WO2015099492A1 - 빌리루빈 나노입자, 이의 용도 및 제조방법 - Google Patents

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이용현
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Definitions

  • Bilirubin nanoparticles uses thereof and preparation method [Technical Field]
  • the present invention relates to the use and preparation method of bilirubin nanoparticles thereof.
  • Bilirubin is the yellowish final metabolite formed from heme. Bilirubin has many hydrophilic groups, but is very hydrophobic due to intramolecular hydrogen bonding. Organic solvents other than chloroform and dimethyl sulfoxide cannot dissolve bilirubin, and so is water.
  • bilirubin When bilirubin is not metabolized in the liver, bilirubin is not excreted in vitro and accumulates in places such as the skin. This phenomenon is called jaundice Unlike adults, jaundice of the newborn can have a detrimental effect on the brain. In such cases, phototherapy is used to reduce the level of bilirubin in the body. When light is irradiated to the human body during phototherapy, bilirubin is photoisomerized to break intramolecular hydrogen bonds and ultimately bilirubin becomes a hydrophilic photoi somer and is released to the outside through bile or urine. In addition, during phototherapy, bilirubin produces free radicals from oxygen, which oxidizes bilirubin into colorless oxides that can be released to the outside through urine.
  • bilirubin exhibits antioxidant activity. Upon active oxygen scavenging of bilirubin, the hydrophobic bilirubin can be oxidized to the more hydrophilic compound, bi l iverdin.
  • bilirubin has some interesting properties. The first is photoi somerizat ion. When exposed to blue or longer wavelengths of light, bilirubin becomes a photoisomer, which breaks the intramolecular hydrogen bonds of bilirubin, which eventually becomes a hydrophilic photoisomer. The second characteristic is that bilirubin exhibits photodynamic effects and generates free radicals when stimulated by blue light having the same wavelength but higher intensity. In addition, bilirubin can generate fluorescence while bound to BSA. Finally, bilirubin exhibits strong antioxidant activity capable of scavenging free radicals such as peroxy radicals, hydrogen peroxide, hydroxy radicals and hypochlorous acid.
  • the inventors of the present invention provide fluorescence, photosensitizing, and antioxidant properties. Research efforts have been made to develop nanoparticles that have properties and respond to light or free radicals as stimulants. As a result, hydrophilic blotting was introduced into hydrophobic bilirubin to form bilirubin self-assembly in water, and its drug encapsulation ability, antioxidant capacity and anti-angiogenic capacity; Ability to produce free radicals by exposure to light; Drug release ability through self-assembly degradation by exposure to light or free radicals; And by confirming anticancer and anti-inflammatory activity, the present invention has been completed.
  • Another object of the present invention is to provide bilirubin nanoparticles. Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer.
  • Another object of the present invention to provide a method of treating cancer.
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases (inf lammatory di sease).
  • Still another object of the present invention is to provide a method for treating an inflammatory disease (inf l a atory di sease).
  • Another object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of neovascular diseases.
  • Another object of the present invention to provide a method of treating neovascular diseases.
  • the present invention is bilirubin; And a bilirubin nanoparticle formed by self-assembling a complex including a hydrophilic polymer bound to bilirubin.
  • the present inventors have tried to develop nanoparticles having fluorescence, photosensitizing, and antioxidant properties and reacting to light or free radicals as stimulants.
  • hydrophilic block was introduced into the hydrophobic bilirubin to form a bilirubin self-assembly in the water, its drug encapsulation ability, antioxidant capacity and anti-angiogenic angiogenesis ability; Ability to produce free radicals by exposure to light; Drug release ability through self-assembly degradation by exposure to light or free radicals; And anticancer and anti-inflammatory activity.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention are particles formed by self-assembly of a composite including bilirubin and a hydrophilic polymer bonded thereto, and may be nanoparticles formed by self-assembly in an aqueous system.
  • the bilirubin nanoparticles have a size of 1 nm to 5,000 nm.
  • the size of the bilirubin nanoparticles is 50 nm to 1,000 nm, 50-500 nm in another specific example, 50-300 nm in another specific example.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention enclose a cargo. If the carrier is a hydrophilic material is encapsulated inside the nanoparticles, the hydrophobic carrier can be intergrate in the hydrophobic membrane formed by bilirubin.
  • the term "encapsulation" is used in a broad sense to encompass the collection of a subject.
  • the subject is a drug.
  • the drugs include all hydrophilic drugs, hydrophobic drugs, chemicals and biopharmaceuticals.
  • Such drugs include, for example, anticancer agents, antioxidants, anti-inflammatory agents, analgesics, anti-arthritis agents, sedative agents, anti-inflammatory drugs, antipsychotic drugs, neurostabilizers, anti-anxiety agents, anti-angiogenic inhibitors, immunosuppressants, antiviral agents, Antibiotics, edible inhibitors, antihistamines, hormones, antithrombotic agents, diuretics, antihypertensives, cardiovascular diseases, and vasodilators.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention can eliminate active oxygen.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention can be selectively accumulated in inflammatory tissues and thus can be used to treat inflammation by eliminating the free radicals of inflammatory tissues.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention can be dissociated by light (di sassembled or di srupt ion) to release the encapsulated carrier to the environment.
  • the bilirubin nanoparticles when the nanoparticles of the present invention enclose an anticancer agent, the bilirubin nanoparticles may be selectively accumulated in the tumor tissue, so that the nanoparticles may be exposed by externally irradiated light (eg, blue wavelength light).
  • externally irradiated light eg, blue wavelength light
  • the anticancer agent can be released into cancer tissues, and the anticancer agent can be used to treat cancer.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention may be disrupted by light of 430 nm to 480 nm.
  • the bilitubin nanoparticles of the present invention may be disrupted by light of 620 nm to 680 nm.
  • the bilirubin nanoindenter of the present invention may be released (di sassembled or di srupt ion) by the active oxygen to release the encapsulated object to the environment.
  • the free radicals are free radicals present at the site of cancer or inflammation. Therefore, when the nanoparticles of the present invention enclose an anticancer agent (or anti-inflammatory agent), the nanoparticles are dissolved by the active oxygen present in the cancer (or inflammation) site, thereby releasing the anticancer agent (or anti-inflammatory agent) into the cancer (or inflammation site). It is possible to achieve the therapeutic effect of cancer (or inflammatory disease) by the released anticancer agent (or anti-inflammatory agent).
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention may generate free radicals by light. Therefore, since the bilirubin nanoparticles of the present invention can be selectively accumulated in tumor tissues, cancer can be obtained by generating active oxygen by irradiating light (eg, blue wavelength light) from the outside.
  • light eg, blue wavelength light
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention exhibit anti-angiogenic activity.
  • the hydrophilic polymer is combined with bilirubin to form a complex, which complex functions as a constituent of the bilirubin nanoparticles. Since the bilirubin nanoparticles of the present invention is applied in the body
  • the hydrophilic polymer is preferably biocompatible (0) 1 ⁇ 3 1 ⁇ ).
  • Hydrophilic polymers usable in the present invention include, for example, polyethylene glycol (PEG), poly (acrylic acid), poly (acrylate), poly (acrylamide) (poIy [ acrylamide]), polyvinyl ester], polyvinyl alcohol], polystryene, polyoxide, cellulose
  • hydrophilic polymers that can be used in the present invention include collagen, chitosan, gelatin, acacia gum, dextran, fibrin, hyaluronic acid, pectin, agar, galactomannan, xanthan and alginate. Etc.
  • hydrophilic polymers usable in the present invention include peptides consisting of two or more (eg 2-50) amino acids.
  • the amino acids include natural amino acids as well as non-natural amino acids.
  • Hydrophilic amino acids include glutamine, aspartic acid, glutamic acid, threonine, asparagine, arginine, and serine.
  • Hydrophobic amino acids include phenylalanine ⁇ tryptophan, isoleucine, leucine, plin, methionine, valine, and alanine.
  • Uncoded hydrophilic amino acids include, for example, Cit and hCys. Those skilled in the art can easily synthesize hydrophilic peptides based on this information and peptide synthesis technology, and use them to prepare bilirubin nanoparticles.
  • the range of the hydrophilic polymer includes not only the above-mentioned polymers, but also derivatives thereof.
  • the hydrophilic polymer is polyethylene glycol or derivatives thereof.
  • the polyethylene glycol derivative is, for example Examples include mesospecific PEGCmethoxy polyethylene glycol, succinimide of PEG propionic acid, succinimide of PEG butanoic acid, and branched PEG- NHS.
  • PEG succinimidyl succinate succinimide of carboxymethyl at ed PEG
  • benzotriazole carbonate of PEG PEG-glycidyl ether (PEG -glycidyl ether), PEG- butyloxycarbonyl imidazole (PEG-oxycarbonyl imidazole), PEG-nitrophenyl carbonate (PEG ni trophenyl carbonates), PEG- aldehyde (PEGaldehyde), PEG succinimidyl carboxymethyl the "Hotel's (PEG succinimidyl carboxymethyl ester) and PEG succinimidyl ester.
  • the hydrophilic polymer is bonded to the carboxyl group of bilirubin to form an amphiphilic complex.
  • the hydrophilic polymer has an amine group in the side chain or terminal.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising (a) a pharmaceutically effective amount of bilirubin nanoparticles according to the present invention; And (b) provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the invention provides a method of treating cancer comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention exhibit anti-angiogenic activity and can be used for the prevention and treatment of cancer.
  • the composition of the present invention is a pharmaceutical composition for treating cancer through light stimulation (photodynamic therapy pharmaceutical composition).
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention can be utilized in the treatment of cancer as carriers of light sensitive drugs with fluorescence and photodynamic effects.
  • bilirubin nanoparticles loaded with an anticancer agent when administered parenterally, they accumulate in tumor tissues by the effect of EPR, and when light is irradiated to the tumor tissues from the outside, the hydrophobic layer made of bilirubin becomes hydrophilic Isomers It is converted into a hydrophilic layer to be contained, whereby the nanoparticles disintegrate (disintegrate), thereby releasing anticancer drugs contained in the nanoparticles to tumor tissues, thereby treating cancer.
  • the monomers decomposed from the nanoparticles are combined with albumin to emit fluorescence in the tumor tissue, which enables imaging of the tumor tissue.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention when light of a stronger blue wavelength is irradiated, the bilirubin nanoparticles of the present invention generate free radicals, and anticancer effects can be obtained by the free radicals. Accordingly, the bilirubin nanoparticles of the present invention can be used for photodynamic therapy.
  • Cancers to which the present invention is applicable include, for example, colon cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer, neuroendocrine tumor, lung cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bronchial cancer, nasopharyngeal cancer, laryngeal cancer, gastric cancer, bladder cancer, colon cancer, cervical cancer, Brain cancer, prostate cancer, bone cancer, head and neck cancer, skin cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer and ureter cancer.
  • the subject is a mammal, including a human.
  • the bilirubin nanoparticles enclose an anticancer agent.
  • the invention provides a pharmaceutical composition comprising (a) a pharmaceutically effective amount of bilirubin nanoparticles according to the invention; And (b) provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory diseases (inf la ⁇ atory disease) comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a method for treating an inflammatory disease comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention can be utilized as a R0S sensitive material for the treatment of inflammatory diseases.
  • the anti-inflammatory drug-loading bilirubin nanoparticles administered parenterally into the body can target the inflammation site by the EPR effect.
  • nanoparticles can exhibit anti-inflammatory activity by eliminating abnormal levels of free radicals, while at the same time hydrophobic bilirubin is oxidized to hydrophilic bilivaldine oxide, causing nanoparticles to disintegrate (collapse) or further As oxidation progresses, bilirubin is further decomposed into small compounds, and the nanoparticles disintegrate (disintegrate), thereby releasing drugs contained in the nanoparticles to the site of inflammation, thereby treating the inflammation. Drug release from nanoparticles may also be caused by macrophage uptake.
  • the bilitubin nanoparticles contain an inflammatory disease therapeutic agent.
  • Inflammatory diseases to which the present invention is applicable include, for example, inflammatory bowel disease, atopic dermatitis, edema, dermatitis, allergy, asthma, conjunctivitis, periodontitis, rhinitis, otitis media, atherosclerosis, sore throat, Tonsillitis, pneumonia, gastric ulcer, gastritis, Crohn's disease, colitis, hemorrhoids, gout, spondylitis, rheumatic fever, tupus, fibromyalgia, psoriatic arthritis, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, periarthritis, tendinitis, hay salt, myositis, Hepatitis, cystitis, nephritis, Sjogren's syndrome and multiple sclerosis.
  • the bilirubin nanoparticles are
  • MP0 myeloper oxidase
  • the -phase-Zl-bilvillebinbinnano-inlet-self reduces the level of -induced- -induced cytokines.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising (a) a pharmaceutically effective amount of bilirubin nanoparticles according to the present invention; And (b) provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of angiogenesis-related diseases comprising a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the present invention provides a method for treating angiogenesis-related diseases comprising administering the pharmaceutical composition to a subject in need thereof.
  • the present invention provides a method for inhibiting angiogenesis, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual.
  • angiogenesis-related diseases used in the present invention is a form in which capillary blood vessels invade tissue by vascular endothelial cells from existing blood vessels. It refers to a disease caused by outgrowing vasculature.
