WO2015199043A1 - カロテノイド合成酵素およびその利用 - Google Patents

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WO2015199043A1
WO2015199043A1 PCT/JP2015/067927 JP2015067927W WO2015199043A1 WO 2015199043 A1 WO2015199043 A1 WO 2015199043A1 JP 2015067927 W JP2015067927 W JP 2015067927W WO 2015199043 A1 WO2015199043 A1 WO 2015199043A1
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WO
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protein
gene
domain
transformant
carotene
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秋　庸裕
宏明 岩坂
佐藤　矩行
亮 小柳
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Hiroshima University NUC
kinawa Institute of Science and Technology Graduate University
Original Assignee
Hiroshima University NUC
kinawa Institute of Science and Technology Graduate University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the present invention relates to a novel carotenoid synthase and use thereof.
  • Carotenoids typified by astaxanthin and carotene are widely used in foods, cosmetics, pharmaceuticals and feeds.
  • Non-Patent Documents 1 to 14 a gene involved in carotenoid biosynthesis is identified (for example, see Non-Patent Documents 1 to 14), a transformant into which the identified gene is introduced is prepared, and the carotenoid is produced by the transformant. Attempts have been made to produce (see, for example, Patent Documents 1 to 3).
  • Patent Document 1 discloses a technique for producing carotenoids using a transformant into which a gene involved in carotenoid biosynthesis of Brevibacterium flavum has been introduced.
  • Patent Document 2 discloses a gene encoding phytoene synthase, a gene encoding phytoene desaturase, a gene encoding ⁇ -carotene desaturase, Also disclosed is a technique for producing carotenoids using a transformant into which at least one gene selected from the group consisting of genes encoding lycopene cyclase (Lycopene cyclase) has been introduced.
  • Patent Document 3 discloses a gene encoding phytoene desaturase, a gene encoding lycopene cyclase, a gene encoding ⁇ -carotene hydroxylase, and a gene encoding lycopene cyclase.
  • a technique for producing carotenoids using a transformant introduced with a gene encoding ⁇ -carotene-C (4) -oxygenase ( ⁇ -carotene C (4) oxygenase) is disclosed.
  • JP 2001-149077 A released June 5, 2001
  • JP 2002-537841 A published on November 12, 2002
  • JP 2006-75097 A published March 23, 2006
  • the conventional techniques as described above produce carotenoids by a multi-stage enzymatic reaction using a transformant that artificially expresses many types of enzymes simultaneously.
  • carotenoid productivity (for example, production amount) is greatly influenced by the enzyme with the slowest reaction rate and / or the enzyme with the least amount of expression among many types of enzymes. .
  • the conventional techniques as described above use transformants in which many types of enzymes are artificially expressed at the same time. Therefore, among these enzymes, enzymes with very slow reaction rates, As a result, the enzyme reaction stage through the enzyme becomes the rate-determining stage in the carotenoid biosynthesis system, resulting in a decrease in carotenoid productivity. ing.
  • the present invention has been made in view of the above conventional problems, and an object thereof is to provide a novel carotenoid synthase capable of improving the productivity of carotenoid and use thereof.
  • the protein of the present invention is characterized by including a phytoene desaturase domain, a phytoene synthase domain, and a lycopene cyclase domain.
  • the phytoene desaturase domain, the phytoene synthase domain, and the lycopene cyclase domain are preferably arranged in this order from the amino terminal side of the protein.
  • the protein of the present invention preferably contains at least part of the protein represented by the following (a) or (b). That means (A) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or (B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and having an activity of generating ⁇ -carotene from geranylgeranyl pyrophosphate.
  • the gene of the present invention is characterized by encoding the protein of the present invention in order to solve the above problems.
  • the gene of the present invention preferably contains at least a part of the following polynucleotide (c) or (d). That means (C) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or (D) hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 and produces ⁇ -carotene from geranylgeranyl pyrophosphate A polynucleotide encoding a protein having activity.
  • the vector of the present invention is characterized in that the gene of the present invention is inserted in order to solve the above problems.
  • the transformant of the present invention is characterized in that the vector of the present invention is introduced in order to solve the above problems.
  • the method for producing ⁇ -carotene of the present invention is characterized by including a step of culturing the transformant of the present invention in order to solve the above problems.
  • the transformant is preferably a transformant capable of producing geranylgeranyl pyrophosphate.
  • the method for producing astaxanthin of the present invention includes a step of culturing the transformant of the present invention in order to solve the above problems, and the transformant is a transformant capable of producing astaxanthin from ⁇ -carotene. It is characterized by.
  • the transformant is preferably further introduced with a CrtS gene.
  • the transformant is preferably further introduced with a CrtR gene.
  • the present invention can catalyze a multi-step reaction from the generation of geranylgeranyl pyrophosphate to ⁇ -carotene with a single enzyme, the productivity of carotenoid can be improved.
  • the multi-step reaction from the formation of ⁇ -carotene from geranylgeranyl pyrophosphate is catalyzed by a single enzyme, and the multi-step reaction proceeds continuously.
  • accumulation of intermediates in the transformation can be suppressed. That is, in the present invention, the amount of geranylgeranyl pyrophosphate used for the production of substances other than ⁇ -carotene can be reduced. Therefore, the present invention has an effect that the production amount of carotenoid can be increased.
  • the present invention has an effect that the production process of the transformant, more specifically, the production process of carotenoid can be simplified.
  • a transformant that simultaneously expresses a plurality of enzymes as in the prior art tends to change its trait and it is difficult to maintain a desired trait for a long period of time. As a result, it is difficult for the prior art to stably produce carotenoids.
  • a transformant expressing one enzyme may be used, and such a transformant is relatively easy to maintain a desired trait for a long period of time. Therefore, the present invention has an effect that carotenoid can be produced stably.
  • the protein of the present embodiment is a protein including a phytoene desaturase domain, a phytoene synthase domain, and a lycopene cyclase domain.
  • the term “protein” is used interchangeably with “polypeptide”, and a polymer of amino acids is intended.
  • phytoene desaturase domain means a domain having the activity of phytoene desaturase, in other words, a domain having high amino acid sequence homology with phytoene desaturase.
  • activity of phytoene desaturase means the activity of converting phytoene to lycopene.
  • the activity of phytoene desaturase can be confirmed by bringing a desired domain into contact with phytoene. Specifically, if lycopene is generated when a desired domain is brought into contact with phytoene, the domain can be determined to be a phytoene desaturase domain.
  • a specific method for testing that lycopene is produced from phytoene is not particularly limited, and a known method can be used as appropriate.
  • the presence of lycopene in a mixed solution of a desired domain and phytoene may be detected by various types of chromatography (for example, thin layer chromatography).
  • Whether or not the domain has high amino acid sequence homology with phytoene desaturase can be confirmed, for example, by comparing the amino acid sequence of the desired domain with the amino acid sequence of a known phytoene desaturase. Can do.
  • phytoene desaturases include, for example, Fulvivirga, Haloquadratum, Arabidopsis, Ectocarpus, or Xanthophyllomyces phytoene desaturase (for example, Accession No. ELR70603, CAJA20735A, AJA5735C, CAJA2A7A7, CAJAA2 .
  • the amino acid sequence of the desired domain and the amino acid sequence of a known phytoene desaturase are 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85 % Or more, more preferably 90% or more, and most preferably 95% or more, the domain can be determined to be a phytoene desaturase domain.
  • the homology of amino acid sequences can be determined by a known method. Specifically, GENETYX-WIN (manufactured by Genetics Co., Ltd.) is used in accordance with the GENETYX-WIN manual, for example, a homology search (homology search) between a specific amino acid sequence and an amino acid sequence to be compared is performed, and the same The homology can be calculated as the percentage (%) of amino acids.
  • GENETYX-WIN manufactured by Genetics Co., Ltd.
  • the homology can be calculated as the percentage (%) of amino acids.
  • the homology can be calculated as the ratio (%) of the number of identical amino acids to the total number of amino acids of the longer amino acid sequence of the amino acid sequences to be compared.
  • the domain having high amino acid sequence homology with phytoene desaturase is one or several (for example, within 20, 19, within 18, within the amino acid sequence of the well-known phytoene desaturase, 17 or less, 16 or less, 15 or less, 14 or less, 13 or less, 12 or less, 11 or less, 10 or less, 9 or less, 8 or less, 7 or less, 6 or less, 5 or less
  • phytoene synthase domain means a domain having the activity of phytoene synthase, in other words, a domain having high amino acid sequence homology with phytoene synthase.
  • the activity of phytoene synthase intends the activity of converting geranylgeranyl pyrophosphate into phytoene.
  • the activity of phytoene synthase can be confirmed by contacting a desired domain with geranylgeranyl pyrophosphate. Specifically, if phytoene is produced when a desired domain is contacted with geranylgeranyl pyrophosphate, the domain can be determined to be a phytoene synthase domain.
  • the specific method for testing that phytoene is produced from geranylgeranyl pyrophosphate is not particularly limited, and a known method can be used as appropriate.
  • the presence of phytoene in a mixed solution of a desired domain and geranylgeranyl pyrophosphate may be detected by various types of chromatography (for example, high performance liquid chromatography).
  • Whether or not a domain has high amino acid sequence homology with phytoene synthase can be confirmed, for example, by comparing the amino acid sequence of a desired domain with the amino acid sequence of a known phytoene synthase.
  • phytoene synthases include, for example, phytoene synthases of Fulvivirga, Haloquadratum, Arabidopsis, Ectocarpus, or Xanthophyllomyces. (For example, Accession No. ELR70639, CAJ52967, AED92400, CBJ31337 or AAO47570).
  • the amino acid sequence of the desired domain and the amino acid sequence of a known phytoene synthase are 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more. More preferably, if the homology is 90% or more, most preferably 95% or more, the domain can be determined to be a phytoene synthase domain.
  • the homology of the amino acid sequence can be determined in the same manner as in the “phytoene desaturase domain”.
  • the domain having high amino acid sequence homology with phytoene synthase is one or several in the amino acid sequence of the well-known phytoene synthase described above (for example, 20 or less, 19 or less, 18 or less, 17 or less, 16 pieces, 15 pieces, 14 pieces, 13 pieces, 12 pieces, 11 pieces, 10 pieces, 9 pieces, 8 pieces, 7 pieces, 6 pieces, 5 pieces, 4 pieces Or a domain consisting of an amino acid sequence in which 3 amino acids are deleted, substituted or added.
  • lycopene cyclase domain means a domain having lycopene cyclase activity, in other words, a domain having a high amino acid sequence homology with lycopene cyclase.
  • the activity of lycopene cyclase is intended to convert lycopene to ⁇ -carotene.
  • lycopene cyclase The activity of lycopene cyclase can be confirmed by bringing a desired domain into contact with lycopene. Specifically, if ⁇ -carotene is produced when a desired domain is brought into contact with lycopene, the domain can be determined to be a lycopene cyclase domain.
  • the specific method for testing the production of ⁇ -carotene from lycopene is not particularly limited, and a known method can be used as appropriate.
  • the presence of ⁇ -carotene in the mixed solution of the desired domain and lycopene may be detected by various types of chromatography (eg, thin layer chromatography).
  • a domain having high amino acid sequence homology with lycopene cyclase can be confirmed, for example, by comparing the amino acid sequence of the desired domain with the amino acid sequence of a known lycopene cyclase. .
  • lycopene cyclase examples include fulvivirga, Haloquadratum, Arabidopsis, Ectocarpus, or Xanthophyllomyces lycopene cyclase. (For example, Accession No. ELR70634, CAJ51148, AEE74875, CBN78004 or AAO47570).
  • the amino acid sequence of the desired domain and the amino acid sequence of a known lycopene cyclase are 50% or more, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85%. As described above, if the homology is 90% or more, most preferably 95% or more, the domain can be determined to be a lycopene cyclase domain. The homology of the amino acid sequence can be determined in the same manner as in the “phytoene desaturase domain”.
  • one or several domains (for example, 20 or less, 19 or less, 18 or less, 17) of the amino acid sequence of the well-known lycopene cyclizing enzyme described above have high homology with lycopene cyclase. Up to 16, up to 15, up to 14, up to 14, up to 13, up to 12, up to 11, up to 10, up to 9, up to 8, up to 7, up to 6, up to 5, It may be a domain consisting of an amino acid sequence in which 4 amino acids, 3 amino acids, or 2 amino acids are deleted, substituted or added.
  • the positions of the phytoene desaturase domain, phytoene synthase domain, and lycopene cyclase domain in the protein of the present embodiment are not particularly limited, but from the amino terminal side of the protein, the phytoene desaturase domain, They can be arranged in the order of the phytoene synthase domain and the lycopene cyclase domain.
  • phytoene synthase functions first, then phytoene desaturase functions, and finally lycopene cyclase functions.
