due to its high antioxidant activity, astaxanthin is widely used as a raw material for the manufacture of fine chemicals such as pharmaceutical ingredients, food additives, and cosmetics, and its demand and application range are expected to expand rapidly.
  • the astaxanthin is produced in yeast strains Phaffia rthodozyma and algae Hematococcus and Bervibacterium, but is widely distributed in marine and freshwater animals (Phytochemistry, 15). 1003, 1976) Astaxanthin extracted from shellfish such as shrimp and crayfish is low in content and difficult to extract, and papia rodjima strains have high growth rate but low productivity of astaxanthin Due to the cell walls, there are many difficulties in extraction.
  • Haematococcus species also have higher astaxanthin accumulation than yeast papia rodji, but have fast growth due to problems such as low growth rate, thick cell wall and low cell density.
  • Significant and industrially weaker than Jima favorable and industrially weaker than Jima.
  • high levels of astaxanthin could be recovered if the accumulated astaxanthin could be extracted by efficiently destroying the rigid cell walls of Haematococcus species with high levels of astaxanthin. .
  • Astaxanthin extraction method of the representative Haematococcus species presented so far was extracted astaxanthin in the stage of maturation (Mature Cyst) by culturing hematococcus species.
  • Stage Cyst stage of maturation
  • astaxanthin may be accumulated at a high concentration.
  • the cell wall is very hard, which makes it difficult to break the cell wall.
  • Astaxanthin is extracted from representative hematococcus species presented so far.
  • US Pat. No. 4,871,551 and US Pat. No. 6,022,701 have been used to freeze the strains from which water was completely removed with liquid nitrogen, and then use an impact mill (High). It has been disclosed that the powder can be powdered using speed impact mill or jet mills, and astaxanthin can be extracted by breaking the cell walls of the strain.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2000-0072136 discloses a technique for extracting astaxanthin using a microwave by suspending hematococcus species in water, and further, Appl. Environ. Microbiol., 35; In 1155 and 1978, hematococcus spp. Was used to destroy cell walls using machines such as physical homogenizers, and then physical methods of extracting astaxanthin with solvents and enzymes that break down cell walls, namely cellulase and factinah.
  • a biological method of extracting astaxanthin after breaking down a cell wall using a protease or the like has been disclosed.
  • the technical problem to be achieved by the present invention is to provide a method of more efficiently extracting astaxanthin accumulated in high concentration from the microalgae by re-differentiating the microalgae to weaken the cell wall of the cysts containing astaxanthin.
  • a method for efficiently extracting a high concentration of astaxanthin from the microalgae according to the present invention includes the steps of (a) culturing the microalgae, and (b) applying the stress to the cultured microalgae to accumulate astaxanthin.
  • the microalgae in step (a), is characterized in that hematococcus pluvialis (Haematococuss pluvialis).
  • the method for efficiently extracting astaxanthin from the microalgae in the step (b), the method of stressing the microalgae is cultured in a medium depleted nitrogen source, medium phosphate depleted Culturing in any one selected from cultivation in, set temperature shock, sunshine, culture in a salt-added medium, culture in a fixed CO 2 medium and culture in an acetate (CH 3 COO-) addition medium. do.
  • the medium containing the nutrients includes a medium having a non-limiting level of nutrients required for optimal microalgal regeneration
  • the nutrient is characterized in that it comprises at least any one of nitrate, phosphate, vitamin.
  • the method for efficiently extracting astaxanthin from the microalgae according to the present invention in the step (c), the culture medium containing the mature cysts, divided cysts, discharge cysts and cyst wall is less than 70% regeneration It is characterized by obtaining the corresponding.
  • the method for efficiently extracting astaxanthin from the microalgae according to the present invention is characterized in that in step (c), the divided cysts and the released cysts have weakened the strength of the cell wall by regeneration of mature cysts.
  • the method for efficiently extracting astaxanthin from the microalgae according to the present invention in the step (d), the method for recovering the divided cells and the release cells are centrifugation, membrane filtration, flotation and chemoprecipitation It is characterized in that it is any one method selected.
  • the method for efficiently extracting astaxanthin from the microalgae according to the present invention is characterized in that in the step (e), the mechanical pretreatment is a method by pressure crushing or homogenization.
  • the method for efficiently extracting astaxanthin from the microalgae according to the present invention is characterized in that in the step (e), the chemical pretreatment is a method using an ionic liquid.
  • the present invention also proposes astaxanthin prepared by a method for efficiently extracting astaxanthin from microalgae.
  • the present invention proposes a method for using the astaxanthin in cosmetics, feed or food additives.
  • microalgae cells may be re-differentiated to obtain microalgal cells with a weakened cell wall, thereby providing a method of more efficiently extracting astaxanthin accumulated at high concentration from microalgal cells.
  • FIG. 1 is a flow chart showing a method for efficiently extracting astaxanthin from the microalgae according to the present invention.
  • Figure 2 is a photograph showing the cell type, i.
  • FIG. 3 is a result graph showing the amount of astaxanthin extract per cell according to the re-differentiation rate of hematococcus fluvialis cells using mechanical pretreatment by pressure press (french press) according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a graph showing the results of astaxanthin extract per cell according to the re-differentiation rate of hematococcus fluvilis cells using mechanical pretreatment by homogenization according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is an optical microscope photograph after 20 minutes of reaction with an ionic liquid ([Bmim] MeSO4) at atmospheric pressure and 60 ° C. to mature cysts of Hematoculous fluvilis cells according to the experimental example of the present invention.
  • an ionic liquid [Bmim] MeSO4
  • FIG. 6 is an optical microscope photograph of water after evaporation of an ionic liquid ([Bmim] MeSO 4 ) by reacting the divided cysts of hematococcus fluvialis cells with atmospheric pressure and room temperature according to an experimental example of the present invention.
  • an ionic liquid [Bmim] MeSO 4
  • FIG. 7 is an optical micrograph after immediately reacting with an ionic liquid ([Bmim] MeSO 4 ) in an emissive cyst of hematococcus fluvialis cells under normal pressure and room temperature and after 2 minutes according to an experimental example of the present invention. .
  • FIG. 1 is a flow chart illustrating a method for extracting astaxanthin from microalgal cells according to the present invention. As shown in the figure, the present invention provides a method for efficiently extracting astaxanthin from microalgal cells using microalgal cell regeneration.
  • Astaxanthin production method of the present invention in the extraction of astaxanthin (astaxantin) from the microalgae, the step of culturing the microalgae (S101), by applying stress to the cultured microalgae accumulating astaxanthin Forming a mature cyst (S102) and by culturing the mature cysts accumulating the astaxanthin in a culture medium containing nutrients to re-differentiate the culture medium containing the mature cysts, split cysts, release cysts and cyst wall Obtaining step (S103), and recovering the group of vesicles including mature cysts, divided cysts, discharge cysts and cyst wall from the culture obtained in step S103 (S104) and the recovered cyst group by mechanical or chemical pretreatment Extracting astaxanthin (S105).