  • the angiogenesis-related disease is cancer, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration, rheumatoid arthritis, endometriosis, psoriasis or chronic inflammation.
  • the present invention provides an antioxidant composition comprising the bilirubin nanoparticles of the present invention.
  • the antioxidant composition of the present invention may be implemented as a pharmaceutical composition or cosmetic composition.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to achieve the above pharmacological effect.
  • composition of the present invention is a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutically acceptable carrier is included.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is conventionally used in the preparation, lactose, textose, sucrose, sorbet, manny, starch, acacia rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin calcium silicate, microcrystalline cellol Loose, polyvinylpyridone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include a lubricant, a humectant, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifier, a suspending agent, a preservative, and the like.
  • compositions of the present invention may be parenterally administered, for example intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or topical administration.
  • parenterally administered for example intravenous administration, intraperitoneal administration, intramuscular administration, subcutaneous administration or topical administration.
  • oral administration, rectal administration, hop-in administration, and expense administration are possible.
  • compositions vary depending on factors such as formulation method, mode of administration, age, weight, sex, degree of disease symptom, food, time of administration, route of administration, rate of excretion and reaction response, usually The skilled practitioner can readily determine and prescribe a dosage effective for the desired treatment.
  • compositions of the invention are conventional in the art According to methods readily available to those skilled in the art, they may be prepared in unit dose form or formulated using pharmaceutically acceptable carriers and / or excipients, or may be prepared in a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension or emulsion in oil or aqueous medium, and may further comprise a dispersant or stabilizer.
  • the present invention comprises the steps of ( a ) combining the hydrophilic polymer with bilirubin to prepare a bilirubin-hydrophilic polymer composite; (b) dissolving the bilirubin-hydrophilic polymer complex in chloroform or dimethyl sulfoxide; (c) removing the chloroform or dimethyl sulfoxide to form a bilirubin-hydrophilic polymer composite film layer; And (d) treating the film layer with a hydrophilic solvent to sel f-assemble the bilirubin nanoparticles.
  • FIG. 1 Each process of the manufacturing method is shown in FIG. 1
  • the present invention provides bilirubin nanoparticles formed by self-assembly of an amphiphilic composite comprising bilirubin and a hydrophilic polymer, a use thereof, and a preparation method thereof.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention can be released by stimulating light or reactive oxygen stimulus to the inside encapsulated.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention exhibit antioxidant activity, anti-angiogenic activity, anticancer activity and anti-inflammatory activity.
  • the bilirubin nanoparticles of the present invention have fluorescence.
  • FIG. 2 shows the UV spectrum results of PEG-BR.
  • FIG. 3 shows the ⁇ ⁇ results of PEG-BR.
  • Figure 4 shows the synthesis of bilirubin nanoparticles (BRNVs) according to the present invention.
  • Figure 5 shows the size of the bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • Figure 6 shows the zeta potential of the bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • 7 shows SEM and TEM images of bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • Figure 8 shows the critical micelle concentration of bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • 9 shows the stability of bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • 10 shows the antioxidant activity of bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • FIG. 11 shows the R0S-reflective decay of bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • Figure 13 shows the hydrophilic drug loading efficiency and drug loading efficiency of bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • 17A to 17D show fluorescence characteristics during particle formation and decomposition of bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • Figure 20 shows endocytosis upon laser irradiation of doxorubicin-loaded bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • Figure 21 shows the results of toxicity evaluation of bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • bilirubin nanoparticles according to the present invention can protect cells from free radicals.
  • Figure 23 is a cell shape image showing that bilirubin nanoparticles according to the present invention can protect cells from free radicals.
  • Figure 25a shows the anticancer activity of the doxorubicin loading bilirubin nanoparticles according to the present invention and at the same time shows the difference of anticancer activity with or without laser.
  • Figure 25b shows the anticancer activity of the dodetaxal loading bilirubin nanoparticles according to the present invention and at the same time shows the difference of anticancer activity with or without laser.
  • Figure 26 shows the anti-angiogenic activity of bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • 28 is a graph showing the weight change of the normal control group, inflammatory control group and bilirubin nanoparticle administration group in the experiment using the IBD animal model.
  • 29 is a photograph and a graph showing colon length of a normal control group, an inflammatory control group, and a bilirubin nanoparticle-administered group in an experiment using an IBD animal model.
  • FIG. 30 is a colon tissue image and inflammation score graph of the normal control group, inflammatory control group and bilirubin nanoparticle administration group in the experiment using IBD animal model.
  • Figure 31a is a graph showing the MP0 activity of the normal control group, inflammatory control group and bilirubin nanoparticle administration group in the experiment using the IBD animal model.
  • FIG. 31B and 31C are graphs showing the levels of normal control, inflammatory control and bilirubin nanoparticle-administered groups and pro-inflammatory cytokine in experiments using IBD animal models.
  • FIG. 32A shows that in the animal model without inflammation, lower fluorescence values were observed in the liver than in the IBD animal model. And after the bilirubin nanoparticles selectively accumulate in IBD inflammation, it is an image showing the release of ICG by R0S.
  • 32B is H & E image of liver of IBD animal model and normal group.
  • Figure 33 shows the anticancer activity of bilirubin nanoparticles and doxorubicin-loaded bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • Figure 34 shows the body weight change according to the administration of bilirubin nanoparticles according to the present invention.
  • PEG-BR (5 mg) was dissolved in chloroform (200 ⁇ ) ⁇ , dried under nitrogen gas vapor and further dried in vacuo to form a film layer.
  • phosphate PBS 150 mM NaCl, 10 mM phosphate, pH 7.4 was added to the film layer.
  • PEGylated bilirubin nanoparticles (BRNVs) with even sizes were produced.
  • BRNVs prepared by DLS (Dynamic Light Scattering) detection and zeta potential analysis were analyzed and visual evidence of particle formation was obtained through scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM).
  • Nanoparticle critical micelle concentrations were measured. Specifically, film layers were formed using various amounts of PEG-BR, and 1 ml of phosphate PBSCL50 mM NaCl, 10 mM phosphate, pH 7.4) was added to the film layer to form nanoparticles. Next, the nanoparticles formed in each group were confirmed by dynasc lightning scattering (DLS).
  • DLS dynasc lightning scattering
  • the size of the BRNVs was measured with a DLS zetasizer every 8 days.
  • BRNVs dissolved in DPBS were converted into 100 mM peroxide generating reagent PH (2, 2-azobi s (2-am idi nopr opane) di hydrochloride, sigma—aldr ich Incubated at a temperature of 37 ° C).
  • UV / Vi s spectrometers or DLS were used to measure UV / Vi s spectra or size of BRNVs at 0, 10 and 60 minutes following exposure to various concentrations of peroxide.
  • the reaction was monitored by measuring the absorbance at 453 and 650 nm with a spectrophotometer at 37 ° C.
  • doxorubicin D0X
  • 3 mg PEG-BR film was hydrated with 300 / g of doxorubicin, phosphate PBSC 150 mM NaCl, 10 mM phosphate, pH 7.4.
  • free doxorubicin was removed by gel filtration using a Sephadex CL-4B column (sigma-aldr i ch) equipped with 20 mM HEPES-buffer 5% glucose (HBG). .
  • a total of 20 2 mi fractions were collected, each solution was lyophilized and then 200 ⁇ of asotonitrile was added to the residue. Doxorubicin fluorescence of each fraction was measured with a fluorophotometer.
  • hydrophobic drug dosetaxel, DTX
  • 400 / g of DTX and 3 mg of PEG-BR were dissolved in chloroform, dried under nitrogen gas vapor and further dried in vacuo to consist of PEG-BR and DTX.
  • a film layer was formed.
  • the film layer was hydrated with phosphate PBSU 50 mM NaCl, 10 mM phosphate, pH 7.4).
  • Free DTX was briefly removed by centrifugation (8,000 rpm, 5 minutes) and filtration using a membrane filter (0.45 / dl) and a supernatant containing DTX loaded BRNVS was used.
  • Encapsulation efficiency and drug loading efficiency were calculated by the following equation.
  • Inclusion Efficiency (3 ⁇ 4) Weight of Drug in BRNVs / Weight of Initially Provided Drug X
  • Drug loading efficiency (%) weight of drug in BRNVs / (weight of drug in BRNVs + weight of PEG-BR initially provided) X 100% drug release by light exposure
  • Drug release experiments were performed of docetaxel-loaded BRNVs (DTX @ BRNVs) in PBS buffer using the extraction method.
  • DTX @ BRNVs (l mg / mi, DTX loading rate 10%) were aliquoted equally into four microtubes. 450 micrometers of light (10 mW / cm ⁇ 2> , 10hz) or 650 nm of light (80mWVcm ⁇ 2> ) was irradiated to this micro-louve.
  • DOX @ BRNVs DOX @ BRNVs
  • DOX @ BR Vs l mg / ml, 10% D0X loading rate
  • 450 nm (10 mW / cm 2 , 10 hz) or 650 nm (90 mW / cm 2 ) was irradiated to D0X @ BRNVs.
  • the amount of D0X emitted from the solution was monitored by .fluorescence emission at ⁇ nm 3550 nm with 4800 nm excitation.
  • BRNVs solution (2 mg / ml) with or without 0.5% Triton-X was prepared and loaded into a 96-well black plate. Fluoromax emission spectrum Recorded by fluorometer. The solution was excited at 450 nm, the emission was measured and then integrated from 530 nm to 800 nm (cut off: 515 nm). The solution was excited at 650 nm, the emission was measured and then integrated from 680 nm to 800 nm (cut off: 690 nm). Cell culture
  • Mammalian CH ()-K1 cells were humidified to 37 ° C in RPMI1940 medium with 103 ⁇ 4 (v / v) heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), 100 IU / m ⁇ penicillin and L-glutamine 5% Cultured under C0 2 conditions, A549 cells were cultured in a humidified 5% C0 2 condition at a temperature of 37 ° C in Ham's F-12K medium supplemented with 10% FBS.
  • Endothelial eel 1 line human vascular endothelial eel Is (HUVECs) were incubated in EGM2 medium (Lonza) at a humidified 5% C0 2 condition at 37 ° C. Confocal Microscopy
  • D0X (5 ug / ml), BRNVs (20 ⁇ g / ml), D0X @ BRNVs (D0X; 5 ug / ml, BRNVs; 20 pg / ml) or D0X @ BRNVs (D0X; 5 g / ml) ml, BRNVs; 20 g / ml) + 650 nm of light (5 min, 90 mW / cm 2 ) were treated at 37 ° C. for 4 h.
  • A549 cells (0.7 ⁇ 10 3 / well, 96 well plates) were incubated for 24 hours at 37 ° C. in the medium, after removing the medium, cells were fresh medium (control), D0X (5 ug / ml), D0X @ BRNVs (DOX; 5 ug / ml, BRNVs; 20 g / ml), D0X @ BRNVs (D0X; 5 ug / ml, BRNVs; 20 Ug / ml) + light at 650 nm (5 minutes, 90 mW / cm 2 ) or BRNVs (20 pg / ml) were treated and incubated for 15 hours.
  • HUVEC cells (7.5 ⁇ 10 wells) in EBM-2 culture medium added with VEGFC20 ng / ml), BRNVs (25 g / ml) or VEGF (20 ng / ml) + BRNVs (2.5 ug / ml or 25 yg / ml) ) was placed on top of the Matrigel. After incubation at 37 ° C. overnight, the cells were washed with DPBS and observed by fluorescence microscopy. Animal care
  • mice Female C57BL / 6 mice (6 weeks old, 17-20 g, Orient bio, seoul, korea),
  • D0X (4 mg / ml), BRNVs (40 mg / kg) or D0X @ BRNVs (D0X; 4 mg / kg, BRNVs; 40 mg / kg) through tail blood vessels in ICR mice (6 weeks of age, 25 g).
  • Me0H 100 f was added to the serum and centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes. Free D0X in the sample was confirmed by HPLC.
  • BRNVs were identified by UV / Vis spectroscopy at a wavelength of 450 nm. Anti-inflammatory effect evaluation
  • mice Five C57BL / 6 mice were bred per cage and roamed for a week before entering the experiment. Mice were given water supplemented with 3.53 ⁇ 4 (w / v) DSS (25,000 Daltons; Tokyo Industry Chemicals) for 5 days and then water for 10 days. Control healthy mice received only water. Mice were observed daily and weight changes were investigated. On day 1, the BRNVs (125 mg / kg) — 3 ⁇ 4_E3 ⁇ 4S — of 100 ⁇ were taken to the day 1: to-to-reversed. The mouse was sacrificed and the entire colon was excised. Colon length was measured and washed with PBS.
  • distal colon 1 cm was fixed in 4% (v / v) buffer formalin and 70% (v / v) alcohol and paraffin embedded. Tissue sections of distal colon were then prepared and H & E stained. The colon was analyzed histologically using a microscope. Severity was scored according to previously reported methods (Garrett Ws et al (Cell 2010), Xiao-Dong Li et al (PNAS 2011)).
  • 0 normal
  • 1 hyperproliferation, abnormal crypts and goblet cell loss
  • 2 crypt loss between hardness and severity (10-50%)
  • 3 severe crypt loss (50-90%)
  • 4 complete crypt loss, surface epithelium intact
  • MPOCmyeloper oxidase activity and concentrations of IL-1 ⁇ , IL-6, IFN- ⁇ and TNF- ⁇ were measured.
