WO2015130045A1 - 개산초 추출물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

개산초 추출물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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metabolic diseases
preventing
present
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이현선
김문옥
오세량
조성찬
금항
이중구
강종순
이와니
이상우
이창영
최상호
권은빈
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한국생명공학연구원
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Definitions

  • composition for the prevention and treatment of metabolic diseases containing extract of Caesancho
  • the present invention is to prevent metabolic diseases such as obesity, type 2 diabetes mellitus, insulin resistance, dyslipidemia, hepatic steatosis and non-alcoholic fatty liver containing ultra-Zanthoxylum planispinum extract as an active ingredient and It relates to a therapeutic pharmaceutical composition.
  • Metabolic disorders are commonly associated with risk factors for cardiovascular disease, including obesity, diabetes, insulin resistance (ins / in resistance), lipid metabolism disorders, hypertriglyceridemia, increased free fatty acids, and high density cholesterol. Diseases such as reduction and hypertension are included in metabolic diseases. Metabolic disorders are caused by genetic defects that create problems in the body's metabolic processes. Most of the genetic defects of metabolic disorders are inherited from parents, and the genes that cause metabolic disorders have been found to vary. Metabolic processes are a series of processes that convert the body's food into energy for use. The body uses enzymes to break down food into smaller forms that can be digested. In addition, other cells in the enzyme serves to produce in order to use the materials of the type that can not 'be taken from food as an energy source.
  • nonalcoholic steatohepatitis has increased due to the increase in obesity, diabetes, hyperlipidemia, and some are known to progress to cirrhosis.
  • fatty liver is regarded as an early symptom of metabolic disease, not just liver disease, the importance of early diagnosis and treatment of fatty liver due to obesity is increasing.
  • adipose tissue which is an energy storage tissue, and accumulates in the form of triglycerides in non-fat tissues such as liver, muscle, pancreas, heart, etc.
  • Inflammation increased fatty acid synthesis, decreased fatty acid oxidation rate, increased insulin resistance in muscles and liver, decreased insulin production in the pancreas and beta cell death, heart failure in the heart, myocardial infarction, and non-alcoholic fatty liver in the liver (non-alcohol) ic fat ty 1 iver (NAFLD)) is known to occur. Therefore, inhibition of fat accumulation in tissues through fat absorption, inhibition of fat biosynthesis and fatty acidization can be an effective strategy for the prevention and treatment of obesity, insulin resistance, diabetes, fatty liver and metabolic syndrome.
  • TG triglycerides
  • Glycerol is an enzyme called diacylglycerol acyl transferase (DGAT) found in various tissues of mammals.
  • DGAT is the final step in the glycerol phosphate pathway, the main pathway of triglyceride synthesis. It is an enzyme that synthesizes TG by binding fatty acid acyl-CoA to the hydroxyl group of diacylglycerol.
  • DGAT has been found to have two isoforms, DGAT1 and DGAT2.
  • DGAT1 is mainly expressed in the small intestine and adipose tissue
  • DGAT2 is mainly expressed in the liver and adipose tissue
  • DGAT1 is the ACAT family
  • DGAT2 is the MGAT family
  • Roles are expected to differ (Yen CE., Stone SJ, Koliwad S, Harris C, and Farese RV. 2008. DGAT enzymes and tr iacylglycerol biosynthesis. J. Lipid Research. 49: 2283-2301).
  • Inhibiting the activity of DGAT1 results in the blocking of enzyme catalysis, which synthesizes the triglycerides of DGAT, or a decrease in the efficiency of synthesis.
  • Inhibiting the biosynthesis of triglycerides by inhibiting DGAT a final enzyme involved in triglyceride synthesis, inhibits the accumulation of fat in adipose tissue, decreases the size of fat cells, increases motor mass and uncoupling.
  • Increasing energy expression by increasing expression of protein inhibits weight gain induced by high fat diet (Smith SJ. Et. d ⁇ . Nature genetics, 25, 87-90, 2000; Chen et al., J Clin Invest., 109 (8), 1049-1055, 2002; Chen et al.
  • DGAT1 inhibition of DGAT1 is known to improve insulin resistance by inhibiting fat accumulation in non-adipose tissues such as skeletal muscle, liver, and pancreas.
  • non-adipose tissues such as skeletal muscle, liver, and pancreas.
  • PI-3K phosphat idyl inosi tol-3 kinase
  • PKB protein kinase B, Akt
  • DGAT1 inhibition acts as a target for treatment of type 2 diabetes, in which glucose uptake is impaired while insulin secretion is normal or insulin resistant. Meanwhile .
  • DGAT2 mainly contributes to the biosynthesis of TG in vivo in various studies including animal experiments. Whereas DGAT2 deficient mice hardly synthesize TG and die shortly after birth due to abnormal skin layers, DGAT1 deficient mice do not have TG levels. Slightly decreased and no survival of the mice (Stone SJ, Myers HM, fatk Feingold R, Elias PM, and Farese RV. 2004. J. Biol.
  • DGAT2 can be used as a molecular target for the treatment of related metabolic diseases including fatty liver (Choi CS, Savage DB, ⁇ karni A, Yu XX, Liu ZX, Mori no, Kim S, Distefano A, Samuel VT, Neschen S, Zhang D, Wang A, Zhang XM, Kahn M, Cline GW, Pandey SK, Geisler JG, Bhanot S, MoniaBP, Shaman GI. 2007. J. Biol. Chem.
  • DGAT enzyme inhibitor extracted from natural products, it was isolated from aphadi lactones AD (J. Org. Chem. 79, 599-607, 2014), Kanto ⁇ (Tussilago / ar / ara) of diterpene isolated from Aphanamixis grandifolia series Sesquiterpene-based materials (Park et al. J. Agric. Food Chem. 56, 10493-10497, 2008), alkamide-based (alkamide, J. Agric. Food Chem. 54, 9759-9763, 2006) (Lee et al. PI ant a Med. 70, 199-200, 2004), quinolone alkaloids, Ko et al.
  • the present inventors have tried to search for an active substance that inhibits DGAT from natural products, and the extract of Caesancho inhibits DGAT enzyme and pancreat icl ipase enzyme activity in animal models. Inhibition of resorption and resynthesis of fat in the gastrointestinal tract has been shown to exhibit a blood triglyceride lowering effect.
  • the present invention was completed by confirming that the extract of Caesancho can be usefully used as an active ingredient in the prevention and treatment of metabolic diseases such as obesity, type 2 diabetes, insulin resistance, hyperlipidemia, hepatic steatosis and non-alcoholic fatty liver. I was.
  • An object of the present invention is to provide a composition for the prevention and treatment of metabolic diseases, containing the extract of Za Ay / i / / / planispinum as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic disorders containing 7 anchovy Zanthoxylum planispinum) extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a health food for preventing and improving metabolic diseases, which contains the extract of Caesancho as an active ingredient.
  • Super Zanthoxyliun planispinum) extract of the present invention effectively inhibits the activity of DGAT1 and DGAT2, pancreat icl ipase that causes metabolic diseases, inhibits the biosynthesis of intracellular triglycerides, oral oral lipid test using animals l ip id tol erance test (OLTI) shows the effect of hypotriglyceridemia in the blood, which is an effective ingredient in the prevention and treatment of metabolic diseases such as obesity, type 2 diabetes, dyslipidemia, hepatic steatosis and nonalcoholic fatty liver. It can be usefully used.
  • OLTI l ip id tol erance test
  • Figure 1 shows the inhibition of DGATKdi acylglycerol acyl transferase 1 and DGAT2 by treatment of ⁇ danthoxylum planispinum) methanol extract with concentrations (0.3, 1, 3, 10, 30 and 100 / zg / i) Is a diagram showing.
  • Figure 2 is a diagram showing the results of measuring the inhibitory activity of the extract of Cannabis for triglyceride biosynthesis in HepG2 (eye-derived hepatocytes) and HuTu 80 (human-derived duodenal adenocarcinoma cells).
  • Figure 3 is a diagram showing the concentration-dependent inhibitory activity of antagonist methane extract for pancreat i c l ipase.
  • Figure 4 is a diagram showing the blood lipid lowering effect by the methanol extract of Gaechocho using the animal lipid oral load test (0LTT).
  • the term "administration” means introducing a certain substance into a patient in any suitable way and the route of administration of the substance can be administered via any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition may be administered by any device that allows the active substance to migrate to the target cell.
  • the "administration” is "systemic delivery” or “topical” of the composition of the present invention to the cells 'To be introduced'.
  • “Whole body delivery” refers to delivery resulting in composition and widespread biodistribution within an organism. Some administration techniques induce systemic delivery of certain compositions, and others may not. Such systemic delivery is useful, preferably This means that a therapeutically effective amount of the composition is exposed to most of the body, in general, in order to obtain a broad biodistribution, so that the composition is not rapidly degraded or eliminated before it reaches a disease site remote from the site of administration (e.g. For example , life expectancy in the blood is required by the first passage organ (liver, lung, etc.) or by rapid nonspecific cell binding, as used herein, “topical delivery” refers to the delivery of a composition directly to a target site in an organism.
  • the composition may be a disease site, such as a tumor, or other target site or target organ. Local delivery can be made by directly injecting the present invention, etc.
  • the present invention will be described in detail
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of metabolic diseases, which contains an extract of Marijuana as an active ingredient.
  • the Cannabis extract is preferably prepared by a manufacturing method comprising the following steps, but not always limited thereto:
  • step 3 drying the filtered extract of step 2) under reduced pressure.
  • the flowering herb of step 1) may be used without limitation, such as cultivated or commercially available, and may be used for all organs of natural, hybrid or cultivar, for example, roots, branches, stems, leaves, and flowers. It is preferable to include all, and more preferably, the ground portion including the leaves and stems, but is not limited thereto.
  • the extract may be extracted with water, a solvent of C 2 alcohol or a mixture thereof, and specifically, the alcohol is ethanol Or methanol, but is not limited thereto.
  • the extraction method it is preferable to use conventional methods in the art such as filtration, hot water extraction, dipping extraction, reflux cooling extraction, and ultrasonic extraction.
  • the hot water extraction method it is preferable to extract 1 to 5 times, and more preferably to extract repeatedly 3 times, but not always limited thereto.
