WO2015128448A1 - Lasermikrodissektionssystem und lasermikrodissektionsverfahren - Google Patents

Lasermikrodissektionssystem und lasermikrodissektionsverfahren Download PDF

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WO2015128448A1
WO2015128448A1 PCT/EP2015/054103 EP2015054103W WO2015128448A1 WO 2015128448 A1 WO2015128448 A1 WO 2015128448A1 EP 2015054103 W EP2015054103 W EP 2015054103W WO 2015128448 A1 WO2015128448 A1 WO 2015128448A1
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laser
sample
laser beam
webs
cutting line
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Falk Schlaudraff
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Leica Microsystems CMS GmbH
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    • G01N2001/2833—Collecting samples on a sticky, tacky, adhesive surface
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    • G01N2001/2873—Cutting or cleaving
    • G01N2001/2886—Laser cutting, e.g. tissue catapult

Definitions

  • the present invention relates to a laser microdissection system and a
  • a dissectate can be isolated from a sample by means of an infrared or ultraviolet laser beam, which falls under the influence of gravity into a suitable dissektate collecting container.
  • the dissectate can be cut out of the sample also together with a membrane attached to the sample.
  • a thermoplastic membrane is heated by means of a corresponding laser beam. The membrane fuses with the desired area of the sample and can be removed by tearing in a subsequent step.
  • Another alternative is to attach the dissectate by means of the laser beam to a lid of a Dissektatauffang practicers.
  • upwardly transported dissectates may also be attached to the bottom of a dissectate collection container provided with an adhesive coating.
  • pulsed lasers are generally used, a hole or depression being produced in the sample by each laser pulse.
  • a cutting line is formed by a juxtaposition of such holes or depressions, optionally with
  • the laser microdissection can be used to obtain single cells or defined areas of tissue, which are separated by a laser beam from the surrounding tissue and subsequently subjected to different diagnostic analysis methods, for example.
  • laser microdissection can be used to specifically isolate tumor cells from a microscopic section and to examine specific metabolites or proteins.
  • the laser microdissection can also be used for the manipulation of single cells or defined tissue areas.
  • the laser microdissection can also be used for the manipulation of single cells or defined tissue areas.
  • a method for laser microdissection is known in which a sample region of interest is to be cut out along a cutting line, wherein the cutting line is interrupted by at least two webs. Subsequently, the sample area of interest is torn off with a single laser pulse directed at the sample area, whereby the sample area is separated from the sample. For this last step, the laser beam is widened or defocused to distribute its energy over a larger area.
  • the proposed method is intended to solve the problem typical of this type of laser microdissection, that when cutting a sample area with a closed cutting line shortly before closing the cutting line, only a narrow web remains, which is connected to the surrounding sample. Due to electrical charge or mechanical stress in the web, there is often a folding away of the previously cut sample area, so that the remaining narrow web is often no longer in the focal plane of the laser beam.
  • this method may also have disadvantages, for example, if the energy of the expanded laser beam is insufficient to cut through all the remaining webs at the same time, or if the energy of the expanded laser beam must be increased to sever all the webs in such a way that a risk of damage to the To be separated sample area occurs.
  • Object of the present invention is therefore to make the process of laser microdissection more reliable, in particular without the disadvantages mentioned.
  • the present invention proposes
  • the present invention is based on a known per se
  • a laser microdissection system comprising a microscope, comprising a receiving device for receiving a biological sample and a Auflicht align with a
  • a laser deflection device which a provided by a laser unit laser beam through a microscope objective of the microscope on a sample area of the biological sample and which shifts a point of impact of the laser beam on the sample area.
  • the laser beam from a laser light source is coupled into the observation beam path of the microscope in such a laser microdissection system.
  • the laser beam is focused through the microscope objective, which is also used to view the sample.
  • the beam path of the laser beam of the laser unit passes through the incident light device and through the microscope objective and intersects an object plane of the microscope objective at an adjustable one
  • the laser microdissection system used in the context of the present invention is used with samples that have already been prepared for microscopy. These may be, for example, tissue thin sections which have been separated out of a larger tissue block by means of a microtome, but in the present case also thicker sections from a corresponding tissue block. Such a tissue block may be, for example, a fixed organ or a biopsy of a corresponding organ.
  • the laser microdissection system is not used to obtain samples but to process them and to isolate certain areas thereof. It is understood that the present invention may also be used with samples that are not obtained by means of a microtome, e.g. with smears, macerates, etc. As mentioned, however, the invention is also suitable for processing thicker samples which have not been prepared by means of a microtome.
  • Microtomes are used exclusively in the preparation of microscopic samples. Microtomes can also have lasers for this purpose.
  • Microtomed sections are applied to a slide as mentioned above, optionally attached there, stained, etc. Only then are they available for use in the laser microdissection system.
  • a microtome differs fundamentally from a laser microdissection system in its operation in that it cuts with as homogeneous a shape as possible
  • Microtomes are therefore designed to be a large To produce a number of identical cuts with parallel cut surfaces,
  • laser microdissection systems are designed to separate dissectates according to sample-dependent criteria, for example according to visual morphological criteria.
  • the laser microdissection system is used in particular for separating out sample particles, which are subsequently taken up in a suspending fluid. The person skilled in the art would therefore not transfer technical solutions used in microtomes to such laser microdissection systems due to the completely different objectives.
  • a sample area along a cutting line is completely severed and thus detached from the surrounding sample.
  • a dissectate obtained by laser microdissection always represents a "bulk sample area" throughout the entire thickness of the processed sample; a differentiation into individual tissue layers by means of
  • Laser microdissection is not possible or can only be done indirectly over the thickness of the sample area.
  • the microscope stage is in laser microdissection systems with a
  • Laser deflecting device during processing of the sample relative to the microscope objective with respect to the x and y direction (that is, perpendicular to the optical axis of the microscope objective) fixedly arranged.
  • Dissecting process motorized microscope stage which must have a high positioning accuracy, especially for strongly magnifying lenses, to allow precise cuts, turn out to be
  • Laser microdissection systems with a laser deflector are simpler and less expensive to manufacture and have precision advantages.
  • the laser deflection device has two thick glass wedge plates ("glass wedges") which are inclined relative to an optical axis and can rotate independently about an optical axis and which generate a beam deflection by their wedge angles
  • the resulting deflection angle of the laser beam with respect to the optical axis is variable.
  • the Laser beam through the thickness and the inclination of the glass wedge plates on a lateral beam offset from the optical axis and applies to all
  • Such a laser deflection device is therefore particularly advantageous over other laser deflection devices such as mirror scanners,
  • Galvanometercannern or stepper motor scanners because this does not have to be arranged in a conjugate to the lens pupil plane. Thus, no so-called pupil imaging is required in order to achieve that the deflected beam hits the objective pupil. In the case of laser microdissection with UV laser light, for example, a UV-compatible pupil image would be required. Further advantages of such a laser deflection device with wedge plates are mentioned, for example, in EP 1 276 586 B1.
  • a focused laser beam is guided along at least part of a cutting line surrounding the sample region, whereby the sample region is separated from the surrounding sample, and at least two webs remain before detachment of the sample region connect the sample area to the surrounding sample.
  • at least one further laser beam focused on the cutting line is provided, and each of the at least two remaining webs is passed through one of each
  • the two or more remaining webs are cut in parallel and in particular simultaneously by means of two or more laser beams. In this way, it can be reliably ensured that all remaining webs are cut through at the same time by means of laser beams focused on these webs, so that the sample area reliably detaches from the surrounding sample and can be further processed as a dissectate.
  • the speed of the sample cutting can be further increased if one of the at least one further laser beam is guided along a previously assigned part of the cutting line before the webs are severed.
  • a laser beam may be a part the cutting line and the other laser beam intersect the other part of the cutting line with the exception of the remaining webs, in which case the two remaining webs are then severed by a laser beam.
  • the at least two remaining webs are selected such that they are equally distributed along the cutting line. In this way, a high stability of connected by the webs with the surrounding sample
  • Centroid of the sample area runs.
  • a pair of webs may each be selected such that the imaginary connecting line between the two webs of this pair extends through the centroid of the sample area. In this way, a particularly high stability of the connected via the webs with the surrounding sample
  • the at least two remaining webs should have the same length in the cut line direction. This simplifies, in particular, the subsequent severing of these webs with the respective laser beams, since their parameters for the severing can be set substantially the same. Parameters include laser energy, laser aperture and laser focus.
  • a simplification of the transection of the remaining webs can be achieved by placing one, several or all of the webs in straight sections of the cutting line.
  • the term "straight section” is understood to mean sections of the section line which show a relatively small curvature in comparison with the remaining sections of this section line.
  • the laser microdissection system according to the invention has a microscope which has a receiving device for receiving a biological sample and a
  • Incident light device having a laser deflection device which guides a laser beam provided by a laser unit through a microscope objective of the microscope on a sample area of this biological sample surrounding cutting line and focused there and shifts the point of incidence of the laser beam along this section line.
  • This laser microdissection system additionally has at least one further laser deflection device, which is set up in such a way that it is at least another laser beam on at least a portion of the cutting line leads and focused.
  • Such a laser microdissection system is designed in particular for carrying out the laser microdissection method according to the invention.
  • Said (at least one) further laser deflection device is set up in such a way that it guides the (at least one) further laser beam onto at least one part of the cutting line and focuses it there. This makes it possible to part of the
  • Cut cutting line of another laser may form such part of the cutting line.
  • Laser deflection device is also designed to move the point of impact of the at least one further laser beam along at least part of the cutting line.
  • the cutting line of two or more lasers can be processed in parallel and in particular simultaneously. This saves a tremendous amount of time when cutting sample areas from a sample.