  • the step (S101) is a step of culturing the microalgae, it is possible to obtain microalgal cells of the exponential phase through the culture of the microalgae.
  • microalgae is suitable to use Hematococcus pluvialis (Haematococcus pluvialis).
  • the culture conditions and the culture medium may be used as it is, conditions and medium well known in the art, for example, may be used NIES-C medium of pH 7.5.
  • step S102 is a step of forming a mature cyst accumulating astaxanthin by applying stress to the hematococcus fluvialis that passed through step S101.
  • the method of applying the stress is cultured in a medium depleted of nitrogen source, phosphate Any one selected from among these cultures in depleted medium, high temperature shock, sunshine, culture in salted medium, culture in CO 2 fixed medium and culture in acetate (CH 3 COO-) addition medium It is desirable to create a combined environment of the above.
  • the medium depleted of the nitrogen source is not particularly limited in kind, for example, NIES-N medium which is a medium depleted in the nitrogen source in the NIES-C medium described below can be used, specifically in the composition of the NIES-C medium Medium with 0.15 g / L Ca (NO 3 ) 2 and 0.10 g / L KNO 3 replaced with 0.13 g / L CaCl 2 .2H 2 O and 0.07 g / L KCl, respectively.
  • NIES-N medium which is a medium depleted in the nitrogen source in the NIES-C medium described below can be used, specifically in the composition of the NIES-C medium Medium with 0.15 g / L Ca (NO 3 ) 2 and 0.10 g / L KNO 3 replaced with 0.13 g / L CaCl 2 .2H 2 O and 0.07 g / L KCl, respectively.
  • step S103 is a step of obtaining a culture solution containing mature cysts, divided cysts, discharge cysts and cyst walls by culturing and re-differentiating the mature cyst formed in step S102 in a culture medium containing nutrients. Through weakening the strength of the cell wall of the mature cysts, divided cysts, releasing cysts can facilitate the extraction of astaxanthin contained in each cyst.
  • the medium containing the nutrient is a medium having a nutrient of a non-limiting level required for optimal cell regeneration, the nutrient preferably comprises at least one of nitrate, phosphate, vitamin.
  • NIES-C medium having a pH of 7.5 may be used.
  • the regeneration rate can be adjusted by varying the concentration and composition of the composition belonging to at least one of the nitrate, phosphate or vitamin contained in the culture solution in this step.
  • a culture medium including the mature cyst, divided cyst, the emissive cyst and the cyst wall having a regeneration rate of 70% or less, which corresponds to the range in which the divided cyst and the emissive cyst are most distributed.
  • the extraction rate of astaxanthin is the highest.
  • the regeneration rate is divided among the mature cysts, divided cysts, the emissary cysts, and the cyst wall. It is the ratio of occupancy.
  • Said step S104 is a step of recovering a group of cysts including mature cysts, divided cysts, bleeding cysts and cyst walls from the culture solution obtained in step S103, for example, centrifugation, membrane filtration, flotation or chemoprecipitation. Can be recovered.
  • the above-mentioned recovery method may be performed by a method well known in the art, and thus, detailed description thereof will be omitted herein because it is not a feature of the present invention.
  • step S105 the method of extracting astaxanthin by mechanical or chemical pretreatment of the collected cyst group is not particularly limited, for example, mechanical pretreatment by crushing or homogenization and ionicity. It can be carried out by any of the methods selected among chemical pretreatments by addition of a solution.
  • the mechanical or chemical pretreatment method of extracting the cells in this step (S105) may be carried out by conventional methods well known in the art, and thus detailed description thereof will be omitted.
  • the strain used in the present invention was purchased from the National Institute for Environmental Studies, University of Tokyo, Japan as Haematococcus pluvialis NIES-144.
  • NIES-C and NIES-N medium are two kinds of medium used in this experiment, and their components are shown in the following [Table 1].
  • the pH of the NIES-C and NIES-N medium was adjusted to 7.5 and sterilized using a 0.2 ⁇ m filter.
  • NIES-144 One population of Hematococcus fluvialis (NIES-144) grown in Agar medium was transferred to 100 mL of NIES-C medium plated in a 250 mL Erlenmeyer flask. At this time, the culture was incubated with a shake incubator (IS-971RF, Lab Companion, Korea) at 25 °C and 150 rpm conditions, using four white fluorescent lamps for 14 days at 40 ⁇ mol / m 2 s continuous irradiation It was.
  • a shake incubator IS-971RF, Lab Companion, Korea
  • a batch culture using a photobioreactor was performed, and the culture was performed using a bubble-collumn photobioreactor (b-PBR) made of Prex glass (length, 35 cm; inner diameter, 3.7 cm; culture volume, 500 mL).
  • the inoculation concentration was set to an initial optical density (OD, 680 nm) of 0.1, and 5% (v / v) CO 2 inair was continuously supplied at 0.4 vvm at the bottom of the bubble column photobioreactor.
  • the gas supplied was filtered using a 0.2 ⁇ m PTFE syringe filter (Minisart SRP15, Satorius stedium biotech., Germany) and flowed into the reactor using a flow controller (MKP, Korea) and a flow meter (Dwyer instruments Inc., USA). Supplied.
  • the incubation was performed for 15 days in a photoincubator (GC-300, JEIO TECH, Korea) set at a light / dark condition of 12 hours with a light intensity of 25 ⁇ mol / m 2 ⁇ s at 25 °C. .
  • a photoincubator GC-300, JEIO TECH, Korea
  • Hematococcus fluvialis cells of the exponential phase obtained as a result of the cultivation of (1) were harvested by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes, washed with sterile distilled water, and plated in a 300 mL funnel-type photobioreactor. Transfer to -N medium to induce astaxanthin accumulation.
  • the inoculation concentration was set to an initial OD (680 nm) 0.9, and 5% (v / v) CO 2 inair was continuously supplied at 0.4 vvm at the bottom of the photobioreactor.
  • the photobioreactor was incubated at 26 ° C. for 15 days at a light intensity of 69 ⁇ mol / m 2 ⁇ s.
  • the mature cyst of Hematococcus fluvialis obtained in (2) was harvested by centrifugation at 3000 rpm for 2 minutes, washed with sterilized distilled water, and then transferred to NIES-C medium for culture.
  • the culture was carried out for 24 hours in a shaker (IS-971RF, Lab Companion, Korea) under the conditions set to 25 °C, 150 rpm, 40 ⁇ mol / m 2 ⁇ s.
  • the mature cyst of Hematococcus fluvialis was re-differentiated to obtain a culture solution containing the mature cyst, the split cyst, the release cyst and the cyst wall.
  • cysts were harvested by centrifugation at 4000 rpm for 2 minutes and washed with distilled water.
  • Example 4 The cysts recovered in Example 4 were crushed at 30000 psi using high pressure crushing (French pressure cell press, Thermo Electron Corporation, USA).
