WO2015152003A1 - 孔形成方法及び測定装置 - Google Patents

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WO2015152003A1
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voltage
electrode
hole
applying
film
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PCT/JP2015/059424
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板橋　直志
園子 右高
至 柳
玲奈 赤堀
武田　健一
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株式会社日立ハイテクノロジーズ
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    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y40/00—Manufacture or treatment of nanostructures

Definitions

  • the present invention relates to nanopore technology for measuring biomolecules, particularly DNA.
  • Non-Patent Document 1 a TEM (Transmission Electron Microscope) apparatus is used as a nanopore forming method, and a membrane using a silicon nitride film (Si 3 N 4 ) or the like is irradiated with a reduced electron beam diameter to obtain energy and current. It is described that pores having a diameter of 10 nm or less are formed by controlling the above.
  • TEM Transmission Electron Microscope
  • Non-Patent Document 2 discloses another method for forming nanopores.
  • a 10 nm thick non-porous membrane Si 3 N 4 film
  • an aqueous solution potassium chloride
  • the electrodes are placed in the KCl aqueous solution in the upper and lower chambers, respectively.
  • aqueous solution potassium chloride
  • the electrodes are placed in the KCl aqueous solution in the upper and lower chambers, respectively.
  • voltage application is stopped when the current in the direction through the membrane exceeds a certain current threshold.
  • 5 V is continuously applied between the electrodes, and the current between the electrodes reaches the current threshold between 400 s and 500 s, and the voltage application is stopped there.
  • Nanopores having a pore diameter of about 5 nm are formed.
  • a hole (nanopore 103) having a size on the order of nm comparable to the thickness of the DNA molecule 102 is provided in the region 101 of the thin film membrane, and the chamber 104 above / below the thin film membrane is filled with the aqueous solution 105.
  • the DNA 102 to be measured is placed in one of the upper / lower chambers, and measurement is performed when the DNA passes through the nanopore to determine the structural characteristics and base sequence of the DNA (see FIG. 1).
  • an optical measurement method photoexcitation 108 to measure the optical signal 109
  • an electrical measurement method electrical measurement method
  • Non-Patent Document 1 Using the TEM device drilling method of Non-Patent Document 1 and the non-patent document 2 voltage-drilling drilling method, we investigated the formation of nanopores used for optical measurement and tunnel current measurement. This will be described below.
  • a conductor thin film 402 is formed on an insulating film membrane 401 and a hole 403 is formed in the conductor thin film 402 (hole array), or a bowtie 404 (Bowtie array) in which two conductor dots are arranged close to each other.
  • the near-field light locally becomes strong only in the 5 nm region of the gap. Therefore, when the position where the DNA hole passes through the hole and the DNA molecule passes through the hole is not fixed, or when the hole position is deviated from the midpoint position of the gap, the excitation light received by the molecule becomes weak. A significant decline is inevitable. In principle, it is considered that the effect of the pore position itself on the displacement is larger than the case where the pore diameter is enlarged and the DNA passage position is not fixed.
  • the pore diameter is (at the same time, for example, the tip of the bowtie is scraped off and the gap widens (from the original 5 nm to 7 nm), and the optical signal intensity is lowered.
  • the hole diameter or hole position varies by only a few nanometers, the signal strength obtained changes by an order of magnitude. It is difficult to produce an optical measurement type nanopore device with uniform performance by drilling with TEM with good reproducibility.
  • a tunnel current measurement method as another typical example of a device for measuring a molecule passing through a nanopore by providing a structure near the nanopore.
  • a tunnel current measurement electrode pair 501 is provided on the plane of the insulating film membrane (FIG. 5A), and a hole is provided in the gap 502 between the tip portions of the electrode pair.
  • a tunneling current flowing through the DNA molecule when the DNA molecule passes through the hole is measured while a voltage is applied thereto.
  • the point of processing to open a hole aiming at the gap between a pair of conductor structures is the same as that of the aforementioned Bowtie.
  • electrical wiring 503 is applied to each of the two dots of Bowtie and connected to a power source. It can be regarded as a device that is different from that used for measurement (FIG. 5B).
  • the hole diameter has a variation of about 2 nm at 3 ⁇ with respect to the target 5 nm
  • the hole position has a misalignment (position variation) of about 5 nm at 3 ⁇ from the midpoint of the target gap. .
  • the change of the tunnel current when the DNA molecule passes through the nanopore is sharply weakened even if the DNA molecule deviates even a little from the current path connecting between the pair of electrodes arranged in the immediate vicinity of the nanopore.
  • the gap is rapidly weakened. For this reason, even in the fabrication of nanopore devices used in the tunnel current measurement method, it is considered that the signal intensity obtained in subsequent measurements has changed by orders of magnitude, with only a few nanometers of hole diameter and hole position. .
  • the drilling method using the TEM apparatus has not provided sufficient processing accuracy for measurement application. Furthermore, in the method using the TEM apparatus, not only the accuracy but also the apparatus cost is high and the throughput is low.
  • the non-patent document 2 drilling method was tried next.
  • the power supply device is less expensive than the method using the TEM device, and the vacuum system is not used, so that the throughput can be expected to be improved significantly.
  • a membrane Si 3 N 4 film having a thickness of 10 nm is prepared, and a potassium chloride aqueous solution (KCl aqueous solution) is filled up and down across the top and bottom.
  • the electrode was immersed in a KCl aqueous solution in the chamber, and a voltage was applied between both electrodes (FIG. 2).
  • the process was stopped because the current value exceeded the threshold value in 440 seconds.
  • a nanopore having a pore diameter of 5 nm could be formed in the first time at a position shifted about 40 nm to the left from the center of the membrane region.
  • Non-Patent Document 2 With respect to the position of the hole, there is no straight hole at a position near the center of the membrane with respect to a flat membrane in which no characteristic structure is arranged. It was.
  • the second time (second chip) has a hole shifted by 35 nm to the upper right from the center of the membrane, the third time is close to the center, and the fourth time, a hole is formed at a distance of about 45 nm to the lower right, licking from the central position. It was.
  • the nanopore used in the optical measurement method and the tunnel current method needs to be formed at the position of the Bowtie gap or the gap of the electrode pair.
  • a device in which a bowtie 404 for an optical measurement method is formed at the center of a membrane region 101 having a thickness of 10 nm and a device in which a gap structure of an electrode pair for a tunnel current measurement method is formed are prepared and loaded into a chamber 104 Then, the aqueous solution 105 was injected, and a hole was made by applying a voltage.
  • a plasmon enhancement device such as Bowtie is an element that enhances near-field light, so that there may be some influence of light in an experiment in a bright place. Therefore, in the drilling process for these bowtie and electrode pair, a drilling experiment was conducted in a dark room (shield box) in order to eliminate the influence of light and confirm the effect of voltage application.
  • nanopores 103 having a pore diameter of 5 nm were accurately formed at random locations unrelated to the arrangement of the structures. There was no effect of the structure formed on the membrane on the position of the hole formation (FIG. 6).
  • the Bowtie structure used for the optical measurement method and the electrode pair used for the tunnel current method are formed on the surface of the membrane, and the hole making method by the TEM device of Non-Patent Document 1 and the hole by voltage application of Non-Patent Document 2 We examined the opening method.
  • the hole drilling method using the TEM apparatus due to drift, a hole diameter variation of about 2 nm (3 ⁇ ) and a hole misalignment of about 5 nm (3 ⁇ ) occurred.
  • the hole drilling method by applying voltage the variation in hole diameter is improved to 1 nm (3 ⁇ ), and the cost and high throughput can be expected.
  • a membrane, bowtie or electrode pair with no structure is formed on the surface.
  • the drilling position was not determined.
  • the blocking current method shown in Non-Patent Document 2 the membrane does not have a structure other than nanopores, and the blocking of molecules with ion current flowing through the nanopores is measured
  • the position of the holes need not be determined accurately.
  • the optical measurement method using near-field light with the plasmon enhancement structure and the tunnel current method using the gap between the electrode pairs not only the hole diameter is reduced and the accuracy is improved, but also at a fixed position of the structure. Position control to drill holes is necessary.
  • the insulating film on which the near-field light generating element is mounted is irradiated with light in the electrolytic solution, or the film is irradiated with light.
  • the second step of detecting the value is repeated, and the procedure of repeating the first step and the second step is stopped when the current value reaches or exceeds a preset threshold value.
  • the measuring apparatus of the present invention includes a light source for irradiating light to an insulating film on which a near-field light generating element is mounted, a mechanism for installing the film in the chamber, and an electrolyte solution in the chamber in which the film is installed.
  • an introduction port for introducing a substance to be measured, a first electrode and a second electrode provided across a film, a power source for applying a voltage between the first electrode and the second electrode, and a voltage
  • An ammeter that detects the current value obtained by applying the light source, a control unit that controls the light source and the power source, and a storage unit that stores the relationship between the size of the hole formed by applying a voltage to the film and the current value
  • the control unit applies a first voltage between the first electrode and the second electrode while irradiating the film with light or after irradiation, and after applying the first voltage, the first voltage is applied to the film.
  • the measurement target substance such as a biomolecule
  • the measurement target substance that passes through the formed hole or a label illuminator added to the measurement target substance detects light emitted by receiving light from the light source. It has the photodetector provided with the color identification mechanism, and the memory
  • the storage unit stores a value for each substance constituting the measurement target substance.
  • an insulating film in which an electrode pair is placed with a gap interposed therebetween is placed in the electrolyte solution, and a voltage is applied to the electrode pair or after a voltage is applied, the film is sandwiched.
  • the measuring apparatus of the present invention includes a mechanism for installing an insulating film in which an electrode pair is placed with a gap in between in a chamber, and an inlet for introducing an electrolyte and a substance to be measured into the chamber in which the film is installed.
  • a first ammeter for detecting a current value obtained by applying a voltage from the first power supply
  • a controller for controlling the first and second power supplies, and applying a voltage to the film
  • a storage unit that stores the relationship between the size of the hole formed by the current and the current value, and the control unit applies the voltage from the second power source to the electrode pair or after applying the voltage to the electrode pair.
  • a first voltage is applied between the second electrode and the first electrode after application of the first voltage.
  • Control that detects a current value flowing between the first electrode and the second electrode by applying the second voltage between the two electrodes and the first ammeter by applying the second voltage Is repeated, and when the current value is stored in the storage unit and reaches or exceeds a preset threshold value, it is stopped to repeat the control as a hole is formed in the film.
  • the measurement unit further includes a second ammeter that detects a current value flowing through the electrode pair as the measurement target substance passes through the formed hole. A value for each substance constituting the measurement target substance is stored.
  • the effects obtained by typical ones are as follows.
  • a hole can be formed at a position suitable for measurement.
  • the hole size can be controlled at an angstrom level while monitoring with high accuracy. Thereby, measurement with good reproducibility becomes possible using the nanopore of the optical measurement method or the tunnel current measurement method. This is a simple method and can be expected to reduce costs.
  • a plasmon enhancing structure is provided on a membrane
  • the plasmon enhancing structure is a Bowtie structure as an example, and a hole is accurately formed in a gap of the Bowtie structure.
  • FIG. 7 shows the entire apparatus.
  • the chamber 104 is provided with an aqueous solution inlet 106 and an outlet 107 for introducing an aqueous solution 105 containing an electrolytic solution and the like, and an insulating film 101 is sandwiched between the electrode 1 and the electrode 2. It has a mechanism to do. From the aqueous solution inlet 106, an electrolytic solution, a substance to be measured, and the like can be introduced into the chamber 104.
  • a near-field light generating element 404 that generates near-field light when irradiated with light as shown in FIG. 4 is placed on the insulating film 101.
  • This apparatus includes a light source 203 that emits light to the near-field light generating element 404.