  • the extraction solvent may be added 0.1 to 10 times to the dried flowering herb, preferably 0.3 to 5 times.
  • the extraction temperature is preferably 20 ° C to 40 ° C, but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 12 to 48 hours, but is not limited thereto.
  • the decompression concentration in step 3) preferably uses a vacuum decompression concentrator or a vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but is not limited thereto.
  • the metabolic disease may be any one selected from the group consisting of obesity, type 2 diabetes mellitus, insulin resistance, hepatic steatosis, and nonalcoholic fatty liver, but not limited thereto.
  • the extract of Caesancho may inhibit the enzymatic activity of diacylglycerol acyl transferase (DGAT), which causes metabolic diseases such as obesity, diabetes, hyperlipidemia and fatty liver in the process of lipid metabolism.
  • DGAT diacylglycerol acyl transferase
  • the present inventors pulverized the extract and extracted by dipping methanol, ethane or water, respectively, and then filtered the extract and concentrated under reduced pressure to obtain a methanol extract, ethanol extract, water extract.
  • triglycerides in the cells by extracting methanol of the present invention To evaluate the effect on the synthesis, we measured the inhibitory activity of triglyceride biosynthesis in the cells using human-derived hepatocyte hepatocyte HepG2 and human-derived duodenal adenocarcinoma HuTu 80. , 10 and 30 1 ⁇ 2 / ⁇ concentrations and [ 14 C] glycerol as a substrate to effectively inhibit the production of triglycerides in the cells, HuTu 80 cells 1, 3, 10 and 30 The concentration-dependent neutral fat biosynthesis inhibitory effect was also observed when treated with a concentration of ⁇ and [ 14 C] olate was used as a substrate (see Table 3 and FIG. 2).
  • the extract of Gaechochocho of the present invention inhibits DGAT enzyme activity in the epithelial cells, inhibits the resynthesis of triglycerides, and in animal experiments, significantly inhibits the absorption of fat in the gastrointestinal tract, obesity, diabetes, hyperlipidemia, fatty liver It can be usefully used as a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic diseases such as.
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains 0.01 to 99.9% by weight of the herbaceous extract of the present invention based on the total weight of the composition as an active ingredient, and may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent. .
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be in various oral or parenteral formulations. When formulated, it may be prepared using diluents or excipients, such as commonly used layering agents, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants.
  • Solid form preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which form at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose ( l actose) or gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, etc. may also be used. Can be.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvents and suspensions propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate may be used.
  • wi tepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, depending on the desired method, and may be administered externally or intraperitoneally, rectally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intrauterine dural or intravascular injection by parenteral administration. It is preferable to select, and most preferably, it is used for external skin.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health status, diet, time of administration, method of administration, excretion, and severity of the disease of the patient, the scope of the present invention in any way It is not intended to be limiting. Individual dosages specifically contain amounts in which the effective drug is administered at one time.
  • the daily dosage is from 0.01 to 1000 mg / kg, preferably from 30 to 500 mg / kg, more preferably from 50 to 300 mg / kg, based on the amount of the extract of Echinacea extract, to be administered 1 to 6 times a day. Can be.
  • compositions of the present invention may be used alone or in combination with methods using surgery, radiation therapy, hormonal therapy, chemotherapy and biological reaction modifiers.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating metabolic disease, comprising administering to the individual a pharmaceutically effective amount of the composition.
  • the metabolic diseases include obesity, type 2 diabetes, insulin resistance, hepatic steatosis and It may be any one selected from the group consisting of non-alcoholic fatty liver, but is not limited thereto.
  • the subject is a vertebrate, specifically a mammal, more specifically an experimental animal such as a rat, a rabbit, a guinea pig, a hamster, a dog or a cat, and more particularly a protozoan animal such as a chimpanzee or a gorilla. Can be.
  • the extract of Gaechochocho of the present invention inhibits DGAT enzyme activity in the epidermal cells and inhibits resynthesis of triglycerides. It can be usefully used for the prevention or treatment of metabolic diseases.
  • the pharmaceutically effective amount is 0.0001 to 100 mg / kg, preferably 0.001 to 10 mg / kg, but is not limited thereto. Dosage may vary according to the weight, age, sex, health status, diet, duration of administration, method of administration, elimination, and severity of the disease.
  • the pharmaceutical composition can be administered orally or parenterally during clinical administration and intraperitoneal injection, intrarectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intrauterine epidural injection, cerebrovascular injection or chest during parenteral administration. It can be administered by internal injection and can be used in the form of general pharmaceutical preparations.
  • the present invention provides a composition for preventing and improving metabolic diseases, including the extract of Caesancho as an active ingredient.
  • the extract of Gaechochocho of the present invention inhibits DGAT enzyme activity in the epithelial cells, inhibits the resynthesis of triglycerides, and results from animal experiments, significantly inhibiting the absorption of fat in the gastrointestinal tract.
  • Obesity, diabetes, hyperlipidemia, fatty liver It can be usefully used in the health food for the prevention or improvement of metabolic diseases.
  • the health food of the present invention can be added as it is, or may be used in combination with other food or food ingredients, and can be appropriately used in accordance with conventional methods.
  • There is no particular limitation on the kind of the health food. remind Examples of crops to which can be added cannabis extract include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other dairy products including noodles, gum, ice cream, various soups, drinks, tea, and drinks. , Alcoholic beverages and vitamin complexes, and the like, and include all of the health food in the usual sense.
  • the health beverage composition which is one of the health foods of the present invention, may be contained as an additional ingredient, such as various flavors or natural carbohydrates, like a normal beverage.
  • the natural carbohydrates are sugars such as glucose, monosaccharides such as fructose, malsaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, xylyl, sorbitol and erythritol. .
  • natural sweeteners such as tautin, stevia extract, synthetic sweeteners such as saccharin, aspartame, and the like can be used.
  • the proportion of said natural carbohydrate can be selected in the range of generally about 0.01-0.04 g, preferably about 0.02-0.03 g per 100 g of the composition of the present invention.
  • the health food of the present invention is a variety of nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol And carbonizing agent used in carbonated beverages.
  • it may contain flesh for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks.
  • the components can be used independently or in combination.
  • the ratio of such additives is not critical but is generally selected in the range of 0.01 to 0.1 parts by weight per 100 parts by weight of the composition of the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing and treating metabolic diseases, which contains the fraction of the antagonist as an active ingredient.
  • the Cannabis fraction is preferably prepared by a manufacturing method comprising the following steps, but not always limited thereto:
  • the organic solvent of step 4) is preferably, but not limited to, normal-nucleic acid, chloroform, ethyl acetate or butane.
  • the fractions are obtained by suspending the extract of Kalanchoe in water and then systematically fractionating the mixture into normal-nucleic acid, chloroform, ethyl acetate, normal-butane and water, followed by normal-nucleic acid fraction, chloroform fraction, ethyl acetate fraction and normal-butanol fraction.
  • Gaechocho extract of the present invention inhibits the hydrolysis of triglycerides absorbed through the diet by inhibiting pancreat icl ipase enzyme activity in the gastrointestinal tract, and inhibits the resynthesis of triglycerides by inhibiting DGAT enzyme activity in intestinal epithelial cells.
  • microsomal protein isolated from sf9 insect cells overexpressing human hDGATl or hDGAT2 was used as an enzyme source, and the method used by Kohlmann et al. (CoJe / nan et al, Methods EnzymoL, 98-103, 1992) were produced after enzyme reaction using 1,2-diacylglycerol (Sigma, DO 138) and [ 14 C] oleoyl-coei (Amersham, CFA583) as substrates. The amount of radioactivity of [ 14 C] triacylglycerol was measured. More specifically, reaction solution (175 mM Tr is-HCKpH 8.0), bovine serum albumin (10, 100 mM magnesium chloride (4 mM MgCl 2 : DGAT2 enzyme activity), 30 ⁇ of
  • T DPM value of test group in which the extract of the present invention was added to the enzyme reaction solution.
  • HepG2 cells were used to measure the triglyceride biosynthesis inhibitory activity against one substrate.
  • HepG2 cells were obtained from ATCC, and the minimum essential medium containing 2 mM L-glutamine (MEM); 1.5 g / L hydrogen carbonate 10% fetal bovine serum (FBS) in earle's BSS medium prepared to contain sodium bicarbonate, O.lmM essential amino acids and 1 mM sodium pyruvate 1% antibiotics (100 U / i penicillin and 100 g / mi streptomycin) were added and cultured in 37 ° C. and 5% C0 2 incubators.
  • MEM L-glutamine
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotics 100 U / i penicillin and 100 g / mi streptomycin
  • the amount of triglycerides produced in the cells was measured, and the reduction of triglyceride production rate was determined as the effect of the enzyme inhibitor after the addition of the methanol extract of the present invention as the enzyme activity inhibiting substance, respectively.
  • the wells per 1 xlO replaced with 6 FBS is DMEM (D becco's modified Eagle's medium) that does not exist after the frequency division by culturing for 24 hours in cell number of the cell medium and as a substrate [14 C] glyceryl ([14 C] glycerol ) And 18 hours
  • the extract was used by dissolving in dimethyl sulfoxide (dimethyl s // «oxide (DMS0)) and reacting with dimethyl sulfoxide alone without adding the extract of the present invention to the control group.
  • the production rate was 100.
  • the cells were dissolved in 0.3 N of 0.1 N sodium hydroxide and used to measure the protein concentration of the cells used in the reaction.
  • the amount of radioactivity of triglycerides was measured, and the experimental error between each test group was corrected by using the value obtained by dividing the protein concentration as an experimental value, thereby calculating the production of triglycerides by the extract of Ganoderma lucidum of the present invention.
  • HepG 2 cells were treated with the concentrations of 1, 3, 10 and 30 g / n ⁇ , respectively, and [ 14 C] glycerol was used as a substrate.
  • HuTu 80 cells were dispensed at 2 ⁇ 10 5 (eel ls / wel 1) in 24-well culture dishes, respectively.
  • the cells remaining after extraction were dissolved in 0.3N NaOH 0.3 to measure the protein concentration of the cells used for reaction. Protein quantitation was performed using Bio-Rad's protein quantification kit based on the Lowry method.