  • Astaxanthin was then performed using high-performance liquid chromatography (HPLC), Agilent 1260 series, Agilent, USA, equipped with a variable wavelength detector (VWD) and a 250 X 4.6-mm YMC carotenoid column. The amount of chitin extract was measured.
  • the re-differentiation rate is divided into four types of total cysts obtained in Example (4), such as mature cysts, divided cysts, releasing cysts, and cyst wall, and refers to the proportion of the divided cysts, the emissive cysts and the cyst wall.
  • An improved Neubauer counting chamber (C-Chip, DHC-N01, iNCYTO, Korea) was used to measure the number of cysts.
  • Example (4) the cysts were collected by the method of Example (4) every 6 hours from the time when the regeneration of Example (3) was started to determine the regeneration rate.
  • Figure 3 shows the results of measuring the extraction amount of astaxanthin according to the re-differentiation rate of the hematococcus fluvialis cells obtained above.
  • astaxanthin extract amount increased with the redifferentiation rate of hematococcus fluvialis cells, and the maximum amount of astaxanthin extract was about 76 pg / cell at about 60%. Afterwards, when the differentiation rate decreased to about 70%, the extraction amount was similar to that before the differentiation.
  • Astaxanthin was extracted after mechanical disruption of the cells recovered in Example (4) using homogenization.
  • the homogenization was performed using an in-line dispserser (Colloid mill, ESYN ⁇ -TRON LAB / P, Korea). About 1 g / L of cells were fixed at a gap of the rotor and the stator at 0.1 mm, and reacted at a speed of 7000 rpm for 60 minutes to confirm whether or not the astaxanthin was extracted. Astaxanthin extraction took 3 mL of the culture solution, 3 mL of ethyl acetate was added and mixed vigorously, and centrifuged at 3000 rpm for 10 minutes to separate the layers.
  • the average cell size decreased and the number of cells increased.
  • the cells in the range of 15 ⁇ 60 ⁇ m were crushed and the number and size of the cells decreased.
  • increased debris was observed in cells in the range 2 to 15 ⁇ m. In particular, it was confirmed that the maximum number of cells undergoing mature cyst differentiation for 24 hours.
  • the astaxanthin extraction rate increased sharply, and the astaxanthin extraction rate decreased from 60% to about 90 pg / cell.
  • the mature cysts of the hematococcus fluvialis obtained in Example (2) were harvested by centrifugation at 300 0 rpm for 2 minutes, washed with sterilized distilled water, and then six NIES having different components as shown in Table 3 below. Transferred to -C medium and cultured. Thus, the regeneration rate was determined every 6 hours on the basis of the time of transfer of the obtained cysts into four types of mature cysts, divided cysts, discharge cysts, and cyst walls. The results are shown in FIG. 8.
  • Regeneration rate after 24 hours was 82.35% when (A) medium of FIG. 8 was used, 63.89% when (B) medium was used, and 84.21 when (C) medium was used, respectively. %, 81.48% when using (D) medium, and 100% when using (E) and (F) medium. Therefore, it was confirmed that the regeneration rate with time varies depending on the composition of the medium.
  • microalgal cells are re-differentiated to obtain microalgal cells with weakened cell walls, thereby making it easier to extract high concentrations of astaxanthin from the cells, which are used as feeds, medicines, and food additives for fry. Astaxanthin can be extracted more efficiently.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 미세조류 세포를 재분화시켜 세포벽이 약화된 미세조류 세포를 얻음으로써 미세조류 세포로부터 고농도로 축적된 아스타잔틴을 보다 효율적으로 추출하는 방법에 관한 것으로, 미세조류로부터 아스타잔틴(astaxantin)을 효율적으로 추출하는 방법은 (a) 미세조류를 배양하는 단계와, (b) 배양된 상기 미세조류에 스트레스를 가하여 아스타잔틴을 축적한 성숙포낭(mature cyst)을 형성시키는 단계와, (c) 상기 아스타잔틴을 축적한 성숙포낭을 영양분이 포함된 배양액에 배양하여 재분화시킴으로써 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함한 배양액을 얻는 단계와, (d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 상기 배양액에서 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및포낭벽을 포함하는 포낭군을 회수하는 단계 및 (e) 상기 회수된 포낭군을 기계적 방법 또는 화학적 전처리하여 아스타잔틴을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

Description

세포 재분화를 이용하여 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법
본 발명은 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세조류(미세조류 세포)를 재분화시켜 세포벽이 약화된 미세조류를 얻음으로써 미세조류로부터 고농도로 축적된 아스타잔틴을 보다 효율적으로 추출할 수 있는 방법에 관한 것이다.
적색의 케토카로티노이드(Ketocarotenoid)인 아스타잔틴(Astaxanthin, 3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione)은 식물 및 미세조류 등에서만 생산하며, 동물 체내에서 자체합성이 불가능하여 외부에서 공급이 필요한 불포화성 이소프렌 유도체의 일종이다. 이러한 아스타잔틴은 홍색 해조류에 다량 함유되어 있고, 이를 먹이로 하는 적색 또는 황색의 열대어나 갑각류에도 함유되어 있다.
상기 아스타잔틴은 자외선 조사로부터 피부를 방어할 수 있으며, 노화와 관련있는 망막황반의 퇴화(AMD)를 개선할 수 있고, 화학물질에 의해 발생하는 암으로부터 방어할 수 있으며, 고밀도 지방단백을 증가시키고, 면역시스템을 강화할 수 있는 장점이 있다. 특히, 막 인지질과 다른 지질들을 과산화로부터 보호하는데 뛰어난 능력이 있으며, 항산화 능력이 베타카로틴이나 다른 카로티노이드와 비교할 때 약 20 배 정도 우수하고 기존에 항산화제로 가장 널리 알려져 있는 비타민 E보다 약 500 배 정도 높다.
이러한 높은 항산화 활성기능으로 인해 아스타잔틴은 의약원료, 식품 첨가제 및 화장품 등 정밀 화학물질 제조 원료로 널리 사용되고 있고, 그 수요량 및 활용 범위가 급격히 확대될 것으로 예상된다.
상기 아스타잔틴은 효모균주인 파피아 로드지마(Phaffia rthodozyma )와 조류인 헤마토코쿠스 종(Haematococcus) 및 버비박테리아(Bervibacterium)에서 생성되며, 해양동물과 담수동물에 많이 분포되어 있지만(Phytochemistry, 15; 1003, 1976), 새우나 가재 등의 갑각류에서 추출된 아스타잔틴은 함량이 적고, 추출과정이 어려워 적용되지 않고 있으며, 파피아로드지마 균주는 성장률이 높으나 아스타잔틴의 생산성이 적고, 단단한 세포벽 때문에 추출에도 많은 어려운 점이 있다.