  • MP0 activity was measured according to a previously reported method (Wi lson et al. Nature materials 2010), briefly to confirm MP0 activity, colon fragments were l: 10 containing 0.5% nucleodecyl ammonium bromide. w / v) was stirred at a temperature of 4 ° C. in phosphate buffer (pH 6.0). After sonication for 10 seconds, freeze thawing was performed three times, and each sample was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes.
  • DSS induced mouse colitis model C57BL / 6 mice and healthy mice as controls were prepared by the method described above.
  • ICG was loaded into BRNVS. Specifically, on day 5, 100 ⁇ ICG @ BRNVs (ICG; 17 y g, BRNVs; 340 y g) were intravenously administered to mice. Six hours later, the mice were regenerated and their major organs (large intestine, kidney, liver, spleen, lung and heart) were collected. Fluorescence intensities of the major organs from each group were confirmed using an in vivo imaging system (5 second exposure time) and ICG filter channels. Anticancer activity evaluation
  • Tumor xenograft mouse models with tumors with a tumor volume of at least 80-120 mm 3 were prepared by subcutaneous injection of the A549 tumor cell line (1 ⁇ 10 6 ) into the dorsal flank of 6 week old female BALB / c nude mice.
  • mice with tumors Randomly divided into four groups (day 0), minimizing the difference in weight and tumor size, and then in each group D0X (2 mg / kg), BRNVs (20 mg / kg), D0X @ BRNVs (D0X; 2 mg / kg, BRNVs; 20 mg / kg), D0X @ BRNVs (D0X; 2 mg / kg, BRNVs; 20 mg / kg) + light at 650 nm (irradiation for 30 minutes after 5 min administration, 200 mW / cm 2 ), Or DPBS (control) was administered I.V at predetermined times (0, 3, 6, 9, 12 days). On each day, the tumor volume of each group was measured using vernier calipers. Tumor volume was calculated by the formula "(length X width X height) / 2 '".
  • mice Toxicity assessments were performed using healthy mice or DSS induced colitis mice (6 week old, C57 / BL6 female mice).
  • BRNVs 150 mg / ml
  • PBS PBS
  • tumor-bearing nude mice were prepared by subcutaneously injecting A549 tumor cell lines (1 ⁇ 10 6 ) into the dorsal flanks of 6-week old female BALB / c nude mice. Three weeks later, BRNVs (25 mg / kg) or PBS as a control was injected intravenously into the tail of nude mice. After 24 hours, each group of nude mice was sacrificed, major organs (liver, heart, spleen, kidneys and lungs) and tumors were collected, and an in vivo imaging system (IVIS) was used to obtain optical images of the major organs and tumors of each group. Obtained. Optical images were obtained using a 5 second exposure time and GFP filter channel.
  • IVIS in vivo imaging system
  • BRNVs were prepared. PEG-BR was dissolved in chloroform and then dried under a vapor of nitrogen gas, further dried in vacuo to form a film layer, PBS was added to the film layer and sonicated for 10 minutes to prepare BRNVs (FIG. 4). .
  • nanoparticles were formed from PEG-BR standard 100 nM (0.5 u g / ml) or more.
  • the encapsulation capacity of the hydrophilic and hydrophobic drugs of PEG-BR nanoparticles was investigated.
  • the hydrophilic drug was first dissolved in water and then the solution was poured into a vial containing a PEG-BR film layer. After nanoparticle formation, the free hydrophilic drug and PEG were removed by column separation. As a result, the encapsul at ion ef f i c ency was about 100%, and the drug loading percent age was confirmed up to 9.09% (FIG. 13).
  • the hydrophobic drug and PEG-BR were dissolved in chloroform, the chloroform was evaporated to obtain a film layer consisting of PEG—BR and a hydrophobic drug, and then the film layer was hydrated with PBS buffer to nano Enclosed in particles. Non-enclosed drugs were removed by precipitation and filtration. As a result, the loading efficiency was 69.8%, and the drug loading ratio was confirmed up to 8.53 ⁇ 4 (Fig. 14).
  • the drug released from BRNVs was measured using extraction during 450 nm laser irradiation. After laser irradiation, the released drug was observed in 1 minute, and about 1003 ⁇ 4) of drug was released in 5 minutes (FIGS. 15 and 16).
  • the inventors have determined that BRNVs can be resolved not only by 450 nm light (blue light), but also by 650 nm light (red light), so that the drug is released from BRNVs using extraction during 650 nra laser irradiation. was measured. As a result, the drug was released in 1 minute after laser irradiation, and the drug was released in 5 minutes. Completed (FIGS. 15 and 16). The above results support that BRNVs can be degraded by both blue and red light, thereby releasing the encapsulation drug. Fluorescence Measurement of BRNVs
  • Fluorescence of the BRNVs was measured. If nanoparticles are formed, the fluorescence of the bilirubin layer of BRNVs will self-quench. As a result of the measurement, as shown in FIGS. 17A to 17D, when the nanoparticles were formed and when the nanoparticles were collapsed, it was confirmed that they had fluorescence at excitation wavelengths of 450 and 650 nm. ROS generation performance of BRNVs by light irradiation
  • BRNVs were introduced into cells, and as shown in FIG. 20, D0X @ BRNVs transferred doxotubine to the nucleus as much as free doxorubicin enters the cell nucleus by the release of doxorubicin effectively during laser irradiation. It was shown to pass. This trend appears to decrease when D0X @ BRNVs are not exposed to the laser.
  • BRNVs showed no toxicity.
  • BRNVs showed a cytoprotective effect by effectively removing the R0S.
  • 24 shows that the color of the nanoparticles becomes transparent when BRNVs remove R0S and save cells. When nanoparticles remove R0S, they show the nanoparticles collapse at the same time. This shows that if a drug is contained, it can release the drug.
  • D0X @ BRNVs showed anticancer activity, and when D0X @ BRNVs were not exposed to 650 nm laser, doxorubicin delivery was slow as nanoparticles did not effectively uptake. This did not show anticancer activity as free D0X. However, when treated with 650 nm laser for 5 minutes immediately after treatment with D0X @ BRNVs, it effectively released D0X and showed anticancer activity as free D0X.
  • the tube formation was less when the BRNVs were treated together than the VEGF treatment, and these results show that the BRNVs have anti-angiogenic activity.
  • BRNVs The anti-inflammatory effect of BRNVs was confirmed in humans using the IBD model. Body weights were measured during the in vivo test. Regenerated and colon collected. Next, the distal sect ion of the colon was dissected, a histological sample was prepared, and the colonic damage score was evaluated. As a result, significant weight loss was observed in the inflammatory control group at 5 days, but no weight loss was observed in the BRNVs group for 10 days as in the normal control group (FIG. 28). In addition, the colon length of the inflammatory control group was short, but the colon length of BRNVs was normal as in the normal group (FIG. 29). In addition, in the H & E image of FIG.
  • the normal control group has a well-organized colon epithelial tissue, which is well formed with crypts in the mucosal layer, and furthermore, in the mucosa, submucsa, muscle and mucosal layers.
  • the intestinal tissue of the BRNVs group showed a similar appearance to the intestinal tissue of the normal control group (well organized mucosal layer, non-infiltration of immune cells).
  • colonic epithelial injury scores were scored in total 6 points, mucosal immune cell infiltration was scored in total, submucosal immune cell infiltration was scored in total, muscle / mastococcal immune cell infiltration was scored in total, and colon damage was scored in total.
  • the intestinal tissue of the group treated with BRNVs was confirmed to be lowered in the salinity of _salt_increase-significantly-significantly (Fig. 30).
  • MP0 activity and cytokines associated with inflammation were also identified.
  • MP0 activity and IL-1 ⁇ , IL-6, TNF- ⁇ , IFN- ⁇ levels were found to be high in the inflammatory group, but decreased to normal tissue levels in the BRNVs treated group (Figs. 31A-31C).
  • the first is that the nanoparticles themselves may have migrated to the liver.
  • the fourth is ICG-loaded nanoparticles reach the inflamed site of the colon through leaky capillaries of the colon, where ICG is rapidly released by R0S, which is present in the submucosa of the colon, and then through the portal vein. It may have been reached and released into the liver.
  • the first and second cases are theoretically inconsistent because low fluorescence values are observed in the liver in animal models where no inflammation has occurred (FIG. 32A).
  • the third explanation, as shown in the H & E image, is not correct because no inflammation occurred in the liver DSS inflammation model (FIG. 32B). Therefore, the fourth interpretation is considered to be the most appropriate. That is, the experimental results show that bilirubin nanoparticles (BRNVs) release ICG by R0S after selectively reaching inflammatory tissues.
  • BRNVs bilirubin nanoparticles

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Abstract

본 발명은 빌리루빈과 친수성 고분자를 포함하는 복합체가 가자-조립하여 형성된 빌리루빈 나노입자, 이의 용도 및 제조방법을 제공한다. 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 빛 또는 활성산소 자극에 의하여 와해됨으로써 내부에 봉입한 약물을 외부로 방출시킬 수 있다. 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 항산화 활성, 항-신생혈관형성 활성, 항암 활성 및 항염 활성을 나타낸다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
빌리루빈 나노입자， 이의 용도 및 제조방법 【기술 분야】
본 발명은 빌리루빈 나노입자 이의 용도 및 제조방법에 관한 것이다.
【배경 기술】
나노기술의 급격한 발전과 함께 외부 혹은 내부 자극에 의하여 분해 (disassembled)될 수 있으나， 자극이 없으면 안정한 폴리머성 바이오소재 (biomaterial )에 대한 관심이 높아지고 있다. pH, 특정 효소， 온도， 초음파， 활성산소 및 빛과 같은 다양한 내외부 자극에 대한 연구가 이루어지고 있다. 이중에서， 광 자극은 짧은 시간 동안 원격으로 적용할 수 있고， 공간적 및 시간적으로 높은 정확성을 갖는다는 점에서 매력적인 자극원이다. 또한， 염증 부위에서의 비정상적인 활성산소의 수준은 염증 부위 특이적 촉발 자극원 (triggering st imulus)으로서 이용될 수 있다.
나아가 나노입자를 이용한 염증 질환과 같은 질병 치료에 대한 관심이 높아지고 있다. R0S는 염증성 질환 질환의 발병 부위에 존재하며， 질환의 경과와 밀접하게 관련되어 있다. 그러므로, 항염증 효과를 갖는 다양한 치료용 나노입자가 심혈관 질환, 뇌종중， IBD와 같은 다양한 질환의 치료 목적으로 개발되었다. 또한， 감광성 (photosensit izing) 효과를 갖는 나노입자를 이용한 암 치료방법이 개발되고 있다. 이에 더하여, 나노입자를 사용하여 이미징과 치료를 동시에 할 수 있는 테라그노시스 (theragnosis)가 맞춤형 의료 (personal ized medicine)를 통한 최적의 치료 수단으로 각광받고 있다.
빌리루빈은 헴 (heme)으로부터 형성된 노르스름한 최종 대사산물이다. 빌리루빈은 많은 친수성 그룹을 가지지만， 분자 내 수소결합으로 인하여 매우 소수성이다. 클로로포름과 디메틸설폭사이드 외의 유기용매는 빌리루빈을 용해시킬 수 없으며, 물도 마찬가지이다.
빌리루빈이 간에서 대사되지 못하는 경우， 빌리루빈은 체외로 배출되지 못하여 피부와 같은 곳에 축적된다. 이러한 현상을 황달이라고 하는데， 어른의 경우와 달리 신생아 황달은 뇌에 해로운 영향을 줄 수 있다. 이러한 경우， 체내의 빌리루빈의 수준을 감소시키기 위하여 광 치료 (phototherapy)가 이용된다. 광 치료 시 빛이 인체에 조사되면， 빌리루빈은 광이성질체화 (photoisomerized)되어 분자 내 수소결합이 깨지고 궁극적으로 빌리루빈은 친수성의 광이성질체 (photoi somer)가 되어 담즙 또는 소변을 통하여 외부로 배출된다. 또한, 광 치료 동안 빌리루빈은 산소로부터 활성산소를 생성시키며, 이 활성산소는 빌리루빈을 소변을 통하여 외부로 배출될 수 있는 무색의 산화물로 산화시킨다.
또한， 빌리루빈은 항산화 활성을 나타낸다. 빌리루빈의 활성산소 소거 시, 소수성의 빌리루빈은 더 친수성의 화합물인 빌리벌딘 (bi l iverdin)으로 산화될 수 있다.