  • a power source 1 (201) for applying a voltage between the electrode 1 and the electrode 2, and a current for detecting a current flowing between the first electrode and the second electrode when the voltage is applied It has a total of 1 (202) and has a control unit 701 for controlling them.
  • the control unit 701 includes a processor, a memory, and the like necessary for controlling a power source, a light source, and the like.
  • a chip formed with a Bowtie structure 404 in which two conductive dots having a size of about 40 nm are arranged in proximity to each other on a Si 3 N 4 membrane 101 having no hole with a thickness of 10 nm is loaded into the chamber and separated by the membrane.
  • the KCl aqueous solution 105 was filled on both sides of the chamber, and the electrodes 1 and 2 were immersed in the KCl aqueous solution in the chambers on both sides.
  • a voltage of 4 V was first applied between the electrode 1 and the electrode 2 by the power source 1 for 2 minutes in a dark environment where the chamber 104 was shielded by a shield box.
  • the current value that was 800 pA (corresponding to a pore diameter of 2 nm) immediately after application of a voltage of 4 V for measurement increased to 1060 pA (corresponding to a pore diameter of 2.3 nm) 30 seconds after the start of application of the voltage for measurement. (FIG. 12). It is desirable that the hole does not expand during the period in which the voltage for measuring the diameter of the hole is applied. By applying a voltage in the liquid, a 2 nm hole could be formed in the first 2 minutes, but the voltage of 4 V applied for the subsequent pore diameter measurement was too high. Seems to have spread. Moreover, the position of the hole was formed at a position unrelated to the Bowtie structure formed on the membrane.
  • the position of hole formation was not determined, but the following guidelines were obtained for the applied voltage and the application time.
  • the Si 3 N 4 membrane having a thickness of 10 nm which is used for hole formation
  • a voltage of 4 V when a voltage of 4 V is continuously applied, a hole is formed and the hole diameter gradually increases.
  • ions when a voltage of 1 V is applied, ions are passed through the hole. A current flows, and the hole diameter can be estimated from the current value, but the hole diameter does not increase.
  • the hole formation of about 2 nm is completed by repeating the voltage application 6 to 8 times. For example, when the applied voltage is made higher than 4 V while maintaining the thickness of the membrane, it is thinner than this.
  • the amount of hole expansion by applying a voltage for 2 minutes at a time increases, and the desired hole diameter is reached at a smaller number of times. Further, even when the material is changed to a material having low insulation resistance, holes are easily formed with a small number of times. Thus, if the number of times decreases, it may not be possible to stop at the target hole diameter, and the target hole diameter may be exceeded. In such a case, measure the hole diameter with a voltage of 1V each time as the hole diameter expands in small increments, such as by changing the voltage application for drilling that was in 2 minute increments to 1 minute increments. By proceeding while confirming, it is possible to more accurately match the target hole diameter.
  • the hole diameter measurement time was fixed at 30 seconds. However, when the voltage is lowered to 1V, the hole does not expand during the hole diameter measurement. It doesn't matter. In this example, noise is present in the ion current being measured, and the error in the pore diameter was large at 10% or more in the measurement for several seconds. However, by measuring the current for 30 seconds and averaging the noise, The hole diameter could be estimated with an error of less than%.
  • the light source 1 is installed in the shield box, turned on, and the plasmon enhancement structure (Bowtie structure 404) formed on the membrane 101 is irradiated with light to generate near-field light at the Bowtie gap position.
  • a laser having a wavelength of 785 nm and an output of 50 mW was used as the light source.
  • the electrodes 1 and 2 were immersed in the KCl aqueous solution 105 in the chambers 104 on both sides separated by the membrane (FIG. 7), and a voltage of 4 V was applied between the electrodes by the power source 1 for 2 minutes. I tried drilling.
  • the light source 1 was turned off, a voltage of 1 V was applied between the electrodes for 30 seconds, and the current value was measured accurately.
  • the current value when a voltage of 4 V for drilling was applied increased to 800 pA (corresponding to a hole diameter of 2 nm), and it was confirmed that there was a hole.
  • the current flowing through the hole is stable at 200 pA (corresponding to a hole diameter of 2.0 nm) for 30 seconds without being changed (FIG. 14).
  • the current flowing through the hole may be measured by applying a voltage of 1 V between the electrode 1 and the electrode 2 by the power source 1 without illuminating the light source without turning off the light source.
  • the value is inaccurate due to the effect of charge-up due to light, etc. Therefore, it is better to turn off the light source when applying the hole diameter measurement voltage.
  • a hole is formed by applying a voltage while irradiating light.
  • light is irradiated in advance to the near-field light generating element on the membrane, and light is emitted in the vicinity of the near-field light generating element.
  • a membrane is placed in the electrolyte solution of the chamber and voltage is applied to form a hole.
  • the laser beam intensity was increased by a factor of 10 to a chip in which a Bowtie structure was formed on a Si 3 N 4 membrane having a thickness of 10 nm.
  • Two experiments were conducted: an experiment in which the drilling voltage was lowered to 2 V, and an experiment in which the laser beam wavelength was changed to 638 nm, which is a short wavelength, and the drilling voltage was lowered to 2 V. The voltage was lowered to 2 V. In spite of this, it was found that there was a hole in the Bowtie gap position. This is probably due to the enhancement of the excitation density at the Bowtie gap position or excitation to a high energy level.
  • the hole diameter measurement voltage for 30 seconds after applying the drilling voltage for 2 minutes at 2 V is set to 2 V, which is the same as the hole drilling voltage, for simplicity, the laser beam is measured during the hole diameter measurement. It was also found that the pore diameter did not expand in 30 seconds if was turned off.
  • the voltage at the time of drilling and the hole diameter measurement is simply the same except that the voltage is lowered at the time of hole diameter measurement. It has also been found that by simply turning off the light irradiation during measurement, it is possible to set desired drilling conditions that do not cause the hole to expand during hole diameter measurement.
  • FIG. 8 shows the entire apparatus, and a description of the same parts as in FIG. 7 is omitted.
  • the insulating film 101 includes an electrode pair 501 and a power source 2 (204) for applying a voltage to the electrode pair 501.
  • a hole is formed in the gap of the electrode pair 501 by applying the voltage application method as described in the first embodiment while applying a voltage to the electrode pair 501 or after applying the voltage. Specific examples are shown below.
  • An electrode pair 501 was formed on a Si 3 N 4 membrane having a thickness of 10 nm and no holes, and a chip having a gap 502 of 3 nm at a position where the tips of the electrode pair faced was loaded into the chamber.
  • a power source 2 for applying a voltage to the electrode pair 501 was connected. Both sides of the chamber isolated by the membrane were filled with KCl aqueous solution, and electrodes 1 and 2 were immersed in the KCl aqueous solution in the chambers on both sides, respectively, and a power source 1 was connected thereto. Since it is different from the photoexcitation device shown in Example 1, it may not be affected by light. However, the same shield box used in Example 1 was used for comparison by forming a hole in the membrane in the same experimental environment. The experiment was carried out in a dark environment with light shielding.
  • a voltage of 4 V was applied by the power source 1 between the electrodes 1 and 2 for 2 minutes without applying a voltage (power source 2) to the electrode pair for tunnel current measurement.
  • a voltage of 1 V was applied between both electrodes for 30 seconds, and the current value was accurately measured.
  • a voltage of 2 V was applied to the tunnel current measurement electrode pair 501 by the power source 2 (204), and a voltage was applied to the 3 nm gap 502 at the tip of the electrode pair on the membrane without a hole. Since the KCl aqueous solution is filled between the gaps, a current flows through the gap 502 of the electrode pair. In this situation, the electrodes 1 and 2 were immersed in the KCl aqueous solution in the chambers on both sides separated by the membrane, respectively, and the power supply 1 applied a voltage of 4 V between the electrodes for 2 minutes to try to make a hole. .
  • the voltage applied to the gap at the tip of the tunnel current measuring electrode pair 501 is turned off, and a voltage of 1 V is applied between the electrodes 1 and 2 by the power source 1. It was applied for 30 seconds and the current value was accurately measured. As a result, it was confirmed that pores were formed almost unchanged for 30 seconds at 250 pA.
  • the vicinity of the gap at the tip of the electrode pair of the tunnel current measuring electrode pair was carefully observed to find the position where the hole was formed. As a result, a hole close to an ellipse having a major axis of 2.2 nm and a minor axis of 2.0 nm was found. It was confirmed that it was formed at the gap position of the part.
  • the shape of the hole is slightly extended between the tips of the tunnel current measuring electrode pair in the direction of the tips of both electrodes. Since a current is induced in the gap at the electrode tip by the voltage applied by the power source 2, the electronic excitation state and the charged state of the membrane material are changed, and dielectric breakdown is likely to occur. It is thought that a hole was formed in the surface.
  • Example 1 and Example 2 a specific position on the membrane was excited by a functional structure capable of realizing light enhancement, local current excitation, and the like, so that the drilling position could be determined.
  • a functional structure capable of realizing light enhancement, local current excitation, and the like so that the drilling position could be determined.
  • a bowtie as a plasmon enhancement structure on a membrane and one having a tunnel current measurement electrode pair on a membrane as an example, one having a bowtie as a plasmon enhancement structure on a membrane Is used to investigate the relationship between the drilling voltage, the number of voltage applications, and the time (throughput) required to complete the hole.
  • Both sides were filled with a KCl aqueous solution, and electrodes 1 and 2 were immersed in the KCl aqueous solution in the chambers on both sides.
  • the goal was to make a 3 nm hole.
  • the procedure 1 was performed 10 times, and when the current at the time of applying 1V for the hole diameter measurement reached 310 pA, the processing was switched to the processing in which the applied voltage was increased (procedure 2). From the 11th voltage application, the procedure for increasing the applied voltage setting for drilling from 4V to 5V and then measuring the hole diameter at 1V (procedure 2) was performed 6 times (up to the 16th in total). However, it showed a tendency to increase from 310 pA as shown in the 11th to 16th times of FIG. 17, and it was judged that 450 pA (hole diameter of 3 nm) was reached when the voltage of 1 V for the 16th hole diameter measurement was applied.
  • the expansion of the hole tends to saturate as the number of times increases, and it is large from the beginning when it is desired to expand the hole.
  • the desired hole diameter is not easily reached even if the number of times is increased. It was found that when it is desired to increase the hole diameter or to form a hole having a slightly larger diameter, the time required to complete the hole can be shortened by increasing the drilling voltage. However, if the voltage is increased too much from the beginning, there is a concern that the desired hole diameter may be exceeded only by performing procedure 1 a few times. Once the hole has been expanded too much, it cannot be narrowed again, so it is better to aim at a smaller size, switch the voltage on the way, and expand it a little to complete.
  • FIG. 18 (a) shows the current change when forming a 2 nm diameter hole in a 10 nm thick membrane
  • FIG. 18 (b) shows the current change when forming a 3 nm diameter hole in a 10 nm thick membrane
  • FIG. 18 (c) shows a current change when the drilling is further performed with the aim of forming a hole having a diameter of 4 nm in the membrane having a thickness of 20 nm by increasing the load of the drilling process.
  • a reverse voltage of ⁇ 2 V is set to 5 immediately after drilling under the conditions of FIG. 18C (drilling voltage 8.5 V, hole diameter measuring voltage 1 V). It applied for 2 second, and it changed into the conditions which transfer to a hole diameter measurement after that.
  • a pore diameter measurement voltage of 1 V was applied, the current value once fluctuated below the graph, and then no behavior was observed that settled to a constant value, and the current during the pore diameter measurement became a constant value.
  • FIG. 20 shows a state in which the charge accumulated on the surface is eliminated by applying a reverse voltage when there is an influence of charging due to the hole punching voltage, and the hole diameter can be measured with high accuracy.
