WO2015100876A1 - 一种制备利拉鲁肽的方法 - Google Patents

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WO2015100876A1 PCT/CN2014/075113 CN2014075113W WO2015100876A1 WO 2015100876 A1 WO2015100876 A1 WO 2015100876A1 CN 2014075113 W CN2014075113 W CN 2014075113W WO 2015100876 A1 WO2015100876 A1 WO 2015100876A1
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路杨
杨东晖
方晨
周亮
刘少华
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Adlai Nortye Biopharma Co Ltd
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Adlai Nortye Biopharma Co Ltd
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    • C07K1/1077—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides by covalent attachment of residues or functional groups by covalent attachment of residues other than amino acids or peptide residues, e.g. sugars, polyols, fatty acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing a polypeptide drug, which is a synthetic therapeutic agent for long-acting type II diabetes mellitus having a glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonist-liuraglutide Preparation method.
  • GLP-1 glucagon-like peptide-1
  • Liraglutide English name: Liraglutide, the structural formula is as follows:
  • the monthly sequence is:
  • Liraglutide is the first and only long-acting human GLP-1 analogue developed by Novo Nordisk of Denmark. It has a GLP-1 receptor agonist function in molecular structure, biological activity, and action. Targets and immunogenicity are similar to GLP-1.
  • the molecular structure of liraglutide is 97% homologous to GLP-1 (7-37). The structural difference is that Lys 34 is replaced by Arg. Lys 26 undergoes palmitoylation via glutamate, fatty acid side chains. It can make liraglutide reversibly bind to albumin in the blood, prolong the action time of liraglutide, and enhance the resistance to DPP-4 enzyme degradation.
  • the fatty acid side chain can also make The liraglutide molecule self-crosslinks into a heptamer at the injection site, thereby delaying its subcutaneous attraction, allowing it to last for up to 24 hours, once a day and at any time, with a low risk of hypoglycemia. .
  • this product can also reduce the secretion of glucagon in a blood glucose-dependent manner and delay gastric emptying.
  • Novo Nordisk's liraglutide is prepared by biological methods such as genetic engineering, which is technically difficult and has high production cost, which is not conducive to large-scale production of liraglutide.
  • US6268343B1 and US6458924B2 reported the synthesis of solid-liquid liraglutide, intermediate GLP-l (7-37) -OH require purified by Reverse Phase HPLC, then under liquid phase conditions with N a -Palmitoyl-Glu (OSu) -OtBu reaction, this method requires two purifications, a long synthesis cycle, a large amount of waste liquid, and is expensive, which is disadvantageous for the disadvantage of mass production.
  • WO2013037266A1 discloses a preparation method of liraglutide, the specific steps are: sequentially, by Fmoc solid phase synthesis, according to the liraglutide main chain peptide sequence, an amino acid having N-terminal Fmoc protection and side chain protection, wherein For the guanidine, Fmoc-Lys (Alloc)-OH was used to remove Alloc, and Palmitoyl-Glu-Offiu was coupled to the amino group of the lysine side chain by solid phase synthesis, and the product was obtained after cleavage.
  • the present inventors have prepared liraglutide by the existing synthesis method, and found that the technical problems existing in the prior art are: more synthetic steps, long synthesis cycle, low purity and yield, and unsuitable for industrial scale production. For this reason, the inventors have studied the synthesis method of liraglutide, thereby obtaining the technical scheme of the present invention.
  • the synthetic route of the present invention is shown in Figure 1: First, the lysine tripeptide fragment Fmoc-Lys-(Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH is synthesized by a liquid phase method, followed by the presence of an activator system.
  • the Fmoc-Gly-resin is obtained by coupling the resin solid phase carrier and Fmoc-Gly-OH, and then the N-terminal Fmoc-protected and side-chain protected amino acid is sequentially coupled by the solid phase synthesis method according to the liraglutide main chain peptide sequence.
  • HATU 2-(7-azobenzotriazole) - ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ '-tetradecylurea hexafluorophosphate
  • Trt triphenyl fluorenyl
  • Palmitoyl Palmitoyl
  • Trp tryptophan
  • the present invention provides a method for synthesizing liraglutide, the steps of which are as follows:
  • Step 1 synthesizing a lysine tripeptide fragment by a liquid phase method
  • Step 2 Fmoc-Gly-resin is obtained by coupling a resin solid phase carrier and Fmoc-Gly-OH in the presence of an activator system;
  • Step 3 by solid phase synthesis, according to the liraglutide main chain peptide sequence, the amino acid having N-terminal Fmoc protection and side chain protection is sequentially coupled, wherein the lysine tripeptide fragment is Fmoc-Lys-(Glu(N) a -Palmitoyl)-OtBu)-OH;
  • Step 4 cleavage, purification, and lyophilization to obtain liraglutide.
  • the liquid phase synthesis of the fragment Fmoc-Lys-(Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH is: n-hexadecanoic acid, HOSu, Coupling with Palmitoyl-OSu activated ester by DCC, then reacting with H-Glu-OtBu to obtain the dipeptide fragment Palmitoyl-Glu-OtBu; Palmitoyl-Glu-OtBu, HOSu, DCC coupling to obtain Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu activated ester Then, it is reacted with Fmoc-Lys-OH to obtain a lysine tripeptide fragment Fmoc-Ly s-(Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH.
  • the solid phase synthesis method according to the second step wherein the resin solid phase carrier is made of 2-CTC resin, the activator system is selected from DIEA, TMP or NMM, and the Fmoc-Gly-resin is 0.10-0.35 mmol. /g substitution degree Fmoc-Gly-CTC resin.