  • 96-well back After dispensing the bottom plate dish protein, mixed solution containing 20 protein reagent S (bio-rad, surfactant solut i on) was added to 1 protein assay reagent (bi o-rad, alkal in copper tartrate solut ion). The wells were aliquoted to induce reactions between copper ions and proteins. After the reaction was completed, Reagent B (bio-rad, fol in reagent) was dispensed into each well by 200 ⁇ to reduce reaction using a fol in reagent.
  • Reagent B bio-rad, fol in reagent
  • the amount of protein was measured at 750 nm as the degree of the reduction of the polyline reagent was developed in blue, and the standard concentration was determined using BSA as a standard to quantify the protein concentration corresponding to each absorbance.
  • the radiation dose of the measured thick fat divided by the protein concentration was used as the experimental value. As a result, the Figure 2 and Table 3.
  • the extract of methanol of the flowering herb inhibited the biosynthesis of thick fat by concentration-dependently by inhibiting intracellular DGAT.
  • test results were as follows.
  • mice 8-week-old male C57BL / 6J mice were purchased from the Biolink and purified for 1 week in a clean animal breeding room (temperature 22 ⁇ 3 ° C, humidity 50 ⁇ 10%, lighting 12-hour cycle). Fasting 16 hours a day before was used in the experiment.
  • the feed used in the experiment was a solid feed for mice sterilized by radiation (Har lan, IN, USA) to be freely ingested except for the fasting period of 16 hours. Drinking water was sterilized by autoclave and allowed to drink freely at all times throughout the experimental period.
  • C57BL / 6J mice were divided into five groups, each of which was divided into a solvent control group or an experimental group, and the methanol methane of the present invention was administered as follows.
  • the normal control group only the administration medium (0.5% CMC; carboxy methyl cel l ⁇ ose) was administered, and the experimental group was orally administered with methanol extract of Gaechochocho at a concentration of 300 mg / kg.
  • All experimental animals were fasted for 16 hours prior to administration of the extract of methanol methane of the present invention, followed by oral administration of the respective extracts once orally using a maximal dose for oral administration. After 60 minutes, corn oil was orally administered at a level of 6 mi / kg.
  • a capillary tube was taken (0 hr) immediately before administration of corn oil and treated with heparin from retro-orbital sinus by hour (2 and 4 hours) after corn oil administration. ), Blood was collected directly. Thereafter, the collected blood was centrifuged at 3,000 rpm for 10 minutes to separate plasma, and the concentration of triglycerides was directly analyzed by an automated blood chemistry analyzer (Hitachi 7150, Japan). The results are shown in [Table 4] below.
  • mice administered with carboxy methyl cell ose (CMC) as a solvent control group were about 5.3 times compared to before administration when 2 hours after the administration of high fat corn oil. After 4 hours, the concentration of triglyceride was increased 2.1 times compared to before administration.
  • CMC carboxy methyl cell ose
  • mice administered 300 mg / kg of Gaechocho methanol extract according to the present invention were 2 hours after corn oil administration, about 1.0 times compared to before administration, and about 0.97 times after 4 hours. It was confirmed that the concentration of triglycerides was significantly reduced compared to the solvent control group. From the above results, Gaechochocho extract according to the present invention inhibits pancreatic lipase in the gastrointestinal tract, inhibits hydrolysis of triglycerides ingested through diet, and inhibits resynthesis of triglycerides through inhibition of DGAT enzyme activity in epithelial cells. By inhibiting the absorption of fat in the gastrointestinal tract, it was confirmed to suppress the concentration of triglycerides in the blood of mice (Table 4).
  • T863 DGAT1 selective inhibitor (Cao et al., J. Biol. Chem. 48, 41838-41851, 2011)
  • the tablets were prepared by direct tableting method after mixing the above components.
  • Each component was added and dissolved in purified water according to a conventional method for preparing a liquid, and the above components were mixed after adding an appropriate amount of lemon flavor. Purified water was added to the mixture to adjust the whole to 100, and then filled into a brown bottle to sterilize to prepare a liquid.
  • Brown rice, barley, sesame rice, and yulmu were alphad by a known method, and then dried and roasted to prepare a powder having a particle size of 60 mesh.
  • Black beans, black sesame seeds, and perilla were also steamed and dried by a known method, and then ground to a powder having a particle size of 60 mesh.
  • the dried ethanol extract of Example ⁇ 1-2> was concentrated under reduced pressure in a vacuum concentrator, and the dried product obtained by spraying and drying with a hot air dryer was pulverized with a particle size of 60 mesh to obtain a dry powder.
  • the grains, seeds and the ethanol extract of Example ⁇ 1-3> prepared above were prepared by combining the following ratios:
  • Cereals (30 parts by weight brown rice, 15 parts by weight of radish, 20 parts by weight of barley) ,
  • Seeds (7 parts by weight perilla, 8 parts by weight black beans, 7 parts by weight black sesame seeds),
  • composition ratio of the vitamin and mineral mixtures described above is a relatively suitable composition for a health food in a preferred embodiment, but the composition ratio may be arbitrarily modified, it is possible to mix the above components according to a conventional health food manufacturing method After that, the granules may be prepared and used for preparing a health food composition according to a conventional method.
  • the above ingredients were mixed according to the general method of preparing a healthy beverage for a total of 500 mi, stirred and heated at 85 ° C. for about 1 hour, and then the resulting solution was filtered and obtained in a sterilized 1 f container to be sealed and sterilized. After refrigerated storage, it is used to prepare a health beverage composition of the present invention.
  • composition ratio is a composition suitable for a preferred beverage in a preferred embodiment
  • the compounding ratio may be arbitrarily modified according to regional and ethnic preferences such as demand hierarchy, demand country, and use purpose.

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Abstract

본 발명은 개산초(Zanthoxylum planispinum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 개산초 추출물은 대사성 질환을 유발하는 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(diacylglycerol acyltransferase(DGAT))와 pancreatic lipase의 활성을 효과적으로 억제하고, 인간유래 간세포(HepG2)와 십이지장선암세포(HuTu 80) 내의 중성지방 생합성을 저해하며, 동물 지질 경구부하시험(oral lipid tolerance test(OLTT))에서 위장관에서 중성지방의 흡수를 효과적으로 억제하여 중성지방의 혈중강하 효과를 나타내므로, 본 발명의 개산초 추출물은 비만, 제2형 당뇨, 인슐린저항성, 이상지질혈증, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver) 등의 대사성 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

【명세서]
【발명의 명칭】
개산초 추출물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 【기술분야】
본 발명은 초 Zanthoxylum planispinum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 비만， 제 2형 당뇨， 인술린저항성， 이상지질혈증， 간지방증 (hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간 (fatty liver)등의 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
[배경기술]
대사장애는 일반적으로 심혈관 질병을 결정짓는 위험 요소로, 비만, 당뇨병， 인슐린 저항증 (ins/ in resistance), 지질 대사 이상, 고중성지방혈증 (hypertriglyceridemia), 유리지방산의 증가， 고밀도 콜레스테를의 감소 및 고혈압 등의 병들이 대사성 질환에 포함된다. 대사장애는 유전적인 결함으로 인해서 신체의 대사과정에 문제가 생성되어 발생된다. 대부분 대사장애의 유전적 결함은 부모로부터 유전되며， 대사장애의 원인이되는 유전자의 종류는 다양하다고 밝혀졌다. 대사과정은 신체에서 섭취한 음식물을 사용할 수 있는 에너지로 전환하는 일련의 과정을 일컫는다. 신체는 효소를 아용하여 음식물을 잘게 분해한 후 소화시킬 수 있는 간단한 형태로 만든다. 또한 세포내의 또 다른 효소는 음식물로부터 섭취할' 수 없는 형태의 물질을 에너지원으로 사용하기 위하여 생성하는 역할을 한다. 즉， 대사장애의 유전적인 결함은 대사에 필요한 효소가 정상적으로 활동할 수 없거나， 신체가 생성하는 효소의 양이 극도로 감소하거나， 없어지는 경우에 발생한다. 또한 유전적 결함으로 인해 섭취된 물질이 분해되지 않고， 신체 내에서 독성을 갖게 되는 경우도 발생하며， 신체에서 필요한 물질을 대사과정을 통해서 공급할 수 없는 결과가 초래되기도 한다. 현대 사회에서 비만은 다양한 원인에 의해 체내의 지방 축적량이 증가하여 발생하고 있으며， 체내의 과도한 지방 축적의 위험에 대해서는 그리스 시대부터 알려졌다고 하나, 이로 유도되는 병에 대해서는 지난 세기 비만이 영양부족을 제치고 주요한 문제로 자리매김하면서 그 중요성이 평가되기 시작하였다. 또한, 비만은 고혈압， 당뇨병， 심장질환， 동맥경화， 고지혈증과 같은 대사성 질환으로 발전할 수 있기 때문에 그 치료와 예방이 중요하다. 또한 근래에는 비만， 당뇨병， 고지혈증 등의 증가로 비 알코을성 지방 간염이 증가하고 있으며， 일부는 간경변증으로 진행되는 것으로 알려져 있다. 더욱이 지방간이 단순한 간 질환아 아니라 대사 질환의 초기 증상으로 여겨지면서 비만으로 인한 지방간의 조기 진단과 치료의 중요성이 커지고 있다. 비만에 의한 만성질환 유발 기전의 하나로 과도한 에너지 공급이 에너지 저장조직인 지방조직의 한계를 넘어서 간， 근육， 췌장, 심장 등 비 지방조직에 중성지방 형태로 축적되며 혈중 유리지방산의 증가에 의한 세포사멸과 염증， 지방산 합성증가， 지방산 산화속도 감소, 근육과 간에서의 인슐린 내성 증가， 췌장에서의 인슐린 생성 감소와 베타세포 사멸， 심장에서의 심부전， 심근경색， 간에서의 비알콜성 지방간 (non-alcohol ic fat ty 1 iver(NAFLD) ) 등의 문제가 발생한다고 알려져 았다. 따라서, 지방의 흡수, 지방생합성 억제와 지방산화 증대를 통한 조직의 지방축적의 억제는 비만， 인슐린저항성， 당뇨, 지방간 및 대사증후군의 예방 및 치료의 효율적인 전략이 될 수 있다. 중성지방의 대표적인 형태인 트리글리세라이드 ( tr iglycer ides(TG) )의 생합성에 있어서 결정적인 효소는, 아실 코에이 (acyl CoA) 및 디아실글리세를 (diacylglycerol )로부터 TG를 생성하는데 촉매작용올 하는 디아실글리세를 아실트랜스퍼라제 (diacylglycerol acyl transferase(DGAT) )라는 효소로서 포유동물의 다양한 조직에서 발견된다. DGAT는 중성지방 합성의 주경로인 글리세를 포스페이트 (glycerol phosphate) 경로의 마지막 단계에서 디아실글리세를 (diacylglycerol)의 하이드록실기에 지방산 아실코에이 (fatty acyl-CoA)를 결합시켜 TG를 합성하는 효소이다. 지금까지, DGAT는 2가지 이소체 (isoform)인 DGAT1 및 DGAT2이 있는 것으로 밝혀져 있다. 이들의 생화학적 기능은 유사하나 조직분포 (DGAT1은 소장과 지방조직， DGAT2는 간과 지방조직에서 주로 발현) 및 속해 있는 유전자 군 (DGAT1은 ACAT 패밀리， DGAT2는 MGAT 패밀리)이 달라 이들의 TG 생합성에 대한 역할이 다를 것으로 예상된다 (Yen CE. , Stone SJ, Koliwad S, Harris C, and Farese RV. 2008. DGAT enzymes and tr iacylglycerol biosynthesis. J. Lipid Research. 49: 2283-2301) . 최근， 미국의 글래드스톤 심장질환연구소에 실행한 DGAT1 유전자 결핍 마우스를 이용한 DGAT 기능 연구에서， DGAT1 결핍 마우스에 고지방식이를 투여한 결과, 체중 증가 (diet-induced obesity)가 효과적으로 억제되었고 인슐린 (ins in)과 렙틴 (leptin)에 대한 감수성이 증대되어 당대사 (glucose metabolism)가 개선된다는 증거를 제시하고 있다. 또한， 후속 연구 결과에서는 인슐린에 민감한 조직인 지방조직， 골격근， 간， 췌장의 베타세포 (beta-cell) 등에서 중성지방 생합성 과정을 촉매하는 효소인 DGAT1를 선택적으로 저해하는 것이 비만과 제 2형 당뇨의 예방 및 치료에 효과적임이 밝혀져 부상되고 있다 (Chen H (：， et al. , Trends Cardiovasc. Med., 10， 188-192, 2000; Farese Jr. et al. , Curr. Op in. Lip idol., 11， 229-234, 2000； A. Subauste et. al. , Cur runt Drjug Target -Immun, Endocrine &Metabol Disorders, 3， 263-270 2003; Y. Yu et. al. Anals of Medicine, 36. 252-261).