  • Laser beams may be generated by additional laser units and / or by one or more beam splitter assemblies which split an existing laser beam into two or more beams.
  • the at least one further laser deflection device is assigned a further laser unit which provides one of the at least one laser beam.
  • at least one further laser deflection device with at least one further laser unit is present. This is particularly useful if the full laser power is required for example for laser cutting for each laser beam.
  • Beam splitting multiple laser beams are generated.
  • a further laser unit can be followed by a beam splitter arrangement, which in turn transmits at least one further laser beam from the further laser beam provided by this further laser unit
  • the aforementioned laser deflection devices can guide the respective laser beams in different ways to a sample.
  • Laser deflecting device and at least one of (at least one) furthermore
  • Laser deflection devices set up so that of these
  • Laser deflectors deflected laser beams are passed through the microscope objective of the microscope of the laser microdissection system according to the invention.
  • one, several or all of the further laser beams can each have a laser focusing lens which guides the respective further laser beam onto the sample.
  • one of the at least one further laser deflection device is set up in such a way that it deflects the laser beam deflected by it through a laser beam
  • Laser microdissection system at least one further laser focusing lens
  • Laserfokussierlinse represents another microscope objective of another microscope.
  • the laser microdissection system according to the invention thus comprises several microscopes for the parallel processing of a sample area.
  • the invention further relates to a use of an inventive
  • a sample area is separated from the surrounding sample by displacement of the point of incidence of the laser beam along the section line surrounding the sample area, wherein at least two bars which connect the sample area to the surrounding sample remain before detachment of the sample area.
  • the laser deflection devices guide and focus the respectively associated laser beams on the at least two remaining webs, so that each of these webs is severed by one of the laser beams.
  • At least one of the further laser beams can be displaced by means of its associated laser deflection device with its impact point along an associated part of the cutting line before the webs are severed.
  • Figure 1 shows a laser microdissection system, which is preferably the starting point of the present invention, in a schematic representation.
  • FIG. 2 shows schematically a sample area of a sample surrounded by a cut line (FIG. 2A) and the corresponding sample area after cutting with two opposing webs in a first case (FIG. 2B) and in a second case (FIG. 2C),
  • FIGS. 2D to 2F represent the perspective side views of the plan views of Figures 2A to 2C.
  • FIG. 3 shows schematically a possibility according to the invention of the parallel
  • FIG. 4 shows schematically another possibility according to the invention of parallel cutting of a sample area on a sample.
  • FIG. 5 schematically shows a further possibility according to the invention for parallel cutting of a sample area on a sample.
  • Figure 6 shows schematically a possibility of providing further laser beams by further laser units.
  • Figure 7 shows schematically the provision of further laser beams by means of a beam splitter arrangement
  • FIG. 8 schematically shows a combination possibility from the examples of FIGS. 6 and 7.
  • corresponding elements are given identical reference numerals and will not be explained repeatedly.
  • FIG. 1 a laser microdissection system that can be used to practice the invention is shown schematically and designated 100 as a whole.
  • the laser microdissection system 100 corresponds in substantial parts to that disclosed in EP 1 276 586 B1, to which reference is expressly made.
  • Directions x, y and z are illustrated in FIG. 1 as 200.
  • the laser microdissection system 100 includes a microscope 10. In one
  • Lighting device 12 may be provided. This can, for example, a (not shown) light source and suitable means for influencing the by the
  • illumination light such as filters and / or aperture.
  • condenser unit 90 can be provided for transmitted light illumination and for setting suitable contrast or observation methods.
  • the microscope 10 may be designed as a confocal, in particular as a spinning disk microscope and in this case has corresponding further or alternative means (not shown in Figure 1).
  • a user input and / or user information unit 13 may be arranged, which may be formed for example as a touch screen, and via which the user can input and / or read, for example, viewing and / or processing parameters.
  • a drive knob 14 is provided. This serves to operate a coarse and a fine drive for adjusting a height of a microscope stage 30.
  • a sample 51 for example a tissue sample attached in a corresponding receiving device or holder 52, can thereby be brought into an object plane of an objective 41.
  • the lens 41 is next to other lenses 42 in one
  • a protective cover 15 may be provided.
  • Auskoppel painen 61 may be a preferably variable portion of
  • Observation light can be coupled into a digital image acquisition unit 63 and detected by imaging.
  • the image acquisition unit 63 can be assigned, locally, in a control unit 82 or a control computer 81 (see below), or in another spatial arrangement, an image evaluation module 64.
  • the necessary connections to the control computer are designated 83.
  • the laser microdissection system 100 has a laser unit 70 with a
  • Laser light source 75 on. A through the laser light source 75, in which it is
  • laser beam 77 with laser beam axis b is deflected in a reflected light unit, which is indicated here at 76 in total, at a first deflecting mirror 71 and a second deflecting mirror 72 and focused by the lens 41 on the sample 51.
  • the location at which the laser beam 77 impinges on the sample 51 in the object plane, and thus also in the sample area, can basically be set in different ways.
  • a manual adjusting device 31 may be provided by means of which the microscope stage 30 designed as a cross table can be adjusted in the x and y directions (that is to say, perpendicularly or parallel to the plane of the paper).
  • electromechanical adjusting means may be provided which can be controlled for example by a control unit 82 and whose position can be detected by the control unit 82.
  • the control unit 82 may also be any other motorized functions of the
  • Laser microdissection system 100 and in particular provide an interface to an external control computer 81, which may be connected via corresponding connections 83 provide.
  • the control unit 82 or the control computer 81 can also evaluate data obtained, for example, by the image evaluation module 64. By way of example, a sequence of tissue layers or other structures of the sample 51 can thereby be recognized.
  • a laser deflection device 73 can be provided.
  • the laser deflection device 73 By means of the laser deflection device 73, the laser beam 77 with respect to one between the first deflection mirror 71 and the second
  • Deflection mirror 72 extending optical axis c are deflected.
  • the laser beam can therefore impinge at different positions on the second deflection mirror 72, which may be formed, for example, as a dichromatic divider, and is thus also focused at different positions on the sample 51 in the object plane.
  • a deflection by means of a laser deflection device 73 is shown in detail in EP 1 276 586 B1. It should be emphasized that here different possibilities for the deflection of a laser beam 77 and for positioning the sample 51 in the
  • Object level opposite the laser beam 77 can be used.
  • the invention is not limited to the illustrated example.
  • the laser deflection device 73 has two solid glass wedge plates 731 which are inclined and independent relative to the optical axis c
  • the wedge plates 731 are mounted with ball bearings 732.
  • Each of the wedge plates is connected to a gear 733.
  • the gears 733 can each be rotated by means of actuators 734, which can be acted upon by corresponding drive signals and accordingly drive the gears 733.
  • the rotators may have position sensors 735 (shown here only on the right actuator 734). A position detected by the position sensors 735 may be transmitted to the control unit 82.
  • Figure 2 shows schematically the case of cutting by means of a
  • Laser microdissection system 100 of Figure 1 a sample 51 visualized.
  • a region of interest 510 of interest may be made visible by staining, for example.
  • This sample area 510 is to be made available as a dissectate for further analysis.
  • the sample area 510 is surrounded by a cutting line 550.
  • this cutting line 550 surrounds the object contour of the individual cut line
  • Sample area 510 be spaced by a certain delta in order not to destroy the sample area 510 in the edge region due to the finite diameter of the laser focus during cutting.
  • FIG. 2A shows the top view of the sample area 510
  • FIG. 2D shows a perspective side view of the situation from FIG. 2A.
  • FIG. 2B shows a first case in which two webs 560 remain, via which the sample area 510 is connected to the surrounding sample 51.
  • FIG. 2E shows a corresponding perspective side view. It can be seen from this that the portions of the sample area 510 detached from the sample 51 remain in the plane of the sample 51. This represents the optimal case.
  • the two webs 560 can then be severed simultaneously in parallel by one laser beam focused on the respective web 560. In this way, it is ensured that the sample area 510 cleanly dissolves from the surrounding sample 51 and into a
  • the center of gravity of the sample area 510 runs, wherein all four bars should be distributed as equally as possible over the section line 550.
  • Figure 3 shows schematically a possibility of parallel cutting a
  • a laser beam 77 focused on a sample 51 by means of a microscope objective 41.
  • the position of the focus of the laser beam 77 on the sample 51 is controlled by means of a laser deflection device 73, as already explained with reference to FIG.
  • the same sample area 510 of the sample 51 can be processed by both laser beams 77 and 77' parallel and in particular simultaneously cut the sample area 510 along the cutting line 550 (see Figure 2). In this way, the speed of dissecting can be increased.
  • FIG 4 shows schematically a possibility according to the invention for parallel
  • the embodiment according to Figure 4 is to be understood as a further embodiment of the parallel processing of a sample region 510 on a sample 51 (see Figure 3).
  • FIG. 5 shows a further embodiment of the arrangement according to FIG. 4.
  • an additional third laser beam 77 " is provided, which in the illustration according to FIG. 5 is directed to the underside of the sample 51, while the two laser beams 77, 77 'are placed on the upper side thereof Sample 51.
  • the device shown in FIG. 5 is again suitable for cutting a single sample area 510 on the sample 51. For this purpose, reference is made to the explanations in connection with FIG.
  • the laser beam 77 ' can be guided from above onto the cutting line 550 (see Fig. 2) while the laser beam 77' 'is from below the same cutting line 550 is guided so that the cutting line 550 is cut from two sides. In this way, a thicker sample area can be cut more gently than if with a single
  • FIGS. 4 and 5 further emphasize that the one shown there
  • Laser focusing lenses can be achieved.
