ES2822557T3 - Composiciones y su uso para inducir la embolización microvascular de tumores mediada por nanopartículas - Google Patents

Composiciones y su uso para inducir la embolización microvascular de tumores mediada por nanopartículas Download PDF

Info

Publication number
ES2822557T3
ES2822557T3 ES15829211T ES15829211T ES2822557T3 ES 2822557 T3 ES2822557 T3 ES 2822557T3 ES 15829211 T ES15829211 T ES 15829211T ES 15829211 T ES15829211 T ES 15829211T ES 2822557 T3 ES2822557 T3 ES 2822557T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
oxygen
tumor
polymersomes
various embodiments
myoglobin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES15829211T
Other languages
English (en)
Inventor
P Peter Ghoroghchian
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Poseida Therapeutics Inc
Original Assignee
Poseida Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US14/455,082 external-priority patent/US20140363496A1/en
Application filed by Poseida Therapeutics Inc filed Critical Poseida Therapeutics Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2822557T3 publication Critical patent/ES2822557T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
    • A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
    • A61K49/0093—Nanoparticle, nanocapsule, nanobubble, nanosphere, nanobead, i.e. having a size or diameter smaller than 1 micrometer, e.g. polymeric nanoparticle
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0031—Rectum, anus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0034—Urogenital system, e.g. vagina, uterus, cervix, penis, scrotum, urethra, bladder; Personal lubricants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/007—Pulmonary tract; Aromatherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A61K9/1273—Polymersomes; Liposomes with polymerisable or polymerised bilayer-forming substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Una composición que comprende un agente inhibidor de óxido nítrico (NO) y un vehículo portador, en la que el agente inhibidor de (NO) es para uso en el tratamiento de tumores altamente vascularizados causando embolización microvascular en el tumor, en la que el vehículo portador es una nanopartícula, y en la que la nanopartícula es un polimerosoma, en la que el agente inhibidor de (NO) comprende una molécula de unión a (NO); en la que la unión a NO se habilita solo a tensiones de oxígeno de menos de 10 mm Hg; en la que la molécula de unión a (NO) se selecciona de una o más de mioglobina humana no modificada, mioglobina no modificada de otra especie biológica, y mioglobina modificada química o genéticamente de seres humanos o de otra especie biológica; en la que la molécula de unión a (NO) está precargada con oxigeno; y en la que el agente inhibidor de NO está encapsulado dentro del vehículo portador.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y su uso para inducir la embolización microvascular de tumores mediada por nanopartículas
CAMPO DE INVENCIÓN
La presente solicitud se refiere a composiciones y métodos para la síntesis y suministro de agentes de unión a oxígeno con alta afinidad a los tumores para aumentar las presiones parciales intratumorales de oxígeno, mitigar la selección natural de células tumorales que demuestran un comportamiento molecular agresivo y potencial metastásico, y potenciar los efectos de radiación y quimioterapias. La presente solicitud también se refiere a composiciones y métodos para la generación y suministro de compuestos vasoactivos que inducen la hemostasia específica del tumor. La presente invención se refiere a una composición que comprende un agente inhibidor de óxido nítrico (NO) y un vehículo portador, en la que el agente inhibidor de (NO) es para uso en el tratamiento de tumores altamente vascularizados causando embolización microvascular en el tumor, en la que el vehículo portador es una nanopartícula, y en la que la nanopartícula es un polimerosoma, en la que el agente inhibidor de (NO) comprende una molécula de unión a (NO); en la que la unión a NO se habilita solo a tensiones de oxígeno de menos de 10 mm Hg; en la que la molécula de unión a (NO) se selecciona de una o más de mioglobina humana no modificada, mioglobina no modificada de otra especie biológica, y mioglobina modificada química o genéticamente de seres humanos o de otra especie biológica; en la que la molécula de unión a (NO) está precargada con oxígeno; y en la que el agente inhibidor de NO está encapsulado dentro del vehículo portador.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Cada año, aproximadamente 1,2 millones de estadounidenses son diagnosticados con neoplasias de tumores sólidos, lo que da como resultado costes totales de atención médica de más de $ 55 mil millones para el tratamiento12. Más del 50% de estos pacientes se someten a radioterapia (XRT) como parte de su plan de tratamiento3-5. La recurrencia tumoral local en el campo irradiado a menudo está implicada como la causa principal del fracaso del tratamiento en pacientes sometidos a terapia definitiva4-7. La capacidad de XRT para erradicar las células malignas depende críticamente del contenido intratumoral de O2, un potente radiosensibilizador involucrado en la mediación del daño del ADN8-10. El nivel intratumoral de O2 es uno de los determinantes más importantes de la respuesta entre tumores del mismo tipo tratados con una sola fracción de radioterapia ionizante4- 5- 11. Los estudios experimentales sugieren que las células hipóxicas son 2-3 veces más resistentes a una sola fracción de radiación ionizante que aquellas con niveles normales de O25, 10, 12, 13. Mientras que el XRT genera altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) localizadas que son citotóxicas, la hipoxia tumoral promueve ROS endógenos basales14 que dan como resultado la estabilización del factor 1 inducible por hipoxia (HIF-1) y conducen a un fenotipo tumorigénico más agresivo3, 5, 8, 15-17. Investigaciones sobre la importancia pronóstica de los niveles de O2 previos al tratamiento de tumores en pacientes con cánceres de cabeza, cuello y cuello uterino han demostrado además que el empeoramiento de la hipoxia, típicamente designado en estos estudios como niveles de tensión de oxígeno (pO2) por debajo de 2,5-10 mmHg, se asocia con resistencia a la radiación y a la quimioterapia, disminución del control local del tumor después de la cirugía, así como tasas más bajas de supervivencia4, 5, 18-28.
Aunque la hipoxia ha sido reconocida como la causa del fracaso del tratamiento en tumores sólidos durante más de 50 años, los esfuerzos para superarla generalmente no han tenido éxito4, 5, 8, 29-35. Se han diseñado varias estrategias para mejorar la radiosensibilidad y la radiocurabilidad de los tumores sólidos. Los métodos más bien estudiados que alteran la hipoxia han implicado el uso de radiosensibilizadores de afinidad electrónica que imitan las acciones de O2 pero se metabolizan más lentamente. Durante las últimas tres décadas, los compuestos de nitroimidazol se han evaluado ampliamente como complementos de XRT en carcinomas de cabeza, cuello, cuello uterino y pulmón36-43. La mayoría de estos estudios han informado resultados decepcionantes de control local y supervivencia36-38, 40, 4143, pero los esfuerzos para maximizar su eficacia y seguridad, así como para desarrollar nuevas clases de agentes, están en curso44-47. La mayoría de las estrategias alternativas se han basado en el uso de compuestos alquilantes masivos que confieren efectos citotóxicos directos que son independientes de la administración de XRT. Los ensayos clínicos que evalúan la mitomicina C, la tirapazamina, la porfiromicina, y otros, han demostrado mejoras estadística y clínicamente significativas en el control locorregional y la supervivencia específica de la causa de diversos cánceres, pero a menudo a costa de toxicidades significativas con dosis repetidas30-32, 48-73.
La ruta más directa y menos tóxica para superar la hipoxia tumoral es aumentar la pO2 intratumoral. La administración de oxígeno hiperbárico se intentó inicialmente, pero no se usa clínicamente ya que muestra una respuesta inconsistente, un coste prohibitivo, inconvenientes y problemas de seguridad relacionados con la administración4, 5, 8, 10, 74. Las estrategias más recientes han incluido la administración de carbógeno45, 75-82, transfusiones de sangre, portadores sintéticos de oxígeno a base de hemoglobina, o emulsiones de perfluorocarbono5, 83, 84, e inyecciones de eritropoyetina humana recombinante5, 85-89, efectores alostéricos (RSR13), o inhibidores de la angiogénesis90-92. Todas estas estrategias han tenido un éxito clínico mínimo debido a su dependencia de la carga de oxígeno hiperbárico, la inestabilidad de la formulación, la liberación de oxígeno unido a la hemoglobina que ocurre a valores de pO2 (20-40 mmHg) que son mucho más altos que los encontrados en regiones tumorales hipóxicas (<3 mmHg), y/o mecanismos reguladores intravasculares que alteran el flujo sanguíneo para mantener niveles de oxigenación tisular relativamente constantes5, 8, 83, 91.
Además, dado que se requiere angiogénesis para el crecimiento tumoral y la metástasis lo requiere, dicho proceso también es un punto importante en el control de la progresión del cáncer. En los últimos 35 años, algunas terapias que se han desarrollado para buscar los fundamentos moleculares de la angiogénesis específica de tumor incluyen las terapias del anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) e inhibidores de la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR). Sin embargo, estas terapias solo inhiben parcialmente la angiogénesis y, por lo tanto, solo proporcionan un ligero efecto en la mayoría de los cánceres. El documento WO 2012/094679 describe composiciones y métodos para administrar agentes de unión de oxígeno con alta afinidad a los tumores. El documento WO 2011/133635 describe nanopartículas biodegradables como portadores de oxígeno a base de hemoglobina. El documento US 5612310 describe el uso de un eliminador de óxido nítrico (NO) o un inhibidor de la NO sintasa para mejorar la efectividad de la terapia tumoral con agentes quimioterapéuticos hipóxicos, o ácidos, o hipertermia.
A continuación, se incluye una lista de publicaciones a las que se hace referencia en esta descripción.
1. American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2010, http://www.cancer.org/research/cancerfactsfigures/cancerfactsfigures/cancer-facts-and-figures-2010 (visitado por última vez el 10 de octubre de 2011).
2. Care Core National, Radiation Therapy Management 2010, http://www.carecorenational.com/radiation-therapymanagement.asp (visitado por última vez en 2010).
3. Feldmann H.J., Molls M., Vaupel P., Blood Flow And Oxygenation Status Of Human Tumors - Clinical Investigations, STRAHLENTHERAPIE UND ONKOLOGIE 1999;175:1-9.
4. Harrison L., Blackwell K., Hypoxia and Anemia: Factors In Decreased Sensitivity To Radiation Therapy And Chemotherapy, ONCOLOGIST 2004; 9:31-40.
5. Harrison L.B., Chadha M., Hill R.J., Hu K., Shasha D., Impact Of Tumor Hypoxia And Anemia On Radiation Therapy Outcomes, ONCOLOGIST 2002; 7:492-508.
6. Mundt A.J., Connell P.P., Campbell T., Hwang J.H., Rotmensch J., Waggoner S., Race And Clinical Outcome In Patients With Carcinoma Of The Uterine Cervix Treated With Radiation Therapy, GYNECOLOGIC ONCOLOGY 1998; 71:151-8.
7. Takeshi K., Katsuyuki K., Yoshiaki T., et al., Definitive Radiotherapy Combined With High-Dose-Rate Brachytherapy For Stage III Carcinoma Of The Uterine Cervix: Retrospective Analysis Of Prognostic Factors Concerning Patient Characteristics And Treatment Parameters, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 1998; 41:319-27.
8. Rockwell S., Dobrucki I.T., Kim E.Y., Marrison S.T., Vu V.T., Hypoxia and Radiation Therapy: Past History, Ongoing Research, and Future Promise, CURRENT MOLECULAR MEDICINE 2009; 9:442-58.
9. Carlson D.J., Keall P.J., Chen Z.J., Stewart R.D., Nath R., Brown J.M., Towards Temporal Optimization of Radiation Fractionation: The Kinetic Effects of Tumor Hypoxia, DNA Damage Repair, and Tumor Cell Repopulation, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 2009; 75:S615-S6.
10. Brown J.M., The Hypoxic Cell: A Target For Selective Cancer Therapy - Fighteenth Bruce F. Cain Memorial Award Lecture, CANCER RESEARCH 1999; 59:5863-70.
11. Dietz A., Rudat V., Vanselow B., et al. Rise Of Oxygenation In Cervical Lymph Node Metastasis During The Initial Course Of Radiochemotherapy, OTOLARYNGOLOGY-HEAD AND NECK SURGERY 1999; 121:789-96.
12. Evans S.M., Jenkins W.T., Shapiro M., Koch C.J., Evaluation Of The Concept Of "Hypoxic Fraction"As A Descriptor Of Tumor Oxygenation Status, ADV. EXP. MED. BIOL 1997; 411:215-25, OXYg En TRANSPORT TO TISSUE XVIII (Nemoto E.M., LaManna J.C. eds.) (1997).
13. Teicher B.A., Physiological-Mechanisms of Therapeutic Resistance - Blood-Flow and Hypoxia, HEMATOLOGY-ONCOLOGY CLINICS OF NORTH AMERICA 1995; 9:475-506.
14. Kaelin W.G., ROS: Really Involved In Oxygen Sensing. Cell Metabolism 2005; 1:357-8.
15. Alarcon R., Koumenis C., Geyer R.K., Maki C.G., Giaccia A.J., Hypoxia Induces Accumulation Through MDM2 Down-Regulation And Inhibition Of E6-Mediated Degradation, Cancer Research 1999; 59:6046-51.
16. Graeber T.G., Osmanian C., Jacks T., et al. Hypoxia-Mediated Selection Of Cells With Diminished Apoptotic Potential In Solid Tumors, Nature 1996; 379:88-91.
17. Rockwell S., Oxygen Delivery: Implications For The Biology And Therapy Of Solid Tumors, Oncology Research 1997; 9:383-90.
18. Brizel D.M., Dodge R.K., Clough R.W., Dewhirst M.W., Oxygenation Of Head And Neck Cáncer: Changes During Radiotherapy And Impact On Treatment Outcome, Radiotherapy and Oncology 1999; 53:113-7.
19. Brizel D.M., Sibley G.S., Prosnitz L.R., Scher R.L., Dewhirst M.W., Tumor Hypoxia Adversely Affects The Prognosis Of Carcinoma Of The Head And Neck, International Journal of Radiation Oncology Biology Physics 1997; 38:285-9.
20. Fyles A.W., Milosevic M., Wong R., et al., Oxygenation Predicts Radiation Response And Survival In Patients With Cervix Cancer. Radiotherapy And Oncology 1998; 48:149-56.
21. Hockel M., Knoop C., Schlenger K., et al., Intratumoral Po2 Predicts Survival In Advanced Cancer Of The Uterine Cervix, Radiotherapy and Oncology 1993; 26:45-50.
22. Hockel M., Schlenger K., Aral B., Mitze M., Schaffer U., Vaupel P., Association Between Tumor Hypoxia And Malignant Progression In Advanced Cancer Of The Uterine Cervix, Cancer Research 1996; 56:4509-15.
23. Hockel M., Vorndran B., Schlenger K., Baussmann E., Knapstein P.G., Tumor Oxygenation - A New Predictive Parameter In Locally Advanced Cancer Of The Uterine Cervix, Gynecologic Oncology 1993; 51:141-9.
24. Knocke T.H., Weitmann H.D., Feldmann H.J., Selzer E., Potter R., Intratumoral Po(2)-Measurements As Predictive Assay In The Treatment Of Carcinoma Of The Uterine Cervix, Radiotherapy and Oncology 1999; 53:99-104.
25. Rofstad E.K., Sundfor K., Lyng H., Trope C.G., Hypoxia-Induced Treatment Failure In Advanced Squamous Cell Carcinoma Of The Uterine Cervix Is Primarily Due To Hypoxia Induced Radiation Resistance Rather Than Hypoxia-Induced Metastasis, British Journal of Cancer 2000; 83:354-9.
26. Rudat V., Vanselow B., Wollensack P., et al. Repeatability And Prognostic Impact Of The Pretreatment Po(2) Histography In Patients With Advanced Head And Neck Cancer, RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 2000; 57:31-7.
27. Stadler P., Becker A., Feldmann H.J., et al., Influence Of The Hypoxic Subvolume On The Survival Of Patients With Head And Neck Cancer, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 1999; 44:749-54.
28. Stadler P., Feldmann H.J., Creighton C., Kau R., Molls M., Changes In Tumor Oxygenation During Combined Treatment With Split-Course Radiotherapy And Chemotherapy In Patients With Head And Neck Cancer, RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 1998; 48:157-64.
29. Karar J., Maity A., Modulating the Tumor Microenvironment to Increase Radiation Responsiveness, CANCER BIOLOGY & THERAPY 2009; 8:1994-2001.
30. Bache M., Kappler M., Said H.M., Staab A., Vordermark D., Detection And Specific Targeting Of Hypoxic Regions Within Solid Tumors: Current Preclinical And Clinical Strategies, CURRENT MEDICINAL CHEMiSt RY 2008; 15:322-38.
31. Ahn G.O., Brown M., Targeting Tumors With Hypoxia-Activated Cytotoxins, FRONTIERS IN BIOSCIENCE 2007; 12:3483-501.
32. Nagasawa H., Uto Y., Kirk K.L., Hori H., Design Of Hypoxia-Targeting Drugs As New Cancer Chemotherapeutics. BIOLOGICAL & PHARMACEUTICAL BULLETIN 2006; 29:2335-42.
33. Janssen H.L., Haustermans K.M., Balm A.J., Begg A.C., Hypoxia In Head And Neck Cancer: How Much, How Important? HEAD AND NECK-JOURNAL FOR THE SCIENCES AND SPECIALTIES OF THE HEAD AND NECK 2005; 27:622-38.
34. Wouters B.G., Weppler S.A., Koritzinsky M., et al., Hypoxia As A Target For Combined Modality Treatments, EUROPEAN JOURNAL OF CANCER 2002; 38:240-57.
35. Kondo A., Safaei R., Mishima M., Niedner H., Lin X.J., Howell S.B., Hypoxia-Induced Enrichment And Mutagenesis Of Cells That Have Lost DNA Mismatch Repair, CANCER RESEARCH 2001; 61:7603-7.
36. Grigsby P.W., Winter K., Wasserman T.H., et al., Irradiation With Or Without Misonidazole For Patients With Stages IIIB And IVA Carcinoma Of The Cervix: Final Results of RTOG 80-05. INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 1999; 44:513-7.
37. Lee D.J., Cosmatos D., Marcial V.A., et al., Results Of An RTOG Phase-III Trial (RTOG-85-27) Comparing Radiotherapy Plus Etanidazole With Radiotherapy Alone For Locally Advanced Head And Neck Carcinomas, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 1995; 32:567-76.
38. Lee D.J., Pajak T.F., Stetz J., Order S.E., Weissberg J.B., Fischer J.J., A Phase-I Phase-II Study Of The Hypoxic Cell Sensitizer Misonidazole As An Adjunct To High Fractional Dose Radiotherapy In Patients With Unresectable Squamous-Cell Carcinoma Of The Head And Neck - A RTOG Randomized Study (79-04), INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 1989; 16:465-70.
39. Overgaard J., Sensitization Of Hypoxic Tumor-Cells - Clinical-Experience, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION BIOLOGY 1989; 56:801 -11.
40. Overgaard J., Bentzen S.M., Kolstad P., et al., Misonidazole Combined With Radiotherapy In The Treatment Of Carcinoma Of The Uterine Cervix, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 1989; 16:1069-72.
41. Overgaard J., Hansen H.S., Andersen A.P., et al. Misonidazole Combined With Split-Course Radiotherapy In The Treatment Of Invasive-Carcinoma Of Larynx And Pharynx - Report From The Dahanca-2 Study, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 1989; 16:1065-8.
42. Overgaard J., Hansen H.S., Overgaard M., et al., A Randomized Double-Blind Phase III Study Of Nimorazole As A Hypoxic Radiosensitizer Of Primary Radiotherapy In Supraglottic Larynx And Pharynx Carcinoma, Results Of The Danish Head And Neck Cancer Study (DAHANCA) Protocol 5-85, RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 1998; 46:135-46.
43. Wasserman T.H., Lee D.J., Cosmatos D., et al., Clinical-Trials With Etanidazole (Sr-2508) By The Radiation-Therapy Oncology Group (RTOG), RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 1991; 20:129-35.
44. Lim SH, Lee JY, Park SH, et al. Effect of Combination of Anticancer Agents and Nitroimidazoles on the Survival of Human Hepatocellular Carcinoma Cells under Hypoxic Conditions, JOURNAL OF THE KOREAN SURGICAL SOCIETY 2009; 76:337-47.
45. Fenton B.M., Lord E.M., Paoni S.E., Enhancement Of Tumor Perfusion And Oxygenation By Carbogen And Nicotinamide During Single- And Multifraction Irradiation, RADIATION RESEARCH 2000; 153:75-83.
46. Rosenthal D.I., Nurenberg P., Becerra C.R., et al. A Phase I Single-Dose Trial Of Gadolinium Texaphyrin (Gd-Tex), A Tumor Selective Radiation Sensitizer Detectable By Magnetic Resonance Imaging, CLINICAL CANCER RESEARCH 1999; 5:739-45.
47. Eisbruch A., Robertson J.M., Johnston C.M., et al., Bromodeoxyuridine Alternating With Radiation For Advanced Uterine Cervix Cancer: A Phase I And Drug Incorporation Study, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 1999; 17:31-40.
48. Rischin D., Peters L.J., O’Sullivan B., et al., Tirapazamine, Cisplatin, and Radiation Versus Cisplatin and Radiation for Advanced Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck (TROG 02.02, HeadSTART): A Phase III Trial of the Trans-Tasman Radiation Oncology Group, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 2010; 28:2989-95.
49. Fogh S., Machtay M., Werner-Wasik M., et al., Phase I Trial Using Patupilone (Epothilone B) And Concurrent Radiotherapy For Central Nervous System Malignancies, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 2010; 77:1009-16.
50. de la Fouchardiere C., Negrier S., Labrosse H., et al., Phase I Study Of Daily Irinotecan As A Radiation Sensitizer For Locally Advanced Pancreatic Cancer, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 2010; 77:409-13.
51. Williams K.J., Albertella M.R., Fitzpatrick B., et al., In Vivo Activation Of The Hypoxia-Targeted Cytotoxin AQ4N In Human Tumor Xenografts, MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS 2009; 8:3266-75.
52. Hay M.P., Pruijn F.B., Gamage S.A., et al., DNA-Targeted 1,2,4-Benzotriazine 1,4-Dioxides: Potent Analogues Of The Hypoxia-Selective Cytotoxin Tirapazamine, JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY 2004; 47:475-88. 53. Shibamoto Y., Zhou L., Hatta H., Mori M., Nishimoto S., In Vivo Evaluation Of A Novel Antitumor Prodrug, 1-(2’-Oxopropyl)-5-Fluorouracil (OFU001), Which Releases 5-Fluorouracil Upon Hypoxic Irradiation, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 2001; 49:407-13.
54. Koch C.J., Hahn S.M., Rockwell K., Covey J.M., McKenna W.G., Evans S.M., Pharmacokinetics Of EF52-(2-Nitro-1-H-Imidazol-1-Yl)-N-(2,2,3,3,3-Pentafluoropropyl) Acetamide In Human Patients: Implications For Hypoxia Measurements In Vivo By 2-Nitrolmidazoles, CaNcER CHEMOTHER PHARMACOL 2001; 48:177-87.
55. von Pawel J., von Roemeling R., Gatzemeier U., et al., Tirapazamine Plus Cisplatin Versus Cisplatin In Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer: A Report Of The International CATAPULT I Study Group, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 2000; 18:1351 -9.
56. Roberts K.B., Urdaneta N., Vera R., et al., Interim Results Of A Randomized Trial Of Mitomycin C As An Adjunct To Radical Radiotherapy In The Treatment Of Locally Advanced Squamous-Cell Carcinoma Of The Cervix, INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER 2000; 90:206-23.
57. Papadopoulou M.V., Ji M., Rao M.K., Bloomer W.D., 4- 3-(2-Nitro-1-Imidazolyl)Propylamino-7-Chloroquinoline Hydrochloride (NLCQ-1), A Novel Bioreductive Compound As A Hypoxia-Selective Cytotoxin, ONCOLOGY RESEARCH 2000; 12:185-92.
58. Papadopoulou M.V., Ji M., Rao M.K., Bloomer W.D., 4-3-(2-Nitro-1-Imidazolyl)Propylamino -7-Chloroquinoline Hydrochloride (NLCQ-1), A Novel Bioreductive Agent As Radiosensitizer In Vitro And In Vivo: Comparison With Tirapazamine, ONCOLOGY RESEARCH 2000; 12:325-33.
59. Craighead P.S., Pearcey R., Stuart G., A Phase I/II Evaluation Of Tirapazamine Administered Intravenously Concurrent With Cisplatin And Radiotherapy In Women With Locally Advanced Cervical Cancer, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 2000; 48:791-5.
60. Weitman S., Mangold G., Marty J., et al., Evidence Of Enhanced In Vivo Activity Using Tirapazamine With Paclitaxel And Paraplatin Regimens Against The MV-522 Human Lung Cancer Xenograft, CANCER CHEMOTHER PHARMACOL 1999; 43:402-8.
61. Treat J., Johnson E., Langer C., et al., Tirapazamine With Cisplatin In Patients With Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer: A Phase II Study, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 1998; 16:3524-7.
62. Siemann D.W., Hinchman C.A., Potentiation Of Cisplatin Activity By The Bioreductive Agent Tirapazamine, RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 1998; 47:215-20.
63. Lee D.J., Trotti A., Spencer S., et al., Concurrent Tirapazamine And Radiotherapy For Advanced Head And Neck Carcinomas: A Phase II Study, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 1998; 42:811-5.
64. Harrison L.B., Raben A., Pfister D.G., et al. A Prospective Phase II Trial Of Concomitant Chemotherapy And Radiotherapy With Delayed Accelerated Fractionation In Unresectable Tumors Of The Head And Neck, HEAD AND NECK-JOURNAL FOR THE SCIENCES AND SPECIALTIES OF THE HEAD AND NECK 1998; 20:497-503.
65. Gatzemeier U., Rodriguez G., Treat J., et al., Tirapazamine-Cisplatin: The Synergy, BRITISH JOURNAL OF CANCER 1998; 77:15-7.
66. Brown J.M., Wang L.H., Tirapazamine: Laboratory Data Relevant To Clinical Activity, ANTI-CANCER DRUG DESIGN 1998; 13:529-39.
67. Haffty B.G., Son Y.H., Papac R., et al., Chemotherapy As An Adjunct To Radiation In The Treatment Of Squamous Cell Carcinoma Of The Head And Neck: Results Of The Yale Mitomycin Randomized Trials, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 1997; 15:268-76.
68. Adelstein D.J., Saxton J.P., Lavertu P., et al., A Phase III Randomized Trial Comparing Concurrent Chemotherapy And Radiotherapy With Radiotherapy Alone In Resectable Stage III And IV Squamous Cel1Head And Neck Cancer: Preliminary Results, HEAD AND NECK-JOURNAL FOR THE SCIENCES AND SPECIALTIES OF THE HEAD AND NECK 1997; 19:567-75.
69. Sartorelli A.C., Hodnick W.F., Belcourt M.F., et al., Mitomycin-C - A Prototype Bioreductive Agent, ONCOLOGY RESEARCH 1994; 6:501-8.
70. Dobrowsky W., Mitomycin-C, 5-Fluorouracil And Radiation In Advanced, Locally Recurrent Rectal-Cancer, BRITISH JOURNAL OF RADIOLOGY 1992; 65:143-7.
71. Sivanesaratnam V., Jayalakshmi P., Mitomycin-C Adjuvant Chemotherapy After Wertheim Hysterectomy For Stage-Ib Cervical-Cancer, CANCER 1989; 64:798-800.
72. Keyes S.R., Rockwell S., Sartorelli A.C., Enhancement Of Mitomycin-C Cyto-Toxicity To Hypoxic Tumor-Cells By Dicoumarol Invivo And Invitro. CANCER RESEARCH 1985; 45:213-6.
73. Keyes S.R, Rockwell S., Sartorelli A.C., Porfiromycin As A Bioreductive Alkylating Agent With Selective Toxicity To Hypoxic Emt6 Tumor-Cells Invivo And Invitro, CANCER RESEARCH 1985; 45:3642-5.