DGAT1의 활성을 저해시키면 DGAT의 중성지방을 합성하는 효소 촉매 반웅이 차단 또는 합성 효율의 감소가 일어난다. 중성지방 합성에 관여하는 최종 단계의 효소인 DGAT를 저해하여 중성지방의 생합성을 억제할 경우, 지방 조직 내의 지방의 축적이 억제되고 지방세포의 크기가 감소하고， 운동량의 증가와 짝풀림 (uncoupling) 단백질의 발현증가에 의해 에너지 소비가 증가함으로써， 고지방식이에 의해 유도된 체중 증가가 억제된다 (Smith SJ. et d入. , Nature genetics, 25, 87-90, 2000; Chen et al.， J Clin Invest., 109(8), 1049-1055, 2002; Chen et al. , J Clin Invest., 111， 1715-1722, 2003； Chen et al. Am. J. Physiol. Endocronol. Metab. , 284, E213-218, 2003) . 또한， DGAT1의 저해는 골격근， 간， 췌장 등의 비 지방조직 (non— adipose tissue)에서 지방의 축적을 억제함으로써 인슐린 저항성을 개선시키는 것으로 알려져 있다. 즉， 세포가 인술린에 의해 자극받으면 IRS-Kins ^in receptor substance—l)의 세린 (serine)부위의 인산화 ( inhibitory phosphory 1 at i on) 7} 감소되고 타이로신 (tyrosine) 부위의 인산화가 증가됨으로써， PI-3K(phosphat idyl inosi tol-3 kinase) , PKB(protein kinase B, Akt ) ,
PKC^proteinkinase j등을 거치는 인슐린 신호전달의 활성화를 통하여 당 수송체인 GLUT-4의 수가 늘어난다. 세포내에서 DGAT1의 활성이 저해될 경우,
PI-3K, PKB 및 PK¾의 활성이 증가하면서 막으로 엑소사이토시스되는 GLUT-4 수가 증가하게 되고 최종적으로 세포내로 유입되는 포도당의 수가 증가하게 된다. 즉， DGAT1의 활성 억제는 인슐린 민감성을 증가시킨다 (Chen et al. , Arterioscler Thromb Vase Biol.25(3) , 482-486, 2005； Chen et al. , J CI in Invest. 111(11), 1715-22, 2003； Chen et al . , J Clin Invest. 109(8)， 1049-1055, 2002； Chen et al. , Diabetes. 51(11), 3189-3195, 2002； Subauste and bur ant . , Curr Drjug Targets Immune Endocr Metabol Disord. 3(4)， 263-270, 2003). DGAT1 저해와 인슐린 저항성 극복의 직접적인 관련성이 밝혀지면서， DGAT1 저해가 인슐린 분비량은 정상이나 인슐린 저항성을 가지게 되면서 포도당 흡수가 장애를 받는 제 2형 당뇨병의 치료의 표적으로 작용하는 것을 알 수 있다. 한편 . DGAT2의 경우， 동물실험을 포함한 다양한 연구에서 생체 내 TG의 생합성에 DGAT2가 주로 기여하는 것으로 알려져 있다. DGAT2 결핍 (knockout) 마우스는 TG를 거의 합성해내지 못하고 비정상적인 피부층으로 인해서 태어난 후 얼마 지나지 않아 죽게 되는 것과는 달리， DGAT1 결핍 마우스는 TG 수준이 약간 감소하고 마우스의 생존에는 문제가 없음을 보여주고 있다 (Stone SJ, Myers HM, fatk Feingold R, Elias PM, 및 Farese RV. 2004. J. Biol. Chem. 279： 11767-11776； Smith SJ, Cases S, Jensen DR' Chen HC, Sande E, Tow B, Sanan DA, Raber J, Eckel RH, 및 Farese RV. 2000. Nat. Genet . 25： 87-90). 지방간 동물모델에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드 (Antisense oligonucleotide(ASO))를 이용하여 DGAT1 또는 DGAT2의 발현량을 감소시킨 결과， 단지 DGAT2의 양을 감소한 경우에만 지방간 증상이 완화되고 간에서의 포도당 생성률이 현저히 감소하는 것올 나타냈다. DGAT2가 지방간을 포함한 관련 대사성 질환의 치료를 위한 분자표적으로 활용될 수 있음을 강하게 증명하고 있다 (Choi CS, Savage DB, ^karni A, Yu XX， Liu ZX, Mori no , Kim S, Distefano A, Samuel VT, Neschen S, Zhang D, Wang A, Zhang XM, Kahn M, Cline GW, Pandey SK, Geisler JG, Bhanot S, MoniaBP, Shaman GI .2007. J. Biol. Chem. 282： 22678-88； Yu XX, Murray SF, Pandey SK, Boo ten SL, Bao D, Song XZ, Kelly S, ChenS, McKay R, MoniaBP, Bhanot S.2005. Hepatology.42： 362-71； Yamaguchi K, Yang L, McCall S, Huang J, Yu XX, Pandey SK, Bhanot S, Monia BP, Li YX, Diehl AM. 2007. Hepatology. 45： 1366-74). 노바티스 (Novartis), 화이자 (Pfizer), 비엠에스 (BMS) 및 아스트라제네카 (AstraZeneca)를 비롯한 몇몇 거대 제약회사에서 비만， 당뇨， 지방간, 고지혈증 등을 포함한 대사성 질환의 분자표적으로서 DGAT1을 결정하고 활발히 그 억제제 개발 프로그램을 진행하였으며， 현재 그 중 일부가 임상 시험 중에 있다 (Zhao et al. J. Med. Chem. 51, 380-383； 2008； Birch et al. 52， 1558-1568, 2009； Dow, Metabolic Disease Drzg Discovery & Development, Half Moon Bay, CA' USA, 2009； Yun et al . 237th ACS National Meeting, Salt Lake City, UT, USA:Abs: MED I -256, 2009). 또한， 국내에서도 일부 제약회사 및 정부출연연구소 등에서 DGAT1의 억제물질 개발 및 이를 이용한 대사성 질환의 치료제 개발 연구를 진행 중에 있다. 그러나， DGAT2를 분자표적으로 하는 신약개발 프로그램은 국내외에서 거의 보고되지 않은 상황이다. 특히, 천연물로부터 추출한 DGAT 효소 저해제로서, Aphanamixis grandifolia 계ᅳ 분리된 디테르펜계의 aphadi lactones A-D( J . Org. Chem. 79， 599-607, 2014)， 관동^ (Tussilago /ar/ara)로부터 분리된 세스퀴터펜계 물질 (Park et al. J. Agric. Food Chem. 56, 10493-10497, 2008)， 호초와 필발로부터 알카마이드계 (alkamide, J. Agric. Food Chem. 54， 9759-9763, 2006) , 인삼으로 분라한 폴리아세틸렌계 (Lee et al . PI ant a Med.70， 199-200， 2004)，오수유로부터 퀴놀론 알칼로이드 (quinolone alkaloids, Ko et al. PI ant a Med. 68, 1131-1133, 2002), 단삼의 탄시논계 (tanshinones, Ko et al. , Arch. Phar. Res. 25， 446-448, 2002), 고삼으로부터 분리한 프레닐플라보노이드계 (Prenyl flavonoids, Chung et al. PI ant a Med. 70， 258-260, 2004) 등이 알려져 있다. 그 외에 일본의 기타사토 연구소의 오무라 (Omura) 그룹에서 보고한 저해제로서 로셀리핀 (roselipins)(US6432682(2002), US6608185(2003)) , 코클리오퀴논 에이 및 에이원 (cochlioquinone A and Al, J. Antibiot., 56, 967, 2003； J. Antibiot., 57， 59， 2004) , 아미뎁신 (amidepsines) 및 크산토후몰 (xanthohumols)， 그 외 에이코 ]"펜타에노익에시드 (eicosapentaenoic ' acid) ,
2-브로모옥타노에이트 (2-bromooctanoate), 나이아신 (niacin) 등이 보고된바 있으나 (Rustan et al . , J. Lipid. Res., 29， 1417-1426, 1988； Ganj i et al. J. Lipid. Res., 45, 1835-1845) , 개산초의 DGAT효소 저해 활성에 대해서는 알려진 바 없다.