  • a corresponding angle of incidence of the laser beam on the sample as explained with reference to Figures 1 and 3, also and preferably with lenses or Laserfokussierlinsen be achieved whose optical axes are perpendicular to the sample, the inclinations of the laser axes then alone by the associated laser deflection be effected.
  • the inclinations of the axes in Figures 4 and 5 thus serve for ease of understanding.
  • FIG. 6 shows schematically a possibility of providing further laser beams by further laser units.
  • two laser units 70 and 70 ' are present in a laser microdissection system 100 (see FIG.
  • FIG. 7 shows schematically the provision of further laser beams by means of a beam splitter arrangement.
  • the laser unit 70 generates a laser beam, which is a
  • Beam splitter arrangement 78 passes through.
  • the laser beam is divided into two beams, wherein one of the two beams is denoted by 77.
  • the other of the two divided beams is denoted by 77 '.
  • two laser beams 77, 77 ' are generated, whose intensity is correspondingly lower than that of the original laser beam 77.
  • the laser beam 77' on a Deflecting mirror 74 is reflected and supplied to a laser deflecting device 73 'associated with it.
  • the embodiment according to FIG. 6 is particularly useful for cutting processes in which the full laser intensity is required, the embodiment according to FIG. 7 is advantageous for processes for which part of the original laser power is sufficient.
  • FIG. 8 shows a possible combination of the embodiments of FIGS. 6 and 7.
  • the laser beam 77 generated by the laser unit 70 is fed to a laser deflection device 73.
  • Another laser beam is generated by a further laser unit 70 '.
  • This further laser beam is split into two laser beams, wherein in turn one of the two split laser beams is to be designated 77 ', the other 77 "The splitting is again effected in a beam splitter arrangement 78'
  • the partial beams 77 'and 77 are then respectively corresponding laser deflection devices 73 'and 73 "supplied, wherein for the laser beam 77" turn a deflection mirror 74 can be used.
  • An arrangement such as shown in Figure 8 can be used, for example, for parallel cutting of thick samples (with laser beam 77) and thin samples (with laser beams 77 'and 77 ”) from Figures 6 to 8 further combination options.

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Abstract

Lasermikrodissektionsverfahren zum Gewinnen eines Probenbereichs (510) aus einer biologischen Probe (51), bei dem ein fokussierter Laserstrahl (77) entlang zumindest eines Teils einer den Probenbereich (510) umgebenden Schnittlinie (550) geführt wird, wodurch der Probenbereich (510) von der umgebenden Probe (51) getrennt wird, und wobei vor einem Ablösen des Probenbereichs (510) mindestens zwei Stege (560) verbleiben, die den Probenbereich (510) mit der umgebenden Probe (51) verbinden, wobei mindestens ein weiterer auf die Schnittlinie fokussierter Laserstrahl (77', 77") bereitgestellt wird, und dass jeder der mindestens zwei verbleibenden Stege (560) durch jeweils einen der Laserstrahlen (77, 77', 77") durchtrennt wird.

Description

Lasermikrodissektionssystem und Lasermikrodissektionsverfahren
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Lasermikrodissektionssystem und ein
Lasermikrodissektionsverfahren gemäß den jeweiligen Oberbegriffen der
unabhängigen Patentansprüche sowie eine Verwendung des beanspruchten
Lasermikrodissektionssystems.
Stand der Technik
Verfahren zur Bearbeitung biologischer Proben durch Lasermikrodissektion existieren bereits seit Mitte der 1970er Jahre und wurden seitdem kontinuierlich weiterentwickelt. Bei der Lasermikrodissektion können Zellen, Geweberegionen usw. aus einer biologischen Probe ("Objekt") isoliert und als sogenannte Dissektate gewonnen werden. Ein besonderer Vorteil der Lasermikrodissektion ist der kurze Kontakt der Probe mit dem Laserstrahl, durch den diese kaum verändert wird. Die Gewinnung der Dissektate kann auf unterschiedliche Weise erfolgen.
Beispielsweise kann in bekannten Verfahren aus einer Probe mittels eines Infrarotoder Ultraviolettlaserstrahls ein Dissektat isoliert werden, das unter dem Einfluss der Schwerkraft in einen geeigneten Dissektatauffangbehälter fällt. Das Dissektat kann dabei aus der Probe auch zusammen mit einer an der Probe anheftenden Membran ausgeschnitten werden. Bei der sogenannten "Laser Capture Microdissection" wird hingegen eine thermoplastische Membran mittels eines entsprechenden Laserstrahls erwärmt. Dabei verschmilzt die Membran mit dem gewünschten Bereich der Probe und kann in einem darauffolgenden Schritt durch Reißen entfernt werden. Eine weitere Alternative besteht darin, das Dissektat mittels des Laserstrahls an einen Deckel eines Dissektatauffangbehälters anzuheften. Bei bekannten inversen Mikroskopsystemen zur Lasermikrodissektion können nach oben transportierte Dissektate auch an den Boden eines Dissektatauffangbehälters, der mit einer adhäsiven Beschichtung versehen ist, angeheftet werden.
Bekannte Mikroskopsysteme zur Lasermikrodissektion weisen eine Auflichteinrichtung auf, in deren Strahlengang ein Laserstrahl eingekoppelt wird. Der Laserstrahl wird durch das jeweils verwendete Mikroskopobjektiv auf die Probe fokussiert, die auf einem motorisch-automatisch verfahrbaren Mikroskoptisch aufliegt. Eine Schnittlinie kann dadurch erzeugt werden, dass der Mikroskoptisch beim Schneiden verfahren wird, um die Probe relativ zu dem feststehenden Laserstrahl zu bewegen. Dies hat jedoch unter Anderem den Nachteil, dass die Probe während des Erzeugens der Schnittlinie nicht ohne weiteres betrachtet werden kann, da sich die Probe im
Gesichtsfeld bewegt und das Bild ohne weitere Kompensationsmaßnahmen verschwommen bzw. verschmiert erscheint.
Vorteilhafter sind daher Lasermikrodissektionssysteme, die Laserablenk- bzw.
Laserscaneinrichtungen aufweisen, die dazu eingerichtet sind, den Laserstrahl bzw. dessen Auftreffpunkt auf der zu dissektierenden feststehenden Probe zu bewegen. Derartige Lasermikrodissektionssysteme, die auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung zum Einsatz kommen sollen und dort besondere Vorteile bieten, werden unten im Detail erläutert. Ein besonders vorteilhaftes Lasermikroskopsystem das eine Laserablenkeinrichtung mit gegeneinander verstellbaren Glaskeilen im
Laserstrahlengang aufweist, ist beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 beschrieben.
In beiden Fällen, also in Systemen mit bewegter oder feststehender Probe, wird in der Regel mit gepulsten Lasern gearbeitet, wobei durch jeden Laserpuls ein Loch bzw. eine Vertiefung in der Probe erzeugt wird. Eine Schnittlinie entsteht durch eine Aneinanderreihung derartiger Löcher bzw. Vertiefungen, gegebenenfalls mit
Überlappung.
Die Lasermikrodissektion kann zur Gewinnung von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen verwendet werden, die mit einem Laserstrahl vom umliegenden Gewebe separiert und anschließend beispielsweise unterschiedlichen diagnostischen Analyse verfahren unterworfen werden. In der Onkologie kann die Lasermikrodissektion beispielsweise dafür eingesetzt werden, um spezifisch Tumorzellen aus einem mikroskopischen Schnitt zu isolieren und auf spezifische Metaboliten oder Proteine zu untersuchen.
Weiterhin kann die Lasermikrodissektion auch zur Manipulation von Einzelzellen oder definierten Gewebebereichen eingesetzt werden. Hier ist beispielsweise an eine Fluoreszenzanregung zu denken oder an die Verwendung als optische Pinzette.
Aus der DE 100 43 504 A1 ist ein Verfahren zur Lasermikrodissektion bekannt, bei dem ein interessierender Probenbereich entlang einer Schnittlinie ausgeschnitten werden soll, wobei die Schnittlinie von mindestens zwei Stegen unterbrochen ist. Anschließend wird der interessierende Probenbereich mit einem einzigen, auf dem Probenbereich gerichteten Laserimpuls abgerissen, wodurch der Probenbereich von der Probe getrennt wird. Für diesen letzten Schritt wird der Laserstrahl aufgeweitet bzw. defokussiert, um seine Energie auf eine größere Fläche zu verteilen. Das vorgeschlagene Verfahren soll das bei dieser Art der Lasermikrodissektion typische Problem lösen, dass beim Schneiden eines Probenbereichs mit geschlossener Schnittlinie kurz vor Schließen der Schnittlinie nur noch ein schmaler Steg verbleibt, der mit der umgebenden Probe verbunden ist. Bedingt durch elektrische Aufladung oder durch mechanische Spannung im Steg kommt es häufig zu einem Wegklappen des bisher ausgeschnittenen Probenbereichs, so dass der verbleibende schmale Steg häufig nicht mehr in der Fokusebene des Laserstrahls liegt. Eine saubere
Fertigstellung des Schnitts ist dann nicht möglich. Häufig kann auch ein Teil des umgeklappten Probenbereichs den verbleibenden Steg überlappen, so dass dieser Probenbereich beim weiteren Schneiden beschädigt würde. Auch ein Ablösen des ausgeschnittenen Probenbereichs mittels des Laserimpulses ist erschwert oder sogar unmöglich, da keine ausreichende Angriffsfläche für den Laserschuss vorhanden ist. Dieses Problem löst die genannte DE 100 43 504 A1 durch die oben erläuterte Methode, bei der mindestens zwei, die Schnittlinie unterbrechende Stege in der
Schnittlinie verbleiben. Auch dieses Verfahren kann allerdings Nachteile aufweisen, beispielsweise, wenn die Energie des aufgeweiteten Laserstrahls nicht ausreicht, alle verbliebenen Stege gleichzeitig zu durchtrennen, oder wenn zum Durchtrennen aller Stege die Energie des aufgeweiteten Laserstrahls in einer Weise erhöht werden muss, dass eine Gefahr der Schädigung des abzutrennenden Probenbereichs eintritt.