74. Overgaard J., Horsman M.R., Modification Of Hypoxia-Induced Radioresistance In Tumors By The Use Of Oxygen And Sensitizers, SEMINARS IN RADIATION ONCOLOGY 1996; 6:10-21.
75. Aquino-Parsons C., Lim P., Green A., Minchinton A.I., Carbogen Inhalation In Cervical Cancer: Assessment Of Oxygenation Change, GYNECOLOGIC ONCOLOGY 1999; 74:259-64.
76. Bernier J., Denekamp J., Rojas A., et al., ARCON: Accelerated Radiotherapy With Carbogen And Nicotinamide In Head And Neck Squamous Cell Carcinomas: The Experience Of The Cooperative Group Of Radiotherapy Of The European Organization For Research And Treatment Of Cancer (EORTC), RADIOTHERAPY And ONCOLOGY 2000; 55:111-9.
77. Bussink J., Kaanders J., Van der Kogel A.J., Clinical Outcome And Tumour Microenvironmental Effects Of Accelerated Radiotherapy With Carbogen And Nicotinamide, ACTA ONCOLOGICA 1999; 38:875-82.
78. Hoskin P.J., Saunders M.I., Dische S., Hypoxic Radiosensitizers In Radical Radiotherapy For Patients With Bladder Carcinoma - Hyperbaric Oxygen, Misonidazole, And Accelerated Radiotherapy, Carbogen, And Nicotinamide, CANCER 1999; 86:1322-8.
79. Miralbell R., Mornex F., Greiner R., et al., Accelerated Radiotherapy, Carbogen, And Nicotinamide In Glioblastoma Multiforme: Report Of European Organization For Research And Treatment Of Cancer Trial 22933, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 1999; 17:3143-9.
80. Saunders M., Dische S., Clinical Results Of Hypoxic Cell Radiosensitisation From Hyperbaric Oxygen To Accelerated Radiotherapy, Carbogen And Nicotinamide, BRITISH JOURNAL OF CANCER 1996; 74:S271-S8. 81. Stuben G., Stuschke M., Knuhmann K., Horsman M.R., Sack H., The Effect Of Combined Nicotinamide And Carbogen Treatments In Human Tumour Xenografts: Oxygenation And Tumour Control Studies, RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 1998; 48:143-8.
82. Zhan H.W., Liu H.B., Bao C.K., Ye X.J., Zhang H., He G.Q., Effect Of Carbogen On Tumour Oxygenation And 32P-Colloid Interstitial Irradiation Response, MEDICAL SCIENCE MONITOR 2010; 16:BR11-BR6.
83. Yu M.H., Dai M., Liu Q., Xiu R.J., Oxygen Carriers And Cancer Chemo- And Radiotherapy Sensitization: Bench To Bedside And Back, CANCER TREATMENT REVIEWS 2007; 33:757-61.
84. Hoogsteen I.J., Marrest A.M., van der Kogel A.J., Kaanders J., The Hypoxic Tumour Microenvironment, Patient Selection And Hypoxia-Modifying Treatments, CLINICAL ONCOLOGY 2007; 19:385-96.
85. Shasha D., The Negative Impact Of Anemia On Radiotherapy And Chemoradiation Outcomes, SEMINARS IN HEMATOLOGY 2001; 38:8-15.
86. Shasha D., George M.J., Harrison L.B., Once-Weekly Dosing Of Epoetin Alfa Increases Hemoglobin And Improves Quality Of Life In Anemic Cancer Patients Receiving Radiation Therapy Either Concomitantly Or Sequentially With Chemotherapy, BLOOD 2000; 96:1866.
87. Henke M., Guttenberger R., Barke A., Pajonk F., Potter R., Frommhold H., Erythropoietin For Patients Undergoing Radiotherapy: A Pilot Study, RADIo Th ERa Py AND ONCOLOGY 1999; 50:185-90.
88. Dusenbery K.E., McGuire W.A., Holt P.J., et al., Erythropoietin Increases Hemoglobin During Radiation-Therapy For Cervical-Cancer, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 1994; 29:1079-84.
89. Lavey R.S., Dempsey W.H., Erythropoietin Increases Hemoglobin In Cancer-Patients During Radiation-Therapy, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 1993; 27:1147-52. 90. McGee M.C., Hamner J.B., Williams R.F., et al., Improved Intratumoral Oxygenation Through Vascular Normalization Increases Glioma Sensitivity To Ionizing Radiation, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 2010; 76:1537-45.
91. Katz D., Ito E., Liu F.F., On The Path To Seeking Novel Radiosensitizers, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 2009; 73:988-96.
92. Gali-Muhtasib H., Sidani M., Geara F., et al., Quinoxaline 1,4-Dioxides Are Novel Angiogenesis Inhibitors That Potentiate Antitumor Effects Of Ionizing Radiation, INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY 2004; 24:1121-31.
93. Ordway G.A., Garry D.J., Myoglobin: An Essential Hemoprotein In Striated Muscle, JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY 2004; 207:3441-6.
94. Wittenberg J.B., Wittenberg B.A., Myoglobin Function Reassessed, JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY 2003; 206:2011-20.
95. Kooyman G.L., Ponganis P.J., The Physiological Basis Of Diving To Depth: Birds And Mammals, ANNUAL REVIEW OF PHYSIOLOGY 1998; 60:19-32.
96. Hochachka P.W., The Metabolic Implications Of Intracellular Circulation, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 1999; 96:12233-9.
97. Conley K.E., Jones C., Myoglobin Content And Oxygen Diffusion: Model Analysis Of Horse And Steer Muscle, AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-CELL PHYSIOLOGY 1996; 271 :C2027-C36.
98. Galluzzo M., Pennacchietti S., Rosano S., Comoglio P.M., Michieli P., Prevention Of Hypoxia By Myoglobin Expression In Human Tumor Cells Promotes Differentiation And Inhibits Metastasis, JOURNAL o F c L iNICAL INVESTIGATION 2009; 119:865-75.
99. Floegel U., Dang C.V., Myoglobin Tames Tumor Growth And Spread, JOURNAL OF CLINICAL INVESTIGATION 2009; 119:766-8.
100. Bunn H.F., The Role Of Hemoglobin Based Substitutes In Transfusion Medicine, TRANSFUS CLIN. BIOL.
1995; 2:433-9.
101. Gottschalk A., Raabe A., Hommel M., Rempf C., Freitag M., Standl T., Influence Of The Hemoglobin Solution HBOC-201 On Tissue Oxygenation In The Rat RIH-Tumor, ARTIF. CELLS BLOOD SUBSTIT. BIOTECHNOL.
2005; 33:379-89.
102. Gundersen S.I., Palmer A.F., Hemoglobin-Based Oxygen Carrier Enhanced Tumor Oxygenation: A Novel Strategy for Cancer Therapy, BIOTECHNOL. PROG. 2008; 24:1353-64.
103. Palaparthy R., Wang H.S., Gulati A., Current Aspects In Pharmacology Of Modified Hemoglobins, ADV DRUG DELIV. REV 2000; 40:185-98.
104. Robinson M.F., Dupuis N.P., Kusumoto T., Liu F., Menon K., Teicher B.A., Increased Tumor Oxygenation And Radiation Sensitivity In 2 Rat-Tumors By A Hemoglobin-Based, Oxygen-Carrying Preparation, ARTIF. CELLS BLOOD SUBSTIT. IMMOBIL. BIOTECHNOL. 1995; 23:431-8.
105. Rowinsky E.K., Novel Radiation Sensitizers Targeting Tissue Hypoxia, ONCOLOGY-NY 1999; 13:61-70. 106. Teicher B.A., Herman T.S., Hopkins R.E., Menon K., Effect Of A Bovine Hemoglobin Preparation On The Response Of The Fsaiic Fibrosarcoma To Chemotherapeutic Alkylating-Agents, J. CANCER RES. CLIN. ONCOL.
1992; 118:123-8.
107. Teicher B.A., Holden S.A., Dupuis N.P., et al., Oxygenation Of The Rat-91 Gliosarcoma And The Rat-13672 Mammary-Carcinoma With Various Doses Of A Hemoglobin Solution, ARTIF. CELLS BLOOD SUBSTIT. IMMOBIL. BIOTECHNOL. 1994; 22:827-33.
108. Teicher B.A., Holden S.A., Menon K., Hopkins R.E., Gawryl M.S., Effect Of Hemoglobin Solution On The Response Of Intracranial And Subcutaneous Tumors To Antitumor Alkylating-Agents, CANCER CHEMOTHER. PHARMACOL. 1993; 33:57-62.
109. Teicher B.A., Schwartz G.N., Sotomayor E.A., Robinson M.F., Dupuis N.P., Menon K., Oxygenation Of Tumors By A Hemoglobin Solution, J. CANCER RES. CLIN. ONCOL. 1993; 120:85-90.
110. Christian D.A., Cai S., Bowen D.M., Kim Y., Pajerowski J.D., Discher D.E., Polymersome Carriers: From Self-Assembly To siRNA And Protein Therapeutics, EUR. J. PHARM. BIOPHARM. 2009; 71:463-74.
111. Levine D.H., Ghoroghchian P.P., Freudenberg J., et al., Polymersomes: A New MultiFunctional Tool For Cancer Diagnosis And Therapy, METHODS 2008; 46:25-32.
112. Letchford K., Burt H., A Review Of The Formation And Classification Of Amphiphilic Block Copolymer Nanoparticulate Structures: Micelles, Nanospheres, Nanocapsules And Polymersomes, EUR. J. PHARM. BIOPHARM. 2007; 65:259-69.
113. Discher B.M., Hammer D.A., Bates F.S., Discher D.E., Polymer Vesicles In Various Media, CURR. OPIN. COLLOID INTERFACE SCI. 2000; 5:125-31.
114. Discher D.E., Ortiz V., Srinivas G., et al., Emerging Applications Of Polymersomes In Delivery: From Molecular Dynamics To Shrinkage Of Tumors, PROG. POLYM. SCI. 2007; 32:838-57.
115. Discher B.M., Won Y.Y., Ege D.S., et al., Polymersomes: Tough Vesicles Made From Diblock Copolymers, SCIENCE 1999; 284:1143-6.
116. O’Neil C.P., Suzuki T., Demurtas D., Finka A., Hubbell J.A., A Novel Method For The Encapsulation Of Biomolecules Into Polymersomes Via Direct Hydration, LANGMUIR 2009; 25:9025-9.
117. Lee Bermudez H., Discher B.M., et al., Preparation, Stability, And In Vitro Performance Of Vesicles Made With Diblock Copolymers, BIOTECHn Ol . BIOENG. 2001; 73:135-45.
118. Ghoroghchian P.P., Li G.Z., Levine D.H., et al., Bioresorbable Vesicles Formed Through Spontaneous Self-Assembly Of Amphiphilic Poly(Ethylene Oxide)-Block-Polycaprolactone, MACROMOLECULES 2006; 39:1673-5.
119. Kim Y.H., Tewari M., Pajerowski J.D., et al., Polymersome Delivery Of siRNA And Antisense Oligonucleotides, J. CONTROL RELEASE 2009; 134:132-40.
120. Hearnden V., Lomas H., MacNeil S., et al., Diffusion Studies of Nanometer Polymersomes Across Tissue Engineered Human Oral Mucosa, PHARm Ac Eu T iCAL RESEARCH 2009; 26:1718-28.
121. Meng F.H., Engbers G.H.M., Feijen J., Biodegradable Polymersomes As A Basis For Artificial Cells: Encapsulation, Release And Targeting, J. CONTROL RELEASE 2005; 101:187-98.
122. Photos P.J., Bacakova L., Discher B., Bates F.S., Discher D.E., Polymer Vesicles In Vivo: Correlations With PEG Molecular Weight, J. CONTROL RELEASE 2003; 90:323-34.
123. Ghoroghchian P.P., Lin J.J., Brannan A.K., et al., Quantitative Membrane Loading Of Polymer Vesicles, SOFT MATTER 2006; 2:973-80.
124. Ghoroghchian P.P., Frail P.R., Susumu K., et al., Near-Infrared-Emissive Polymersomes: Self-Assembled Soft Matter For In Vivo Optical Imaging, PROC NATL. ACAD. SCI. U.S.A. 2005; 102:2922-7.
125. Bermudez H., Hammer D.A., Discher D.E., Effect Of Bilayer Thickness On Membrane Bending Rigidity, LANGMUIR 2004; 20:540-3.
126. Bermudez H., Brannan A.K., Hammer D.A., Bates F.S., Discher D.E., Molecular Weight Dependence Of Polymersome Membrane Structure, Elasticity, And Stability, MACROMOLECULES 2002; 35:8203-8.
127. Massignani M., LoPresti C., Blanazs A., et al., Controlling Cellular Uptake by Surface Chemistry, Size, and Surface Topology at the Nanoscale, SMALL 2009; 5:2424-32.
128. Blanazs A., Massignani M., Battaglia G., Armes S.P., Ryan A.J., Tailoring Macromolecular Expression at Polymersome Surfaces, ADVANCED FUNCTlONAL MATERIALS 2009; 19:2906-14.
129. van Dongen S.F.M., Nallani M., Schoffelen S., Cornelissen J., Nolte R.J.M., van Hest J.C.M., A Block Copolymer For Functionalisation Of Polymersome Surfaces, MACROMOLECULAR RAPID COMMUNICATIONS 2008; 29:321-5.
130. Christian N.A., Milone M.C., Ranka S.S., et al., Tat-Functionalized Near-lnfrared Emissive Polymersomes For Dendritic Cell Labeling, BIOCONJUGATE. CHEM. 2007; 18:31-40.
131. Binder W.H., Sachsenhofer R, Farnik D, Blaas D. Guiding The Location Of Nanoparticles Into Vesicular Structures: A Morphological Study, PHYSICAL CHEMISTRY CHEMICAL PHYSICS 2007; 9:6435-41.
132. Lin J.J., Ghoroghchian P., Zhang Y., Hammer D.A., Adhesion Of Antibody-Functionalized Polymersomes, LANGMUIR 2006; 22:3975-9.
133. Lin J.J., Silas J.A., Bermudez H., Milam V.T., Bates F.S., Hammer D.A., The Effect Of Polymer Chain Length And Surface Density On The Adhesiveness Of Functionalized Polymersomes, LANGMUIR 2004; 20:5493-500.
134. Pangu G.D., Davis K.P., Bates F.S., Hammer D.A., Ultrasonically Induced Release from Nanosized Polymer Vesicles, MACROMOL. BIOSCI. 2010; 10:546-54.
135. Kim M.S., Lee D.S., Biodegradable And Ph-Sensitive Polymersome With Tuning Permeable Membrane For Drug Delivery Carrier, CHEMICAL COMMUNICATIONS 2010; 46:4481-3.
136. Chen W., Meng F.H., Cheng R., Zhong Z.Y., pH-Sensitive Degradable Polymersomes For Triggered Release Of Anticancer Drugs: A Comparative Study With Micelles, J CONTROL RELEASE 2010; 142:40-6.
137. Robbins G.P., Jimbo M., Swift J., Therien M.J., Hammer D.A., Dmochowski I.J., Photoinitiated Destruction of Composite Porphyrin-Protein Polymersomes, J AM CHEM SOC 2009; 131:3872-+.
138. Kim K.T., Cornelissen J., Nolte R.J.M., van Hest J.C.M., A Polymersome Nanoreactor with Controllable Permeability Induced by Stimuli-Responsive Block Copolymers, ADVANCED MATERIALS 2009; 21:2787.
139. Sanson C., Le Meins J.F., Schatz C., Soum A., Lecommandoux S., Temperature Responsive Poly(Trimethylene Carbonate)-Block-Poly(L-Glutamic Acid) Copolymer: Polymersomes Fusion And Fission, SOFT MATTER 2010; 6:1722-30.
140. Castillo R.V., Muller A.J., Raquez J.M., Dubois P., Crystallization Kinetics and Morphology of Biodegradable Double Crystalline PLLA-b-PCL Diblock Copolymers, MACROMOLECULES 2010; 43:4149-60.
141. Wang F., Wang Y.C., Yan L.F., Wang J., Biodegradable Vesicular Nanocarriers Based On Poly(Epsilon-Caprolactone)-Block-Poly(Ethyl Ethylene Phosphate) For Drug Delivery, POLYMER 2009; 50:5048-54.
142. Schatz C., Louguet S., Le Meins J.F., Lecommandoux S., Polysaccharide-Block-Polypeptide Copolymer Vesicles: Towards Synthetic Viral Capsids, ANGEW. CHEM. INT. EDIT 2009; 48:2572-5.
143. Rabotyagova O.S., Cebe P., Kaplan D.L., Self-Assembly of Genetically Engineered Spider Silk Block Copolymers, BIOMACROMOLECULES 2009; 10:229-36.
144. Katz J.S., Levine D.H., Davis K.P., Bates F.S., Hammer D.A., Burdick J.A., Membrane Stabilization of Biodegradable Polymersomes, LANGMUiR 2009; 25:4429-34.
145. Bromley E.H.C, Channon K., Moutevelis E., Woolfson D.N., Peptide And Protein Building Blocks For Synthetic Biology: From Programming Biomolecules To Self-Organized Biomolecular Systems, Acs CHEMICAL BIOLOGY 2008; 3:38-50.
146. Najafi F., Sarbolouki M.N., Biodegradable Micelles/Polymersomes From FumariclSebacic Acids And Poly(Ethylene Glycol), BIOMATERIALS 2003;24:1175-82.
147. Rameez S., Bamba I., Palmer A.F., Large Scale Production of Vesicles by Hollow Fiber Extrusion: A Novel Method for Generating Polymersome Encapsulated Hemoglobin Dispersions, lAn GMUIR 2010; 26:5279-85.
148. Shum H.C., Kim J.W., Weitz D.A., Microfluidic Fabrication Of Monodisperse Biocompatible And Biodegradable Polymersomes With Controlled Permeability, J AM CHEM SOC 2008; 130:9543-9.
149. Yildiz M.E., Prud’homme R.K., Robb I., Adamson D.H., Formation And Characterization Of Polymersomes Made By A Solvent Injection Method, POLYMERS FOR ADVANCED TECHNOLOGIES 2007; 18:427-32.
150. Dewhirst M.W., Relationships Between Cycling Hypoxia, HIF-1, Angiogenesis And Oxidative Stress, RADIATION RESEARCH 2009; 172:653-65.
151. Palmer G.M., Boruta R.J., Viglianti B.L., Lan L., Spasojevic I., Dewhirst M.W., Non-Invasive Monitoring Of Intra-Tumor Drug Concentration And Therapeutic Response Using Optical Spectroscopy, J CONTROL RELEASE 2010; 142:457-64.
152. Dewhirst M.W., Thrall D.E., Palmer G., et al., Utility Of Functional Imaging In Prediction Or Assessment Of Treatment Response And Prognosis Following Thermotherapy, INTERNATIONAL JOURNAL OF HYPERTHERMIA 2010; 26:283-93.
153. Zhang G.Q., Palmer G.M., Dewhirst M., Fraser C.L., A Dual-Emissive-Materials Design Concept Enables Tumour Hypoxia Imaging, NATURE MATERIALS 2009; 8:747-51.
154. Palmer G.M., Viola R.J., Schroeder T., Yarmolenko P.S., Dewhirst M.W., Ramanujam N., Quantitative Diffuse Reflectance And Fluorescence Spectroscopy: Tool To Monitor Tumor Physiology In Vivo, JOURNAL OF BIOMEDICAL OPTICS 2009; 14.
155. Hardee M.E., Dewhirst M.W., Agarwal N., Sorg B.S., Novel Imaging Provides New Insights into Mechanisms of Oxygen Transport in Tumors, CURRENT MOLECULAR MEDICINE 2009; 9:435-41.
156. Sorg B.S., Hardee M.E., Agarwal N., Moeller B.J., Dewhirst M.W., Spectral Imaging Facilitates Visualization And Measurements Of Unstable And Abnormal Microvascular Oxygen Transport In Tumors, JOURNAL OF BIOMEDICAL OPTICS 2008; 13.
157. Dewhirst M.W., Cao Y., Moeller B., Cycling Hypoxia And Free Radicals Regulate Angiogenesis And Radiotherapy Response, NAt Ur E REVIeW s CANCER 2008; 8:425-37.
158. Sorg B.S., Moeller B.J., Donovan O., Cao Y.T., Dewhirst M.W., Hyperspectral Imaging Of Hemoglobin Saturation In Tumor Microvasculature And Tumor Hypoxia Development, JOURNAL OF BIOMEDICAL OPTICS 2005; 10.
159. Dewhirst M.W., Cao Y.T., Li C.Y., Moeller B., Exploring The Role Of HIF-1 In Early Angiogenesis And Response To Radiotherapy, RADIOTHERAPY AND On COLOGY 2007; 83:249-55.
160. Moeller B., Dewhirst M.W., HIF-I and tumour radiosensitivity, BRITISH JOURNAL OF CANCER 2006; 95:1-5.
161. Moeller B.J., Dreher M.R., Rabbani Z.N., et al., Pleiotropic Effects Of HIF-1 Blockade On Tumor Radiosensitivity, CANCER CELL 2005; 8:99-110.
162. Arifin D.R., Palmer A.F., Polymersome Encapsulated Hemoglobin: A Novel Type Of Oxygen Carrier, BIOMACROMOLECULES 2005; 6:2172-81.
163. Rameez S., Alosta H., Palmer A.F., Biocompatible And Biodegradable Polymersome Encapsulated Hemoglobin: A Potential Oxygen Carrier, BIOCONJUGATE CHEM 2008; 19:1025-32.
164. Ghoroghchian P.P., Therien M.J., Hammer D.A., In Vivo Fluorescence Imaging: A Personal Perspective, WILEY INTERDISCIP. REV-NANOMED NANOBIOTECHNOL. 2009; 1:156-67.
165. Duncan T.V., Ghoroghchian P.P., Rubtsov I.V., Hammer D.A., Therien M.J., Ultrafast Excited-State Dynamics Of Nanoscale Near-Infrared Emissive Polymersomes, J AM. CHe M. SOC 2008; 130:9773-84.
166. Ghoroghchian P.P., Frail P.R., Li G.Z., et al., Controlling Bulk Optical Properties Of Emissive Polymersomes Through Intramembranous Polymer-Fluorophore Interactions, CHEM. MAT 2007; 19:1309-18.
167. Ghoroghchian P.P., Frail P.R., Susumu K., et al., Broad Spectral Domain Fluorescence Wavelength Modulation Of Visible And Near-Infrared Emissive Polymersomes, J. Am . CHEM. SOC. 2005; 127:15388-90. 168. Christian N.A., Benencia F., Milone M.C., et al., In Vivo Dendritic Cell Tracking Using Fluorescence Lifetime Imaging and Near-Infrared-Emissive Polymersomes, MOL. IMAGING BIOL. 2009; 11:167-77.
169. Hearnden V., Battaglia G., MacNeil S., Murdoch C., Thornhill M., Penetration Of Polymersome Drug And Gene Delivery Nanoparticles Into In Vitro Models Of Head And Neck Cancer And Tissue Engineered Oral Mucosa, ORAL ONCOLOGY 2009:66.
170. Li S.L., Byrne B., Welsh J., Palmer A.F., Self-AssembledPoly(Butadiene)-B-Poly(Ethylene Oxide) Polymersomes As Paclitaxel Carriers, BIOTECHNOL. PROG. 2007; 23:278-85.
171. Ahmed F., Pakunlu R.I., Brannan A., Bates F., Minko T., Discher D.E., Biodegradable Polymersomes Loaded With Both Paclitaxel And Doxorubicin Permeate And Shrink Tumors, Inducing Apoptosis In Proportion To Accumulated Drug, J. CONTROL RELEASE 2006; 116:150-8.
172. Zhang X.L., Liu C.S., Yuan Y., et al., Key Parameters Affecting The Initial Leaky Effect Of Hemoglobin-Loaded Nanoparticles As Blood Substitutes, JOURNAL OF MATERIALS SCIENCE-MATERIALS IN MEDICINE 2008; 19:2463-70.
173. Dewhirst M.W., Kimura H., Rehmus S.W.E., et al., Microvascular Studies On The Origins Of Perfusion-Limited Hypoxia, BRITISH JOURNAL OF CANCER 1996; 74:S247-S51.
174. Zupancich J.A., Bates F.S., Hillmyer M.A., Aqueous Dispersions Of Poly(Ethylene Oxide)-B-Poly(Gamma-Methyl-Epsilon-Caprolactone) Block Copolymers, MACROMOLECULES 2006; 39:4286-8.
175. Hahn J.S., Braun R.D., Dewhirst M.W., et al., Stroma-Free Human Hemoglobin A Decreases R3230Ac Rat Mammary Adenocarcinoma Blood Flow And Oxygen Partial Pressure, RADIATION RESEARCH 1997; 147:185-94.
176. Arifin D.R., Palmer A.F., Determination Of Size Distribution And Encapsulation Efficiency Of Liposome-Encapsulated Hemoglobin Blood Substitutes Using Asymmetric Flow Field-Flow Fractionation Coupled With Multi-Angle Static Light Scattering, BIOTECHNOL PROG 2003; 19:1798-811.
177. Sakai H., Sato A., Sobolewski P., et al., NO And CO Binding Profiles Of Hemoglobin Vesicles As Artificial Oxygen Carriers, BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-PROTEINS AND PROTEOMICS 2008; 1784:1441-7. 178. Sakai H., Hamada K., Takeoka S., Nishide H., Tsuchida E., Functional Evaluation Of Hemoglobin- And Lipidheme-Vesicles As Red Cell Substitutes, POLYMERS FOR ADVANCED TECHNOLOGIES 1996; 7:639-44.
179. Frauenfelder H., McMahon B.H., Fenimore P.W., Myoglobin: The Hydrogen Atom Of Biology And A Paradigm Of Complexity, PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA 2003; 100:8615-7.
180. Herold S., Exner M., Nauser T., Kinetic And Mechanistic Studies Of The NO Center Dot-Mediated Oxidation Of Oxymyoglobin And Oxyhemoglobin, BIOCHEMISTRY 2001; 40:3385-95.
181. Nienhaus G.U., Mourant J.R., Chu K., Frauenfelder H., Ligand-Binding To Heme-Proteins - The Effect Of Light On Ligand-Binding In Myoglobin, BIOCHEMISTRY 1994; 33:13413-30.
182. Ansari A., Jones C.M., Henry E.R., Hofrichter J., Eaton W.A., Conformational Relaxation And Ligand-Binding In Myoglobin, BIOCHEMISTRY 1994; 33:5128-45.
183. Mourant J.R., Braunstein D.P., Chu K., et al., Ligand-Binding To Heme-Proteins .2. Transitions In The Heme Pocket Of Myoglobin, BIOPHYSICAL JOURNAL 1993; 65:1496-507.
184. Kanner J., Harel S., Granit R., Nitric-Oxide As An Antioxidant, ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS 1991; 289:130-6.
185. Chance B., Optical Method. ANNUAL REVIEW OF BIOPHYSICS AND BIOPHYSICAL CHEMISTRY 1991; 20:1-28.
186. Chance B., Nioka S., Kent J., et al., Time-Resolved Spectroscopy Of Hemoglobin And Myoglobin In Resting And Ischemic Muscle, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 1988; 174:698-707.
187. Privalov P.L., Griko Y.V., Venyaminov S.Y., Kutyshenko V.P., Cold Denaturation Of Myoglobin, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY 1986; 190:487-98.
188. Helcke G.A., Ingram D.J.E., Slade E.F., Electron Resonance Studies Of Haemoglobin Derivatives .3. Line-Width And G-Value Measurements Of Acid-Met Myoglobin And Of Met Myoglobin Azide Derivatives, PROCEEDINGS OF THE ROYAL SOCIETY OF LONDON SERIES B-BIOLOGICAL SCIENCES 1968; 169:275.