또한 녹조류 헤마토코쿠스 종(Haematococcus)은 효모 파피아 로드지마에 비해 월등히 높은 아스타잔틴 축적량을 가지고 있으나, 낮은 성장속도와 두꺼운 세포벽 및 낮은 세포밀도와 같은 문제점으로 인해 빠른 성장성을 갖는 파피아 로드지마보다 선호성 및 산업성이 미약하다. 하지만, 높은 아스타잔틴의 축척량을 가지고 있는 헤마토코쿠스 종(Haematococcus)의 단단한 세포벽을 효율적으로 파괴하여 축적된 아스타잔틴을 추출할 수 있다면, 고농도의 아스타잔틴을 회수할 수 있을 것이다.
따라서 아스타잔틴의 상업화를 위해서는 헤마토코쿠스 종의 세포 내에 축적된 아스타잔틴의 고효율 추출방법의 개발이 요구되고 있다. 지금까지 제시된 대표적 헤마토코쿠스 종(Haematococcus)의 아스타잔틴 추출 방법은 헤마토코쿠스 종을 배양하여 성숙포낭(Mature Cyst) 단계에서 아스타잔틴의 추출이 이루어졌다. 이 때, 배양 시 영양분을 공급하지 않는 등 스트레스 환경 하에서 포낭이 노화됨에 따라 아스타잔틴을 고농도로 축적시킬 수 있으나, 성숙포낭 단계에서는 세포벽이 매우 단단하여 세포벽의 파쇄가 어려운 단점이 있다.
지금까지 제시된 대표적인 헤마토코커스 종으로부터 아스타잔틴을 추출하는 방법으로, 예를 들어, 미국특허 제 4,871,551호 및 미국특허 제 6,022,701호에는 수분을 완전히 제거한 균주를 액체 질소로 냉동시킨 후 임팩트 밀(High speed impact mill or jet mills)을 이용하여 분말화하고, 이를 통하여 균주의 세포벽을 파괴시켜 아스타잔틴을 추출할 수 있는 기술이 개시되어 있다.
또한, 대한민국 특허공개 제 2000-0072136호에는 헤마토코쿠스 종을 물에 현탁시켜 마이크로웨이브를 사용하여 아스타잔틴을 추출하는 기술이 개시되어 있고, 또한, Appl. Environ. Microbiol., 35; 1155, 1978에는 헤마토코쿠스 종을 물리적 균질화기(Homogenizer)와 같은 기계를 사용하여 세포벽을 파괴한 후 용매로 아스타잔틴을 추출하는 물리적 방법 및 세포벽을 분해하는 효소, 즉 셀룰라이제, 팩틴나아제, 프로테아제 등을 이용하여 세포벽을 파괴한 후 아스타잔틴을 추출하는 생물학적 방법 등이 개시되고 있다.
그러나 종래 기술에 있어서 상기와 같은 방법들은 헤마토코쿠스 종의 성숙포낭(mature cyst) 상태에서 실시되며 이는 두꺼운 세포벽으로 인해 아스타잔틴 추출 시, 낮은 추출 속도와 높은 아스타잔틴 파괴율, 많은 노동력 및 고처리 비용 등의 문제점들이 존재하여 상업적으로 널리 이용되지 못하는 문제가 있다. 따라서 헤마토코쿠스 종(Haematococcus)을 이용한 아스타잔틴의 상업적 대량 생산을 위해서는 균주로부터 고농도의 아스타잔틴을 효율적으로 추출할 수 있는 새로운 고효율 아스타잔틴 분리 공정이 필요하다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 미세조류를 재분화시켜 아스타잔틴을 포함하고 있는 포낭의 세포벽을 약화시킴으로써, 미세조류로부터 고농도로 축적된 아스타잔틴을 보다 효율적으로 추출하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 미세조류로부터 고농도의 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법은, (a) 미세조류를 배양하는 단계와, (b) 배양된 상기 미세조류에 스트레스를 가하여 아스타잔틴을 축적한 성숙 포낭(mature cyst)을 형성시키는 단계와, (c) 상기 아스타잔틴을 축적한 성숙 포낭을 영양분이 포함된 배양액에 배양하여 재분화시킴으로써 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함한 배양액을 얻는 단계와, (d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 상기 배양액에서 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함하는 포낭군을 회수하는 단계 및 (e) 상기 회수된 포낭군을 기계적 방법 또는 화학적 전처리하여 아스타잔틴을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법은, 상기 단계 (a)에서, 상기 미세조류는 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococuss pluvialis)인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법은, 상기 단계 (b)에서, 상기 미세조류에 스트레스를 가하는 방법은 질소원이 고갈된 배지에서의 배양, 인산염이 고갈된 배지에서의 배양, 설정된 온도 충격, 일광, 소금이 첨가된 배지에서의 배양, CO2를 고정한 배지에서의 배양 및 아세테이트(CH3COO-)첨가 배지에서의 배양 중 선택된 어느 하나에서 배양하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법은, 상기 단계 (c)에서, 상기 영양분을 포함한 배지는 최적의 미세조류 재분화에 필요한 비제한적 수준의 영양소를 갖는 배지를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 영양소는 질산염, 인산염, 비타민 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법은, 상기 단계 (c)에서, 상기 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함하는 배양액은 재분화율이 70 % 이하에 해당하는 것을 얻는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법은, 상기 단계 (c)에서, 상기 분할포낭과 방출포낭은 성숙포낭의 재분화에 의해 세포벽의 강도가 약해진 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법은, 상기 단계 (d)에서, 상기 분할세포와 방출세포를 회수하는 방법은 원심분리, 막 여과, 부상분리 및 화학침전 중 선택된 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법은, 상기 단계 (e)에서, 상기 기계적 전처리는 압력파쇄 또는 호모제니제이션(homogenization)에 의한 방법인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명에 따른 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법은, 상기 단계 (e)에서, 상기 화학적 전처리는 이온성 액체를 이용한 방법인 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법에 의해 제조된 아스타잔틴을 제안한다.
아울러, 본 발명은 상기 아스타잔틴을 화장품 용도, 사료용 또는 식품첨가물에 사용하는 방법을 제안한다.
본 발명에 따르면 미세조류 세포를 재분화시켜 세포벽이 약화된 미세조류 세포를 얻음으로써 미세조류 세포로부터 고농도로 축적된 아스타잔틴을 보다 효율적으로 추출하는 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법을 나타내는 흐름도이다.
도 2는 본 발명에 따른 헤마토코커스 플루비알리스의 성숙포낭에서 재분화를 거쳐 나타나는 세포타입, 즉 a)성숙 포낭, b)분할 포낭, c)방출 포낭, d)포낭 벽을 나타낸 사진이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따라 압력파쇄(french press)에 의한 기계적 전처리를 이용하여 헤마토코커스 플루비알리스 세포의 재분화율에 따른 세포당 아스타잔틴 추출량을 나타낸 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따라 호모제니제이션(homogenization)에 의한 기계적 전처리를 이용하여 헤마토코커스 플루비알리스 세포의 재분화율에 따른 세포당 아스타잔틴 추출량을 나타낸 결과 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실험예에 따라 헤마토코커스 플루비알리스 세포의 성숙포낭에 상압 및 60 ℃ 조건 하에서 이온성 액체([Bmim]MeSO4)와 반응시켜 20 분이 경과한 후의 광학현미경 사진이다.