71] ( Zanthoxylu planispinwny는 운향과 (Rutaceae)의 초피나무속 (Zanthoxylum)에 속하는 식물로서 우리나라를 비롯하여 중국 등지에 분포되어 있으며 감기 및 치통의 치료에 민간약으로 사용되어 왔다. 그러나， 상기 개산초는 리그난계 성분을 가지고 있고， 항산화 활성 및 항균활성만이 보고되어 있을 뿐, 지금까지 대사성 질환에 대한 연구는 알려진 바가 거의 없다 (Yang et al. Helvetica Chimmica Acta, 92, 1657-1664, 2009； Deng et al. Food Chemi stry, 125， 1430-1435 , 2009)
이에 본 발명자들은 대사성 질환의 치료에 있어서 DGAT의 중요성을 감안하여 천연물로부터 DGAT를 억제하는 활성물질을 탐색하기 위해 노력한 결과， 개산초 추출물이 DGAT 효소와 pancreat i c l ipase효소 활성을 저해하고， 동물모델에서 위장관에서 지방의 흡수와 재합성를 억제하여 혈중 중성지방 강하효과를 나타냄을 확인하였다. 이로써 개산초 추출물이 비만， 제 2형 당뇨, 인슐린저항성， 고지혈증， 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 치료 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용할 수 있음을 확인함으로써， 본 발명을 완성시켰다.
【발명의 상세한 설명】
[기술적 과제]
본 발명의 목적은 개산초 (Za Ay/i///? planispinum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
[기술적 해결방법】
상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 7 노초 Zanthoxylum planispinum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러， 본 발명은 개산초 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품을 제공한다.
【유리한 효과】
본 발명의 초 Zanthoxyliun planispinum) 추출물은 대사성 질환을 유발하는 DGAT1 및 DGAT2의 활성， pancreat i c l ipase을 효과적으로 억제하고， 세포내 중성지방의 생합성을 저해하며， 동물을 이용한 지질 경구부하시험 (oral l ip i d tol erance test (OLTI ) )에서 혈중 내 중성지방 강하 효과가 나타내므로 비만， 제 2형 당뇨， 이상지질혈증, 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 치료에 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다. [도면의 간단한 설명]
도 1은 ^ ^^danthoxylum planispinum) 메탄올 추출물을 농도별 (0.3 , 1， 3 , 10， 30 및 100 /zg/i )로 처리하여 DGATKdi acylglycero l acyl transferase 1) 및 DGAT2의 저해활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 HepG2(안간유래 간세포) 및 HuTu 80(인간유래 십이지장선암세포)내에서의 중성지방 생합성에 대한 개산초 추출물의 저해 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 pancreat i c l ipase에 대한 개산초 메탄을 추출물의 농도 의존적인 저해활성을 나타낸 도이다.
도 4는 동물 지질 경구부하시험 (0LTT)을 이용하여 개산초 메탄올 추출물에 의한 혈중지질 강하효과를 나타낸 도이다.
【발명의 실시를 위한 최선의 형태】 이하， 본 발명의 용어를 상세히 설명한다. 본 발명에서， 용어 "투여 "는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여， 근육내 투여， 피하 투여， 피내 투여， 경구 투여， 국소 투여， 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나， 이에 제한되지는 않는다. 또한， 상기 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한， 상기 "투여''는 본 발명의 조성물을 세포로 "전신 전달" 또는 "국소 전달' '하여 도입되는 것을 뜻한다. "전신 전달' '은 유기체 내에 조성물와 광역 생체분포를 유발하는 전달을 지칭한다. 일부 투여 기술은 특정한 조성물의 전신 전달을 유발하고， 다른 것들에는 그렇지 않을 수 있다. 상기 전신 전달은 유용한， 바람직하게는 치료적으로 유효한 양의 조성물이 신체의 대부분에 노출되는 것을 의미한다. 일반적으로， 광역 생분포를 얻기 위하여, 조성물이 투여 부위와 멀리 떨어진 질환 부위에 도달하기 전에 빠르게 분해되거나 제거되지 않도록 (예를 들면, 최초 통과 기관 (간, 폐 등)에 의해 또는 빠른 비특이적 세포 결합에 의해) 혈액내에서 수명이 요구된다. 본 명세서에 사용된 "국소 전달"은 유기체 내에서 표적 부위에 조성물을 직접 전달하는 것을 지칭한다. 예를 들면， 조성물은 질환 부위， 예를 들면 종양， 또는 다른 표적 부위 또는 표적 기관 등에 직접 주사함으로써 국소 전달될 수 있다. 이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 개산초 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 개산초 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다：
1) 개산초에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계 .
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 개산초는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며， 천연， 잡종 또는 변종 수련의 모든 기관， 예를 들어, 뿌리， 가지, 줄기， 잎， 꽃을 모두 포함하는 것이 바람직하고， 잎과 줄기를 포함한 지상부인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서 , 상기 추출물은 물， 내지 C2의 알코올 또는 이들의 흔합물인 용매로 추출되는 것일 수 있으며， 구체적으로 상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 추출 방법으로는 여과법， 열수추출， 침지추출 , 환류냉각추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 상기 열수추출 방법으로는 1회 내지 5회 추출하는 것이 바람직하고 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매는 건조된 개산초에 0. 1 내지 10배 첨가할 수 있으며， 0.3 내지 5배 첨가하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20°C 내지 40oC인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 추출시간은 12 내지 48시간인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한， 상기 건조는 감압건조， 진공건조， 비등건조， 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 대사성 질환은 비만, 제 2형 당뇨， 인슐린저항성， 간지방증 (hepat i c steatosi s) 및 비알코올성 지방간 ( fatty l iver )으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 개산초 추출물은 지질대사 과정에서 비만, 당뇨병， 고지혈증， 지방간 등과 같은 대사성 질환을 유발하는 디아실글리세를 아실트랜스퍼라제 (di acylglycerol acyl transferase(DGAT) )의 효소활성을 저해시키는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서， 본 발명자들은 개산초를 분쇄하여 메탄올， 에탄을 또는 물에 각각 침지하여 추출한 후， 추출액을 여과하고， 감압 농축하여 메탄올 추출물， 에탄올 추출물，물 추출물을 수득하였다. 그런 다음， 개산초 추출물의 인간 DGAT1 & DGAT2효소 저해 활성을 측정한 결과， 본 발명의 개산초 추출물은 농도 -의존적으로 DGAT의 효소활성을 저해함을 확인하였다 (표 1， 표 2 및 도 1 참조) .
또한， 본 발명의 개산초 메탄을 추출물에 의한 세포내에서의 중성지방 합성에 미치는 영향을 알아보기 위하여， 인간 유래 간세포민 HepG2및 인간유래 십이지장선암세포인 HuTu 80을 이용하여 세포내에서의 중성지방 생합성 저해 활성을 측정한 결과， HepG2 세포에 개산초 추출물을 1， 3， 10 및 30 ½/ ^의 농도로 처리하고 [ 14C]글리세를을 기질로 사용했을 때 세포내의 중성지방 생성을 매우 효과적으로 저해하였으며， HuTu 80세포에 개산초 추출물을 1 , 3， 10 및 30 ^의 농도로 처리하고 [14C]올에이트를 기질로 사용했을 때에도 농도-의존적인 중성지방 생합성 저해효과를 확인하였다 (표 3 및 도 2 참조) . 또한， 본 발명의 개산초 추출물을 마우스에 경구 투여하고， 고지방식이로 콘 오일 (corn oi l )올 투여하여 혈중에 나타나는 중성지방의 농도 변화를 관찰한 결과， 본 발명의 추출물이 투여된 마우스는 대조군 마우스와 대비하여 중성지방 농도의 상승을 억제하는 효과가 우수한 것을 확인하였다 (표 4 및 도 4 참조) .
따라서， 본 발명의 개산초 추출물은 장피세포에서 DGAT효소 활성을 저해하고， 중성지방의 재합성을 억제하며， 동물실험 결과， 위장관에서 지방의 흡수를 유의적으로 억제함으로써 비만, 당뇨병， 고지혈증， 지방간 등의 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 조성물의 총 중량에 대하여 본 발명의 개산초 추출물을 0. 1 내지 99.9 중량 %를 유효성분으로 함유하고， 약제학적으로 허용 가능한 담체， 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 층진제， 증량제， 결합제， 습윤제， 붕해제， 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제， 환제， 산제， 과립제， 캡슐제 등이 포함되며, 상기 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면， 전분， 칼슘카보네이트， 수크로오스 ( sucrose) , 락토오스 ( l actose) 또는 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한， 단순한 부형제 이외에 마그네슘스테아레이트 (magnes ium stearate) , 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제， 내용액제， 유제， 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물， 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제， 예를 들면 습윤제， 감미제， 방향제， 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액， 비수성용제， 현탁제， 유제， 동결건조제제， 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol ) , 폴리에틸렌 글리콜， 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 았다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (wi tepsol ) , 마크로골, 트원 (tween) 61， 카카오지， 라우린지， 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라， 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며， 비경구 투여시 피부 외용 또는복강내， 직장， 정맥， 근육, 피하，자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하며， 가장 바람직하게는 피부 외용으로 사용한다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령， 성별， 건강상태， 식이， 투여시간， 투여방법， 배설를 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 개별 투약량은 구체적으로 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유한다.