Aufgabe vorliegender Erfindung ist es daher, den Prozess der Lasermikrodissektion zuverässiger, insbesondere ohne die genannten Nachteile, zu gestalten.
Offenbarung der Erfindung
Zur Lösung der genannten Aufgabe schlägt die vorliegende Erfindung ein
Lasermikrodissektionssystem, Verwendungen dieses Systems sowie ein Verfahren zur Lasermikrodissektion gemäß den unabhängigen Patentansprüchen vor.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind Gegenstand der jeweiligen Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Die vorliegende Erfindung geht aus von einem an sich bekannten
Lasermikrodissektionssystem mit einem Mikroskop, das eine Aufnahmeeinrichtung zur Aufnahme einer biologischen Probe und eine Auflichteinrichtung mit einer
Laserablenkeinrichtung aufweist, welche einen durch eine Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops auf einen Probenbereich der biologischen Probe führt und welche einen Auftreffpunkt des Laserstrahls auf dem Probenbereich verschiebt.
Ein entsprechendes Lasermikrodissektionssystem ist unten ausführlich unter
Bezugnahme auf die Figur 1 erläutert. Mittels der Auflichteinrichtung wird in einem solchen Lasermikrodissektionssystem der Laserstrahl aus einer Laserlichtquelle in den Beobachtungsstrahlengang des Mikroskops eingekoppelt. Der Laserstrahl wird durch das Mikroskopobjektiv, das auch zum Betrachten der Probe verwendet wird, auf diese fokussiert. Somit verläuft, mit anderen Worten, der Strahlengang des Laserstrahls der Lasereinheit durch die Auflichteinrichtung und durch das Mikroskopobjektiv und schneidet eine Objektebene des Mikroskopobjektivs an einem einstellbaren
Schnittpunkt, der mittels Ansteuersignalen an die Laserablenkeinrichtung vorgegeben wird.
Zur Vermeidung von Missverständnissen sei an dieser Stelle betont, dass das im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzte Lasermikrodissektionssystem mit Proben verwendet wird, die bereits mikroskopietauglich vorbereitet sind. Hierbei kann es sich beispielsweise um Gewebe-Dünnschnitte handeln, die mittels eines Mikrotoms aus einem größeren Gewebeblock herausgetrennt wurden, im vorliegenden Fall jedoch auch um dickere Schnitte aus einem entsprechenden Gewebeblock. Bei einem solchen Gewebeblock kann es sich beispielsweise um ein fixiertes Organ oder eine Biopsie eines entsprechenden Organs handeln. Das erfindungsgemäße
Lasermikrodissektionssystem dient daher nicht zur Gewinnung von Proben, sondern zu deren Bearbeitung sowie zur Isolation von bestimmten Bereichen hiervon. Es versteht sich, dass die vorliegende Erfindung auch mit Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms gewonnen werden, zum Einsatz kommen kann, z.B. mit Ausstrichen, Mazeraten usw. Wie erwähnt, eignet sich die Erfindung jedoch auch zur Verarbeitung dickerer Proben, die nicht mittels eines Mikrotoms vorbereitet wurden.
Mikrotome werden ausschließlich bei der Vorbereitung von mikroskopischen Proben eingesetzt. Mikrotome können hierzu auch Laser aufweisen. Die mittels eines
Mikrotoms erhaltenen Schnitte werden auf einen Objektträger, wie oben erwähnt, aufgebracht, gegebenenfalls dort befestigt, angefärbt usw. Erst dann stehen diese für einen Einsatz in dem Lasermikrodissektionssystem zur Verfügung. Ein Mikrotom unterscheidet sich in seinem Betrieb unter anderem dadurch fundamental von einem Lasermikrodissektionssystem, dass dort Schnitte mit möglichst homogener
Schnittstärke gewonnen werden. Mikrotome sind daher dazu ausgebildet, eine große Anzahl an identischen Schnitten mit parallelen Schnittflächen zu erzeugen,
wohingegen Lasermikrodissektionssysteme zum Heraustrennen von Dissektaten nach probenabhängigen Kriterien, beispielsweise nach visuellen morphologischen Kriterien, eingerichtet sind. Im vorliegenden Fall dient das Lasermikrodissektionssystem insbesondere zum Heraustrennen von Probenpartikeln, die anschließend in einem Suspendierfluid aufgenommen werden. Der Fachmann würde daher bei Mikrotomen eingesetzte technische Lösungen aufgrund der völlig unterschiedlichen Zielsetzung nicht auf derartige Lasermikrodissektionssysteme übertragen.
Zum Heraustrennen von Probenpartikel bzw. Probenbereichen, also zur Gewinnung von Dissektaten, wird ein Probenbereich entlang einer Schnittlinie vollständig durchtrennt und somit von der umgebenden Probe abgelöst. Es ist beispielsweise nicht möglich, Material unterschiedlicher, übereinander liegender Gewebeschichten getrennt voneinander zu isolieren. Ein mittels Lasermikrodissektion gewonnenes Dissektat stellt daher stets ein "Sammelprobenbereich" durch die gesamte Dicke der bearbeiteten Probe dar; eine Differenzierung in einzelne Gewebeschichten mittels
Lasermikrodissektion ist nicht möglich bzw. kann nur indirekt über die Dicke des Probenbereichs geschehen.
Der Mikroskoptisch ist in Lasermikrodissektionssystemen mit einer
Laserablenkeinrichtung, wie erfindungsgemäß eingesetzt, beim Bearbeiten der Probe gegenüber dem Mikroskopobjektiv bezüglich der x- und y-Richtung (also senkrecht zur optischen Achse des Mikroskopobjektivs) feststehend angeordnet.
Im Gegensatz zu Lasermikrodissektionssystemen mit einem während des
Dissektiervorgangs motorisch verfahrenen Mikroskoptisch (Scanningtisch), der insbesondere bei stark vergrößernden Objektiven eine hohe Positioniergenauigkeit besitzen muss, um präzise Schnitte zu ermöglichen, erweisen sich
Lasermikrodissektionssysteme mit einer Laserablenkeinrichtung als einfacher und kostengünstiger in der Herstellung und besitzen Präzisionsvorteile.
Die Laserablenkeinrichtung weist in einer besonders vorteilhaften Ausführungsform zwei dicke, gegen eine optische Achse geneigte und unabhängig voneinander um eine optische Achse drehbare gläserne Keilplatten („Glaskeile") auf, welche durch ihre Keilwinkel eine Strahlablenkung erzeugen. Durch die Drehung der gläsernen
Keilplatten ist der resultierende Ablenkwinkel des Laserstrahls gegenüber der optischen Achse variabel. Am Ausgang der Laserablenkeinrichtung weist der Laserstrahl durch die Dicke und die Schrägstellung der gläsernen Keilplatten einen seitlichen Strahlversatz gegenüber der optischen Achse auf und trifft für alle
Ablenkwinkel die Mitte der Objektivpupille des Mikroskopobjektivs. Der Schnittpunkt des Laserstrahls mit der Objektebene ist damit einstellbar.
Eine derartige Laserablenkeinrichtung ist insbesondere deshalb vorteilhaft gegenüber anderen Laserablenkeinrichtungen wie beispielsweise Spiegelscannern,
Galvanometerscannern oder Schrittmotorscannern, weil diese nicht in einer zu der Objektivpupille konjugierten Ebene angeordnet werden muss. Damit ist auch keine sogenannte Pupillenabbildung erforderlich, um zu erreichen, dass der abgelenkte Strahl die Objektivpupille trifft. Bei der Lasermikrodissektion mit UV-Laserlicht wäre dabei beispielsweise eine UV-taugliche Pupillenabbildung erforderlich. Weitere Vorteile einer derartigen Laserablenkeinrichtung mit Keilplatten sind beispielsweise in der EP 1 276 586 B1 genannt.
Vorteile der Erfindung
Bei dem erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionsverfahren zum Gewinnen eines Probenbereichs aus einer biologischen Probe wird ein fokussierter Laserstrahl entlang zumindest eines Teils einer den Probenbereich umgebenden Schnittlinie geführt, wodurch der Probenbereich von der umgebenden Probe getrennt wird, und wobei vor einem Ablösen des Probenbereichs mindestens zwei Stege verbleiben, die den Probenbereich mit der umgebenden Probe verbinden. Erfindungsgemäß wird mindestens ein weiterer auf die Schnittlinie fokussierter Laserstrahl bereitgestellt und jeder der mindestens zwei verbleibenden Stege wird durch jeweils einen der
Laserstrahlen durchtrennt. Dieses Verfahren führt zu einer erhöhten Zuverlässigkeit und einer erhöhten Geschwindigkeit des Probenschneidens mittels
Lasermikrodissektion. Die zwei oder mehr verbleibenden Stege werden entsprechend mittels zwei oder mehr Laserstrahlen parallel und insbesondere gleichzeitig durchtrennt. Auf diese Weise kann zuverlässig sichergestellt werden, dass gleichzeitig alle verbleibenden Stege mittels auf diese Stege fokussierten Laserstrahlen durchschnitten werden, so dass sich der Probenbereich zuverlässig von der umgebenden Probe ablöst und als Dissektat weiterverarbeitet werden kann.