  • the solid phase synthesis method according to the second step wherein the resin solid phase carrier is made of a king resin, the activator system is composed of DIC, HOBt and DMAP, and the Fmoc-Gly-king resin is 0.10 to 0.35 mmol/ Fmoc-Gly-king resin with degree of g substitution.
  • the degree of substitution of the resin is the degree of substitution of the resin by ultraviolet spectrophotometry, and the Fmoc protecting group on the resin coupled with the Fmoc-protected amino acid is deprotected with a 20% piperidine/DMF solution.
  • the concentration is determined by ultraviolet spectrophotometry, and then the Fmoc molar value of the resin is calibrated with an amino acid standard compound containing Fmoc, such as Fmoc-Leu-OH, and the resin is used to determine the degree of substitution of the resin. Call it the degree of substitution.
  • lysine oxime is Fmoc-Lys-(Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH
  • the amino acid sequence is: Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc- Ile-OH , Fmoc-Phe-OH , Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc- Lys-(Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fm
  • the coupling agent system comprises a condensing agent selected from the group consisting of DIC/HOBt, PyBOP/HOBt/DIEA or HATU/HOBt/DIEA; and the reaction solvent is selected from DMF, DCM, NMP, DMSO or they Any combination between.
  • step 3 during the amino acid coupling process, wherein when the condensing agent is selected
  • AA-resin H-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-resin (hereinafter referred to as AA-resin): Fmoc-Lys-( The molar ratio of Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH:HATU:HOBt:DIEA is preferably: 1:3:3:3:3-1:5:5:5:5, ie the Fmoc-Lys - (Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH and the condensing agent HATU/HOBt/DIEA are equal in number of moles, and their respective molar ratios to the AA resin are 3/1 to 5/1.
  • the reaction temperature is 25 to 35 ° C, and the reaction time is 2 to 3 hours; more
  • the method of the present invention is obtained by screening, and the screening process is as follows:
  • the amino acid sequence is: Fmoc-Ala-OH, Fmoc -Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc- Ser(tBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr( tBu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Boc-His(Trt)-OH, cleavage, purification, lyophilization,
  • the beneficial effects of the invention are as follows:
  • the direct solid phase synthesis of liraglutide by using the fragment Fmoc-Lys-(Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH solves the long synthesis cycle, high cost and purity of the prior art. Low, high impurity, not suitable for industrial production;
  • the present invention provides a synthesis process of liraglutide which is short in synthesis cycle, low in cost and high in yield and suitable for large-scale production.
  • Figure 1 is a synthetic route of the liraglutide of the present invention
  • Figure 2 HPLC chromatogram of a lysine tripeptide fragment
  • Figure 3 is a HPLC chromatogram of the crude peptide of liraglutide
  • Figure 5 is a morphological language map of a lysine tripeptide fragment
  • Figure 6 is a thirteenth diagram of liraglutide peptidic peptide. Detailed ways:
  • Fmoc protecting group amino acid raw materials, 2-CTC resin and Wang resin are all conventional commercial reagents (manufacturer: Jill Biochemical (Shanghai) Co., Ltd.; chemically pure); lysine tripeptide fragment Fmoc-Lys-(Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH is synthesized as described in this patent.
  • the sources of organic solvents and other raw materials are commercially available (manufacturer: Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.; chemically pure).
  • Rotary distillation equipment Rotary evaporator R-200/205 (Switzerland Buchi);
  • Condensation and concentration conditions under vacuum (-O.lMpa) at 30 ° C, the mixture is concentrated by steaming, and the volume after concentration is 75% or less before the steaming.
  • Freeze-drying equipment Freeze-drying machine FD-3 (Beijing Bo Yikang Experimental Instrument Co., Ltd.);
  • Freeze-drying conditions Place the lyophilized tray in the freezer (-20 °C) and pre-freeze for 6 h. Turn on the freeze dryer, turn on the refrigeration, pre-cool for more than 30 min, and set the freeze-drying curve as follows: First stage: 16 h at -27 °C; second stage: 4 h at -5 °C; third stage: 2 h at 5 °C; fourth stage: 16 h at 30 °C.
  • HPLC Dionex high performance liquid chromatography; using octadecylsilane bonded silica gel (5 ⁇ , 250 4.6mm) as a filler; 0.1% TFA solution as mobile phase A, gradient elution with acetonitrile as mobile phase; It is 1.0 ml per minute; the detection wavelength is 220 nm; the column temperature is 30 °C. Take 20 ⁇ l of the test solution and inject it into the liquid chromatograph to record the chromatogram.
  • Mass spectrometry MALDI-TOF-MS matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry; instrument model is AUTO FLEX SPEED TOF-TOF.
  • Example 1 Synthesis of Palmitoyl-OSu activated ester
  • the reaction solution was filtered, the mother liquor was spun dry, dissolved in DCM, filtered, washed with saturated sodium bicarbonate 3 times, purified water 2 times, stripped 2 times, combined organic phase, dried anhydrous sodium carbonate, spin dried, recrystallized from ice ethanol 3
  • the filter was filtered and the solid oil pump was dried to 314.62 g of Palmitoyl-OSu activated ester in a yield of 89%.
  • Palmitoyl-Glu-OtBu (0.2mol), 27.62g of HOSu (0.24mol), add it to 1000ml of THF, add 49.51g of DCC (0.24mol) under ice water bath, react for 1 hour, and warm to room temperature for 3 hours.
  • Example 4 Synthesis of Fmoc-Lys-(Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH
  • the HPLC purity is 97.40%, the yield is 85%;
  • [M+Na] + : 814.555, [M+K] + : 830.605 the theoretical precision of the lysine tripeptide fragment Fmoc-Lys-(Glu(N a -Palmitoyl)-OtBu)-OH
  • the molecular weight is: 791.5, and the mass spectrometry results of the sample are consistent with the theoretical molecular weight and the structure is correct.