따라서， 빌리루빈은 몇 가지 흥미로운 특성을 가지고 있다. 첫 번째 특성은 광이성질체화 (photoi somerizat ion) 특성이다. 청색 혹은 이보다 더 긴 파장의 빛에 노출되는 경우, 빌리루빈은 광이성질체화되며， 이는 빌리루빈의 분자 내 수소결합을 파괴시켜 결국 빌리루빈은 친수성의 광이성질체가 된다. 두 번째 특성은, 빌리루빈이 파장은 같으나 강도가 더 높은 청색 빛에 의하여 자극되는 경우 광역동 효과 (photodynamic effects)를 나타내어 활성산소 # 발생시킨다는 점이다. 또한， 빌리루빈은 BSA에 결합되어 있는 동안에 형광을 발생시킬 수 있다. 끝으로， 빌리루빈은 과산화기 (peroxy radical ) , 과산화수소， 하이드록시 라디칼 (hydroxy radical ) 및 차아염소산 (hypochlorous acid)과 같은 활성산소를 소거 (scavange)할 수 있는 강력한 항산화 활성을 나타낸다. 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 형광 특성, 감광성 (photosensi t izing) 특성, 항산화 특성을 가지며， 자극원으로서 빛 또는 활성산소에 반응하는 나노입자를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과， 소수성의 빌리루빈에 친수성 블톡을 도입하여 수계에서 빌리루빈 자기조립체를 형성하도특 하였으며， 이의 약물 봉입 능력, 항산화 능력 및 항-신생혈관형성 능력; 빛 노출에 의한 활성산소 생성 능력; 빛 또는 활성산소 노출에 의한 자기조립체 와해를 통한 약물 방출 능력; 및 항암 및 항염증 활성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서， 본 발명의 목적은 빌리루빈 나노입자를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는떼 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 암의 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 염증성 질환 ( inf lammatory di sease)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 염증성 질환 ( inf l a瞧 atory di sease)의 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 신생혈관 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 신생혈관 관련 질환의 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항산화 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 빌리루빈 나노입자의 제조방법을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면， 본 발명은 빌리루빈; 및 상기 빌리루빈에 결합된 친수성 고분자를 포함하는 복합체가 자기 -조립 (sel f- assembled)하여 형성된 빌리루빈 나노입자를 제공한다. 본 발명자들은 형광 특성， 감광성 (photosensi t izing) 특성, 항산화 특성을 가지며， 자극원으로서 빛 또는 활성산소에 반응하는 나노입자를 개발하기 위하여 연구 노력하였다. 그 결과, 소수성의 빌리루빈에 친수성 블록을 도입하여 수계에서 빌리루빈 자기조립체를 형성하도록 하였으며, 이의 약물 봉입 능력, 항산화 능력 및 항ᅳ신생혈관형성 능력; 빛 노출에 의한 활성산소 생성 능력; 빛 또는 활성산소 노출에 의한 자기조립체 와해를 통한 약물 방출 능력 ; 및 항암 및 항염증 활성을 확인하였다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 빌리루빈 및 이에 결합된 친수성 고분자를 포함하는 복합체가 자기- 조립하여 형성된 입자로서, 수계에서 자기-조립하여 형성된 나노입자일 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 빌리루빈 나노입자는 1 nm 내지 5 , 000 nm의 크기를 갖는다. 하나의 특정예에서, 상기 빌리루빈 나노입자의 크기는 50 nm 내지 1 , 000 nm이고， 다른 특정예에서는 50-500 nm이며， 또 다른 특정예에서는 50-300 nm이다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 운반대상 (cargo)을 봉입하고 있다. 운반대상이 친수성 물질인 경우 나노입자의 내부에 봉입되며， 소수성의 운반대상은 빌리루빈이 형성한 소수성 막 내에 포집 ( intergrate)될 수 있다. 따라서, 본 명세서에서, 용어 "봉입"은 운반대상의 포집을 포함하는 넓은 개념으로 사용된다.
하나의 특정예에서, 상기 운반대상은 약물이다. 상기 약물에는 친수성 약물, 소수성 약물， 화학약물 및 바이오약물이 모두 포함된다. 이러한 약물로는， 예를 들면, 항암제， 항산화제, 항염증증제， 진통제， 항관절염제, 진정제， 항우을증제, 항정신병 약물， 신경안정제, 항불안제, 항혈관신생 억제제， 면역억제제， 항바이러스제, 항생제， 식용억제제, 항히스타민제， 호르몬제， 항혈전제， 이뇨제， 항고혈압제， 심혈관질환 치료제 및 혈관 확장제 등을 들 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 활성산소를 소거할 수 있다. 하기 실시예에서 확인된 바와 같이， 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 염증조직에 선택적으로 축적될 수 있으므로 염증조직의 활성산소를 소거함으로써 염증을 치료하는 데 사용할 수 있다. 본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 빛에 의하여 와해 (di sassembled or di srupt ion)되어 봉입된 운반대상을 주위로 방출시킬 수 있다.
하나의 특정예에서, 본 발명의 나노입자가 항암제를 봉입하는 경우, 빌리루빈 나노입자는 종양 조직에 선택적으로 축적될 수 있으므로， 외부에서 조사하는 빛 (예컨대, 청색파장의 빛)에 의하여 나노입자가 와해됨으로써 암 조직으로 항암제를 방출할 수 있고, 방출된 항암제에 의하여 암 치료효과를 거둘 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 430 nm 내지 480 nm의 빛에 의하여 와해될 수 있다.
본 발명의 다른 일구현예에 따르면， 본 발명의 빌리투빈 나노입자는 620 nm 내지 680 nm의 빛에 의하여 와해될 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 나노압자는 활성산소에 의하여 와해 (di sassembl ed or di srupt ion)되어 봉입된 운반대상을 주위로 방출시킬 수 있다.
하나의 특정예에서， 상기 활성산소는 암 또는 염증 부위에 존재하는 활성산소이다. 따라서， 본 발명의 나노입자가 항암제 (또는 항염증제)를 봉입하는 경우, 암 (또는 염증) 부위에 존재하는 활성산소에 의하여 나노입자가 와해됨으로써 암 (또는 염증 부위)로 항암제 (또는 항염증제)를 방출할 수 있고, 방출된 항암제 (또는 항염증제)에 의하여 암 (또는 염증성 질환)의 치료효과를 거둘 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 빛에 의하여 활성산소를 발생시킬 수 있다. 따라서， 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 종양 조직에서 선택적으로 축적될 수 있으므로， 외부에서 빛 (예컨대, 청색파장의 빛)올 조사하여 활성산소를 발생시킴으로써 암 치료효과를 얻을 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 항- 신생혈관형성 활성을 나타낸다.
본 발명에 따르면， 상기 친수성 고분자는 빌리루빈과 결합되어 복합체를 형성하며, 이 복합체는 빌리루빈 나노입자의 구성성분으로서 기능한다. 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 체내에 적용되기 때문에 상기 친수성 고분자는 생체적합성( 0 )1叩3 1^ )임이 바람직하다.
본 발명에서 사용 가능한 친수성 고분자로는， 예를 들면， 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리 (아크릴산) (poly[acrylic acid]), 폴리 (아크릴산염) (polytacrylate]), 폴리 (아크릴아마이드) (poIy[acrylamide] ) , 폴리 (비닐에스테르) (polyvinyl ester]), 폴리 (비닐알콜) (polyvinyl alcohol]), 폴리스티렌 (polystryene), 폴리옥사이드 (polyoxide) , 셀롤로오스
(cellulose), 전분 (starch), 폴리다당류 (polysaccharide) , 폴리 일렉트로라이트 (polyelectrolyte), 폴리 (1-니트로프로필렌) (poly[l-nitro propylene]), 폴리 (N-비닐피를리돈 )(poly[N-vinyl pyrrol i done] ) , 폴리 비닐아민 (poly[vinyl amine]), 폴리 (베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트) (Polytbeta-hydroxyethylmethacrylate] ) , 폴리에틸렌 옥사이드
(Polyethyleneoxide), 폴리 (에틸렌옥시드 -b-프로필렌 옥사이드
(Polytethylene oxide— b— propylene oxide]) 및 폴리라이신 (Polylysine) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용 가능한 친수성 고분자의 또 다른 예로는， 콜라겐， 키토산， 젤라틴， 아카시아 검， 덱스트란， 피브린, 히알루론산, 펙틴, 아가 (agar), 갈락토만난 (Galactomannan)， 잔탄 (Xanthan) 및 알지네이트 등이 있다.
본 발명에서 사용 가능한 친수성 고분자의 또 다른 예로는, 2개 이상 (예컨대 2-50개)의 아미노산으로 이루어진 펩티드 등이 있다. 상기 아미노산에는 천연형 아미노산뿐만 아니라, 비천연 아미노산도 포함된다. 친수성 아미노산에는 글루타민， 아스파라긴산, 글루탐산, 트레오닌, 아스파라긴, 아르기닌, 세린 등이 있으며， 소수성 아미노산에는 페닐알라닌ᅳ 트립토판, 이소류신, 류신， 프를린, 메티오닌, 발린, 알라닌 등이 있다. 비코드화된 친수성 아미노산은， 예를 들어, Cit 및 hCys 등이 있다. 당업자는 이러한 정보와 펩타이드 합성기술을 바탕으로 친수성의 펩티드를 용이하게 합성하여 빌리루빈 나노입자의 제조에 사용할 수 있다.
상기 친수성 고분자의 범위에는, 위에서 언급한 고분자뿐만 아니라, 이들의 유도체도 포함된다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 유도체이다. 상기 폴리에틸렌 글리콜 유도체는， 예를 들면, 메특시 PEGCmethoxy polyethylene glycol ) , PEG 프로피론산의 숙시니미드 (succinimide of PEG propionic acid) , PEG 부타논산의 숙시니미드 (succinimide of PEG butanoic acid) , 가지달린 PEG- HNS(branched PEG-NHS) , PEG 숙시니미딜 숙시네이트 (PEG succinimidyl succinate) , 카복시메틸화 PEG의 숙시니미드 (succinimide of carboxymethyl at ed PEG) , PEG의 벤조트리아졸 카보네이트 (benzotriazole carbonate of PEG) , PEG-글리시딜 에테르 (PEG-glycidyl ether) , PEG- 옥시카보닐이미다졸 (PEG-oxycarbonyl imidazole) , PEG 니트로페닐 카보네이트 (PEG ni trophenyl carbonates) , PEG-알데히드 (PEGaldehyde) , PEG 숙시니미딜 카르복시메틸 에'스테르 (PEG succinimidyl carboxymethyl ester ) 및 PEG숙시니미딜에스테르 (PEG succinimidyl ester) 등을 들 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 친수성 고분자는 빌리루빈의 카르복실기에 결합되어 양친매성 복합체를 형성한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 친수성 고분자는 측쇄 또는 말단에 아민기를 갖는다. 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 치료가 필요한 개체 (subject )에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 빌리루빈 나노입자는 항-신생혈관형성 활성을 나타내는바， 암의 예방 및 치료에 이용할 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 조성물은 광 자극을 통한 암 치료용 약제학적 조성물이다 (광역동 치료용 약제학적 조성물) . 형광 및 광역동 효과를 갖는 빛 민감성 약물들의 전달체로서 본 발명의 빌리루빈 나노입자를 암 치료에 활용할 수 있다. 구체적으로， 항암제를 로딩하는 빌리루빈 나노입자가 비경구적으로 체내로 투여되는 경우， EPR 효과에 의하여 종양 조직에서 축적되며， 이때 외부에서 종양 조직으로 빛을 조사하면, 빌리루빈으로 이루어진 소수성층이 친수성의 광이성질체를 포함하는 친수성층으로 변환되고， 이에 의하여 나노입자가 와해 (붕괴)됨으로써 나노입자에 포함되어 있던 항암약물이 종양 조직으로 방출되어 암의 치료가 가능하다. 동시에, 나노입자로부터 분해된 모노머가 알부민과 결합하게 되어 종양 조직에서 형광이 방출되고, 이를 이용하여 종양 조직의 이미징이 가능하다.
또한, 보다 센 청색 파장의 빛을 조사하게 되면, 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 활성산소를 생성시키고, 생성된 활성산소에 의해서도 항암효과를 얻을 수 있다. 이에 따라， 본 발명의 빌리루빈 나노입자 자체를 광역동 치료에 이용할 수 있다.
본 발명이 적용 가능한 암은, 예를 들면， 대장남， 췌장암, 담도암， 신경내분비종양, 폐암, 유방암， 난소암， 간암， 기관지암， 비인두암， 후두암, 위암， 방광암ᅳ 결장암, 자궁경부암， 뇌암, 전립선암, 골암， 두경부암, 피부암， 갑상선암, 부갑상선암 및 요관암 등을 들 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 개체는 인간을 포함하는 포유동물이다.
본 발명의 일구현예에 따르면ᅳ 상기 빌리루빈 나노입자는 항암제를 봉입한다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증성 질환 ( inf la瞧 atory disease)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 염증성 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 빌리루빈 나노입자는 염증성 질환 치료를 위한 R0S 민감성 물질로서 활용될 수 있다. 구체적으로, 비경구적으로 체내로 투여된 항염증 약물-로딩빌리루빈 나노입자는 EPR 효과에 의하여 염증 부위를 타겟팅 할 수 있다. 염증 부위에서， 나노입자는 비정상적 수준의 활성산소를 소거함으로써 항염 활성을 나타낼 수 있으며， 동시에 소수성의 빌리루빈이 친수성의 빌리벌딘 산화물로 산화되어 나노입자가 와해 (붕괴)되거나 더 산화가 진행되어 빌리루빈이 작은 화합물로 더 분해되어 나노입자가 와해 (붕괴)됨으로써 나노입자에 포함되어 있던 약물이 염증 부위로 방출되어 염증의 치료가 가능하다. 또한， 나노입자로부터의 약물방출은 대식세포 업테이크 (uptake)에 의하여 일어날 수도 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 상기 빌리투빈 나노입자는 염증성 질환 치료제를 봉입하고 있다.