189. Moeller B.J., Richardson R.A., Dewhirst M.W., Hypoxia And Radiotherapy: Opportunities For Improved Outcomes In Cancer Treatment, CANCER AND METASTASIS REVIEWS 2007; 26:241-8.
190. Kong G., Braun R.D., Dewhirst M.W., Characterization Of The Effect Of Hyperthermia On Nanoparticle Extravasation From Tumor Vasculature, CANCER RESEARCH 2001; 61:3027-32.
191. Kong G., Braun R.D., Dewhirst M.W., Hyperthermia Enables Tumor-Specific Nanoparticle Delivery: Effect Of Particle Size, CANCER RESEARCH 2000; 60:4440-5.
192. Moeller B.J., Dewhirst M.W., Raising The Bar - How HIF-1 Helps Determine Tumor Radiosensitivity, CELL CYCLE 2004; 3:1107-10.
193. Mozzarelli A., Faggiano S., Bettati S, Bruno S., Haemoglobin-based oxygen carriers: research and reality towards an alternative to blood transfusions, BLOOD TRANSFUS 2010; 8 (Suppl 3):s59-s68.
194. Aranda-Espinoza H., Bermudez H., Bates F.S., Discher D.E., Electromechanical Limits of Polymersomes, PHYSICAL REVIEW LETTERS 2001; 87:208301.
195. Chin A.I., Lam J.S., Figlin R.A., Belldegrun A.S., Surveillance Strategies for Renal Cell Carcinoma Patients Following Nephrectomy, REVIEWS IN UROLOGY 2006; 8:1-7.
196. Ather M.H., Masood N, T.S. Current management of advanced and metastatic renal cell carcinoma, UROLOGY JOURNAL 2010; 7:1-9.
197. Benjamini Y., Hochberg Y., Controlling the false discovery rate - a practical and powerful approach to multiple testing, JOURNAL OF THE ROYAL STATISTICAL SOCIETY SERIES B-METHODOLOGICAL 1995; 57:289-300.
198. Brahmer J.R. et al., Safety and Activity of Anti-PD-Ll Antibody in Patients with Advanced Cancer, NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE 2012; 366:2455-65.
199. Cabrales P. FJ, HBOC vasoactivity: interplay between nitric oxide scavenging and capacity to generate bioactive nitric oxide species, ANTIOXID REDOX SIGNAL 2013; 18:2284-97.
200. Caroline R., Jean-Charles S., Alexander M. ME, Drug of the year: Programmed Death-1 receptor/Programmed Death-1 Ligand-1 receptor monoclonal antibodies, EUROPEAN JOURNAL OF CANCER 2013; 49:2968-71. 201. Chance B. et al., Time-Resolved Spectroscopy of Hemoglobin and Myoglobin in Resting and Isechmic Muscle, ANALYTICAL BIOCHEMISTRY 1988;174:698-707.
202. Chance B., Optical Method, ANNUAL REVIEW OF BIOPHYSICS AND BIOPHYSICAL CHEMISTRY 1991; 20:1-28.
203. Chang A., Finelli A., Berns J.S., Rosner M., Chronic Kidney Disease in Patients With Renal Cell Carcinoma, ADVANCES IN CHRONIC KIDNEY DISEASE 2014; 21:91 -5.
204. Chang T. MS., Blood replacement with nanobiotechnologically engineered hemoglobin and hemoglobin nanocapsules, WILEY INTERDISCIPLINARY REVIEWS: NANOMEDICINE AND NANOBIOTECHNOLOGY 2010; 2:418-30.
205. Chang Y. et al., Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models, CANCER CHEMOTHER PHARMACOL 2007; 59:561-74.
206. Cho D., Signoretti S., Regan M., Mier J.W., Atkins M.B., The role of mammalian target of rapamycin inhibitors in the treatment of advanced renal cancer, CLIN CANCER RES 2007; 13:758s-63s.
207. Cho D. et al., The Efficacy of the Novel Dual PI3-Kinase/mTOR Inhibitor NVP-BEZ235 Compared with Rapamycin in Renal Cell Carcinoma, CLINICAL CANCER RESEARCH 2010; 16:3628-38.
208. Choueiri T.K. et al, Clinical factors associated with outcome in patients with metastatic clear-cell renal cell carcinoma treated with vascular endothelial growth factor-targeted therapy, CANCER 2007; 110:543-50.
209. Choueiri T.K. et al., Prognostic factors associated with long-term survival in previously untreated metastatic renal cell carcinoma, ANN ONCOL 2007; 18:249-55.
210. Choueiri T.K., Efficacy of cabozantinib (XL184) in patients (pts) with metastatic, refractory renal cell carcinoma (RCC), 2012 ASCO Annual Meeting; 2012.
211. Choueiri T.K., Factors associated with outcome in patients with advanced renal cell carcinoma in the era of antiangiogenic agents, CLIN GENITOURIN CANCER 2008; 6:15-20.
212. Christian D.A., Garbuzenko O.B., Minko T., Discher D.E., Polymer Vesicles with a Red Cell-like Surface Charge: Microvascular Imaging and in vivo Tracking with Near-Infrared Fluorescence, MACROMOLECULAR RAPID COMMUNICATIONS 2010; 31:135-41.
213. Clifford S.C., Maher E.R., Von Hippel-Lindau disease: clinical and molecular perspectives, ADV CANCER RES 2001; 82:85-105.
214. Cora N.S. et al., A randomised, double-blind phase III study of pazopanib in patients with advanced and/or metastatic renal cell carcinoma: Final overall survival results and safety update, EUROPEAN JOURNAL OF CANCER 2013; 49:1287-96.
215. Courtney K.D., Choueiri T.K., Optimizing recent advances in metastatic renal cell carcinoma, CURR ONCOL REP 2009; 11:218-26.
216. Courtney K.D., Choueiri T.K., Review: Updates on novel therapies for metastatic renal cell carcinoma, THERAPEUTIC ADVANCES IN MEDICAL ONCOLOGY 2010; 2:209.
217. David S.T. et al., Sickle Erythrocytes Target Cytotoxics to Hypoxic Tumor Microvessels and Potentiate a Tumoricidal Response, PLOS ONE 2013; 8:e52543.
218. Doehn C. et al., Mode-of-Action, Efficacy, and Safety of a Homologous Multi-Epitope Vaccine in a Murine Model for Adjuvant Treatment of Renal Cell Carcinoma, EUROPEAN UROLOGY 2009; 56:123-31.
219. Escudier B, et al., Randomized, Controlled, Double-Blind, Cross-Over Trial Assessing Treatment Preference for Pazopanib Versus Sunitinib in Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma: PISCES Study, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 2014; 32:1412-8.
220. Feldman D.R. et al., Phase I Trial of Bevacizumab Plus Escalated Doses of Sunitinib in Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 2009; 27:1432-9.
221. Figlin R.A. et al., Overall survival with sunitinib versus interferon (IFN)-alfa as first-line treatment of metastatic renal cell carcinoma (mRCC), JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 2008 (Meeting Abstracts); 26:abstr 5024.
222. Fontanella A.N. et al., Quantitative Mapping of Hemodynamics in the Lung, Brain, and Dorsal Window Chamber-Grown Tumors Using a Novel, Automated Algorithm, MICROCIRCULATION 2013; 20:724-35.
223. Golshayan A.R. et al., Metastatic Sarcomatoid Renal Cell Carcinoma Treated With Vascular Endothelial Growth Factor-Targeted Therapy, JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 2009; 27:235-41.
224. Gregory M.P. et al., In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters, NATURE PROTOCOLS 2011; 6:1355-66. 225. Grepin R. et al., Acceleration of clear cell renal cell carcinoma growth in mice following bevacizumab/Avastin treatment: the role of CXCL cytokines, ONCOGENE 2012; 31:1683-94.
226. Grisanzio C. et al., Orthotopic xenografts of RCC retain histological, immunophenotypic and genetic features of tumours in patients, JOURNAL OF PATHOLOGY, 2011; 225:212-21.
227. Sonpavde G., Choueiri T., Precision medicine for metastatic renal cell carcinoma, UROLOGIC ONCOLOGY 2014; 32:5-15 (DOI: 10.1016/j.urolonc.2013.07.010).
228. Hai C., Systems Biology of HBOC-Induced Vasoconstriction, CURRENT DRUG DISCOVERY TECHNOLOGIES 2012; 9:204-11.
229. Hillman G.G. et al., Progression of renal cell carcinoma is inhibited by genistein and radiation in an orthotopic model, BMC CANCER, 2007; 7:4.
230. Hodi F.S. et al., MPDL3280A (anti-PDLl): Clinical activity, safety and biomarkers of an engineered PD-L1 antibody in patients with locally advanced or metastatic tumors, EUROPEAN JOURNAL OF CANCER 2013; 49:S 184.
231. Hudes G. et al., Temsirolimus, Interferon Alfa, or Both for Advanced Renal-Cell Carcinoma, NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE 2007; 356:2271-81.
232. Hutson TE, Axitinib versus sorafenib as first-line therapy in patients with metastatic renal cell carcinoma (mRCC), JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY 2013; 31 (suppl 6): abstr LBA348.
233. Hylander B.L. et al., Origin of the vasculature supporting growth of primary patient tumor xenografts, JOURNAL OF TRANSLATIONAL MEDICINE 2013; 11:1-14.
234. Jason S.H. et al., Stroma-Free Human Hemoglobin A Decreases R3230Ac Rat Mammary Adenocarcinoma Blood Flow and Oxygen Partial Pressure, RADIATION RESEARCH 1997; 147:185-94.
235. Chen J.Y., Scerbo M., Kramer G., A Review of Blood Substitutes: Examining The History, Clinical Trial Results, and Ethics of Hemoglobin-Based Oxygen Carriers, CLINICS (SAO PAULO) 2009; 64:803-13.
236. Kaelin W.G. Jr., The von Hippel-Lindau tumor suppressor protein and clear cell renal carcinoma, CLIN CANCER RES 2007;13:680s-684s.
237. Kaelin W.G. Jr., The Von Hippel-Lindau Tumor Suppressor Gene and Kidney Cancer, CLIN CANCER RES 2004; 10:6290s-6295s.
238. Kersey F.R., Zhang G., Palmer G.M., Dewhirst M.W., Fraser C.L., Stereocomplexed Poly(lactic acid)-Polyethylene glycol) Nanoparticles with Dual-Emissive Boron Dyes for Tumor Accumulation, ACS NANO 2010; 4:4989-96.
239. Kobayashi M., Morita T., Chun N., Matsui A., Takahashi M., Murakami T., Effect of host immunity on metastatic potential in renal cell carcinoma: the assessment of optimal in vivo models to study metastatic behavior of renal cancer cells, TUMOR BIOLOGY 2012; 33:551-9.
240. Kondo K., Klco J., Nakamura E., Lechpammer M., Kaelin W.G. Jr., Inhibition of HIF is necessary for tumor suppression by the von Hippel-Lindau protein, CANCER CELL 2002; 1:237-46.
241. Kondo K. et al., Comprehensive mutational analysis of the VHL gene in sporadic renal cell carcinoma: relationship to clinicopathological parameters, GENES CHROMOSOMES CANCER 2002; 34:58-68.
242. Larkin J. et al., Efficacy of Sequential Treatment with Sunitinib-Everolimus in an Orthotopic Mouse Model of Renal Cell Carcinoma, ANTICANDER RESEARCH 2012; 32:2399-2406.
243. Lee J., Siemann D.W., Koch C.J., Lord E.M., Direct relationship between radiobiological hypoxia in tumors and monoclonal antibody detection of EF5 cellular adducts, INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER 1996; 67:372-8.
244. Lee Y.S. et al., Coexpression of erythropoietin and erythropoietin receptor in von Hippel-Lindau disease-associated renal cysts and renal cell carcinoma, CLIN CANcEr RES 2005; 11:1059-1064.
245. Leiping F., Gang W., Shevchuk M.M., Nanus D.M., Gudas L.J., Generation of a Mouse Model of Von Hippel-Lindau Kidney Disease Leading to Renal Cancers by Expression of a Constitutively Active Mutant of HIFloc, CANCER RESEARCH 2011; 71:6848-6856.
246. Lin W. et al., Laboratory Studies: A novel murine model of human renal cell carcinoma spinal metastasis, JOURNAL OF CLINICAL NEUROSCIENCE 2012; 19:881-3.
247. Liu G., Chen C., Ji J., Biocompatible and biodegradable polymersomes as delivery vehicles in biomedical applications, SOFT MATTER 2012; 8:8811 -21.
248. Lomas H. et al., Polymersome-Loaded Capsules for Controlled Release of DNA, SMALL 2011; 7:2109-19.
249. Ma W.W., Adjei A.A., Novel agents on the horizon for cancer therapy, CA CANCER J CLIN 2009; 59:111 -37.
250. Malik A., Kundu J., Mukherjee S.K., Chowdhury P.K., Myoglobin Unfolding in Crowding and Confinement, JOURNAL OF PHYSICAL CHEMISTRY B 2012;116:12895-8904.
251. Marzilli L., Golden T., Cotter R., Woods A., Peptide sequence information derived by pronase digestion and ammonium sulfate in-source decay matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, J AM SOC SPECTROM 2000;11:1000-1008.
252. Massignani M. et al., Controlling Cellular Uptake by Surface Chemistry, Size, and Surface Topology at the Nanoscale, SMALL 2009; 5:2424-32.
253. Massimo C., Chusilp C., Gabriel N.H., Angiogenesis modulation in cancer research: novel clinical approaches, NATURE REVIEWS DRUG DISCOVERY 2002; 1:415-426.
254. McGee M.C. et al., Improved Intratumoral Oxygenation Through Vascular Normalization Increases Glioma Sensitivity To Ionizing Radiation, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION ONCOLOGY BIOLOGY PHYSICS 2010; 76:1537-1545.
255. Melichar B. et al., First-line bevacizumab combined with reduced dose interferon-alpha2a is active in patients with metastatic renal cell carcinoma, ANN ONCOL 2008; 19:1470-76.
256. Meng F. H., Engbers G.H.M., Feijen J., Biodegradable Polymersomes As A Basis For Artificial Cells: Encapsulation, Release And Targeting, J. CONTROL RELEASE 2005; 101:187-198.
257. Meric-Bernstam F., Gonzalez-Angulo A.M., Targeting the mTOR signaling network for cancer therapy, J CLIN ONCOL 2009; 27:2278-287.
258. Minoru K. et al., Investigative Urology: Establishment and Characterization of Transplantable, Luminescence Labeled Rat Renal Cell Carcinoma Cell Lines, J UROL 2009; 183:2029-35.
259. Miralbell R. et al., Accelerated Radiotherapy, Carbogen, And Nicotinamide In Glioblastoma Multiforme: Report Of European Organization For Research And Treatment Of Cancer Trial 22933, J CLIN ONCOL 1999; 17:3143-49.
260. Moeller B., Dewhirst M.W., HIF-1 and tumour radiosensitivity, BRITISH JOURNAL OF CANCER 2006; 95:1-5.
261. Moeller B.J., Dewhirst M.W., Raising The Bar-How HIF-1 Helps Determine Tumor Radiosensitivity, CELL CYCLE 2004; 3:1107-10.
262. Moeller B.J. et al., Pleiotropic Effects Of HIF-1 Blockade On Tumor Radiosensitivity, CANCER CELL 2005; 8:99-110.
263. Moeller B.J., Richardson R.A., Dewhirst M.W., Hypoxia And Radiotherapy: Opportunities For Improved Outcomes In Cancer Treatment, CANCER AND METASTASIS REVIEWS 2007; 26:241-48.
264. Molina A.M. et al., Phase 1 trial of everolimus plus sunitinib in patients with metastatic renal cell carcinoma, CANCER 2012; 118:1868-76.
265. Molino D., Sepe J., Anastasio P., De Santo N.G., The history of von Hippel-Lindau disease, J NEPHROL 2006;19 Supp:S119-23.
266. Moore E.E. et al., Human Polymerized Hemoglobin for the Treatment of Hemorrhagic Shock when Blood Is Unavailable: The USA Multicenter Trial, JOURNAL OF THE AMERICAN COLLEGE OF SURGEONS 2009;208:1 -13.
267. Motzer R.J. et al., A phase 3 comparative study of nivolumab (anti-PD-1; BMS-936558; ONO-4538) versus everolimus in patients with advanced or metastatic renal cell carcinoma (mRCC) previously treated with antiangiogenic therapy, BJU INTERNATIONAL 2013; 112 Suppl:10.
268. Motzer R.J., Escudier B., Oudard S., et al., Efficacy of everolimus in advanced renal cell carcinoma: a doubleblind, randomised, placebo-controlled phase III trial, LANCET 2008; 372:449-56.
269. Motzer R.J. et al., Phase I Trial of Sunitinib Malate plus Interferon-oc for Patients with Metastatic Renal Cell Carcinoma, CLINICAL GENITOURINARY CANCER 2009; 7:28-33.
270. Motzer R.J. et al., Overall survival and updated results for sunitinib compared with interferon alfa in patients with metastatic renal cell carcinoma, J CLIN ONCOL 2009; 27:3584-90.
271. Motzer R.J. et al., Overall survival and updated results for sunitinib compared with interferon alfa in patients with metastatic renal cell carcinoma, J CLIN ONCOL 2009; 27:3584-90.
272. Motzer R.J. et al., Dovitinib versus sorafenib for third-line targeted treatment of patients with metastatic renal cell carcinoma: an open-label, randomised phase 3 trial, LANCET ONCOLOGY 2014; 15:286-96.
273. Motzer R.J. et al., Tivozanib versus sorafenib as initial targeted therapy for patients with advanced renal cell carcinoma: Results from a phase III randomized, open-label, J CLIN ONCOL 2012; 30(suppl 15):277s, abstr 4501.
274. Mourant J.R. et al., Ligand-Binding To Heme-Proteins: II. Transitions In The Heme Pocket Of Myoglobin, BIOPHYSICAL JOURNAL 1993; 65:1496-507.
275. Mundt A..J., Connell P.P., Campbell T., Hwang J.H., Rotmensch J., Waggoner S., Race And Clinical Outcome In Patients With Carcinoma Of The Uterine Cervix Treated With Radiation Therapy, g Yn ECOLOGIC ONCOLOGY 1998; 71:151-8.
276. Musumeci F., Radi M., Brullo C., Schenone S., Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Receptors: Drugs and New Inhibitors, J. MED. CHEM. 2012; 55:10797-822.
277. Nagasawa H., Uto Y., Kirk K.L., Hori H., Design Of Hypoxia-Targeting Drugs As New Cancer Chemotherapeutics, BIO PHa Rm BULL 2006; 29:2335-42.
278. Najafi F., Sarbolouki M.N., Biodegradable Micelles/Polymersomes From Fumaric/Sebacic Acids And Poly(Ethylene Glycol), BIOMATERIALS 2003; 24:1175-82.
279. Natanson C., Kern S.J., Lurie P., Banks S.M., Wolfe S.M., Cell-free hemoglobin-based blood substitutes and risk of myocardial infarction and death: A meta-analysis, JAMA 2008; 299:2304-12.
280. Nienhaus G.U., Mourant J.R., Chu K., Frauenfelder H., Ligand-Binding To Heme-Proteins - The Effect Of Light On Ligand-Binding In Myoglobin, B iOCHEMISTRY 1994; 33:13413-30.
281. O’Neil C.P., Suzuki T., Demurtas D., Finka A., Hubbell J.A., A Novel Method For The Encapsulation Of Biomolecules Into Polymersomes Via Direct Hydration, LANGMUIR 2009; 25:9025-9.
282. Ordway G.A., Garry D.J., Myoglobin: An Essential Hemoprotein In Striated Muscle, JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY 2004; 207:3441-6.
283. Overgaard J. et al., Misonidazole Combined With Radiotherapy In The Treatment Of Carcinoma Of The Uterine Cervix, IJROBP 1989; 16:1069-72.
284. Overgaard J. et al., Misonidazole Combined With Split-Course Radiotherapy In The Treatment Of Invasive-Carcinoma Of Larynx And Pharynx - Report From The Dahanca-2 Study, IJROBP 1989; 16:1065-8.
285. Overgaard J. et al., A Randomized Double-Blind Phase III Study OfNimorazole As A Hypoxic Radiosensitizer Of Primary Radiotherapy In Supraglottic Larynx And Pharynx Carcinoma, Results Of The Danish Head And Neck Cancer Study (DAHANCA) Protocol 5-85, RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 1998; 46:135-46.
286. Overgaard J., Horsman M.R., Modification Of Hypoxia-Induced Radioresistance In Tumors By The Use Of Oxygen And Sensitizers, SEMINARS IN RADIATION ONCOLOGY 1996; 6:10-21.
287. Overgaard J., Sensitization Of Hypoxic Tumor-Cells - Clinical-Experience, INTERNATIONAL JOURNAL OF RADIATION BIOLOGY 1989; 56:801 -11.
288. Cabrales P., Examining and mitigating acellular hemoglobin vasoactivity, ANTIOXID REDOX SIGNAL 2013; 18:2329-41.
289. Palaparthy R., Wang H.S., Gulati A., Current Aspects In Pharmacology Of Modified Hemoglobins, ADV DRUG DELIV. REV 2000; 40:185-98.
290. Palmer A.F., Sun G., Harris D.R., Tangential flow filtration of hemoglobin, BIOTECHNOLOGY PROGRESS 2009; 25:189-99.
291. Palmer G.M., Boruta R.J., Viglianti B.L., Lan L., Spasojevic I., Dewhirst M.W., Non-Invasive Monitoring Of Intra-Tumor Drug Concentration And Therapeutic Response Using Optical Spectroscopy, J CONTROL RELEASE 2010; 142:457-64.
292. Palmer G.M., Viola R.J., Schroeder T., Yarmolenko P.S., Dewhirst M.W., Ramanujam N., Quantitative Diffuse Reflectance And Fluorescence Spectroscopy: Tool To Monitor Tumor Physiology In Vivo, JOURNAL OF BIOMEDICAL OPTICS 2009; 14:024010.
293. Palmer G.M. et al., In vivo optical molecular imaging and analysis in mice using dorsal window chamber models applied to hypoxia, vasculature and fluorescent reporters, NAT PROTOC 2011; 6:1355-66.
294. Palmer G.M., Fontanella A.N., Zhang G., Hanna G., Fraser C.L., Dewhirst M.W., Optical imaging of tumor hypoxia dynamics, J BIOMED OPT. 2010; 15:066021.
295. Pangu G.D., Davis K.P., Bates F.S., Hammer D.A., Ultrasonically Induced Release from Nanosized Polymer Vesicles, MACROMOL. BIOSCI. 2010; 10:546-54.
296. Papadopoulou M.V., Ji M., Rao M.K., Bloomer W.D., 4- 3-(2-Nitro-1 -Imidazolyl)Propylamino -7-Chloroquinoline Hydrochloride (NLCQ-1), A Novel Bioreductive Compound As A Hypoxia-Selective Cytotoxin, ONCOLOGY RESEARCH 2000; 12:185-92.
297. Papadopoulou M.V., Ji M., Rao M.K., Bloomer W.D., 4-3-(2-Nitro-1-Imidazolyl)Propylamino -7-Chloroquinoline Hydrochloride (NLCQ-1), A Novel Bioreductive Agent As Radiosensitizer In Vitro And In Vivo: Comparison With Tirapazamine, ONCOLOGY RESEARCH 2000; 12:325-33.
298. Patel P.H., Senico P.L., Curiel R.E., Motzer R.J., Phase I Study Combining Treatment with Temsirolimus and Sunitinib Malate in Patients with Advanced Renal Cell Carcinoma, CLINICAL GENITOURINARY CANCER 2009;7:24-7.
299. Patton J.N., Palmer A.F., Physical Properties of Hemoglobin-Poly(acrylamide) Hydrogel-Based Oxygen Carriers: Effect of Reaction pH, LANGMUIR 2006; 22:2212-21.
300. Photos P.J., Bacakova L., Discher B., Bates F.S., Discher D.E., Polymer Vesicles In Vivo: Correlations With PEG Molecular Weight, J. CONTROL RELEASE 2003; 90:323-34.
301. P.L., Griko Y.V., Venyaminov S.Y., Kutyshenko V.P., Cold Denaturation Of Myoglobin, JOURNAL OF MOLECULAR BIOLOGY 1986; 190:487-98.
302. Qi W., Ghoroghchian P.P., Li G., Hammer D.A., Therien M.J., Aqueous self-assembly of polyethylene oxide)-block-poly([varepsilon]-caprolactone) (PEO-b-PCL) copolymers: disparate diblock copolymer compositions give rise to nano- and meso-scale bilayered vesicles, n An OSCALE 2013; 5:10908-15.
303. Rabotyagova O.S., Cebe P., Kaplan D.L., Self-Assembly of Genetically Engineered Spider Silk Block Copolymers, BIOMACROMOLECULES 2009; 10:229-36.
304. Rameez S., Banerjee U., Fontes J., Roth A., Palmer A.F., Reactivity of Polymersome Encapsulated Hemoglobin with Physiologically Important Gaseous Ligands: Oxygen, Carbon Monoxide, and Nitric Oxide, MACROMOLECULES 2012; 45:2385-9.
305. Rameez S., Alosta H., Palmer A.F., Biocompatible And Biodegradable Polymersome Encapsulated Hemoglobin: A Potential Oxygen Carrier, BIOCONJUGATE CHEM 2008; 19:1025-32.
306. Rameez S., Bamba I., Palmer A.F., Large Scale Production of Vesicles by Hollow Fiber Extrusion: A Novel Method for Generating Polymersome Encapsulated Hemoglobin Dispersions, lAn GMUIR 2010; 26:5279-85.
307. Raval R.R. et al., Contrasting properties of hypoxia-inducible factor 1 (H1F-1) and HIF-2 in von Hippel-Lindauassociated renal cell carcinoma, MOL CELL BIOL 2005; 25:5675-86.
308. Rini B. et al., AMG 386 in combination with sorafenib in patients with metastatic clear cell carcinoma of the kidney, CANCER 2012; 118:6152-61.
309. Rini B. et al., Bevacizumab plus interferon alfa compared with interferon alfa monotherapy in patients with metastatic renal cell carcinoma: CALGB 90206, J CLIN o Nc OL 2008; 26:5422-8.
310. Rischin D. et al., Tirapazamine, Cisplatin, and Radiation Versus Cisplatin and Radiation for Advanced Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck (TROG 02.02, HeadSTART): A Phase III Trial of the Trans-Tasman Radiation Oncology Group, J CLIN ONCOL 2010; 28:2989-95.
311. Robbins G.P., Jimbo M., Swift J., Therien M.J., Hammer D.A., Dmochowski I.J., Photoinitiated Destruction of Composite Porphyrin-Protein Polymersomes, J AM CHEM SOC 2009; 131:3872-4.
312. Roberts K.B. et al., Interim Results Of A Randomized Trial Of Mitomycin C As An Adjunct To Radical Radiotherapy In The Treatment Of Locally Advanced Squamous-Cell Carcinoma Of The Cervix, INT. J. CANCER 2000; 90:206-23.
313. Robinson M.F., Dupuis N.P., Kusumoto T., Liu F., Menon K., Teicher B.A., Increased Tumor Oxygenation And Radiation Sensitivity In 2 Rat-Tumors By A Hemoglobin-Based, Oxygen-Carrying Preparation, ARTIF. CELLS BLOOD SUBSTIT. IMMOBIL. BIOTECHNOL. 1995; 23:431-8.
314. Rockwell S., Dobrucki I.T., Kim E.Y., Marrison S.T., Vu V.T., Hypoxia and Radiation Therapy: Past History, Ongoing Research, and Future Promise, Cu RRENT MOLECULAR MEDICINE 2009; 9:442-58.
315. Rockwell S., Oxygen Delivery: Implications For The Biology And Therapy Of Solid Tumors, ONCOLOGY RESEARCH 1997; 9:383-90.