  • a light source 1 (203) and a photodetector 1 (206) are used to irradiate the bowtie of the near-field light generating element 404 from the light source, and from the DNA molecules passing through the holes. Is measured at the detector.
  • a chip in which 100 elements of 10 ⁇ 10 elements each having a bowtie structure for an optical measurement system formed on a 5 nm-thick membrane is formed in parallel and separated by a membrane.
  • Each side of the chamber was filled with a KCl aqueous solution, and the electrodes 1 and 2 were immersed in the KCl aqueous solution in the chambers on both sides.
  • 100 electrodes are arranged in the upper region, one for each of the 100 parallel elements, while the lower side of the membrane Since the electrode 2 in the region may be at a common potential, it is a common electrode for 100 membranes.
  • 100 elements were irradiated with light, and a voltage was applied to each one element by the method described above to form holes.
  • one switch 505 is provided for each of 100 electrodes 1 for 100 membranes. 100 holes were formed in each Bowtie gap position while applying voltage in order and checking the hole diameter one by one. Thereafter, without removing the membrane chip from the chamber, the aqueous solution containing the DNA was continuously injected into the upper chamber to shift to the measurement of DNA molecules.
  • mixed light of laser beams having wavelengths of 505 nm and 642 nm was used as light for exciting the fluorescent dye for analyzing the four types of bases (A, G, C, T) of DNA.
  • This is one of the general wavelength selections for emitting all of the four types of fluorescence shown below. Since the intensity of the excitation light is enhanced by the plasmon enhancement device, depending on the enhancement, in this experiment, it was sufficient for the laser output to have a wavelength of about 50 mW for both the wavelength of 505 nm and the wavelength of 642 nm.
  • a non-coherent light source may be used instead of a laser as long as it can output light having the same excitation wavelength.
  • A is 520 nm as the wavelength for analysis.
  • 666 nm for C is 520 nm as the wavelength for analysis.
  • 567 nm for C is a nm as the wavelength for analysis.
  • 702 nm for T is a nm as the wavelength for analysis.
  • FIG. 22B shows a signal analyzed using a color filter plate for the color selection function.
  • a spectroscopic unit using a prism or a diffraction grating may be used as long as four types can be identified.
  • results of G, A, G, T, C, and T were obtained.
  • the analysis unit performs computing such as duplication characteristics and estimation from the superposition of a plurality of data, and by combining the analyzed fragments, It was possible to clarify the order of arrangement, and the basic functions as a DNA sequencer could be configured and confirmed.
  • peaks having a wavelength difference little by little peaks having a difference of about several hundred cm -1 at the maximum in terms of energy
  • the vibrational spectrum structure Due to the difference in the molecular structure, the vibrational spectrum structure is different, and this appears as a difference in the peak wavelength of the spectrum in the observation wavelength region in Raman spectroscopy. In the field of Raman spectroscopy, this is called Raman shift. That is, since the four types of bases have different Raman shifts, they appear as separated peaks that can identify the four types of bases on the Raman spectrum.
  • FIG. 23A shows a schematic block diagram in the case of using Raman spectroscopy.
  • the spectrum obtained when excited at a wavelength of 638 nm using a diffraction grating spectroscope and an optical system is imaged in the color selection function portion. 23 (b).
  • the peak wavelengths can be separated in this way, the results of trying the DNA analysis using these four peaks are shown in FIG.
  • FIG. 23C the results with A, T, G, C, T, and A were obtained.
  • Such data information is collected, and the analysis unit performs computing such as duplication characteristics and estimation from the overlapping of a plurality of data.
  • the order could be clarified, and the basic function as a DNA sequencer could be constructed and confirmed.
  • the current flowing through the nanopore when the voltage is applied to the electrodes above and below the membrane without using the light source 1 (203) and the light detector 1 (206) among the ones shown in FIG. 9 is the ammeter 1 (202). Measure the change in current as DNA molecules pass through while monitoring at. This is a method of measuring the difference in the blocking rate at which DNA molecules block the nanopore and identifying the type of base that has passed through.
  • the configuration shown in FIG. 11 will be described in which the light source 1 (203), the photodetector (206), and the optical system (lens, color identification) associated therewith are not used.
  • a chip in which 100 ⁇ 10 elements having a Bowtie structure for an optical measurement system formed on a 5 nm-thick membrane is formed in parallel is loaded into a chamber, and both sides of the chamber isolated by the membrane are filled with a KCl aqueous solution.
  • the electrodes 1 and 2 were immersed in the KCl aqueous solution in the chambers on both sides.
  • 100 electrodes are arranged in the upper region, one for each of the 100 parallel elements, while the lower side of the membrane Since the electrode 2 in the region may be at a common potential, it is a common electrode for 100 membranes.
  • 100 elements were irradiated with light, and a voltage of 2 nm was formed by applying a voltage to the one element per element by the method described above.