본 발명이 적용 가능한 염증성 질환은, 예를 들면， 염증성 장질환 ( inf la瞧 atory bowel di sease) , 아토피 피부염， 부종, 피부염, 알레르기, 천식， 결막염， 치주염， 비염, 중이염， 죽상경화증， 인후염， 편도염, 폐렴， 위궤양， 위염， 크론병， 대장염， 치질， 통풍, 간직성 척추염, 류마티스 열, 투푸스, 섬유근통 (f ibromyalgia) , 건선관절염， 골관절염， 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염， 쇼그렌 증후군 (Sjogren' s syndrome) 및 다발성 경화증 등을 들 수 있다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 빌리루빈 나노입자는
MP0(myeloper oxidase) 활성을 저해시킨다.
본 발명의 일구 면-,ᅳ상 -Zlᅳ빌킈幕빈ᅳ나노입-자는 - -염중— -유발 사이토카인의 수준을 감소시킨다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 치료가 필요한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 치료방법을 제공한다.
본 발명의 또 다론 양태에 따르면， 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "혈관신생 관련 질환' '은 기존의 혈관으로부터 혈관내피세포가 출아하여 조직에 침입하는 형태로 모세혈관이 뻗어나가는 맥관 형성으로 인해 발생되는 질환을 의미한다.
본 발명의 일구현예에 따르면, 상기 혈관신생 관련 질환은 암, 당뇨병성 망막증， 연령관련 황반변성, 류마티스 관절염, 자궁내막증， 건선 또는 만성염증이다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 본 발명의 빌리루빈 나노입자를 포함하는 항산화 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예에 따르면， 본 발명의 항산화 조성물은 약제학적 조성물 또는 화장료 조성물로 구현될 수 있다. 본 명세서에서 용어， "약제학적 유효량' '은 상기한 약리학적 효과를 달성하는 데 층분한 양을 의미한다 .
본 발명의 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 약제학적으로 허용되는 담체가 포함된다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서， 락토스， 텍스트로스, 수크로스， 솔비틀, 만니를, 전분， 아카시아 고무， 인산 칼슘， 알기네이트, 젤라틴 규산 칼슘， 미세결정성 셀롤로스, 폴리비닐피를리돈， 셀를로스, 물, 시럽， 메틸 셀를로스, 메틸히드록시벤조에이트， 프로필히드록시벤조에이트， 활석， 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 비경구 투여가 가능하며， 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여， 근육내 투여， 피하투여 또는 국부투여될 수 있다. 또한, 그밖에도 경구투여, 직장투여， 홉입투여, 경비투여 등이 가능하다
본 발명의 약제학적. 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여방식， 환자의 연령， 체중, 성, 질병 증상의 정도， 음식， 투여 시간， 투여 경로, 배설 속도 및 반웅 감웅성과 같은 요인들에 의해 다양하며， 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및 /또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나， 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며， 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 양태에 따르면， 본 발명은 (a) 빌리루빈에 친수성 고분자를 결합시켜 빌리루빈-친수성 고분자 복합체를 제조하는 단계; (b) 상기 빌리루빈-친수성 고분자 복합체를 클로로포름 또는 디메틸설폭사이드에 용해시키는 단계; (c) 상기 클로로포름 또는 디메틸설폭사이드를 제거하여 빌리루빈-친수성 고분자 복합체 필름 층을 형성시키는 단계; 및 (d) 상기 필름 층에 친수성 용매를 처리하여 빌리루빈 나노입자를 자기 -조립 (sel f-assemble)시키는 단계를 포함하는 빌리루빈 나노입자의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법의 각 과정은 도 4에 나타내었다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
( i ) 본 발명은 빌리루빈과 친수성 고분자를 포함하는 양친매성 복합체가 자기-조립하여 형성된 빌리루빈 나노입자， 이의 용도 및 제조방법을 제공한다.
( i i ) 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 빛 또는 활성산소 자극에 의하여 분해됨으로써 내부에 봉입한 약물을 외부로 방출시킬 수 있다.
( i i i ) 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 항산화 활성， 항-신생혈관형성 활성， 항암 활성 및 항염 활성을 나타낸다.
( iv) 본 발명의 빌리루빈 나노입자는 형광성을 갖는다.
【도면의 간단한 설명】
도 1은 PEG-BR의 MALDI-T0F 결과를 보여준다.
도 2는 PEG-BR의 UV스펙트럼 결과를 보여준다.
도 3은 PEG-BR의 -賺 결과를 보여준다 . 도 4 는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자 (BRNVs)의 합성과정을 보여준다.
도 5는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 크기를 보여준다.
도 6은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 제타전위를 보여준다. 도 7 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 SEM 및 TEM 이미지를 보여준다.
도 8 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 임계 미셀 농도를 보여준다.
도 9는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 안정성을 보여준다. 도 10 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 항산화 활성을 보여준다.
도 11 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 R0S-반웅성 붕괴를 보여준다.
도 12 는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 빛-반웅성 붕괴를 보여준다.
도 13 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 친수성 약물 봉입 효율 및 약물 로딩 효율을 보여준다.
도 14 는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 소수성 약물 봉입 효율 및 약물 로딩 효율을 보여준다.
도 15 는 빛 조사에 따른 빌리루빈 나노입자의 약물 (독소루비신) 방출을 보여준다.
도 16 은 빛 조사에 따른 빌리루빈 나노입자의 약물 (도데탁셀) 방출을 보여준다,
도 17a 내지 17d 는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 입자 형성 시와 분해 시의 형광 특성을 보여준다.
도 18 은 빛 조사 (450 nm)에 의한 빌리루빈 나노입자의 R0S 생성능올 보여준다.
도 19 는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 세포 내 이입을 보여준다.
도 20 은 본 발명에 따른 독소루비신 -로딩 빌리루빈 나노입자의 레이져 조사 시의 세포 내 이입을 보여준다. 도 21 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 독성 평가 결과를 보여준다.
도 22 는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자가 활성산소로부터 세포를 보호할 수 있음을 보여주는 세포생존율 그래프이다.
도 23 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자가 활성산소로부터 세포를 보호할 수 있음을 보여주는 세포 모양 이미지이다.
도 24 는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자가 R0S 를 제거할 때， 동시에 나노입자가 붕괴됨을 보여준다.
도 25a 는 본 발명에 따른 독소루비신 로딩 빌리루빈 나노입자의 항암 활성을 보여주고 동시에 레이져의 유무에 따른 항암 활성의 차이를 나타내고 있다.
도 25b 는 본 발명에 따른 도데탁샐 로딩 빌리루빈 나노입자의 항암 활성을 보여주고 동시에 레이져의 유무에 따른 항암 활성의 차이를 나타내고 있다.
도 26 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 항-신생혈관형성 활성을 보여준다.
도 27 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자의 PK 프로파일을 보여준다.
도 28 은 IBD 동물모델을 이용한 실험에서， 정상 대조군, 염증 대조군 및 빌리루빈 나노입자 투여군의 체중변화를 보여주는 그래프이다. 도 29 는 IBD 동물모델을 이용한 실험에서， 정상 대조군， 염증 대조군 및 빌리루빈 나노입자 투여군의 결장 길이를 보여주는 사진 및 그래프이다.
도 30 은 IBD 동물모델을 이용한 실험에서， 정상 대조군, 염증 대조군 및 빌리루빈 나노입자 투여군의 결장조직 이미지 및 염증 스코어 그래프이다.
도 31a 는 IBD 동물모델을 이용한 실험에서, 정상 대조군, 염증 대조군 및 빌리루빈 나노입자 투여군의 MP0 활성을 보여주는 그래프이다.
도 31b 및 31c 는 IBD 동물모델을 이용한 실험에서， 정상 대조군, 염증 대조군 및 빌리루빈 나노입자 투여군의 및 염증 유발 사이토카인 (pro- inf la函 atory cytokine)의 수준을 보여주는 그래프이다. 도 32a 는 염증이 일어나지 않은 동물모델의 경우 IBD 동물모델에서 보다 간에서 낮은 형광값이 관찰되었음을 보여준다. 그리고 IBD 염증에 선택적으로 빌리루빈 나노입자가 축적된 후， R0S 에 의해 ICG 를 방출함을 보여주는 이미지이다.
도 32b는 IBD 동물모델과 정상군의 간의 H&E 이미지이다.
도 33 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자 및 독소루비신 -로딩 빌리루빈 나노입자의 항암 활성을 보여준다.
도 34 는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자 투여에 따른 체중 변화를 보여준다.
도 35 는 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자 투여에 따른 주요 장기의 H&E 이미지를 보여준다.
도 36 은 본 발명에 따른 빌리루빈 나노입자가 종양 조직에서 선택적으로 축적되었음을 보여준다. 【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하， 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
실험재료 및 실험방법
페길화 빌리루빈 (PEG-BR) 합성
빌리루빈 (292 mg, 0.5 mmol )과 EDC(95.5 mg, 0.6 mmol )를 DMS0(5 )에 용해하였다. 상은에서 10 분간 저어준 후， mPEG2000-N¾(400 mg, 0.2 醒 ol )과 TEA 150 를 첨가한 다음， 질소가스 하에서 상온에서 4시간 동안 저어주었다. 프리 (free)한 빌리루빈을 제거하기 위하여, 메탄올 (45 을 반응 흔합물에 첨가하고， 10 분간 3,000 rpm 으로 원심분리한 후 침전물을 버리고 상청액을 증발시켰다. 에테르를 농축된 반웅 흔합물에 첨가하여 침전물을 얻었다. 얻은 침전물을 컬럼크로마토그래피를 이용한 정제를 위하여 클로로포름에 용해시켰다. 클로로로포름 /메탄올 (85: 1 이동상)을 갖는 실리카 상에서 컬럼크로마토그래피 후， 용매를 증발시켜 페길화된 빌리루빈 (PEG-BR)을 수득하였다. 이후， UV 및 MALDI— TOF 분석으로
PEG-BR을 분석하였다. 페길화 빌리루빈 나노베지클 (PEGylated Bilirubin Nanovesicles,
BRNVs)의제조
PEG-BR(5 mg)을 클로로포름 (200 μί)^} 용해시키고, 질소가스 증기 하에서 건조시킨 다음 진공에서 더 건조시켜 필름 층을 형성시켰다. 나노입자를 형성시키기 위하여, 인산염 PBS 150 mM NaCl, 10 mM 인산염, pH 7.4)를 필름 층에 첨가하였다. 10 분간의 초음파 처리 후， 고른 사이즈를 갖는 페길화 빌리루빈 나노입자 (BRNVs)가 생성되었다. DLS(Dynamic light scattering) 검출과 제타전위 분석으로 제조된 BRNVs 를 분석하고， 입자형성의 시각증거를 SEM(scanning electron microscope) 및 TEM( transmission electron microscope)을 통하여 얻었다.
BRNVs의 임계 미셀 ^S.(critical micelle concentration)
나노입자 임계 미셀 농도를 측정하였다. 구체적으로， 다양한 양의 PEG-BR 을 사용하여 필름층을 형성시키고， 인산염 PBSCL50 mM NaCl, 10 mM 인산염, pH 7.4) 1 ml 을 나노입자를 형성시키기 위하여 상기 필름층에 첨가하였다. 다음으로， 각 그룹에서 형성된 나노입자를 DLS(dynai c lightning scattering)로 확인하였다.
BRNVs의 안정성 확인
BRNVs 의 상온에서의 안정성을 확인하기 위하여 , BRNVs 의 크기를 매 8일 동안 DLS zetasizer로 측정하였다.
BRNVs의과산화수소소거능 (항산화 활성)
과산화수소의 뭔칭 활성을 EnzyChrom™ Catalase Assay Kit(MEDIBENA Life Science & Diagnostic Solutions)를 사용하여 정량하였다. 간단히 설명하면, 50 μΜ 의 과산화수소 (90 ≠)를 각 농도의 BRNVsClO 에 처리하였다. 30 분간 인큐베이션 한 후, 각 샘플을 100 ^의 HRP/Dye 검출 시약과 함께 10 분간 인큐베이션 한 다음， 형광 강도 ( λ em/ex = 585/530 nm)를 체크하여 각 그룹에서 남아있는 과산화수소의 농도를 측정하였다.
BRNVs 의 WS-반웅성 붕괴와 빛-반웅성 붕괴 (ROS and Light- responsive disruption)
과산화기에 의한 BRNVs 의 변화를 확인하기 위하여, DPBS 에 용해된 45 의 BRNVs 를 100 mM 의 과산화기 발생 시약인 PH(2 , 2 - azobi s ( 2-am i d i nopr opane ) di hydrochloride , sigma—aldr ich)와 함께 37°C의 온도에서 인큐베이션 하였다. UV/Vi s 분광계 또는 DLS 를 사용하여 다양한 농도의 과산화기에 노출됨에 따른 BRNVs 의 UV/Vi s 스펙드럼 또는 크기를 0， 10 및 60 분에 측정하였다. 또한， 상기 반웅을 37°C에서 분광광도계로 453과 650 nm에서의 흡광도를 측정하여 모니터링 하였다. 약물 봉입
친수성 약물 (독소루비신， D0X)을 로딩시키기 위하여， PEG-BR 필름 3 mg 을 300 / g의 독소루비신， 인산염 PBSC 150 mM NaCl , 10 mM 인산염 , pH 7.4)로 수화시켰다. 10 분간 초음파 처리를 한 다음, 프리 ( free)한 독소루비신을 20 mM HEPES-버퍼 5% 글루코오스 (HBG)가 구비된 세파덱스 CL- 4B 컬럼 (sigma-aldr i ch)을 이용한 겔 여과를 통하여 제거하였다. 전체 20 개의 2 mi 분획을 모으고, 각 용액을 동결건조시킨 다음, 200 ^의 아소토니트릴을 잔여물에 첨가하였다. 각 분획물의 독소루비신 형광을 형광광도계로 측정하였다.