316. Rofstad E.K., Sundfor K., Lyng H., Trope C.G., Hypoxia-Induced Treatment Failure In Advanced Squamous Cell Carcinoma Of The Uterine Cervix Is Primarily Due To Hypoxia Induced Radiation Resistance Rather Than Hypoxia-Induced Metastasis, BRITISH JOURNAL OF CANCER 2000; 83:354-9.
317. Rosenthal D.I., Nurenberg P., Becerra C.R., et al. A Phase I Single-Dose Trial Of Gadolinium Texaphyrin (Gd-Tex), A Tumor Selective Radiation Sensitizer Detectable By Magnetic Resonance Imaging, CLINICAL CANCER RESEARCH 1999; 5:739-45.
318. Rowinsky E.K., Novel Radiation Sensitizers Targeting Tissue Hypoxia, ONCOLOGY (WILLISTON PARK) 1999; 13:61-70.
319. Rosenthal D.I., Nurenberg P., Becerra C.R., et al. A Phase I Single-Dose Trial Of Gadolinium Texaphyrin (Gd-Tex), A Tumor Selective Radiation Sensitizer Detectable By Magnetic Resonance Imaging, CLINICAL CANCER RESEARCH 1999; 5:739-45.
320. Rudat V., Vanselow B., Wollensack P., et al. Repeatability And Prognostic Impact Of The Pretreatment Po(2) Histography In Patients With Advanced Head And Neck Cancer, RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 2000; 57:31-7.
321. Sabatini D.M., MTOR and cancer: insights into a complex relationship, NAT REV CANCER 2006; 6:729-34.
322. Sakai H., Hamada K., Takeoka S., Nishide H., Tsuchida E., Functional Evaluation Of Hemoglobin- And Lipidheme-Vesicles As Red Cell Substitutes, POLYMERS FOR ADVANCED TECHNOLOGIES 1996; 7:639-44.
323. Sakai H. et al., NO And CO Binding Profiles Of Hemoglobin Vesicles As Artificial Oxygen Carriers, BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA-PROTEINS AND PROTEOMICS 2008; 1784:1441-7.
324. Salumbides B.C., Lehet K.M., Ndikuyeze G., Pili R., Pre-clinical models of renal carcinoma and their utility in drug development, CURR PROTOC PHARMACOL. Dec. 2009; Chapter 14:Unit 14.13.
325. Sanson C., Le Meins J.F., Schatz C., Soum A., Lecommandoux S., Temperature Responsive Poly(Trimethylene Carbonate)-Block-Poly(L-Glutamic Acid) Copolymer: Polymersomes Fusion And Fission, SOFT MATTER 2010; 6:1722-30.
326. Sartorelli A.C. et al., Mitomycin-C - A Prototype Bioreductive Agent, ONCOLOGY RESEARCH 1994; 6:501 -8.
327. Saunders M., Dische S., Clinical Results Of Hypoxic Cell Radiosensitisation From Hyperbaric Oxygen To Accelerated Radiotherapy, Carbogen And Nicotinamide, BRITISH JOURNAL OF CANCER 1996; 74:S271-8. 328. Schatz C., Louguet S., Le Meins J.F., Lecommandoux S., Polysaccharide-Block-Polypeptide Copolymer Vesicles: Towards Synthetic Viral Capsids, ANGEW. CHEM. INT. EDIT 2009; 48:2572-5.
329. Schraml P. et al., VHL mutations and their correlation with tumour cell proliferation, microvessel density, and patient prognosis in clear cell renal cell carcinoma, J PATHOL 2002; 196:186-93.
330. Shasha D., George M.J., Harrison L.B., Once-Weekly Dosing Of Epoetin-Alfa Increases Hemoglobin And Improves Quality Of Life In Anemic Cancer Patients Receiving Radiation Therapy Either Concomitantly Or Sequentially With Chemotherapy, CANCER 2003; 98:1072-9.
331. Shasha D., The Negative Impact Of Anemia On Radiotherapy And Chemoradiation Outcomes, SEMINARS IN HEMATOLOGY 2001; 38:8-15.
332. Shibamoto Y., Zhou L., Hatta H., Mori M., Nishimoto S., In Vivo Evaluation Of A Novel Antitumor Prodrug, 1-(2’-Oxopropyl)-5-Fluorouracil (OFU001), Which Releases 5-Fluorouracil Upon Hypoxic Irradiation, IJROBP 2001; 49:407-13.
333. Shibuya M., Vascular endothelial growth factor-dependent and -independent regulation of angiogenesis, BMB REP 2008; 41:278-86.
334. Shum H.C., Kim J.W., Weitz D.A., Microfluidic Fabrication Of Monodisperse Biocompatible And Biodegradable Polymersomes With Controlled Permeability, J AM CHEM SOC 2008; 130:9543-9.
335. Siemann D.W., Hinchman C.A., Potentiation Of Cisplatin Activity By The Bioreductive Agent Tirapazamine, RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 1998; 47:215-20.
336. Sivanand S. et al., A Validated Tumorgraft Model Reveals Activity of Dovitinib Against Renal Cell Carcinoma, SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE 2012; 4:137ra75.
337. Sivanesaratnam V., Jayalakshmi P., Mitomycin-C Adjuvant Chemotherapy After Wertheim Hysterectomy For Stage-Ib Cervical-Cancer, CANCER 1989; 64:798-800.
338. Smaldone M.C., Fung C., Uzzo R.G., Haas N.B., Adjuvant and Neoadjuvant Therapies in High-Risk Renal Cell Carcinoma, HEMATOLOGY/ONCOLOGY CLINICS OF NORTH AMERICA 2011; 25:765-91.
339. Sonpavde G., Willey C.D., Sudarshan S., Fibroblast growth factor receptors as therapeutic targets in clear-cell renal cell carcinoma, EXPERT OPINION ON INVESTIGATIONAL DRUGS 2014; 23:305-15.
340. Sonveaux P. et al., Oxygen Regulation of Tumor Perfusion by S-Nitrosohemoglobin Reveals a Pressor Activity of Nitric Oxide. Circulation Research 2005; 96:1119-26.
341. Sorg B.S., Hardee M.E., Agarwal N., Moeller B.J., Dewhirst M.W., Spectral Imaging Facilitates Visualization And Measurements Of Unstable And Abnormal Microvascular Oxygen Transport In Tumors, J. BIOMED. OPT.
2008; 13:014026.
342. Sorg B.S., Moeller B.J., Donovan O., Cao Y.T., Dewhirst M.W., Hyperspectral Imaging Of Hemoglobin Saturation In Tumor Microvasculature And Tumor Hypoxia Development, JOURNAL OF BIOMEDICAL OPTICS 2005; 10:044004.
343. Stadler P. et al., Influence Of The Hypoxic Subvolume On The Survival Of Patients With Head And Neck Cancer, IJROBP 1999; 44:749-54.
344. Stadler P., Feldmann H.J., Creighton C., Kau R., Molls M., Changes In Tumor Oxygenation During Combined Treatment With Split-Course Radiotherapy And Chemotherapy In Patients With Head And Neck Cancer, RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 1998; 48:157-64.
345. Strube A., Stepina E., Mumberg D., Scholz A., Hauff P., Kakonen S.M., Characterization of a new renal cell carcinoma bone metastasis mouse model, CLIN EXP METASTASIS 2010;27:319-30.
346. Stuben G., Stuschke M., Knuhmann K., Horsman M.R., Sack H., The Effect Of Combined Nicotinamide And Carbogen Treatments In Human Tumour Xenografts: Oxygenation And Tumour Control Studies, RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 1998; 48:143-8.
347. Takeshi K. et al., Definitive Radiotherapy Combined With High-Dose-Rate Brachytherapy For Stage III Carcinoma Of The Uterine Cervix: Retrospective Analysis Of Prognostic Factors Concerning Patient Characteristics And Treatment Parameters, IJROBP 1998; 41:319-27.
348. Tang P.A., Heng D.Y.C., Programmed death 1 pathway inhibition in metastatic renal cell cancer and prostate cancer, CURRENT ONCOLOGY REPORTS 2013; 15:98-104.
349. Teicher B.A., Herman T.S., Hopkins R.E., Menon K., Effect Of A Bovine Hemoglobin Preparation On The Response Of The Fsaiic Fibrosarcoma To Chemotherapeutic Alkylating-Agents, J. CANCER RES CLIN ONCOL 1992; 118:123-8.
350. Teicher B.A. et al., Oxygenation Of The Rat-9l Gliosarcoma And The Rat-13672 Mammary-Carcinoma With Various Doses Of A Hemoglobin Solution, ARTIF. CELLS BLOOD SUBSTIT. IMMOBIL. BIOTECHNOL. 1994; 22:827-33.
351. Teicher B.A., Holden S.A., Menon K., Hopkins R.E., Gawryl M.S., Effect Of Hemoglobin Solution On The Response Of Intracranial And Subcutaneous Tumors To Antitumor Alkylating-Agents, CANCER CHEMOTHER. PHARMACOL. 1993; 33:57-62.
352. Teicher B.A., Physiological-Mechanisms of Therapeutic Resistance - Blood-Flow and Hypoxia, HEMATOLOGY-ONCOLOGY CLINICS OF NORTH AMERICA 1995; 9:475-506.
353. Teicher B.A., Schwartz G.N., Sotomayor E.A., Robinson M.F., Dupuis N.P., Menon K., Oxygenation Of Tumors By A Hemoglobin Solution, J. CANCER RES CLIN ONCOL 1993; 120:85-90.
354. Treat J. et al., Tirapazamine With Cisplatin In Patients With Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer: A Phase II Study, J CLIN ONCOL 1998; 16:3524-7.
355. Van Dongen S.F.M., Nallani M., Schoffelen S., Cornelissen J., Nolte R.J.M., Van Hest J.C.M., A Block Copolymer For Functionalisation Of Polymersome Surfaces, MACROMOLECULAR RAPID COMMUNICATIONS 2008; 29:321-5.
356. Von Pawel J. et al., Tirapazamine Plus Cisplatin Versus Cisplatin In Advanced Non-Small-Cell Lung Cancer: A Report Of The International CATAPULT I Study Group, Cisplatin and Tirapazamine in Subjects with Advanced Previously Untreated Non-Small-Cell Lung Tumors, J CLIN o Nc OL 2000; 18:1351-9.
357. Walsh L. et al., Efficacy of ablative high-dose-per-fraction radiation for implanted human renal cell cáncer in a nude mouse model, EUROPEAN UROLOGY 2006; 50:795-800.
358. Walter S. et al., Multipeptide immune response to cancer vaccine IMA901 after single-dose cyclophosphamide associates with longer patient survival, NATURE MEDICINE 2012; 18:1254-61.
359. Wang F., Wang Y.C., Yan L.F., Wang J., Biodegradable Vesicular Nanocarriers Based On Poly(Epsilon-Caprolactone)-Block-Poly(Ethyl Ethylene Phosphate) For Drug Delivery, POLYMER 2009; 50:5048-54.
360. Wang L. et al., Encapsulation of Biomacromolecules within Polymersomes by Electroporation, ANGEW CHEM INT ED ENGL.2012; 51:11122-5.
361. Wasserman T.H. et al., Clinical-T rials With Etanidazole (Sr-2508) By The Radiation-Therapy Oncology Group (RTOG), RADIOTHERAPY AND ONCOLOGY 1991; 20:129-35.
362. Weitman S. et al., Evidence Of Enhanced In Vivo Activity Using Tirapazamine With Paclitaxel And Paraplatin Regimens Against The MV-522 Human Lung Cancer Xenograft, CANCER CHEMOTHER PHARMACOL 1999; 43:402-8.
363. Williams K.J. et al., In Vivo Activation Of The Hypoxia-Targeted Cytotoxin AQ4N In Human Tumor Xenografts, MOLECULAR CANCER THERAPEUTICS 2009; 8:3266-75.
364. Wilson D., Evans S., Jenkins W., Vinogradov S., Ong E., Dewhirst M., Oxygen Distributions within R3230AC Tumors Growing in Dorsal Flap Window Chambers in Rats, ADV EXP MED B iOl .1998; 454:603-9.
365. Wittenberg J.B., Wittenberg B.A., Myoglobin Function Reassessed, JOURNAL OF EXPERIMENTAL BIOLOGY 2003; 206:2011 -20.
366. Wood C.G., Figlin R.A., ADAPT: An Ongoing international phase 3 randomized trial of autologous dendritic cell Immunotherapy (AGS 003) plus standard treatment in advanced renal cell carcinoma (RCC), BJU INTERNATIONAL 2013; 112:11 -2.
367. Wouters B.G. et al., Hypoxia As A Target For Combined Modality Treatments, EUROPEAN JOURNAL OF CANCER 2002; 38:240-57.
368. Yildiz M.E., Prud’homme R.K., Robb I., Adamson D.H., Formation And Characterization Of Polymersomes Made By A Solvent Injection Method, POLYMERS FOR ADVANCED TECHNOLOGIES 2007; 18:427-32.
369. Yu M.H., Dai M., Liu Q., Xiu R.J., Oxygen Carriers And Cancer Chemo- And Radiotherapy Sensitization: Bench To Bedside And Back, CANCER TREATMENT REVIEWS 2007; 33:757-61.
370. Yuen J.S.P. et al., Inhibition of angiogenic and non-angiogenic targets by sorafenib in renal cell carcinoma (RCC) in a RCC xenograft model, BRITISH JOURNAL OF CANCER 2011; 104:941-7.
371. Zhan H.W., Liu H.B., Bao C.K., Ye X.J., Zhang H., He G.Q., Effect Of Carbogen On Tumour Oxygenation And 32P-Colloid Interstitial Irradiation Response, MED SCI MONIT 2010; 16:BR11-6.
372. Zhang G.Q., Palmer G.M., Dewhirst M., Fraser C.L., A Dual-Emissive-Materials Design Concept Enables Tumour Hypoxia Imaging, NATURE MATERIALS 2009; 8:747-51.
373. Zhang X.L. et al., Key Parameters Affecting The Initial Leaky Effect Of Hemoglobin-Loaded Nanoparticles As Blood Substitutes, J MATER SCI METER MED. 2008; 19:2463-70.
374. Zupancich J.A., Bates F.S., Hillmyer M.A., Aqueous Dispersions Of Poly(Ethylene Oxide)-B-Poly(Gamma-Methyl-Epsilon-Caprolactone) Block Copolymers, MACROMOLECULES 2006; 39:4286-8.
375. IARC CancerBase No. 10. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010.
376. Lam, John S.; Leppert, John T.; Belldegrun, Arie S., Figlin, Robert A., Novel approaches in the therapy of metastatic renal cell carcinoma, WORLD JOURNAL OF UROLo Gy 20015; 23:202-12.
377. Patil S., Manola J., Elson P., Negrier S., Escudier B., Eisen T., Atkins M., Bukowski R., Motzer R.J., Improvement in Overall Survival of Patients with Advanced Renal Cell Carcinoma: Prognostic Factor Trend Analysis from an International Data Set of Clinical Trials, JUROL. 2012; 188: 2095-100.
378. Shih Y.C., Chien C.R., Xu Y., Pan I.W., Smith G.L., Buchholz T.A., Economic burden of renal cell carcinoma in the US: Part II--an updated analysis, PHARMACOECONOMICS 2011; 29:331-41.
379. Helfand C., Top twenty orphan drugs by 2018, FREEPHARMA (July 23, 2013), http://www.fiercepharma.com/special-reports/top-20-orphan-drugs-2018.
380. Global Industry Analysts, Inc., Kidney Cáncer Drugs: A Global Strategic Business Report (2011), available at http://www.strategyr.com/Kidney_Cancer_Drugs_Market_ Report.asp.
381. Vítecek J., Lojek A., Valacchi G., Kubala L., Arginine-Based Inhibitors of Nitric Oxide Synthase: Therapeutic Potential and Challenges, MEDIATORS OF INFLAMMATION 2012; Article ID 318087.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
La invención se define según las reivindicaciones adjuntas. Diversos aspectos de la descripción incluyen métodos para causar embolización microvascular mediada por nanopartículas (NME) en un tumor, que incluyen administrar un agente que afecta el óxido nítrico (NO) a un tumor. En algunos aspectos, administrar el agente que afecta el NO al tumor incluye la introducción del agente que afecta el NO en la circulación sistémica, en la cual el agente que afecta el NO no afecta la actividad normal del NO en la circulación sistémica, y la acumulación del agente que afecta el NO dentro del tumor se basa, al menos en parte, en una mayor retención y permeabilidad de la microvasculatura tumoral.
En algunos aspectos, el agente que afecta el NO son las moléculas de unión a NO encapsuladas dentro de las partículas portadoras, y la prevención selectiva de la actividad normal del NO incluye la captura selectiva de NO en la microvasculatura tumoral. En algunos aspectos, las partículas portadoras se seleccionan del grupo que consiste en nanopartículas y micropartículas, y en las que las partículas portadoras incluyen al menos uno de fosfolípidos, polímeros sintéticos, polipéptidos, y ácidos polinucleicos. En algunos aspectos, las nanopartículas son polimerosomas.
En algunos aspectos, las moléculas de unión a NO se unen competitivamente al oxígeno (O2) y NO, en el que la introducción del agente que afecta el NO en la circulación sistémica incluye la introducción de moléculas de unión a NO oxigenadas en la circulación sistémica, en el que las moléculas de unión a NO se desoxigenan al acumularse las partículas portadoras en el tumor, lo que permite de ese modo la captura selectiva de NO en la microvasculatura tumoral.
En algunos aspectos, la acumulación del agente que afecta el NO en el tumor permite la difusión del NO en las partículas portadoras, en las cuales la captura selectiva de NO se realiza al menos en parte mediante la desoxigenación de las moléculas de unión a NO encapsuladas. En algunos aspectos, el agente que afecta el NO incluye además moléculas de unión a NO asociadas a la superficie, en las que la captura selectiva de NO se realiza al menos en parte por desoxigenación de la molécula de unión a NO asociada a la superficie. En algunos aspectos, las moléculas de unión a NO solo liberan oxígeno a tensiones inferiores a 10 mmHg.
En algunos aspectos, las moléculas de unión a NO se seleccionan de una o más de mioglobina humana no modificada, mioglobina no modificada de otra especie biológica, y mioglobina modificada química o genéticamente de seres humanos o de otra especie biológica. En algunos aspectos, la prevención selectiva de la actividad normal de NO en la vasculatura tumoral provoca vasoconstricción y agregación plaquetaria en la vasculatura tumoral. En algunos aspectos, la presión hidrodinámica persistente en la vasculatura tumoral provoca la ruptura de la agregación plaquetaria y la hemorragia hacia el tumor. En algunos aspectos, la hemorragia hacia el tumor causa trombosis de la vasculatura tumoral y necrosis del tejido tumoral.
En algunos aspectos, las moléculas de unión a NO asociadas a la superficie incluyen mioglobina unida a la superficie. En algunos aspectos, la administración del agente que afecta el NO al tumor incluye la administración del agente que afecta el NO junto con al menos uno de un inhibidor de tirosina cinasa (TKI) del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), un inhibidor de la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR), y radioterapia. En algunos aspectos, el agente que afecta el NO incluye además al menos uno de un agente de quimioterapia y un agente inhibidor de la angiogénesis coencapsulado con las moléculas de unión a NO dentro de las partículas portadoras. En algunos aspectos, el agente que afecta el NO incluye al menos uno de un inhibidor de NO sintasa (NOS) y un antioxidante.
En otros aspectos, las composiciones incluyen un agente inhibidor de óxido nítrico (NO), y un vehículo portador, en las que el agente inhibidor de NO se incorpora química o no covalentemente al vehículo portador de manera que la actividad de NO no se ve afectada cuando el vehículo portador está en circulación sistémica, y la actividad de No se inhibe después de la extravasación del vehículo portador de la circulación hacia un tumor. En algunos aspectos, la inhibición de la actividad de NO implica la unión de NO, en la que la unión de NO se habilita solo a tensiones de oxígeno de menos de 5 mmHg.
En algunos aspectos, el vehículo portador es una vesícula de polímero sintético, en la cual el agente inhibidor de NO está dentro de un núcleo acuoso de la vesícula de polímero. En otros aspectos, el vehículo portador comprende una vesícula de polímero sintético, y el agente inhibidor de NO está dentro de una porción membranosa de la vesícula de polímero. En algunos aspectos, el vehículo portador es una vesícula de polímero sintético, y el agente inhibidor de NO está unido a la superficie exterior de la vesícula de polímero. En otros aspectos, el vehículo portador es un polimerosoma uni- o multilaminar.
En algunas composiciones de la realización, el vehículo portador incluye una pluralidad de polímeros biodegradables. En otros aspectos, la pluralidad de polímeros biodegradables forma una nanopartícula. En algunos aspectos, la nanopartícula tiene menos de 200 nanómetros de diámetro, y en otros aspectos, la nanopartícula tiene menos de 100 nanómetros de diámetro.
En algunos aspectos, el vehículo portador coencapsula el agente inhibidor de NO con al menos otro agente quimioterapéutico o sensibilizador a la radiación. En otros aspectos, el vehículo portador se selecciona de al menos uno de una micela, una nanopartícula sólida, un polimerosoma, y un liposoma. En otros aspectos, el vehículo portador es una nanopartícula, y la composición incluye además una pluralidad de las nanopartículas configuradas para acumularse en sitios de interés mediante difusión pasiva o mediante una modalidad seleccionadora de dianas compuesta de una conjugación de una molécula seleccionadora de dianas separada de las nanopartículas. En algunos aspectos, la al menos parte de la pluralidad de nanopartículas son vesículas de polímero biodegradable, y al menos parte de la pluralidad de vesículas de polímero son vesículas de polímero biocompatible. En algunos aspectos, las vesículas de polímero biocompatible incluyen poli(óxido de etileno) o poli(etilenglicol). En otros aspectos, las vesículas de polímero biodegradable incluyen poli( e-caprolactona). En otras composiciones de la realización, las vesículas de polímero biodegradable incluyen poli(g-metil e-caprolactona). En otros aspectos, las vesículas de polímero biodegradable incluyen poli(trimetilcarbonato).
En algunos aspectos, las vesículas de polímero biodegradable incluyen al menos un copolímero de bloques de poli(óxido de etileno) y poli(e-caprolactona). En otros aspectos, las vesículas de polímero biodegradable incluyen al menos un copolímero de bloques de poli(óxido de etileno) y poli(g-metil e-caprolactona). En otros aspectos, las vesículas de polímero biodegradable incluyen al menos un copolímero de bloques de poli(óxido de etileno) y poli(trimetilcarbonato). En otros aspectos, las vesículas de polímero biodegradable son puras o mezclas de copolímero de múltiples bloques, en las que el copolímero incluye al menos uno de poli(óxido de etileno) (PEO), poli(lactida) (PLA), poli(glicolida) (PLGA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), poli(e-caprolactona) (PCL), y poli(carbonato de trimetileno) (PTMC), poli(ácido láctico), poli(metil e-caprolactona).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Los dibujos adjuntos ilustran aspectos ejemplares de la invención, y junto con la descripción general dada anteriormente y la descripción detallada dada a continuación, sirven para explicar las características de la invención. La FIG. 1 es un gráfico que ilustra la curva de disociación de oxígeno de la hemoglobina.
La FIG. 2 es un gráfico que ilustra las curvas de disociación de oxígeno de la hemoglobina, y agentes de ejemplo que pueden usarse para manipular los niveles de oxígeno en los tejidos según diversas realizaciones.
La FIG. 3 es un gráfico que ilustra las curvas de disociación de oxígeno de la hemoglobina y la mioglobina. La FIG. 4A es una ilustración de polímeros biodegradables que pueden ser un componente de un portador de oxígeno celular biodegradable en diversas realizaciones.
La FIG. 4B es una ilustración de fluoróforos de infrarrojo cercano solubles en agua “◊” y proteínas de unión a oxígeno solubles en agua “o” que pueden usarse como componentes de un portador de oxígeno celular biodegradable en diversas realizaciones.
La FIG. 4C es una ilustración de la síntesis de mioglobina encapsulada en polimerosomas a nanoescala (PEM) y procedimientos de procesamiento (calor, ultrasonidos, y extrusión) usados para producir PEM a nanoescala según diversas realizaciones.
La FIG. 4D es una ilustración de un esquema de encapsulamiento de una realización polimérica.
La FIG. 4E es una micrografía electrónica de transmisión criogénica y una micrografía confocal de PEM.
La FIG. 5 es un conjunto de fotografías que ilustran el campo brillante (A), la tensión de oxígeno (B) en % de oxígeno, y la vasculatura sanguínea funcional (C) para un tumor de cámara de ventana.
La FIG. 6A es una micrografía electrónica de transmisión criogénica de polimerosomas a base de PEO(2K)-¿>-PCL(12K) en agua desionizada (5 mg/ml) que ilustra el grosor del núcleo de la membrana de las vesículas como 22.5 ± 2,3 nanómetros.
La FIG. 6B es un gráfico que ilustra la liberación in situ acumulativa de doxorrubicina, cargada dentro de polimerosomas a base de PEO(2K)-b-PCL(12K) de 200 nm de diámetro, bajo diversas condiciones fisiológicas (pH 5.5 y 7,4; T = 37°C) tal como se midió fluorométricamente durante 14 días.
La FIG. 7A es una imagen óptica in vivo de fluoróforos de infrarrojo cercano (NIR) basados en oligo(porfirina) encapsulados (NIRFs) que ilustra la acumulación de un portador de la realización en tumores.
La FIG. 7B es un gráfico de crecimiento tumoral in vivo inhibido por disolución salina amortiguada con fosfato (PBS), doxorrubicina (DOX), DOX encapsulada en liposomas, y DOX encapsulada en polimerosomas.
La FIG. 8A es un gráfico de barras que ilustra las eficiencias de encapsulamiento de hemoglobina (Hb) de cuatro formulaciones de Hb bovina y humana encapsuladas en polimerosomas después de la extrusión a través de membranas de policarbonato de 200 nm de diámetro.
La FIG. 8B es un gráfico de barras que ilustra la P50 (mmHg) de glóbulos rojos, hemoglobina, y cuatro formulaciones de hemoglobina encapsulada en polimerosomas después de la extrusión a través de membranas de policarbonato de 200 nm.
La FIG. 9 es un diagrama de flujo del procedimiento que ilustra un método de realización para la preparación y suministro de un portador de oxígeno basado en mioglobina (MBOC).
La FIG. 10 es un diagrama de flujo del procedimiento que ilustra un método de realización para preparar un polimerosoma que incluye al menos un polímero biocompatible y al menos un polímero biodegradable.
La FIG. 11 es una ilustración esquemática de etapas optimizadas para la generación de PEM.
La FIG. 12 es un conjunto de gráficos de barras que cuantifican las concentraciones de mioglobina y los porcentajes en peso de mioglobina a polímero en suspensiones de PEM formadas por el método de la FIG. 11.
La FIG. 13A es un gráfico que ilustra la saturación de oxígeno de PEM que tiene mioglobina asociada tanto en la superficie como en las cavidades acuosas de los polimerosomas (es decir, PEM-SE), PEM que tiene mioglobina asociada solo en las cavidades acuosas de los polimerosomas (es decir, PEM-E), y mioglobina libre, como una función de la presión parcial de oxígeno.
La FIG. 13B es un gráfico que ilustra el curso del tiempo cinético para la disociación de oxígeno de PEM, en el que toda la mioglobina no encapsulada y asociada a la superficie se había eliminado mediante proteólisis, y en el que la mioglobina restante se había reducido a oximioglobina en presencia de 1,5 mg/ml de Na2S2O4.
La FIG. 13C es un gráfico que ilustra el curso del tiempo cinético para la desoxigenación de PEM mediada por NO, en el que toda la mioglobina no encapsulada y asociada a la superficie se había eliminado mediante proteólisis, y en el que la mioglobina restante se había reducido a oximioglobina.