  • the order of the phytoene desaturase domain, the phytoene synthase domain, and the lycopene cyclase domain from the amino terminal side of the protein. Can be arranged.
  • the order of the arrangement is a unique configuration of the present invention that cannot be conceived from conventional technical common sense.
  • the protein of the present embodiment may be a protein consisting of the protein represented by the following (a) or (b), or a protein containing the protein as at least a part: (A) a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, or (B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, and having an activity of generating ⁇ -carotene from geranylgeranyl pyrophosphate.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2 means that geranylgeranyl pyrophosphate to ⁇ -carotene found in the genus Aurantiochytrium genus KH105 is a diploid organism. Is a novel carotenoid synthase capable of catalyzing a multi-step reaction until it is produced.
  • a protein is a protein having the activity of generating ⁇ -carotene from geranylgeranyl pyrophosphate, whether ⁇ -carotene is generated when the protein is contacted with geranylgeranyl pyrophosphate. You can test it. That is, if ⁇ -carotene is produced when the protein is contacted with geranylgeranyl pyrophosphate, the protein can be determined to be a protein having an activity of producing ⁇ -carotene from geranylgeranyl pyrophosphate.
  • the specific determination method is not particularly limited, and a known method can be used as appropriate.
  • the extract of the solution or cell is separated by various chromatography (for example, thin layer chromatography), and ⁇ -The presence or absence of carotene may be confirmed based on color or absorbance.
  • an organic solvent for example, an acetone / methanol mixed solution
  • acetone / methanol mixed solution may be appropriately selected and used.
  • amino acid in which one or several amino acids are deleted, substituted or added the position where the deletion, substitution or addition occurs is not particularly limited.
  • the number of amino acids intended by “one or several amino acids” is not particularly limited, but is within 20 pieces, within 19 pieces, within 18 pieces, within 17 pieces, within 16 pieces, within 15 pieces, within 14 pieces, Less than 13, Less than 12, Less than 11, Less than 10, Less than 9, Less than 8, Less than 7, Less than 6, Less than 5, Less than 4, Less than 3, Less than 2, or It can be a single amino acid.
  • the amino acid substitution is preferably a conservative substitution.
  • the conservative substitution means that a specific amino acid is substituted with another amino acid having the same chemical properties and / or structure as the amino acid.
  • Chemical properties include, for example, hydrophobicity (hydrophobic and hydrophilic), charge (neutral, acidic and basic).
  • Examples of the structure include an aromatic ring, an aliphatic hydrocarbon group, and a carboxyl group that exist as a side chain or a functional group of the side chain.
  • conservative substitutions include, for example, substitution of serine and threonine, substitution of lysine and arginine, and substitution of phenylalanine and tryptophanamino.
  • substitutions include, for example, substitution of serine and threonine, substitution of lysine and arginine, and substitution of phenylalanine and tryptophanamino.
  • the present invention is not limited to these substitutions.
  • the protein of the present embodiment may be a protein containing at least a part of the protein represented by the following (e) or a protein comprising the protein represented by the following (e): (E) 50% or more of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 2, more preferably 60% or more, more preferably 70% or more, more preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably Proteins with homology of 90% or more, most preferably 95% or more.
  • the homology of amino acid sequences can be determined by a known method. Specifically, GENETYX-WIN (manufactured by Genetics Co., Ltd.) is used in accordance with the GENETYX-WIN manual, for example, a homology search (homology search) between a specific amino acid sequence and an amino acid sequence to be compared is performed, and the same The homology can be calculated as the percentage (%) of amino acids.
  • GENETYX-WIN manufactured by Genetics Co., Ltd.
  • the homology can be calculated as the percentage (%) of amino acids.
  • the homology can be calculated as the ratio (%) of the number of identical amino acids to the total number of amino acids of the longer amino acid sequence of the amino acid sequences to be compared.
  • the protein of the present embodiment may contain a configuration other than the above-described phytoene desaturase domain, phytoene synthase domain, and lycopene cyclase domain as necessary.
  • Examples of such a configuration include a linker that connects domains, a tag (for example, His tag, Flag tag, HA tag, Myc tag, etc.), and a protein (for example, GST protein, fluorescent protein, etc.).
  • a linker that connects domains
  • a tag for example, His tag, Flag tag, HA tag, Myc tag, etc.
  • a protein for example, GST protein, fluorescent protein, etc.
  • the linker may be a linker made of a polypeptide (for example, a linker made of 1 to 20 or 1 to 10 amino acids), or a well-known cross-linking agent capable of linking proteins. May be. If the linker is provided, the relative positions of the domains can be appropriately adjusted, so that a more active protein and / or a more heat-stable protein can be realized.
  • a linker made of a polypeptide for example, a linker made of 1 to 20 or 1 to 10 amino acids
  • a well-known cross-linking agent capable of linking proteins May be. If the linker is provided, the relative positions of the domains can be appropriately adjusted, so that a more active protein and / or a more heat-stable protein can be realized.
  • the gene of the present embodiment is [1. It is a gene encoding the protein of the present invention explained in the column of [Protein].
  • the term “gene” is used interchangeably with “polynucleotide”, “nucleic acid” or “nucleic acid molecule”, and is intended to be a polymer of nucleotides.
  • the codon encoding each amino acid constituting the protein is not limited, and may be a desired codon.
  • the gene of the present embodiment may be in the form of DNA (for example, cDNA or genomic DNA) or RNA (for example, mRNA). Furthermore, when it is in the form of DNA, it may be double-stranded DNA or single-stranded DNA. Furthermore, the single-stranded DNA and RNA may be a sense strand encoding a protein, or may be an antisense strand to the sense strand.
  • the gene of the present embodiment may be a gene comprising the following polynucleotide (c) or (d), or a gene containing the gene as at least a part thereof. That is, (c) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4, or (D) hybridizes under stringent conditions with DNA comprising a nucleotide sequence complementary to the polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 and produces ⁇ -carotene from geranylgeranyl pyrophosphate A polynucleotide encoding a protein having activity.
  • the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 or 4 is a gene obtained from geranylgeranyl pyrophosphate found in an Aurantiochytrium genus KH105 strain until the production of ⁇ -carotene. It is a polynucleotide encoding a novel carotenoid synthase capable of catalyzing the step reaction alone.
  • stringent conditions refers to hybridization solutions (50% formamide, 5 ⁇ SSC (150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate), 50 mM sodium phosphate (pH 7). .6) Incubate overnight at 42 ° C. in 5 ⁇ Denhart solution, 10% dextran sulfate, and 20 ⁇ g / ml denatured sheared salmon sperm DNA, then in 0.1 ⁇ SSC at about 65 ° C.
  • the washing conditions at high stringency can be changed as appropriate. For example, when using mammalian-derived DNA, 0.1% SDS containing 0.1% SDS is used.
  • washing at 65 ° C. in 5 ⁇ SSC (preferably 15 minutes ⁇ 2 times) is preferred, and EWhen using E. coli-derived DNA, washing at 68 ° C. in 0.1 ⁇ SSC containing 0.1% SDS (preferably 15 minutes ⁇ 2 times) is preferable, and when using RNA, 0.1% Washing at 68 ° C. in 0.1 ⁇ SSC containing SDS (preferably twice for 15 minutes) is preferable, and when using oligonucleotide, in 0.1 ⁇ SSC containing 0.1% SDS Washing at the hybridization temperature (preferably 15 minutes ⁇ 2 times) is preferred.
  • the above hybridization was performed by Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory (1989).
  • the gene according to the present embodiment includes a configuration other than the region encoding the phytoene desaturase domain, the region encoding the phytoene synthase domain, and the region encoding the lycopene cyclase domain as necessary. You may go out.
  • a polynucleotide encoding a linker that connects domains for example, a linker consisting of 1 to 20 or 1 to 10 amino acids
  • a tag for example, a His tag, a Flag tag
  • Examples include polynucleotides encoding HA tags, Myc tags, and the like, and polynucleotides encoding proteins (eg, GST protein, fluorescent protein, etc.).
  • the linker is provided, the relative positions of the domains can be appropriately adjusted, so that a more active protein and / or a more highly heat-stable protein can be realized.
  • the vector of the present embodiment is described in [2. It is a vector containing the gene of the present invention described in the section “Gene”. In other words, the vector of the present embodiment is [2. It is a vector into which the gene of the present invention described in the section “Gene” is inserted.
  • the specific type of the vector is not particularly limited, and the gene of the present invention is expressed in a desired host (for example, bacteria (for example, E. coli, Bacillus subtilis), yeast, filamentous fungi, fungi, animal cells, plant cells). Any vector can be used. Therefore, for known expression vectors [2. Vectors into which the gene of the present invention described in the section “Gene” is inserted are included in the vector of the present invention.
  • the vector only needs to contain an expression control region (for example, promoter, terminator, and / or replication origin) according to the type of host to be introduced.
  • an expression control region for example, promoter, terminator, and / or replication origin
  • the host is a bacterium, for example, a trc promoter, a tac promoter, or a lac promoter can be used as the promoter.
  • the promoter can be, for example, a GAL1 promoter, glyceraldehyde, or the like.
  • a triphosphate dehydrogenase promoter, a PHO5 promoter or the like can be used.
  • the host is a filamentous fungus, for example, an amylase promoter or a trpC promoter can be used as the promoter, and the host is an animal.
  • the SV40 early promoter or the SV40 late promoter can be used as the promoter.
  • the present invention is not limited to these configurations.
  • the expression control region may be a promoter capable of inducing expression (eg, tac promoter, GAL1 promoter, etc.).
  • the expression of the protein of the present invention can be induced at a specific timing in the host life cycle (in other words, a specific timing at which a specific metabolic pathway functions in the host). That is, in this configuration, A) a specific enzyme that is not originally contacted in the host is contacted with ⁇ -carotene, and / or B) the amount of phytoene, ⁇ -carotene, and lycopene in the host is determined. Can be reduced. As a result, production of a new carotenoid and / or improvement in production efficiency of a specific carotenoid can be realized.
  • the vector of this embodiment can be produced according to a conventional method. Transformation of the host with the vector of the present embodiment can also be performed according to conventional techniques.
  • the transformant of the present embodiment is [3.
  • the transformant of the present embodiment is [3.
  • the host is not particularly limited, and a desired host (for example, bacteria (for example, Escherichia coli, Bacillus subtilis), yeast, filamentous fungi, fungi, animal cells, plant cells) can be used as appropriate.
  • the host include, for example, a host in which geranylgeranyl pyrophosphate can be present in cells (for example, the following (1) to (3)), geranylgeranyl pyrophosphate can be present in cells, and Examples include hosts capable of producing astaxanthin from ⁇ -carotene (for example, (4) to (9) below).
  • a given host (6) Artificially imparted the ability to produce geranylgeranyl pyrophosphate (in other words, biosynthetic pathway) and originally produced the ability to produce astaxanthin from ⁇ -carotene (in other words, biosynthetic pathway).
  • geranylgeranyl pyrophosphate is present in the host.
  • the transformant when the transformant is prepared by introducing the vector of the present invention into such a host, the transformant contains the protein of the present invention expressed by the vector and geranylgeranyl pyrophosphate which is a substrate of the protein. Will come into contact. As a result, ⁇ -carotene can be produced from geranylgeranyl pyrophosphate.
  • the transformant can be obtained by introducing the vector of the present invention into such a host. As a result, the transformant can produce astaxanthin from ⁇ -carotene produced by the protein of the present invention.
  • a method for imparting to a host the ability to produce geranylgeranyl pyrophosphate is not particularly limited.
  • a gene encoding at least one enzyme that catalyzes a biosynthesis reaction of geranylgeranyl pyrophosphate can be expressed. Examples thereof include a method for introduction into a host.
  • Examples of such a gene include a gene encoding an enzyme that generates geranyl pyrophosphate from isopentenyl pyrophosphate (for example, a GDPS gene (Accession No. Y17376)), and an enzyme that generates farnesyl pyrophosphate from geranyl pyrophosphate.
  • Genes encoding eg, FDPS gene (Accession No. AY063112)
  • genes encoding enzymes that produce geranylgeranyl pyrophosphate from farnesyl pyrophosphate eg, BTS1 gene (Accession No. U31632), and CrtE gene ( Accession No. DQ016502)).
  • a gene encoding an enzyme that generates geranylgeranyl pyrophosphate from farnesyl pyrophosphate may be introduced into the host, or an enzyme that generates geranylgeranyl pyrophosphate from farnesyl pyrophosphate to the host.