Die Geschwindigkeit des Probenschneidens kann weiter erhöht werden, wenn einer des mindestens einen weiteren Laserstrahls entlang eines ihm vorher zugeordneten Teils der Schnittlinie geführt wird, bevor die Stege durchtrennt werden. Mit anderen Worten kann beim Vorhandensein von zwei Laserstrahlen ein Laserstrahl einen Teil der Schnittlinie und der andere Laserstrahl den anderen Teil der Schnittlinie mit Ausnahme der verbleibenden Stege schneiden, wobei anschließend die zwei verbleibenden Stege jeweils durch einen Laserstrahl durchtrennt werden.
Entsprechendes gilt beim Vorhandensein von mehr als zwei Laserstrahlen.
Es ist vorteilhaft, wenn die mindestens zwei verbleibenden Stege derart gewählt werden, dass sie entlang der Schnittlinie gleich verteilt sind. Auf diese Weise kann eine hohe Stabilität des durch die Stege mit der umgebenden Probe verbundenen
Probenbereichs sichergestellt werden.
Es ist weiterhin vorteilhaft, wenn (zumindest) zwei der verbleibenden Stege derart gewählt werden, dass die gedachte Verbindungslinie dieser zwei Stege durch den
Flächenschwerpunkt des Probenbereichs verläuft. Bei einer geradzahligen Anzahl von Stegen kann beispielsweise jeweils ein Paar von Stegen derart gewählt werden, dass die gedachte Verbindungslinie zwischen den zwei Stegen dieses Paars durch den Flächenschwerpunkt des Probenbereichs verläuft. Auf diese Weise ist eine besonders hohe Stabilität des über die Stege mit der umgebenden Probe verbundenen
Probenbereichs gewährleistet.
Die mindestens zwei verbleibenden Stege sollten in Schnittlinienrichtung gleiche Länge aufweisen. Dies vereinfacht insbesondere das anschließende Durchtrennen dieser Stege mit den jeweiligen Laserstrahlen, da deren Parameter zur Durchtrennung im Wesentlichen gleich eingestellt werden können. Parameter sind unter anderem die Laserenergie, die Laserapertur und der Laserfokus.
Eine Vereinfachung der Durchtrennung der verbleibenden Stege kann dadurch erzielt werden, dass einer, mehrere oder alle der Stege in gerade Abschnitte der Schnittlinie gelegt werden. Unter "gerader Abschnitt" sollen Abschnitte der Schnittlinie verstanden werden, die eine verhältnismäßig geringe Krümmung im Vergleich zu den übrigen Abschnitten dieser Schnittlinie zeigen.
Das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem besitzt ein Mikroskop, das eine Aufnahmeeinrichtung zur Aufnahme einer biologischen Probe und eine
Auflichteinrichtung mit einer Laserablenkeinrichtung aufweist, die einen durch eine Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl durch ein Mikroskopobjektiv des Mikroskops auf eine einen Probenbereich dieser biologischen Probe umgebende Schnittlinie führt und dort fokussiert und den Auftreffpunkt des Laserstrahls entlang dieser Schnittlinie verschiebt. Dieses Lasermikrodissektionssystem weist zusätzlich mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung auf, die derart eingerichtet ist, dass sie mindestens einen weiteren Laserstrahl auf zumindest einen Teil der Schnittlinie führt und fokussiert.
Ein solches Lasermikrodissektionssystem ist insbesondere zur Durchführung des erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionsverfahrens ausgebildet. Bezüglich der entsprechenden Vorteile einer solchen Vorrichtung sei daher auf die obigen
Erläuterungen im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verwiesen.
Die genannte (mindestens eine) weitere Laserablenkeinrichtung ist derart eingerichtet, dass sie den (mindestens einen) weiteren Laserstrahl auf zumindest einen Teil der Schnittlinie führt und dort fokussiert. Hierdurch wird es möglich, einen Teil der
Schnittlinie von einem weiteren Laser schneiden zu lassen. Insbesondere die oben ausführlich erwähnten Stege können einen solchen Teil der Schnittlinie bilden.
Besonders vorteilhaft ist weiterhin, wenn die mindestens eine weitere
Laserablenkeinrichtung auch zum Verschieben des Auftreffpunkts des mindestens einen weiteren Laserstrahls entlang zumindest eines Teils der Schnittlinie ausgestaltet ist. In diesem Fall kann die Schnittlinie von zwei oder mehr Lasern parallel und insbesondere gleichzeitig bearbeitet werden. Dies bringt eine enorme Zeitersparnis beim Schneiden von Probenbereichen aus einer Probe.
Im Folgenden sollen mögliche und bevorzugte Ausführungsformen für die
Bereitstellung weiterer Laserablenkeinrichtungen mit zugeordneten Laserstrahlen erörtert werden. Allgemein kann der weitere Laserstrahl (oder die weiteren
Laserstrahlen) durch zusätzliche Lasereinheiten und/oder durch einen oder mehrere Strahlteileranordnungen erzeugt werden, die einen vorhandenen Laserstrahl in zwei oder mehr Strahlen aufteilen.
Es kann vorteilhaft sein, wenn der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung eine weitere Lasereinheit zugeordnet ist, die einen des mindestens einen Laserstrahls bereitstellt. Somit ist mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung mit mindestens einer weiteren Lasereinheit vorhanden. Dies ist insbesondere dann zweckmäßig, wenn für jeden Laserstrahl die volle Laserleistung beispielsweise beim Laserschneiden benötigt wird.
Es kann vorteilhaft sein, wenn der Lasereinheit eine Strahlteileranordnung
nachgeordnet ist, die aus dem von der Lasereinheit bereitgestellten Laserstrahl den mindestens einen weiteren Laserstrahl durch Strahlteilung erzeugt. Es wäre somit prinzipiell ausreichend, wenn eine Lasereinheit vorhanden ist, aus der durch
Strahlteilung mehrere Laserstrahlen erzeugt werden. Selbstverständlich können auch Mischformeln der beiden genannten Ausgestaltungen zweckmäßig sein. So kann einer weiteren Lasereinheit eine Strahlteileranordnung nachgeordnet sein die aus dem von dieser weiteren Lasereinheit bereitgestellten weiteren Laserstrahl wiederum mindestens einen weiteren Laserstrahl durch
Strahlteilung erzeugt.
Die genannten Laserablenkeinrichtungen können die jeweiligen Laserstrahlen auf verschiedene Weise auf eine Probe führen.
Zum einen ist es möglich, alle Laserstrahlen durch dasselbe Mikroskopobjektiv des Mikroskops der Lasermikrodissektionseinrichtung zu leiten. Selbstverständlich ist es auch möglich, nur einen Teil aller zur Verfügung stehenden Laserstrahlen durch dasselbe Mikroskopobjektiv zu leiten. Hierbei ist die vorhandene
Laserablenkeinrichtung und mindestens eine der (mindestens einen) weiteren
Laserablenkeinrichtungen derart eingerichtet, dass die von diesen
Laserablenkeinrichtungen abgelenkten Laserstrahlen durch das Mikroskopobjektiv des Mikroskops des erfindungsgemäßen Lasermikrodissektionssystems geführt werden.
Zum Anderen kann für einen, mehrere oder für alle der weiteren Laserstrahlen jeweils eine Laserfokussierlinse vorgesehen sein, die den jeweiligen weiteren Laserstrahl auf die Probe führt. Hierzu ist eine der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung derart eingerichtet, dass sie den von ihr abgelenkten Laserstrahl durch eine
Laserfokussierlinse auf den Probenbereich (Schnittlinie, Steg) führt. Bei dieser
Ausgestaltung würde dem Mikroskop bzw. dem Mikroskopobjektiv des
Lasermikrodissektionssystems mindestens eine weitere Laserfokussierlinse
zugeschaltet sein. Dies ist insbesondere dann sinnvoll, wenn ein Probenbereich zu bearbeiten ist, der nicht durch das selbe Mikroskopobjektiv bearbeitet werden kann, wobei zur Bearbeitung aber nicht ein weiterer Mikroskopaufbau notwendig ist.
Schließlich kann es auch sinnvoll oder notwendig sein, wenn die genannte
Laserfokussierlinse ein weiteres Mikroskopobjektiv eines weiteren Mikroskops darstellt. In diesem Fall umfasst das erfindungsgemäße Lasermikrodissektionssystem somit mehrere Mikroskope zur parallelen Bearbeitung eines Probenbereichs.
Selbstverständlich sind die oben genannten drei Ausführungsformen beliebig miteinander kombinierbar, ohne dass es hierzu näherer Erläuterungen bedürfte.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Verwendung eines erfindungsgemäßen
Lasermikrodissektionssystems für das Eingangs geschilderte erfindungsgemäße Verfahren. Hierbei wird ein Probenbereich durch Verschiebung des Auftreffpunktes des Laserstrahls entlang der den Probenbereich umgebenden Schnittlinie von der umgebenden Probe getrennt, wobei vor einem Ablösen des Probenbereichs mindestens zwei Stege verbleiben, die den Probenbereich mit der umgebenden Probe verbinden. Die Laserablenkeinrichtungen führen und fokussieren die jeweils zugeordneten Laserstrahlen jeweils auf die mindestens zwei verbleibenden Stege, so dass jeder dieser Stege durch jeweils einen der Laserstrahlen durchtrennt wird.
Insbesondere kann mindestens einer der weiteren Laserstrahlen mittels der ihm zugeordneten Laserablenkeinrichtung mit seinem Auftreffpunkt entlang eines ihm zugeordneten Teils der Schnittlinie verschoben werden, bevor die Stege durchtrennt werden. Bezüglich Vorteile und weitere Ausgestaltungen der erfindungsgemäßen Verwendung sei auf die obigen Erläuterungen der Erfindung verwiesen.