  • the solvent is changed to: DMSO and DMF mixed solution with a volume ratio of 1:4;
  • Fmoc-Asp(OtBu)-OH is coupled with the coupling reagent: PyBOP/HOBt/DIEA;
  • the coupling reagent for Boc-His(Trt)-OH coupling was changed to: HATU/HOBt/DIEA.
  • the liraglutide CTC resin was washed 3 times with DMF, washed 3 times with DCM, and washed 3 times with MeOH.
  • the DCM was washed 3 times, washed with MeOH 3 times, and dried to give 9.67 g of liraglutide CTC resin.
  • the solvent is replaced by: a mixed solution of DMSO and DMF in a volume ratio of 1:4; and the coupling reagent of Fmoc-Asp(OtBu)-OH is converted to: PyBOP/HOBt/DIEA; Boc-His(Trt)-OH coupling reagent was changed to: HATU/HOBt/DIEA, after coupling, the liraglutide resin was washed 3 times with DMF and 3 times with DCM. The MeOH was washed 3 times, DCM was washed 3 times, MeOH was washed 3 times, and dried to give 9.78 g of liraglutide resin.
  • Example 11 Large-scale preparation of liraglutide resin
  • DMF The mixed solution with a pyridine volume ratio of 4:1 was deprotected by Fmoc, and then washed 6 times with DMF, and 3240 g of Fmoc-Arg(Pbf)-OH (5 mol) and 682 g of HOBt (5 mol) were weighed to a volume ratio of 1:
  • the mixed solution of DCM and DMF of 1 is activated by adding 800 ml of DIC (5 mol) in an ice water bath, and then added to the reaction column containing the resin, and reacted at room temperature for 2 'J, and then the end point of the reaction is determined by the ninhydrin method.
  • the target product was obtained after 2 purifications on a C18 or C8 column, salt transfer, and lyophilization.
  • First purification conditions The mobile phase is: Phase A: 0.1% TFA; Phase B: Acetonitrile, detection wavelength 220 nm, collection of target peaks.

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Abstract

本发明公开了一种合成利拉鲁肽的方法，具体步骤为：A）液相合成片段Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；B）树脂固相载体和Fmoc-Gly-OH偶联得到Fmoc-Gly-树脂；C）通过固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有N端Fmoc保护且侧链保护的氨基酸，其中赖氨酸三肽片段采用Fmoc-Lys-(Glu(Nα-Palmitoyl)-OtBu)-OH；D）裂解，纯化，冻干后得到利拉鲁肽。该方法合成周期短、成本低、收率较高，适合规模化生产。

Description

一种制备利拉鲁肽的方法 技术领域
本发明涉及一种多肽类药物的制备方法， 是一种合成的具有胰高血糖素样 肽 -l(GLP-l)受体激动剂的长效 II型糖尿病的治疗特效药-利拉鲁肽的制备方法。 背景技术
利拉鲁肽， 英名为： Liraglutide, 结构式如下:
Figure imgf000003_0001
月太序列为:
H-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Al a-Ala-Lys(N-s-(N-a-Palmitoyl-L-y-glutamyl))-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Arg-Gl y-Arg-Gly-OH
利拉鲁肽是由丹麦诺和诺德公司开发的第一个也是目前唯——个长效人 GLP-1类似物， 具有 GLP-1受体激动剂作用， 在分子结构、 生物活性、 作用靶 点及免疫原性等方面与 GLP-1相似。 利拉鲁肽的分子结构与 GLP-l(7-37) 的同 源性达 97 %， 结构差异表现在 Lys34被 Arg替代， Lys26 经由谷氨酸介导发生 棕榈酰化， 脂肪酸侧链可以使利拉鲁肽在血液中与白蛋白可逆性地结合， 使利 拉鲁肽的作用时间延长， 且增强对 DPP-4酶降解的抵抗， 脂肪酸侧链还可以使 利拉鲁肽分子在注射部位自交联成七聚体， 从而延緩其自皮下吸引， 使其作用 时间可长达接近 24小时， 每天注射一次并且可在任意时间注射， 且低血糖发生 风险小。 此外， 本品还能够以血糖依耐性方式降低胰高血糖素的分泌， 并延迟 胃排空。
诺和诺德的利拉鲁肽通过基因工程等生物学方法进行制备， 技术难度大， 生产成本高， 不利于利拉鲁肽的大规模生产。 US6268343B1 和 US6458924B2 报道了利拉鲁肽的固液合成法，中间体 GLP-l(7-37)-OH均需要反相 HPLC纯化， 再在液相条件下与 Na-Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu反应， 此方法需两次纯化， 合成 周期长， 废液多， 成本昂贵， 不利于大规模生产的缺点。