  • the gene encoding and the gene encoding the enzyme that generates farnesyl pyrophosphate from geranyl pyrophosphate may be introduced, or the gene encoding the enzyme generating geranylgeranyl pyrophosphate from farnesyl pyrophosphate to the host and geranyl pyroline
  • a gene encoding an enzyme that generates farnesyl pyrophosphate from an acid and a gene encoding an enzyme that generates geranyl pyrophosphate from isopentenyl pyrophosphate may be introduced.
  • a method for imparting to a host the ability to produce astaxanthin from ⁇ -carotene is not particularly limited.
  • it encodes at least one enzyme that catalyzes a biosynthetic reaction for producing astaxanthin from ⁇ -carotene.
  • Examples thereof include a method for introducing a gene into a host so that the gene can be expressed.
  • enzymes examples include genes encoding enzymes that produce astaxanthin from ⁇ -carotene (for example, CrtS gene (Accession No. DQ202402) and CrtR gene (Accession No. EU884134)), ⁇ -carotene Genes encoding enzymes that produce canthaxanthin (for example, CrtO gene (Accession No. DQ257290) and CrtW gene (Accession No. EF031051)) and genes encoding enzymes that produce astaxanthin from canthaxanthin (for example, CrtZ gene (Accession No. EF031052)).
  • CrtS gene Accession No. DQ202402
  • CrtR gene accesion No. EU884134
  • ⁇ -carotene Genes encoding enzymes that produce canthaxanthin (for example, CrtO gene (Accession No. DQ257290) and CrtW gene (Accession No. EF031051)) and genes
  • a gene encoding an enzyme that generates astaxanthin from ⁇ -carotene may be introduced into the host, or a gene encoding an enzyme that generates canthaxanthin from ⁇ -carotene to the host. And a gene encoding an enzyme that produces astaxanthin from canthaxanthin may be introduced.
  • hosts include various microorganisms that have been confirmed to be carotenoid-produced (for example, the genus Hematotococcus, Monoraphidium, Phaffia (Xanthophyllomyces), Paracoccus, Brevundimonas, Gordoniaco (ccord)) , Nostoc genus and Gloeobacter genus), plants (eg oysters, oranges, carrots, tomatoes and tobacco).
  • the present invention is not limited to these hosts.
  • the method for producing ⁇ -carotene of the present embodiment includes a step of culturing the transformant of the present invention.
  • Specific culture methods for example, culture medium, culture time, culture temperature, etc. are not limited, and may be appropriately selected according to the host used for production of the transformant.
  • the transformant is preferably a transformant capable of producing geranylgeranyl pyrophosphate.
  • “transformants capable of producing geranylgeranyl pyrophosphate” include [4.
  • the hosts described in (1) to (9) described in the section “Transformant” are added to [3. Examples thereof include a transformant prepared by introducing the vector of the present invention described in the “Vector” column.
  • geranylgeranyl pyrophosphate is present in the cell.
  • the transformant when the transformant is prepared by introducing the vector of the present invention into such a host, the transformant contains the protein of the present invention expressed by the vector and geranylgeranyl pyrophosphate which is a substrate of the protein. Will come into contact. As a result, ⁇ -carotene can be produced from geranylgeranyl pyrophosphate.
  • the method for producing ⁇ -carotene of the present embodiment may include a step other than the step of culturing the transformant.
  • Examples of the step include a step of purifying ⁇ -carotene.
  • ⁇ -carotene may be purified by various chromatography.
  • the method for producing astaxanthin according to the present embodiment includes the step of culturing the transformant of the present invention, and the transformant is a transformant capable of producing astaxanthin from ⁇ -carotene.
  • Specific culture methods for example, culture medium, culture time, culture temperature, etc. are not limited, and may be appropriately selected according to the host used for production of the transformant.
  • a transformant is prepared by introducing the vector of the present invention into such a host.
  • the transformant can produce astaxanthin from ⁇ -carotene produced by the protein of the present invention.
  • the method for producing astaxanthin according to the present embodiment may include a step other than the step of culturing the transformant.
  • Examples of the step include a step of purifying astaxanthin.
  • astaxanthin may be purified by various chromatography.
  • KH105 strain was cultured in GPY medium (3% glucose, 0.6% polypeptone, 0.2% yeast extract, 2% sea salts) for 4 days, and the cells were collected by centrifugation. After the collected cells are washed with distilled water, the cells are lysed in buffer (0.25 M Tris-HCl, pH 8.2, 0.1 M EDTA (pH 8.0), 2% SDS, 0.1 M NaCl). It was suspended in.
  • the upper layer separated by the above centrifugation is collected in a new test tube, an equal amount of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixed solution (25: 24: 1, v / v) is added, and after gently tumbling for 20 minutes, The solution was centrifuged at 8000 rpm for 15 minutes at room temperature.
  • a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixed solution 25: 24: 1, v / v
  • the upper layer separated by the above centrifugation is collected in a new test tube, an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol mixed solution (24: 1, v / v) is added, and the solution is gently tumbled for 20 minutes. And centrifuged at room temperature for 15 minutes.
  • the upper layer separated by the above centrifugation was collected in a new test tube, 2.5 times the amount of chilled ethanol was added, and the mixture was inverted and stirred, and then the solution was centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes.
  • TE buffer 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0
  • RNase A was added so as to be / mL, and incubation was performed at 37 ° C. for 1 hour.
  • the upper layer separated by the above centrifugation is collected in a new test tube, an equal volume of chloroform / isoamyl alcohol mixed solution (24: 1, v / v) is added, and after inversion stirring, the solution is 8000 rpm, 15 minutes, Centrifuge at room temperature.
  • the upper layer separated by the above centrifugation was collected in a new test tube, 2.5 times the amount of chilled ethanol was added, and the mixture was inverted and stirred, and then the solution was centrifuged at 15000 rpm for 15 minutes.
  • the CrtIBY gene was amplified and isolated as follows by PCR using the genomic DNA of the KH105 strain as a template.
  • a PCR reaction solution containing 150 ng of genomic DNA, 1 unit / 50 ⁇ L of KOD FX neo (manufactured by Toyobo), 0.4 mM of dNTP, 0.3 ⁇ M of primer 1 and 0.3 ⁇ M of primer 2 was prepared.
  • Primer 1 5'-CAGTGTGCTGGAATTATGGCGCGCAGGGCGTCG-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • Primer 2 5'-GATATCTGCAGAATTTCAGGCATTCTTGTACAGCGGGAGC-3 '(SEQ ID NO: 6)
  • the PCR reaction solution was heated at 94 ° C. for 2 minutes, followed by a reaction cycle comprising a denaturation reaction at 98 ° C. for 10 seconds, an annealing reaction at 70 ° C. for 30 seconds, and an extension reaction at 68 ° C. for 2 minutes. Was repeated 30 times.
  • the PCR reaction solution was separated by agarose gel electrophoresis, and the amplified CrtIBY gene was purified from the agarose gel according to a conventional method.
  • each of the DNA base sequences of the two types of genes is shown in SEQ ID NOs: 3 and 4 (hereinafter also referred to as CrtIBY gene). Moreover, each of the amino acid sequences of the proteins encoded by the two types of genes is shown in SEQ ID NOs: 1 and 2.
  • the total length of the DNA encoding the protein was 3807 bp (including one stop codon), and encoded a polypeptide consisting of 1268 amino acids.
  • a protein having high homology to the polypeptide was searched from a database.
  • the polypeptide was derived from various organisms such as phytoene synthase (CrtB), phytoene desaturase. (CrtI) and lycopene cyclase (CrtY) were found to have domains showing high homology.
  • the above two types of polypeptides are, in order from the amino-terminal side, a domain having high homology with phytoene desaturase (CrtI) and a high homology with phytoene synthase (CrtB). And a domain exhibiting high homology with lycopene cyclase (CrtY).
  • Fig. 2 shows a molecular phylogenetic tree created based on homology with proteins derived from various organisms.
  • the molecular phylogenetic tree was created using a clustalw and a saveaw program. The specific creation procedure was in accordance with the manual attached to the program. As shown in FIG. 2, it has been clarified that proteins derived from any organisms are located in positions close to evolutionary phylogeny.
  • Saccharomyces cerevisiae INVSc1 (MATa his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52 / MAT ⁇ his3D1 leu2 trp1-289 ura3-52) was used as an expression host.
  • the expression of the CrtIBY gene was performed by S. Yeast expression vector capable of autonomous replication in cerevisiae, having URA3 as a selection marker, GAL1 promoter and CYC1 terminator capable of inducing expression in galactose as a gene expression control region, and ampicillin resistance gene as a selection marker in E. coli pYES2 (Life Technologies) was used.
  • PYES2 was digested with restriction enzyme Eco RI, the digest was subjected to agarose electrophoresis, and linearized pYES2 was purified from an agarose gel by a conventional method.
  • Linearized pYES2 100 ng of the PCR product containing the full length of the CrtIBY gene obtained in the previous section, and 5 ⁇ L of 5 ⁇ In-fusion HD enzyme premix (Clontech (Laboratories, Inc.) were mixed, and the mixture was Incubated at 50 ° C. for 15 minutes.
  • E. coli competent cells Stella TM Competent Cells (F-, endA1, supE44, thi-1, recA1, relA1, gyrA96, phoA, ⁇ 80d lacZ ⁇ m15, ⁇ (lacZYA-argF) U169, ⁇ 50 ⁇ L of a solution containing (mrr-hsdRMS-mcrBC), ⁇ mcrA, ⁇ -) (Clontech Laboratories, Inc.) was added, and the cell suspension was ice-cooled for 30 minutes and then heat shocked at 42 ° C. for 45 seconds. And immediately left on ice for 1 minute.
  • the bacterial cell suspension was applied to LB plate medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 2% agar) containing 50 ⁇ g / mL ampicillin, and cultured at 37 ° C. for 12 hours.
  • LB plate medium 1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 2% agar
  • Colonies that appeared on the LB plate medium were inoculated into 5 mL of LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and cultured at 37 ° C., 300 rpm for 12 hours.
  • the plasmid was extracted from the obtained cells in accordance with the protocol of PowerPrep Express Plasmid Miniprep System (OriGene).
  • the obtained plasmid was digested with restriction enzyme Xho I, and the digest was confirmed by agarose gel electrophoresis. As a result, it was judged that the target plasmid was obtained because it showed an expected band pattern.
  • An Escherichia coli strain having the target plasmid was inoculated into 50 mL of LB medium containing 50 ⁇ g / mL ampicillin and cultured at 37 ° C. and 160 rpm for 12 hours. From the obtained cells, NucleoBond (registered trademark) Xtra Midi Plus (The target plasmid, that is, the expression plasmid pYES2-CrtIBY was obtained according to the protocol of Clontech (Laboratories, Inc.).
  • Yeast cells were transformed with each of the above-described pYES2-CrtIBY and pYES2 serving as a negative control.
  • S. Cerevisiae INVSc1 was cultured in 5 mL of YPD medium (2% polypeptone, 1% yeast extract, 2% D-glucose) at 28 ° C. and 300 rpm for 12 hours. 1 mL of the culture solution was dispensed into a microtube, and the culture solution was centrifuged at 1500 g for 5 minutes at room temperature.
  • YPD medium 2% polypeptone, 1% yeast extract, 2% D-glucose
  • plasmid pYES2-CrtIBY or pYES2
  • the suspension after the incubation was added to SD plate medium (0.67% without uracil). Yeast nitrogen base w / o amino acids, 0.19% yeast synthetic drop out medium w / o uracil, 2% D-glucose, 2% agar) and cultured at 28 ° C.
  • Transformants that appeared on the SD plate medium were treated with 3 mL of SCT w / o ura medium (0.67% yeast nitrogen base w / o amino acids, 0.19% yeast synthetic dropout medium w / o uracil, 4% D -Raffinose) and inoculated at 28 ° C. and 300 rpm for 15 hours.
  • SCT w / o ura medium 0.67% yeast nitrogen base w / o amino acids, 0.19% yeast synthetic dropout medium w / o uracil, 4% D -Raffinose
  • the carotenoid pigment was extracted from the transformant in which the expression of the CrtIBY gene was induced as follows.
  • the supernatant separated by the above centrifugation is removed, and the precipitated cells are collected.
  • the cells are suspended in 1 mL of distilled water, and then the suspension is transferred to a screw-mouth test tube at 2000 g for 5 minutes. Centrifuge at 4 ° C.
  • the supernatant separated by the above centrifugation is removed and the precipitated cells are collected, and 1 mL of 3N HCl is added to the cells and suspended vigorously, and then the suspension is allowed to stand still in a boiling water bath for 3 minutes. I put it.
  • the suspension after standing was centrifuged at 2000 g for 5 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed and the precipitated cells were collected, and 1 mL of distilled water was added to the cells and suspended.
  • the suspension was centrifuged at 2000 g for 5 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed and the precipitated cells were collected, and 1 mL of an acetone / methanol mixture (7: 3, v / v) was added and vigorously suspended.