Figurenbeschreibung
Figur 1 zeigt ein Lasermikrodissektionssystem, das vorzugsweise den Ausgangspunkt der vorliegenden Erfindung darstellt, in schematischer Darstellung.
Figur 2zeigt schematisch einen von einer Schnittlinie umgebenen Probenbereich einer Probe (Figur 2A) und den entsprechenden Probenbereich nach dem Schneiden mit zwei gegenüberliegenden Stegen in einem ersten Fall (Figur 2B) und in einem zweiten Fall (Figur 2C), wobei die Figuren 2D bis 2F die perspektivischen Seitenansichten der Aufsichten gemäß Figuren 2A bis 2C darstellen.
Figur 3zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen
Schneidens eines Probenbereichs auf einer Probe.
Figur 4zeigt schematisch eine weitere erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Schneidens eines Probenbereichs auf einer Probe.
Figur 5zeigt schematisch wiederum eine weitere erfindungsgemäße Möglichkeit des parallelen Schneidens eines Probenbereichs auf einer Probe.
Figur 6zeigt schematisch eine Möglichkeit der Bereitstellung weiterer Laserstrahlen durch weitere Lasereinheiten.
Figur 7zeigt schematisch die Bereitstellung weiterer Laserstrahlen mittels einer Strahlteileranordnung, und
Figur 8zeigt schematisch eine Kombinationsmöglichkeit aus den Beispielen der Figuren 6 und 7. In den Figuren sind einander entsprechende Elemente mit identischen Bezugszeichen angegeben und werden nicht wiederholt erläutert.
In Figur 1 ist ein Lasermikrodissektionssystem, das zur Durchführung der Erfindung verwendet werden kann, schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet. Das Lasermikrodissektionssystem 100 entspricht in wesentlichen Teilen jenem, das in der EP 1 276 586 B1 offenbart ist, auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird. Ein Koordinatensystem, anhand dessen die nachfolgend erwähnten Achsen bzw.
Richtungen x, y und z veranschaulicht sind, ist in der Figur 1 mit 200 bezeichnet.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 umfasst ein Mikroskop 10. In einem
Mikroskopfuß 1 1 des Mikroskops 10 kann eine hier nur teilweise dargestellte
Beleuchtungseinrichtung 12 vorgesehen sein. Diese kann beispielsweise eine (nicht dargestellte) Lichtquelle und geeignete Mittel zur Beeinflussung des durch die
Lichtquelle bereitgestellten Beleuchtungslichts umfassen, beispielsweise Filter und/oder Blenden. Zur Durchlichtbeleuchtung und zur Einstellung geeigneter Kontrast- bzw. Beobachtungsverfahren kann eine Kondensoreinheit 90 vorgesehen sein.
Das Mikroskop 10 kann als Konfokal-, insbesondere als Spinning-Disk-Mikroskop ausgebildet sein und verfügt in diesem Fall über entsprechende weitere oder alternative Mittel (in Figur 1 nicht dargestellt).
Am Mikroskopfuß 1 1 kann beispielsweise auch eine Benutzereingabe- und/oder Benutzerinformationseinheit 13 angeordnet sein, die beispielsweise als Touchscreen ausgebildet sein kann, und über die der Benutzer beispielsweise Betrachtungsund/oder Bearbeitungsparameter eingeben und/oder auslesen kann.
Ferner ist ein Triebknopf 14 vorgesehen. Dieser dient zur Bedienung eines Grob- und eines Feintriebs zur Einstellung einer Höhe eines Mikroskoptischs 30. Eine Probe 51 , beispielsweise eine in einer entsprechenden Aufnahmeeinrichtung bzw. Halterung 52 angebrachte Gewebeprobe, kann hierdurch in eine Objektebene eines Objektivs 41 gebracht werden. Das Objektiv 41 ist neben weiteren Objektiven 42 in einem
Objektivrevolver 40 befestigt. Zum Schutz vor Laserstrahlung kann eine Schutzhaube 15 vorgesehen sein.
Von der Probe 51 ausgehendes Beobachtungslicht verläuft entlang eines
Beobachtungsstrahlengangs a. In einer Tubuseinheit 60 mit geeigneten
Auskoppeleinrichtungen 61 kann ein vorzugsweise variabler Anteil des
Beobachtungslichts, beispielsweise um 60°, ausgekoppelt und mittels eines Okularpaars 62 einem Benutzer dargeboten werden. Ein weiterer Anteil des
Beobachtungslichts kann in eine digitale Bilderfassungseinheit 63 eingekoppelt und bildgebend erfasst werden. Der Bilderfassungseinheit 63 kann, vor Ort, in einer Steuereinheit 82 oder einem Steuerrechner 81 (siehe unten), oder in anderer räumlicher Anordnung, ein Bildauswertungsmodul 64 zugeordnet sein. Die dazu notwendigen Verbindungen zum Steuerrechner sind mit 83 bezeichnet.
Das Lasermikrodissektionssystem 100 weist eine Lasereinheit 70 mit einer
Laserlichtquelle 75 auf. Ein durch die Laserlichtquelle 75, bei der es sich
beispielsweise um eine UV-Laserlichtquelle handeln kann, bereitgestellter Laserstrahl 77 mit Laserstrahlachse b wird in einer Auflichteinheit, die hier insgesamt mit 76 angegeben ist, an einem ersten Umlenkspiegel 71 und einem zweiten Umlenkspiegel 72 umgelenkt und durch das Objektiv 41 auf die Probe 51 fokussiert.
Bei dem Lasermikrodissektionssystem 100 kann der Ort, an dem der Laserstrahl 77 auf die Probe 51 in der Objektebene, und damit auch in dem Probenbereich auftrifft, grundsätzlich auf unterschiedliche Weise eingestellt werden. Einerseits kann eine manuelle Versteileinrichtung 31 vorgesehen sein, mittels derer der als Kreuztisch ausgebildete Mikroskoptisch 30 in x- und y-Richtung (also hier senkrecht bzw. parallel zur Papierebene) verstellt werden kann. Neben der Versteileinrichtung 31 können auch elektromechanische Stellmittel vorgesehen sein, die beispielsweise durch eine Steuereinheit 82 angesteuert bzw. deren Position durch die Steuereinheit 82 erfasst werden kann.
Die Steuereinheit 82 kann auch beliebige weitere motorisierte Funktionen des
Lasermikrodissektionssystems 100 steuern und insbesondere eine Schnittstelle zu einem externen Steuerrechner 81 , der über entsprechende Verbindungen 83 angebunden sein kann, bereitstellen. Die Steuereinheit 82 oder der Steuerrechner 81 kann auch beispielsweise mittels des Bildauswertungsmoduls 64 erhaltene Daten auswerten. Beispielsweise kann hierdurch eine Abfolge von Gewebeschichten oder anderer Strukturen der Probe 51 erkannt werden.
Für die Lasermikrodissektion kann insbesondere eine Laserablenkeinrichtung 73 vorgesehen sein. Mittels der Laserablenkeinrichtung 73 kann der Laserstrahl 77 gegenüber einer zwischen dem ersten Umlenkspiegel 71 und dem zweiten
Umlenkspiegel 72 verlaufenden optischen Achse c abgelenkt werden. Der Laserstrahl kann daher an unterschiedlichen Positionen auf den zweiten Umlenkspiegel 72 auftreffen, der beispielsweise als dichromatischer Teiler ausgebildet sein kann, und wird damit auch an unterschiedlichen Positionen auf die Probe 51 in der Objektebene fokussiert. Eine Ablenkung mittels einer Laserablenkeinrichtung 73 ist im Detail in der EP 1 276 586 B1 gezeigt. Es sei betont, dass hier unterschiedliche Möglichkeiten zur Ablenkung eines Laserstrahls 77 bzw. zur Positionierung der Probe 51 in der
Objektebene gegenüber dem Laserstrahl 77 zum Einsatz kommen können. Die
Erfindung ist nicht auf das dargestellte Beispiel beschränkt.
Im dargestellten Beispiel weist die Laserablenkeinrichtung 73 zwei massive gläserne Keilplatten 731 auf, die gegen die optische Achse c geneigt und unabhängig
voneinander um die optische Achse c drehbar sind. Hierzu sind die Keilplatten 731 mit Kugellagern 732 gelagert. Jede der Keilplatten ist mit einem Zahnrad 733 verbunden. Die Zahnräder 733 können jeweils mittels Aktoren 734 gedreht werden, die mit entsprechenden Ansteuersignalen beaufschlagt werden können und entsprechend die Zahnräder 733 antreiben. Die Rotationseinrichtungen können über Positonsgeber 735 verfügen (hier nur an dem rechten Aktor 734 gezeigt). Eine durch die Positonsgeber 735 erfasste Position kann an die Steuereinheit 82 übermittelt werden.
Figur 2 zeigt schematisch den Fall des Schneidens mittels eines
Lasermikrodissektionsverfahrens, wie im Folgenden erläutert wird:
In an sich bekannter Weise wird beispielsweise mit einem
Lasermikrodissektionssystems 100 gemäß Figur 1 eine Probe 51 visualisiert. Ein interessierender Probenbereich 510 kann hierbei beispielsweise durch Färbung sichtbar gemacht sein. Dieser Probenbereich 510 soll als Dissektat einer weiteren Analyse zur Verfügung gestellt werden. Hierzu wird der Probenbereich 510 mit einer Schnittlinie 550 umgeben. Im dargestellten Ausführungsbeispiel gemäß Figur 2A umgibt diese Schnittlinie 550 als individuelle Schnittlinie die Objektkontur des
Probenbereichs 510. In der Praxis wird diese Schnittlinie 550 vom eigentlichen
Probenbereich 510 um ein gewisses Delta beabstandet sein, um aufgrund des endlichen Durchmessers des Laserfokus beim Schneiden den Probenbereich 510 im Randbereich nicht zu zerstören. Figur 2A zeigt die Aufsicht auf den Probenbereich 510, während Figur 2D eine perspektivische Seitenansicht der Situation aus Figur 2A darstellt.