  • a voltage one by one with a switch provided on each of the 100 electrodes 1 for 100 membranes and checking the hole diameter one by one, 100 holes were formed at each Bowtie gap position. Thereafter, without removing the membrane chip from the chamber, the aqueous solution containing the DNA was continuously injected into the upper chamber to shift to the measurement of DNA molecules.
  • DNA molecules are not measured by optical measurement, but the amount of current flowing through the hole is measured by blocking the hole when the molecule passes through the hole (blocking).
  • Current method First, with the light source 1 turned off, a voltage was applied to the electrode 1 and the electrode 2 by the power source 1 and the ion current flowing through the hole was continuously monitored by an ammeter attached to the power source 1; When passing through, a characteristic decrease (blocking) of the ionic current was observed, and it was possible to capture how DNA molecules in the aqueous solution passed through the pores.
  • a chip in which 100 pairs of 10 ⁇ 10 elements each having an electrode pair for tunnel current measurement formed on a 5 nm-thick membrane is formed in a chamber and separated by the membrane.
  • Each side of the chamber was filled with a KCl aqueous solution, and the electrodes 1 and 2 were immersed in the KCl aqueous solution in the chambers on both sides.
  • 100 electrodes are arranged in the upper region, one for each of the 100 parallel elements, while the lower side of the membrane
  • the electrode 2 in the region is a common electrode for 100 membranes.
  • a voltage is applied to the electrode pair for tunnel current measurement of 100 elements by the power source 2 to excite the gap of the electrode pair, and a voltage is applied to the one element per element by the power source 1 by the above-described method. Formed.
  • one switch 505 is provided for each of 100 electrodes 1 for 100 membranes. 100 holes were formed in the gap position of each electrode pair while applying voltage in order and checking the hole diameter one by one. Thereafter, without removing the membrane chip from the chamber, the aqueous solution containing the DNA was continuously injected into the upper chamber to shift to the measurement of DNA molecules.
  • a voltage was applied from the power source 2 to the electrode pair on the membrane, and when the DNA molecules passed through the holes, the tunnel currents flowing through the respective bases were measured. It was found that the tunneling currents flowing through the four different base structures of the DNA molecules were different, and that the DNA base sequence could be obtained by this method.
  • the hole position is aligned with the electrode gap so that a tunnel current can flow through the molecule by the method described in this specification, and the hole diameter is controlled with high accuracy. The first measurement was realized.
  • the nanopore formation method using the method of Example 1-7 is not limited to the SiON membrane, the SiO 2 membrane, the alumina membrane, the HfO 2 membrane, the HfSiON membrane, the TiO 2 membrane, the zirconia membrane, the ZrSiO 4 membrane, Application was also made to inorganic material membranes such as yttria membranes and other polymer membranes. Although the voltage required for drilling differs depending on the material due to differences in material characteristics such as band gap, it was confirmed that the present technology can be basically applied to the above materials.
  • a common light source for near-field light generation and DNA analysis by optical measurement can be used as long as the power and wavelength can be varied so as to be suitable for measurement.

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Abstract

　近接場光発生素子が載置された絶縁性の膜に対し、電解液中で膜に光を照射しながら、又は、膜に光を照射後に膜を電解液中に設けた後、電解液中で膜を挟んで設置された２つの電極の間に第１の電圧を印加し、その後２つの電極の間に第２の電圧を印加し、第２の電圧を印加することにより２つの電極の間に流れる電流値を検出する手順を、電流値が予め設定した閾値に到達又は超えた場合に止めるようにすることで、薄膜の所望の場所に孔をあける。

Description

孔形成方法及び測定装置
　本発明は、生体分子、特にＤＮＡを計測するためのナノポア技術に関するものである。
　非特許文献１には、ナノポア形成方法としてＴＥＭ（transmission electron microscope）装置を用いて、シリコン窒化膜（Ｓｉ3Ｎ4）などを用いたメンブレン上に電子ビーム径を絞って照射し、エネルギーと電流を制御することで、１０ｎｍ以下の径のポアを形成することが記載されている。
　非特許文献２にて、別のナノポアの形成方法が公開されている。その方法では、厚み１０ｎｍの孔のあいていないメンブレン（Ｓｉ3Ｎ4膜）を挟んで上／下に水溶液（塩化カリウム）を満たし、上／下のチャンバのＫＣｌ水溶液中に電極と電極をそれぞれ浸し、両電極間に電圧を印加し続ける。そして、メンブレンを貫く方向の電流がある電流閾値を超えたところで電圧印加を停止する。非特許文献２中のFigure 2のｆに示されるように、５Ｖを電極間に印加し続け、４００ｓから５００ｓの間で電極間電流が電流閾値に到達し、そこで電圧印加を停止することで、孔径５ｎｍ程度のナノポアが形成されている。
Jacob K Rosenstein, et al., Nature Methods, Vol.9, No.5, 487-492 (2012) Vol.6, No.4, 779-782 Kwok, H.; Briggs, K.; and Tabard-Cossa, V.; "Nanopore Fabrication by Controlled Dielectric Breakdown"
　ナノポアを用いた計測技術は、薄膜メンブレンの領域１０１にＤＮＡ分子１０２の太さと同程度のｎｍレベルの寸法の孔（ナノポア１０３）を設け、薄膜メンブレンの上／下のチャンバ１０４を水溶液１０５で満たし、上／下チャンバのいずれかに測定対象となるＤＮＡ１０２を入れ、このＤＮＡがナノポアを通過した際に計測することで、ＤＮＡの構造的な特徴や塩基配列を決定しようとするものである（図１）。ＤＮＡがナノポアを通過した際に計測する方法としては、光学的計測方法（光励起１０８して光信号１０９を計測）あるいは電気的計測方法（電気信号１１０を計測）がある。
　非特許文献１のＴＥＭ装置による孔あけ方法と非特許文献２の電圧印加による孔あけ方法を用いて、特に光学的計測とトンネル電流計測に用いるナノポア形成を検討した結果、明らかになった課題を以下に説明する。
　ナノポアを用いた光学的計測では、分子がナノポアを通過するときに光励起し、この励起分子、あるいは分子に付加された標識が励起されたものからの光放出を計測する方法がある。この光を計測する手段として、ナノポア位置のごく近傍に、近接場光を発生するプラズモン増強構造を設けたデバイスがある。プラズモン増強構造には、絶縁膜メンブレン４０１上に、導体薄膜４０２を形成し、これにホール４０３をあけたもの（ホールアレイ）や、２つの導体ドットを近接して配置したBowtie４０４（Bowtieアレイ）、２つの導体のドット４０６を上下に縦に積み、その間を絶縁体薄膜４０７で絶縁したもの（２段積みドットアレイ）などがある（図４）。デバイスに光を照射すると、例えばホール構造ならばそのホール４０３の底部の中心位置が、Bowtie構造ならばその２つの導体ドット間のギャップ４０５の位置が、２段積みドットアレイならばドット構造の間４０７が、近接場光発生位置４０８となるので、これを光計測のための励起光として用いることができる。
　孔形成の一例として、メンブレン上のBowtie構造の２つの導体ドット間のギャップ位置（ギャップの中点）を狙い、ＴＥＭ装置で孔径５ｎｍの孔あけを試行した。この位置は、計測時には近接場光が発生する位置である。しかしながら、同じ孔あけを複数回試み、仕上がり寸法を調べたところ、狙いの孔径５ｎｍに対し３σで２ｎｍ程度の孔径バラツキが発生していることがわかった。また、ＴＥＭ装置の位置調整機構により正確にBowtieギャップの中点の位置に孔を形成する操作を行ったが、正確にギャップの中点の位置に孔をあけることはできなかった。複数回の孔あけにおいて、狙いの位置から３σで５ｎｍ程度の合わせズレ（位置のバラツキ）が発生していた。