일일 투여량은 개산초 추출물의 양을 기준으로 0.01내지 1000 mg/kg이고, 바람직하게는 30내지 500 mg/kg이고， 더욱 바람직하게는 50내지 300 mg/kg이며， 하루 1 내지 6회 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 단독으로， 또는 수술， 방사선 치료, 호르몬 치료， 화학 치료 및 생물학적 반웅 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
상기 대사성 질환은 비만， 제 2형 당뇨， 인슐린저항성， 간지방증 및 비알코을성 지방간으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
상기 개체는 척추동물이고， 구체적으로는 포유동물이고， 더욱 구체적으로는 쥐， 토끼， 기니아피그， 햄스터， 개， 고양이와 같은 실험동물이며, 더욱 더 구체적으로는 침팬지， 고릴라와 같은 유인원류 동물일 수 있다.
따라서, 본 발명의 개산초 추출물은 장피세포에서 DGAT효소 활성을 저해하고， 중성지방의 재합성을 억제하몌 동물실험 결과, 위장관에서 지방의 흡수를 유의적으로 억제함으로써 비만， 당뇨병， 고지혈증， 지방간 등의 대사성 질환의 예방 또는 치료 방법에 유용하게 사용될수 있다. 상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 mg/kg이고， 바람직하게는 0.001내지 10 mg/kg이나， 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중， 연령， 성별, 건강상태， 식이， 투여기간， 투여방법， 제거을， 질환의 중증도 등에 따라 달라질 수 았다.
상기 약학적 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내 주사， 직장내 주사，피하주사， 정맥주사，근육내 주사, 자궁내 경막주사， 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고， 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 또한， 본 발명은 개산초 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.
본 발명의 개산초 추출물은 장피세포에서 DGAT효소 활성을 저해하고， 중성지방의 재합성을 억제하며， 동물실험 결과， 위장관에서 지방의 흡수를 유의적으로.억제함으로써 비만， 당뇨병， 고지혈증, 지방간 등의 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강식품에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 건강식품은 개산초 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 개산초 추출물을 첨가할 수 있는 삭품의 예로는 육류， 소시지， 빵, 초콜릿， 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품， 각종 스프， 음료수, 차， 드링크제， 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며， 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강식품 중의 하나인 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등올 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드， 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드， 및 덱스트린， 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드， 자일리를， 소르비를， 에리트리를 등의 당알코올이다. 감미제로서는 타우마틴， 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나， 사카린， 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 g당 일반적으로 약 0.01 - 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ― 0.03 g의 범위에서 선택할 수 있다.
상기 외쎄 본 발명의 건강식품은 여러 가지 영양제， 비타민, 전해질， 풍미제， 착색제， 펙트산 및 그의 염， 알긴산 및 그의 염， 유기산， 보호성 콜로이드 증점제， pH조절제 , 안정화제 , 방부제， 글리세린， 알코올， 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일주스， 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비을은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100증량부 당 0.01 - 0. 1중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 또한， 본 발명은 개산초 분획물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 개산초 분획물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다:
1) 개산초에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계 ; 3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하여 개산초의 추출물을 제조하는 단계 ; 및
4) 단계 3)의 개산초 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 개산초 분획물을 제조하는 단계. 상기 방법에 있어서, 단계 4)의 유기용매는 노르말-핵산， 클로로포름， 에틸아세테이트 또는 부탄을인 것이 바람직하나， 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 개산초 추출물을 물에 현탁시킨 후 노르말-핵산， 클로로포름， 에틸아세테이트， 노르말-부탄을 및 물로 순차적으로 계통 분획하여 수득한 노르말 -핵산 분획물， 클로로포름 분획물， 에틸아세테이트 분획물， 노르말-부탄올 분획물 또는 물 분획물 중 어느 하나인 것이 바람직하며， 에틸아세테이트 분획물임이 더욱 바람직하나， 이에 한정하지 않는다. 상기 분획물은 상기 개산초 추출물로부터 분획 과정을 1내지 · 5회， 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고， 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 따라서， 본 발명의 개산초 추출물은 위장관에서 pancreat i c l ipase 효소활성을 저해하여 식이를 통해 흡수된 중성지방의 가수분해를 억제하고， 장상피세포에서 DGAT효소 활성을 저해하여 중성지방의 재합성을 억제하였으며， 동물실험 결과， 위장관에서 지방의 흡수를 유의적으로 억제하여 혈중 중성지방의 상승을 억제함을 나타냄으로써, 개산초 분획물을 비만， 당뇨병, 고지혈증， 지방간 등의 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 이하， 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다. 단， 하기의 실시예， 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐， 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다. <실시예 1> 초 Zanthoxyl n planispinum) 추출물의 제조 <1-1> 개산초 메탄올 추출물의 제조
5 g의 건조된 개산초 (해외생물소재은행， 한국생명공학연구원)를 분쇄하고 메탄올 100 에 침지하여 2 일간 2회 추출하였다. 추출액을 여과하고， 감압 농축하여 메탄올 추출물 490 mg을 얻었다.
<1-2> 개산초 에탄을 추출물의 제조
5 g의 건조된 개산초를 분쇄하고 에탄올 100 ^에 침지하여 2 일간 2회 추출하였다. 추출액을 여과하고， 감압 농축하여 에탄올 추출물 403 mg을 얻었다.
<1-3> 개산초 물 추출물의 제조
5 g의 건조된 개산초를 분쇄하고 물 100 에 침지하여 2 일간 2회 추출하였다. 추출액을 여과하고， 감압 농축하여 물 추출물 750 mg을 얻었다.
<실험예 1> DGATKdiacylglycerol acyltransferase 1) 및 DGAT2 효소 활성저해도 실험
상기 <실시예 1〉에서 제조한 추출물에 의한 DGAT 효소 활성 저해 효과를 알아보기 위하여 , 효소원으로서 인간 DGAT1 또는 DGAT2를 각각 sf9 곤충세포에 과발현시켰다. 상기 sf9 곤충세포로부터 얻은 hDGATl 또는 hDGAT2 효소를 사용하여 DGAT의 효소활성 저해도 및 DGAT1 또는 DGAT2의 선택성을 조사하였다.
구체적으로， 인간 유래 DGAT의 효소저해 활성 측정을 위하여, 인간 hDGATl 또는 hDGAT2를 과발현시킨 sf9 곤충세포로부터 분리한 마이크로좀 단백질을 효소원으로 사용하였고， 콜만외 다수가 이용한 방법 ( CoJe/nan et al, Methods EnzymoL , 98-103 , 1992)에 따라 기질로서 1 , 2-디아실글리세를 (Sigma , DO 138) 및 [ 14C]올레오일-코에이 (Amersham , CFA583)를 사용하여 효소 반웅 후 생성된 [ 14C]트리아실글리세를의 방사능의 양올 측정하였다. 더욱 구체적으로， 반웅액 ( 175 mM Tr is-HCKpH 8.0) , 20 ^의 소의 혈청 알부민 ( 10 , 100 mM의 염화마그네슘 (4 mM MgCl2 : DGAT2효소활성 ) , 30 μΜ의
[14C]올레오일 코에이 (0.02 pCi， Amersham)및 200 μΜ 1， 2-디을레오일글리세를에 디메틸설폭사이드에 녹인 본 발명의 추출물 10.0 f 를 가하고, 분리한 마이크로좀 단백질을 30 ； «g(32 ^g: DGAT2효소활성)을 넣은 후 370C에서 10분간 반웅시킨 후, 1.5 m의 반웅 종결액 (2-프로판올:헵탄:물 = 80:20:2， v:v:v)을 가하여 반웅을 정지시켰다. 상기 반옹으로 생성된 [14C]트리아실글리세를을 추출하기 위하여， 1 의 헵탄 및 0.5 의 증류수를 가하여 진탕한 후 상등액 1 111«을 취하고 여기에 2 의 알칼리성 에탄올 용액 (에탄올: 0.5 N 소듐히드록시드:물 = 50: 10 : 40， v:v:v)을 가하여 진탕하였다. 상기 진탕액의 상층액 0.65 을 취하여 LSC( l iquid scint i l lat ion counter)로 방사능의 양을 측정하고 DGAT와 저해활성을 하기 수학식 1로 계산하였다.
【수학식 1】 저히 ί활성 -{(T-E c- ^ 1
T ： 효소 반웅액에 본 발명의 추출물을 넣은 시험군의 DPM 값，
C ： 효소 반웅액에 본 발명의 추출물을 넣지 않은 대조군의 DPM 값， 및
B ： 효소원을 넣지 않고 본 발명의 추출물을 넣은 대조군의 DPM 값. 상기 <실시예 1>에서 제조한 개산초의 메탄을, 에탄을 및 물 추출물을
30 및 100 ^의 농도로 처라하여 hDGATl 1 및 2의 효소 활성에 대한 저해능력을 측정하였고,특히 메탄을 추출물올 0.3， 1， 3， 10， 30및 100 /ig/m의 6개의 농도로 처리하여 50%의 저해활성을 나타내는 농도 ( IC50)를 구하였다. 상기 실험결과를 하기 [표 1] 및 [표 2]에 정리하여 나타냈다.
그 결과， [표 1] 및 도 1에 나타난 바와 같이, 개산초 추출물 (메탄올, 에탄을 및 물 추출물)의 hDGA l 대한 저해활성이 우수하게 나타났고, 그 중에서 메탄을 추출물이 가장 강한 저해활성을 나타냈으며， 에탄을 및 물 추출물 순으로、 나타났다. 또한， [표 2]에 나타낸 바와 같이 메탄올 추출물은 농도 -의존적으로 hDGAT 저해활성을 나타내었으며 50%의 저해활성을 나타내는 농도인 IC50는 DGAT1 및 DGAT2 각각에 대해 9.9와 5.0 ； «g/ ^로 매우 우수한 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다 (표 1， 표 2 및 도 1) .
【표 1】
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
【표 2】
Figure imgf000020_0003
<실험예 2> 개산초 메탄올 추출물의 세포내에서의 중성지방 생합성 저해 효과확인
<2-1> HepG2 세포내에서의 중성지방 생합성 저해 확인
본 발명의 개산초 추출물에 의한 세포내에서의 중성지방 합성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, HepG2 세포를 이용하여 1 종의 기질에 대한 중성지방 생합성 저해 활성을 측정하였다.