La FIG. 14 es una tabla que muestra las constantes cinéticas de velocidad para la disociación de oxígeno (Koff, O2) y la desoxigenación mediada por NO (Kox, no) para diversas formulaciones de PEM en comparación con la mioglobina (Mb) libre (sin encapsular).
La FIG. 15A es un conjunto de imágenes ópticas in vivo de la biodistribución de NIR-mioglobina, polimerosomas vacíos, y PEM en cuatro puntos temporales después de la inyección intravenosa.
La FIG. 15B es un gráfico que ilustra las acumulaciones tumorales de NIR-mioglobina, polimerosomas vacíos, y PEM como funciones del tiempo.
La FIG. 15C es un gráfico que ilustra las concentraciones plasmáticas de mioglobina de NIR-mioglobina y PEM en función del tiempo.
La FIG. 16 es un conjunto de imágenes que muestran el tratamiento de PEM de tumores mamarios ortotópicos singénicos 4T1.
La FIG. 17 es un gráfico que ilustra la concentración de hemoglobina intratumoral total en función del tiempo para los tumores tratados con PEM que se muestran en la FIG. 16, así como para tumores tratados con NIR-mioglobina y polimerosomas vacíos.
La FIG. 18A es un conjunto de imágenes de campo claro de tumor y tejidos normales circundantes a lo largo del tiempo después del tratamiento con PEM.
La FIG. 18B es un conjunto de imágenes del tumor de la FIG. 18A a 24 h después de la administración de PEM. La FIG. 19A es un conjunto de imágenes que muestran la saturación de hemoglobina (%) en tumores antes y alrededor de las 4 horas posteriores al tratamiento con PEM y polimerosomas vacíos.
La FIG. 19B es un conjunto de imágenes que muestran la velocidad de flujo (mm/s) en tumores antes y alrededor de 4 horas después del tratamiento con PEM y polimerosomas vacíos.
La FIG. 20 es un conjunto de imágenes fluorescentes representativas e imágenes de hematoxilina y eosina de tumores extirpados para el control de NIR-mioglobina y animales tratados con PEM.
La FIG. 21 es una tabla que ilustra los resultados de un panel de química del suero para animales tratados con PEM.
Las FIGs. 22A y 22B son conjuntos de imágenes de hematoxilina y eosina de hígados extirpados de ratones con tumores tratados con PEM y polimerosomas vacíos.
La FIG. 22C es un conjunto de imágenes que muestran tumores RENCA de aloinjerto en ratones tratados con PEM.
La FIG. 22D es un conjunto de imágenes que muestran tumores RENCA de aloinjerto en ratones tratados con polimerosomas vacíos.
Las FIGs. 22E y 22F son conjuntos de imágenes fluorescentes representativas e imágenes de hematoxilina y eosina de tumores extirpados de ratones que fueron tratados con PEM y con polimerosomas vacíos, respectivamente.
La FIG. 23A es una tabla que ilustra los parámetros del estudio para determinar los niveles de dosificación segura y los programas para PEM.
La FIG. 23B es una tabla que ilustra los parámetros del estudio para determinar las dosis mínimas eficaces de PEM para inducir la embolización microvascular mediada por nanopartículas (NME) específica del tumor tal como se visualiza en las cámaras de ventana.
La FIG. 24A es una tabla que ilustra los parámetros del estudio para determinar un programa óptimo de dosificación de PEM y una combinación terapéutica con un TKI del receptor de VEGF para inhibir el crecimiento tumoral como terapia de primera línea para RCC.
La FIG. 24B es una tabla que ilustra los parámetros del estudio para determinar un programa óptimo de dosificación de PEM y una combinación terapéutica con un inhibidor de mTOR para inhibir el crecimiento tumoral como una terapia de segunda línea para RCC.
La FIG. 25 es una tabla que ilustra los parámetros del estudio para determinar un programa óptimo de dosificación de PEM con radioterapia para inhibir el crecimiento tumoral como terapia paliativa para RCC.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
La presente invención puede entenderse más fácilmente haciendo referencia a la siguiente descripción detallada tomada en relación con las figuras y ejemplos adjuntos, que forman parte de esta descripción.
Las referencias a valores señalados en intervalos incluyen todos y cada uno de los valores dentro de ese intervalo. La expresión “alrededor de” se usa aquí cuando se refiere a un valor medible tal como una cantidad, una duración temporal, y similares, para abarcar variaciones de ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, o ±0,1% del valor especificado, ya que tales variaciones son apropiadas para realizar los métodos descritos.
El término “ejemplar” se usa aquí para significar “que sirve como un ejemplo, caso, o ilustración”. Cualquier implementación aquí descrita como “ejemplar” no debe interpretarse necesariamente como preferida o ventajosa sobre otras implementaciones.
El término “pluralidad” se usa aquí para significar más de uno. Cuando se expresa un intervalo de valores, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando los valores se expresan como aproximaciones, mediante el uso del antecedente “alrededor de”, se entenderá que el valor particular forma otra realización. Todos los intervalos son inclusivos.
Los términos “sujeto” y “paciente” se usan indistintamente aquí para referirse a pacientes humanos, mientras que el término “sujeto” también puede referirse a cualquier animal. Debe entenderse que, en diversas realizaciones, el sujeto puede ser un mamífero, un animal no humano, un can y/o un vertebrado.
La expresión “unidades monoméricas” se usa aquí para significar una unidad de molécula de polímero que contiene el mismo número de átomos o uno similar que uno de los monómeros. Las unidades monoméricas, como se usan en esta memoria descriptiva, pueden ser de un solo tipo (homogéneas) o de una variedad de tipos (heterogéneas). El término “polímeros” se usa según su significado ordinario de macromoléculas que comprenden moléculas monoméricas conectadas.
La expresión “sustancia anfifílica” se usa aquí para significar una sustancia que contiene grupos tanto polares (solubles en agua) como hidrófobos (insolubles en agua).
La expresión 'Suministro in vivo" se usa aquí para referirse al suministro de un producto biológico por vías de administración tales como tópica, transdérmica, supositorio (rectal, vaginal), pesario (vaginal), intravenosa, oral, subcutánea, intraperitoneal, intratecal, intramuscular, intracraneal, inhalatoria, oral, y similares.
La expresión “una cantidad eficaz” se usa aquí para referirse a una cantidad de un compuesto, material o composición eficaz para lograr un resultado biológico particular tal como, pero no limitado a, resultados biológicos divulgados, descritos o ejemplificados aquí. Dichos resultados pueden incluir, pero no se limitan a, la reducción eficaz de los síntomas asociados con cualquiera de los estados de enfermedad mencionados aquí, según se determine por cualquier medio adecuado en la técnica.
El término “membrana” se usa aquí para significar una colección espacialmente distinta de moléculas que define una superficie bidimensional en un espacio tridimensional, de este modo separa un espacio de otro en al menos un sentido local.
La expresión “agente farmacéuticamente activo” se usa aquí para referirse a cualquier proteína, péptido, azúcar, sacárido, nucleósido, compuesto inorgánico, lípido, ácido nucleico, pequeño compuesto químico sintético, o compuesto orgánico que altera o afecta apreciablemente el sistema biológico en el que se introduce.
La expresión “administración de fármaco” se usa aquí para referirse a un método o procedimiento de administración de un compuesto farmacéutico para lograr un efecto terapéutico en seres humanos o animales.
El término “vehículo” se usa aquí para referirse a agentes sin ningún beneficio terapéutico inherente, pero cuando se combina con un agente farmacéuticamente activo para fines de administración del fármaco da como resultado la modificación de las propiedades del agente farmacéutico activo, que incluyen, pero no se limitan a, su mecanismo o modo de administración in vivo, su concentración, biodisponibilidad, absorción, distribución y eliminación en beneficio de mejorar la eficacia y seguridad del producto, así como la conveniencia y cumplimiento del paciente.
El término “portador” se usa aquí para describir un vehículo de suministro que se usa para incorporar un agente farmacéuticamente activo a los fines del suministro de fármacos.
La expresión “agente de unión a oxígeno” o “compuesto de unión a oxígeno” se usa aquí para referirse a cualquier molécula o macromolécula que se una, almacene y libere oxígeno.
La expresión “efector alostérico” se usa aquí para referirse a una molécula que modula la velocidad o cantidad de oxígeno que se une o libera de un portador de oxígeno.
La expresión agente de “alta afinidad por oxígeno” o “compuesto de alta afinidad por oxígeno” se usa aquí para referirse a cualquier molécula o macromolécula que se une y almacena oxígeno, pero solo lo libera a presiones parciales de oxígeno que son inferiores a los niveles en los que la hemoglobina humana natural libera normalmente oxígeno. Los agentes de alta afinidad por oxígeno incluyen compuestos de unión a oxígeno. Los agentes de alta afinidad por oxígeno pueden incluir compuestos que se unen al oxígeno con una P50 para el oxígeno que es menor que la de las hemoglobinas de adultos humanos o fetales con o sin sus interacciones con moduladores alostéricos naturales, monóxido de carbono o agentes reductores u oxidantes fuertes.
La expresión “portador de unión a oxígeno” o “portador de oxígeno” se usa aquí para referirse a un portador compuesto por un vehículo sintético o parcialmente sintético que incorpora un único o una pluralidad de agentes de unión a oxígeno.
El término “homopolímero” se usa aquí para referirse a un polímero derivado de una especie monomérica de polímero.
El término “copolímero” se usa aquí para referirse a un polímero derivado de dos (o más) especies monoméricas de polímero, en oposición a un homopolímero en el que solo se usa un monómero. Dado que un copolímero consiste en al menos dos tipos de unidades constituyentes (también unidades estructurales), los copolímeros pueden clasificarse en función de cómo están dispuestas estas unidades a lo largo de la cadena.
La expresión “copolímeros de bloques” se usa aquí para referirse a un copolímero que incluye dos o más subunidades de homopolímero unidas por enlaces covalentes, en el que la unión de las subunidades de homopolímero puede requerir una subunidad intermedia no repetitiva, conocida como un bloque de unión. Los copolímeros de bloques con dos o tres bloques distintos se denominan aquí “copolímeros de dibloques” y “copolímeros de tribloques”, respectivamente.
La expresión “deformación de área” se usa aquí para referirse al cambio en el área superficial de una partícula bajo una fuerza o tensión externa dividida entre el área superficial original de la partícula antes de la aplicación de dicha fuerza o tensión externa (representada por “A” y expresado como %).
La expresión “tensión de lisis crítica” o “Tc” se usa aquí para referirse a la tensión a la que se rompe una partícula cuando se somete a una fuerza externa medida por aspiración por micropipeta y expresada como miliNewtons/metro (mN/m).
La expresión “deformación de área crítica” o “Ac” se usa aquí para referirse a la deformación de área realizada por el portador de oxígeno o polimerosoma en la tensión de lisis crítica.
La expresión “relación de carga” se usa aquí para referirse a una medida de un portador de unión a oxígeno, y puede definirse como el peso del agente de unión a oxígeno dentro del portador de oxígeno dividido entre el peso seco del vehículo inerte.
La expresión “capacidad de carga de mioglobina” se usa aquí para referirse a una medida de un portador de oxígeno basado en mioglobina, y puede definirse como el peso de la mioglobina dentro del portador de oxígeno dividido entre el peso total del portador. La expresión “eficiencia de carga de mioglobina” se usa aquí para referirse a una medida de un portador de oxígeno basado en mioglobina, y se puede definir como el peso de mioglobina que se encapsula y/o se incorpora dentro de una suspensión de portador dividido entre el peso de la mioglobina original en disolución antes del encapsulamiento (expresado como un %).
La expresión “dosis unitaria” se usa aquí para referirse a una cantidad discreta de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo.
Debe entenderse que P50 es la presión parcial de oxígeno (pO2) a la cual el compuesto de unión a oxígeno se satura al 50% con oxígeno. A medida que disminuye P50, aumenta la afinidad por oxígeno, y viceversa. La hemoglobina A adulta normal tiene una P50 de 26,5 mm Hg, mientras que la hemoglobina F fetal tiene una P50 de 20 mm Hg, y la hemoglobina S de anemia falciforme tiene una P50 de 34 mm Hg.
Las diversas realizaciones proporcionan un portador terapéutico basado en nanopartículas para administrar agentes de alta afinidad por oxígeno (por ejemplo, moléculas y proteínas tales como la mioglobina) a los tumores con el fin de aumentar la pO2 intratumoral, atrofiar sus fenotipos moleculares agresivos, y aumentar la eficacia de las terapias de radiación y quimioterapias dirigidas contra el tumor.
En general, el tratamiento con radiación puede aumentarse aumentando los niveles de oxígeno de los tumores, a fin de generar más radicales libres a base de oxígeno con radioterapia concomitante, o administrando a sitios específicos de tumores sensibilizadores de radiación no dependientes de O2. Los métodos convencionales para manipular los niveles de oxígeno de los tumores dependen de aumentar el nivel sistémico de oxígeno para eventualmente suministrar esta mayor capacidad de oxígeno al tumor. Uno de dichos métodos que suministra sustitutos de sangre artificial usando hemoglobina natural (Hb) se describe en la Solicitud de Patente EE. UU. n° 13/090.076 titulada “Nanopartículas biodegradables como nuevos portadores de oxígeno a base de hemoglobina, y métodos para usarlas” presentada el 19 de abril de 2011.
La hemoglobina es una proteína transportadora de oxígeno en los glóbulos rojos humanos. La estructura de la hemoglobina la hace eficiente para unirse al oxígeno, y eficiente para descargar el oxígeno unido en los tejidos humanos/torrente sanguíneo. La hemoglobina consiste en dos pares de dímeros de globina unidos por enlaces no covalentes para formar una molécula de hemoglobina de cuatro subunidades (tetramérica) más grande. La capacidad de unión a oxígeno de la hemoglobina tetramérica depende de la presencia de una unidad no proteica llamada grupo hemo (es decir, una molécula de hemoglobina puede unirse con cuatro moléculas de oxígeno).
La FIG. 1 ilustra la curva de disociación de oxígeno de la hemoglobina. La unión cooperativa de oxígeno a la hemoglobina le da a la hemoglobina nativa una curva de disociación de oxígeno en forma sigmoidal, y permite que el oxígeno se una y libere dentro de un intervalo fisiológico estrecho de pO2s (de 40-100 mmHg). Los métodos convencionales para manipular los niveles de oxígeno de los tumores han intentado usar hemoglobina o agentes (proteínas, moléculas, etc.) que tienen una curva de disociación de oxígeno similar a la hemoglobina nativa. Otros han intentado usar agentes que tienen curvas de disociación de oxígeno que se desplazan a la derecha de la curva de disociación de oxígeno de la hemoglobina (es decir, agentes que tienen una menor afinidad por oxígeno que la hemoglobina).
La FIG. 2 ilustra las curvas de disociación de oxígeno de la hemoglobina y otros dos agentes de ejemplo (por ejemplo, Agente A, Agente B) que pueden usarse para manipular los niveles de oxígeno en tumores. Específicamente, la FIG.
2 ilustra que los agentes de ejemplo (Agente A, Agente B) tienen curvas de disociación de oxígeno que se desplazan a la derecha de la curva de disociación de oxígeno de la hemoglobina, lo que aumenta la cantidad de oxígeno suministrado por los agentes de ejemplo.
La FIG. 3 ilustra las curvas de disociación de oxígeno de la hemoglobina y la mioglobina, una proteína ubicua involucrada en la regulación de los niveles de oxígeno en los tejidos musculares. La FIG. 3 muestra que la curva de disociación de oxígeno de la mioglobina es una hipérbola rectangular con una P50 muy baja que se encuentra a la izquierda de la curva de disociación de oxígeno de hemoglobina en forma de sigmoide (es decir, la mioglobina tiene una afinidad mucho mayor por oxígeno que la hemoglobina). Es decir, en contraste con los agentes de ejemplo (por ejemplo, Agente A, Agente B) discutidos anteriormente con referencia a la FIG. 2, la mioglobina tiene una curva de disociación de oxígeno que se desplaza a la izquierda de la curva de disociación de oxígeno de la hemoglobina. Esto se debe en parte al hecho de que, a diferencia de la hemoglobina (que tiene afinidad por oxígeno de aproximadamente 20 a 50 mmHg), la mioglobina se une fuertemente al oxígeno y solo lo libera a una tensión de oxígeno muy baja (2 a 3 mmHg). Las diversas realizaciones se benefician del hecho de que existe un nivel similar de tensión de oxígeno (2 a 5 mmHg) en el centro de los tumores sólidos, y se ha demostrado que este mismo nivel (2 a 5 mmHg) es el nivel en el que la eficacia de la radioterapia cae por debajo del cincuenta por ciento de su valor máximo.
Las diversas realizaciones proporcionan composiciones y métodos para administrar a tumores sólidos agentes de alta afinidad por oxígeno (por ejemplo, mioglobina, hemoglobina modificada, proteínas sintéticas), que tienen afinidad por oxígeno similar a la mioglobina nativa, para mejorar la eficacia de la radioterapia. Dado que la tensión de oxígeno en el centro de un tumor sólido es similar a la tensión de oxígeno (2 a 3 mmHg) a la que se libera oxígeno de la mioglobina, el uso de agentes de alta afinidad por oxígeno asegura que el oxígeno no se libere de los agentes hasta que se colocan alrededor o dentro del tumor.
Como se mencionó anteriormente, las tensiones de oxígeno en el centro de los tumores sólidos son similares a las tensiones de oxígeno (2 a 3 mmHg) a las que se libera oxígeno de la mioglobina. Como también se mencionó anteriormente, la eficacia del tratamiento con radiación puede mejorarse aumentando los niveles de oxígeno de los tumores, y los métodos convencionales para manipular los niveles de oxígeno dependen del aumento del nivel sistémico de oxígeno. Por ejemplo, las técnicas existentes para administrar oxígeno a los tumores pueden implicar aumentar la cantidad de flujo sanguíneo al tumor, aumentar la cantidad de oxígeno disuelto en la sangre, o aumentar la concentración sanguínea global de hemoglobina. Los métodos convencionales logran esto mediante el uso de agentes que tienen una afinidad similar por el oxígeno como los glóbulos rojos naturales (por ejemplo, derivados de la hemoglobina humana o xenótica y/u otros agentes que tienen la misma o menor afinidad por oxígeno que la hemoglobina humana natural) para aumentar la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre con la esperanza de que esto pueda traducirse en un aumento en el suministro de oxígeno al tumor. En contraste con estos métodos de tratamiento convencionales, las diversas realizaciones describen composiciones de materia y metodología para administrar oxígeno a los tejidos tumorales mediante el uso de agentes que tienen una afinidad mucho mayor por el oxígeno que la de la hemoglobina humana natural y que poseen una curva de disociación de oxígeno similar a la de mioglobina natural. Dado que la presión parcial de oxígeno en el centro de un tumor sólido es similar a la tensión de oxígeno a la que se libera oxígeno de la mioglobina (2 a 3 mmHg), el oxígeno no se libera hasta que los agentes de alta afinidad por oxígeno estén alrededor o dentro del tumor.
Si bien el suministro de agentes de alta afinidad por oxígeno (por ejemplo, mioglobina, otras proteínas sintéticas que tienen una afinidad por oxígeno similar a la mioglobina, etc.) a los tumores sólidos puede mejorar la eficacia de la radioterapia, a fin de lograr una localización adecuada del tumor, debe inyectarse en el torrente sanguíneo una gran cantidad de los agentes de alta afinidad por oxígeno. Inyectar una gran cantidad de tales proteínas en el torrente sanguíneo es peligroso, ya que el agente inyectado (por ejemplo, mioglobina) puede ser nefrotóxico y/o causar urgencia o emergencia hipertensiva (a través del secuestro del óxido nítrico vasodilatador que normalmente controla el tono de los vasos sanguíneos). Por ejemplo, en el caso de la mioglobina, este fenómeno se observa comúnmente en personas que tienen ataques cardíacos, corren maratones, realizan otros ejercicios extenuantes, y/o usan diversas drogas tal como la cocaína. En esas personas, los músculos pueden comenzar a descomponerse muy rápidamente, liberando así una gran cantidad de mioglobina en el torrente sanguíneo. Esta mioglobina adicional puede provocar que la proteína quede atrapada en el aparato de filtro del cuerpo (es decir, glomérulos renales) y/o causar una afección potencialmente mortal conocida como rabdomiólisis. Una gran cantidad de mioglobina en el torrente sanguíneo también puede aumentar la presión arterial y provocar daños en los órganos. Esto se debe a que, en el torrente sanguíneo, la mioglobina y otras proteínas de unión a oxígeno libres secuestran óxido nítrico (NO) que es un mediador del tono vascular y el flujo sanguíneo. De este modo, cuando la mioglobina se inunda en el torrente sanguíneo, actúa para extraer óxido nítrico de las paredes de los vasos sanguíneos, haciendo que los vasos sanguíneos se contraigan. Esto puede causar un aumento en la presión sanguínea general y posiblemente conducir a una crisis hipertensiva, dañando órganos importantes tales como los riñones, el corazón y el cerebro. Por estas y otras razones, inyectar una proteína que se une al oxígeno, tal como la mioglobina, directamente en el torrente sanguíneo en su forma libre es peligroso.
Para abordar estos y otros problemas, varias realizaciones pueden encapsular los agentes de unión a oxígeno de alta afinidad en un vehículo portador (por ejemplo, una cubierta de nanopartículas) que protegerá a los agentes encapsulados de ser liberados en el torrente sanguíneo o de interactuar con componentes biológicos (por ejemplo, proteínas, las células, y las paredes de los vasos sanguíneos) mientras están en la circulación sanguínea. En algunas realizaciones, el portador inerte puede ser una versión PEGilada o polimerizada del propio agente de unión a oxígeno con alta afinidad.
En diversas realizaciones, los agentes de unión a oxígeno con alta afinidad pueden encapsularse en vehículos portadores que tienen características que permiten su acumulación alrededor de regiones tumorales y/o son capaces de dirigirse a tumores que experimentan baja tensión de oxígeno. El vehículo portador también puede tener características tales que el oxígeno se difundirá desde dentro del vehículo a regiones de baja tensión de oxígeno (como existe en el centro de los tumores) mientras que los agentes de unión a oxígeno con alta afinidad permanecen encapsulados. Los agentes de alta afinidad por oxígeno pueden administrarse a los tumores de una manera que permita que el agente administrado libere oxígeno a la tensión de oxígeno requerida para aumentar la eficacia de la radiación debido a las características del gradiente de presión parcial de oxígeno del agente.
En diversas realizaciones, los agentes de alta afinidad por oxígeno pueden encapsularse en un vehículo compuesto por polímeros biodegradables (por ejemplo, polimerosomas, nanopartículas, etc.). Según la invención, el agente inhibidor del óxido nítrico se encapsula dentro del vehículo portador, que es una nanopartícula, que es un polimerosoma. El encapsulamiento de los agentes de alta afinidad por oxígeno (por ejemplo, proteínas y/o moléculas que se unen al oxígeno) en vehículos poliméricos biodegradables protege a los agentes del contacto con la sangre y los tejidos, reduciendo así la toxicidad mientras mantiene altas concentraciones internas de oxígeno hasta que los vehículos se colocan dentro de tejidos tumorales hipóxicos. En una realización, los agentes pueden encapsularse de modo que estén altamente concentrados en el interior acuoso del vehículo portador. Los agentes pueden encapsularse de modo que el vehículo portador (por ejemplo, la cubierta de nanopartículas) proteja a las proteínas encapsuladas de interactuar con las paredes de los vasos sanguíneos, evitando que el óxido nítrico ingrese a la nanopartícula y/o se una a las proteínas y/o moléculas de unión a oxígeno encapsuladas. Los agentes pueden incluir proteínas y/o moléculas que tienen una afinidad muy alta por el oxígeno (por ejemplo, proteínas que tienen una P50 baja para oxígeno) y/o tienen propiedades de unión a oxígeno de modo que el oxígeno se desliga de las proteínas y/o moléculas solo a las tensiones de oxígeno más bajas, tales como las que se encuentran en la mayoría de los tumores hipóxicos (es decir, tumores heterogéneos en los que las bolsas de tejido tienen tensiones de oxígeno que están por debajo de la P50 del agente portador de oxígeno de alta afinidad). Los agentes pueden incluir proteínas y/o moléculas para las cuales se libera oxígeno a una tensión de oxígeno de menos de 10 milímetros de mercurio (mmHg).
En diversas realizaciones, los agentes de unión a oxígeno con alta afinidad pueden ser mioglobina humana no modificada, mioglobina no modificada de otra especie biológica, mioglobina modificada química o genéticamente de seres humanos o de otra especie biológica, hemoglobina no modificada de otra especie biológica, o una molécula pequeña, complejo quelante de metales, o un agente biológico, que incluye un péptido, proteína, ácido nucleico, o polisacárido que se une fuertemente al oxígeno a las tensiones fisiológicas de unión a oxígeno que se encuentran en los pulmones y que lo libera solamente a las tensiones de oxígeno más bajas como se encuentran en los tumores hipóxicos (es decir, moléculas que poseen P50 para oxígeno de < o = 10 mm Hg). Según la invención, la molécula de unión a (NO) se selecciona de una o más de mioglobina humana no modificada, mioglobina no modificada de otra especie biológica, y mioglobina modificada química o genéticamente de seres humanos o de otra especie biológica. En diversas realizaciones, el vehículo portador inerte puede ser uno cualquiera o más de un liposoma, polimerosoma, micela, lipoproteína modificada, nanopartícula sólida, partícula sólida de tamaño micrométrico, emulsión de lípidos o perfluorocarbono, dendrímero, virus, o partícula similar a virus. En otras realizaciones, el vehículo portador inerte puede ser una versión PEGilada o polimerizada del agente o agentes de unión a oxígeno con alta afinidad. En una realización preferida, la mioglobina humana puede encapsularse dentro de nanopartículas, vesículas de polímero y/o polimerosomas. En diversas realizaciones, las nanopartículas, vesículas de polímero y/o polimerosomas pueden construirse a partir de uno de varios materiales biodegradables diferentes.
Como se mencionó anteriormente, en una realización, los agentes de unión a oxígeno con alta afinidad pueden incluir mioglobina. La mioglobina (Mb) es una proteína hemo citoplasmática que desempeña un papel bien caracterizado en el transporte de O2 y captura de radicales libres en el músculo esquelético y cardíaco (dos tejidos, en particular, con baja incidencia de malignidad) 9394. Las funciones relacionadas con el oxígeno de la mioglobina son múltiples, e incluyen al menos 3 actividades diferentes. Primero, la mioglobina actúa como un depósito de oxígeno, que posee una afinidad por O2 mucho mayor que la de hemoglobina (Mb) (P50-Mb = 2,75 frente a P50-Hb = 25-50 mmHg). La mioglobina se une así a O2 en condiciones aeróbicas y lo libera en condiciones hipóxicas95, como se encuentra en los tumores. En segundo lugar, la mioglobina es capaz de amortiguar O2 intracelular descargando su oxígeno a medida que pO2 citoplasmática cae hasta niveles bajos, promoviendo la fosforilación oxidativa continua96. En tercer lugar, la mioglobina suplementa el suministro simple de O2 al trabajar como un portador en un proceso conocido como difusión de O2 facilitada97.
Recientemente se ha demostrado que la mioglobina es un modulador de la hipoxia tumoral98, 99. La transferencia de genes de mioglobina en un tumor de pulmón humano xenotransplantado en ratón proporcionó un modelo válido para estudiar el papel de O2 y ROS en la progresión tumoral. Al permitir la fosforilación oxidativa bajo pO2 baja, la mioglobina previene aún más la formación de ROS basal en condiciones hipóxicas y mitiga la respuesta tumorigénica98’ 99. En estos modelos de cáncer de ratón, la expresión de mioglobina dio como resultado la implantación tumoral retardada, redujo el crecimiento de xenoinjerto, y generó niveles mínimos de HIF-198. La angiogénesis y la invasión también fueron fuertemente inhibidas98. Estos efectos no se observaron usando formas de mioglobina con mutación puntual que no pueden unirse a O2 pero que son capaces de capturar radicales libres98. En conjunto, estos datos sugieren que la hipoxia no es solo un epifenómeno asociado con el crecimiento desregulado, sino también un factor clave que impulsa la progresión del tumor. También sugieren que las funciones pleiotrópicas de la mioglobina afectan la biología del cáncer de múltiples maneras.