WO2013037266A1公开了一种利拉鲁肽的制备方法， 具体步骤为： 通过 Fmoc固相合成法，按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc保护且侧链 保护的氨基酸， 其中赖氨酸釆用 Fmoc-Lys (Alloc ) -OH， 脱去 Alloc, 通过固相 合成法在赖氨酸侧链氨基上偶联 Palmitoyl-Glu-Offiu， 裂解后得到产品。 此方法 由于使用四 （三苯基膦）钯脱去 Alloc, 不仅使成本偏高， 不利于大规模生产， 还会使金属残留导致重金属含量超标， 导致产品质量和含量不高。
综上所述， 现有利拉鲁肽的固相合成过程中， 由于合成周期长， 成本高， 收率低， 杂质多， 不适用于工业化生产。 发明内容
本发明人用现有的合成方法， 制备利拉鲁肽， 发现现有技术存在的技术问 题是： 合成步骤较多， 合成周期长， 纯度和收率不高， 不适于工业化规模生产。 为此， 本发明人对利拉鲁肽的合成方法进行了研究， 从而得到了本发明的技术 方案。
本发明的目的是提供一种利拉鲁肽的固相合成方法。 本发明的合成路线如 图 1 所 示 ： 首 先 通 过 液 相 方 法 合 成 赖 氨 酸 三 肽 片 段 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH， 其次在活化剂系统的存在下， 由树脂 固相载体和 Fmoc-Gly-OH偶联得到 Fmoc-Gly-树脂， 然后通过固相合成法， 按 照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc保护且侧链保护的氨基酸， 其中 赖氨酸三肽片段釆用 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH， 最后裂解， 纯化， 冻干， 得到利拉鲁肽， 该利拉鲁肽的氨基酸序列如序列表（SEQ No. 1 )所示。 本发明中一些常用的缩写具有以下含义；
Fmoc ： 芴曱氧羰基
Fmoc-AA： 芴曱氧羰基保护的氨基酸
DIC ： N, Ν'-二异丙基碳化二亚胺
DCC ： Ν, Ν'-二环己基碳二亚胺
PyBOP ： 六氟磷酸苯并三唑 -1-基 -氧基三吡咯烷基磷
HATU ： 2-(7-偶氮苯并三氮唑) -Ν,Ν,Ν',Ν'-四曱基脲六氟磷酸酯
HOBt ： 1- 羟基苯骈三唑
HOSu ： N-羟基琥珀酰亚胺
tBu ： 叔丁基
Trt ： 三苯曱基
Boc ： 叔丁氧叛基
Palmitoyl ： 棕榈酰基
Pbf ： 2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃 -5-磺醜基
Tyr ： 酪氨酸
lie ： 异亮氨酸
Gin ： 谷氨酰胺
Asn ： 天冬酰胺
Cys ： 半胱氨酸
Pro ： 脯氨酸
Leu ： 亮氨酸
Gly ： 甘氨酸
Arg ： 精氨酸
Val ： 缬氨酸
Trp ： 色氨酸
Ala ： 丙氨酸
Phe ： 苯丙氨酸
Glu ： 谷氨酸 Lys ： 赖氨酸
Ser ： 丝氨酸
Asp ： 天冬氨酸
Thr ： 苏氨酸
His ： 组氨酸
DMF ： N, Ν'-二曱基曱酰胺
MeOH ： 曱醇
DCM ： 二氯曱烷
NMP ： N-曱基吡咯烷酮
DMSO ： 二曱基亚砜
TFA： 三氟醋酸
EDT ： 乙二疏醇
Piperidine ： 六氢 p比
DMAP ： 4-二曱氨基吡啶
DIEA ： N, Ν'-二异丙基乙胺
ΤΜΡ ： 2,4,6-三曱基吡啶。
ΝΜΜ: Ν-曱基吗啉
2-CTC: 2-氯三苯曱基氯
为此本发明提供一种利拉鲁肽的合成方法， 其步骤如下：
步 骤 1 ， 通 过 液 相 方 法 合 成 赖 氨 酸 三 肽 片 段
Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH;
步骤 2， 在活化剂系统的存在下， 由树脂固相载体和 Fmoc-Gly-OH偶联得 到 Fmoc-Gly-树脂；
步骤 3， 通过固相合成法， 按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc 保 护 且 侧 链保 护 的 氨基 酸 ， 其 中 赖 氨 酸 三 肽 片 段 釆 用 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH;
步骤 4， 裂解， 纯化， 冻干， 得到利拉鲁肽。
其 中 ， 步 骤 1 所 述 的 固 相 合 成 方 法 ， 所 述 片 段 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH 的液相合成为： 正十六烷酸、 HOSu、 DCC偶联得到 Palmitoyl-OSu活化酯， 然后和 H-Glu-OtBu反应得到二肽片段 Palmitoyl-Glu-OtBu ； Palmitoyl-Glu-OtBu 、 HOSu 、 DCC 偶 联 得 到 Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu活化酯， 然后和 Fmoc-Lys-OH反应得到赖氨酸三肽片 段 Fmoc-Ly s-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH。
其中， 步骤 2所述的固相合成方法， 所述树脂固相载体釆用 2-CTC树脂， 所述活化剂系统选自 DIEA、 TMP 或 NMM， 所述 Fmoc-Gly-树脂为 0.10~0.35mmol/g取代度的 Fmoc-Gly-CTC树脂。
其中， 步骤 2所述的固相合成方法， 所述树脂固相载体釆用王树脂， 所述 活化剂系统由 DIC、 HOBt 和 DMAP 组成， 所述 Fmoc-Gly-王树脂为 0.10~0.35mmol/g取代度的 Fmoc-Gly-王树脂。
本发明中， 所述的树脂的取代度是釆用紫外吸光光度法测定的树脂的取代 度， 用 20%哌啶 /DMF溶液将偶联 Fmoc保护型氨基酸的树脂上的 Fmoc保护基 脱保护下来， 用紫外吸光光度法测定其浓度， 然后釆用含 Fmoc 的氨基酸标准 化合物例如 Fmoc-Leu-OH, 以外标法标定树脂上的 Fmoc的 mmol数值， 除以 树脂重量， 即得到树脂的取代度或称之为替代度。
其中， 步骤 3所述的固相合成方法，
1 )釆用由体积比为 1 :4的哌啶和 DMF组成的去保护液脱除 Fmoc-Gly-树脂 上的 Fmoc保护基， 得到 H-Gly-树脂；
2 )在偶联剂系统的存在下， H-Gly-树脂和 Fmoc保护且侧链保护的精氨酸 偶联得到 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