소수성 약물 (도시탁셀， DTX)을 로딩시키기 위하여， 400 / g의 DTX 와 3 mg 의 PEG-BR 을 클로로포름에 용해시키고， 질소가스 증기 하에서 건조시킨 다음 진공에서 더 건조시켜 PEG-BR 과 DTX 로 이루어진 필름 층을 형성시켰다. 인산염 PBSU50 mM NaCl , 10 mM 인산염, pH 7.4)로 필름 층을 수화시켰다. 프리 DTX 를 원심분리 (8，000 rpm, 5 분)를 이용한 침전법 및 막 필터 (0.45 /皿)를 이용한 여과법으로 간단히 제거하고， DTX 로딩된 BRNVS 이 함유된 상청액을 사용하였다. DTX 로딩된 BRNVS(DTX/BR VS)의 로딩된 DTX 양을 측정하기 위하여 , 100 ^의 DTX-로딩 BRNVS 현탁액을 감압 동결건조하고, 100 ul 의 ACN 을 잔여물에 첨가한 다음 막 필터 (0.45 卿)로 여과하였다. 여과액 10 ^에서의 DTX 농도를 HPLC로 측정하였다.
봉입 효율과 약물 로딩 효율을 하기의 식으로 계산하였다.
수학식 1
봉입 효율 (¾) = BRNVs 내 약물의 무게 /초기 제공된 약물의 무게 X
100%
수학식 2
약물 로딩 효율 (%) = BRNVs 내 약물의 무게 /(BRNVs 내 약물의 무게 + 초기 제공된 PEG-BR의 무게) X 100% 빛노출에의한 약물 방출
추출법을 사용하여 PBS 버퍼에서 도시탁셀 -로딩 BRNVs(DTX@BRNVs)의 약물 방출 실험을 수행하였다. 약물 방출 프로파일의 측정을 위하여, DTX@BRNVs(l mg/mi, DTX 로딩 비율 10%)을 4 개의 마이크로튜브에 동량으로 분주하였다. 이 마이크로류브에 450 nm 의 빛 (10 mW/cm2, 10hz) 또는 650 nm 의 빛 (80 mWVcm2)을 조사하였다. 각 특정 시간 (0， 1， 5 및 10 분)에서， 4 개의 마이 a로튠ᅳ브ᅳ중ᅳ하나 춰-하고ᅵ， ᅳ동-일ᅳ —붙륨의ᅵ클—로로포름으로— 10초간 추출한 다음 감압 동결건조하고, 100 ul 의 ACN을 잔여물에 첨가한 후 막 필터 (0.45 )로 여과하였다. 여과액 10 ≠ 부분에서의 DTX 농도를 HPLC로 측정하였다.
PBS 에서 독소루비신 -로딩 BRNVs(DOX@BRNVs)로부터 빛 자극에 의한 봉입된 약물의 방출을 37°C에서 확인하였다. 약물 방출 프로파일을 확인하기 위하여， DOX@BR Vs(l mg/ml , 10% D0X 로딩 비율)를 제조하였다. D0X@BRNVs 에 450 nm (10 mW/cm2, 10 hz) 또는 650 nm (90 mW/cm2)의 빛을 조사하였다. 각 시간 (0, 1, 3, 5 및 10 분)마다, 용액으로부터 방출된 D0X 의 양을 4800 nm 여기의 λΠ3Χ 550 nm 에서의 .형광 방출로 모니터링 하였다.
BRNVs의 형광측정
0.5% 트리톤 -X 를 포함하거나 포함하지 않는 BRNVs 용액 (2 mg/ml)을 제조하고, 96-웰 불랙 플레이트에 로딩하였다. 방출 스펙트럼을 fluoromax fluorometer 로 기록하였다. 용액을 450 nm에서 여기시키고， 방출을 측정한 다음 530 nm 에서 800 nm 까지 통합하였다 (cut off: 515 nm). 용액을 650 nm 에서 여기시키고， 방출을 측정한 다음 680 nm 에서 800 nm 까지 통합하였다 (cut off: 690 nm). 세포 배양
포유동물 CH()-K1 세포를 10¾(v/v) 열-불활성화 소 태아 혈청 (FBS), 100 IU/m^ 페니실린 및 L-글루타민과 함께 RPMI1940 배지에서 37°C의 온도로 가습 5% C02 조건에서 배양하고， A549 세포는 10% FBS 가 보층된 Ham's F-12K 배지에서 37°C의 온도로 가습 5% C02 조건에서 배양하였다. HUVECs(Endothel ial eel 1 line human vascular endothelial eel Is)는 EGM2 배지 (Lonza)에서 37°C의 온도로 가습 5% C02 조건에서 배양하였다. 공초점 현미경 관찰
650 nm 의 레이저 (5 분， 90 mW/cm2)의 존재 흑은 부존재 하에서의
BRNVs 및 D0X@BRNVs 의 세포이입 (intracel lular uptake)을 확인하기 위하여 공초좀 현미경 이미지를 얻었다. A549 세포 (1 X 104/웰, 24-웰 플레이트)를 커버 스립 위의 배양 배지에서 24 시간 동안 37°C에서 .배양하였다. 세포에 배양 배지， D0X(5 ug/ml), BRNVs (20 μ g/ml ) , D0X@BRNVs(D0X; 5 ug/ml, BRNVs; 20 pg/ml) 또는 D0X@BRNVs(D0X; 5 g/ml, BRNVs; 20 g/ml) + 650 nm 의 빛 (5 분, 90 mW/cm2)을 37°C에서 4 시간 동안 처리하였다. 이후, 세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정하고, DAPI(4',6'-diamidino-2- phenyl indole, Sigma— Aldrich)로 염색하고 공초점 레이저-스캐닝 현미경 (LSM 710； Carl Zeiss Microimaging, Jena, Germany)으로 관찰하였다 (여기 파장: 480 nm, 방출 파장: 530-670 nm).
MTT 분석 (MT assay)
MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazol iumbromide) 환원 분석을 이용하여 CH0-K1 세포주에서 BRNVs 의 세포보호 효과 및 빛 조사 (450 nm)에 따른 D0X@BRNVs 의 항암활성을 알아보았다. CH으 K1 세포를 7 X 103 세포 /웰의 농도로 96-웰 플레이트에 분주하고 배지에서 37°C의 온도로 24 시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후, 신선한 배지， 500 μΜ 의 과산화수소 또는 500 μΜ의 과산화수소가 첨가되거나 첨가되지 않은 다양한 농도의 BRNVs 를 각 웰에 8 시간 동안 처리하였다. A549 세포 (0.7 X 103/웰， 96 웰 플레이트)를 배지에서 37°C의 온도로 24 시간 동안 배양하였다, 배지를 제거한 후, 세포에 신선한 배지 (대조군)， D0X(5 ug/ml), D0X@BRNVs (DOX; 5 ug/ml, BRNVs; 20 g/ml), D0X@BRNVs(D0X; 5 ug/ml, BRNVs; 20 Ug/ml) + 650 nm의 빛 (5분， 90 mW/cm2) 또는 BRNVs(20 pg/ml)를 처리하고 15 시간 동안 인큐베이션 하였다. 이후， 세포를 DPBS 로 세척하고， 신선한 배지에서 20시간 동안 더 인큐베이션 하였다. 다음으로， 세포를 세척한 후， 100 ^의 신선한 배지를 각 웰에 첨가하고, 20 /^의 MTT용액 (PBS에 용해된 5 mg/i )을 각 웰에 처리하였다. 포르마잔 결정을 완전히 용해시킨 후, 96웰 플레이트 리더를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
HUVEC세포주를 이용한 혈관 형성 분석
growh factor-reduced MatrigeKBD bioscience) 50 μΙ% 마트리젤이 잘 분배되도록 96-웰 플레이트에 부주하고， 정상 세포의 배양 플레이트에서는 관찰되지 않는 모세혈관 유사 구조를 형성시키기 위한 환경을 HUVECs 에 제공하는 젤을 형성시키기 위하여 37°C에서 30 분간 배양하였다. VEGFC20 ng/ml), BRNVs (25 g/ml) 또는 VEGF(20 ng/ml) + BRNVs(2.5 ug/ml or 25 yg/ml)가 첨가된 EBM-2 배양 배지 내의 HUVEC 세포 (7.5 X 10 웰)를 마트리젤의 상단에 위치시켰다. 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 후, 세포를 DPBS로 세척하고, 형광현미경으로 관찰하였다. 동물 관리
암컷 C57BL/6 마우스 (6 주령， 17-20 g, Orient bio, seoul, korea),
ICR 마우스 (6 주령， 20-25 g) 또는 Balb/c 누드마우스 (6 주령， 20—25 g, Orient bio)를 사용하여 실험을 수행하였다. 마우스를 무병 (pathogen-free) 조건 (25°C)에서 사육하였다. 동물 사육은 한구과학기술원 동물 관리 위원회의 가이드라인에 따라 실시하였다. 모든 수술은 이소푸투란을 사용하여 실시하였다. BRNVs의 PK프로파일
ICR 마우스 (6 주령， 2으25 g)에 꼬리 혈관을 통하여 D0X(4 mg/ml ) , BRNVs (40 mg/kg) 또는 D0X@BRNVs(D0X; 4 mg/kg, BRNVs; 40 mg/kg)를 정맥주사하고, 0.0167， 0.5, 1, 4, 8, 12 및 24 시간 후에 희생시켰다. 13,000 rpm 에서 5 분간 원심분리한 후 혈액 (450 μί)^ 모으고, BD microtainer® tubes (BD biosciences)로 흔합하였다. 혈청에 Me0H(100 f )를 첨가하고 12,000 rpm 에서 10 분간 원심분리하였다. 샘플 내 프리 D0X 을 HPLC 로 확인하였다. BRNVs 는 450 nm 의 파장에서 UV/Vis 분광기로 확인하였다. 항염효과 평가
C57BL/6 마우스를 우리 당 5 마리씩 사육하고, 실험에 들어가기 전 일주일동안 순웅시켰다. 마우스에 3.5¾(w/v) DSS(25,000 달톤; Tokyo Industry Chemicals)가 보충된 물을 5 일간 제공한 다음, 물을 10 일간 제공하였다. 대조군 건강 마우스에는 오직 물만 제공하였다. 마우스를 매일 관찰하고, 체중 변화를 조사하였다. 1 일에， 100 ^의 BRNVs(125 mg/kg) — ¾_E¾S—를ᅳ정 t주스 1:로- -투-역-하였-다-.ᅳ실-험 -마지 -막ᅳ날「―마취ᅳ후ᅳ마우스를 희생시키고, 전체 결장을 절제하였다. 결장 길이를 측정하고， PBS 로 세척하였다.
원위 결장 1 cm 를 4%(v/v) 버퍼 포르말린과 70%(v/v) 알코을에 고정하고， 파라핀 포매하였다. 이후, 원위 결장의 조직 절편을 제조하고， H&E 염색하였다. 현미경을 사용하여 결장을 조직학적으로 분석하였다. 심각도를 이전에 보고된 방법에 따라 스코어링 하였다 (Garrett Ws et al (Cell 2010), Xiao-Dong Li et al (PNAS 2011)). 간단히 설명하면， 결장의 상피 손상을 다음과 같이 점수화 하였다: 0 = 정상; 1 = 과다증식， 비정상적 크립트 (crypt) 및 배상세포 손실; 2 = 경도와 중증도 사이의 크립트 손실 (10-50%); 3 = 심각한 크립트 손실 (50-90%); 4 = 완전한 크립트 손실, 표면 상피 온전성 (surface epithelium intact); 5 = 중소 크기의 궤양 (<10 크립트 폭); 6 = 큰 궤양 (≥10 크립트 폭). 염증세포의 침윤을 점막 (0 = 정상， 1 = 경도 2 = 중증도， 3 = 심각), 점막하조직 (◦ = 정상, 1 = 경도와 중증도 사이, 2 = 심각) 및 근육 /장막 (0 = 정상, 1 = 중증도와 심각 사이)에 대하여 스코어링 하였다. 상피 손상과 염증세포 침윤에 대한 점수를 더하여 0-12의 점수를 얻었다.