도 6은 본 발명의 실험예에 따라 헤마토코커스 플루비알리스 세포의 분할포낭에 상압 및 상온 조건 하에서 이온성 액체([Bmim]MeSO4)와 반응시켜 수분이 경과한 후의 광학현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 실험예에 따라 헤마토코커스 플루비알리스 세포의 방출포낭에 상압 및 상온 조건 하에서 이온성 액체([Bmim]MeSO4)와 반응시킨 직후 및 2분이 경과한 후의 광학현미경 사진이다.
도 8은 본 발명의 비교예에 따라 각각 성분을 달리한 6 가지 NIES-C 배지에 옮겨 배양 후 옮긴 시점을 기준으로 매 6 시간마다 재분화율을 나타낸 결과 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
도 1은 본 발명에 따른 미세조류 세포로부터 아스타잔틴을 추출하는 방법을 나타내는 흐름도이다. 도면에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 미세조류 세포 재분화 를 이용하여 미세조류 세포로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 아스타잔틴의 생산 방법은 미세조류로부터 아스타잔틴(astaxantin)의 추출에 있어서, 미세조류를 배양하는 단계(S101)와, 배양된 상기 미세조류에 스트레스를 가하여 아스타잔틴을 축적한 성숙 포낭(mature cyst)을 형성시키는 단계(S102)와, 상기 아스타잔틴을 축적한 성숙 포낭을 영양분이 포함된 배양액에 배양하여 재분화시킴으로써 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함한 배양액을 얻는 단계(S103)와, 상기 단계 S103에서 얻어진 상기 배양액에서 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함하는 포낭군을 회수하는 단계(S104) 및 상기 회수된 포낭군을 기계적 또는 화학적 전처리하여 아스타잔틴을 추출하는 단계(S105)를 포함한다.
여기서, 상기 단계(S101)는 미세조류를 배양하는 단계로, 이 미세조류의 배양을 통해 지수기의 미세조류 세포를 얻을 수 있다.
또한, 상기 미세조류는 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis)를 사용하는 것이 적합하다.
또한, 이 단계(S101)에서 배양 조건 및 배양 배지는 당해 분야에 널리 알려져 있는 조건 및 배지를 그대로 이용하면 되며, 예를 들어, pH 7.5의 NIES-C배지를 사용할 수 있다.
그리고, 상기 단계 S102는 단계 S101를 거친 헤마토코커스 플루비알리스에 스트레스를 가하여 아스타잔틴을 축적한 성숙포낭을 형성시키는 단계로, 상기 스트레스를 가하는 방법은 질소원이 고갈된 배지에서의 배양, 인산염이 고갈된 배지에서의 배양, 높은 온도 충격, 일광, 소금이 첨가된 배지에서의 배양, CO2를 고정한 배지에서의 배양 및 아세테이트(CH3COO-)첨가 배지에서의 배양 중 선택된 어느 하나 또는 그 이상의 조합된 환경을 조성하는 것이 바람직하다.
이중 상기 질소원이 고갈된 배지는 특별히 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어, 후술된 NIES-C 배지에서 질소원이 고갈된 배지인 NIES-N 배지를 이용할 수 있으며 구체적으로 NIES-C배지의 조성물 중 Ca(NO3)2 0.15 g/L와 KNO3 0.10 g/L를 각각 CaCl2·2H2O 0.13 g/L와 KCl 0.07g/L로 대체한 배지를 사용할 수 있다.
그리고, 상기 단계 S103은, 단계 S102를 거쳐 형성된 성숙포낭(mature cyst)을 영양분이 포함된 배양액에 배양하여 재분화시킴으로써 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함한 배양액을 얻는 단계로, 이러한 재분화를 통해 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭의 세포벽의 강도를 약화시켜 각 포낭에 포함된 아스타잔틴의 추출을 용이하게 할 수 있다.
여기서, 상기 영양분을 포함한 배지는 최적의 세포 재분화에 필요한 비제한적 수준의 영양소를 갖는 배지이며, 상기 영양소는 질산염, 인산염, 비타민 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것이 바람직하다.
구체적인 예로는, pH 7.5의 NIES-C 배지를 사용할 수 있다. 특히, 본 단계에서 상기 배양액에 포함된 질산염, 인산염 또는 비타민 중 적어도 어느 하나에 속하는 조성물의 농도 및 조성을 달리하여 재분화 속도를 조절할 수 있다.
또한, 상기 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함하는 배양액은 재분화율이 70 % 이하에 해당하는 것을 얻는 것이 바람직한데, 이는 분할포낭 및 방출포낭이 가장 많이 분포하는 범위에 해당하며, 결과적으로 아스타잔틴의 추출율이 가장 높게 나타나기 때문이다.
참고로, 전체 포낭을 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽의 4 종류로 구분하는 경우, 상기 재분화율은 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽 중 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽이 차지하는 비율을 말한다.
상기 단계 S104는, 단계 S103에서 얻어진 상기 배양액에서 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함하는 포낭군을 회수하는 단계로서, 예를 들어 원심분리, 막여과, 부상분리 또는 화학침전 등을 통해 회수할 수 있다.
상기에서 언급한 회수하는 방법은 당해 분야에 널리 알려져 있는 방법으로 수행할 수 있으며, 본 발명의 특징이 아니므로 본 명세서에서 자세한 설명은 생략하기로 한다.
아울러, 상기 단계 S105에서, 회수된 포낭군을 기계적 또는 화학적 전처리하여 아스타잔틴을 추출하는 방법은 특별히 그 종류가 제한되지 않으며, 예를 들어, 압력파쇄 또는 호모제니제이션에 의한 기계적 전처리 및 이온성 용액의 첨가에 의한 화학적 전처리 중 선택된 어느 하나의 방법에 의해 실시될 수 있다. 이 단계(S105)에서 세포를 추출하는 기계적 또는 화학적 전처리 방법은 당해 분야에 널리 알려져 있는 통상적인 방법으로 실시될 수 있으므로 본 명세서에서 자세한 설명은 생략하기로 한다.
<실시예>
본 발명에 사용된 균주는 Haematococcus pluvialis NIES-144로서 National Institute for Environmental studies, University of Tokyo, Japan으로부터 구입되었다. 또한, 본 실험에 사용된 배지의 종류는 모두 2가지로서 NIES-C 및 NIES-N 배지이고, 이들의 구성성분을 하기 [표 1]에 나타내었다.
또한, 상기 NIES-C 및 NIES-N 배지의 pH는 7.5에 맞추었고 0.2 ㎛필터를 이용하여 멸균하였다.
[표 1] NIES-C 배지 및 NIES-N 배지의 구성성분
Figure PCTKR2015001530-appb-I000001
(1) 배양 단계
Agar 배지에서 자란 헤마토코커스 플루비알리스(NIES-144)의 군집 하나를 250 mL 삼각플라스크에 도말된 100 mL의 NIES-C 배지에 옮겨 배양하였다. 이때, 상기 배양은 25℃ 및 150 rpm 조건 하의 진탕배양기(IS-971RF, Lab Companion, Korea)로 배양하였으며, 이때 4개의 백색형광램프를 이용하여 14 일간 40 μmol/m2s의 광도로 연속 조사하였다.