3 ) 重复步骤 1 )、 2 ), 按照利拉鲁肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联， 其 中赖氨酸釆用 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH, 偶联氨基酸顺序为： Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、 Fmoc-Val-OH 、 Fmoc-Leu-OH 、 Fmoc-Trp(Boc)-OH 、 Fmoc-Ala-OH 、 Fmoc-Ile-OH 、 Fmoc-Phe-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc- Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ala-OH 、 Fmoc-Gln(Trt)-OH 、 Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH 、 Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 、 Fmoc-Ala -OH, Boc-His(Trt)-OH;
所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂， 所述缩合剂选自 DIC/HOBt、 PyBOP/HOBt/DIEA或 HATU/HOBt/DIEA; 所述反应溶剂选自 DMF、 DCM、 NMP、 DMSO或他们之间的任意组合。
优选地， 步骤 3 ) 中， 氨基酸偶联过程中， 其中当缩合剂选择
HATU/HOBt/DIEA时，
H-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂（以下 简称 AA-树脂）: Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH:HATU:HOBt:DIEA的摩 尔比优选为： 1:3:3:3:3-1:5:5:5:5,即所述 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH 和缩合剂 HATU/HOBt/DIEA这 4种物质的摩尔数相等， 它们各自相对于所述 AA树脂的摩尔比例为 3/1~5/1， 反应温度为 25~35°C， 反应时间为 2~3小时； 更优选， 它们各自相对于所述 AA树脂的摩尔比例为 5/1， 反应温度为 35°C， 反应时间为 2小时。
本发明的方法是经过筛选获得的， 筛选过程如下：
1 )摩尔比的选择：
H-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树
月旨: Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH:HATU:HOBt:DIEA的摩尔比为：
1:3:3:3:3和 1:5:5:5:5;
2 )反应温度的选择：
25°C和 350C;
3 )反应时间的选择：
2小时和 3小时。
为此提出了 8种实验条件：
实验条件 1 : 取 3.43g
H-Glu(OtBu)-Phe-Ile-Ala-Trp(Boc)-Leu-Val-Arg(Pbf)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-树脂
(1.0mmol)、 2.16g Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH (3.0 mmol), 0.41 g HOBt (3.0 mmol)和 1.14g HATU (3.0 mmol)加入 20ml DMF中搅拌溶解， 冷却到 0°C， 将 0.5ml DIEA (3.0 mmol)加入上述溶液中， 在 25°C反应 2小时， 然后依次偶联 剩下的氨基酸， 偶联氨基酸顺序为： Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH、 Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc-Ala -OH, Boc-His(Trt)-OH, 裂解， 纯化， 冻干， 得到利拉鲁肽精肽；
实验条件 2—8, 实验操作如实验条件 1 所示， 不同的实验条件及其实验结 果如下面的表 1所示：
表 1
Figure imgf000009_0001
以上结果表明， 实验条件 4的纯化效果最优。
本发明的方法和现有技术相比具有明显的优势， 有关对比实验如下表 2 所 表 2 对比实验结果
Figure imgf000009_0002
本发明的有益效果是： 选用片段 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH直 接固相合成利拉鲁肽， 解决了现有技术存在的合成周期长， 成本高， 纯度低， 杂质多， 不适用于工业化生产的问题； 本发明提供了一种合成周期短、 成本低、 收率较高， 适合规模化生产的利拉鲁肽的合成工艺。
附图说明
图 1本发明利拉鲁肽的合成路线；
图 2 赖氨酸三肽片段的 HPLC谱图；
图 3利拉鲁肽粗肽的 HPLC谱图；
图 4利拉鲁肽精肽的 HPLC谱图；
图 5赖氨酸三肽片段的质语语图；
图 6实施例十三利拉鲁肽精肽质语语图。 具体实施方式：
以下通过实施例进一步说明本发明。
具体地， 关于下面实施例中涉及的各商购氨基酸以及氨基酸片段， 以及各商 购树脂， 其生产厂家和商品型号如下：
Fmoc保护基氨基酸原料、 2-CTC树脂和王树脂均为常规的市售试剂（厂家： 吉 尔 生化 （ 上海 ） 有 限公司 ； 化学 纯 ）； 赖氨酸三肽片 段 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH是本专利描述合成的。
有机溶剂和其它原料来源均为市售品 （厂家： 国药集团化学试剂有限公司； 化学纯）。
另夕卜， 下面实施例中提到的 "旋蒸浓缩" 以及 "冻干" 以及测定 HPLC和质 谱的条件和所用设备型号及生产厂家说明如下：
旋蒸浓缩设备： 旋转蒸发仪 R-200/205 (瑞士 Buchi (布奇)公司）；
旋蒸浓缩条件： 30°C下， 真空 （-O.lMpa )条件下旋蒸浓缩， 浓缩后体积在 旋蒸前总体积 75%以下。
冻干设备： 冻干机 FD-3 (北京博医康实验仪器有限公司）；
冻干条件： 将冻干盘放入冰箱冷冻室 (-20 °C) 中， 预冻 6 h。 开启冻干机， 打 开制冷， 预冷 30 min以上， 设置冻干曲线如下： 第一段： 在 -27 °C运行 16 h; 第二段： 在 -5°C运行 4 h; 第三段： 在 5°C运行 2 h; 第四段： 在 30°C运行 16 h。
HPLC: Dionex 高效液相色谱仪； 用十八烷基硅烷键合硅胶（ 5μπι， 250 4.6mm ) 为填充剂； 以 0.1%TFA溶液为流动相 A， 以乙腈为流动相 进行梯 度洗脱； 流速为每分钟 1.0ml; 检测波长为 220nm; 柱温 30°C。 取供试品溶液 20μ1, 注入液相色谱仪， 记录色谱图。
质谱： MALDI-TOF-MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱； 仪器型号 为 AUTO FLEX SPEED TOF-TOF。 实施例一： Palmitoyl- OSu活化酯的合成