　続いて、これらのＴＥＭ装置による孔形成により孔径や孔位置のばらついたデバイスを、順次、評価用のチャンバに装填してＤＮＡの入った水溶液を注入し、励起光を照射して、ＤＮＡがナノポアを通過した際に発せられる光信号の強度を測定した。その結果、ＤＮＡから発せられる光信号強度のデバイス個体によるばらつきは極めて大きく、光信号が最も強いものと最も弱いもので実に２桁以上の差があることが明らかになった。プラズモン増強により発生する近接場光は局所において強くなるものであり、例えば、ここにあげたBowtieでは、ギャップ間隔５ｎｍの場合、このギャップの５ｎｍの領域だけで局所的に近接場光が強くなる。従って、孔が拡がってＤＮＡ分子が孔内を通過する位置が定まらない場合や、孔位置がギャップの中点位置とずれている場合には、分子が受ける励起光が弱くなるため、光信号の著しい低下は免れない。原理的には、孔径が拡がってＤＮＡ通過位置が定まらない場合よりも孔位置自体がズレている場合の方が強度の低下に及ぼす影響は大きいと考えられるが、たとえ位置が正確でも孔径が（例えば７ｎｍまで）拡がると同時にBowtieの先端部も削れてギャップが（元々の５ｎｍから７ｎｍに）拡がってしまい光信号強度が低下するなどの別の悪影響も考えられる。いずれにせよ、孔径や孔位置がわずか数ｎｍばらついただけで、得られる信号強度が桁違いに変わってしまう。ＴＥＭによる孔あけによって性能の揃った光計測方式のナノポアデバイスを再現性よく製造することは難しい。
　一方、ナノポア近傍に構造物を設けてナノポアを通過する分子を計測するデバイスのもうひとつの代表的な例として、トンネル電流計測方式がある。トンネル電流計測方式とは、絶縁膜メンブレンの平面の上にトンネル電流計測用電極対５０１を設け（図５（ａ））、その電極対の先端部の間のギャップ５０２に孔を設け、電極間に電圧を印加しながらＤＮＡ分子が孔を通過した際にＤＮＡ分子に流れるトンネル電流を計測するものである。一対の導体構造物の間のギャップを狙って孔をあける加工という点に関しては、前述のBowtieと同様であり、一例としてはBowtieの２つのドットのそれぞれに電気配線５０３を施して電源に接続し計測に用いるという点が異なるデバイスととらえることができる（図５（ｂ））。
　そこで、Bowtieの場合と同様に、一対の導体構造物の間のギャップ位置５０２（ギャップの中点）を狙い、ＴＥＭ装置で孔径５ｎｍの孔あけを複数回試みた。しかし、Bowtieのときと同様に、孔径では、狙い５ｎｍに対し３σで２ｎｍ程度のバラツキ、孔位置では、狙いのギャップの中点位置から３σで５ｎｍ程度の合わせズレ（位置のバラツキ）が発生した。
　これらの孔径や孔位置のばらついたトンネル電流方式ナノポアデバイスの性能を評価した。その結果、トンネル電流方式においても同様に、計測性能のバラツキは極めて大きいことがわかった。ギャップの中点ちょうどの位置にたまたま孔が形成されたチップ個体ではトンネル電流が精度よく計測できたが、孔径が２ｎｍ拡大したものや孔位置が２ｎｍズレたものでは、ＤＮＡ分子のナノポア通過によるトンネル電流の変化は著しく低下し、検出限界以下となり有意な信号が確認できなかった。ＤＮＡ分子がナノポアを通過したときのトンネル電流の変化は、ナノポアの直近に配した電極対の間を結ぶ電流経路からＤＮＡ分子が少しでも外れると急激に弱くなる。また、孔が大きくなり、孔の直近の両側の電極の先端部が削れてギャップが拡がることによっても急激に弱くなる。このため、トンネル電流計測方式に用いるナノポアデバイスの作製においても、孔径や孔位置がたった数ｎｍばらついただけで、その後の計測で得られる信号強度が桁違いに変わってしまったのであろうと考えられる。
　以上、上記のいずれの計測方式に対応するナノポアデバイスに対しても、ＴＥＭ装置を用いた孔あけ方法では、計測への応用に十分な加工精度は得られなかった。さらに、ＴＥＭ装置を用いた方法では、精度だけでなく、装置コストが高いことやスループットが低いことも課題である。
　そこで、精度、装置コスト、スループットにおける改善を期待して、次に、非特許文献２の孔あけ方法を試行した。この方法では、十分な孔あけ性能さえ得られれば、ＴＥＭ装置を用いた方法と比較して、電源装置が安価であり、また、真空システムを用いないため、スループットは格段に改善すると期待できる。
　前述のＴＥＭ装置による孔あけ加工と同様に、厚み１０ｎｍの孔のあいていないメンブレン（Ｓｉ3Ｎ4膜）を準備し、これを挟んで上下に塩化カリウム水溶液（ＫＣｌ水溶液）を満たし、上下のチャンバのＫＣｌ水溶液中に電極を浸し、両電極間に電圧を印加した（図２）。電極間電流の推移を監視しながら電圧を印加し続けたところ、４４０秒で電流値が閾値を超えたので処理を停止した。その結果、一回目は、メンブレン領域の中央よりも左に４０ｎｍほどずれた位置に、孔径５ｎｍのナノポアを形成することができた。そこで、孔のあいていないメンブレンをさらに複数準備して、同一条件設定で順次孔あけを実施し、孔の仕上がり寸法のばらつきを調べた。その結果、狙いの孔径５ｎｍに対し３σで１ｎｍ程度の孔径バラツキが発生していることがわかった。ばらつきを１ｎｍまで抑えてもまだ十分ではないが、ＴＥＭ装置による孔あけと比較して、この非特許文献２の方法では、少なくとも孔径バラツキが改善することがわかった。
　しかしながら、孔の位置に関して、非特許文献２にも示されているように、特徴的な構造物を配置していない平坦なメンブレンに対し、メンブレン中央付近の位置に素直に孔があくことはなかった。２回目（２チップ目）はメンブレン中央より右上に３５ｎｍずれた位置に、３回目は中央に近い位置に、４回目は中央位置よりもななめ右下に４５ｎｍほどの距離の位置に孔が形成された。このように、上／下のチャンバを水溶液で満たして電圧印加により孔をあける方法では、ＴＥＭ装置を用いた方法と比較して、孔径のバラツキは小さく抑えられ高精度となる利点があるが、一方、孔位置は定まらない。
　そこで、次に、光学的計測方式とトンネル電流計測方式に用いる構造物（Bowtieあるいは電極対）がメンブレン上に配置されているデバイスについて、非特許文献２の方法で孔あけを検討した。前述の通り、光学的計測方式、トンネル電流方式に用いるナノポアはBowtieのギャップの位置、あるいは、電極対のギャップの位置に形成する必要がある。厚み１０ｎｍのメンブレン領域１０１の中心部に、光学的測定方式用のBowtie４０４を形成したデバイス、ならびに、トンネル電流測定方式用の電極対のギャップ構造を形成したデバイスを作製し、これをチャンバ１０４に装填して水溶液１０５を注入し、電圧を印加することにより孔あけを実施した。なお、Bowtieなどのプラズモン増強デバイスは近接場光を増強する素子であるため、明るい場所での実験では何らかの光の影響があるかもしれない。そこで、これらBowtieと電極対に対する孔あけ加工の検討では、光の影響を排除して電圧印加による効果を確認するために、暗室（シールドボックス）内で孔あけ実験を実施した。
　しかし、メンブレンの平面上にBowtieや電極対といった導体構造物が存在するのにもかかわらず、構造物のエッジ近傍やギャップ部など特徴的な形態の直近の位置に孔があく傾向は特にみられず、構造物の配置とは無関係なランダムな場所に孔径５ｎｍのナノポア１０３が精度良く形成された。孔形成の位置に対しメンブレン上に形成された構造物の影響はみられなかった（図６）。
　以上、メンブレンの表面上に、光学測定方式に用いるBowtie構造、ならびに、トンネル電流方式に用いる電極対を形成し、非特許文献１のＴＥＭ装置による孔あけ方法、非特許文献２の電圧印加による孔あけ方法を検討した。しかし、ＴＥＭ装置による孔あけ方法では、ドリフトにより、２ｎｍ（３σ）程度の孔径ばらつきと５ｎｍ（３σ）程度の孔位置の合わせズレが発生した。一方、電圧印加による孔あけ方法では、孔径のバラツキは１ｎｍ（３σ）に改善され、また、低コスト化、高スループット化も期待できる方式だが、構造が無いメンブレン、Bowtieあるいは電極対が表面に形成されたメンブレンのいずれにおいても、孔あけ位置が定まらなかった。非特許文献２に示される封鎖電流方式（メンブレンにはナノポア以外に構造をもたず、ナノポアを貫いて流れるイオン電流の分子による封鎖を計測する方式）では、孔位置は必ずしも正確に定まる必要はないが、プラズモン増強構造による近接場光を用いた光学測定方式や、電極対のギャップを用いたトンネル電流方式では、孔径の縮小、高精度化はもちろんのこと、構造物のある決まった位置に孔をあける位置制御が必要である。
　上記課題を解決するため、本発明の孔形成方法では、近接場光発生素子が載置された絶縁性の膜に対し、電解液中で膜に光を照射しながら、又は、膜に光を照射後に膜を電解液中に設けた後、電解液中で膜を挟んで設置された第１の電極と第２の電極との間に第１の電圧を印加する第１の工程と、第１の工程後、第１の電極と第２の電極との間に第２の電圧を印加し、第２の電圧を印加することにより第１の電極と第２の電極との間に流れる電流値を検出する第２の工程と、を繰り返し、第１の工程と第２の工程を繰り返す手順を、電流値が予め設定した閾値に到達又は超えた場合に止めることを特徴とする。
　また、本発明の測定装置は、近接場光発生素子が載置された絶縁性の膜に対し光を照射する光源と、膜をチャンバに設置する機構と、膜が設置されたチャンバに電解液及び測定対象物質を導入する導入口と、膜を挟んで設けられる第１の電極及び第２の電極と、第１の電極及び第２の電極との間に電圧を印加する電源と、電圧を印加することにより得られる電流値を検出する電流計と、光源及び電源を制御する制御部と、膜に電圧を印加することにより形成される孔の大きさと電流値との関係を記憶した記憶部とを備え、制御部は、膜に対し光を照射しながら又は照射後に第１の電極と第２の電極との間に第１の電圧を印加し、第１の電圧の印加後に第１の電極と第２の電極との間に第２の電圧を印加し、第２の電圧を印加することにより第１の電極と第２の電極との間に流れる電流値を検出する制御を繰り返し行い、電流値が記憶部に記憶され予め設定した閾値に到達又は超えた場合に膜に孔が形成されたとして制御を繰り返すのを止めることを特徴とする。さらに、生体分子等の測定対象物質を測定するため、形成された孔を通過する測定対象物質又は測定対象物質に付加された標識発光体が、光源からの光を受けて放出する光を検出する色識別機構を備えた光検出器を有し、記憶部は、測定対象物質を構成する物質毎の光検出値を記憶していることを特徴とする。また測定対象物質を測定する別の構成として、第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加することにより、形成された孔を測定対象物質が通過するのに伴い流れる電流値について、記憶部は、測定対象物質を構成する物質毎の値を記憶していることを特徴とする。
　さらに、孔形成方法として、電極対がギャップを挟んで載置された絶縁性の膜を電解液中に設置し、電極対に電圧を印加しながら、又は電圧を印加した後に、膜を挟んで設置された第１の電極と第２の電極との間に第１の電圧を印加する第１の工程と、第１の工程後、第１の電極と第２の電極との間に第２の電圧を印加し、第２の電圧を印加することにより第１の電極と第２の電極との間に流れる電流値を検出する第２の工程と、を繰り返し、第１の工程と第２の工程を繰り返す手順を、電流値が予め設定した閾値に到達又は超えた場合に止めることを特徴とする。
　また、本発明の測定装置は、電極対がギャップを挟んで載置された絶縁性の膜をチャンバに設置する機構と、膜が設置されたチャンバに電解液及び測定対象物質を導入する導入口と、膜を挟んで設けられる第１の電極及び第２の電極と、第１の電極と第２の電極との間に電圧を印加する第１の電源と、電極対に電圧を印加する第２の電源と、第１の電源により電圧を印加することにより得られる電流値を検出する第１の電流計と、第１及び第２の電源を制御する制御部と、膜に電圧を印加することにより形成される孔の大きさと電流値との関係を記憶した記憶部とを備え、制御部は、電極対に対し第２の電源から電圧を印加しながら又は印加後に、第１の電極と第２の電極との間に第１の電圧を印加し、第１の電圧の印加後に第１の電極と第２の電極との間に第２の電圧を印加し、第２の電圧を印加することにより第１の電極と第２の電極との間に流れる電流値を第１の電流計により検出する制御を繰り返し行い、電流値が記憶部に記憶され予め設定した閾値に到達又は超えた場合に膜に孔が形成されたとして制御を繰り返すのを止めることを特徴とする。さらに、測定対象物質を測定するため、形成された孔を測定対象物質が通過するのに伴い電極対に流れる電流値を検出する第２の電流計を有し、記憶部は、さらに電流値について測定対象物質を構成する物質毎の値を記憶していることを特徴とする。
　本明細書において開示される発明のうち、代表的なものによって得られる効果は以下の通りである。従来のナノポアデバイス形成方法では、狙った位置に孔を形成しようとしても、孔位置や孔寸法の数ｎｍのばらつきが回避できないが、本発明の方法により、計測に相応しい位置に合せて孔形成でき、孔寸法も高精度にモニタしながらオングストロームレベルで制御できる。これにより、光計測方式やトンネル電流計測方式のナノポアを用いて、再現性の良い計測が可能となる。簡便な手法であり、低コスト化も期待できる。
ナノポア計測の原理を示す図である。 孔あけ方法の課題を説明する図である。 ＤＮＡ分析方法を説明する図である。 プラズモン増強構造と近接場光発生位置の例を示す図である。 トンネル電流測定用電極対とその配線の例を示す図である。 孔あけ方法の課題を説明する図である。 本発明のプラズモン増強構造による孔あけの実施例を説明する図である。 本発明のトンネル電流計測用電極対による孔あけの実施例を説明する図である。 本発明のプラズモン増強構造によるＤＮＡ計測の実施例を説明する図である。 本発明のトンネル電流計測用電極対によるＤＮＡ計測の実施例を説明する図である。 （ａ）本発明の複数センサアレイへの孔あけの実施の形態を示す図である。（ｂ）本発明の複数のセンサアレイによる計測の実施の形態を示す図である。 本発明の孔あけの実施例を説明するためのデータである。 本発明の孔あけの実施例を説明するためのデータである。 本発明の孔あけの実施例を説明するためのデータである。 本発明の孔あけのメカニズムを説明する図である。 本発明の孔あけの実施例を説明するためのデータである。 本発明の孔あけの実施例を説明するためのデータである。 本発明の孔あけの実施例を説明するためのデータである。 実施例（孔あけならびに孔径計測の条件と、孔あけ成績）を説明する図である。 実施例（逆電圧印加）を説明する図である。 （ａ）本発明の複数センサアレイへの孔あけの実施の形態を示す図である。（ｂ）本発明の複数のセンサアレイによる計測の実施の形態を示す図である。 （ａ）実施例（ＤＮＡ解析）を説明する図である。（ｂ）実施例（ＤＮＡ解析結果）を説明する図である。 （ａ）実施例（ＤＮＡ解析）を説明する図である。（ｂ）実施例（ラマンスペクトル）を説明する図である。（ｃ）実施例（ＤＮＡ解析結果）を説明する図である。