In an sich bekannter Weise wird mittels des in Figur 1 dargestellten
Lasermikrodissektionssystems 100 der Laserstrahl 77 entsprechend der Schnittlinie 550 verschoben, sodass der Laserstrahlfokus die Schnittlinie schreibt. Hierzu wird die Laserablenkeinrichtung 73 mittels der Steuereinheit 82 entsprechend angesteuert (vgl. die Erläuterungen zu Figur 1 ). Die Figuren 2B und 2C zeigen zwei mögliche
Situationen nach dem Schneiden.
Figur 2B zeigt einen ersten Fall, bei dem zwei Stege 560 verbleiben, über die der Probenbereich 510 mit der umgebenden Probe 51 verbunden ist. Figur 2E zeigt eine entsprechende perspektivische Seitenansicht. Es ist hieraus zu sehen, dass die von der Probe 51 abgelösten Abschnitte des Probenbereichs 510 in der Ebene der Probe 51 verbleiben. Dies stellt den optimalen Fall dar. Die beiden Stege 560 können anschließend parallel von jeweils einem auf den jeweiligen Steg 560 fokussierten Laserstrahl gleichzeitig durchtrennt werden. Auf diese Weise ist gesichert, dass der Probenbereich 510 sich sauber von der umgebenden Probe 51 löst und in einen
Auffangbehälter gelangt. Weitere Details zum gleichzeitigen parallelen Durchtrennen der Stege 560 werden anhand der folgenden Figuren erläutert werden.
Im zweiten Fall gemäß Figuren 2C und 2F ist zu erkennen, dass die von der Probe 51 abgetrennten Abschnitte des Probenbereichs 510 nicht in der Ebene der Probe 51 verbleiben, sondern aufgrund Oberflächenspannungen und/oder Eigengewicht sich aus der Ebene der Probe 51 heraus bewegen. Dies stellt den schlechten Fall dar, den es zu vermeiden gilt. In diesem Fall ist es also zweckmäßig, drei oder mehr Stege vorzusehen. Die drei oder mehr Stege sind dabei so entlang der Schnittlinie zu verteilen, dass nach dem Schneiden abgelöste Abschnitte möglichst vollständig in der Ebene der Probe 51 verbleiben. Hierbei ist es beispielsweise sinnvoll, ein weiteres Paar von Stegen 560 vorzusehen, deren Verbindungslinie ebenfalls durch den
Flächenschwerpunkt des Probenbereichs 510 verläuft, wobei alle vier Stege über die Schnittlinie 550 möglichst gleich verteilt sein sollten.
Anhand von Figur 2B sollen die beiden Möglichkeiten des Schneidens mit zwei Laserstrahlen nochmals kurz erläutert werden. Zum Einen kann mittels eines
Laserstrahls die Schnittlinie 550 geschnitten werden, bis zwei Stege 560 verbleiben. Diese beiden Stege 560 werden dann durch zwei parallele Laserstrahlen gleichzeitig durchtrennt. Es ist aber auch möglich, dass ein erster Laser den mit 551 bezeichneten Abschnitt der Schnittlinie 550 schneidet, während ein zweiter Laser den mit 552 bezeichneten Abschnitt der Schnittlinie 550 schneidet. Die beiden verbliebenen Stege 560 werden dann wiederum gleichzeitig von zwei parallel betriebenen Lasern durchtrennt. Entsprechendes gilt für den Fall, dass drei oder mehr Stege verbleiben.
Figur 3 zeigt schematisch eine Möglichkeit des parallelen Schneidens eines
Probenbereichs auf einer Probe. Hierzu wird, wie anhand von Figur 1 bereits erläutert, ein Laserstrahl 77 auf eine Probe 51 mittels eines Mikroskopobjektivs 41 fokussiert. Die Position des Fokus des Laserstrahls 77 auf der Probe 51 wird mit Hilfe einer Laserablenkeinrichtung 73, wie sie anhand von Figur 1 bereits erläutert wurde, gesteuert.
Mittels eines weiteren Laserstrahls 77' mit zugeordneter weiterer
Laserablenkeinrichtung 73' kann derselbe Probenbereich 510 der Probe 51 bearbeitet werden, indem beide Laserstrahlen 77 und 77' parallel und insbesondere gleichzeitig den Probenbereich 510 entlang der Schnittlinie 550 (vgl. Figur 2) schneiden. Auf diese Weise kann die Geschwindigkeit des Dissektierens erhöht werden. Die parallelen Laser 77, 77' können also entlang derselben Schnittlinie 550 an unterschiedlichen
Koordinaten gleichzeitig schneiden, aber prinzipiell auch an gleichen Koordinaten, etwa bei dicken Proben. Hierbei können die Foki der Laser 77, 77' in unterschiedlichen Probentiefen liegen, um dicke Proben schneller und effektiver zu schneiden.
Mittels entsprechender Umlenkspiegel 72, 72' können die Achsen b, b' der
Laserstrahlen 77, 77' in die optische Achse c des Objektivs 41 eingekoppelt werden.
Figur 4 zeigt schematisch eine erfindungsgemäße Möglichkeit zum parallelen
Bearbeiten eines Probenbereichs auf einer Probe. Gleiche Bezugszeichen bezeichnen wiederum gleiche Elemente wie in den vorangegangen Figuren.
Die Ausführungsform gemäß Figur 4 soll als weitere Ausgestaltung des parallelen Bearbeitens eines Probenbereichs 510 auf einer Probe 51 (vgl. Figur 3) verstanden werden. Im Vergleich zu der Ausführungsform gemäß Figur 3 sind in Figur 4 aber zwei Fokussierlinsen 41 , 41 ' bzw. ein Mikroskopobjektiv 41 und eine Fokussierlinse 41 ' bzw. zwei Mikroskopobjektive 41 , 41 ' vorgesehen. Somit werden die beiden Laserstrahlen 77, 77' nicht durch eine einzige Fokussierlinse bzw. ein einziges Mikroskopobjektiv 41 geführt, sondern durch jeweils ein zugeordnetes Mikroskopobjektiv oder eine zugeordnete Fokussierlinse 41 bzw. 41 '. Dies ermöglicht beispielsweise nicht nur innerhalb des Sichtfelds eines Mikroskopobjektivs, sondern auch außerhalb dieses Sichtfelds und schließlich innerhalb der Sichtfelder zweier Mikroskopobjektive zu arbeiten, je nachdem ob 41 und 41 ' eine Fokussierlinse und ein Mikroskopobjektiv oder zwei Mikroskopobjektive bezeichnet.
Figur 5 zeigt eine weitere Ausgestaltung der Anordnung gemäß Figur 4. Hierbei ist ein zusätzlicher dritter Laserstrahl 77" vorgesehen, der in der Darstellung gemäß Figur 5 auf die Unterseite der Probe 51 gerichtet ist, während die beiden Laserstrahlen 77, 77' auf die Oberseite dieser Probe 51 gerichtet sind. Der auf die Unterseite der Probe 51 gerichtete Laserstrahl 77" besitzt eine ihm zugeordnete Laserablenkeinrichtung 73". Die in Figur 5 dargestellte Vorrichtung eignet sich wiederum zum Schneiden eines einzigen Probenbereichs 510 auf der Probe 51 . Hierzu sei auf die Erläuterungen im Zusammenhang mit Figur 4 verwiesen.
Der auf die Unterseite gerichtete Laserstrahl 77" gemäß Figur 5 kann insbesondere zum Schneiden dicker Probenbereiche eingesetzt werden. Beispielsweise kann der Laserstrahl 77' von oben auf die Schnittlinie geführt 550 (vgl. Fig. 2) werden, während der Laserstrahl 77" von unten auf dieselbe Schnittlinie 550 geführt wird, so dass die Schnittlinie 550 von zwei Seiten geschnitten wird. Auf diese Weise kann ein dicker Probenbereich schonender geschnitten werden, als wenn mit einem einzigen
Laserstrahl entsprechend hoher Energie nur von einer Seite aus geschnitten würde.
Bzgl. der Figuren 4 und 5 sei weiterhin betont, dass die dort dargestellte
Schrägstellung der Laserachsen nicht unbedingt nur durch die dargestellte
Schrägstellung der optischen Achsen der Mikroskopobjektive bzw.
Laserfokussierlinsen erreicht werden kann. Ein entsprechender Auftreffwinkel des Laserstrahls auf die Probe kann, wie anhand der Figuren 1 und 3 erläutert, auch und vorzugsweise mit Objektiven bzw. Laserfokussierlinsen erzielt werden, deren optische Achsen senkrecht auf die Probe stehen, wobei die Schrägstellungen der Laserachsen dann allein durch die zugeordneten Laserablenkeinrichtungen bewirkt werden. Die Schrägstellungen der Achsen in den Figuren 4 und 5 dienen somit eher der leichteren Verständlichkeit.
Figur 6 zeigt schematisch eine Möglichkeit der Bereitstellung weiterer Laserstrahlen durch weitere Lasereinheiten. Hierbei sind zwei Lasereinheiten 70 und 70' in einem Lasermikrodissektionssystem 100 vorhanden (vgl. Figur 1 ). Die Lasereinheiten 70, 70' erzeugen entsprechende Laserstrahlen 77, 77', die durch ihnen zugeordnete
Laserablenkeinheiten 73, 73' auf einem Probenbereich geführt und dort verschoben werden.