  • the suspension is centrifuged at 2000 g for 5 minutes at 4 ° C., and the resulting supernatant is transferred to a new screw-mouth test tube.
  • the supernatant is evaporated to dryness with a heat block at 60 ° C. under a nitrogen stream. Solidified.
  • the dried product was dissolved in 50 ⁇ L of acetone and transferred to a vial, and the dissolved product was used as a dye sample for each transformant.
  • the dye composition of the obtained dye sample was confirmed by thin-layer chromatography (TLC).
  • Acetone / hexane mixture (3: 7, v / v) was used as a developing solvent, and 20 ⁇ L of each dye sample was developed in the dark on TLC Silica gel 60 F 254 (Merck).
  • 10 ⁇ L each of 1 mg / mL ⁇ -carotene and astaxanthin was similarly developed.
  • lane 1 shows ⁇ -carotene as a comparative control
  • lane 2 shows astaxanthin as a comparative control
  • Lane 3 shows the test results of the yeast into which pYES2 was introduced, and production of ⁇ -carotene was not observed in the yeast.
  • lane 4 shows the test results of the yeast introduced with pYES2-CrtIBY, and production of ⁇ -carotene was observed in the yeast.
  • FIG. 4 shows the biosynthetic pathway and metabolic pathway of ⁇ -carotene, and genes encoding enzymes involved in the biosynthetic pathway and metabolic pathway.
  • Cerevisiae is a route originally owned by S. cerevisiae. This is a route that cerevisiae does not originally have.
  • IPP indicates isopentenyl pyrophosphate
  • GPP indicates geranyl pyrophosphate
  • FPP indicates farnesyl pyrophosphate
  • GGPP indicates geranylgeranyl pyrophosphate.
  • Cerevisiae can biosynthesize geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP), which is a substrate of phytoene synthase (CrtB), but cannot produce phytoene because it does not have phytoene synthase (CrtB).
  • GGPP phytoene synthase
  • S. Cerevisiae does not have phytoene desaturase / lycopene synthase (CrtI) and lycopene cyclase (CrtY), and therefore cannot produce ⁇ -carotene.
  • the CrtIBY gene encodes an enzyme having an activity to produce ⁇ -carotene using GGPP as a substrate.
  • a BTS1 gene (derived from S. cerevisiae INVSc1 geneome) (amino acid sequence: SEQ ID NO: 11, nucleotide sequence: SEQ ID NO: 12) encoding an enzyme responsible for the production of GGPP was further introduced. , Investigated its effect. The following tests were performed according to the method described in “Ukibe et al. (2009) Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Astaxanthin Production and Oxidative Stress Tolerance. Appl. Environ. Microbiol. 75: 7205-7211.
  • pHV1 The yeast constitutive expression plasmid pHV1, which can autonomously replicate in cerevisiae and has HIS3 as a selection marker, was used. More specifically, pHV-BTS1-crtS was constructed in which the BTS1 gene and the CrtS gene were inserted in tandem downstream of the ADH1 promoter in pHV1.
  • Transformation into yeast cells was performed by the method described above.
  • SD w / o ura his plate medium (0.67% yeast nitrogen base w / o amino acids, 0.19% yeast synthetic dropout medium w / ouracil, histidine, leucine, tryptophan, 2% D-glucose, 76 mg / L L-tryptophan, 76 mg / L L-leucine, 2% agar).
  • the obtained transformants were respectively SCT w / o ura, his medium (0.67% yeast nitrogen base w / o amino acid, 0.19% yeast synthetic dropout medium w / ouracile, histidine, histidine.
  • 4% D-raffinose, 76 mg / L L-tryptophan, 76 mg / L L-leucine was cultured in the same manner as described above, and the pigment composition was examined.
  • lane 5 shows the test results when a CrtS gene and a BTS1 gene were further expressed in yeast in addition to the CrtIBY gene.
  • the yeast expressing the CrtIBY gene, the BTS1 gene and the CrtS gene significantly increased the amount of ⁇ -carotene produced, and further, astaxanthin Production was barely observable. This indicates that the amount of GGPP serving as a substrate for the enzyme encoded by the CrtIBY gene was increased by the action of the BTS1 gene, and that astaxanthin was generated by the action of the CrtS gene.
  • the plasmid pAD4 for yeast constitutive expression that can replicate autonomously in cerevisiae and has LEU2 as a selection marker was used. More specifically, pAD-crtR in which the CrtR gene was inserted downstream of the ADH1 promoter in pAD4 was constructed.
  • Transformation into yeast cells was performed by the method described above, and pAD-crtR was also introduced into yeast into which only pYES2 and pHV-BTS1-crtS were introduced as a negative control.
  • SD w / o ura, his, leu plate medium 0.67% yeast nitrogen base w / o amino acids, 0.19% yeast synthetic dropout medium w / ouracile Histidine, leucine, tryptophan, 2% D-glucose, 76 mg / L L-tryptophan, 2% agar).
  • the resulting transformants were respectively SCT w / o ura, his, leu medium (0.67% yeast nitrogen base w / o amino acids, 0.19% yeast synthetic dropout medium w / o uracilin, histidine. , Tryptophan, 4% D-raffinose, 76 mg / L L-tryptophan) and cultured in the same manner as described above to examine the pigment composition.
  • the present invention can be used in the field of producing carotenoids. More specifically, the present invention can be used in the field of producing foods, cosmetics, pharmaceuticals, samples and the like.

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Abstract

　カロテノイドの生産性を向上させることができる新規なカロテノイド合成酵素およびその利用を提供する。本発明のタンパク質は、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメインを含むタンパク質である。

Description

カロテノイド合成酵素およびその利用
　本発明は、新規なカロテノイド合成酵素およびその利用に関する。
　アスタキサンチンやカロテンなどに代表されるカロテノイドは、食品、化粧品、医薬品および飼料などに広く利用されている。
　自然界から天然のカロテノイドを安全かつ安定して得ることは、非常に困難である。それ故に、現在、カロテノイドの生合成に関与する遺伝子を同定し（例えば、非特許文献１～１４参照）、同定された遺伝子が導入された形質転換体を作製して、当該形質転換体によってカロテノイドを生産する試みがなされている（例えば、特許文献１～３参照）。
　例えば、特許文献１には、ブレビバクテリウム　フラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ）のカロテノイドの生合成に関与する遺伝子が導入された形質転換体を用いて、カロテノイドを生産する技術が開示されている。
　特許文献２には、フィトエン合成酵素（Ｐｈｙｔｏｅｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）をコードする遺伝子、フィトエン不飽和化酵素（Ｐｈｙｔｏｅｎｅ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）をコードする遺伝子、ζ－カロテン不飽和化酵素（ζ－ｃａｒｏｔｅｎｅ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）をコードする遺伝子、および、リコペン環化酵素（Ｌｙｃｏｐｅｎｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）をコードする遺伝子からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子が導入された形質転換体を用いて、カロテノイドを生産する技術が開示されている。
　特許文献３には、フィトエン不飽和化酵素（Ｐｈｙｔｏｅｎｅ　ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ）をコードする遺伝子、リコペン環化酵素（Ｌｙｃｏｐｅｎｅ　ｃｙｃｌａｓｅ）をコードする遺伝子、β－カロテンハイドロキシラーゼ（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ　ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）をコードする遺伝子、および、β－カロテン－Ｃ（４）－オキシゲナーゼ（β－ｃａｒｏｔｅｎｅ　Ｃ（４）　ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）をコードする遺伝子が導入された形質転換体を用いて、カロテノイドを生産する技術が開示されている。
特開２００１－１４９０７７号公報（２００１年　６月　５日公開） 特表２００２－５３７８４１号公報（２００２年１１月１２日公開） 特開２００６－　７５０９７号公報（２００６年　３月２３日公開）
Takashi Maoka, Mar. Drugs, (2011), 9, p278-293 Yves Lemoine et al., Photosynth Res, (2010), 106, p155-177 Changfu Zhu et al., Archives of Biochemistry and Biophysics, (2010), 504, p132-141 Martine Bertrand, Photosynth Res, (2010), 106, p89-102 Chengwei Liang et al., Int. J. Biol. Sci., (2006), 2, p197-207 Mauricio Niklitschek et al., Biol Res, (2008), 41, p93-108 Vanessa Alvarez et al., Fungal Genetics and Biology, (2006), 43, p261-272 Jennifer Alcaino et al., BMC Microbiology, (2008), 8:169 Patrick Schaub et al., PLoS ONE, June 2012, Volume 7, Issue 6, p1-15 Ken Ukibe et al., Applied and Environmental Microbiology, Nov 2009, p7205-7211 Isabell Schmidt et al., Appl Microbiol Biotechnol, (2011), 89, p555-571 L. Campenni et al., Appl Microbiol Biotechnol, (2013), 97, p1383-1393 M.Aguila et al., Carotenoid Biosynthesis in Arabidopsis: AColorful Pathway, The Arabidopsis Book, First published on January 19, 2012, 1-28 Shinichi Takaichi, Mar. Drugs, (2011), 9, p1101-1118
　しかしながら、上述のような従来技術は、カロテノイドの生産性が低いという問題点を有している。
　具体的に、上述のような従来技術は、人為的に多くの種類の酵素を同時に発現させた形質転換体を用いて、多段階の酵素反応によってカロテノイドを生産している。
　この場合、カロテノイドの生産性（例えば、生産量）は、多くの種類の酵素の中の、最も反応速度の遅い酵素、および／または、最も発現量の少ない酵素などに大きく左右されることになる。
　そして、上述のような従来技術は、人為的に多くの種類の酵素を同時に発現させた形質転換体を用いているが故に、これらの酵素の中に、非常に反応速度の遅い酵素や、非常に発現量の少ない酵素が含まれてしまい、その結果、当該酵素を介した酵素反応の段階が、カロノイドの生合成系における律速段階になり、カロテノイドの生産性が低下するという問題点を有している。
　本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、カロテノイドの生産性を向上させることができる新規なカロテノイド合成酵素およびその利用を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成するまでの多段階の酵素反応を単独で触媒することができる新規なカロテノイド合成酵素を発見し、本発明を完成させるに至った。
　本発明のタンパク質は、上記課題を解決するために、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメインを含むことを特徴としている。