구체적으로， HepG2 세포를 ATCC에서 분양받았고， 2 mM L-글루타민이 포함된 최소필수배지 (Minimum essent ial medium(MEM) )； 1.5 g/L 탄산수소 나트롬 (sodium bicarbonate) , O.lmM불필수 아미노산 (nonessent ial amino acids) 및 1 mM 피루브산 나트륨 (sodium pyruvate)을 함유하도록 제조된 earle's BSS 배지 )에 10% 소태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)， 1% 항생제 (100 U/i 페니실린 (penicillin) 및 100 g/mi 스트렙토마이신 (streptomycin)을 첨가하여 37°C 및 5% C02 배양기에서 배양하였다. 세포내에서의 hGPATl 효소 활성은 배양된 HepG2 세포에서 생성된 중성지방의 양으로 측정하였다. 효소활성 저해 물질로서 본 발명의 개산초 메탄올 추출물을 각각 첨가한 후 중성지방 생성률의 감소를 효소 저해제의 효과로서 결정하였다. 24웰 (well)배양접시에 웰 당 1 xlO6 세포 의 세포수로 분주하여 24시간 동안 배양한 후 FBS가 존재하지 않는 DMEM(D becco's modified Eagle's medium) 배지로 교환하고 기질로서 [14C]글리세를 ([14C]glycerol)을 첨가시키고 18시간 동안 반웅시켰다. 상기 추출물은 디메틸설폭사이드 (dimethyl s//«oxide(DMS0))에 녹여 사용하였으며, 대조군에는 본 발명의 추출물을 넣지 않고 디메틸설폭사이드만으로 반웅을 시켰다. 대조군에서 생성된 중성지방의 생성률을 100으로 하였다.
반웅이 끝난 세포내에서 중성지방의 생성된 양을 측정하기 위하여， 세포로 흡수되지 않고 배지 중에 남아있는 기질인 [14C]글리세를을 제거하고 인산완충식염수 (PBS)로 1회 세척한 후 0.5 의 추출용매 (핵산 (hexane) ： 아이소프로판올 (isopropanol) = 3:2, v:v)를 첨가하여 중성지방을 포함한 전체 지방을 추출하였다. 상기 추출 용매로 30 분씩 2희 추출하였고, 얻어진 추출액 (1 )을 질소가스를 통해 농축하였다. 추출용매를 제거한 후 전체 지방을 유기용매 (클로로포름:메탄올 = 2:1)에 녹여 박층 크로마토그래피 (TLC: 실뫼카겔 (silica gel) 60F254, 두께: 0.5 mm, Merck)에 점적하여 전개용매 (핵산：디에틸에테르:아세틱에시드 = 80:20:1, v:v:v)상에서 전개하였다. TLC상에서 중성지방 (Rf값: 0.4)을 분리한 후 TLC판을 방사능 에너지를 감광할 수 있는 필름에 3시간 동안 감광한 후， 이미지 분석 (BAS-1500, Fuji Photo Film Co. Ltd.)을 통해 중성지방의 [14C] 방사능 양을 측정하였다. 추출 후 남아 있는 세포는 0. 1 N 수산화나토륨 0.3 m.e에 녹여 반응에 이용된 세포의 단백질 농도 측정에 이용하였다. 중성지방의 방사능 양을 측정하여 단백질 농도로 나눈 값을 실험값으로 하여 각 시험군 사이의 실험 오차를 보정하여, 본 발명의 개산초 추출물에 의한 중성지방의 생성를을 산출하였다. 그 결과, [표 3]및 도 2에 나타낸 바와 같이， HepG2세포에 개산초 추출물을 각각 1， 3， 10및 30 g/n^의 농도로 처리하고 [14C]글리세를을 기질로 사용했을 때， 세포내의 중성지방 생성를을 농도 -의존적으로 9%ᅳ 28% , 58%， 86%의 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다 (표 3 및 도 2) . <2-2> HuTu 80세포내에서의 중성지방 생합성 저해 확인
HuTu 80세포를 24-웰 배양접시에 2x l05 (eel l s/wel 1 )로 각각 분주하였다.
24시간 후에， FBS가 존재하지 않는 DMEM 배지로 교환하고 본 발명의 개산초 메탄올 추출물 및 기질을 동시에 처리하였다. 기질로서 0.5 MCi
[14C]올레이트를 각각 첨가하였고 2시간 동안 반웅시켰다. 반웅 후， 세포로 흡수되지 않거나 반웅에 사용되지 않은 기질을 PBS로 2회 세척한 후， 1 의 추출 용매 (n-핵산 /2-프로판을 =3/2 , v/v)를 첨가하여 중성지방을 포함한 전체 지방을 추출하였다. 얻어진 추출액은 질소가스를 이용하여 농축하였다. 추출용매를 제거한 전체 지방은 유기용매 (클로로포름 /메탄올 =2' I 1 , v/V)에 녹여， 박충 크로마토그래피 (TLC : s i l i ca gel 6(¾½4，0.5睡， Merck)에 점적한 후 전개용매 (n-핵산 /다이에틸 에테르 /아세트산 =80/20/1， v/v/v)상에서 전개하였다. 박충 크로마토그래피 (TLC) 상에서 중성지방 (R/값 ： 0.4)을 분리한 후， 방사선원소 에너지를 감광할 수 있는 필름 ( imaging plate's Fuj i f i lm ,
BAS-MS 2040)에 3시간 감광하고， 이미지 분석 (FLA 7000)을 수행하여 중성지방의 방사선량을 측정하였다.
추출 후 남아있는 세포를 0. 1N NaOH 0.3 에 녹여 반웅에 이용된 세포의 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 정량은 로우리법 (Lowry method)을 기초로 하는 바이오-래드사 (Bio-Rad)의 단백질 정량 키트를 사용하였다. 96-웰 등근 바닥 배양접시쎄 단백질을 분주한 후 1 의 단백질 분석 시약 (bi o-rad , alkal in copper tartrate solut ion)에 20 의 단백질 시약 S(bio-rad , surfactant solut i on)를 첨가한 혼합용액을 25 씩 웰에 분주하여 구리 이온과 단백질 사이의 반웅을 유도하였다. 반웅이 끝난 후， 시약 B(bio-rad, fol in reagent )를 각 웰에 200 ^씩 분주하여 폴린 시약 ( fol in reagent )을 이용한 환원 반웅을 진행시켰다. 단백질 양은 폴린 시약이 환원되면서 청색으로 발색되는 정도의 흡광도를 750 nm에서 측정하였고， BSA를 표준물질로 사용하여 표준곡선을 구하여 각 흡광도에 해당하는 단백질 농도를 정량하였다. 측정된 증성지방의 방사선량을 단백질 농도로 나눈 값을 실험값으로 사용하였다. 그 결과， 도 2 및 [표 3]에 나타낸 바와 같이, 인간 십이지장 선암 (duodenal adenocarcinoma) 세포인 HuTu 80에 개산초 메탄올 추출물을 각각 3， 10， 30 g/ 의 농도로 처리하고 [14C]올레이트를 기질로 사용하여 세포내에서의 중성지방 생합성 억제효과를 측정한 결과， 30 / Αιι의 농도에서 약 21%의 양호한 저해활성을 나타내는 것을 확인하였다 (도 2 및 표 3) .
따라서, 상기에서 알 수 있는 바와 같이， 개산초의 메탄을 추출물은 세포내의 DGAT를 저해함으로써 증성지방의 생합성을 농도 -의존적으로 억제하였다.
[표 3】
HepG2 세포 및 HuTu 80 세포내에서 개산초 추출물의 중성지방 생합성 저해 활성
Figure imgf000023_0001
<실험예 3> 개산초 메탄을 추출물의 pancreatic l ipase 저해활성 확인 본 발명의 개산초 메탄올 추출물의 pancreatic lipase 억제효과를 측정하기 위하여 4-methylumbelliferyl oleate (4-MU0) 시약을 이용하여 시험하였다.
구체적으로， DMS0에 녹인 시료 2.5 i 96 well plat에 분주한 후， 여기에 22.5 ^의. 증류수를 첨가하여 잘 흔합하여 주었다. 이 용액에 다시 D^becco' s phosphate buffered에 녹인 4-MU0 50 βί (0.5 mM)를 첨가한 후， pancreatic lipase (0.5 ^g/mi) 25 ^를 첨가하여 잘 흔합한 다음 10분 동안
37 °C에서 반웅시켰다. 각각의 반웅용액에 sodium citrate(pH 4.2) 100 을 분주하여 반웅을 정지시킨 다음, lipase에 의해 유리된 4_methyl lumbel 1 i ferone를 fluorescence microplate reader (FlexSt at ion 3, Molecular devices , USA)를 이용하여 여기파장 (exc it at i이 i wavelength) 350 nm, 방출파장 (emission wavelength) 460 nm에서 형광정도를 측정하였다.
그 결과， 도 3에 나타낸 바와 같이 시료를 10， 100， 300 /g/i 의 농도로 처리하였을 때 pancreatic lipase에 대한 농도 의존적인 저해활성을 나타냄으로써 식이를 통해 장으로 들어온 중성지방의 가수분해를 억제하여 혈중 중성지방 농도의 상승을 억제할 가능성을 보였다 (도 3).
<실험예 4> 개산초 메탄을 추출물의 마우스를 이용한 단회 경구투여 독성시험
본 발명의 개산초 메탄올 추출물의 급성독성 정보를 얻기 위한 목적으로 하기와 같은 실험을 수행하였다.
구체적으로, SPF(Specific Pathogens Free; 특정 병원체 부재) 상태의 6주령 암컷 ICR 마우스에 시험물질을 0.5 및 1 g/kg 으로 단회경구투여하여 14일간의 사망를， 일반증상, 체중， 부검소견을 관찰하였다.
그 결과， 시험한 결과는 하기와 같았다.
(1) 시험기간중 사망동물은 관찰되지 않았다. (2) 일반증상의' 경우, 모든 용량투여군에서 시험물질의 투여에 기인한 어떠한 이상증상도 관찰되지 않았다.
(3) 체중변화의 경우， 최고용량군 (1 g/kg)에서 투여 첫째날 유의한 체중 감소가 관찰되었으나 다음날부터 서서히 회복되었으며， 저용량군 (0.5 g/kg)에서는 시험기간동안 유의한 체중감소는 없었다.
(4) 부검소견의 경우， 시험물질의 투여에 기인한 어떠한 이상소견도 관찰되지 않았다.
따라서， 시험물질인 개산초 메탄올 추출물의 마우스에 대한 단회 경구투여는 0.5 및 1 g/kg 용량에서 사망률 일반증상， 체중 및 부검소견에 - 있어서 독성학적인 변화를 야기시키지 않았다.