称取 256.42g正十六烷酸（ l.Omol )， 138.10g HOSu( 1.2mol )加入 2000ml THF 中， 冰水浴下加入 247.56g DCC ( 1.2mol )， 反应 1小时， 升温到室温反应 3小 时， 反应液过滤， 母液旋干， 加 DCM溶解， 过滤， 饱和碳酸氢钠洗 3遍， 纯 水 2遍， 反萃 2遍， 合并有机相， 无水碳酸钠干燥， 旋干， 冰乙醇重结晶 3次， 过滤， 固体油泵拉干的到 314.62g Palmitoyl-OSu活化酯， 收率 89%。
实施例二： Palmitoyl-Glu-OtBu的合成
称取 101.62g H-Glu-OtBu( 0.5mol )和 79.50g Na2C03( 0.75mol )加入到 500ml 水和 500ml THF的混合溶液中溶解， 称取 176.75g Palmitoyl-OSu ( 0.5mol )加 入到 500ml THF， 溶解后滴加上述混合溶液中， 室温下反应过夜， 用 10%稀盐 酸调节 PH到 7， 旋蒸除去 THF， 之后调节 PH到 3。 得到大量白色沉淀， 过滤。 将得到的白 色沉淀用冰乙醇重结晶。 固体油泵拉干的到 192. llg Palmitoyl-Glu-OtBu, 收率 87%。
实施例三： Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu的合成
称取 88.33g Palmitoyl-Glu-OtBu ( 0.2mol )， 27.62g HOSu ( 0.24mol )加入 1000ml THF中， 冰水浴下加入 49.51g DCC ( 0.24mol )， 反应 1小时， 升温到室 温反应 3小时， 反应液过滤， 母液旋干， 加 DCM溶解， 过滤， 饱和碳酸氢钠 洗 3遍， 纯水 2遍， 反萃 2遍， 合并有机相， 无水碳酸钠干燥， 旋干， 冰乙醇 重结晶 3次，过滤， 固体油泵拉干的到 94.81g Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu活化酯， 收率 88%。 实施例四： Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH的合成
称取 36.74g Fmoc-Lys-OH ( O.lmol )和 15.90g Na2C03 ( 0.15mol )加入到 100ml水和 100ml THF的混合溶液中溶解，称取 53.87g Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu ( O.lmol )加入到 100ml THF， 溶解后滴加上述混合溶液中， 室温下反应过夜， 用 10%稀盐酸调节 PH到 7， 旋蒸除去 THF， 之后调节 PH到 3。 得到大量白色 沉淀， 过滤。 将得到的白色沉淀用冰乙醇重结晶。 固体油泵拉干的到 67.24g Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH,其 HPLC谱图如图 2所示， HPLC纯度 为 97.40%，收率 85%;其质语如图 5所示， [M+Na]+: 814.555、 [M+K]+: 830.605， 赖氨酸三肽片段 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH的理论精确分子量为： 791.5, 样品质谱结果与理论分子量相符， 结构正确。
实施例五： 取代度为 0.10mmol/g的 Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取取代度为 0.40mmol/g的 2-CTC树脂 20g， 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗涤 1次，用 DMF溶胀树脂 30分钟后，取 13.37g Fmoc-Gly-OH(45mmol) 用 DMF溶解， 冰水浴下加入 7.5ml DIEA(45mmol)活化后， 加入上述装有树脂 的反应柱中， 反应 2小时后， 加入 100ml无水曱醇封闭 1小时。 用 DMF洗涤 3 次， DCM洗涤 3次， 用无水曱醇封闭 30分钟， 曱醇收缩干燥， 得到 22.34g Fmoc-Gly-CTC树脂， 检测替代度为 0.10mmol/g。
实施例六： 取代度为 0.25mmol/g的 Fmoc-Gly-CTC树脂的合成
称取取代度为 0.95mmol/g的 2-CTC树脂 10g， 加入到固相反应柱中， 用 DMF洗涤 1次，用 DMF溶胀树脂 30分钟后，取 14.11g Fmoc-Gly-OH(47mmol) 用 DMF溶解， 冰水浴下加入 8.0ml DIEA(47mmol)活化后， 加入上述装有树脂 的反应柱中， 反应 2小时后， 加入 100ml无水曱醇封闭 1小时。 用 DMF洗涤 3 次， DCM洗涤 3次，用无水曱醇封闭 30分钟，曱醇收缩干燥，得到 Fmoc-Gly-CTC 树脂， 检测替代度为 0.25mmol/g。
实施例七： 取代度为 0.10mmol/g的 Fmoc-Gly-王树脂的合成
称取取代度为 0.45mmol/g的王树脂 20g， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 1次，用 DMF溶胀树脂 30分钟后，取 13.37g Fmoc-Gly-OH(45mmol)、 6.01g HOBt(45mmol)用 DMF溶解，冰水浴下加入 7.0ml DIC(45mmol)活化后，加入上 述装有树脂的反应柱中， 5分钟后加入 2.75g DMAP(22.5mmol)，反应 2小时后， 用 DMF洗涤 3次， DCM洗涤 3次， 用 100ml醋酸酐 /吡啶封端过夜， 曱醇收缩 干燥， 得到 Fmoc-Gly-王树脂， 检测替代度为 0.10mmol/g。
实施例八： 取代度为 0.25mmol/g的 Fmoc-Gly-王树脂的合成
称取取代度为 0.75mmol/g的王树脂 20g， 加入到固相反应柱中， 用 DMF 洗涤 1次，用 DMF溶胀树脂 30分钟后，取 22.28g Fmoc-Gly-OH(75mmol) , 10.13g HOBt(75mmol)用 DMF溶解， 冰水浴下加入 11.6 ml DIC(75mmol)活化后， 加入 上述装有树脂的反应柱中， 5分钟后加入 4.5g DMAP(37.5mmol)，反应 2小时后， 用 DMF洗涤 3次， DCM洗涤 3次， 用 100ml醋酸酐 /吡啶封端过夜， 曱醇收缩 干燥， 得到 22.54g Fmoc-Gly-王树脂， 检测替代度为 0.25mmol/g。
实施例九： 利拉鲁肽 CTC树脂的制备