　本発明のタンパク質では、上記タンパク質のアミノ末端側から、上記フィトエン不飽和化酵素ドメイン、上記フィトエン合成酵素ドメインおよび上記リコペン環化酵素ドメインの順番にて配置されていることが好ましい。
　本発明のタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）で示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むことが好ましい。つまり、
（ａ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｂ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成する活性を有するタンパク質。
　本発明の遺伝子は、上記課題を解決するために、本発明のタンパク質をコードしていることを特徴としている。
　本発明の遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含むことが好ましい。つまり、
（ｃ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（ｄ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　本発明のベクターは、上記課題を解決するために、本発明の遺伝子が挿入されていることを特徴としている。
　本発明の形質転換体は、上記課題を解決するために、本発明のベクターが導入されていることを特徴としている。
　本発明のβ－カロテンの製造方法は、上記課題を解決するために、本発明の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴としている。
　本発明のβ－カロテンの製造方法では、上記形質転換体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成し得る形質転換体であることが好ましい。
　本発明のアスタキサンチンの製造方法は、上記課題を解決するために、本発明の形質転換体を培養する工程を含み、上記形質転換体はβ－カロテンからアスタキサンチンを生成し得る形質転換体であることを特徴としている。
　本発明のアスタキサンチンの製造方法では、上記形質転換体は、更に、ＣｒｔＳ遺伝子が導入されたものであることが好ましい。
　本発明のアスタキサンチンの製造方法では、上記形質転換体は、更に、ＣｒｔＲ遺伝子が導入されたものであることが好ましい。
　本発明は、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成するまでの多段階の反応を単独の酵素で触媒することができるので、カロテノイドの生産性を向上させることができるという効果を奏する。
　具体的に、従来知られているゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成する生合成経路では、β－カロテンが生成される前に様々な中間体（例えば、フィトエン、ζ－カロテン、リコペン）が形成され、これらの中間体が形質転換体内に蓄積されることになる。そして、蓄積された中間体は、β－カロテン以外の物質を生成するためにも利用され、β－カロテンの生産量が低下する。
　一方、本発明では、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成するまでの多段階の反応を単独の酵素で触媒し、多段階の反応が連続的に進むことになる。その結果、中間体が形質転換内に蓄積されることを抑制することができる。つまり、本発明では、β－カロテン以外の物質の生成に利用されるゲラニルゲラニルピロリン酸の量を少なくすることができる。それ故に、本発明は、カロテノイドの生産量を増加させることができるという効果を奏する。
　また、従来技術では、複数の酵素を同時に発現する形質転換体を作製する必要があったが、本発明であれば、１つの酵素を発現する形質転換体を作製すればよい。それ故に、本発明は、形質転換体の作製工程、更に言えば、カロテノイドの生産工程を簡略化させることができるという効果を奏する。
　また、従来技術のような複数の酵素を同時に発現する形質転換体は、その形質が変化し易く、所望の形質を長期間にわたって維持することが難しい。その結果、従来技術では、安定してカロテノイドを生産することが難しい。
　一方、本発明では、１つの酵素を発現する形質転換体を用いればよく、このような形質転換体は、所望の形質を長期間にわたって維持することが比較的容易である。それ故に、本発明は、安定してカロテノイドを生産することができるという効果を奏する。
本発明のタンパク質中の各ドメインに対して高い相同性を示す酵素を示す図である。 本発明のタンパク質、および、本発明のタンパク質の部分構造に対して高い相同性を示す酵素の分子系統樹である。 実施例における、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の発現解析の試験結果を示す写真である。 カロテノイドの生合成経路、および、当該生合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子を示す図である。
　本発明の一実施形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されない。本発明は、以下に説明する各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態および実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態および実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。また、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。
　〔１．タンパク質〕
　本実施の形態のタンパク質は、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメインを含むタンパク質である。なお、本明細書において、用語「タンパク質」は、「ポリペプチド」と交換可能に使用され、アミノ酸の重合体が意図される。
　本明細書において「フィトエン不飽和化酵素ドメイン」とは、フィトエン不飽和化酵素の活性を有しているドメイン、換言すれば、フィトエン不飽和化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインを意図する。なお、フィトエン不飽和化酵素の活性とは、フィトエンをリコペンに変換する活性を意図する。
　フィトエン不飽和化酵素の活性は、所望のドメインとフィトエンとを接触させることによって確認することができる。具体的に、所望のドメインとフィトエンとを接触させたときにリコペンが生成されれば、当該ドメインを、フィトエン不飽和化酵素ドメインであると判定することができる。
　なお、フィトエンからリコペンが生成されたことを試験する具体的な方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。例えば、各種クロマトグラフィー（例えば、薄層クロマトグラフィー）によって、所望のドメインとフィトエンとの混合溶液中におけるリコペンの存在を検出すればよい。
　フィトエン不飽和化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインであるか否かは、例えば、所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のフィトエン不飽和化酵素のアミノ酸配列とを比較することによって確認することができる。
　周知のフィトエン不飽和化酵素としては、例えば、Ｆｕｌｖｉｖｉｒｇａ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ、または、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓのフィトエン不飽和化酵素を挙げることができる（例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＥＬＲ７０６４０、ＣＡＪ５２９７０、ＡＡＡ２０１０９、ＣＢＮ７７３３８またはＡＡＯ５３２５７）。
　所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のフィトエン不飽和化酵素のアミノ酸配列とが、５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有していれば、当該ドメインを、フィトエン不飽和化酵素ドメインであると判定することができる。
　アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば、特定のアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｓｅａｒｃｈ）を行い、同一のアミノ酸の割合（％）として相同性を算出することができる。
　更に具体的には、比較するアミノ酸配列のうちの長い方のアミノ酸配列の総アミノ酸数に対する、同一のアミノ酸の数の割合（％）として、相同性を算出することができる。
　また、フィトエン不飽和化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインは、上述した周知のフィトエン不飽和化酵素のアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、または、２個以内）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。
　本明細書において「フィトエン合成酵素ドメイン」とは、フィトエン合成酵素の活性を有しているドメイン、換言すれば、フィトエン合成酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインを意図する。なお、フィトエン合成酵素の活性とは、ゲラニルゲラニルピロリン酸をフィトエンに変換する活性を意図する。
　フィトエン合成酵素の活性は、所望のドメインとゲラニルゲラニルピロリン酸とを接触させることによって確認することができる。具体的に、所望のドメインとゲラニルゲラニルピロリン酸とを接触させたときにフィトエンが生成されれば、当該ドメインを、フィトエン合成酵素ドメインであると判定することができる。
　ゲラニルゲラニルピロリン酸からフィトエンが生成されたことを試験する具体的な方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。例えば、各種クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー）によって、所望のドメインとゲラニルゲラニルピロリン酸との混合溶液中におけるフィトエンの存在を検出すればよい。
　フィトエン合成酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインであるか否かは、例えば、所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のフィトエン合成酵素のアミノ酸配列とを比較することによって確認することができる。
　周知のフィトエン合成酵素としては、例えば、Ｆｕｌｖｉｖｉｒｇａ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ、または、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓのフィトエン合成酵素を挙げることができる。（例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＥＬＲ７０６３９、ＣＡＪ５２９６７、ＡＥＤ９２４００、ＣＢＪ３１３３７またはＡＡＯ４７５７０）。
　所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のフィトエン合成酵素のアミノ酸配列とが、５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有していれば、当該ドメインを、フィトエン合成酵素ドメインであると判定することができる。なお、アミノ酸配列の相同性は、「フィトエン不飽和化酵素ドメイン」の場合と同様にして求めることができる。
　また、フィトエン合成酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインは、上述した周知のフィトエン合成酵素のアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、または、２個以内）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。
　本明細書において「リコペン環化酵素ドメイン」とは、リコペン環化酵素の活性を有しているドメイン、換言すれば、リコペン環化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインを意図する。なお、リコペン環化酵素の活性とは、リコペンをβ－カロテンに変換する活性を意図する。
　リコペン環化酵素の活性は、所望のドメインとリコペンとを接触させることによって確認することができる。具体的に、所望のドメインとリコペンとを接触させたときにβ－カロテンが生成されれば、当該ドメインを、リコペン環化酵素ドメインであると判定することができる。
　リコペンからβ－カロテンが生成されたことを試験する具体的な方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。例えば、各種クロマトグラフィー（例えば、薄層クロマトグラフィー）によって、所望のドメインとリコペンとの混合溶液中におけるβ－カロテンの存在を検出すればよい。
　リコペン環化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインであるか否かは、例えば、所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のリコペン環化酵素のアミノ酸配列とを比較することによって確認することができる。
　周知のリコペン環化酵素としては、例えば、Ｆｕｌｖｉｖｉｒｇａ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｅｃｔｏｃａｒｐｕｓ、または、Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓのリコペン環化酵素を挙げることができる。（例えば、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＥＬＲ７０６３４、ＣＡＪ５１１４８、ＡＥＥ７４８７５、ＣＢＮ７８００４またはＡＡＯ４７５７０）。
　所望のドメインのアミノ酸配列と、周知のリコペン環化酵素のアミノ酸配列とが、５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有していれば、当該ドメインを、リコペン環化酵素ドメインであると判定することができる。なお、アミノ酸配列の相同性は、「フィトエン不飽和化酵素ドメイン」の場合と同様にして求めることができる。
　また、リコペン環化酵素とアミノ酸配列の相同性が高いドメインは、上述した周知のリコペン環化酵素のアミノ酸配列において１若しくは数個（例えば、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、または、２個以内）のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるドメインであってもよい。
　本実施の形態のタンパク質内における、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメインの位置は特に限定されないが、タンパク質のアミノ末端側から、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメインおよびリコペン環化酵素ドメインの順番にて配置され得る。
　ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成する場合、従来公知の酵素では、まず、フィトエン合成酵素が機能し、次いでフィトエン不飽和化酵素が機能し、最後にリコペン環化酵素が機能する。
　本発明のタンパク質のような３つのドメインを有するタンパク質は未知であるので、当業者が当該３つのドメインの配置を考えること自体あり得ないことではあるが、仮に考えたとすれば、酵素が機能する順番に基づけば、当業者であれば、タンパク質のアミノ末端側から、フィトエン合成酵素ドメイン、フィトエン不飽和化酵素ドメインおよびリコペン環化酵素ドメインの順番にて配置されると考えるのが一般的である。
　つまり、当業者であれば、フィトエン合成酵素ドメインによって形成された第１の中間体がフィトエン不飽和化酵素ドメインへ受け渡されるためには、フィトエン合成酵素ドメインとフィトエン不飽和化酵素ドメインとが隣接している必要があり、フィトエン不飽和化酵素ドメインによって形成された第２の中間体がリコペン環化酵素ドメインへ受け渡されるためには、フィトエン不飽和化酵素ドメインとリコペン環化酵素ドメインとが隣接している必要があると考える。それ故に、当業者であれば、タンパク質のアミノ末端側から、フィトエン合成酵素ドメイン、フィトエン不飽和化酵素ドメインおよびリコペン環化酵素ドメインの順番にて配置されると考える。
　しかしながら、後述する実施例にて示すように、驚くべきことに本実施の形態のタンパク質では、タンパク質のアミノ末端側から、フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメインおよびリコペン環化酵素ドメインの順番にて配置され得る。当該配置の順番は、従来の技術常識からは決して想到できない、本発明の独自の構成である。
　本実施の形態のタンパク質は、以下の（ａ）または（ｂ）で示されるタンパク質からなるタンパク質、または、当該タンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質であってもよい：
（ａ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
（ｂ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成する活性を有するタンパク質。
　ここで、配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質とは、２倍体の生物であるオーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＫＨ１０５株から見出された、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成するまでの多段階の反応を単独で触媒することができる新規なカロテノイド合成酵素である。