<실험예 5> 개산초 메탄올추출물의 동물 지질 경구부하시험 (oral l ipid tolerance test(OLTD)
동물실험을 하기와 같이 실행하였다.
구체적으로， 8주령의 수컷 C57BL/6J마우스를 대한 바이오 링크로부터 구 입하여 청정 동물사육실 (온도 22 土 3°C , 습도 50 土 10 %, 조명 12시간 주기) 에서 1주일 동안 순화시킨 후 실험하기 하루 전에 16시간 동안 절식하여 실험 에 이용하였다. 실험에 사용한 사료는 방사선으로 멸균된 마우스용 고형사료 (Har lan, IN , USA)를 본 발명의 개산초 메탄을 추출물 투여 전에 16시간.동안의 절식 기간을 제외하고, 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였으며， 음용수는 고압멸 균기로 멸균시킨 후， 실험기간 전반에 걸쳐 항상 자유롭게 충분히 마실 수 있 도록 하였다.
C57BL/6J마우스를 용매대조군 또는 실험군으로 구분하여 각 5마리씩 배 정하였고, 본 발명의 개산초 메탄을 추출물을 하기와 같이 투여하였다. 정상대 조군에는 투여매체 (0.5% CMC ; carboxy methyl cel l ^ose)만을 투여하고, 실험군 에는 개산초 메탄올 추출물을 300 mg/kg 농도로 경구 투여하였다. 모든 실험군 동물에 대하여 본 발명의 개산초 메탄을 추출물을 투여하기 전 16시간 동안 절 식시킨 뒤 경구 투여용 존대를 사용하여 각각의 해당 추출물을 경구로 1회 투 여하였고， 60분 후 콘 오일을 6 mi/kg액량으로 경구 투여하였다. 콘 오일을 투 여하기 직전에 채혈 (0시간)하였으며， 콘 오일 투여 후시간별 (2시간 및 4시간) 로 후완와정맥동 (retro-orbital sinus)으로부터 헤파린 (heparin)이 처리된 모 세관 (capillary tube)을 이용하여 직접 혈액을 채취하였다. 이 후， 채취된 혈액 을 3,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈장을 분리한 후， 중성지방의 농도를 자동혈액화학분석기 (Hitachi 7150, Japan)로 직접 분석하였다. 상기 결과를 하 기 [표 4]에 나타냈다.
그 결과， [표 4] 및 도 4에 나타난 바와 같이， 본 발명에 따른 실시예 <1-1>에서 제조된 개산초 메탄올 추출물은 마우스에 100， 300， 500mg/kg의 용량 을 투여되었을 경우， 혈중 중성지방의 농도를 저하시키는 효과가 우수한 것을 확인하였다. 더욱 구체적으로， 용매대조군으로서 카르복실 메틸 셀를로오즈 (CMC: car boxy methyl cell ose)가 투여된 마우스는 고지방식이인 콘 오일을 투여하고 2시간이 경과한 경우, 투여 전과 대비하여 약 5.3배， 4시간이 경과한 경우에는 투여 전과 대비하여 약 2.1배로 중성지방의 농도가 증가한 것으로 확 인되었다. 반면， 본 발명에 따른 개산초 메탄올 추출물을 300 mg/kg 투여한 마 우스는 콘 오일올 투여하고 2시간이 경과한 경우， 투여 전과 대비하여 약 1.0 배, 4시간이 경과한 경우에는 약 0.97배로 용매대조군 대비 중성지방의 농도가 현저하게 감소함이 확인되었다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 개산초 추출 물은 위장관에서 pancreatic lipase를 억제하여 식이를 통해 섭취된 중성지방 의 가수분해를 저해하고 장피세포에서의 DGAT 효소활성의 저해를 통해 중성지 방의 재합성을 억제하여 위장관에서의 지방의 흡수를 억제함으로써 마우스의 혈중 중성지방의 농도를 억제하는 것을 확인하였다 (표 4).
【표 4】 개산초 메탄을 추출물의 동물 지질 경구부하시험
투여량 혈청 TG (mg/di)
(n=5)
(mg/kg) 0시간 2시간 4시간 용매대조군
0 40.7±6.0 213.4±105.2 83·3±22.4
(0.5% CMC) 메탄올
100 mg/kg 39.3 土 6.4 158.4 士 118.7 64.6 士 22.1 추출물
300 mg/kg 34.6±9.3 35.1土 18.4*** 33.6±15.4***
500 mg/kg 41.9 土 8.0 57.9± 17.8** 44.9±21.9**
Τ863υ 10 uM 32.6±8.1 30.1±7.7** 22.0±6.9*** 유효숫자 (t-테스트): * p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 (용매 대조군 대비)
1) T863:DGAT1선택적 저해제 (Caoet al.， J. Biol. Chem.48， 41838-41851, 2011)
<제조예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1>산제의 제조
실시예 <1-1>의 개산초 메탄올 추출물 0.1 g
유당 1.5 g - 탈크 0.5 g
상기의 성분들을 흔합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2>정제의 제조
실시예 <1-1>의 개산초 메탄올 추출물 0.1 g
락토오스 7.9 g
결정성 셀를로오스 1.5 g
마그네슘 스테아레이트 0.5 g
상기의 성분들을 흔합한 후 직타법 (direct tablet ing method)으로 정제를 제조하였다.
<1-3>캡슐제의 제조
실시예 <1-1>의 개산초 메탄을 추출물 0.1 g 옥수수전분 5.0 g 카르복시 셀를로오스 4.9 g 상기의 성분들을 흔합하여 분말을 제조한 후， 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 층전하여 캡슐제를 제조하였다.
<1-4>주사제의 제조
실시예 <1-1>의 개산초 메탄올 추출물 0. 1 g 주사용 멸균 증류수 적량 pH 조절제 적량 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 (2 mi )상기의 성분 함량으로 제조하였다.
<1-5> 액제의 제조
실시예 <1-1>의 개산초 메탄올 추출물 0. 1 g 이성화당 10.0 g 만니를 5.0 g 정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고， 적량의 레몬향을 첨가한 후 상기의 성분을 흔합하였다. 상기 흔합물에 정제수를 첨가하여 전체를 100으로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
<제조예 2>건강식품의 제조
<2-1>밀가루 식품의 제조
상기 실시예 <1-2>의 개산초 에탄올 추출물의 0.5 내지 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고， 상기 흔합물올 이용하여 빵， 케이크， 쿠키， 크래커 및 면류를 제조하였다. <2-2>스프 및 육즙 (gravies)의 제조
상기 실시예 <1ᅳ2〉의 개산초 에탄올 추출물의 0. 1 내지 5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품 면류의 수프 및 육즙올 제조하였다.
<2-3>그라운드 비프 (ground beef)의 제조
상기 실시예 <1-2>의 개산초 에탄올 추출물의 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다. <2-4>유제품 (dairy products)의 제조
상기 실시예 <1-2>의 개산초 에탄을 추출물 5 내지 10 중량부를 우유에 첨가하고， 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다. <2-5>선식의 제조
현미， 보리， 참쌀， 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 검정콩, 검정깨， 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다. 상기 실시예 <1-2>의 개산초 에탄올 추출물올 진공 농축기에서 감압농축하고， 분무， 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다. 상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 상기 실시예 <1-3>의 개산초 에탄올 추출물을 하기의 비율로 배합하여 제조하였다:
곡물류 (현미 30 중량부， 율무 15 중량부， 보리 20 중량부)，
종실류 (들깨 7 중량부， 검정콩 8 중량부， 검정깨 7 중량부)，
상기 실시예 <1ᅳ2〉의 개산초 에탄을 추출물 (3 중량부) ,
영지 (0. 5 중량부)， 및
지황 (0.5 중량부) . <2~6>건강보조식품의 제조
실시예 <1-3〉의 개산초 물 추출물
비타민 흔합물
비타민 A 아세테이트
비타민 E
비타민 B1
비타민 B2
비타민 B6
비타민 B12
비타민 C
비오틴
니코틴산아미드
엽산
판토텐산 칼슘
무기질 흔합물
황산제 1철
산화아연
탄산마그네슘
제 1인산칼륨
제 2인산칼슘
구연산칼륨
탄산칼슘
염화마그네슘
상기의 비타민 및 미네랄 흔합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 흔합 조성하였지만 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며， 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 후， 과립을 제조하고， 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
<제조예 3>건강음료의 제조
실시예 <1-3>의 개산초 물 추출물 100 mg
구연산 100 mg
올리고당 100 mg
매실농축액 2 mg
타우린 100 nig
정제수를 가하여 전체 500 mi 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 흔합한 후， 약 1시간 동안 85°C에서 교반 가열한 후， 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 1 f 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 후， 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합조성하였지만，수요계층，수요국가，사용 용도 등 지역적，민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR

Claims

【청구의 범위】
【청구항 11
7 초 Zanthoxyhm] planispinum) 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 2]
제 1항에 있어서 , 상기 개산초 추출물은 물, 내지 C2저급 알코을 또는 이들의 흔합물로 추출되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용
정정용지 (규칙 제 91조) ISA/KR 약학적 조성물.
【청구항 3]
제 2항에 있어서， 상기 저급 알코올은 에탄을 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 4】
제 1항에 있어서, 상기 대사성 질환은 비만， 제 2형 당뇨， 이상지질혈증， 인슐린저항성， 이상지질혈증, 간지방증 (hepat ic steatosis) 및 비알콜성 지방간 (fatty l iver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 5]
제 1항에 있어서， 상기 개산초 추출물은 디아실글리세를 아실트랜스퍼라제 (diacylglycerol acyltransferase(DGAT) ) 효소 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
【청구항 6]
개산초 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품.
【청구항 7】
제 6항에 있어서， 상기 대사성 질환은 비만， 제 2형 당뇨, 이상지질혈증, 인술린저항성， 이상지질혈증, 간지방증 (hepat i c steatosis) 및 비알콜성 지방간 (fatty l iver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품.
【청구항 8】
정정용지 (규칙제 91조) ISA/KR 제 6항에 있어서，■ 상기 개산초 추출물은 디아실글리세를 아실트랜스퍼라제 효소 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품.
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