이어서, 광생물 반응기를 이용한 회분식 배양을 수행하였으며, 상기 배양은 Prex 유리로 제작된 기포탑 광생물반응기(bubble-collumn photobioreactor, b-PBR) (길이, 35 cm; 내경, 3.7 cm; 배양용량, 500 mL)에서 수행되었다. 이때, 접종 농도는 초기 optical density (OD, 680 nm) 0.1로 설정하였으며, 상기 기포탑 광생물반응기의 하단부에 5 %(v/v) CO2 inair를 0.4 vvm로 연속적으로 공급하였다.
여기서, 공급되는 가스는 0.2 μm PTFE 주사기필터(Minisart SRP15, Satorius stedium biotech., Germany)를 이용하여 여과하였고 유량조절장치(MKP, Korea)와 유량계(Dwyer instruments Inc., USA)를 이용하여 반응기에 공급하였다.
또한, 상기 배양은 25 ℃에서 25 μmol/m2·s의 광도로 12 시간 주기의 light/dark 조건으로 세팅된 광생물배양기 (Photoincubator) (GC-300, JEIO TECH, Korea)에서 15 일간 수행되었다. 그 결과, 헤마토코커스 플루비알리스가 분화하여 지수기의 헤마토코커스 플루비알리스 세포들을 얻었다.
(2) 스트레스를 가하는 단계
상기 (1)의 배양 결과 얻어진 지수기의 헤마토코커스 플루비알리스 세포들은 3000 rpm으로 2 분 동안 원심분리하여 수확하였고, 멸균된 증류수로 세척한 후 300 mL 깔대기 형태의 광생물 반응기에 도말된 NIES-N 배지에 옮겨 아스타잔틴 축적을 유도하였다.
이때, 접종농도는 초기 OD(680 nm) 0.9로 설정하였으며, 광생물반응기의 하단부에 5 %(v/v) CO2 inair를 0.4 vvm로 연속적으로 공급하였다. 또한, 상기 광생물반응기는 69 μmol/m2·s의 광도로 26 ℃에서 15 일간 배양시켰다.
그 결과, 헤마토코커스 플루비알리스 세포에 적색 물질이 축적된 성숙포낭을 얻었다.
(3) 재분화 단계
상기 (2)에서 얻어진 헤마토코커스 플루비알리스의 성숙포낭을 3000 rpm으로 2 분간 원심분리하여 수확하였으며, 멸균된 증류수로 세척한 후 NIES-C 배지에 옮겨 배양하였다.
여기서, 상기 배양은 25 ℃, 150 rpm, 40 μmol/m2·s로 설정된 조건하의 진탕배양기(IS-971RF, Lab Companion, Korea)에서 24 시간 동안 수행되었다. 그 결과, 헤마토코커스 플루비알리스의 성숙포낭이 재분화되어 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함하는 배양액을 얻었다.
(4) 회수 단계
상기 (3)에서 재분화를 거친 포낭들을 회수하기 위하여 4000 rpm 에서 2 분간 원심분리하여 상기 포낭들을 수확한 후 증류수로 세척하였다.
(5) 추출 단계
상기 (4)에서 회수된 포낭들로부터 아스타잔틴을 추출하기 위하여 후술되는 압력파쇄에 의한 기계적 전처리, 호모제니제이션(homogenization)을 이용한 기계적 전처리 또는 이온성 용액의 첨가에 의한 화학적 전처리를 수행함으로써 아스타잔틴을 추출하였다.
1. 압력파쇄(French Press)를 이용한 기계적 전처리 및 아스타잔틴 추출
상기 실시예 (4)에서 회수된 포낭들을 high pressure 파쇄법(French pressure cell press, Thermo Electron Corporation, USA)을 이용하여 30000 psi에서 파쇄하였다.
이후, 파쇄된 포낭 1mL에 에틸아세테이트(ethyl acetate) 5 mL를 첨가한 후 방치하여 에틸아세테이트 층과 물 층으로 층 분리가 일어나도록 하였다.
그리고, 에틸아세테이트 층과 물 층으로 분리가 일어난 용액을 1 mL로 증발 농축하여 아스타잔틴 추출물을 얻었다.
상기에서 얻어진 아스타잔틴 추출물의 양을 측정하기 위해서, 상기 아스타잔틴 추출물에 1 mL의 0.025 N NaOH 메탄올 용액을 첨가하여 검화(saponification)하고 교반한 후 4 ℃에서 70 분간 보관하였다.
이후, variable wavelength detector (VWD)와 250 X 4.6-mm YMC 카르테노이드(carotenoid) 컬럼이 장착된 고성능 액체크로마토그래피(High-performance liquid chromatography, HPLC, Agilent 1260 series, Agilent, USA)를 이용하여 아스타잔틴 추출물의 양을 측정하였다.
이동상은 메탄올, MTBE(methyl tertiary butyl ether) 및 1 % phosphoric acid로 구성되었으며, 유량, 주입용량 및 검출 파장은 각각 1.0 ml/min, 20 μL 및 474 nm로 맞추었다. 또한, 자유 아스타잔틴(free astaxanthin)을 분리하기 위해서 기울기 용리를 이용하였다(메탄올:MTBE:1%Phosphoric acid = 81 : 15 : 4, 15 분; 81 : 15 : 4에서 16 : 80 : 4, 27 분; 81 : 15 : 4, 35 분).
상기의 기계적 방법을 통한 아스타잔틴의 추출은 후술되는 재분화율에 따라 분류된 포낭들을 대상으로 반복하여 수행하였다.
여기서, 상기 재분화율은 실시예 (4)에서 얻어진 전체 포낭을 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭, 포낭벽의 4 종류로 구분하여 이 중 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽이 차지하는 비율을 말하며, 이를 위한 각 포낭 수 측정에는 improved Neubauer counting chamber (C-Chip, DHC-N01, iNCYTO, Korea)을 사용하였다.
또한, 상기 실시예 (3)의 재분화를 시작한 시점으로부터 매 6시간마다 실시예 (4)의 방법으로 포낭들을 회수하여 재분화율을 구하였다.
도 3은 상기에서 구한 헤마토코커스 플루비알리스 세포의 재분화율에 따른 아스타잔틴의 추출량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3에 도시한 바와 같이 헤마토코커스 플루비알리스 세포의 재분화율이 증가함에 따라 아스타잔틴 추출량이 증가하여 약 60 %에서 아스타잔틴 추출량이 약 76 pg/cell로 최대치를 나타냈다. 이후 점차 감소하여 분화율이 약 70 % 정도가 되었을 때에는 분화 전과 비슷한 추출량을 나타냈다.