　本発明の実施の形態を説明するための全図において同一機能を有するものは同一の符号を付すようにし、その繰り返しの説明は可能な限り省略するようにしている。以下、本発明の実施の形態を図面に基づいて詳細に説明する。実施例に記載するデバイス構造および材料は、本発明の思想を具現化するための一例であり、材料および寸法などを厳密に特定するものではない。
　以下の実施例に示す方法を用いることで、前述の課題を解決することができる。
　まず、第一の実施例として、メンブレン上にプラズモン増強構造を有し、そのプラズモン増強構造が一例としてBowtie構造であり、Bowtie構造のギャップに精度良く孔を形成した例を示す。
　図７は、全体装置を示しており、チャンバ１０４は、電解液等を含んだ水溶液１０５を導入する水溶液入口１０６と出口１０７を備え、絶縁性の膜１０１を電極１と電極２で挟んで設置するための機構を有している。この水溶液入口１０６からは電解液や測定対象物質等をチャンバ１０４に導入することができる。この絶縁性の膜１０１には、図４で示したような光が照射されることにより近接場光を発生するような近接場光発生素子４０４が載置されている。この装置は、この近接場光発生素子４０４に対して光を照射する光源２０３を備えている。さらに、電極１と電極２との間に電圧を印加するための電源１（２０１）、そして、電圧が印加されることにより第１の電極と第２の電極の間を流れる電流を検知する電流計１（２０２）を備え、それらを制御する制御ユニット７０１を有する。制御ユニット７０１は、電源や光源等を制御するのに必要なプロセッサやメモリ等を有する。
　続いて具体的な例を示す。
　厚み１０ｎｍの孔のあいていないＳｉ3Ｎ4メンブレン１０１上に大きさが４０ｎｍほどの２個の導体ドットを近接して配置したBowtie構造４０４を形成したチップをチャンバに装填し、メンブレンで隔離されたチャンバの両側にＫＣｌ水溶液１０５を満たし、これらの両側のチャンバのＫＣｌ水溶液中に、それぞれ電極１、電極２を浸した。メンブレンへ孔を形成するため、チャンバ１０４の周りをシールドボックスで遮光した暗い環境下で、まず、電極１、電極２の間に、電源１により４Ｖの電圧を２分間印加した。次に、孔の径を測定するため、両電極間に４Ｖの電圧を３０秒間印加し、正確に電流値を測定した。この手順（手順１）を繰り返したところ、６回目で、孔の径を測定するための４Ｖを印加したときの電流値が８００ｐＡまで上昇したため、あらかじめ孔径と電流値との関係を求めておいたデータと照らし合わせ、メンブレンに孔があき孔径２ｎｍに到達したと確認できた。
　しかしながら、測定用の４Ｖの電圧印加直後に８００ｐＡ（孔径２ｎｍ相当）であった電流値は、測定用電圧の印加開始から３０秒後には、１０６０ｐＡ（孔径２．３ｎｍ相当）まで増加してしまった（図１２）。孔の径を測定するための電圧を印加している期間には孔が拡がらないことが望まれる。液中での電圧印加により、はじめの２分で２ｎｍの孔を形成することはできていたが、その後の孔径測定のために印加した４Ｖの電圧が高過ぎたため、この追加の３０秒で孔径が拡がってしまったと考えられる。また、孔の位置は、メンブレン上に形成されているBowtie構造とは無関係の位置に形成されていた。
　そこで、シールドボックスで遮光した暗い環境下で、電極１、電極２の間に、電源１により４Ｖの電圧を２分間印加したのち、今度は、孔の径を測定するための電圧を下げ、両電極間に１Ｖの電圧を３０秒間印加し、正確に電流値を測定した。この手順（手順１）を繰り返したところ、８回目で、孔あけのための電圧４Ｖを印加したときの電流値が８００ｐＡ（孔径２ｎｍ相当）まで上昇した。その直後、孔径測定用の電圧１Ｖを３０秒間印加したが、電圧を低くした効果により、孔径の測定開始時から３０秒後の測定終了時まで、孔を流れる電流は２００ｐＡ（孔径２．０ｎｍ相当）のまま、ほぼ不変であった（図１３）。はじめの２分間で孔が形成でき、かつ、その後の３０秒で、電圧を低くして孔を流れる電流を測ることで、孔径を拡げることなく正確に２．０ｎｍの孔径が測定できたと考える。しかしながら、孔の位置は、何度試行しても、メンブレン上Bowtie構造の位置とは無関係なランダムな位置に形成されていた。
　なお、ここまででは、孔形成の位置は定まらなかったが、印加電圧や印加する時間については、以下に述べるような指針が得られた。孔形成に用いた厚み１０ｎｍの孔のあいていないＳｉ3Ｎ4メンブレンでは、４Ｖの電圧印加を継続すると孔があいて少しずつ孔径が拡大していき、一方、１Ｖの電圧印加では孔を通してイオン電流が流れ、電流値から孔径を見積もることはできるが孔径は拡大しない。この例では、６～８回の電圧印加の繰り返しで２ｎｍ程の孔形成が完了しているが、例えば、このメンブレンの厚みのままで４Ｖよりも印加電圧を高くした場合や、これよりも薄いメンブレンの場合には、一回２分の電圧印加での孔の拡がり量が大きくなり、これより少ない回数で所望の孔径に到達することになる。また、材料が絶縁耐性の低いものに変わった場合にも、少ない回数で孔があきやすくなる。こうして、回数が少なくなると、狙いの孔径で停止できず、狙いの孔径を過ぎてしまう場合がありうる。そのような場合には、２分刻みであった孔あけ用の電圧印加を１分刻みに変更するなどして、小刻みに孔径が拡大していく様子を、その都度１Ｖの電圧で孔径を測定して確認しながら進めることで、狙いの孔径に対し、より精度良く合わせることが可能である。一方、今回の例では、孔径測定をする時間を３０秒に固定したが、１Ｖに下げた場合には孔径測定中に孔が拡がることは無いので、孔径測定をする時間３０秒は適当に変えてもかまわない。本実施例では、測定しているイオン電流にノイズがのっており、数秒の測定では孔径の誤差が１０％以上と大きかったが、３０秒間電流を測定しノイズを平均化することで、１０％未満の誤差で孔径を見積もることができた。
　そこで次に、シールドボックス内に光源１を設置し、オンにして、メンブレン１０１上に形成されたプラズモン増強構造（Bowtie構造４０４）に対し光を照射し、Bowtieのギャップ位置に近接場光を発生させた。本実施例では、光源として、波長７８５ｎｍ、出力５０ｍＷのレーザを用いた。この状況で、メンブレンで隔離された両側のチャンバ１０４のＫＣｌ水溶液１０５中に、それぞれ電極１、電極２を浸し（図７）、電源１により、両電極間に４Ｖの電圧を２分間印加して、孔あけを試みた。また、その後、孔の径を見積もるため、光源１をオフにして、両電極間に１Ｖの電圧を３０秒間印加し、正確に電流値を測定した。これを６回繰り返した結果、孔あけのための電圧４Ｖを印加したときの電流値が８００ｐＡ（孔径２ｎｍ相当）まで上昇し、孔があいたことが確認された。その直後に孔径測定用の１Ｖの電圧を印加したときに孔を流れる電流は、２００ｐＡ（孔径２．０ｎｍ相当）で３０秒間変化せず安定となり（図１４）、シールドボックスで遮光した暗い環境下で実施したときと同様に、正確に孔を形成することができ、また、測定中に拡大することなく孔径を見積もることができた。
　ここで、Bowtie構造の近傍を注意深く観察し、孔が形成された位置を探したところ、２．０ｎｍの孔は、Bowtieのギャップ位置に形成されていることがわかった。照射した光がBowtieによりギャップ位置で桁違いに増強されギャップ近傍のメンブレン材料の電子状態を高密度励起し、絶縁破壊が起こりやすくなったことにより、電極１と電極２の間への電圧印加で、近接場光の最も強いギャップ位置に孔が形成されたものと考えられる（図１５）。
　なお、孔の径を見積もる際に、光源はオフにせず、光を照射したまま、電極１と電極２の間に電源１により１Ｖの電圧を印加して、孔を流れる電流を計測することもできるが、光によるチャージアップの影響などで値の正確さを欠くことも考えられるため、孔径測定電圧印加時には光源はオフとしておく方がよい。
　また、上記では光を照射しながら電圧印加を行って孔形成をしたが、メンブレン上の近接場光発生素子に対して光を事前に照射しておき、近接場光発生素子の近傍で光が増強されることにより所定の位置を劣化させておき、その状態でチャンバの電解液中にメンブレンを設置して電圧印加を行って、孔形成をすることもできる。
　一方、同様の孔あけを、厚み１５ｎｍの孔のあいていないＳｉ3Ｎ4メンブレン上にBowtie構造を形成したチップに対しても試しに実施した。光源１からの光照射強度、電極１と電極２の間に印加する電圧ともに、厚み１０ｎｍのメンブレンの場合と全く同じ条件を適用したところ、４Ｖでの２分の孔あけと１Ｖでの３０秒の孔径測定の手順を２０回まで繰り返しても、なかなか孔があかなかった。そこで、孔あけのための電圧印加と孔径測定のための電圧印加の一連の手順（手順１）を繰り返す毎に、孔あけのための電圧（第１の電圧）を、４Ｖから、＋０．１Ｖずつ増していく制御を行ったところ、７回目に孔あけ電圧が４．７Ｖとなったところで電流値が上昇し、孔があいたことが確認できた（図１６）。メンブレンの厚みのバラツキや、貫通したい位置のメンブレンの材質の絶縁耐性のばらつきも考えられるが、このように、孔があかないときに、ひとつの良い方法として、低い値の方から少しずつ孔あけ電圧を増加させていく方法をとれば、孔のあき易さのバラツキを吸収でき、所望の孔をあけたメンブレンチップを高い歩留まりで製造できる。
　また一方、レーザ光の強度と波長の影響を調べるため、試しに、厚み１０ｎｍの孔のあいていないＳｉ3Ｎ4メンブレン上にBowtie構造を形成したチップに対して、レーザ光強度を１０倍にして孔あけ用電圧を２Ｖに下げた実験、レーザ光の波長を短波長の６３８ｎｍに換え孔あけ用の電圧を２Ｖに下げた実験、の２つを行ったところ、電圧は２Ｖに下げているのにもかかわらず、Bowtieギャップ位置に孔があくことがわかった。おそらく、Bowtieギャップ位置での励起密度の向上、あるいは、高いエネルギーの準位に励起されたことによるものと考えられる。また、このとき、２Ｖで２分の孔あけ電圧印加後の３０秒間の孔径測定用電圧を、簡単化のために、孔あけ用電圧と同じ２Ｖと設定しても、孔径測定中にレーザ光をオフにすれば、３０秒間では孔径が拡がらないこともわかった。このように、孔あけと孔径測定を繰り返す手順として、孔径測定時に電圧を下げる方法以外に、孔あけ時と孔径測定時の電圧は単純に同じままで、孔あけ時に光照射し、一方、孔径計測時には光照射をオフするだけでも、孔径計測時に孔が拡がってしまうことのない所望の孔あけ条件を設定できることもわかった。
　ここまでの評価結果を、図１９に整理して示す。孔あけ時に光照射ＯＦＦの条件Ａ、Ｂでは、孔位置が定まらないが、光照射ＯＮの条件Ｃ、Ｄ、Ｅでは、孔径計測時に電圧を下げる方法（Ｃ）でも、孔あけ時に光の出力（Ｄ）やエネルギー（Ｅ）を上げ孔径計測時に電圧は下げずに光だけＯＦＦにする方法でも、所望の位置に所望の径の孔あけを行うことができた。
　次に、第二の実施例として、メンブレン上にトンネル電流計測用電極対を有し、そのトンネル電流計測用電極対の間のギャップに孔を形成した例を図８を用いて示す。
　図８は、全体装置を示しており、図７と重複するところは説明を省略する。図８では、絶縁性の膜１０１には電極対５０１を有し、電極対５０１に電圧を印加するための電源２（２０４）を備える。この電極対５０１に電圧を印加しながら又は印加後に実施例１に説明したような電圧印加法を実施することにより、電極対５０１のギャップに孔を形成する。以下に具体例を示す。
　厚み１０ｎｍの孔のあいていないＳｉ3Ｎ4メンブレン上に、電極対５０１が形成され、その電極対の先端が対向する位置に３ｎｍのギャップ５０２を有するチップをチャンバに装填した。また、この電極対５０１に電圧を印加するための電源２を接続した。メンブレンで隔離されたチャンバの両側にＫＣｌ水溶液を満たし、これらの両側のチャンバのＫＣｌ水溶液中に、それぞれ電極１、電極２を浸し、これに電源１を接続した。実施例１で示した光励起デバイスとは異なるため、光の影響は無いかもしれないが、同じ実験環境でメンブレンへ孔を形成して比較するために、実施例１で使用したものと同じシールドボックス内の遮光した暗い環境下で実験を行った。
　まず、トンネル電流計測用電極対に電圧（電源２）を印加しない状態で、電極１、電極２の両電極間に、電源１により４Ｖの電圧を２分間印加した。次に、孔の径を測定するため、両電極間に１Ｖの電圧を３０秒間印加し、正確に電流値を測定した。これを繰り返すことにより、実施例１のBowtieを形成したメンブレンの場合と同様に、メンブレンに２ｎｍの孔を形成できたが、孔形成位置はトンネル電流計測用電極対とは離れた無関係な位置であった。