Si bien la mioglobina ha demostrado modular la hipoxia tumoral, su utilidad clínica como una sustancia terapéutica de O2 requiere superar dos obstáculos principales relacionados con su infusión intravascular libre: 1) vasoconstricción, hipertensión, flujo sanguíneo reducido, y daño vascular en animales debido al atrapamiento de óxido nítrico (NO) derivado del endotelio; y 2) nefrotoxicidad como se ve con la rabdomiólisis. En las diversas realizaciones, las limitaciones del uso de mioglobina como un portador de oxígeno pueden superarse encapsulando la mioglobina dentro de un vehículo polimérico apropiado (por ejemplo, polimerosoma) para mejorar su suministro específico de tumor y mitigar su exposición sistémica.
Los polimerosomas38, 39 son vesículas de polímeros sintéticos que se forman en dimensiones nanométricas (50 a 300 nm de diámetro) y exhiben varias propiedades favorables como portadores de oxígeno celular. Por ejemplo, los polimerosomas pertenecen a la clase de vesículas bicapas y multicapa que pueden generarse mediante autoensamblaje y pueden encapsular compuestos hidrófilos tales como la hemoglobina (Hb) y la mioglobina (Mb) en su núcleo acuoso40' 41. Además, los polimerosomas ofrecen varias opciones para ser diseñados a partir de componentes totalmente biodegradables aprobados por la FDA, y no muestran toxicidades in vivo agudas o in vitro.
Los polimerosomas exhiben varias propiedades superiores sobre los liposomas y otros vehículos de suministro basados en nanopartículas que los hacen portadores de oxígeno basados en mioglobina MBOCs eficaces. Por ejemplo, dependiendo de la estructura de sus bloques copoliméricos componentes, las membranas de los polimerosomas pueden ser significativamente más gruesas ( ~ 9-22 nm) que las de los liposomas (3-4 nm), haciéndolos 5-50 veces mecánicamente más resistentes y al menos 10 veces menos permeables al agua que los liposomas46, 47. La vida media circulatoria de los polimerosomas, con cepillos de poli(óxido de etileno) (PEO) que oscilan de 1,2-3,7 kDa, es análoga a la de los liposomas basados en poli(etilenglicol) (liposomas de PEG) de tamaños similares ( ~24-48 horas), y se puede adaptar específicamente además mediante el uso de una variedad de copolímeros como bloques de construcción compuestos48. Los polimerosomas han demostrado ser estables durante varios meses in situ, y durante varios días en plasma sanguíneo en condiciones cuasi fisiológicas bien mezcladas, sin experimentar ningún cambio en el tamaño y la morfología de las vesículas40, 48. No muestran transiciones térmicas en superficie hasta 60°C37, 48. Además, los primeros estudios en animales sobre formulaciones de polimerosomas a base de PEO-b-PCL y poli(óxido de etileno)-bloque-poli(butadieno) (PEO-b-PBD) que encapsulan doxorrubicina no han mostrado toxicidades agudas o subagudas. Finalmente, la producción y almacenamiento de polimerosomas es económica. Los polimerosomas se pueden producir y almacenar fácilmente a gran escala sin requerir costosos procedimientos de purificación posteriores a la fabricación.
Se ha planteado la hipótesis de que las formulaciones de mioglobina encapsulada en polimerosomas (PEM) biodegradables más prometedoras se componen de copolímeros de bloques que consisten en el poli(óxido de etileno) (PEO) biocompatible hidrófilo, que es químicamente sinónimo de PEG, acoplado a diversos poli(anhídridos alifáticos hidrófobos), poli(ácidos nucleicos), poli(ésteres), poli(ortoésteres), poli(péptidos), poli(fosfazenos), y poli(sacáridos), incluyendo, pero sin limitarse a, poli(lactida) (PLA), poli(glicolida) (PLGA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), poli(ecaprolactona) (PCL), y poli(carbonato de trimetileno) (PTMC). Los polimerosomas compuestos de superficies 100% PEGiladas poseen estabilidad química in vitro mejorada, biodisponibilidad in vivo aumentada, y vidas medias circulatorias sanguíneas prolongadas42, 43. Por ejemplo, los poliésteres alifáticos, que constituyen las porciones de membrana de los polimerosomas, se degradan por hidrólisis de sus enlaces éster en condiciones fisiológicas tal como en el cuerpo humano. Debido a su naturaleza biodegradable, los poliésteres alifáticos han recibido una gran atención para uso como biomateriales implantables en dispositivos de administración de fármacos, suturas biorreabsorbibles, barreras de adhesión, y como andamiajes para la reparación de lesiones mediante ingeniería de tejidos44, 45.
En comparación con los otros poliésteres alifáticos biodegradables, la poli(e-caprolactona) (PCL) y sus derivados tienen varias propiedades ventajosas, que incluyen: 1) alta permeabilidad a pequeñas moléculas de fármacos; 2) mantenimiento de un entorno de pH neutro tras la degradación; 3) facilidad para formar mezclas con otros polímeros; y 4) idoneidad para el suministro a largo plazo que ofrece la cinética de erosión lenta en comparación con PLA, PGA y PLGA45. La utlización de e-caprolactona (o derivados tales como g-metil e-caprolactona) como las capas formadoras de membrana en las formulaciones de mioglobina encapsulada en polimerosomas (PEM) promete que los portadores de oxígeno a base de mioglobina celular (MBOC) resultantes tendrán degradación in vivo segura y completa.
Los componentes de los polimerosomas biodegradables pueden incluir polímeros biodegradables, como se muestra en la FIG. 4A, y fluoróforos del infrarrojo cercano solubles en agua y proteínas de unión a oxígeno solubles en agua, como se muestra en la FIG. 4B. La FlG. 4C ilustra los procedimientos de procesamiento implicados en la síntesis de PEM a nanoescala en diversas realizaciones, que incluyen calor, ultrasonidos y extrusión. Una PEM de la realización se muestra esquemáticamente en la FlG. 4D, y en micrografía electrónica de transmisión criogénica y micrografías confocales en la FlG. 4E. Los polimerosomas totalmente biodegradables y biorreabsorbibles se han demostrado previamente que se generan mediante autoensamblaje tras la hidratación acuosa de copolímeros de dibloques anfifílicos de PEO-b-PCL39. Más de 20 copolímeros de PEO-b-PCL, que varían en pesos moleculares de los bloques de construcción de los componentes, se han ensayado previamente para la generación de polimerosomas bicapa estables. Sin embargo, solo los copolímeros de dibloques de PEO-b-PCL en los que el bloque de PEO era de 1 -5 kDa y de 10-20% de la masa del polímero en peso han demostrado un rendimiento consistente y significativo de polimerosomas monodispersos estables, con diámetros medios de partículas de <200 nm y grosores de membrana de 9-22 nm después de la extrusión a través de membranas de corte de poros de 200 nm de diámetro. Posteriormente, se ha demostrado que los polimerosomas de PEO-b-PCL son capaces de cargar el fármaco antineoplásico doxorrubicina (DOX) usando un gradiente de sulfato de amonio. La estabilidad in vitro, el mecanismo de degradación, y la velocidad de liberación del fármaco a partir de polimerosomas de PEO(2kDa)-b-PCL(12kDa) cargados con DOX se evaluaron en función del pH durante 14 días. Si bien la cinética de liberación varió en condiciones de pH neutro y ácido (5,5 y 7,4, a 37°C), se observó una fase de liberación de explosión inicial (aproximadamente 20% de la carga útil inicial dentro de las primeras 8 h) en ambas condiciones de pH, seguido por una liberación más controlada y dependiente del pH durante varios días. A un pH de 7,4, los estudios cinéticos de liberación sugieren que las moléculas encapsuladas escapan inicialmente del polimerosoma a través de la difusión pasiva del fármaco a través de la membrana intacta de poli(e-caprolactona) (PCL) (días 1-4), y posteriormente a través de la degradación de la matriz hidrolítica de PCL (días 5-14). Sin embargo, a un pH de 5,5, parece que el mecanismo dominante de liberación, tanto a corto como a largo plazo, es la hidrólisis catalizada por ácido de la membrana de PCL. En particular, estos polimerosomas completamente biodegradables tienen una vida media (ti/2) de circulación (24-48 h) que es mucho más corta que su vida media (n/2) de liberación (2 semanas a pH 7,4).
La FIG. 5 ilustra la (A) micrografía de campo brillante de la vasculatura tumoral, (B) distribución de las tensiones de oxígeno en el parénquima tumoral (en % de oxígeno), y (C) superposición de (A) y (B), que demuestra el suministro funcional de oxígeno, usando un sistema in vivo de modelo de tumor de cámara de ventana. En esta ilustración, el tumor es la región relativamente oscura en el panel A en el centro-izquierda. La saturación de oxígeno (C) se muestra en una escala de colores cuyo brillo está modulado por el contenido total de O2 (de este modo, las regiones bien vascularizadas parecen brillantes). La región tumoral muestra una concentración de oxígeno altamente heterogénea (B), con un pico central en la tensión de oxígeno, así como una región periférica (superior y derecha) que es altamente hipóxica. El mapa compuesto muestra un contraste significativo con el tejido normal circundante debido a la angiogénesis en todo el tumor, lo que hace que parezca brillante borroso. Como es evidente en el ejemplo ilustrado de la FIG. 5, el contenido de O2 (medido por la presión parcial de oxígeno en varios puntos) es heterogéneo en todo el parénquima tumoral, pero las tensiones de oxígeno más bajas (áreas más oscuras como las delimitadas por pO2 de <10 mmHg) se pueden encontrar dentro del centro del tumor. Es dentro de estas áreas bajas en pO2 donde los tumores tienden a regular en exceso la cascada de señalización de HIF-1, lo que conduce a un fenotipo tumorigénico más agresivo que es resistente a la radiación y a las quimioterapias y que tiene una mayor tendencia a metastatizarse a otras localizaciones. Como tal, aumentar las tensiones mínimas de oxígeno encontradas dentro del tumor heterogéneo puede ser tan importante como aumentar la pO2 del tumor en general cuando se trata de una meta terapéutica.
La FIG. 6A ilustra que solo los copolímeros de dibloques de poli(óxido de etileno)-bloque-poli(e-caprolactona) (PEO-b-PCL) en los que el bloque de PEO era 1-5 kDa y 10-20% de la masa del polímero en peso han demostrado un rendimiento consistente y significativo de polimerosomas monodispersos estables, con diámetros medios de partículas de <200 nm y grosores de membrana de 9-22 nm después de la extrusión a través de membranas de corte de poros de 200 nm de diámetro. Posteriormente, se ha demostrado que los polimerosomas de PEO-b-PCL son capaces de cargar el fármaco antineoplásico doxorrubicina (DOX) usando un gradiente de sulfato de amonio.
La FIG. 6B ilustra la estabilidad in vitro, el mecanismo de degradación y la velocidad de liberación del fármaco a partir de polimerosomas de PEO(2kDa)-b-PCL(12kDa) cargados con DOX evaluados en función del pH durante 14 días. La FIG. 6B muestra que, aunque la cinética de liberación varió en condiciones de pH neutro y ácido (5,5 y 7,4, a 37°C), se observó una fase inicial de liberación de estallido (aproximadamente el 20% de la carga útil inicial dentro de las primeras 8 h) a ambas condiciones de pH, seguido de una liberación más controlada y dependiente del pH durante varios días. A un pH de 7,4, los estudios cinéticos de liberación muestran que las moléculas encapsuladas escapan inicialmente del polimerosoma a través de la difusión pasiva del fármaco a través de la membrana de PCL intacta (días 1-4), y posteriormente a través de la degradación de la matriz hidrolítica de PCL (días 5-14). Sin embargo, a un pH de 5,5, el mecanismo dominante de liberación, tanto a corto como a largo plazo, es la hidrólisis catalizada por ácido de la membrana de PCL. En particular, estos polimerosomas completamente biodegradables tienen una vida media t1/2 de circulación (24-48 h) que es mucho más corta que su vida media t1/2 de liberación (2 semanas a pH 7,4). Como tal, se puede esperar que los polimerosomas circulen en el torrente sanguíneo relativamente intactos y liberen sus contenidos encapsulados de manera acelerada solo cuando se exponen a entornos de pH más bajo, como se encuentra en los tumores hipóxicos.
La FIG. 7A ilustra la acumulación de un portador de la realización (polimerosomas) en tumores como se demuestra a través de formación de imágenes ópticas in vivo de fluoróforos de infrarrojo cercano (NIR) basados en oligo(porfirina) (NIRFs) que se incorporan dentro de las cubiertas de membrana de los polimerosomas. Esta figura ilustra que los polimerosomas pueden acumularse alrededor del tumor a través de una modalidad seleccionadora de dianas pasiva debido al efecto mejorado de permeación y retención (EPR) asociado con la microvasculatura tumoral permeable. Los aumentos adicionales en la acumulación de polimerosomas pueden ser ayudados a través de la inclusión de moléculas seleccionadoras de dianas que mejorarán la concentración de los polimerosomas en el sitio tumoral.
La FIG. 7B es un gráfico de líneas de crecimiento tumoral in vivo (representado como el tamaño del tumor en log (mm3)) como inhibido por disolución salina amortiguada con fosfato (PBS), doxorrubicina (DOX), DOX encapsulada en liposomas, y DOX encapsulada en polimerosomas. Esta figura ilustra que no solo los polimerosomas son capaces de acumularse alrededor de los tumores (como se ve en la FIG. 7A), sino que lo hacen en cantidades suficientes y con estabilidades intravasculares preservadas para permitir la liberación eficaz de su carga útil de encapsulante en el sitio tumoral para alterar la biología tumoral. Al comparar diferentes vehículos de suministro biodegradables (por ejemplo, polimerosomas frente a liposomas frente a fármaco libre), es evidente la capacidad superior de los polimerosomas para lograr estos resultados.
La FIG. 8A ilustra la eficacia del encapsulamiento de hemoglobina (Hb) de cuatro formulaciones de Hb bovina y humana encapsuladas en polimerosomas después de la extrusión a través de membranas de policarbonato de 200 nm de diámetro. Específicamente, la FIG. 8A ilustra la eficiencia de encapsulamiento de hemoglobina de PEO-b-PCL-1(1,65 KDa), PEO-b-PCL-2(15 KDa), PEO-b-PLA-1(10 kDa), y PEO-b-PLA-2 (2,45 KDa). Como se discutió anteriormente, las diversas realizaciones proporcionan una metodología para generar constructos que tienen un radio promedio entre 100-125 nm con un índice de polidispersidad <1, 1 y una eficiencia de encapsulamiento de hemoglobina > 50%.
La FIG. 8B ilustra la P50 (mmHg) de glóbulos rojos, hemoglobina y cuatro formulaciones de hemoglobina encapsulada en polimerosomas (PEO-b-PCL-1(1,65 KDa), PEO-b-PCL-2(15 KDa), PEO-b-PLA-1(10 kDa) y PEO-b-PLA-2 (2,45 KDa)) extruidas a través de membranas de policarbonato de 200 nm de diámetro. Como se mencionó anteriormente, las diversas realizaciones proporcionan una metodología para generar constructos de PEM que tienen una P50 < 10 mm de mercurio y al menos una constante de velocidad de unión a NO un orden de magnitud más pequeña que la medida para dispersiones de hemoglobina encapsulada en liposomas (LEHs) a concentraciones de carga de hemoglobina similares.
Como se discutió anteriormente, los polímeros son macromoléculas que comprenden moléculas monoméricas conjugadas químicamente, en las que las unidades monoméricas son de un solo tipo (homogéneas) o de una variedad de tipos (heterogéneas). El comportamiento físico de los polímeros puede estar dictado por varios factores, que incluyen: el peso molecular total, la composición del polímero (por ejemplo, las concentraciones relativas de diferentes monómeros), la identidad química de cada unidad monomérica y su interacción con un disolvente, y la arquitectura del polímero (ya sea de cadena simple o de cadenas ramificadas). Por ejemplo, en el polietilenglicol (PEG), que es un polímero de etilenglicol (EG), cuyas longitudes de cadena, cuando se unen covalentemente a un fosfolípido, optimizan la vida de circulación de un liposoma, se sabe que están en el intervalo aproximado de 34-114 monómeros unidos covalentemente (EG34 a EG114). Las realizaciones preferidas comprenden copolímeros hidrófilos de óxido de polietileno (PEO), un polímero que está relacionado con PEG), y uno de varios bloques hidrófobos que impulsan el autoensamblaje de los polimerosomas, de hasta micrómetros de diámetro, en agua y otros medios acuosos.
Como se discutió anteriormente, una sustancia anfifílica es aquella que contiene grupos tanto polares (solubles en agua) como hidrófobos (insolubles en agua). Para formar una membrana estable en agua, un peso molecular mínimo requerido potencial para un anfífilo debe exceder el del metanol HOCH3 , que es el anfífilo canónico más pequeño, con un extremo polar (HO-) y el otro extremo hidrófobo (-CH3). La formación de una fase laminar estable requiere un anfífilo con un grupo hidrófilo cuya área proyectada es aproximadamente igual al volumen dividido entre la dimensión máxima de la porción hidrófoba del anfífilo.
En algunas realizaciones, el portador de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas no incluye polietilenglicol (PEG) u óxido de polietileno (PEO) como uno de su pluralidad de polímeros. En algunas realizaciones, el portador de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas incluyen al menos un polímero hidrófilo que es polietilenglicol (PEG) u óxido de polietileno (PEO). En algunas realizaciones, el polímero de PEG o de PEO puede variar en peso molecular de alrededor de 5 kDaltons (kDa) a alrededor de 50 kDa en peso molecular.
Los anfífilos formadores de laminillas más comunes pueden tener una fracción de volumen hidrófilo entre 20 y 50%. En algunas realizaciones, la fracción de volumen hidrófilo de los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas es hasta alrededor de 20%. En algunas realizaciones, la fracción de volumen hidrófilo de los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas es hasta alrededor de 19%. En algunas realizaciones, la fracción de volumen hidrófilo de los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas es hasta alrededor de 18%. En algunas realizaciones, la fracción de volumen hidrófilo de los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas es hasta alrededor de 17%. En algunas realizaciones, la fracción de volumen hidrófilo de los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas es hasta alrededor de 16%. En algunas realizaciones, la fracción de volumen hidrófilo de los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas es hasta alrededor de 15%. En algunas realizaciones, la fracción de volumen hidrófilo de los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas es menor que 20%. En algunas realizaciones, la fracción de volumen hidrófilo de los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas es de alrededor de 1% a alrededor de 20%. Cabe señalar que la capacidad de las moléculas anfifílicas y superanfifílicas para autoensamblarse puede evaluarse en gran medida, sin experimentación indebida, suspendiendo el speranfífilo sintético en disolución acuosa y buscando estructuras laminares y vesiculares como se juzga por simple observación bajo cualquier microscopio óptico básico, microscopio electrónico de transmisión criogénica, o mediante la dispersión de la luz.
La cantidad eficaz de la composición puede depender de cualquier número de variables, que incluyen, sin limitación, la especie, raza, tamaño, altura, peso, edad, salud general del sujeto, el tipo de formulación, el modo o la forma de administración, el tipo y/o la gravedad de la afección particular que se está tratando, o la necesidad de modular la actividad de la ruta molecular inducida por la asociación del análogo a su receptor. Los expertos en la técnica pueden determinar de manera rutinaria la cantidad eficaz apropiada usando técnicas de optimización de rutina y el juicio experto e informado del profesional, y otros factores evidentes para los expertos en la técnica.
Una dosis terapéuticamente eficaz de los portadores de oxígeno de las diversas realizaciones puede proporcionar actividad biológica parcial o completa en comparación con la actividad biológica de una oxigenación tisular fisiológicamente media, mediana o mínima del paciente o sujeto. Una dosis terapéuticamente eficaz de los portadores de oxígeno de las diversas realizaciones puede proporcionar una mejora completa o parcial de los síntomas asociados con una enfermedad, trastorno o dolencia para la cual el sujeto está siendo tratado.
Los portadores de oxígeno de las diversas realizaciones pueden retrasar el inicio o disminuir las posibilidades de que un sujeto desarrolle uno o más síntomas asociados con la enfermedad, trastorno o dolencia para la cual el sujeto está siendo tratado. En algunas realizaciones, una cantidad eficaz es la cantidad de un compuesto requerida para tratar o prevenir una consecuencia resultante de la oxigenación tisular baja o pobre. Según las diversas realizaciones, la cantidad eficaz de compuesto o compuestos activos usados para el tratamiento terapéutico de afecciones causadas por o que contribuyen a la oxigenación tisular baja o deficiente varía según la forma de administración, la edad, el peso corporal, y la salud general del paciente.
Los anfífilos solubles, las proteínas, los ligandos, los efectores alostéricos, los compuestos de unión a oxígeno pueden unirse y/o intercalarse dentro de una membrana. Dicha membrana también debe ser semipermeable a los solutos, submicroscópica en su grosor (d), y ser el resultado de un proceso de autoensamblaje o ensamblaje dirigido. La membrana puede tener propiedades fluidas o sólidas, dependiendo de la temperatura y de la química de los anfífilos a partir de los cuales se forma. A algunas temperaturas, la membrana puede ser fluida (con una viscosidad medible), o puede ser sólida, con una elasticidad y rigidez a la flexión. La membrana puede almacenar energía a través de su deformación mecánica, o puede almacenar energía eléctrica manteniendo un potencial de transmembrana. Bajo algunas condiciones, las membranas pueden adherirse entre sí y coalescer (fusionarse).
En diversas realizaciones, la mioglobina puede usarse como el compuesto de unión a oxígeno. En algunas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno es una proteína con propiedades de unión a oxígeno que son similares a la mioglobina. En algunas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno es mioglobina modificada genética o químicamente o una proteína de unión a oxígeno aislada de otra especie que posee características de unión gaseosa que son similares a la mioglobina humana. En algunas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno se escoge de una proteína, molécula pequeña, polipéptido, molécula de ácido nucleico, un complejo quelante de metales, o cualquier combinación de los mismos. En algunas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno es una proteína. En algunas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno es un polipéptido. En algunas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno es un polipéptido con un grupo hemo modificado genética o químicamente. En algunas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno es una molécula pequeña que comprende un grupo hemo.
En algunas realizaciones, el portador de oxígeno transporta una cantidad eficaz de oxígeno para tratar a un sujeto o para evitar que un sujeto sufra una enfermedad o trastorno en el que su sangre no transporta o libera niveles suficientes de oxígeno a los tejidos. En algunas realizaciones, el portador de oxígeno comprende una cantidad eficaz de oxígeno para tratar o prevenir la propagación del cáncer en un sujeto que lo necesita. En algunas realizaciones, el portador de oxígeno comprende una cantidad eficaz de oxígeno para promover la cicatrización de heridas en un sujeto que lo necesita.
En algunas realizaciones, el efector alostérico es 2,3-bisfosfoglicerato o un isómero derivado del mismo. Los efectores alostéricos tales como el 2,3-bisfosfoglicerato pueden aumentar la descarga de oxígeno del portador de oxígeno o polimerosoma de las diversas realizaciones a un tejido o célula que se desoxigena dentro de un sujeto.
Como se mencionó anteriormente, la tensión de lisis crítica (Tc) es la tensión a la que se rompe una partícula cuando se somete a una fuerza externa, medida por aspiración por micropipeta y expresada en miliNewtons/metro (mN/m). El cambio en la tensión de lisis crítica de un portador de oxígeno o polimerosoma puede medirse antes y después de cargar el portador de oxígeno, nanopartícula y/o polimerosoma con mioglobina, otro compuesto de unión a oxígeno, o una mezcla de uno o más compuestos de unión a oxígeno.
En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 20%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 19%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 18%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 17%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 16%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 15%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 14%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 13%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 12%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 11%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de no más de 10%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de alrededor de 5% a alrededor de 10%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas pueden tener un cambio de tensión de lisis crítica de alrededor de 10% a alrededor de 15%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de alrededor de 15% a alrededor de 20%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un cambio de tensión de lisis crítica de alrededor de 1% a alrededor de 5%.
Como se mencionó anteriormente, la deformación de área crítica (Ac) es la deformación de área realizada por los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas en la tensión de lisis crítica. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una deformación de área crítica de alrededor de 20% a alrededor de 50%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una deformación de área crítica de alrededor de 20% a alrededor de 25%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una deformación de área crítica de alrededor de 25% a alrededor de 30%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una deformación de área crítica de alrededor de 30% a alrededor de 35%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una deformación de área crítica de alrededor de 35% a alrededor de 40%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una deformación de área crítica de alrededor de 40% a alrededor de 45%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una deformación de área crítica de alrededor de 45% a alrededor de 50%.
Como se mencionó anteriormente, una “capacidad de carga de mioglobina” es una medida de un portador de oxígeno a base de mioglobina, y se define como el peso de mioglobina dentro del portador de oxígeno dividido entre el peso total del portador. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una capacidad de carga de mioglobina mayor que alrededor de 5. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una capacidad de carga de mioglobina mayor que 10. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una capacidad de carga de mioglobina mayor que 15. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una capacidad de carga de mioglobina mayor que 20. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una capacidad de carga de mioglobina mayor que 25. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una capacidad de carga de mioglobina mayor que 26. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una capacidad de carga de mioglobina mayor que 27. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una capacidad de carga de mioglobina mayor que 28. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una capacidad de carga de mioglobina mayor que 29. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una capacidad de carga de mioglobina mayor que 30.
Como se mencionó anteriormente, una “eficiencia de carga de mioglobina” es una medida fundamental de un portador de oxígeno a base de mioglobina, y se define como el peso de mioglobina que se encapsula y/o se incorpora dentro de una suspensión portadora dividido entre el peso de la mioglobina original en disolución antes del encapsulamiento (expresado como un %). En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 10%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 11%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 12%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 13%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 14%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 15%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 16%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 17%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 18%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 19%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 20%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 21%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 22%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 23%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 24%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 25%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 26%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 27%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 28%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 29%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina mayor que alrededor de 30%.
En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina de alrededor de 10% a alrededor de 35%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina de alrededor de 15% a alrededor de 35%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina de alrededor de 18% a alrededor de 35%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina de alrededor de 20% a alrededor de 35%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina de alrededor de 22% a alrededor de 35%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina de alrededor de 24% a alrededor de 35%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina de alrededor de 26% a alrededor de 35%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina de alrededor de 28% a alrededor de 35%. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una eficiencia de carga de mioglobina de alrededor de 30% a alrededor de 35%.
En diversas realizaciones, el sujeto puede ser un mamífero. En diversas realizaciones, el sujeto puede ser un animal no humano. En diversas realizaciones, el sujeto puede ser un canino. En diversas realizaciones, el sujeto puede ser un vertebrado.
Las diversas realizaciones incluyen composiciones y métodos para obtener, almacenar y administrar portadores de oxígeno que comprenden un compuesto de unión a oxígeno encapsulado en una nanopartícula tal como un polimerosoma. En diversas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno puede estar compuesto de mioglobina. En diversas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno puede estar compuesto de hemoglobina humana o animal. En diversas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno puede estar compuesto por una forma de hemoglobina humana o animal alterada genética o químicamente. En diversas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno puede derivar de un péptido, proteína o ácido nucleico que posee afinidades por oxígeno (P50, coeficiente de cooperatividad n) similares a la de la mioglobina humana. En diversas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno puede derivar de una molécula pequeña o complejo quelante de metales que posee afinidades por oxígeno (P50, coeficiente de cooperatividad n) similares a la de la mioglobina humana. En diversas realizaciones, el compuesto de unión a oxígeno puede derivar de un ácido nucleico o polisacárido que posee afinidades por oxígeno (P50, coeficiente de cooperatividad n) similares a la de la mioglobina humana. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas pueden estar compuestos por una mezcla de compuestos de unión a oxígeno.