称取 4.46g取代度为 0.10mmol/g的 Fmoc-Gly-CTC树脂（lmmol),加入固相 反应柱中， 用 DMF洗涤 1次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-CTC树脂 30分钟后， 用 DMF:吡啶体积比为 4:1的混合溶液脱去 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 6次， 称取 3.24g Fmoc-Arg(Pbf)-OH ( 5mmol )、 0.68g HOBt ( 5mmol )加入体积比为 1:1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下加入 0.8ml DIC ( 5mmol )活化后， 加 入上述装有树脂的反应柱中， 室温下反应 2小时后， 以茚三酮法检测判断反应 终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需要再反应 1 小时， 此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断 反应终点。 重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照利拉 鲁肽主链肽序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc- Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH 、 Fmoc-Gln(Trt)-OH 、 Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH 、 Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 、 Fmoc-Ala -OH、 Boc-His(Trt)-OH的偶联。 其中 Fmoc-Leu-OH和 Fmoc-Phe-OH 偶联时溶剂换为： 选用体积比为 1 :4 的 DMSO 和 DMF 混合溶液； Fmoc-Asp(OtBu)-OH 偶联 时偶联试 剂 换 为 ： PyBOP/HOBt/DIEA； Boc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为： HATU/HOBt/DIEA， 偶联完毕， 将利拉 鲁肽 CTC树脂用 DMF洗涤 3次， DCM洗涤 3次， MeOH洗涤 3次， DCM洗 涤 3次， MeOH洗涤 3次， 抽干得到 9.67g 利拉鲁肽 CTC树脂。
实施例十： 利拉鲁肽王树脂的制备
称取 4.57g ( lmmol )取代度为 0.10mmol/g的 Fmoc-Gly-王树脂， 加入固相 反应柱中， 用 DMF洗涤 1次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-王树脂 30分钟后， 用 DMF:吡啶体积比为 4:1的混合溶液脱去 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 6次，称 取 3.24g Fmoc-Arg(Pbf)-OH ( 5mmol )、 0.68g HOBt ( 5mmol )加入体积比为 1:1 的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下加入 0.8ml DIC ( 5mmol )活化后， 加入 上述装有树脂的反应柱中， 室温下反应 2小时后， 以茚三酮法检测判断反应终 点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需 要再反应 1 小时， 此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反 应终点。 重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照利拉鲁 肽主链肽序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、 Fmoc- Val-OH , Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc- Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH , Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH 、 Fmoc-Gln(Trt)-OH 、 Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Val-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc- Ala -OH, Boc-His(Trt)-OH的偶联。
其中 Fmoc-Leu-OH和 Fmoc-Phe-OH偶联时溶剂换为： 选用体积比为 1:4 的 DMSO 和 DMF 混合溶液； Fmoc-Asp(OtBu)-OH 偶联时偶联试剂换为： PyBOP/HOBt/DIEA; Boc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为： HATU/HOBt/DIEA， 偶联完毕， 将利拉鲁肽王树脂用 DMF洗涤 3次， DCM洗涤 3次， MeOH洗涤 3次， DCM洗涤 3次， MeOH洗涤 3次， 抽干得到 9.78g 利拉鲁肽王树脂。 实施例十一： 利拉鲁肽王树脂的规模化制备
称取 4570g ( lmol )取代度为 0.10mmol/g的 Fmoc-Gly-王树脂， 加入固相 反应柱中， 用 DMF洗涤 1次， 用 DMF溶胀 Fmoc-Gly-王树脂 30分钟后， 用 DMF:吡啶体积比为 4:1的混合溶液脱去 Fmoc保护， 然后用 DMF洗涤 6次，称 取 3240g Fmoc-Arg(Pbf)-OH ( 5mol )、 682g HOBt ( 5mol )加入体积比为 1:1的 DCM和 DMF混合溶液， 冰水浴下加入 800ml DIC ( 5mol )活化后， 加入上述 装有树脂的反应柱中， 室温下反应 2 'J、时后， 以茚三酮法检测判断反应终点， 如果树脂无色透明， 则表示反应完全； 树脂显色， 则表示反应不完全， 需要再 反应 1 小时， 此判断标准适用于后续氨基酸偶联中以茚三酮法检测判断反应终 点。 重复上述脱除 Fmoc保护和加入相应氨基酸偶联的步骤， 按照利拉鲁肽主 链肽序， 依次完成 Fmoc-Gly-OH、 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Trp(Boc)-OH、 Fmoc-Ala-OH、 Fmoc-Ile-OH、 Fmoc-Phe-OH、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH、 Fmoc- Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ala-OH 、 Fmoc-Gln(Trt)-OH 、 Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 、 Fmoc-Leu-OH、 Fmoc-Tyr(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Val-OH、 Fmoc-Asp(OtBu)-OH、 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 Fmoc-Phe-OH 、 Fmoc-Thr(tBu)-OH 、 Fmoc-Gly-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 、 Fmoc-Ala -OH、 Boc-His(Trt)-OH的偶联。 