　そこで次に、トンネル電流計測用電極対５０１に電源２（２０４）により２Ｖの電圧を印加し、孔のあいていないメンブレン上の電極対の先端部の３ｎｍのギャップ５０２に電圧を印加した。ギャップの間にはＫＣｌ水溶液が満たされているため、電極対のギャップ５０２に電流が流れる。この状況で、メンブレンで隔離された両側のチャンバのＫＣｌ水溶液中に、それぞれ電極１、電極２を浸し、電源１により、両電極間に４Ｖの電圧を２分間印加して、孔あけを試みた。また、その後、孔の径を見積もるため、トンネル電流計測用電極対５０１の先端部のギャップに印加する電圧はオフにして、電極１、電極２の両電極間に電源１により、１Ｖの電圧を３０秒間印加し、正確に電流値を測定した。その結果、２５０ｐＡで３０秒間ほぼ不変となり孔を形成できたことを確認できた。このとき、トンネル電流計測用電極対の電極先端部のギャップ近傍を注意深く観察し、孔が形成された位置を探したところ、長径２．２ｎｍ短径２．０ｎｍの楕円に近い孔が、電極先端部のギャップ位置に形成されていることが確認された。
　Bowtieのギャップに孔を形成した場合と比較して、孔の形状は、若干トンネル電流計測用電極対の先端部の間で両電極先端の方向にのびたような形となっていた。電源２により印加した電圧によって電極先端部のギャップで電流が誘起され、メンブレン材料の電子励起状態や帯電状態が変化して、絶縁破壊が起こりやすくなったことにより、電極先端部の間のギャップ位置に孔が形成されたものと考えられる。
　以上、実施例１、実施例２に示したように、光の増強や局所電流励起などを実現できる機能構造によりメンブレン上の特定の位置を励起して、孔あけ位置を定めることができた。次に、第三の実施例として、メンブレン上にプラズモン増強構造としてBowtieを有するものとメンブレン上にトンネル電流測定用電極対を有するもののうち、一例として、メンブレン上にプラズモン増強構造としてBowtieを有するものを用い、孔あけ電圧、電圧印加回数、孔完成までにかかる時間（スループット）の関係を調査した例を示す。
　厚み１０ｎｍの孔のあいていないＳｉ3Ｎ4メンブレン上に大きさが４０ｎｍほどの２個の導体ドットを近接して配置したBowtie構造を形成したチップをチャンバに装填し、メンブレンで隔離されたチャンバの両側にＫＣｌ水溶液を満たし、これらの両側のチャンバのＫＣｌ水溶液中に、それぞれ電極１、電極２を浸した。本実施例３では、３ｎｍの孔をあけることを目標とした。メンブレンへ孔を形成するため、シールドボックス内に設置した光源１をオンにして、メンブレン上に形成されたプラズモン増強構造（Bowtie構造）に対し光を照射し、Bowtieのギャップ位置に近接場光を発生させた。この状態で、電極１、電極２の両電極間に、電源１により４Ｖの電圧を２分間印加した。次に、孔の径を測定するため、両電極間に１Ｖの電圧を３０秒間印加し、正確に電流値を測定した。この手順（手順１）を繰り返し、４５０ｐＡ（孔径３ｎｍ相当）に達したところで処理を停止するつもりであった。しかしながら、繰り返し実施して３ｎｍの完成を目指したが、図１７に示すように、手順１を１０回繰り返しても、８回目、９回目、１０回目では３１０ｐＡあたりで電流値の増加が飽和する傾向であることがわかった。電流値から孔径を計算すると、孔径２．５ｎｍあたりまでで、孔の拡大が飽和していると解釈された。
　そこで、手順１を１０回行い、孔径測定のための１Ｖ印加時の電流が３１０ｐＡになった時点で、印加電圧を増した処理（手順２）に切り替えてみた。１１回目の電圧印加から、孔あけのための印加電圧設定を４Ｖから５Ｖに増加させ、その後１Ｖで孔径を計測する手順（手順２）を、追加で６回（トータルで１６回目まで）実施したところ、図１７の１１～１６回目に示すように３１０ｐＡから増加していく傾向を示し、１６回目の孔径測定用の１Ｖの電圧印加時には４５０ｐＡ（孔径３ｎｍ）に到達したと判断できた。
　試しに厚み１０ｎｍの孔のあいていないBowtie付きメンブレンをもう１チップ用意して、１回目から孔あけのための印加電圧を５Ｖと高くして手順１を繰り返した結果、８回目までで、孔径測定用の１Ｖの電圧印加時の電流が４５０ｐＡ（孔径３ｎｍ相当）に到達した。
　以上のように、電源１の印加電圧一定で手順１を繰り返して孔あけする場合、回数を増すと孔の拡大が飽和していく傾向にあり、追加で孔を拡大したい場合や、はじめから大きい孔を狙う場合には、回数だけ増してもなかなか所望の孔径に到達しない。追加の孔径拡大やもう少し大きい孔を狙って形成したい場合は、孔あけ用電圧を高くして実施すると孔完成までにかかる時間が短くできることがわかった。但し、はじめから電圧を高くしすぎると、手順１を少ない回数実施しただけで、所望の孔径を超えてしまう心配もある。一度拡がり過ぎた孔は再び狭くすることができないため、小さめから狙って、途中で電圧を切り替え、もう少し拡大して完成する製法がよい。
　なお、図１７に示すように、４Ｖから５Ｖに電圧を上げることにより、最終的には３ｎｍの孔径に到達できているが、たとえ５Ｖに上げたとしても、相変わらず徐々に飽和していく傾向がある。このため、３ｎｍ到達に近づくほど一回の孔径拡大量が小さくなり、回数が増えるので効率が悪い。このような飽和特性をあらかじめ把握した上、処理を重ねるごとに徐々に処理時間を延ばしていく制御を行うことによって、処理後半での回数を減らし、効率よく所望の孔径に到達する制御方法も有効に用いることができる。
　次に第四の実施例として、孔あけを完了したのち、孔径測定用電圧を印加して孔径を測定する際の精度の向上の例について述べる。
　図１８（ａ）に、厚み１０ｎｍメンブレンへの直径２ｎｍの孔の形成時の電流変化を、図１８（ｂ）に、厚み１０ｎｍメンブレンへの直径３ｎｍの孔の形成時の電流変化を示す。ここで、さらに、孔あけ加工の負荷を増して、厚み２０ｎｍのメンブレンに直径４ｎｍの孔を形成することを目標として孔あけを実施したときの電流変化を図１８（ｃ）に示す。
　ここで、孔あけを完了したのち孔径測定用電圧を印加して孔径を測定する工程の電流波形を詳細にみると、特に、図１８（ｃ）では、孔径測定用電圧を印加したタイミングで、一旦、グラフの下方に電流値が振れて、それから一定値に落ち着く挙動が確認された（図中に矢印にて指し示した）。図１８（ａ）ならびに図１８（ｂ）では、電極１と電極２の間に印加する電圧は、それぞれ４Ｖと５Ｖであったが、図１８（ｃ）では、メンブレンが厚く、かつ、大き目の孔径を目指すために高めの８．５Ｖの電圧をかけた。おそらく、孔あけ時に高めの電圧を印加したことにより、メンブレン材料表面に多くの電荷が蓄積し、孔径測定用の１Ｖの電圧値に下げた瞬間に蓄積電荷がリリースされることで、このような、一旦、グラフの下方に電流値が振れてから安定する波形になったものと推定した。
　そこで、推定原因である表面電荷の蓄積を解消するために、図１８（ｃ）の条件（孔あけ電圧８．５Ｖ、孔径測定電圧１Ｖ）の孔あけ直後に、逆向きの電圧－２Ｖを５秒間印加し、その後、孔径測定に移行する条件に変更してみた。その結果、孔径測定電圧１Ｖ印加時に、一旦、グラフの下方に電流値が振れて、それから一定値に落ち着く挙動がみられなくなり、孔径測定中の電流は一定値となった。
　このように表面蓄積電荷を逆電圧でリセットすれば、原理的には孔径測定精度が向上し、結果として、より厳密な孔径で形成できるようになると考えられる。本実験の結果、表面電荷の蓄積の影響が特に顕著に現れたのは、特に電圧を８．５Ｖまで高くしたケースであったが、多かれ少なかれ表面に電荷の蓄積はあり得るので、帯電解消ステップとして、孔形成電圧印加の工程の後に、逆電圧を印加する処理を入れるとよい。孔あけ用電圧による帯電の影響がある場合に、逆電圧印加により、表面に蓄積された電荷が解消され、これにより精度良く孔径が計測できる様子を図２０に示す。
　次に、ナノポアデバイスにより、光を用いてＤＮＡ分子を測定した例について述べる。全体構成として、図９に示すように、光源１（２０３）と光検出器１（２０６）を用い、光源から近接場光発生素子４０４のBowtieに光を照射して、孔を通るＤＮＡ分子からの光を検出器において測定する。
　一例として、図１１に示すように、厚み５ｎｍのメンブレン上に光計測方式用のBowtie構造を形成した素子を１０個×１０個で並列に１００個形成したチップをチャンバに装填し、メンブレンで隔離されたチャンバの両側にＫＣｌ水溶液を満たし、これらの両側のチャンバのＫＣｌ水溶液中に、それぞれ電極１、電極２を浸してセッティングした。メンブレンで隔離された上／下の領域のうち、上側領域の電極１は１００個の並列素子に対して、１素子に１個ずつ、合計１００個が設置されており、一方、メンブレンの下側領域の電極２は共通電位でよいので、１００個のメンブレンに対し共通の１つの電極となっている。１００個の素子に光を照射し、この１素子１素子に対し、前述の方法で電圧を印加して孔を形成した。１００個のすべてに同時に電圧印加し、同時に孔を形成することも原理的には可能だが、本実施例では、１００個のメンブレンに対する１００個の電極１のそれぞれに設けたスイッチ５０５により、ひとつずつ順番に電圧を印加し、ひとつずつ孔径をチェックしながら、１００個の孔をそれぞれのBowtieギャップ位置に形成した。その後、メンブレンチップをチャンバから取り外すことなく、そのまま引き続き、ＤＮＡの入った水溶液を上側チャンバに注入して、ＤＮＡ分子の計測に移行した。
　図１１（ａ）（ｂ）に示すように、光源１よりメンブレン上のBowtieに光を照射し、Bowtieギャップで増強された近接場光を発生させ、孔を通過するＤＮＡ分子を励起した。ＤＮＡ分子の４種塩基に対してそれぞれに標識色素を特異的に付加してあるため、ＤＮＡ分子が孔を通過したとき、それぞれの色素からの蛍光が、分光手段として色フィルターを用いた光検出器１によりそれぞれ観測され、通過した分子を分析するための信号が得られていることがわかった。本実施例の測定は、本明細書にて述べている方法で分子が励起される位置に孔位置を合わせ、また、孔径を高精度に制御して形成することにより、初めて実現された。なお、この評価では、ＤＮＡの有する４種の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を分析するための蛍光色素を励起する光には、波長５０５ｎｍと６４２ｎｍのレーザ光の混合光を用いた。後に示す４種の蛍光をどれも光らせるための一般的な波長選択の一つである。プラズモン増強デバイスで励起光の強度が増強されるので、増強度にもよるが、今回の実験では、レーザの出力としては、波長５０５ｎｍ、波長６４２ｎｍの両者ともに５０ｍＷ程度のもので十分であった。原理的には、同じ励起波長の光を出力できるものであれば、レーザでなく非コヒーレントな光源であっても構わない。このとき、４種の塩基の分析のための色素の選択により、様々な波長を用いることは可能であると考えられるが、一例として、ここでは、分析用の波長として、Ａに対しては５２０ｎｍ、Ｇに対しては６６６ｎｍ、Ｃに対しては５６７ｎｍ、Ｔに対しては、７０２ｎｍを用いた。
　これら４種の光を識別する機能を備え、順次、得られた光信号を記録していくシステムを構築すれば、ＤＮＡシーケンサとして用いることができる。その概要ブロック図を図２２（ａ）に示す。一例として、色選別機能の部分にカラーフィルター板を用いて分析した信号を図２２（ｂ）に示す。色識別機能については、４種を識別できれば、プリズムや回折格子を用いた分光ユニットであっても構わない。図２２（ｂ）の例では、Ｇ、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ、Ｔとの結果が得られた。
　このような、データ情報が多数集められ、解析部によって、重複する特徴や、複数のデータの重ねあわせからの推定等のコンピューティングを行い、分析した断片のつなぎ合わせから、４種塩基の元の並び順をあきらかにすることができ、ＤＮＡシーケンサとしての基本的機能を構成、確認することができた。
　また一方、光学的測定方法には、この他に、標識色素を使わない方法として、ラマン分光もある。ＤＮＡ分子の４種塩基は、同じ波長の光で励起されても、分子構造の違いにより励起状態のエネルギー準位が異なるので、それぞれ異なる波長のラマン光を発する。そこで、４種塩基に対して標識色素を付加していないＤＮＡ分子についても計測を試みた。分光手段として回折格子分光器を備えた光検出器１により４種それぞれの塩基の特異波長にあわせて、ラマン光を観測することができた。なお、この評価では、ラマン分光の評価として、ＤＮＡの有する４種の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）を励起する光には、６３８ｎｍまたは７８５ｎｍのレーザ光を用いた。いずれの波長でも、後述のような４種塩基の分離したラマンスペクトルを得ることができた。蛍光色素の場合と同様に、プラズモン増強デバイスで励起光の強度が増強されるので、レーザの出力としては５０ｍＷ程度のもので十分であった。但し、ラマン分光では、高分解能な識別が必要であることから、レーザを用いてシャープな単一波長で励起することが望ましい。４種の塩基からは、少しずつ波長差のあるピーク（エネルギーの値では、せいぜい数１００ｃｍ-1程度の差のあるピーク）が得られる。分子の構造が異なることにより、振動スペクトル構造が異なり、これが、ラマン分光における観測波長域で、スペクトルのピーク波長の差となって現れる。ラマン分光の分野では、ラマンシフトと呼ばれる。すなわち、４種の塩基でラマンシフトがそれぞれ異なるため、これがラマンスペクトル上で４種の塩基を識別できる分離したピークとなって現れる。