　タンパク質が、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成する活性を有するタンパク質であるか否かを判定するためには、タンパク質とゲラニルゲラニルピロリン酸とを接触させたときにβ－カロテンが生成されるか否かを試験すればよい。つまり、タンパク質とゲラニルゲラニルピロリン酸とを接触させたときにβ－カロテンが生成されれば、当該タンパク質を、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成する活性を有するタンパク質であると判定することができる。
　具体的な判定方法は特に限定されず、適宜、周知の方法を用いることができる。例えば、タンパク質とゲラニルゲラニルピロリン酸とを溶液中または細胞中で接触させた後、当該溶液または細胞の抽出物を各種クロマトグラフィー（例えば、薄層クロマトグラフィー）にて分離して、抽出物中にβ－カロテンが存在するか否かを、色または吸光度などに基づいて確認すればよい。なお、上記抽出には、有機溶媒（例えば、アセトン／メタノール混合液など）を適宜選択して用いればよい。
　本明細書における「１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸」では、欠失、置換若しくは付加が生じる位置は特に限定されない。
　また、「１若しくは数個のアミノ酸」が意図するアミノ酸の数は特に限定されないが、２０個以内、１９個以内、１８個以内、１７個以内、１６個以内、１５個以内、１４個以内、１３個以内、１２個以内、１１個以内、１０個以内、９個以内、８個以内、７個以内、６個以内、５個以内、４個以内、３個以内、２個以内、または、１個のアミノ酸であり得る。
　アミノ酸の置換は、保存的置換であることが好ましい。なお、保存的置換とは、特定のアミノ酸から、当該アミノ酸と同様な化学的性質および／または構造を有する他のアミノ酸に置換されることをいう。化学的性質としては、例えば、疎水性度（疎水性および親水性）、電荷（中性、酸性および塩基性）が挙げられる。構造としては、例えば、側鎖、または、側鎖の官能基として存在する芳香環、脂肪炭化水素基およびカルボキシル基が挙げられる。
　保存的置換の例としては、例えば、セリンとスレオニンとの置換、リジンとアルギニンとの置換、およびフェニルアラニンとトリプトファンアミノとの置換、が挙げられる。勿論、本発明は、これらの置換に限定されない。
　本実施の形態のタンパク質は、以下の（ｅ）で示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むタンパク質、または、以下の（ｅ）で示されるタンパク質からなるタンパク質であってもよい：
（ｅ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列と５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質。
　なお、アミノ酸配列の相同性は、公知の方法で求めることができる。具体的には、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＷＩＮ（株式会社ゼネティックス社製）を、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＷＩＮのマニュアルに従って使用し、例えば、特定のアミノ酸配列と比較対象のアミノ酸配列とのホモロジーサーチ（ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｓｅａｒｃｈ）を行い、同一のアミノ酸の割合（％）として相同性を算出することができる。
　更に具体的には、比較するアミノ酸配列のうちの長い方のアミノ酸配列の総アミノ酸数に対する、同一のアミノ酸の数の割合（％）として、相同性を算出することができる。
　本実施の形態のタンパク質は、必要に応じて上述したフィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメイン以外の構成を含んでいてもよい。
　このような構成としては、例えば、ドメイン同士を繋ぐリンカー、タグ（例えば、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグなど）、タンパク質（例えば、ＧＳＴタンパク質、蛍光タンパク質など）を挙げることができる。
　リンカーは、ポリペプチドからなるリンカー（例えば、１～２０個、または、１～１０個のアミノ酸からなるリンカー）であってもよいし、タンパク質同士を連結することが可能な周知の架橋剤であってもよい。リンカーを備えていれば、ドメイン同士の相対的な位置を適切に調節することができるので、より活性の高いタンパク質、および／または、より熱安定性の高いタンパク質を実現することができる。
　〔２．遺伝子〕
　本実施の形態の遺伝子は、〔１．タンパク質〕の欄にて説明した本発明のタンパク質をコードしている遺伝子である。なお、本明細書において、用語「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」と交換可能に使用され、ヌクレオチドの重合体が意図される。
　本実施の形態の遺伝子では、タンパク質を構成する各アミノ酸をコードするコドンは限定されず、所望のコドンであり得る。
　また、本実施の形態の遺伝子は、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）の形態であってもよいし、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の形態であってもよい。更に、ＤＮＡの形態である場合、二本鎖ＤＮＡであってもよいし、一本鎖ＤＮＡであってもよい。更に、一本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡは、タンパク質をコードするセンス鎖であってもよいし、当該センス鎖に対するアンチセンス鎖であってもよい。
　本実施の形態の遺伝子は、以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドからなる遺伝子、または、当該遺伝子を少なくとも一部分として含む遺伝子であってもよい。つまり、（ｃ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
（ｄ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
　ここで、配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドとは、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＫＨ１０５株から見出された、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成するまでの多段階の反応を単独で触媒することができる新規なカロテノイド合成酵素をコードするポリヌクレオチドである。
　本明細書中で使用される場合、用語「ストリンジェントな条件」は、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート液、１０％硫酸デキストラン、および２０μｇ／ｍｌの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む）中にて４２℃で一晩インキュベーションした後、約６５℃にて０．１×ＳＳＣ中でフィルターを洗浄することが意図されるが、ハイブリダイゼーションさせるポリヌクレオチドによって、高ストリンジェンシーでの洗浄条件は適宜変更され、例えば、哺乳類由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ中にて６５℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、Ｅ．ｃｏｌｉ由来ＤＮＡを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、ＲＮＡを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にて６８℃での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましく、オリゴヌクレオチドを用いる場合は、０．１％　ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣ中にてハイブリダイゼーション温度での洗浄（好ましくは１５分間×２回）が好ましい。また、上記ハイブリダイゼーションは、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｄ　Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に記載されている周知の方法で行うことができる。
　本実施の形態の遺伝子は、必要に応じて上述したフィトエン不飽和化酵素ドメインをコードする領域、フィトエン合成酵素ドメインをコードする領域、および、リコペン環化酵素ドメインをコードする領域以外の構成を含んでいてもよい。
　このような構成としては、例えば、ドメイン同士を繋ぐリンカーをコードするポリヌクレオチド（例えば、１～２０個、または、１～１０個のアミノ酸からなるリンカー）、タグ（例えば、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグなど）をコードするポリヌクレオチド、タンパク質（例えば、ＧＳＴタンパク質、蛍光タンパク質など）をコードするポリヌクレオチドを挙げることができる。
　リンカーを備えていれば、ドメイン同士の相対的な位置を適切に調節することができるので、より活性の高いタンパク質、および／または、より熱安定性の高いタンパク質を実現することができる。
　〔３．ベクター〕
　本実施の形態のベクターは、〔２．遺伝子〕の欄にて説明した本発明の遺伝子を含むベクターである。換言すれば、本実施の形態のベクターは、〔２．遺伝子〕の欄にて説明した本発明の遺伝子が挿入されたベクターである。
　ベクターの具体的な種類は特に限定されず、所望の宿主（例えば、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）、酵母、糸状菌、真菌、動物細胞、植物細胞）の中で本発明の遺伝子を発現可能なベクターであればよい。それ故に、周知の発現ベクターに対して〔２．遺伝子〕の欄にて説明した本発明の遺伝子が挿入されたベクターが、本発明のベクターに包含される。
　ベクターは、導入されるべき宿主の種類に応じた発現制御領域（例えば、プロモーター、ターミネーター、および／または複製起点等）を含有したものであればよい。宿主が細菌である場合、プロモーターとしては、例えば、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、または、ｌａｃプロモーター等を使用することができ、宿主が酵母である場合、プロモーターとしては、例えば、ＧＡＬ１プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、または、ＰＨＯ５プロモーター等を使用することができ、宿主が糸状菌である場合、プロモーターとしては、例えば、アミラーゼプロモーター、または、ｔｒｐＣプロモーター等を使用することができ、宿主が動物細胞である場合、プロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター、または、ＳＶ４０後期プロモーター等を使用することができる。勿論、本発明は、これらの構成に限定されない。
　上記発現制御領域は、発現誘導が可能なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ＧＡＬ１プロモーターなど）であってもよい。
　当該構成であれば、宿主の生活環の特定のタイミング（換言すれば、宿主内で特定の代謝経路が機能している特定のタイミング）にて本発明のタンパク質の発現を誘導することができる。つまり、当該構成であれば、Ａ）宿主内で本来接触することが無い特定の酵素とβ－カロテンとを接触させる、および／または、Ｂ）宿主内のフィトエン、ζ－カロテンおよびリコペンの量を減少させる、ことができる。その結果、新規なカロテノイドの生産、および／または、特定のカロテノイドの生産効率の向上、を実現することができる。
　本実施の形態のベクターは、慣用的な手法に従って作製することができる。本実施の形態のベクターによる宿主の形質転換もまた、慣用的な手法に従って行うことができる。
　〔４．形質転換体〕
　本実施の形態の形質転換体は、〔３．ベクター〕の欄にて説明した本発明のベクターを含む形質転換体である。換言すれば、本実施の形態の形質転換体は、〔３．ベクター〕の欄にて説明した本発明のベクターを所望の宿主に導入することによって、〔１．タンパク質〕の欄にて説明した本発明のタンパク質を発現可能になった形質転換体である。
　上記宿主としては特に限定されず、適宜、所望の宿主（例えば、細菌（例えば、大腸菌、枯草菌）、酵母、糸状菌、真菌、動物細胞、植物細胞）を用いることができる。
　上記宿主の具体例としては、例えば、ゲラニルゲラニルピロリン酸が細胞内に存在し得る宿主（例えば、下記（１）～（３）など）、および、ゲラニルゲラニルピロリン酸が細胞内に存在し得、かつ、β－カロテンからアスタキサンチンを生成し得る宿主（例えば、下記（４）～（９）など）を挙げることができる。更に具体的には、
（１）元々、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）を有している宿主；
（２）人為的に、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与された宿主；
（３）外界（例えば、培地）から細胞内にゲラニルゲラニルピロリン酸を取り込む能力を有している宿主；
（４）元々、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）と、β－カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）とを有している宿主；
（５）元々、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）を有し、かつ、人為的に、β－カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与された宿主；
（６）人為的に、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与され、かつ、元々、β－カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）を有している宿主；
（７）人為的に、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与され、かつ、人為的に、β－カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与された宿主；
（８）外界（例えば、培地）から細胞内にゲラニルゲラニルピロリン酸を取り込む能力を有し、かつ、元々、β－カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）を有している宿主；
（９）外界（例えば、培地）から細胞内にゲラニルゲラニルピロリン酸を取り込む能力を有し、かつ、人為的に、β－カロテンからアスタキサンチンを生成する能力（換言すれば、生合成経路）が付与された宿主。
　上記（１）～（９）の宿主であれば、宿主内にゲラニルゲラニルピロリン酸が存在する。そして、このような宿主に本発明のベクターを導入して形質転換体を作製すれば、当該形質転換体では、ベクターによって発現された本発明のタンパク質と、当該タンパク質の基質であるゲラニルゲラニルピロリン酸とが接触することになる。その結果、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成することができる。
　更に、上記（４）～（９）の宿主であれば、宿主がβ－カロテンからアスタキサンチンを生成する能力を有しているので、このような宿主に本発明のベクターを導入して形質転換体を作製すれば、当該形質転換体では、本発明のタンパク質によって生成されたβ－カロテンからアスタキサンチンを生成することができる。
　人為的に、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する能力を宿主に付与する方法としては特に限定されないが、例えば、ゲラニルゲラニルピロリン酸の生合成反応を触媒する酵素の少なくとも１つをコードする遺伝子を、発現可能に宿主に導入する方法を挙げることができる。
　このような遺伝子としては、例えば、イソペンテニルピロリン酸からゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＧＤＰＳ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｙ１７３７６））、ゲラニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＦＤＰＳ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＡＹ０６３１１２））、および、ファルネシルピロリン酸からゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＢＴＳ１遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．Ｕ３１６３２）、および、ＣｒｔＥ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＤＱ０１６５０２））を挙げることができる。
　更に具体的には、宿主に対してファルネシルピロリン酸からゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子のみを導入してもよいし、宿主に対してファルネシルピロリン酸からゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子とゲラニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子とを導入してもよいし、宿主に対してファルネシルピロリン酸からゲラニルゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子とゲラニルピロリン酸からファルネシルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子とイソペンテニルピロリン酸からゲラニルピロリン酸を生成する酵素をコードする遺伝子とを導入してもよい。
　人為的に、β－カロテンからアスタキサンチンを生成する能力を宿主に付与する方法としては特に限定されないが、例えば、β－カロテンからアスタキサンチンを生成する生合成反応を触媒する酵素の少なくとも１つをコードする遺伝子を、発現可能に宿主に導入する方法を挙げることができる。