其中 Fmoc-Leu-OH和 Fmoc-Phe-OH 偶联时溶剂换为： 选用体积比为 1 :4 的 DMSO 和 DMF 混合溶液； Fmoc-Asp(OtBu)-OH 偶联 时偶联试 剂 换 为 ： PyBOP/HOBt/DIEA； Boc-His(Trt)-OH偶联时偶联试剂换为： HATU/HOBt/DIEA， 偶联完毕， 将利拉 鲁肽王树脂用 DMF洗涤 3次， DCM洗涤 3次， MeOH洗涤 3次， DCM洗涤 3 次， MeOH洗涤 3次， 抽干得到 9795g 利拉鲁肽王树脂。
实施例十二： 利拉鲁肽粗肽的制备
称取 100g 全保护的利拉鲁肽 CTC 树脂或者利拉鲁肽王树脂， 加入到 lOOOmL的三口圓底烧瓶中， 按 TFA:苯曱硫醚:苯曱醚: EDT=90: 5: 3:2的体积比 配置裂解液 10L， 将裂解液加入上述树脂中， 室温反应 2小时， 过滤， 用少量 TFA洗涤裂解后的树脂 3次， 合并滤液， 浓缩， 将浓缩后的液体加入到冰乙醚 中沉淀 1小时， 离心， 无水乙醚离心洗涤 6次， 真空干燥， 得到利拉鲁肽粗肽 34.13g， 其 HPLC语图如图 3所示， HPLC纯度 83.03%， 粗肽收率 78%。
实施例十三： 利拉鲁肽精肽醋酸盐的制备
称取 3413g 利拉鲁肽粗肽用 50%乙腈 +50%水的混合溶液 30L溶解后， 通 过 C18或 C8柱 2次纯化、 转盐、 冷冻干燥后得到目标产物。 第一次纯化条件： 流动相为： A相： 0.1 %TFA; B相： 乙腈， 检测波长 220nm， 收集目的峰榴分。 第二次纯化条件： 流动相为： A相： 0.3%乙酸； B相： 乙腈。检测波长 220nm， 收集目的峰榴分。 转盐条件： 流动 相： A相： 20mM乙酸铵-水溶液； B相： 乙腈； 检测波长 220nm。 收集目的峰榴分， 旋蒸浓缩， 冻干得到利拉鲁肽醋酸 盐精肽 11.24g，其 HPLC语图如图 4所示， HPLC纯度 99.75%，纯化总收率 40%， 总收率 31%。 其质谱如图 6所示， [M]+: 3751.848, 利拉鲁肽的理论精确分子 量为： 3751.2， 样品质谱结果与理论分子量相符。 以上内容是结合具体的修选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能 认定本发明的具体实施只局限于这些说明。 对于本发明所属技术领域的普通技 术人员来说， 在不脱离本发明构思的前提下， 还可以做出若干简单推演或替换， 都应当视为属于本发明的保户范围。

Claims

权利要求书
1. 一种利拉鲁肽的合成方法， 所述方法步骤如下：
步 骤 1 ， 通 过 液 相 方 法 合 成 赖 氨 酸 三 肽 片 段 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH;
步骤 2， 在活化剂系统的存在下， 由树脂固相载体和 Fmoc-Gly-OH偶联得 到 Fmoc-Gly-树脂；
步骤 3， 通过固相合成法， 按照利拉鲁肽主链肽序依次偶联具有 N端 Fmoc 保 护 且 侧 链保 护 的 氨基 酸 ， 其 中 赖 氨 酸 三 肽 片 段 釆 用 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH;
步骤 4， 裂解， 纯化， 冻干， 得到利拉鲁肽。
2. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征是：
其 中 ， 步 骤 1 所 述 的 固 相 合 成 方 法 ， 所 述 片 段 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH的液相合成步骤为： 正十六烷酸、 HOSu 和 DCC偶联得到 Palmitoyl-OSu， 然后 Palmitoyl-OSu和 H-Glu-OtBu反应得到 二肽片段 Palmitoyl-Glu-OtBu; Palmitoyl-Glu-OtBu、 HOSu 和 DCC 偶联得到 Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu , 然后 Palmitoyl-Glu(OSu)-OtBu和 Fmoc-Lys-OH反应 得到赖氨酸三肽片段 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH。
3. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征是：
其中， 步骤 2所述的固相合成方法， 所述树脂固相载体釆用 2-CTC树脂， 所述活化剂系统选自 DIEA、 TMP 或 NMM， 所述 Fmoc-Gly-树脂为 0.10~0.35mmol/g取代度的 Fmoc-Gly-CTC树脂。
4. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征是：
其中， 步骤 2所述的固相合成方法， 所述树脂固相载体釆用王树脂， 所述 活化剂系统由 DIC、 HOBt 和 DMAP 组成， 所述 Fmoc-Gly-树脂为 0.10~0.35mmol/g取代度的 Fmoc-Gly-王树脂。
5. 根据权利要求 1所述的方法， 其特征是：
其中， 步骤 3所述的固相合成方法包括如下步骤： 1 )釆用由体积比为 1:4 的哌啶和 DMF组成的去保护液脱除 Fmoc-Gly-树脂上的 Fmoc保护基， 得到 H-Gly-树脂；
2 )在偶联剂系统的存在下， H-Gly-树脂和 Fmoc保护且侧链保护的精氨 酸偶联得到 Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-树脂；
3 ) 重复步骤 1 )、 2 ), 按照利拉鲁肽主链肽序依次进行氨基酸的偶联， 其 中赖氨酸三肽片段釆用 Fmoc-Lys-(Glu(Na-Palmitoyl)-OtBu)-OH;
6. 根据权利要求 5所述的方法， 其特征是：
所述偶联剂系统包括缩合剂和反应溶剂， 所述缩合剂选自 DIC/HOBt、 PyBOP/HOBt/DIEA或 HATU/HOBt/DIEA; 所述反应溶剂选自 DMF、 DCM、 NMP、 DMSO或他们之间的任意组合。
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