MPO활성과 염증성사이토카인 측정
남아있는 결장 조직 샘플을 사용하여， 결장 조직 내
MPOCmyeloper oxidase) 활성 및 IL-1 β , IL-6, IFN- γ 및 TNF- α의 농도를 측정하였다. MP0 활성은 이전에 보고된 방법에 따라 측정하였다 (Wi lson et al . Nature materials 2010) , 간단히 설명하면， MP0 활성을 확인하기 위하여， 결장 단편을 0.5% 핵사데실 암모늄 브로마이드가 함유된 l : 10(w/v) 인산염 버퍼 (pH 6.0)에서 4°C의 온도로 교반하였다. 10 초간 초음파 처리한 후， 동결 융해를 세 번 하고, 각 샘플을 14,000 rpm 으로 5 분간 원심분리 하였다. 상청액 10 ^를 으 167 mg/i 의 0-디이니시딘 염산염과 0.0005% 과산화수소가 함유된 50 mM 포스페이트 버퍼 (pH 6.0) 290 ^에 첨가하고， 460 nm 에서 흡광도 변화를 5 분 동안 측정하였다. MP0 활성의 1 유닛을 25°C에서 1 분에 Ι μ Μ 의 과산화물을 분해하는 능력으로 정의하였다. Enzyme- l inked immunosorbent assay kit (R&D)를 人 ]·용하여 제조入 }의 지시에 따라 IL-Ι β , IL-6, IFN- γ 및 TNF- α 농도를 측정하였다.
BRNVs의 염증 부위 타겟팅 능력 평가
DSS 유도 마우스 대장염 모델 (C57BL/6 마우스) 및 대조군인 건강한 마우스를 상기에서 설명한 방법으로 준비하였다. ICG 를 BRNVS 에 로딩하였다. 구체적으로, 5 일째, 100 ^의 ICG@BRNVs( ICG; 17 y g, BRNVs ; 340 y g)를 마우스에 정맥투여하였다. 6시간 후， 마우스를 회생시키고 주요 장기 (대장， 신장， 간， 비장， 폐， 심장)을 모았다. 각 그룹에서 얻은 주요 기관의 형광 강도를 인 비보 이미징 시스템 (5 초의 노출시간)과 ICG 필터 채널을 사용하여 확인하였다. 항암활성 평가
A549 종양 세포주 (1 X 106)를 6 주령 암컷 BALB/c 누드마우스의 등쪽 옆구리에 피하주사 하여 종양의 부피가 최소 80-120 mm3 인 종양을 갖는 종양 이종이식 마우스 모델을 제조하였다. 종양을 갖는 마우스를 임의적으로 4 개의 그룹으로 나누고 (day 0) , 체중과 종양 크기 차이를 최소화한 다음， 각 그룹에 D0X(2 mg/kg) , BRNVs (20 mg/kg) , D0X@BRNVs(D0X; 2 mg/kg, BRNVs ; 20 mg/kg) , D0X@BRNVs(D0X; 2 mg/kg, BRNVs ; 20 mg/kg) + 650 nm 의 빛 (5 분간의 투여 후 30 분간 조사, 200 mW/cm2) , 또는 DPBS (대조군)를 미리 정해진 시간 (0 , 3， 6 , 9 , 12 일)에 I .V투여하였다. 각 날에， 각 그룹의 종양 부피를 버니어 캘리퍼스를 사용하여 측정하였다. 종양 부피는 " (길이 X폭 X높이) /2' '의 공식으로 계산하였다.
BRNVs의 독성 평가
건강한 마우스 또는 DSS 유도 대장염 마우스 (6 주령, C57/BL6 암컷 마우스)를 사용하여 독성 평가를 실시하였다. BRNVs (150 mg/ml ) 또는 동량의 PBS를 꼬리를 통하여 주사하였다. 1주일 후， 마우스의 행동 변화와 체중을 모티터링 하였다. 이후， 마우스를 회생시킨 다음 주요 장기 (간， 폐, 신장， 비장)을 모으고 독성을 분석하였다.
EPR효과 평가
EPR 효과 평가를 위하여, A549 종양 세포주 ( 1 X 106)를 6 주령 암컷 BALB/c 누드마우스의 등쪽 옆구리에 피하주사 하여 종양을 갖는 누드마우스를 제조하였다. 3 주 후， BRNVs(25 mg/kg) 또는 대조군으로서 PBS 를 누드마우스의 꼬리에 정맥 주사하였다. 24 시간 후, 누드마우스 각 그룹을 희생시키고, 주요 장기 (간， 심장, 비장， 신장 및 폐)과 종양을 채취하고， 각 그룹의 주요 장기과 종양의 광학이미지를 인 비보 이미징 시스템 ( IVIS)을 사용하여 얻었다. 광학이미지는 5 초의 노출시간 및 GFP 필터 채널을 사용하여 수득하였다. 실험결과
페길화 빌리루빈 합성
빌리루빈의 두 개의 카르복실 그룹 중 하나와 mPEG2000-NH2 를 컨쥬게이션하기 위하여， 말단 아민 그룹을 갖는 메록시 폴리에틸렌글라이콜 2000 을 사용하였다. 클로로포름에서 EDC 로 빌리루빈을 활성화시킨 후， PEG-BR 을 얻기 위하여 TEA 및 mPEG2000-NH2를 첨가한 다음， 정제 과정을 통하여 PEG-BR 을 수득하였다. MALDIᅳ T0F (도 1)， UV 스펙트럼 (도 2) 및 - R (도 3)을 통하여 PEG~BR이 제대로 합성되었음을 확인하였다.
BRNVs 제조
제조된 PEG— BR 컨쥬게이트를 사용하여 필름 충 방법을 통하여
BRNVs 을 제조하였다. PEG-BR 을 클로로포름에 용해시킨 다음 질소 가스의 증기 하에서 건조시키고， 필름 층을 만들기 위하여 진공 상태에서 더 건조시키고, PBS 를 필름 층에 첨가한 다음 10 분간 초음파 처리를 하여 BRNVs을 제조하였다 (도 4) .
PEG-BR 의 나노입자 형성을 확인하기 위하여， 크기, 제타전위 및
PBS 에서 BRNVs 의 SEM 과 TEM 이미지를 분석하였다. 분석 결과， BRNVs 의 크기는 약 100 nm 이었으며 (도 5) , 제타전위는 약 -30 mv 이었다 (도 6) . BRNVs의 SEM 및 TEM 이미지는 도 7에 나타내었다. 이상의 결과는 PEG-BR의 양친매성 특성이 약 100 nm의 나노베지클을 형성시켰음을 보여준다ᅳ
BRNVs의 임계 미셀
Figure imgf000024_0001
micel le concentration)
β匿 sᅳ의ᅳ임 _계_ᅳ의ᅳ셀—농도 C&r-i— t4c-a- — m -c^^
측정하였다. 도 8을 통하여， PEG-BR기준 100 nM(0.5 u g/ml ) 이상에서부터 나노입자가 형성되어짐을 확인하였다.
BRNVs의 안정성
상은에서 보관하는 동안의 PBS 에서의 BRNVS 의 안정성을 확인하기 위하여， 8 일 동안 BRNVs 의 크기를 관찰하였다. 그 결과, 나노입자의 웅집 경향은 매우 낮았으며， 크기 변화가 일어나지 않았다 (도 9) . 이러한 결과는， 본 발명의 나노입자가 보관 시 매우 안정함을 보여준다,
BRNVs의과산화수소 소거능 (항산화 활성)
PEG-BR 나노입자의 항산화 효과를 알아보기 위하여， 과산화수소를 다양한 농도의 빌리루빈 나노입자에 처리한 다음， 40분간 인큐베이션 한후 남아있는 과산화수소의 농도를 형광 강도를 이용하는 HRP/dye 시스템을 사용하여 측정하였다. 그 결과, 도 10 에 나타난 바와 같이, 낮은 수준의 PEG-BR 이 큰 농도의 과산화수소를 소거하였으며， 이러한 결과는 BRNVs 의 강력한 항산화 활성을 보여준다.
BRNVs의 ROS-반웅성 붕괴와빛-반웅성 붕괴
도 11및 12에 나타난 바와 같이 , R0S , 650 nm와 450 nm레이져 조사 하에서 굉장히 빠른 시간인 1분만에 나노입자가 붕괴되는 것을 관찰하였다. 약물 봉입
빛 자극에 의하여 봉입 약물을 방출하는 BRNVs 의 능력을 평가하기 전， PEG-BR 나노입자의 친수성 및 소수성 약물의 봉입 능력을 조사하였다. 친수성 약물을 로딩시키기 위하여， 먼저 친수성 약물을 물에 용해시킨 다음， 이 용액을 PEG-BR 필름 층을 함유하는 바이알에 부었다. 나노입자 형성 후， 프리 ( f ree)한 친수성 약물 및 PEG 를 컬럼 분리로 제거하였다. 실험 결과， 봉입 효율 (encapsul at ion ef f i c i ency)은 약 100%이었으며, 약물 로딩 비율 (Drug loading percent age)은 9.09%까지 확인되었다 (도 13) .
소수성 약물을 로딩시키기 위하여， 소수성 약물과 PEG-BR 을 클로로포름에 용해하고, 클로로포름을 증발시켜 PEG— BR 과 소수성 약물로 이루어진 필름 층을 얻은 다음, 상기 필름 층을 PBS 버퍼로 수화시켜 소수성 약물을 나노입자에 봉입시켰다. 비-봉입된 약물은 침전법 및 여과법으로 제거하였다. 실험 결과, 봉입 효율은 69.8%이었으며， 약물 로딩 비율은 8.5¾까지 확인되었다 (도 14) . 빛노출에 의한 약물 방출
나노입자의 빛 민감성 분해능을 조사하기 위하여， 450 nm 레이저 조사 동안에 추출법을 사용하여 BRNVs 에서 방출되는 약물을 측정하였다. 레이저 조사 후， 1 분 만에 방출된 약물이 관찰되었으며， 약 100¾)의 약물이 5 분 만에 방출 완료되었다 (도 15 및 16) . 또한, 본 발명자들은 BRNVs 가 450 nm 의 빛 (청색 빛)뿐만 아니라， 650 nm 의 빛 (빨강 빛)에 의해서도 분해될 수 있올 것으로 판단하여, 650 nra 레이저 조사 동안에 추출법을 사용하여 BRNVs에서 방출되는 약물을 측정하였다. 그 결과， 레이저 조사 후, 1 분 만에 방출된 약물이 관찰되었으며， 약 의 약물이 5 분 만에 방출 완료되었다 (도 15 및 16) . 이상의 결과는, BRNVs 가 청색 빛과 빨강 빛 모두에 의해서 분해되고， 이에 의하여 봉입 약물을 방출시킬 수 있음을 뒷받침한다. BRNVs의 형광측정
BRNVs 의 형광을 측정하였다. 만약 나노입자가 형성된다면， BRNVs 의 빌리루빈 층의 형광은 자가소광 될 것이다. 측정 결과, 도 17a 내지 17d 에 나타난 바와 같이， 나노입자가 형성되었을 때와 나노입자가 붕괴되었을 때， 450과 650 nm의 여기 파장에서 형광성을 가지는 것을 확인하였다. 빛조사에 의한 BRNVs의 ROS생성능
나노입자가 청색 빛에 의하여 활성산소 (R0S)를 발생시킬 수 있는지 알아보기 위하여, R0S 생성능을 평가하였다. 그 결과， 도 18에 나타난 바와 같이， 레이저 조사에 의하여 BRNVs 의 색이 투명하게 변하였는데, 이는 레이저 조사 동안 빌리루빈의 감광성 효과 (photosens i t i zing ef fect )에 의하여 산소로부터 생성된 R0S 에 의하여 BRNVs 의 빌리루빈 코어가 무색의 산화물로 변경되었음을 나타낸다. 따라서, 이러한 결과는 BRNVs 가 레이저 조사에 의하여 R0S를 발생시킬 수 있음을 간접쩍으로 시사한다. BRNVS ^세포 내 이입 (공초점 현미경 분석)
도 19 에 나타난 바와 같이, BRNVs 가 세포 내로 이입되었고, 도 20에서 나타난 바와 같이 , 레이져 조사 시 효과적으로 독소루비신의 방출이 일어나 프리 ( free)한 독소루비신이 세포핵으로 들어가는 것만큼 D0X@BRNVs 가 독소투비신을 세포핵으로 전달시키는 것으로 나타났다. 이러한 경향은 D0X@BRNVs가 레이져를 쬐지 않았을 때는 감소하는 것으로 나타난다.
MT분석 결과
도 21에 나타난 바와 같이， BRNVs는 독성을 나타내지 않았다.
도 22 및 23 에 나타난 바와 같이 , BRNVs 는 효과적으로 R0S 를 제거함으로써 세포보호 효과를 나타내었다. 도 24 는 BRNVs 가 R0S 를 제거하며 세포를 살릴 때， 나노입자의 색깔이 투명해지는 것으로부터, 나노입자가 R0S 를 제거할 때， 동시에 나노입자가 붕괴됨을 보여준다. 이는 약물을 내포한다면, 약물을 방출할 수 있음을 보여준다.
도 25a에 나타난 바와 같이， D0X@BRNVs는 항암 활성을 보여주었는데 D0X@BRNVs 에 650 nm 레이져를 쬐여주지 않았을 때는 나노입자 자체가 효과적으로 이입 (upt ake)되지 못함에 따라 독소루비신의 전달이 더디게 나타났고， 이로부터 free 한 D0X 만큼 항암 활성을 나타내지 못하였다. 그러나, D0X@BRNVs 를 처리하고 난 직후 5 분 동안 650 nm 레이져를 쬐여주었을 때는 효과적으로 D0X를 방출하여 free 한 D0X만큼 항암 활성을 나타내었다.