Las diversas realizaciones incluyen composiciones y métodos para obtener, almacenar y administrar portadores de oxígeno que comprenden un compuesto de unión a oxígeno encapsulado en un vehículo tal como un polimerosoma. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno pueden comprender mioglobina. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno pueden comprender una forma de hemoglobina humana o animal alterada genética o químicamente. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas pueden comprender una mezcla de compuestos de unión a oxígeno.
Algunas realizaciones pueden incluir además composiciones y métodos para desarrollar mioglobina encapsulada en polimerosomas (PEM) como portadores de oxígeno. En diversas realizaciones, la PEM puede incluir polimerosomas que comprenden poli(óxido de etileno)-bloque-poli(e-caprolactona) (PEO-b-PCL) y copolímeros de dibloques relacionados de poli(óxido de etileno)-bloque-poli(g-metil e-caprolactona) (PEO-b-PMCL). PEO puede proporcionar a los polimerosomas estabilidad química in vitro mejorada, biodisponibilidad in vivo aumentada, y vidas medias prolongadas de circulación sanguínea. Tanto PEO-b-PCL como PEO-b-PMCL pueden proporcionar una biodegradación in vivo total y segura de las membranas de polimerosomas vía hidrólisis de sus enlaces de éster. En diversas realizaciones, las dispersiones de mioglobina encapsulada en polimerosomas (PEM) biodegradables pueden estar compuestas por copolímeros de dibloques de PEO-b-PCL con un tamaño de bloque de PEO de ~1,5-2kDa y con una fracción de bloque de ~10-20% en peso. En diversas realizaciones, las dispersiones de mioglobina encapsulada en polimerosomas (PEM) biodegradables pueden estar compuestas de copolímeros de dibloques de PEO-b-PCL con un tamaño de bloque de PCL de ~8kDa-23kDa y con una fracción de peso de bloque de alrededor de ~50 a 85 por ciento. En otras realizaciones, las dispersiones de PEM pueden estar compuestas de copolímeros de dibloques de PEO-b-PMCL. Los polimerosomas de PEO-b-PCL y PEO-b-PMCL pueden ser portadores de oxígeno celular basados en mioglobina (MBOCs) preferidos, y poseen todas las propiedades necesarias para el suministro eficaz de oxígeno, incluyendo capacidades de unión a oxígeno ajustables, distribuciones uniformes y apropiadamente pequeñas de tamaños, viscosidades similares a la sangre humana y propiedades oncóticas, así como facilidad de producción en masa y almacenamiento asequible.
En una realización, se puede usar un enfoque de autoensamblaje supramolecular para preparar polimerosomas unilaminares monodispersos (50-300 nm de diámetro) que incorporan fluoróforos de infrarrojo cercano (NIR) basados en oligo(porfirina) (NIRFs) de alto rendimiento cuántico dentro de sus membranas bicapa124- 130 164-167. Estos polimerosomas brillantes, emisores de NIR, pueden poseer las propiedades fotofísicas y la biocompatibilidad necesarias para la formación de imágenes ópticas in vivo ultrasensibles 111124164168. Los estudios de formación de imágenes de ratones con tumores han demostrado que los polimerosomas no dirigidos pueden acumularse en los tumores después de la inyección intravascular debido al efecto de retención y permeabilidad mejorada (EPR) asociado con la microvasculatura tumoral permeable; el análisis cuantitativo de fluorescencia ha demostrado que se logra fácilmente una acumulación tumoral mayor de dos veces (FIGURA 7A) 164. La acumulación específica del tumor puede mejorarse aún más modificando las superficies de los polimerosomas a través de la conjugación química con ligandos seleccionadores de dianas, tales como moléculas pequeñas, péptidos, proteínas (por ejemplo, anticuerpos), y ácidos nucleicos111' 127164.
Algunas realizaciones incluyen una metodología operativa para sintetizar dispersiones de PEM que cumplen consistentemente con las siguientes características estándar: (i) radio promedio entre 100-200 nm con índice de polidispersidad < 1,1; (ii) eficiencia de encapsulamiento de Mb > 50% en moles; (iii) relación en peso de Mb encapsulada:polímero > 2; (iv) nivel de metMb en disolución < 5%; (v) viscosidad de la suspensión entre 3-4 cP; (vi)
P50 entre 2-3 mm Hg; y, (vii) una constante de velocidad de unión a NO al menos un orden de magnitud más pequeño que la medida para Mb libre a un peso similar por volumen de distribución; (viii) concentración de suspensión final de entre 80 y 180 mg de Mb/ml de disolución; y (ix) excelente estabilidad bajo diferentes condiciones de almacenamiento y flujo según lo determinado por la morfología intacta, cambio en el diámetro promedio de partículas < 5 nm, y concentración de Mb inalterada (cambio < 0,5 g/dl) y nivel de metMb sin cambios (cambio < 2%).
Las diversas PEMs de la realización pueden diferir en su combinación de tamaño de partículas, deformabilidad y concentración. Cada uno de estos parámetros puede afectar independientemente la cantidad de Mb por partícula, la estabilidad de la partícula, y el número de partículas que se acumularán en el sitio del tumor. Se pueden formar PEMs que tengan un diámetro medio de partícula de 100 nm o 200 nm. Los polimerosomas, al igual que otras nanopartículas que tienen un diámetro menor que 250 nm, pueden acumularse en tumores sólidos debido al efecto de EPR111- 114164.
Aunque los polimerosomas con un diámetro particular medio de 200 nm pueden suministrar más Mb por partícula, aquellos que tienen un diámetro de ~100 nm pueden exhibir vidas medias de circulación sanguínea más largas (antes del aclaramiento eventual por el sistema reticuloendotelial (RES))102- 111114136172, y pueden demostrar una mayor acumulación de tumores al atravesar los canales de plasma173 (microvasos pequeños que excluyen los glóbulos rojos (RBCs)).
Una PEM de la realización puede construirse a partir de copolímeros de dibloques de PEO-b-PCL, poli(óxido de etileno)-bloque-poli(g-metil e-caprolactona) (PEO-b-PMCL), y/o de poli(óxido de etileno)-bloque-poli(trimetilcarbonato)
(PEO-b-PTMC) para determinar el equilibrio final de la estabilidad de las partículas frente a la deformabilidad que puede maximizar el suministro tumoral in vivo. El PMCL, como derivado de PCL, forma de manera similar polimerosomas totalmente biorreabsorbibles que se degradan a través de la hidrólisis no enzimática de enlaces de éster174. Sin embargo, PEO-b-PCL puede producir membranas de vesículas sólidas ultraestables, mientras que PEO-b-PMCL y PEO-b-TMC pueden generar polimerosomas más deformables, una característica que puede ayudar en el paso de PEM a través de los vasos sanguíneos tumorales tortuosos.
Las diversas realizaciones pueden incluir una nanopartícula de polimerosomas u otros portadores de oxígeno con tamaños variables. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno incluye una forma aproximadamente esférica, y tiene un diámetro de alrededor de 50 nm a alrededor de 1 pm. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 50 nm a alrededor de 250 nm. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 100 nm a alrededor de 200 nm. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 200 nm a alrededor de 300 nm. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 300 nm a alrededor de 400 nm. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 400 nm a alrededor de 500 nm. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 500 nm a alrededor de 600 nm. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 600 nm a alrededor de 700 nm. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 700 nm a alrededor de 800 nm. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 800 nm a alrededor de 900 nm. En diversas realizaciones, el polimerosoma o portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 900 nm a alrededor de 1 pm.
En diversas realizaciones, el portador de oxígeno consiste en una nanopartícula que tiene un diámetro de alrededor de 5 nm a alrededor de 100 nm. En diversas realizaciones, el portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de
5 nm a alrededor de 10 nm. En diversas realizaciones, el portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 10 nm a alrededor de 50 nm. En diversas realizaciones, el portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 50 nm a alrededor de 100 nm. En diversas realizaciones, el portador de oxígeno tiene un diámetro de alrededor de 100 nm a alrededor de 300 nm. En diversas realizaciones, el portador de oxígeno tiene un diámetro de alre a alrededor de 500 nm. En diversas realizaciones, el portador de oxígeno tiene un diámetro de alre a alrededor de 1 pm.
En una realización adicional, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas pueden incluir grosores de membrana variables. El grosor de la membrana puede depender del peso molecular de los polímeros y los tipos de polímeros usados en la preparación de los portadores de oxígeno o polimerosomas. En diversas realizaciones, la membrana puede ser una sola, doble, triple, cuádruple, o más capas de polímeros. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un grosor de membrana de polímero de alrededor de 5 nm a alrededor de 35 nm. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un grosor de membrana de alrededor de 5 nm a alrededor de 10 nm. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un grosor de membrana de alrededor de 10 nm a alrededor de 15 nm. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un grosor de membrana de alrededor de 15 nm a alrededor de 20 nm. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un grosor de membrana de alrededor de 20 nm a alrededor de 25
nm. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un grosor de membrana de alrededor de 25 nm a alrededor de 30 nm. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen un grosor de membrana de alrededor de 30 nm a alrededor de 35 nm. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una membrana polimérica que no tiene más de alrededor de 5 nm de grosor. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una membrana polimérica que no tiene más de alrededor de 10 nm de grosor. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una membrana polimérica que no tiene más de alrededor de 15 nm de grosor. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una membrana polimérica que no tiene más de alrededor de 20 nm de grosor. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una membrana polimérica que no tiene más de alrededor de 25 nm de grosor. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una membrana de polímero que no tiene más de alrededor de 30 nm de grosor. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas tienen una membrana de polímero que no tiene más de alrededor de 35 nm de grosor.
La FIG. 9 ilustra un método 900 para la preparación y suministro de MBOC. En la etapa 902, el portador de oxígeno a base de mioglobina (MBOC) se autoensambla en disolución acuosa. En la etapa 904, el portador de oxígeno a base de mioglobina se estabiliza mediante modificación química. En la etapa 906, el constructo resultante se liofoliza. En la etapa 908, el constructo resultante se almacena mediante almacenamiento en fase seca. En la etapa 910, rehidratación de la disolución en el punto de atención. En la etapa 912, se suministran in vivo MBOCs biodegradables que retienen su mioglobina original. Como un ejemplo no limitativo, la Mb encapsulada en polimerosomas puede prepararse y generarse mediante dicho método de preparación de MBOC. En la etapa 914, el tratamiento puede administrarse, por ejemplo, administrando el MBOC y/o el agente de alta afinidad por oxígeno al paciente y administrando radiación ionizante al tumor.
La FIG. 10 ilustra un método 1000 para preparar un polimerosoma que comprende al menos un polímero biocompatible y al menos un polímero biodegradable. Cabe señalar que la FIG. 10 proporciona una descripción general de alto nivel de las etapas del método, y que los detalles para cada etapa se proporcionan más abajo. En la etapa 1002, se puede preparar una disolución orgánica que tiene una pluralidad de polímeros. En la etapa 1004, la disolución orgánica que comprende la pluralidad de polímeros puede exponerse a una superficie de plástico, de politetrafluoroetileno (es decir, Teflon™) (aquí “PTFE”) o de vidrio. En la etapa 1006, la disolución orgánica puede deshidratarse sobre la superficie de plástico, de PTFE o de vidrio, para crear una película de polímeros. En la etapa 1008, la película de polímeros puede rehidratarse en una disolución acuosa. En la etapa 1010, los polímeros pueden reticularse en la disolución acuosa mediante modificación química.
Los polimerosomas de las diversas PEMs de la realización pueden comprender copolímeros que se sintetizan para incluir grupos polimerizables dentro de sus bloques hidrófilos o hidrófobos. Los polímeros biodegradables polimerizables pueden usarse para formar polimerosomas que co-incorporan Mb y un iniciador soluble en agua en sus interiores acuosos, o alternativamente, compartimentando Mb en sus cavidades acuosas y un iniciador insoluble en agua en sus membranas hidrófobas.
Las diversas realizaciones pueden incluir además un método para preparar un polimerosoma que comprende al menos un polímero biocompatible y al menos un polímero biodegradable, que comprende: (a) preparar una disolución orgánica que comprende una pluralidad de polímeros, y exponer la disolución orgánica que comprende la pluralidad de polímeros a una superficie de plástico, de politetrafluoroetileno (PTFE) (también conocido como Teflon®), o de vidrio; (b) deshidratar la disolución orgánica sobre la superficie de plástico, de Teflon®, o de vidrio, para crear una película de polímeros; y (c) rehidratar la película de polímeros en una disolución acuosa; (d) reticular los polímeros en la disolución acuosa mediante modificación química.
Las composiciones de las diversas realizaciones pueden hacerse por métodos de hidratación directa como se describe en O’Neil, et al., Langmuir 2009, 25(16), 9025-9029. Brevemente, los polimerosomas de las diversas realizaciones pueden prepararse y encapsularse usando el siguiente método: Para preparar formulaciones, se pueden pesar 20 mg totales de polímero en un tubo de centrífuga de 1,5 ml, calentar a 95°C durante 20 minutos, y mezclar. Después de que las muestras se enfríen hasta temperatura ambiente (mínimo 15 min), se pueden añadir 10 pl de disolución de proteína y se pueden diluir con 20, 70 y 900 pl de disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) de 10 mmoles, pH 7,4, mezclando después de cada adición. Como control, los polimerosomas pueden formarse mediante dilución con PBS (10, 20, 70, 890 pl de PBS, mezclando después de cada adición), y finalmente se añaden 10 pl de la disolución de proteína después de la formación de los polimerosomas. De esta manera, la eficiencia de encapsulamiento y la carga pueden calcularse por sustracción. Todas las muestras pueden prepararse por triplicado. Las eficiencias de encapsulamiento pueden cuantificarse a partir de las curvas estándar generadas a partir de la reticulación marcada con fluorescencia a los polímeros de elección bajo investigación.
En otro método de realización, la preparación de polimerosomas puede implicar el fraccionamiento a gran escala de partículas vesiculares. Brevemente, se puede hidratar un total de 1,25 g de copolímero de dibloques con 25 ml de amortiguador de fosfato (PB) 10 mM a pH 7,3. Debido a la baja solubilidad de los copolímeros de dibloques en PB, la mezcla de polímeros acuosa puede someterse a ultrasonidos (Branson Sonifier 450, VWR Scientific, West Chester, PA) durante 8-10 h a temperatura ambiente para producir la disolución madre de copolímero. La disolución madre de copolímero puede mezclarse entonces con 25 ml de Mb purificada (250-300 g/l) para producir una concentración de copolímero de 12,5 mg/ml en la mezcla de copolímero de Mb. Los polimerosomas vacíos pueden prepararse diluyendo la disolución madre de copolímero en PB, en lugar de en la disolución de Mb purificada, para producir una concentración de copolímero de 12,5 mg/ml. Para el método de extrusión manual de 1 ml de volumen, la mezcla de Mb-copolímero/copolímero puede extruirse 20 veces a través de membranas de policarbonato de 100 nm o 200 nm de diámetro (Avanti PolarLipids, Alabaster, AL). Sin embargo, para el método de extrusión de fibra hueca (HF) a gran escala (Figuras 4 y 5), la mezcla de Mb-copolímero/copolímero puede extruirse a través de una membrana de HF de 0,2 mm (Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA). Para ambos métodos de extrusión, las dispersiones de PEM extruidas se pueden dializar durante la noche usando bolsas de diálisis de corte de peso molecular (MWCO) de 300 kDa (Spectrum Laboratories Inc., Rancho Dominguez, CA) en PB a 4°C a una relación de volumen/volumen (v/v) de 1:1000 (PEM extruida/PB) para eliminar Mb sin encapsular de la dispersión vesicular. Para medir la distribución de tamaños de los polimerosomas vacíos y las partículas de PEM se puede usar un fraccionador de flujo de campo de flujo asimétrico Eclipse (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA) acoplado en serie a un fotómetro de dispersión de luz estática de ángulo múltiple Dawn Heleos de 18 ángulos (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA). El fotómetro de dispersión de luz está equipado con un láser de GaAs de 30 mW que funciona a una longitud de onda de láser de 658 nm. Los espectros de dispersión de luz pueden analizarse usando el paquete de software ASTRA (Wyatt Technology Corp., Santa Barbara, CA) para calcular la distribución de tamaños de partículas. El amortiguador de elución consistió en PB 10 mM a pH 7,3.
Cabe señalar que, si bien los intervalos de diámetro se dan anteriormente, el diámetro final de la membrana de policarbonato a través de la cual se extruyen los polimerosomas definirá la distribución final de tamaños (diámetro) de los polimerosomas en esa suspensión.
Encapsulamiento de Mb en PEM: Para medir la cantidad de Mb que se encapsuló dentro de las partículas de PEM, las dispersiones de PEM dializadas se lisaron en primer lugar usando Triton X100 al 0,5% v/v (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) en PB. Las muestras de PEM lisadas se pueden centrifugar a 14.000 rpm durante 15 min, y el sobrenadante se recogió para análisis. La concentración de Mb encapsulada obtenida después de la lisis de las partículas de PEM (mg/ml) puede medirse usando el método de Bradford a través del kit de análisis de proteínas Coomassie Plus (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
Como consecuencia de la reacción de dos o más de los grupos polimerizables facilitados por el iniciador, se pueden generar dispersiones de PEM estabilizadas mediante la formación de enlaces covalentes entre las cadenas de los copolímeros que forman las membranas de los polimerosomas. Estos constructos de PEM estabilizados pueden secarse adicionalmente a través de protocolos de liofilización bien establecidos sin alterar la estructura del polimerosoma formada o sin perder la Mb encapsulada. En diversas realizaciones, los polimerosomas se administran en la disolución acuosa. Si se liofilizan, en diversas realizaciones, los polimerosomas se reconstituyen en una disolución acuosa apropiada y se administran a un sujeto. El PEM biodegradable liofilizado puede almacenarse en un desecador (sin O2) a 4°C durante períodos de tiempo variables sin degradación de polímero o Mb, ya que las suspensiones secas están libres de radicales libres acuosos, protones, etc. Los polimerosomas pueden rehidratarse en el punto de atención antes del suministro.
Para generar polimerosomas estabilizados, las unidades polimerizables pueden unirse químicamente a los extremos hidrófilos o hidrófobos del copolímero después de la síntesis. Se pueden formar una o más reticulaciones entre cadenas de copolímeros de múltiples bloques entre las unidades polimerizables y los polímeros hidrófilos o hidrófobos de las diversas realizaciones. Estas reticulaciones pueden formarse adecuadamente introduciendo una composición que tiene múltiples grupos polimerizables en las cadenas de copolímero de múltiples bloques, aunque en diversos casos, el propio copolímero de múltiples bloques incluye múltiples grupos polimerizables. En diversas realizaciones, los grupos múltiples polimerizables se escogen de acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, vinilos, unidades de vinilsulfona, o una combinación de los mismos. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables de alrededor de 0% en peso (peso) a alrededor de 5% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables de alrededor de 5% en peso a alrededor de 10% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables de alrededor de 10% en peso a alrededor de 20% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables de alrededor de 20% en peso a alrededor de 30% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables de alrededor de 30% en peso a alrededor de 40% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables de alrededor de 40% en peso a alrededor de 50% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables de alrededor de 50% en peso a alrededor de 60% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables de alrededor de 60% en peso a alrededor de 70% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno o los polimerosomas comprenden los grupos polimerizables desde alrededor de 70% en peso hasta alrededor de 80% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables desde alrededor de 80% en peso hasta alrededor de 90% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables desde alrededor de 90% en peso hasta alrededor de 95% en peso del peso total de la composición. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas comprenden los grupos polimerizables desde alrededor de 95% en peso hasta alrededor de 100% en peso del peso total de la composición. La reticulación entre las cadenas de una membrana se logra mediante la activación de la reacción de polimerización por un iniciador, y da como resultado la mejora de la rigidez de la composición de polimerosoma. En ciertas realizaciones, el grupo polimerizable puede conjugarse con el bloque hidrófilo del copolímero que consiste en poli(óxido de etileno), poli(etilenglicol), poli(ácido acrílico), y similares. En otras realizaciones, el grupo polimerizable puede conjugarse con el bloque hidrófobo del copolímero que consiste en poli(e-caprolactona), poli(g-metil e-caprolactona), poli(trimetilcarbonato), poli(mentida), poli(lactida), poli(glicolida), poli(metilglicolida), poli(dimetilsiloxano), poli(isobutileno), poli(estireno), poli(etileno), poli(óxido de propileno), etc. El iniciador puede ser una molécula que genera/reacciona al calor, luz, pH, fuerza iónica de la disolución, osmolaridad, presiones, etc. En diversas realizaciones, el iniciador puede ser fotorreactivo y reticula los polímeros del portador de oxígeno o polimerosoma por exposición a la luz ultravioleta.
Las composiciones de las diversas realizaciones pueden prepararse sin el uso de disolventes orgánicos. Las composiciones de las diversas realizaciones pueden incluir polimerosomas que comprenden copolímeros de poli(óxido de etileno)-bloque-poli(e-caprolactona), poli(óxido de etileno)-bloque-poli(g-metil e-caprolactona) y/o poli(óxido de etileno)-bloque-poli(trimetilcarbonato) que se han modificado con un resto de acrilato en el extremo del bloque hidrófobo. En diversas realizaciones, los portadores de oxígeno, nanopartículas y/o polimerosomas pueden comprender polímeros reticulados formados entre el extremo del bloque hidrófobo y un diacrilato usando un iniciador de UV, tal como 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (DMPA). En diversas realizaciones, la DMPA se divide en compartimentos en la membrana del polimerosoma durante el ensamblaje del polimerosoma mientras, que Mb ocupa el compartimento acuoso interno del portador.
La composición de las diversas realizaciones también puede comprender polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno que tienen vidas medias degradativas aumentadas. Los tiempos de circulación del portador de oxígeno y de los polimerosomas pueden estar limitados generalmente a horas (o hasta un día) debido a su aclaramiento rápido por el sistema fagocítico mononuclear (MPS) del hígado y del bazo, o por excreción. Los estudios clínicos han mostrado que los tiempos de circulación de portadores esféricos se pueden prolongar generalmente tres veces en seres humanos con respecto a las ratas. Como se propone para formulaciones farmacéuticas de liposomas de PEG usadas clínicamente, los portadores de oxígeno y los polimerosomas con un tiempo de vida circulante prolongado pueden incrementar la exposición del fármaco a células cancerosas, tejidos poco oxigenados, o heridas cicatrizantes, y de ese modo incrementan la dosis integrada en el tiempo, denominada comúnmente en el suministro de fármacos como “el área bajo la curva”. Adicionalmente, el efecto mejorado de permeación y retención, que permite que pequeños solutos y micelas permeen los vasos sanguíneos permeables de un tumor que se expande rápidamente, también puede permitir que los portadores de oxígeno y polimerosomas se transporten al estroma tumoral. La circulación persistente de los portadores de oxígeno y polimerosomas tiene muchas aplicaciones prácticas debido a que estos vehículos pueden incrementar la exposición de fármacos a células cancerosas, tejidos poco o nada oxigenados, o heridas cicatrizantes.
Las composiciones de las diversas realizaciones pueden comprender polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno que tienen vidas medias circulatorias aumentadas. En diversas realizaciones, las composiciones tienen un cierto porcentaje en masa de composición de polímero diseñada para que tenga una vida media circulatoria de alrededor de 12 horas a alrededor de 36 horas, y una vida media degradativa de alrededor de 38 a alrededor de 60 horas.
En diversas realizaciones, las composiciones tienen cierto porcentaje en masa de composición de polímero diseñado para que tenga una vida media circulatoria alrededor de 12 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. Este retraso en la degradación puede variar dependiendo de la vía de administración y/o del microcompartimiento seleccionado como diana, el tamaño del portador de oxígeno o polimerosoma, o el microentorno subcelular en el que el polimerosoma o portador de oxígeno despliega sus contenidos para el tratamiento o prevención de los estados mórbidos o trastornos descritos aquí. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 11 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 10 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 9 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 8 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 7 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 6 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 5 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 4 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 3 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 2 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 1 hora menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vida media circulatoria alrededor de 14 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen una vidad media circulatoria de alrededor de 1 hora hasta alrededor de 20 horas menor que la vida media degradativa del portador de oxígeno o polimerosoma. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen un cierto porcentaje en masa de composición de polímero diseñado para que tenga una vida media criculatoria de alrededor de 36 horas, y una vida media degradativa mayor que alrededor de 48 horas. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen un cierto porcentaje en masa de composición de polímero diseñado para que tenga una vida media criculatoria de alrededor de 24 horas hasta alrededor de 36 horas, y una vida media degradativa de alrededor de 38 a alrededor de 60 horas. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen un cierto porcentaje en masa de composición de polímero diseñado para que tenga una vida media criculatoria de alrededor de 28 horas hasta alrededor de 36 horas, y una vida media degradativa de alrededor de 38 hasta alrededor de 60 horas. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen un cierto porcentaje en masa de composición de polímero diseñado para que tenga una vida media criculatoria de alrededor de 30 horas hasta alrededor de 36 horas, y una vida media degradativa de alrededor de 38 hasta alrededor de 60 horas. En diversas realizaciones, las composiciones que comprenden polimerosomas, nanopartículas o portadores de oxígeno tienen un cierto porcentaje en masa de composición de polímero diseñado para que tenga una vida media criculatoria de no más de 36 horas, y una vida media degradativa de alrededor de 38 hasta alrededor de
60 horas.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es 6 horas mayor que la vida media circulatoria. En diversas realizaciones, la vida media de degradación está entre 6 horas y 24 horas mayor que la vida media circulatoria. En diversas realizaciones, la vida media de degradación es más de 24 horas mayor que la vida media circulatoria. En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 6 horas mayor que la vida media circulatoria. En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 7 horas mayor que la vida media circulatoria. En diversas realizaciones, la vida media
Figure imgf000039_0001
de degradación es alrededor de 8 horas mayor que la vida media circulatoria. En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 9 horas mayor que la vida media circulatoria. En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 10 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 11 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 12 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 13 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 14 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 15 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 16 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 17 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 18 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 19 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 20 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 21 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 22 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 23 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 24 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 36 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 48 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 60 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es alrededor de 72 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, la vida media de degradación es mas de 96 horas mayor que la vida media circulatoria.
En diversas realizaciones, el suministro in vivo se logra mediante las vías de administración intravenosa, por inhalación, transmucosal (por ejemplo bucal) o transcutánea. Las dosificaciones para un hospedante dado pueden determinarse usando consideraciones convencionales, por ejemplo mediante comparación habitual de las actividades diferenciales de las presentes preparaciones y un protocolo farmacológico apropiado convencional conocido.
En una realización, se pueden usar concentraciones finales diferentes de PEMs a fin de analizar los efectos de la dosis de Mb sobre la mejora de la oxigenación y la mitigación de la hipoxia tumoral. Inyecciones de 100 ul de PEMs, que contienen 90 o 180 mg de Mb/ml, pueden dar como resultado dosis de inyección de 450 o 900 mg/kg de Mb, respectivamente, suponiendo un ratón de 20 g. Estas dosis corresponden a la dosis de inyección de hemoglobina total encontrada en 0,5 y 1 unidades de sangre completa, suponiendo concentraciones sanguíneas de 15 g/dl, 450 ml de sangre/unidad, y un ser humano de 70 kg. Si bien dosis más grandes de PEM probablemente pueden mejorar el suministro de Mb al tumor, mayores cantidades de Mb libre (liberada durante la degradación de las PEMs) pueden dar como resultado una absorción local de NO, una menor microperfusión, y una oxigenación ineficaz175. En una realización preferida, las concentraciones de polímero asociadas y las dosis de inyección presentes pueden oscilar entre 2,5-18 mg/ml y 12,5-90 mg/kg, suponiendo una relación en peso final de Mb encapsulada:polímero que oscila entre 10-35, todo lo cual cae dentro del intervalo de los estudios previos con animales que demostraron ausencia de toxicidades in vivo subagudas o agudas de diversas composiciones de polimerosomas111- 122164168171.