Figur 7 zeigt schematisch die Bereitstellung weiterer Laserstrahlen mittels einer Strahlteileranordnung. Die Lasereinheit 70 erzeugt einen Laserstrahl, der eine
Strahlteileranordnung 78 durchläuft. Hierbei wird der Laserstrahl in zwei Strahlen geteilt, wobei einer der beiden Strahlen mit 77 bezeichnet ist. Der andere der beiden geteilten Strahlen sei mit 77' bezeichnet. Auf diese Weise können zwei Laserstrahlen 77, 77' erzeugt werden, deren Intensität entsprechend geringer ist als die des ursprünglichen Laserstrahls 77. Beispielsweise kann der Laserstrahl 77' an einem Umlenkspiegel 74 reflektiert und einer ihm zugeordneten Laserablenkeinrichtung 73' zugeführt werden.
Während die Ausführungsform gemäß Figur 6 insbesondere für Schneidprozesse sinnvoll ist, bei denen die volle Laserintensität benötigt wird, ist die Ausführungsform gemäß Figur 7 für Prozesse vorteilhaft, für die ein Teil der ursprünglichen Laserleistung ausreichend ist.
Schließlich zeigt Figur 8 eine Kombinationsmöglichkeit der Ausführungsformen von den Figuren 6 und 7. Hierbei wird der von der Lasereinheit 70 erzeugte Laserstrahl 77 einer Laserablenkeinrichtung 73 zugeführt. Ein weiterer Laserstrahl wird durch eine weitere Lasereinheit 70' erzeugt. Dieser weitere Laserstrahl wird in zwei Laserstrahlen aufgespalten, wobei wiederum einer der beiden aufgespaltenen Laserstrahlen mit 77', der andere hingegen mit 77" bezeichnet werden soll. Die Aufspaltung erfolgt wiederum in einer Strahlteileranordnung 78'. Die auf diese Weise erzeugten Teilstrahlen 77' und 77" werden dann jeweils entsprechenden Laserablenkeinrichtungen 73' und 73" zugeführt, wobei für den Laserstrahl 77" wiederum ein Umlenkspiegel 74 zum Einsatz kommen kann. Eine Anordnung, wie sie in Figur 8 gezeigt ist, kann beispielsweise zum parallelen Schneiden von dicken Proben bzw. Probenbereichen (mit Laserstrahl 77) und dünnen Proben bzw. Probenbereichen (mit den Laserstrahlen 77' und 77") verwendet werden. Dem Fachmann erschließen sich aus den Figuren 6 bis 8 weitere Kombinationsmöglichkeiten.
Bezugszeichenliste
10 Mikroskop
1 1 Mikroskopfuß
12 Beleuchtungseinrichtung
13 Benutzereingabe-/informationseinheit
14 Triebknopf
15 Schutzhaube
30 Mikroskoptisch
31 manuelle Versteileinrichtung
40 Objektivrevolver
41 Objektiv
41 ', 41 " Laserfokussierlinse, Objektiv
42 Objektiv
51 Probe
52 Aufnahmeeinrichtung
510 Probenbereich
550 Schnittlinie
551 Teil der Schnittlinie
552 Teil der Schnittlinie
560 Steg
60 Tubuseinheit
61 Auskoppeleinrichtungen
62 Okularpaar
63 Bilderfassungseinheit
64 Bildauswertungsmodul
70, 70' Lasereinheit
71 Umlenkspiegel 72, 72' Umlenkspiegel
73, 73', 73" Laserablenkeinrichtung
74 Umlenkspiegel
75 Laserlichtquelle
76 Auflichteinheit
77, 77', 77" Laserstrahl
78, 78' Strahlteileranordnung
731 Keilplatten
732 Kugellager
733 Zahnrad
734 Aktor
735 Positionsgeber
81 Steuerrechner
82 Steuereinheit
83 Verbindungen
90 Kondensoreinheit
100 Lasermikrodissektionssystem
200 Koordinatensystem
a Beobachtungsstrahlengangachse b, b' Laserstrahlachse
c, c', c" optische Achse

Claims

Patentansprüche
1 . Lasermikrodissektionsverfahren zum Gewinnen eines Probenbereichs (510) aus einer biologischen Probe (51 ), bei dem ein fokussierter Laserstrahl (77) entlang zumindest eines Teils einer den Probenbereich (510) umgebenden Schnittlinie (550) geführt wird, wodurch der Probenbereich (510) von der umgebenden Probe (51 ) getrennt wird, und wobei vor einem Ablösen des Probenbereichs (510) mindestens zwei Stege (560) verbleiben, die den Probenbereich (510) mit der umgebenden Probe (51 ) verbinden,
dadurch gekennzeichnet, dass mindestens ein weiterer auf die Schnittlinie fokussierter Laserstrahl (77', 77") bereitgestellt wird, und dass jeder der mindestens zwei verbleibenden Stege (560) durch jeweils einen der Laserstrahlen (77, 77', 77") durchtrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass einer des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77") entlang eines ihm zugeordneten Teils (551 , 552) der Schnittlinie (550) geführt wird, bevor die Stege (560) durchtrennt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens zwei verbleibenden Stege (560) derart gewählt werden, dass sie entlang der Schnittlinie (550) gleich verteilt sind.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass zwei der verbleibenden Stege (560) derart gewählt werden, dass die gedachte
Verbindungslinie dieser zwei Stege (560) durch den Flächenschwerpunkt des
Probenbereichs (510) verläuft.
5. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die mindestens zwei verbleibenden Stege (560) gleiche Länge in Schnittlinienrichtung aufweisen.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass mindestens einer der mindestens zwei verbleibenden Stege (560) in einen geraden Abschnitt der Schnittlinie (550) gelegt wird.
7. Lasermikrodissektionssystem (100) mit einem Mikroskop (10), das eine Aufnahmeeinrichtung (52) zur Aufnahme einer biologischen Probe (51 ) und eine Auflichteinrichtung (76) mit einer Laserablenkeinrichtung (73) aufweist, welche einen durch eine Lasereinheit (70) bereitgestellten Laserstrahl (77) durch ein Mikroskopobjektiv (41 ) des Mikroskops (10) auf eine einen Probenbereich (50) der biologischen Probe (51 ) umgebende Schnittlinie (550) führt und fokussiert und welche einen Auftreffpunkt des Laserstrahls (77) entlang der Schnittlinie (550) verschiebt, dadurch gekennzeichnet, dass das Lasermikrodissektionssystem (100) mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung (73', 73") zum Führen und Fokussieren mindestens eines weiteren Laserstrahls (77', 77") auf zumindest einen Teil der Schnittlinie (550) aufweist.
8. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, dass die mindestens eine weitere Laserablenkeinrichtung (73', 73") zum Verschieben des Auftreffpunkts des mindestens einen weiteren Laserstrahls (77', 77") entlang zumindest eines Teils (551 ; 552) der Schnittlinie (550) ausgestaltet ist.
9. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73') eine weitere Lasereinheit (70') zugeordnet ist, die einen des mindestens einen Laserstrahls (77') bereitstellt.
10. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Lasereinheit (70) eine Strahlteileranordnung (78)
nachgeordnet ist, die aus dem von der Lasereinheit (70) bereitgestellten Laserstrahl den mindestens einen weiteren Laserstrahl (77') durch Strahlteilung erzeugt.
1 1 . Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der weiteren Lasereinheit (70') eine Strahlteileranordnung (78') nachgeordnet ist, die aus dem von der weiteren Lasereinheit (70') bereitgestellten weiteren Laserstrahl mindestens einen weiteren Laserstrahl (77', 77") durch Strahlteilung erzeugt.
12. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 7 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Laserablenkeinrichtung (73) und eine der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73', 73") derart eingerichtet sind, dass die von diesen Laserablenkeinrichtungen abgelenkten Laserstrahlen (77, 77', 77") durch das Mikroskopobjektiv (41 ) des Mikroskops (10) geführt werden.
13. Lasermikrodissektionssystem (100) nach einem der Ansprüche 7 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass eine der mindestens einen weiteren
Laserablenkeinrichtung (73', 73") derart eingerichtet ist, dass sie den von ihr abgelenkten Laserstrahl (77') durch eine Laserfokussierlinse auf den Probenbereich (50) führt.
14. Lasermikrodissektionssystem (100) nach Anspruch 13, dadurch
gekennzeichnet, dass die Laserfokussierlinse ein weiteres Mikroskopobjektiv (41 ') eines weiteren Mikroskops (10') darstellt.
15. Verwendung eines Lasermikrodissektionssystems (100) nach einem der Ansprüche 7 bis 14 zur Gewinnung eines Probenbereichs (510) aus einer biologischen Probe (51 ), wobei durch Verschiebung des Auftreffpunkts des Laserstrahls (77) entlang der den Probenbereich (50) umgebenden Schnittlinie (550) der Probenbereich (51 ) von der umgebenden Probe (51 ) getrennt wird, wobei vor einem Ablösen des
Probenbereichs (510) mindestens zwei Stege (560) verbleiben, die den Probenbereich (510) mit der umgebenden Probe (51 ) verbinden, und wobei die
Laserablenkeinrichtungen (73, 73', 73") die Laserstrahlen (77, 77', 77") jeweils auf die mindestens zwei verbleibenden Stege (560) führen und fokussieren, so dass jeder dieser Stege (560) durch jeweils einen der Laserstrahlen (77, 77', 77") durchtrennt wird.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei eine der mindestens einen weiteren Laserablenkeinrichtung (73', 73") den entsprechenden weiteren Laserstrahl (77', 77") mit seinem Auftreffpunkt entlang eines ihm zugeordneten Teils (551 ; 552) der
Schnittlinie (550) verschiebt, bevor die Stege (560) durchtrennt werden.
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