　このような酵素としては、例えば、β－カロテンからアスタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＣｒｔＳ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＤＱ２０２４０２）、および、ＣｒｔＲ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＥＵ８８４１３４））、β－カロテンからカンタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＣｒｔＯ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＤＱ２５７２９０）、および、ＣｒｔＷ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＥＦ０３１０５１））、および、カンタキサンチンからアスタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子（例えば、ＣｒｔＺ遺伝子（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．ＥＦ０３１０５２））を挙げることができる。
　更に具体的には、宿主に対してβ－カロテンからアスタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子のみを導入してもよいし、宿主に対してβ－カロテンからカンタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子とカンタキサンチンからアスタキサンチンを生成する酵素をコードする遺伝子とを導入してもよい。
　上述した宿主の更に具体的な例としては、カロテノイド産生が確認されている種々の微生物（例えば、Ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｍｏｎｏｒａｐｈｉｄｉｕｍ属、Ｐｈａｆｆｉａ属（Ｘａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ属）、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ属、Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ属、Ｇｏｒｄｏｎｉａ属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属）、Ｎｏｓｔｏｃ属、および、Gloeobacter属）、植物（例えば、カキ、オレンジ、ニンジン、トマト、および、タバコ）を挙げることができる。勿論、本発明は、これらの宿主に限定されない。
　〔５．β－カロテンの製造方法〕
　本実施の形態のβ－カロテンの製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含んでいる。
　具体的な培養方法（例えば、培養培地、培養時間、培養温度など）は限定されず、形質転換体の作製に用いた宿主などに応じて適宜選択すればよい。
　上記形質転換体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成し得る形質転換体であることが好ましい。
　より具体的に、「ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成し得る形質転換体」としては、〔４．形質転換体〕の欄にて説明した（１）～（９）の宿主に、〔３．ベクター〕の欄にて説明した本発明のベクターを導入して作製された形質転換体を挙げることができる。
　上記（１）～（９）の宿主であれば、細胞内にゲラニルゲラニルピロリン酸が存在する。そして、このような宿主に本発明のベクターを導入して形質転換体を作製すれば、当該形質転換体では、ベクターによって発現された本発明のタンパク質と、当該タンパク質の基質であるゲラニルゲラニルピロリン酸とが接触することになる。その結果、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成することができる。
　本実施の形態のβ－カロテンの製造方法は、形質転換体を培養する工程以外の工程を含んでいてもよい。
　当該工程としては、例えば、β－カロテンを精製する工程を挙げることができる。例えば、各種クロマトグラフィーによって、β－カロテンを精製してもよい。
　〔６．アスタキサンチンの製造方法〕
　本実施の形態のアスタキサンチンの製造方法は、本発明の形質転換体を培養する工程を含み、当該形質転換体はβ－カロテンからアスタキサンチンを生成し得る形質転換体である。
　具体的な培養方法（例えば、培養培地、培養時間、培養温度など）は限定されず、形質転換体の作製に用いた宿主などに応じて適宜選択すればよい。
　「β－カロテンからアスタキサンチンを生成し得る形質転換体」としては、〔４．形質転換体〕の欄にて説明した（４）～（９）の宿主に、〔３．ベクター〕の欄にて説明した本発明のベクターを導入して作製した形質転換体を挙げることができる。
　上記（４）～（９）の宿主であれば、宿主がβ－カロテンからアスタキサンチンを生成する能力を有しているので、このような宿主に本発明のベクターを導入して形質転換体を作製すれば、当該形質転換体では、本発明のタンパク質によって生成されたβ－カロテンからアスタキサンチンを生成することができる。
　本実施の形態のアスタキサンチンの製造方法は、形質転換体を培養する工程以外の工程を含んでいてもよい。
　当該工程としては、例えば、アスタキサンチンを精製する工程を挙げることができる。例えば、各種クロマトグラフィーによって、アスタキサンチンを精製してもよい。
　＜１．カロテノイド合成酵素ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の単離＞
　オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属ＫＨ１０５株（ＩＰＯＤ　独）製品評価技術基盤機構　特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ－ＩＰＯＤ）（２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２０号室）へ寄託。受領番号：ＦＥＲＭ　ＡＰ－２２２６７（日本国内寄託）、寄託番号：ＦＥＲＭ　Ｐ－２２２６７（日本国内寄託）、受領番号：ＦＥＲＭ　ＡＢＰ－２２２６７（国際寄託）、寄託番号：ＦＥＲＭ　ＢＰ－２２２６７（国際寄託）、国内寄託日：２０１４年３月１４日、国際寄託への移管請求日（前記寄託機関が移管請求を受領した日）：２０１５年５月１１日、発行日（前記寄託機関が「原寄託についての受託証」及び「生存に関する証明書」を発行した日）：２０１５年５月２８日）のゲノムＤＮＡを、以下のように調製した。
　ＫＨ１０５株をＧＰＹ培地（３％　ｇｌｕｃｏｓｅ、０．６％　ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎｅ、０．２％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、２％　ｓｅａ　ｓａｌｔｓ）中で４日間培養した後、遠心分離によって菌体を回収した。回収した菌体を蒸留水で洗浄した後、当該菌体をｌｙｓｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．２、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、２％　ＳＤＳ、０．１Ｍ　ＮａＣｌ）中に懸濁した。
　上記懸濁液に対して平衡化フェノール（フェノールに８－ヒドロキシキノリンを加え、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌでｐＨ８．０に平衡化された平衡化フェノール）を等量加え、２０分間緩やかに転倒撹拌した後で、当該溶液を８０００ｒｐｍ、１５分間、室温にて遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上層を新しい試験管に回収し、等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２５：２４：１，ｖ／ｖ）を加え、２０分間緩やかに転倒撹拌した後で、当該溶液を８０００ｒｐｍ、１５分間、室温にて遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上層を新しい試験管に回収し、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２４：１，ｖ／ｖ）を加え、２０分間緩やかに転倒撹拌した後で、当該溶液を８０００ｒｐｍ、１５分間、室温にて遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上層を新しい試験管に回収し、２．５倍量の冷却エタノールを加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を１５０００ｒｐｍ、１５分間、遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上清を捨てて沈殿を回収し、当該沈殿に７０％冷却エタノールを５ｍＬ加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を１５０００ｒｐｍ、５分間、遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上清を捨てて沈殿を回収し、当該沈殿にＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１ｍＬ加えてゲノムＤＮＡを溶解させた後、当該溶液に１μｇ／ｍＬとなるようにＲＮａｓｅ　Ａを加えて３７℃で１時間のインキュベートを行った。
　上記溶液に対して等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混液（２５：２４：１，ｖ／ｖ）を加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を８０００ｒｐｍ、１５分間、室温にて遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上層を新しい試験管に回収し、等量のクロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２４：１，ｖ／ｖ）を加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を８０００ｒｐｍ、１５分間、室温にて遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上層を新しい試験管に回収し、２．５倍量の冷却エタノールを加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を１５０００ｒｐｍ、１５分間、遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上清を捨てて沈殿を回収し、当該沈殿に７０％冷却エタノールを５ｍＬ加え、転倒撹拌した後で、当該溶液を１５０００ｒｐｍ、５分間、遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上清を捨てて沈殿を回収し、当該沈殿にＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を１ｍＬ加えてゲノムＤＮＡを溶解させた。
　次いで、ＫＨ１０５株のゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲによって、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子を、以下のように増幅して単離した。
　ゲノムＤＮＡ　１５０ｎｇ、ＫＯＤ　ＦＸ　ｎｅｏ（東洋紡製）　１ｕｎｉｔ／５０μＬ、ｄＮＴＰ　各０．４ｍＭ、プライマー１　０．３μＭ、プライマー２　０．３μＭを含むＰＣＲ反応溶液を作製した。
・プライマー１：5’-CAGTGTGCTGGAATTATGGCGCGCAGGGCGTCG　　　 -3’（配列番号５）
・プライマー２：5’-GATATCTGCAGAATTTCAGGCATTCTTGTACAGCGGGAGC-3’（配列番号６）
　上記ＰＣＲ反応溶液を９４℃にて２分間加熱した後、９８℃にて１０秒間の変性反応、７０℃にて３０秒間のアニーリング反応、および、６８℃にて２分間の伸長反応からなる反応サイクルを３０回繰り返した。
　ＰＣＲ反応の後、ＰＣＲ反応溶液をアガロースゲル電気泳動によって分離し、常法にしたがって、増幅されたＣｒｔＩＢＹ遺伝子をアガロースゲルから精製した。
　ＣｒｔＩＢＹ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を解析したところ、異なる塩基配列を有する２種類の遺伝子を確認することができた。ＫＨ１０５株は２倍体の生物であるため、２種類の遺伝子が存在するものと考えられた。
　２種類の遺伝子のＤＮＡ塩基配列の各々を、配列番号３および４に示す（以下、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子とも呼ぶ）。また、２種類の遺伝子がコードする各タンパク質のアミノ酸配列の各々を、配列番号１および２に示す。
　何れの遺伝子も、タンパク質をコードしている領域のＤＮＡの全長は３８０７ｂｐ（停止コドン１個を含む）であり、１２６８個のアミノ酸からなるポリペプチドをコードしていた。
　上記ポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて、上記ポリペプチドに対して高い相同性を示すタンパク質をデータベースから検索したところ、上記ポリペプチドは、各種生物由来のフィトエン合成酵素（ＣｒｔＢ）、フィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）、および、リコペン環化酵素（ＣｒｔＹ）の各々と高い相同性を示すドメインを有していることが明らかになった。
　具体的に、図１に示すように、上記２種類のポリペプチドは、アミノ末端側から順に、フィトエン不飽和化酵素（ＣｒｔＩ）と高い相同性を示すドメイン、フィトエン合成酵素（ＣｒｔＢ）と高い相同性を示すドメイン、および、リコペン環化酵素（ＣｒｔＹ）と高い相同性を示すドメインを有していた。
　図２に、各種生物由来のタンパク質との相同性をもとにして作成した分子系統樹を示す。なお、当該分子系統樹は、ｃｌｕｓｔａｌｗおよびｓｅａｖｅａｗプログラムを用いて作成した。具体的な作成手順は、当該プログラムに添付のマニュアルにしたがった。図２に示すように、何れの生物に由来するタンパク質も、進化系統的に近い位置にあることが明らかになった。
　＜２．ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の発現解析＞
　本実施例では発現宿主として、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ１（ＭＡＴａ　ｈｉｓ３Ｄ１　ｌｅｕ２　ｔｒｐ１－２８９　ｕｒａ３－５２／ＭＡＴα　ｈｉｓ３Ｄ１　ｌｅｕ２　ｔｒｐ１－２８９　ｕｒａ３－５２）を用いた。
　また、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の発現には、２μ　ｏｒｉｇｉｎによってＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で自律複製が可能であり、選択マーカーとしてＵＲＡ３、遺伝子発現制御領域としてガラクトースにて発現誘導可能なＧＡＬ１プロモーターおよびＣＹＣ１ターミネーター、並びに、大腸菌における選択マーカーとしてアンピシリン耐性遺伝子、を有する酵母発現用ベクターｐＹＥＳ２（Life Technologies）を用いた。
　ｐＹＥＳ２を制限酵素Ｅｃｏ　ＲＩで消化し、当該消化物をアガロース電気泳動に供し、線状化されたｐＹＥＳ２を、常法にてアガロースゲルから精製した。
　線状化されたｐＹＥＳ２と、前項で得られたＣｒｔＩＢＹ遺伝子の全長を含むＰＣＲ産物　１００ｎｇと、５×Ｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　ｅｎｚｙｍｅ　ｐｒｅｍｉｘ（Clontech Laboratories, Inc.）　５μＬと、を混合し、当該混合物を、５０℃で１５分間インキュベートした。
　インキュベート後の混合物　２μＬに対して、大腸菌コンピテントセルＳｔｅｌｌａＴＭ　Cｏｍｐｅｔｅｎｔ　Ｃｅｌｌｓ（Ｆ－，ｅｎｄＡ１，ｓｕｐＥ４４，ｔｈｉ－１，ｒｅｃＡ１，ｒｅｌＡ１，ｇｙｒＡ９６，ｐｈｏＡ，Φ８０ｄ　ｌａｃＺΔ　ｍ１５，Δ（ｌａｃＺＹＡ－ａｒｇＦ）Ｕ１６９，Δ（ｍｒｒ－ｈｓｄＲＭＳ－ｍｃｒＢＣ），ΔｍｃｒＡ，λ－）（Clontech Laboratories, Inc.）を含む溶液を５０μＬ加え、当該菌体懸濁液を、３０分間氷冷した後、４２℃で４５秒間のヒートショックを行い、直ちに氷上で１分間静置した。
　上記菌体懸濁液を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢプレート培地（１％　ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１％　ＮａＣｌ、２％　ａｇａｒ）に塗布し、３７℃で１２時間培養した。
　ＬＢプレート培地上に現れたコロニーを５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５ｍＬのＬＢ培地（１％　ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．５％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、１％　ＮａＣｌ）に植菌して３７℃、３００ｒｐｍで１２時間培養し、得られた菌体から、ＰｏｗｅｒＰｒｅｐ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（OriGene）のプロトコルに従い、プラスミドを抽出した。
　得られたプラスミドを制限酵素Ｘｈｏ　Ｉで消化し、当該消化物をアガロースゲル電気泳動にて確認したところ、予想されたバンドパターンを示したことから目的のプラスミドが取得されたと判断した。
　目的のプラスミドを有する大腸菌株を５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含む５０ｍＬのＬＢ培地に植菌して３７℃、１６０ｒｐｍで１２時間培養し、得られた菌体から、ＮｕｃｌｅｏＢｏｎｄ（登録商標）　Ｘｔｒａ　Ｍｉｄｉ　Ｐｌｕｓ（Clontech Laboratories, Inc.）のプロトコルに従い、目的のプラスミド、つまり、発現用プラスミドｐＹＥＳ２－ＣｒｔＩＢＹを取得した。
　上述したｐＹＥＳ２－ＣｒｔＩＢＹおよび陰性対照となるｐＹＥＳ２の各々を用いて、酵母細胞を形質転換した。
　Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ１を５ｍＬのＹＰＤ培地（２％　ｐｏｌｙｐｅｐｔｏｎe、１％　ｙｅａｓｔ　ｅｘｔｒａｃｔ、２％　Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ）中にて２８℃、３００ｒｐｍで１２時間培養した。当該培養液の１ｍＬをマイクロチューブに分取し、当該培養液を１５００ｇ、５分間、室温にて遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体に１ｍＬのリチウム酢酸溶液（１００ｍＭ　ｌｉｔｈｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ　ＴＥ
　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．５）を加えて懸濁した後、１５００ｇ、５分間、室温にて遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体に２００μＬのＰＥＧ／リチウム酢酸溶液（１００ｍＭ　ｌｉｔｈｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ、１０ｍＭ　ＴＥ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．５、５０％（ｗ／ｖ）　ＰＥＧ４０００）を加えて懸濁した。
　当該懸濁液に５μｇのプラスミド（ｐＹＥＳ２－ＣｒｔＩＢＹ、または、ｐＹＥＳ２）を添加し、３０℃で１時間のインキュベート、続いて４０℃で１０分間のインキュベートを行った。
　インキュベート後の上記懸濁液を、ウラシルを含まないＳＤプレート培地（０．６７％
　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ、０．１９％　ｙｅａｓｔ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｄｒｏｐ　ｏｕｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗ／ｏ　ｕｒａｃｉｌ、２％　Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ、２％　ａｇａｒ）に塗布し、２８℃で培養した。
　ＳＤプレート培地上に現れた形質転換体を３ｍＬのＳＣＴ　ｗ／ｏ　ｕｒａ培地（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ、０．１９％　ｙｅａｓｔ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｄｒｏｐ　ｏｕｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗ／ｏ　ｕｒａｃｉｌ、４％　Ｄ－ｒａｆｆｉｎｏｓｅ）に植菌して、２８℃、３００ｒｐｍにて１５時間培養した。
　１ｍＬの培養液を３０ｍＬのＳＣＴ　ｗ／ｏ　ｕｒａ培地に植菌して、２８℃、１６０ｒｐｍにて６時間培養した。当該培養液に対して、最終濃度が２％になるようにフィルター滅菌済みのガラクトース溶液を添加して、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の発現誘導をかけた後、更に１６時間培養した。
　ＣｒｔＩＢＹ遺伝子の発現を誘導した形質転換体から、以下のようにしてカロテノイド色素を抽出した。
　３０ｍＬの培養液を５０ｍＬ容量の試験管に入れ、５０００ｇ、５分間、４℃にて遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体を１ｍＬの蒸留水に懸濁した後、当該懸濁液をネジ口試験管に移して２０００ｇ、５分間、４℃にて遠心分離した。
　上記遠心分離によって分離した上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体に１ｍＬの３Ｎ　ＨＣｌを加えて激しく懸濁した後、当該懸濁液を沸騰湯浴中で３分間静置した。
　静置後の懸濁液を２０００ｇ、５分間、４℃にて遠心分離して上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体に１ｍＬの蒸留水を加え懸濁した。当該懸濁液を２０００ｇ、５分間、４℃にて遠心分離して上清を除去して沈殿した菌体を回収し、当該菌体に１ｍＬのアセトン／メタノール混合液（７：３，ｖ／ｖ）を加え、激しく懸濁した。
　上記懸濁液を２０００ｇ、５分間、４℃にて遠心分離して、得られた上清を新しいねじ口試験管に移し、当該上清を、窒素気流下で６０℃のヒートブロックにより蒸発乾固させた。
　乾固物を５０μＬのアセトンに溶解させてバイアル瓶に移し、当該溶解物を、各形質転換体の色素サンプルとした。
　得られた色素サンプルの色素組成を薄層クロマトグラフィー（ｔｈｉｎ－ｌａｙｅｒ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＴＬＣ）によって確認した。
　展開溶媒としてアセトン／ヘキサン混液（３：７，ｖ／ｖ）を用い、ＴＬＣ　Ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０　Ｆ２５４（Merck）上で、暗所にて、各色素サンプル２０μＬを展開した。比較対照として、各１ｍｇ／ｍＬのβ－カロテンおよびアスタキサンチンを１０μＬ、同様に展開した。
　試験結果を図３に示す。具体的に、レーン１は比較対照であるβ－カロテンを示し、レーン２は比較対照であるアスタキサンチンを示している。レーン３はｐＹＥＳ２を導入した酵母の試験結果を示しており、当該酵母では、β－カロテンの生産が認められなかった。一方、レーン４はｐＹＥＳ２－ＣｒｔＩＢＹを導入した酵母の試験結果を示しており、当該酵母では、β－カロテンの生産が認められた。
　図４に、β－カロテンの生合成経路および代謝経路、並びに、当該生合成経路および代謝経路に関与する酵素をコードする遺伝子を示す。なお、図４において、破線にて囲まれている経路は、Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが元々有している経路であり、その他の経路は、Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅが元々有していない経路である。なお、図４において、ＩＰＰはイソペンテニルピロリン酸を、ＧＰＰはゲラニルピロリン酸を、ＦＰＰはファルネシルピロリン酸、ＧＧＰＰはゲラニルゲラニルピロリン酸を示している。
　図４に示すように、Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、フィトエン合成酵素（ＣｒｔＢ）の基質であるゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）を生合成できるが、フィトエン合成酵素（ＣｒｔＢ）を持たないので、フィトエンを生成することはできない。また、Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、フィトエン不飽和化酵素／リコペン合成酵素（ＣｒｔＩ）およびリコペン環化酵素（ＣｒｔＹ）も持たないので、β-カロテンを生成することはできない。
　したがって、上記試験から、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子は、ＧＧＰＰを基質としてβ－カロテンを生成する活性を有する酵素をコードしていることが明らかになった。
　＜３．アスタキサンチンの生産＞
　Ｓ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを宿主としてアスタキサンチンを生産するために、赤色酵母であるＸａｎｔｈｏｐｈｙｌｌｏｍｙｃｅｓ　ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓにおいてβ-カロテンからアスタキサンチンを生成する酵素をコードするＣｒｔＳ遺伝子（Ｘ．　ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ　ＡＴＣＣ　２４２０２　ｃＤＮＡ由来）（アミノ酸配列：配列番号７、塩基配列：配列番号８）、および、当該酵素の酸化還元反応を補助するシトクロムＰ４５０還元酵素をコードするＣｒｔＲ遺伝子（Ｘ．　ｄｅｎｄｒｏｒｈｏｕｓ　Ｙ９８９　ｃＤＮＡ由来）（アミノ酸配列：配列番号９、塩基配列：配列番号１０）の両遺伝子を、既にＣｒｔＩＢＹ遺伝子が導入されている酵母へさらに導入した。
　また、ＧＧＰＰ産生量の増加を目的として、ＧＧＰＰの生成を司る酵素をコードするＢＴＳ１遺伝子（Ｓ.　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ　ＩＮＶＳｃ１　ｇｅｎｏｍｅ由来）（アミノ酸配列：配列番号１１、塩基配列：配列番号１２）も更に導入して、その効果を調べた。以下の試験は、『Ukibe et al. (2009) Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for Astaxanthin Production and Oxidative Stress Tolerance. Appl. Environ. Microbiol. 75:7205-7211』に記載の方法に従って行った。
　ＣｒｔＳ遺伝子およびＢＴＳ１遺伝子の酵母への導入には、２μ　ｏｒｉｇｉｎによってＳ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で自律複製可能であり、選択マーカーとしてＨＩＳ３を有する酵母構成発現用プラスミドｐＨＶ１を使用した。より具体的には、ｐＨＶ１内のＡＤＨ１プロモーターの下流にＢＴＳ１遺伝子およびＣｒｔＳ遺伝子がタンデムに挿入された、ｐＨＶ－ＢＴＳ１－ｃｒｔＳを構築した。
　酵母細胞への形質転換は上述した方法で行った。プラスミドを導入した形質転換体の選択には、ＳＤ　ｗ／ｏ　ｕｒａ、ｈｉｓプレート培地（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ、０．１９％　ｙｅａｓｔ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｄｒｏｐｏｕｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗ／ｏ　ｕｒａｃｉｌ，　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，　ｌｅｕｃｉｎｅ，　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、２％　Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ、７６ｍｇ／Ｌ　Ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、７６ｍｇ／Ｌ　Ｌ－ｌｅｕｃｉｎｅ、２％　ａｇａｒ）を使用した。
　得られた形質転換体をそれぞれ、ＳＣＴ　ｗ／ｏ　ｕｒａ、ｈｉｓ培地（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ、０．１９％　ｙｅａｓｔ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｄｒｏｐ　ｏｕｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗ／ｏ　ｕｒａｃｉｌ，　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，　ｌｅｕｃｉｎｅ，　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、４％　Ｄ－ｒａｆｆｉｎｏｓｅ、７６ｍｇ／Ｌ　Ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、７６ｍｇ／Ｌ　Ｌ－ｌｅｕｃｉｎｅ）を用いて上述の方法と同様に培養し、色素組成を調べた。
　試験結果を図３に示す。具体的に、レーン５は、酵母において、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子に加えて、更にＣｒｔＳ遺伝子およびＢＴＳ１遺伝子を発現させたときの試験結果を示している。
　ＣｒｔＩＢＹ遺伝子のみを発現させた酵母（レーン４）と比較して、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子、ＢＴＳ１遺伝子およびＣｒｔＳ遺伝子を発現させた酵母（レーン５）では、β－カロテンの産生量が顕著に増加し、さらにアスタキサンチンの産生がかろうじて観察できる程度に認められた。このことは、ＢＴＳ１遺伝子の作用によってＣｒｔＩＢＹ遺伝子がコードする酵素の基質となるＧＧＰＰの量が増加したこと、および、ＣｒｔＳ遺伝子の作用によってアスタキサンチンが生成したことを示している。
　ＣｒｔＲ遺伝子の酵母への導入には、２μ　ｏｒｉｇｉｎによってＳ．　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内で自律複製可能であり、選択マーカーとしてＬＥＵ２を有する酵母構成発現用プラスミドｐＡＤ４を使用した。より具体的には、ｐＡＤ４内のＡＤＨ１プロモーターの下流にＣｒｔＲ遺伝子が挿入された、ｐＡＤ－ｃｒｔＲを構築した。
　酵母細胞への形質転換は上述した方法で行い、陰性対照として、ｐＹＥＳ２およびｐＨＶ－ＢＴＳ１－ｃｒｔＳのみが導入された酵母へも、ｐＡＤ－ｃｒｔＲを導入した。プラスミドを導入した形質転換体の選択には、ＳＤ　ｗ／ｏ　ｕｒａ、ｈｉｓ、ｌｅｕプレート培地（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ、０．１９％　ｙｅａｓｔ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｄｒｏｐ　ｏｕｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗ／ｏ　ｕｒａｃｉｌ，　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，　ｌｅｕｃｉｎｅ，　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、２％　Ｄ－ｇｌｕｃｏｓｅ、７６ｍｇ／Ｌ　Ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、２％　ａｇａｒ）を使用した。
　得られた形質転換体をそれぞれ、ＳＣＴ　ｗ／ｏ　ｕｒａ、ｈｉｓ、ｌｅｕ培地（０．６７％　ｙｅａｓｔ　ｎｉｔｒｏｇｅｎ　ｂａｓｅ　ｗ／ｏ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ、０．１９％　ｙｅａｓｔ　ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｄｒｏｐ　ｏｕｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｗ／ｏ　ｕｒａｃｉｌ，　ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，　ｌｅｕｃｉｎｅ，　ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、４％　Ｄ－ｒａｆｆｉｎｏｓｅ、７６ｍｇ／Ｌ　Ｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ）を用いて上述の方法と同様に培養し、色素組成を調べた。
　図３に示すように、ＣｒｔＩＢＹ遺伝子、ＢＴＳ１遺伝子、ＣｒｔＳ遺伝子およびＣｒｔＲ遺伝子を発現させた酵母（レーン６）ではアスタキサンチンおよび生合成中間体と思われる色素の産生量が顕著に増加したが、ＢＴＳ１遺伝子、ＣｒｔＳ遺伝子およびＣｒｔＲ遺伝子を発現させた酵母（レーン７）ではカロテノイドおよびアスタキサンチンの産生は認められなかった。以上の結果は、ＣｒｔＲ遺伝子の作用によってアスタキサンチン合成酵素をコードするＣｒｔＳ遺伝子の作用が強化されたことを示している。
　本発明は、カロテノイドを製造する分野に利用することができる。更に具体的に、本発明は、食品、化粧品、医薬品および試料などを製造する分野に利用することができる。

Claims (12)

  1. 　フィトエン不飽和化酵素ドメイン、フィトエン合成酵素ドメイン、および、リコペン環化酵素ドメインを含むことを特徴とするタンパク質。
  2. 　上記タンパク質のアミノ末端側から、上記フィトエン不飽和化酵素ドメイン、上記フィトエン合成酵素ドメインおよび上記リコペン環化酵素ドメインの順番にて配置されていることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質。
  3. 　以下の（ａ）または（ｂ）で示されるタンパク質を少なくとも一部分として含むことを特徴とする請求項１または２に記載のタンパク質：
    （ａ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質；または、
    （ｂ）配列番号１または２で表されるアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成する活性を有するタンパク質。
  4. 　請求項１～３の何れか１項に記載のタンパク質をコードしていることを特徴とする遺伝子。
  5. 　以下の（ｃ）または（ｄ）のポリヌクレオチドを少なくとも一部分として含むことを特徴とする請求項４に記載の遺伝子：
    （ｃ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチド；または、
    （ｄ）配列番号３または４で表される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ゲラニルゲラニルピロリン酸からβ－カロテンを生成する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  6. 　請求項４または５に記載の遺伝子が挿入されていることを特徴とするベクター。
  7. 　請求項６に記載のベクターが導入されていることを特徴とする形質転換体。
  8. 　請求項７に記載の形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とするβ－カロテンの製造方法。
  9. 　上記形質転換体は、ゲラニルゲラニルピロリン酸を生成し得る形質転換体であることを特徴とする請求項８に記載のβ－カロテンの製造方法。
  10. 　請求項７に記載の形質転換体を培養する工程を含み、
    　上記形質転換体はβ－カロテンからアスタキサンチンを生成し得る形質転換体であることを特徴とするアスタキサンチンの製造方法。
  11. 　上記形質転換体は、更に、ＣｒｔＳ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１０に記載のアスタキサンチンの製造方法。
  12. 　上記形質転換体は、更に、ＣｒｔＲ遺伝子が導入されたものであることを特徴とする請求項１０または１１に記載のアスタキサンチンの製造方法。
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