2. 호모제니제이션(homogenization)을 이용한 기계적전처리 및 아스타잔틴 추출
상기 실시예 (4)에서 회수된 세포를 호모제니제이션(homogenization)을 이용하여 기계적 파쇄 후 아스타잔틴을 추출하였다.
상기 호모제니제이션은 in-line dispserser (Colloid mill, ESYN μ-TRON LAB/P, Korea)를 이용하여 수행하였다. 세포 약 1 g/L를 회전자(rotor)와 고정자(stator)의 간극을 0.1 mm로 고정하여 7000 rpm의 속도로 60 분 동안 반응시켜 파쇄 여부를 확인한 후 아스타잔틴 추출량을 측정하였다. 아스타잔틴 추출은 3 mL의 배양액을 취하고 3 mL의 에틸아세테이트를 더하여 격렬하게 혼합한 후 3000 rpm에서 10분간 원심분리하여 층분리 하였다.
그 후 1 mL의 에틸아세테이트를 증발농축한 후 앞에서 설명한 아스타잔틴 추출물의 양을 측정하는 방법에 따라 HPLC로 정량하였다.
그 결과 파쇄하는 시간이 증가할수록 세포의 평균 크기는 작아지고 세포의 개수는 늘어나는 경향을 보였으며, 60분 동안 파쇄했을 시에는 15 ~ 60 ㎛ 범위에 있는 세포들이 파쇄되어 세포의 개수와 크기가 줄어들고, 2 ~ 15 ㎛ 범위에 있는 세포들의 잔해가 늘어난 것이 관찰됐다. 특히 24 시간 동안 성숙포낭 분화과정을 거친 세포의 수가 최대인 것을 확인할 수 있었다.
또한, 상기 기계적 파쇄 과정을 거친 세포를 현미경으로 관찰한 결과 분할포낭의 세포파쇄가 가장 쉽게 일어나는 것을 확인 할 수 있었다.
또한, 고정자와 회전자 사이에서 세포가 충돌, 전단력, 진공현상 (cavitation)등을 통해 세포 내부 물질이 서로 섞이고 내부 벽 또한 파쇄된 것을 확인 할 수 있었다.
도 4에 도시한 바와 같이 재분화율이 낮을수록 아스타잔틴의 추출율이 적게 나타났는데 이는 분화가 되지 않은 성숙포낭의 경우 세포파쇄가 이루어지지 않기 때문이다.
또한, 재분화율이 증가함에 따라 아스타잔틴 추출율의 급격한 증가를 보이다가 약 60%에서 아스타잔틴의 추출율이 약 90 pg/cell로 최대 추출율을 보인 후 감소하였다.
3. 이온성 액체를 이용한 화학적 전처리 및 아스타잔틴 추출
상기 실시예 (3)의 과정을 거쳐 재분화율이 60 % 이상이 됐을 때, 배양액 중 1 mL를 취하여 4000 rpm 에서 2 분간 원심분리하여 세포를 수확한 후 증류수로 세척하였다. 수확된 세포는 [표 2]의 (A) 내지 (F)에 해당하는 다양한 종류의 이온성액체 500 μL와 30분간 28 ℃에서 반응시키고 4000 rpm으로 2 분간 원심분리하여 이온성액체 층을 분리함으로써 아스타잔틴을 추출하였다.
[표 2]
Figure PCTKR2015001530-appb-I000002
<실험예>
상기 실시예 (4)에서 회수된 포낭 중 성숙포낭을 상온 및 60 ℃의 온도 분위기에서 20 분 동안 이온성 액체인 1-butyl-3-methylimidazolium과 반응시켰다. 이를 광학현미경(Zeiss Imager A2 fluorescence microscope, Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였고 그 결과를 도 5에 나타냈다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 상온에서 뿐만 아니라 60℃에서도 성숙포낭의 형태 등에 있어서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.
또한, 상기에서 회수된 포낭 중 분할포낭 및 방출포낭을 상온에서 20분 동안 이온성 액체인 1-butyl-3-methylimidazolium과 반응시켰다.
이를 광학현미경(Zeiss Imager A2 fluorescence microscope, Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였고 그 결과를 도 6 및 도 7에 나타냈다.
도면에 나타낸 바와 같이, 분할포낭 및 방출포낭의 경우 수분 이내에 붉은색 아스타잔틴이 추출되는 것을 확인하였다. 따라서, 성숙포낭이 재분화된 형태인 분할포낭 및 방출포낭이 이온성 액체를 통한 아스타잔틴 추출에 적합한 것을 확인할 수 있었다.
<비교예>
상기 실시예 (2)에서 얻은 헤마토코커스 플루비알리스의 성숙포낭을 300 0rpm으로 2 분간 원심분리하여 수확하였으며, 멸균된 증류수로 세척한 후 [표 3]과 같이 각각 성분을 달리한 6 가지 NIES-C 배지로 옮겨 배양하였다. 이에 따라 얻어진 포낭들을 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽의 4 종류로 구분하여 옮긴 시점을 기준으로 매 6 시간마다 재분화율을 구하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8의 (A) 내지 (F)에 도시된 바와 같이 시간이 경과함에 따라 재분화율이 증가하는 것을 관찰하였다.
또한, 24시간이 경과했을 시의 재분화율은 각각 도 8의 (A) 배지를 사용했을 시에는 82.35 %, (B) 배지를 사용했을 시에는 63.89 %, (C) 배지를 사용했을 시에는 84.21 %, (D) 배지를 사용했을 시에는 81.48 %, 그리고 (E) 및 (F) 배지를 사용했을 시에는 100 %로 나타났다. 따라서, 시간에 따른 재분화율이 배지의 조성에 따라 변화가 있음을 확인하였다.
[표 3]
Figure PCTKR2015001530-appb-I000003
본 발명에 따르면, 미세조류 세포를 재분화시켜 세포벽이 약화된 미세조류 세포를 얻음으로써 세포로부터 고농도로 축적된 아스타잔틴을 보다 용이하게 추출할 수 있어, 치어의 사료, 의약품, 식품첨가제로 사용되는 아스타잔틴을 보다 효율적으로 추출할 수 있다.