　これら４種の光（ラマンシフトの違いにより波長が違う光）を識別する機能を備え、順次、得られた光信号を記録していくシステムを作れば、蛍光方式と同様に、ＤＮＡシーケンサとして用いることができる。ラマン分光を用いる場合の概要のブロック図を図２３（ａ）に示す。一例として、色選別機能の部分に、回折格子分光器と観測点を結像する（一般名称としてラマン顕微鏡と呼ばれる）光学系を用い、６３８ｎｍの波長で励起した場合に、得られたスペクトルを図２３（ｂ）に示す。また、このように、ピーク波長が分離できているので、これらの４つのピークを用いて、ＤＮＡの分析にトライした結果を図２３（ｃ）に示す。図２３（ｃ）の例では、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ａとの結果が得られた。
　このような、データ情報が集められ、解析部によって、重複する特徴や、複数のデータの重ねあわせからの推定等のコンピューティングを行い、分析した断片のつなぎ合わせから、４種塩基の元の並び順をあきらかにすることができ、ＤＮＡシーケンサとしての基本的機能を構成、確認することができた。
　次に、ナノポアデバイスにより、封鎖電流によりＤＮＡ分子を測定した例について述べる。全体構成として、図９に示すもののうち、光源１（２０３）と光検出器１（２０６）を用いず、メンブレン上下の電極に電圧を印加したときにナノポアを流れる電流を電流計１（２０２）にてモニターしながら、ＤＮＡ分子が通過する際の電流の変化を計測する。ＤＮＡ分子がナノポアをふさぐ封鎖率の違いを測定し、通過した塩基の種類を識別する方法である。一例として、図１１に示すもののうち、光源１（２０３）、光検出器（２０６）、ならびに、これに付随する光学系（レンズ、色識別）を用いない構成で説明する。
　厚み５ｎｍのメンブレン上に光計測方式用のBowtie構造を形成した素子を１０個×１０個で並列に１００個形成したチップをチャンバに装填し、メンブレンで隔離されたチャンバの両側にＫＣｌ水溶液を満たし、これらの両側のチャンバのＫＣｌ水溶液中に、それぞれ電極１、電極２を浸してセッティングした。メンブレンで隔離された上／下の領域のうち、上側領域の電極１は１００個の並列素子に対して、１素子に１個ずつ、合計１００個が設置されており、一方、メンブレンの下側領域の電極２は共通電位でよいので、１００個のメンブレンに対し共通の１つの電極となっている。１００個の素子に光を照射し、この１素子１素子に対し、前述の方法で電圧を印加して２ｎｍの孔を形成した。１００個のメンブレンに対する１００個の電極１のそれぞれに設けたスイッチにより、ひとつずつ順番に電圧を印加し、ひとつずつ孔径をチェックしながら、１００個の孔をそれぞれのBowtieギャップ位置に形成した。その後、メンブレンチップをチャンバから取り外すことなく、そのまま引き続き、ＤＮＡの入った水溶液を上側チャンバに注入して、ＤＮＡ分子の計測に移行した。
　本実施例では、光学的な測定によりＤＮＡ分子を計測することはせず、分子が孔を通過する際に孔を封鎖することにより、孔を流れる電流の減少量を測定することとした（封鎖電流方式）。まず、光源１はオフのまま、電極１と電極２に電源１により電圧を印加し、孔を通過して流れるイオン電流を電源１に取り付けた電流計によりモニタし続けたところ、ＤＮＡ分子が孔を通過したとき、特徴的なイオン電流の減少（封鎖）がみられ、水溶液中のＤＮＡ分子が孔を通過する様子を捉えることができた。
　次に、ナノポアデバイスにより、トンネル電流によりＤＮＡ分子を測定した例について述べる。全体構成として、図１０に示すように、トンネル電流測定用の電極５０１にて、ＤＮＡ分子が孔を通ることに伴い流れる電流を測定する。
　ＤＮＡ分子がナノポアを通過する際に、各塩基を流れるトンネル電流を測定し、その違いより、通過した塩基の種類を識別する方法である。一例として、図２１に示すように、厚み５ｎｍのメンブレン上にトンネル電流計測用の電極対を形成した素子を１０個×１０個で並列に１００個形成したチップをチャンバに装填し、メンブレンで隔離されたチャンバの両側にＫＣｌ水溶液を満たし、これらの両側のチャンバのＫＣｌ水溶液中に、それぞれ電極１、電極２を浸してセッティングした。メンブレンで隔離された上／下の領域のうち、上側領域の電極１は１００個の並列素子に対して、１素子に１個ずつ、合計１００個が設置されており、一方、メンブレンの下側領域の電極２は、１００個のメンブレンに対し共通の１つの電極となっている。１００個の素子のトンネル電流計測用の電極対に電源２により電圧を印加して電極対のギャップを励起し、この１素子１素子に対し、前述の方法で電源１により電圧を印加して孔を形成した。１００個のすべてに同時に電圧印加し、同時に孔を形成することも原理的には可能だが、本実施例では、１００個のメンブレンに対する１００個の電極１のそれぞれに設けたスイッチ５０５により、ひとつずつ順番に電圧を印加し、ひとつずつ孔径をチェックしながら、１００個の孔をそれぞれの電極対のギャップ位置に形成した。その後、メンブレンチップをチャンバから取り外すことなく、そのまま引き続き、ＤＮＡの入った水溶液を上側チャンバに注入して、ＤＮＡ分子の計測に移行した。
　図２１（ａ）（ｂ）に示すように、電源２よりメンブレン上の電極対に電圧を印加し、ＤＮＡ分子が孔を通過する際、それぞれの塩基に流れるトンネル電流を測定した。ＤＮＡ分子の４種塩基の分子構造の違いにより流れるトンネル電流がそれぞれ異なる様子を観測することができ、この方法で、ＤＮＡの塩基配列を得ることができることがわかった。本明細書にて述べている方法で分子にトンネル電流を流せるような電極対ギャップときちんと合った位置に孔位置を合わせ、また、孔径を高精度に制御して形成することにより、本実施例の測定は初めて実現された。
　実施例１－７の手法を用いたナノポア形成方法をＳｉ3Ｎ4メンブレン以外に、ＳｉＯＮメンブレン，ＳｉＯ2メンブレン、アルミナメンブレン、ＨｆＯ2メンブレン，ＨｆＳｉＯＮメンブレン，ＴｉＯ2メンブレン，ジルコニアメンブレン、ＺｒＳｉＯ4メンブレン，イットリアメンブレンなどの無機材料メンブレンや、その他ポリマ膜などに対しても適用を実施した。バンドギャップなどの材料特性の違いにより孔あけに必要な電圧が材料ごとに異なるが、基本的に上記の材料であれば本技術を適用できることが確認できた。
　また、光源については、近接場光発生用と、光計測によるＤＮＡ分析用とについて、共通したものを用いることができ、測定に適するようにパワーや波長を可変できればよい。
１０１　　薄膜メンブレンの領域
１０２　　ＤＮＡ分子
１０３　　ナノポア
１０４　　チャンバ
１０５　　水溶液
１０６　　水溶液入口
１０７　　水溶液出口
１０８　　光励起
１０９　　光信号
１１０　　電気信号
２０１　　電源１
２０２　　電流計１
２０３　　光源
２０４　　電源２
２０５　　電流計２
２０６　　光検出器
４０１　　絶縁膜メンブレン
４０２　　導体薄膜
４０３　　ホール
４０４　　Bowtie
４０５　　ギャップ
４０６　　導体ドット
４０７　　上下の導体ドット間の絶縁体薄膜
４０８　　近接場光発生位置
５０１　　電極対
５０２　　電極対間のギャップ
５０３　　電気配線
５０４　　電流発生位置
５０５　　選択スイッチ
７０１　　制御ユニット

Claims (14)

  1. 　膜に対し孔を形成する方法であって、
    　近接場光発生素子が載置された絶縁性の膜に対し、電解液中で前記膜に光を照射しながら、又は、前記膜に光を照射後に前記膜を前記電解液中に設けた後、前記電解液中で前記膜を挟んで設置された第１の電極と第２の電極との間に第１の電圧を印加する第１の工程と、
    　前記第１の工程後、前記第１の電極と前記第２の電極との間に第２の電圧を印加し、前記第２の電圧を印加することにより前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れる電流値を検出する第２の工程と、を繰り返し、
    　前記第１の工程と前記第２の工程を繰り返す手順を、前記電流値が予め設定した閾値に到達又は超えた場合に止めることを特徴とする孔形成方法。
  2. 　前記第２の電圧は前記第１の電圧よりも小さいことを特徴とする請求項１に記載の孔形成方法。
  3. 　前記手順のｎ回目よりもｍ回目（但しｎ＜ｍ）の方が前記第１の電圧が大きくなるように又は前記第１の電圧の印加時間が長くなるように前記手順を行うことを特徴とする請求項１に記載の孔形成方法。
  4. 　前記第１の工程と前記第２の工程の間に、前記第１の電圧とは逆極性の電圧を印加する工程を有することを特徴とする請求項１に記載の孔形成方法。
  5. 　近接場光発生素子が載置された絶縁性の膜に対し光を照射する光源と、
    　前記膜をチャンバに設置する機構と、
    　前記膜が設置されたチャンバに電解液及び測定対象物質を導入する導入口と、
    　前記膜を挟んで設けられる第１の電極及び第２の電極と、
    　前記第１の電極及び前記第２の電極との間に電圧を印加する電源と、
    　前記電圧を印加することにより得られる電流値を検出する電流計と、
    　前記光源及び前記電源を制御する制御部と、
    　前記膜に電圧を印加することにより形成される孔の大きさと電流値との関係を記憶した記憶部とを備え、
    　前記制御部は、前記膜に対し光を照射しながら又は照射後に前記第１の電極と第２の電極との間に第１の電圧を印加し、前記第１の電圧の印加後に前記第１の電極と前記第２の電極との間に第２の電圧を印加し、前記第２の電圧を印加することにより前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れる電流値を検出する制御を繰り返し行い、前記電流値が前記記憶部に記憶され予め設定した閾値に到達又は超えた場合に前記膜に孔が形成されたとして前記制御を繰り返すのを止めることを特徴とする測定装置。
  6. 　形成された前記孔を通過する前記測定対象物質又は前記測定対象物質に付加された標識発光体が、前記光源からの光を受けて放出する光を検出する色識別機構を備えた光検出器を有し、前記記憶部は、前記測定対象物質を構成する物質毎の光検出値を記憶していることを特徴とする請求項５に記載の測定装置。
  7. 　前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加することにより、形成された前記孔を前記測定対象物質が通過するのに伴い流れる電流値について、前記記憶部は、前記測定対象物質を構成する物質毎の値を記憶していることを特徴とする請求項５に記載の測定装置。
  8. 　前記絶縁性の膜は、シリコン窒化膜、シリコン酸化膜、シリコン酸窒化膜、アルミナ膜、ハフニウム酸化膜、ハフニウム酸窒化膜、ＨｆＳｉＯＮ、チタン酸化膜、ジルコニア膜、ＺｒＳｉＯ4、イットリア膜、ポリマ膜のいずれかであることを特徴とする請求項５に記載の測定装置。
  9. 　膜に対し孔を形成する方法であって、
    　電極対がギャップを挟んで載置された絶縁性の膜を電解液中に設置し、前記電極対に電圧を印加しながら、又は電圧を印加した後に、前記膜を挟んで設置された第１の電極と第２の電極との間に第１の電圧を印加する第１の工程と、
    　前記第１の工程後、前記第１の電極と前記第２の電極との間に第２の電圧を印加し、前記第２の電圧を印加することにより前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れる電流値を検出する第２の工程と、を繰り返し、
    　前記第１の工程と前記第２の工程を繰り返す手順を、前記電流値が予め設定した閾値に到達又は超えた場合に止めることを特徴とする孔形成方法。
  10. 　前記第２の電圧は前記第１の電圧よりも小さいことを特徴とする請求項９に記載の孔形成方法。
  11. 　前記手順のｎ回目よりもｍ回目（但しｎ＜ｍ）の方が前記第１の電圧が大きくなるように又は前記第１の電圧の印加時間が長くなるように前記手順を行うことを特徴とする請求項９に記載の孔形成方法。
  12. 　前記第１の工程と前記第２の工程の間に、前記第１の電圧とは逆極性の電圧を印加する工程を有することを特徴とする請求項９に記載の孔形成方法。
  13. 　電極対がギャップを挟んで載置された絶縁性の膜をチャンバに設置する機構と、
    　前記膜が設置されたチャンバに電解液及び測定対象物質を導入する導入口と、
    　前記膜を挟んで設けられる第１の電極及び第２の電極と、
    　前記第１の電極と前記第２の電極との間に電圧を印加する第１の電源と、
    　前記電極対に電圧を印加する第２の電源と、
    　前記第１の電源により電圧を印加することにより得られる電流値を検出する第１の電流計と、
    　前記第１及び第２の電源を制御する制御部と、
    　前記膜に電圧を印加することにより形成される孔の大きさと前記電流値との関係を記憶した記憶部とを備え、
    　前記制御部は、前記電極対に対し前記第２の電源から電圧を印加しながら又は印加後に、前記第１の電極と第２の電極との間に第１の電圧を印加し、前記第１の電圧の印加後に前記第１の電極と前記第２の電極との間に第２の電圧を印加し、前記第２の電圧を印加することにより前記第１の電極と前記第２の電極との間に流れる電流値を前記第１の電流計により検出する制御を繰り返し行い、前記電流値が前記記憶部に記憶され予め設定した閾値に到達又は超えた場合に前記膜に孔が形成されたとして前記制御を繰り返すのを止めることを特徴とする測定装置。
  14. 　形成された前記孔を前記測定対象物質が通過するのに伴い前記電極対に流れる電流値を検出する第２の電流計を有し、前記記憶部は、さらに前記電流値について前記測定対象物質を構成する物質毎の値を記憶していることを特徴とする請求項１３に記載の測定装置。
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