도 25b에 나타난 바와 같이， DTX@BRNVs는 항암 활성올 보여주었는데
DTX@BRNVs 에 650 nm 레이져를 쬐여주지 않았을 때는 나노입자 자체가 효과적으로 이입되지 못함에 따라 도데탁셀의 전달이 더디게 나타났고, 이로부터 free 한 DTX 만큼 항암 활성을 나타내지 못하였다. 그러나, DTX@BRNVs 를 처리하고 난 직후 5분 동안 650 nm 레이져를 쬐여주었을 때는 효과적으로 DTX를 방출하여 free한 DTX만큼 항암 활성을 나타내었다.
BRNVs의 항-신생혈관형성 활성
도 26 에 나타난 바와 같이, VEGF 를 처리하였을 때보다， BRNVs 를 같이 처리하였을 때 관 형성이 덜 되었고， 이러한 결과는 BRNVs 가 항- 신생혈관형성 활성을 가지고 있음올 보여준다.
BRNVs의 PK프로파일 분석
도 27 에 나타난 바와 같이， D0X 보다 D0X@BRNVs 가 혈중에 더 많이 존재하는 바， 나노입자가 독소루비신을 내포한 채 혈중을 잘 돌아다님을 확인할 수 있었다. 그리고 BRNVs 를 찌른 후, 혈청의 450 nm 의 흡광도로부터 BRNVs 자체의 PK 프로파일을 조사한 결과， BRNVs 가 혈중에서 긴 시간동안 돌아다님을 확인할 수 있었다.
BRNVs의 항염효과
BRNVs 의 항염 효과를 IBD모델을 사용하여 인 섶에서 확인하였다. 인 비보 테스트 동안에 체중을 측정하였으며， 실험 마지막 날 마우스를 회생시키고， 결장을 채취하였다. 다음, 결장의 원위 부분 (di stal sect ion)을 절개하고， 조직학적 샘플을 제조한 다음 결장 손상 스코어 (colonic damage score)를 평가하였다. 그 결과, 염증 대조군에서 심각한 체중 감소가 5 일째 나타났으나， 정상 대조군과 마찬가지로 BRNVs 그룹에서는 10 일 동안 체중 감소가 나타나지 않았다 (도 28) . 또한， 염증 대조군의 결장 길이는 짧았으나, BRNVs 의 결장 길이는 정상 그룹처럼 정상이었다 (도 29) . 또한， 도 30의 H&E 이미지를 보면， 정상 대조군은 결장 상피조직이 잘 조직화되어 있으며, 이는 점막층에 크립트 (crypt )가 잘 형성이 되어있고， 더욱이 점막, 점막하조직층 (submucsa) , 근육 및 장막층에는 면역 세포 침윤이 없었으나, 염증 대조군은 현저한 결장 손상, 궤양 형성， 및 점막， 점막하조직층 근육 및 장막층으로의 과도한 면역세포 침윤이 있었다. 그러나, BRNVs 그룹의 장조직은 정상 대조군의 장조직과 유사한 모습을 나타내었다 (잘 조직화된 점막층, 면역세포의 비침윤) . 또한， 결장의 상피 손상 스코어를 총 6 점으로, 점막 면역세포 침윤을 총 3 점으로， 점막 하 면역세포 침윤을 총 1 점으로, 근육 /장막충 면역세포 침윤을 총 1 점으로 하여 결장 손상을 점수화한 결과 (총 12 점)， BRNVs 를 처리한 그룹의 장조직에서 염 보 ᅳ에ᅳ 해^ᅳ _염_증스코의本 -현저 -히— -낮아졌음을 확인할 수 있었다 (도 30) .
염증과 관련된 MP0 활성 및 사이토카인 역시 확인하였다. 그 결과， MP0 활성 및 IL-1 β , IL-6, TNF- α , IFN- γ 수준은 염증군에서는 높은 수준으로 나타났지만, BRNVs 처리군에서는 정상조직 수준으로 감소되었다 (도 31a 내지 31c) .
이상의 결과는, 본 발명의 BRNVs 가 DSS 유도 대장염에 대한 보호효과를 나타낼 수 있음을 보여준다.
BRNVs의 염증 부위 타겟팅 능력
우선 ICG 가 나타내는 형광값으로부터 네가지 가능성을 알 수 있었다. 첫째는 나노입자 자체가 간에 이입되었을 가능성이다. 두번째는 ICG 를 일반적으로 혈중에 찔렀을 경우, 간으로 주로 배설이 되는데, ICG가 혈중을 돌면서 나노입자로부터 방출이 되어 간으로 방출이 되었을 가능성이 있다. 세번째는 간에서 DSS 에 의해 염증이 생겼을 가능성이 있다. 네번째는 ICG 가 로딩된 나노입자가 leaky 한 대장의 모세혈관을 통하여 대장의 염증부위에 도달하게 되는데, 이때 ICG 가 R0S 에 의해서 빠르게 방출이 되어 대장의 점막하층부위에 존재하게 되고, 이 ICG 는 다시 간문맥을 통하여 간으로 도달 및 방출이 되었을 가능성이 있다.
첫번째， 두번째의 경우는 염증이 일어나지 않은 동물모델의 경우에서 간에서 낮은 형광값이 관찰되므로 이론적으로 맞지 않다 (도 32a) . 그리고 세번째의 설명은 H&E 이미지에서 보이다시피， 간에 DSS염증모델에서 염증이 발생하지 않았으므로 맞지 않다 (도 32b) . 그러므로 네번째로 해석하는 것이 가장 적절한 것으로 판단된다. 즉, 본 실험결과는 빌리루빈 나노입자 (BRNVs )가 염증조직에 선택적으로 도달한 후， R0S 에 의해 ICG 를 방출하는 것을 보여주는 것이다.
BRNVs의 항암활성
도 33 의 결과로부터 독소루비신이 로딩되거나 되지않은 나노입자가 항암효능에 있어서 free 독소루비신에 비해 뛰어난 효능을 갖음을 알 수 있다. 뿐만 아니라, 레이져를 암에 조사한 D0X@BRNVs 그룹이 통계적으로 유의성 있게 레이져를 조사하지않은 D0X@BRNVs 보다 암의 성장을 더욱 억제한 것을 관찰할 수 있었다. 이는 나노입자가 혈중에 남아있다가， EPR 효과에 의해서 암조직으로 도달하고, 이때 도달한 모든 나노입자가 남아서 약물을 방출하는 것이 아니라， 일부의 나노입자만이 암조직에 남아있고 나머지는 다시 빠른 혈류를 따라 빠져나간다. 이를 레이져를 조사해줌으로써 나노입자가 암조직에서 혈중으로 다시금 재빠르게 빠져나가기 전에 약물을 방출함으로써， 훨씬 더 고농도의 독소루비신을 암조직에 전달하는 것이 가능해진다. 이를 통해서 레이져를 조사하였을 때 훨씬 더 효과적인 항암 효능이 얻어졌으리라 추측된다. 뿐만 아니라, 빌리루빈 나노입자 자체만으로도 항암 효능이 있다는 흥미로운 결과를 얻을 수 있었는데， 이는 R0S 를 제거함에 따른 항-신생혈관형성 활성에 기인한 것으로 판단된다.
BRNVs의 독성 평가 도 34 에 나타난 바와 같이, 고용량의 나노입자를 찌른 후， 7 일동안 심각한 체중의 감소가 나타나지 않았고, 7 일뒤 주요장기를 적출한 뒤 H&E 이미지를 찍어본 결과， 도 35 와 같이 뚜렷한 염증의 지표가 관찰이 되지 않았다. 이로부터 BRNVs가 신체에 대하여 안전성을 가짐을 규명하였다.
BRNVs의 EPR효과
나노입자의 물리화학적 특성과, 암 환경 (tumor envi ronment )의 해부학적 구조 (anatomy) 및 생리 (physiology) 사이의 상호작용으로 인한 EPR 효과에 의하여 PEG-BR 나노입자가 종양 조직에서 축적될 수 있는지를 알아보았다. 그 결과， 도 36 에 나타난 바와 같이, BRNVs 처리 그룹은 대조군과 비교하여 종양 조직에서의 형광 강도가 훨씬 강하였다. 이러한 결과는， BRNVs 가 종양 조직에서 선택적으로 축적될 수 있음을 명확히 보여준다. 이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
빌리루빈; 및 상기 빌리루빈에 결합된 친수성 고분자를 포함하는 복합체가 자기 -조립 (sel f-assembled)하여 형성된 빌리루빈 나노입자.
【청구항 2】
제 1 항에 있어서， 상기 빌리루빈 나노입자는 수계에서 자기- 조립하여 형성된 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 3】
제 1 항에 있어서， 상기 빌리루빈 나노입자는 1 nm 내지 5，000 nm의 크기를 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 4】
제 1 항에 있어서, 상기 빌리루빈 나노입자는 운반대상 (cargo)을 봉입하고 있는 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 5】
제 4 항에 있어서, 상기 빌리루빈 나노입자는 빛에 의하여 와해 (di sassembly or di srupt ion)되어 봉입된 운반대상을 주위로 방출하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 6】
제 4 항에 있어서， 상기 빌리루빈 나노입자는 활성산소에 의하여 와해 (di sassembly or di srupt ion)되어 봉입된 운반대상을 주위로 방출하는 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 7】
제 1 항에 있어서， 상기 빌리루빈 나노입자는 빛에 의하여 활성산소를 발생시키는 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 8】
제 1 항에 있어서, 상기 빌리루빈 나노입자는 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 9】
제 1 항에 있어서， 상기 빌리루빈 나노입자는 항-신생혈관형성 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 10】
제 1 항에 있어서， 상기 친수성 고분자는 빌리루빈의 카르복실기에 결합된 것을 톡징으로 하는 나노입자.
【청구항 11]
제 1 항에 있어서, 상기 친수성 고분자는 측쇄 또는 말단에 아민기를 갖는 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 12]
제 1 항에 있어서, 상기 친수성 고분자는 생체적합성인 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 13]
제 1 항에 있어서, 상기 친수성 고분자는 폴리에틸렌 글라이콜 (PEG), 폴리 (아크릴산) (poly[acrylic acid]), 폴리 (아크릴산염) (poly[acrylate]), 폴리 (아크릴아마이드) (poly[acrylamide]), 폴리 (비닐에스테르) (polyvinyl ester]), 폴리 (비닐알콜) (polyvinyl alcohol]), 폴리스티렌 (polystryene) , 폴리옥사이드 (polyoxide), 샐를로오스 (eel lulose) , 전분 (starch), 폴리다당류 (polysaccharide), 폴리일렉트로라이트 (polyelectrolyte), 폴리 (1-니트로프로필렌) (poly[l— nitropropylene]), 폴리 (N- 비닐피를리돈) (poly[N— vinyl pyrrol i done] ) , 폴리비닐아민 (polyvinyl amine]), 폴리 (베타-히드록시에틸 메타아크릴레이트) (Poly[be - hydroxyethylmethacrylate] )， 폴리에틸렌 옥사이드 (Polyethyleneoxide)， 플리 (에틸렌옥시드 -b-프로필렌 옥사이드 (Poly[ethylene oxide— b-propylene oxide] ) 및 폴리라이신 (Polylysine)으로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 14】
제 1 항에 있어서， 상기 친수성 고분자는 콜라겐， 키토산, 젤라틴， 아카시아 검， 덱스트란, 피브린， 히알루론산, 펙틴， 아가 (agar) , 갈락토만난 (Galactomannan) , 잔탄 (Xanthan) 및 알지네이트로 구성된 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 15】
제 1 항에 있어서， 상기 친수성 고분자는 2개 이상의 아미노산으로 이루어진 펩티드인 것을 특징으로 하는 나노입자.
【청구항 16】
(a) 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 빌리루빈 나노입자의 약제학적 유효량; 약 _제_ 으로ᅳ희ᅵ용돠늡ᅳ담체ᅳ를- -포함 -하는ᅳ암의一 예방또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 17】
제 16 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 광 자극을 통한 암 치료용 약제학적 조성물인 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 18】
제 16 항에 있어서, 상기 빌리루빈 나노입자는 항암제를 봉입하고 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
【청구항 19]
(a) 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 빌리루빈 나노입자의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 염증성 질환 ( inf lammatory disease)의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 20】
제 19 항에 있어서, 상기 빌리루빈 나노입자는 염증성 질환 치료제 봉입하고 있는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
[청구항 21】
(a) 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 빌리루빈 나노입자의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 혈관신생 관련 질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
【청구항 22】
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항의 빌리루빈 나노입자를 포함하는 항산화 조성물.
【청구항 23】
(a) 빌리루빈에 친수성 고분자를 결합시켜 빌리루빈-친수성 고분자 복합체를 제조하는 단계;
(b) 상기 빌리투빈―친수성— 표분봐_ ： ^합-홰ᅵ를 -클로 -로포름 또는 디메틸설폭사이드에 용해시키는 단계;
(c) 상기 클로로포름 또는 디메틸설폭사이드를 제거하여 빌리루빈- 친수성 고분자 복합체 필름 층을 형성시키는 단계; 및
(d) 상기 필름 층에 친수성 용매를 처리하여 빌리루빈 나노입자를 자기-조립 (sel f-assemble)시키는 단계를 포함하는 빌리루빈 나노입자의 제조방법 .
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