Claims (12)

  1. 미세조류로부터 아스타잔틴(astaxantin)의 추출에 있어서,
    (a) 미세조류를 배양하는 단계;
    (b) 배양된 상기 미세조류에 스트레스를 가하여 아스타잔틴을 축적한 성숙 포낭(mature cyst)을 형성시키는 단계;
    (C) 상기 아스타잔틴을 축적한 성숙 포낭을 영양분이 포함된 배양액에 배양하여 재분화시킴으로써 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함한 배양액을 얻는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)에서 얻어진 상기 배양액에서 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및포낭벽을 포함하는 포낭군을 회수하는 단계; 및
    (e) 상기 회수된 포낭군을 기계적 방법 또는 화학적 전처리하여 아스타잔틴을 추출하는 단계를 포함하는 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (a)에서, 상기 미세조류는 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococuss pluvialis)인 것을 특징으로 하는 미세조류 세포로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (b)에서, 상기 미세조류에 스트레스를 가하는 방법은 질소원이 고갈된 배지에서의 배양, 인산염이 고갈된 배지에서의 배양, 설정된 온도 충격, 일광, 소금이 첨가된 배지에서의 배양, CO2를 고정한 배지에서의 배양 및 아세테이트(CH3COO-)첨가 배지에서의 배양 중 선택된 어느 하나에서 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서, 상기 영양분을 포함한 배지는 최적의 미세조류 재분화에 필요한 비제한적 수준의 영양소를 갖는 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 영양소는 질산염, 인산염, 비타민 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서, 상기 성숙포낭, 분할포낭, 방출포낭 및 포낭벽을 포함하는 배양액은 재분화율이 70 % 이하에 해당하는 것을 얻는 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (c)에서, 상기 분할 포낭 및 방출 포낭은 성숙 포낭의 재분화에 의해 세포벽의 강도가 약해진 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (d)에서, 상기 분할세포와 방출세포를 회수하는 방법은 원심분리, 막 여과, 부상분리 및 화학침전 중 선택된 어느 하나의 방법인 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 (e)에서, 상기 기계적 전처리는 압력파쇄(french press) 또는 호모제니제이션(homogenization)에 의한 방법인 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법.
  10. 제 1항에 있어서,
    상시 단계 (e)에서, 상기 화학적 전처리는 이온성 액체를 이용한 방법인 것을 특징으로 하는 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법에 의해 제조된 아스타잔틴.
  12. 제 11항의 아스타잔틴을 화장품 용도, 사료용 또는 식품첨가물에 사용하는 방법.
PCT/KR2015/001530 2014-07-15 2015-02-16 세포 재분화를 이용하여 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법 Ceased WO2016010225A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020140089342A KR101588585B1 (ko) 2014-07-15 2014-07-15 세포 재분화를 이용하여 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법
KR10-2014-0089342 2014-07-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2016010225A1 true WO2016010225A1 (ko) 2016-01-21

Family

ID=55078689

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2015/001530 Ceased WO2016010225A1 (ko) 2014-07-15 2015-02-16 세포 재분화를 이용하여 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101588585B1 (ko)
WO (1) WO2016010225A1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113322186A (zh) * 2021-06-21 2021-08-31 昆明理工大学 一种离子液体快速采收微藻的方法
CN116836809A (zh) * 2023-09-01 2023-10-03 暨南大学 具有高虾青素含量类外泌体的基因工程微拟球藻及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102078257B1 (ko) * 2018-04-17 2020-02-17 고려대학교 산학협력단 헤마토코쿠스 플루비알리스의 생물학적 전처리 및 화학적 추출을 포함하는 아스타잔틴의 제조방법
KR102107539B1 (ko) 2019-12-18 2020-05-07 송성은 침투이행성과 식이유용성이 증진된 아스타잔틴 및 유용지방산을 포함하는 미세조류 마이크로 분말의 제조방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0568585A (ja) * 1991-09-11 1993-03-23 Higashimaru Shoyu Kk アスタキサンチンの製造方法
KR100708386B1 (ko) * 2006-02-21 2007-04-18 성균관대학교산학협력단 녹조류에서 프리 아스타잔틴의 선택적 분리 방법
KR20140075869A (ko) * 2012-12-10 2014-06-20 고려대학교 산학협력단 아스타잔틴 생산을 위한 헤마토코쿠스 플루비알리스의 퍼퓨전 배양법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0568585A (ja) * 1991-09-11 1993-03-23 Higashimaru Shoyu Kk アスタキサンチンの製造方法
KR100708386B1 (ko) * 2006-02-21 2007-04-18 성균관대학교산학협력단 녹조류에서 프리 아스타잔틴의 선택적 분리 방법
KR20140075869A (ko) * 2012-12-10 2014-06-20 고려대학교 산학협력단 아스타잔틴 생산을 위한 헤마토코쿠스 플루비알리스의 퍼퓨전 배양법

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113322186A (zh) * 2021-06-21 2021-08-31 昆明理工大学 一种离子液体快速采收微藻的方法
CN113322186B (zh) * 2021-06-21 2023-05-26 昆明理工大学 一种离子液体快速采收微藻的方法
CN116836809A (zh) * 2023-09-01 2023-10-03 暨南大学 具有高虾青素含量类外泌体的基因工程微拟球藻及其应用
CN116836809B (zh) * 2023-09-01 2023-11-21 暨南大学 具有高虾青素含量类外泌体的基因工程微拟球藻及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160008921A (ko) 2016-01-25
KR101588585B1 (ko) 2016-01-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Matsumoto et al. Electron microscopic observations on the effects of penicillin on the morphology of Chlamydia psittaci
KR101180462B1 (ko) 무용매 추출 방법
Zhang et al. Cell cycles and proliferation patterns in Haematococcus pluvialis
WO2021002571A1 (ko) 식물 엑소좀의 대량 생산 방법
WO2016010225A1 (ko) 세포 재분화를 이용하여 미세조류로부터 아스타잔틴을 효율적으로 추출하는 방법
KR101907994B1 (ko) 미생물의 배양방법 및 그 배양미생물로부터 9-시스 베타카로틴의 분리 및 정제방법
JP2017521084A (ja) 微細藻類バイオマスから可溶性タンパク質を抽出する方法
EP2585582A2 (en) Deconstructing algae using ionic liquids
US20160237467A1 (en) Method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of bacillus subtilis subsp
WO2016179735A1 (en) A method of semi-solid state fermentation for producing surfactin from a mutant strain of bacillus subtilis subsp
KR101308354B1 (ko) 카로테노이드의 분리법
CN113260709A (zh) 从微藻萃取颜料的方法
CN114315924B (zh) 一种酚糖苷类化合物eyrein F、其制备方法及应用
KR20170028353A (ko) 미세조류 바이오매스로부터의 가용성 단백질의 추출 방법
WO2017209510A1 (ko) 두나리엘라 변이주 및 이를 이용한 색소 생산 방법
CN111534476B (zh) 一种贝类精巢生精细胞解离和分离的方法
JP4297654B2 (ja) フコキサンチンおよび／またはフコステロールの取得方法
CN104887615B (zh) 一种制备发菜细胞内类菌胞素氨基酸粗品的方法
CN120536245A (zh) 一株薄壁雨生红球藻及其应用
CN105754927A (zh) 缢江蓠原生质体的制备方法
CN107557303A (zh) 一种高产胞外多糖的海洋破囊壶菌菌株分离筛选方法
CN1791667A (zh) 源自Hahella chejuensis的具有溶藻作用的红色颜料
WO2006131240A2 (de) Rückführung lysierter biomasse als nährmedium bei der fermentativen herstellung von riboflavin
US20060105443A1 (en) Process for obtaining biosynthesized lycopene from bacterial cells and the purified lycopene of the same
Priest et al. Redifferentiation of connective tissue cells in serial culture

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 15822612

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 15822612

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1