La composición farmacéutica de las diversas realizaciones puede ser un portador de oxígeno que posee diferentes “relaciones de carga” de agentes de unión a oxígeno a vehículo inerte. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende < 5 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 5 hasta alrededor de 40 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 10 hasta alrededor de 40 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte polimérico. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 20 hasta alrededor de 40 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 30 hasta alrededor de 40 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 35 hasta alrededor de 40 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 25 hasta alrededor de 40 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 25 hasta alrededor de 35 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 25 hasta alrededor de 30 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 20 hasta alrededor de 25 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 10 hasta alrededor de 15 mg de agente de unión a oxígeno/mg de vehículo inerte.
En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 5 hasta alrededor de 35 mg de Mb/mg de polímero. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 10 hasta alrededor de 35 mg de Mb/mg de polímero. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 20 hasta alrededor de 35 mg de Mb/mg de polímero. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 30 hasta alrededor de 35 mg de Mb/mg de polímero. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 25 hasta alrededor de 35 mg de Mb/mg de polímero. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 25 hasta alrededor de 30 mg de Mb/mg de polímero. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 20 hasta alrededor de 25 mg de Mb/mg de polímero. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 10 hasta alrededor de 15 mg de Mb/mg de polímero. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 5 hasta alrededor de 10 mg de Mb/mg de polímero. En diversas realizaciones, las dosis de Mb se pueden sustituir por el mismo peso de Mb.
En diversas realizaciones, la composición farmacéutica es una formulación líquida, en la que la dosificación puede ser de alrededor de 1 unidad de composiciones a alrededor de 50 unidades de suspensión de portador de oxígeno, en la que una unidad de suspensión comprende de alrededor de 40 g de Mb a alrededor de 85 g de Mb.
En una realización, el agente/compuesto de alta afinidad por oxígeno tiene una P50 para el oxígeno que es menor que 25 mmHg. En una realización, el agente/compuesto de alta afinidad por oxígeno tiene una P50 para oxígeno que es menor que 20 mmHg. En una realización, el agente/compuesto de alta afinidad por oxígeno tiene una P50 para oxígeno que es menor que 15 mmHg. En una realización, el agente/compuesto de alta afinidad por oxígeno tiene una P50 para oxígeno que es menor que 10 mmHg. En una realización, el agente/compuesto de alta afinidad por oxígeno tiene una P50 para oxígeno que es menor que 5 mmHg.
En diversas realizaciones, una unidad de una formulación líquida que comprende la composición farmacéutica comprende alrededor de 41 gramos de Mb. En diversas realizaciones, una unidad de una formulación líquida que comprende la composición farmacéutica comprende alrededor de 45 gramos de Mb. En diversas realizaciones, una unidad de una formulación líquida que comprende la composición farmacéutica comprende alrededor de 50 gramos de Mb. En diversas realizaciones, una unidad de una formulación líquida que comprende la composición farmacéutica comprende alrededor de 55 gramos de Mb: En diversas realizaciones, una unidad de una formulación líquida que comprende la composición farmacéutica comprende alrededor de 60 gramos de Mb. En diversas realizaciones, una unidad de una formulación líquida que comprende la composición farmacéutica comprende alrededor de 65 gramos de Mb. En diversas realizaciones, una unidad de una formulación líquida que comprende la composición farmacéutica comprende alrededor de 70 gramos de Mb. En diversas realizaciones, una unidad de una formulación líquida que comprende la composición farmacéutica comprende alrededor de 75 gramos de Mb. En diversas realizaciones, una unidad de una formulación líquida que comprende la composición farmacéutica comprende alrededor de 80 gramos de Mb. En diversas realizaciones, una unidad de una formulación líquida que comprende la composición farmacéutica comprende alrededor de 85 gramos de Mb.
En general, una composición farmacéutica según las diversas realizaciones puede comprender una dosis de una proteína de unión a oxígeno que se suspende en una disolución y se administra en unidades, en la que una unidad es igual a 81 gramos de proteína de unión a oxígeno. Si un sujeto se somete a cirugía o experimenta pérdida de sangre, la composición farmacéutica se puede administrar al sujeto según el siguiente régimen de dosificación, en el que la sangre se sustituye por unidades de formulación líquida: En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende de alrededor de 40 g de proteína de unión a oxígeno/unidad de disolución administrada a alrededor de 81 g de proteína de unión a oxígeno/unidad de disolución administrada.
Figure imgf000041_0001
En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una dosis de alrededor de 40 g de Mb/unidad de disolución administrada hasta alrededor de 80 g de Mb/unidad de disolución administrada. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una dosis de alrededor de 50 g de Mb/unidad de disolución administrada hasta alrededor de 80 g de Mb/unidad de disolución administrada. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una dosis de alrededor de 60 g de Mb/unidad de disolución administrada hasta alrededor de 80 g de Mb/unidad de disolución administrada. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una dosis de alrededor de 70 g de Mb/unidad de disolución administrada hasta alrededor de 80 g de Mb/unidad de disolución administrada. En diversas realizaciones, la composición farmacéutica comprende una dosis de alrededor de 60 g de Mb/unidad de disolución administrada hasta alrededor de 70 g de Mb/unidad de disolución administrada.
La dosis de la composición farmacéutica de las diversas realizaciones también se puede medir en gramos de polimerosoma administrado por kg de un sujeto. En diversas realizaciones, la dosis total administrada comprende de alrededor de 12,5 mg de polímero hasta alrededor de 90 mg de polímero por kg de un sujeto. En diversas realizaciones, la dosis total administrada comprende de alrededor de 15 mg de polímero hasta alrededor de 90 mg de polímero por kg de un sujeto. En diversas realizaciones, la dosis total administrada comprende de alrededor de 25 mg de polímero hasta alrededor de 90 mg de polímero por kg de un sujeto. En diversas realizaciones, la dosis total administrada comprende de alrededor de 35 mg de polímero hasta alrededor de 90 mg de polímero por kg de un sujeto. En diversas realizaciones, la dosis total administrada comprende de alrededor de 45 mg de polímero hasta alrededor de 90 mg de polímero por kg de un sujeto. En diversas realizaciones, la dosis total administrada comprende de alrededor de 55 mg de polímero hasta alrededor de 90 mg de polímero por kg de un sujeto. En diversas realizaciones, la dosis total administrada comprende de alrededor de 65 mg de polímero hasta alrededor de 90 mg de polímero por kg de un sujeto. En diversas realizaciones, la dosis total administrada comprende de alrededor de 75 mg de polímero hasta alrededor de 90 mg de polímero por kg de un sujeto. En diversas realizaciones, la dosis total administrada comprende de alrededor de 80 mg de polímero hasta alrededor de 90 mg de polímero por kg de un sujeto. En diversas realizaciones, la dosis total administrada comprende de alrededor de 85 mg de polímero hasta alrededor de 90 mg de polímero por kg de un sujeto.
En diversas realizaciones, la composición farmacéutica es una formulación líquida que comprende un efector alostérico tal como 2,3-Bisfosfoglicerato, en la que la formulación comprende de alrededor de 1 hasta alrededor de 100 mmol/l de formulación. En diversas realizaciones, la formulación comprende de alrededor de 1 hasta alrededor de 100 mmoles de un isómero de 2,3-Bisfosfoglicerato por l de formulación. En diversas realizaciones, la formulación comprende de alrededor de 1 hasta alrededor de 10 mmoles de un isómero de 2,3-Bisfosfoglicerato por l de formulación. En diversas realizaciones, la formulación comprende de alrededor de 5 mmoles de 2,3-Bisfosfoglicerato, o isómero derivado del mismo, por l de formulación. En diversas realizaciones, la formulación comprende de alrededor de 2,25 mmoles de 2,3-Bisfosfoglicerato, o isómero derivado del mismo, por unidad (450 ml) de formulación.
Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar, envasar o vender en forma de una suspensión o disolución acuosa u oleosa estéril inyectable. Esta suspensión o disolución puede formularse según la técnica conocida, y puede comprender, además del ingrediente activo, ingredientes adicionales tales como los agentes dispersantes, agentes humectantes, o agentes de suspensión descritos aquí. Tales formulaciones inyectables estériles pueden prepararse usando un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, tal como, por ejemplo, agua o 1,3 butanodiol. Otros diluyentes y disolventes aceptables incluyen, pero no se limitan a, disolución de Ringer, disolución isotónica de cloruro de sodio, y aceites fijos tales como mono- o diglicéridos sintéticos. Otras formulaciones administrables parenteralmente que son útiles incluyen aquellas que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina, en una preparación liposómica, o como un componente de sistemas de polímeros biodegradables. Las composiciones para liberación sostenida o implante pueden comprender materiales poliméricos o hidrófobos farmacéuticamente aceptables, tal como una emulsión, una resina de intercambio iónico, un polímero escasamente soluble, o una sal escasamente soluble. Las formulaciones descritas aquí también son útiles para la administración pulmonar y el tratamiento de tales cánceres del sistema respiratorio o del pulmón, también son útiles para la administración intranasal de una composición farmacéutica de las diversas realizaciones. Tal formulación adecuada para la administración intranasal es un polvo basto que comprende el ingrediente activo y que tiene una partícula promedio de alrededor de 0,2 a 500 micrómetros, administrada mediante inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente del polvo mantenido próximo a las fosas nasales.
Las composiciones farmacéuticas de las diversas realizaciones pueden administrarse para suministrar una dosis de alrededor de 0,1 g/kg/día a alrededor de 100 g/kg/día, en el que la medida en gramos es igual al peso total de Mb y polímero en la composición farmacéutica. En diversas realizaciones, la dosis es de alrededor de 0,1 a 1 g/kg/día. En otra realización, la dosis es de alrededor de 0,5 g/kg/día a alrededor de 1,0 g/kg/día. En otra realización, la dosis es de alrededor de 1,0 g/kg/día a alrededor de 1,5 g/kg/día. En otra realización, la dosis es de alrededor de 1,5 g/kg/día a alrededor de 2,0 g/kg/día. En otra realización, la dosis es de alrededor de 2,5 g/kg/día a alrededor de 3,0 g/kg/día. En otra realización, la dosis es 1,0, 2,0, 5,0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 g/kg/día, en la que la medida de gramos es igual al peso total de Mb y polímero en la composición farmacéutica. En una realización, la administración de una dosis puede dar como resultado una concentración terapéuticamente eficaz del fármaco, proteína, agente activo, etc., entre 1 pM y 10 pM en un tejido enfermo o afectado por cáncer, o tumor de un mamífero cuando se analiza in vivo.
En una realización, una composición farmacéutica, especialmente aquella usada para fines profilácticos, puede comprender, además, una carga adyuvante farmacéuticamente aceptable o similar. Los portadores adecuados farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica. Los ejemplos de portadores típicos incluyen disolución salina, disolución salina amortiguada y otras sales, lípidos, y tensioactivos. El portador de oxígeno o polimerosoma también puede estar liofilizado, y se puede administrar en formas de un polvo. Tomando precauciones apropiadas para no desnaturalizar ningún componente proteico descrito aquí, las preparaciones se pueden esterilizar y, si se desea, mezclar con agentes auxiliares, por ejemplo lubricantes, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, amortiguadores, y similares, que no reaccionan de forma perjudicial con el portador de oxígeno o polimerosoma explicado aquí. También se pueden combinar, cuando se desee, con otros agentes biológicamente activos, por ejemplo ADN antisentido o ARNm.
Una composición farmacéutica de las diversas realizaciones se puede preparar, envasar, o vender a granel, como una única dosis unitaria, o como una pluralidad de dosis unitarias individuales. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosis del ingrediente activo que se administraría a un sujeto, o una fracción conveniente de tal dosis, tal como, por ejemplo, una mitad o un tercio de tal dosis, como se conoce en la técnica.
Las cantidades relativas del ingrediente activo, del portador farmacéuticamente aceptable, y cualesquiera ingredientes adicionales en una composición farmacéutica de las diversas realizaciones pueden variar, dependiendo de la identidad, el tamaño y la condición del sujeto tratado, y dependiendo además de la vía mediante la cual se administra la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender de alrededor de 0,1% a alrededor de 100% (p/p) de ingrediente activo.
Las composiciones y métodos descritos aquí pueden ser útiles para prevenir o tratar cáncer o cualquier trastorno de la sangre, incluyendo, pero no limitado necesariamente a, anemia, en la que un trastorno de la sangre provoca una mala o baja oxigenación de tejidos en un sujeto. En diversas realizaciones, la composición y métodos descritos aquí pueden usarse en el tratamiento del cáncer junto con radioterapia.
Las composiciones y métodos descritos aquí pueden ser útiles para prevenir la diseminación o mejorar la quimioterapia y/o radioterapia de cánceres, que incluyen leucemias, linfomas, meningiomas, tumores mixtos de las glándulas salivares, adenomas, carcinomas, adenocarcinomas, sarcomas, disgerminomas, retinoblastomas, tumores de Wilms, neuroblastomas, melanomas, y mesoteliomas; como se representa mediante una variedad de tipos de cánceres, incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer de mama, sarcomas y otras neoplasias, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer pancreático, cáncer gástrico, cáncer cervical, cáncer ovárico, cánceres del cerebro, diversas leucemias y linfomas. Se podría esperar que cualquier otra célula tumoral humana, independientemente de la expresión de p53 funcional, fuera el sujeto de tratamiento o prevención mediante los métodos explicados aquí, aunque se pone énfasis particular en células mamarias y tumores mamarios. Las diversas realizaciones también pueden englobar un método de tratamiento, según el cual se puede administrar a un paciente que requiera tal tratamiento una cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco, proteína, agente activo, etc., o un vector que los comprende, según las diversas realizaciones. Las diversas realizaciones no deben interpretarse como limitadas únicamente a estos ejemplos, puesto que otras enfermedades asociadas a cánceres, que actualmente son desconocidas, una vez conocidas también pueden ser tratables usando los métodos de las diversas realizaciones.
También útil junto con los métodos proporcionados en las diversas realizaciones puede ser la quimioterapia, la fototerapia, las terapias antiangiogénicas o de irradiación, por separado o combinadas, que pueden usarse antes, simultáneamente o después de los tratamientos mejorados explicados aquí, pero se usarán más eficazmente después de que las células hayan sido sensibilizadas por los presentes métodos. Como se usa aquí, la frase “agente quimioterapéutico” significa cualquier agente químico o fármaco usado para el tratamiento quimioterapéutico, que afecta selectivamente a células tumorales, incluyendo, pero sin limitarse a, agentes tales como adriamicina, actinomicina D, camptotecina, colchicina, taxol, cisplatino, vincristina, vinblastina, y metotrexato. Estos otros agentes son bien conocidos en la técnica.
Las diversas realizaciones pueden incluir métodos para estimular la cicatrización de heridas en un sujeto que lo necesite, que comprenden administrar el portador de oxígeno o polimerosoma de las diversas realizaciones a un sujeto que lo necesite. Algunas realizaciones pueden incluir métodos para tratar o prevenir enfermedades, dolencias o afecciones en mamíferos. En diversas realizaciones, las composiciones de las diversas realizaciones pueden usarse para anemia canina. En diversas realizaciones, las composiciones de las diversas realizaciones pueden ser útiles para tratar o prevenir síntomas asociados con deficiencia de hierro. Algunas realizaciones pueden proporcionar métodos para tratar un trastorno de la sangre o poca oxigenación de tejidos en pacientes susceptibles a, con síntomas de, o con riesgo elevado de desarrollar hipertensión.
Las diversas realizaciones también pueden incluir kits que comprenden cualquiera de las composiciones mencionadas anteriormente o composiciones farmacéuticas que comprenden un portador de oxígeno o un polimerosoma, en las que el portador de oxígeno o un polimerosoma comprende al menos un polímero biocompatible y al menos un polímero biodegradable. Según diversas realizaciones, la formulación puede suministrarse como parte de un kit. El kit puede comprender la composición farmacéutica que comprende un portador de oxígeno o un polimerosoma. En otra realización, el kit puede comprender un portador de oxígeno o polimerosoma liofilizado, con una mezcla para rehidratación acuosa. En otra realización, el portador de oxígeno o polimerosoma puede estar en un recipiente, mientras que la mezcla de rehidratación está en un segundo recipiente. La mezcla de rehidratación se puede suministrar en forma seca, a la que se puede añadir agua para formar una disolución de rehidratación antes de la administración por la boca, punción venosa, inyección, o cualquier otro modo de suministro. En diversas realizaciones, el kit puede comprender además un vehículo para la administración de la composición, tal como un tubo, un catéter, una jeringuilla, una aguja, y/o una combinación de cualquiera de los anteriores.
Si bien las nanopartículas se pueden usar para incrementar pO2 intratumoral a fin de incrementar la eficacia de la radiación y las quimioterapias como se explican anteriormente, en algunas realizaciones diversas formulaciones de nanopartículas se pueden diseñar para la reducción tumoral a través de mecanismos alternativos. Un mecanismo particular de tales mecanismos alternativos es un procedimiento único de “embolización microvascular mediada por nanopartículas” (NME). En los procedimientos de NME, las nanopartículas pueden usarse para suministrar selectivamente sustancias vasoactivas a tumores para cortar el suministro sanguíneo de una manera que no se base en la expresión de dianas angiogénicas moleculares.
Los intentos actuales de embolización tumoral implican generalmente técnicas que se realizan por radiólogos intervencionistas entrenados, e implican quimioembolización arterial transarterial (TACE) de carcinoma hepatocelular (HCC) o de metástasis hepatodominantes de otras neoplasias primarias. Si bien tales técnicas inducen típicamente necrosis tumoral directa en más de la mitad de los pacientes, los agentes de infusión que se usan pueden distribuirse solamente entre vasos ramificantes en el tumor, y se pueden excluir de la circulación microvascular colateral. Por lo tanto, TACE es muy eficaz para un tratamiento temporal, paliativo y localizado, pero no puede administrarse sistémicamente para tratar todas las áreas tumorales en pacientes con enfermedad metastásica. Además, TACE también puede asociarse con un síndrome de postembolización autolimitante (dolor, fiebre, y malestar general), hepatitis química, y una reacción leucemoide debido a necrosis y liberación de citocinas de hepatocitos y células tumorales embolizadas. Además, los agentes convencionales para la embolización tumoral son típicamente micropartículas poliméricas embebidas con sustancias quimioterapéuticas. Tales agentes no son susceptibles de administrarse sistémicamente debido a que sus tamaños y cargas útiles tóxicas promueven daño grave a los lechos vasculares de órganos vitales (por ejemplo, hígado, corazón, pulmones, riñones, etc.).
La vasoactividad de los HBOCs se atribuye generalmente, al menos en parte, a infiltración de hemoglobina modificada que contiene hierro en el endotelio de vasos sanguíneos, lo que da como resultado el consumo de óxido nítrico (NO). Las técnicas de tratamiento de las diversas realizaciones pueden implicar el encapsulamiento de moléculas que son capaces de unirse al óxido nítrico (“moléculas de unión a NO”), tal como mioglobina, en las cavidades acuosas de nanopartículas, por ejemplo polimerosomas. Tales moléculas encapsuladas de unión a NO pueden ser las mismas o diferentes de aquellas que también tienen una alta afinidad por la unión a oxígeno y que se explican anteriormente con respecto a la oxigenación tumoral (por ejemplo, PEM). Como se explica anteriormente, NO es un factor de señalización paracrino que promueve la vasodilatación, mientras que el agotamiento de NO da como resultado la vasoconstricción. Otras técnicas pueden implicar el encapsulamiento de moléculas que son capaces de inhibir la actividad normal de NO a través de otros mecanismos. En general, las moléculas de unión a NO y otros inhibidores de la actividad de NO pueden denominarse aquí como moléculas “inhibidoras de NO” o “que afectan el NO”. En general, las moléculas de unión a NO también se pueden unir a O2 , y por lo tanto, la expresión molécula de “unión a NO” se puede usar aquí para referirse a una molécula que se une a NO y que se une a O.
En diversas realizaciones, las moléculas encapsuladas de unión a NO pueden mediar un tumor a través de efectos de NME mediante vasoactividad local que suceden solo después de la acumulación de las nanopartículas en él. Tal acumulación puede ser debida a una permeabilidad y retención mejoradas (“EPR”) a partir de la angiogénesis tumoral activa. En general, el efecto de EPR es una propiedad que describe la tendencia de moléculas a acumularse en tejido tumoral más de lo que lo harían en tejido normal, que puede basarse en la creación de vasos anormales en la angiogénesis rápida estimulada por el crecimiento tumoral activo. Tal vasculatura anormal puede ser disfuncional, y puede denominarse aquí como vasculatura “permeable”. Además, los tejidos tumorales habitualmente carecen de drenaje linfático eficaz, lo que, junto con la vasculatura permeable, puede conducir a un transporte anormal molecular y de fluidos, es decir, el efecto de EPR.
Los resultados de NME pueden ser oclusión microvascular eventual y necrosis tumoral, pero sin ninguna vasoactividad sistémica. Como tal, las nanopartículas de las diversas realizaciones pueden tener utilidad particular para el tratamiento de la mayoría de los tumores muy vasculares, incluyendo carcinoma de células renales (RCC), carcinoma hepatocelular (HCC), glioblastoma multiforme (GBM), y mieloma múltiple (MM). Sin desear ceñirse a una teoría particular, la introducción de nanopartículas que contienen mioglobina u otra molécula de unión a NO en la circulación sistémica puede inducir selectivamente NME en tumores al retrasar selectivamente la unión de NO hasta que las partículas se hayan extravasado vía el efecto de EPR o se hayan descargado dentro de la microvasculatura tumoral. En diversos procedimientos ejemplares, las moléculas de unión a NO, tal como una mioglobina, pueden estar encapsuladas en nanopartículas, tales como polimerosomas. En algunas realizaciones, también pueden encapsularse dentro de las nanopartículas agentes formadores de imágenes y/o moléculas terapéuticas adicionales, a fin de promover una actividad complementaria contra el tumor. La molécula de unión a NO puede suministrarse a tumores vía acumulación pasiva y/o selección activa de dianas por nanopartículas. Con el suministro, la molécula de unión a NO puede inducir NME en el tejido tumoral.
Sin desear ceñirse a una teoría particular, la NME puede basarse en una variedad de características, propiedades y ajustes específicos de formulaciones de encapsulamiento de polimerosomas previamente investigadas y otros HBOCs. En comparación con la molécula de unión a NO libre, el secuestro de NO por la molécula de unión a NO encapsulada puede retrasarse significativamente en el tiempo y/o en cantidad, permitiendo así la especificidad por el tejido tumoral. Tal retraso puede basarse en propiedades físicas y/o químicas de la molécula de unión a NO (es decir, afinidad de unión por NO y/u otras moléculas, etc.) y de las nanopartículas (es decir, tamaño, tipo, membrana, etc.). Más abajo se explican diversas teorías no limitantes de estas propiedades que afectan al tiempo de secuestro de NO.
En primer lugar, el efecto de NME puede ser debido a la interacción de nanopartículas con NO. Específicamente, en algunas realizaciones, las moléculas encapsuladas en nanopartículas pueden ser portadores de oxígeno que se unen competitivamente tanto a oxígeno como a NO (por ejemplo, mioglobina). Estas moléculas encapsuladas pueden precargarse con oxígeno, y por lo tanto son incapaces de unirse a NO hasta que se libera el oxígeno. Algunos portadores de oxígeno de la realización también pueden tener afinidades particularmente altas por la unión al oxígeno, proporcionando una barrera adicional al secuestro de NO mientras están en circulación sistémica, ya que la unión a NO solo ocurre después de la desoxigenación. En algunas realizaciones, tal desoxigenación puede ocurrir solamente una vez que los portadores de oxígeno encapsulados hayan sido capaces de acumularse en el tejido tumoral.
En una realización ejemplar, el portador de oxígeno encapsulado puede ser PEM. Como se explica anteriormente, la mioglobina tiene una alta afinidad (P50 baja) por oxígeno, lo que le permite unirse a y retener oxígeno en un grado mucho mayor que la hemoglobina encontrada en glóbulos rojos naturales dentro de la circulación. El sitio molecular específico (es decir, la profirina férrica) a la que se une NO en la mioglobina está ocupado por oxígeno en condiciones fisiológicas. En tales condiciones fisiológicas, que se observan mientras que la nanopartícula está en la circulación sistémica, la mioglobina encapsulada es por lo tanto incapaz de unir cantidades significativas de NO.
En segundo lugar, el efecto de NME específico del tumor también puede ser debido al secuestro de la molécula de unión a NO del entorno debido a la incorporación en o con las nanopartículas. Por ejemplo, en realizaciones en las que las nanopartículas que encapsulan portadores de oxígeno son polimerosomas, sus membranas de polímero sintético pueden ser significativamente más gruesas que las de otras vesículas naturales, tales como liposomas. Tales membranas gruesas pueden proporcionar una barrera adicional frente a las difusiones de moléculas gaseosas polares, incluyendo NO, en las cavidades acuosas de polimerosomas hasta alcanzar el tumor hipóxico. Como se explica anteriormente, otros agentes se pueden coencapsular en la nanopartícula a fin de proporcionar actividad complementaria contra un tumor. Los ejemplos de tales agentes adicionales pueden incluir, sin limitación, agentes quimioterapéuticos o agentes biológicos adicionales que inhiben la angiogénesis (es decir, el proceso de señales moleculares generadas por el tumor que alientan el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos), potenciando así los efectos de NME.
En algunas realizaciones, las moléculas se pueden unir a la superficie de nanopartículas que incorporan las moléculas de unión a NO, lo que puede permitir el direccionamiento hacia órganos particulares o la absorción por células específicas. En algunas realizaciones, las nanopartículas son polimerosomas. En algunas realizaciones, las moléculas de superficie pueden ser mioglobina unida a la superficie, que se puede usar además de, o en lugar de, la mioglobina encapsulada.
Mecanismos de NME propuestos:
Tras su administración (por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal o intravenosa), las nanopartículas pueden acumularse en tumores debido al efecto de EPR, explicado anteriormente. Si bien las nanopartículas en circulación pueden ser incapaces de penetrar a través de uniones endoteliales fuertes de vasos sanguíneos normales, pueden extravasarse selectivamente en tejidos tumorales como resultado de la vasculatura permeable, en la que son atrapados y se acumulan, lo que puede ser ayudado por la falta de un drenaje linfático eficaz.
Puesto que la tensión de oxígeno en el equilibrio en el tumor puede ser mucho menor que la del tejido normal, el oxígeno unido a las moléculas de unión a No encapsuladas que se acumulan en el tejido tumoral se puede disociar entonces y difundir fuera de las nanopartículas. En diversas realizaciones, la disociación del oxígeno de las nanopartículas puede ocurrir cuando la presión parcial de oxígeno en el tumor cae por debajo de la presión de unión en el equilibrio (es decir, presión parcial de oxígeno requerida para saturación del 50%) de la molécula de unión a NO encapsulada. La presión de unión en el equilibrio, en diversas realizaciones, se basa en las propiedades/composición de la molécula de unión a NO específica.
La desoxigenación de la molécula de unión a NO encapsulada puede ser capaz entonces de unirla a NO que se ha difundido pasivamente en las nanopartículas, lo que puede dar como resultado la vasoconstricción debido al agotamiento de NO del endotelio vascular. Los resultados aguas abajo de tal vasoconstricción debido al agotamiento de NO endotelial pueden incluir daño a la microvasculatura tumoral, seguido de adhesión, activación y agregación plaquetarias que dan como resultado la formación de coágulos (es decir, trombosis). Finalmente, la coagulación en la microvasculatura tumoral puede conducir a hemostasia local (es decir, ralentización/detención del flujo de sangre) en el tejido tumoral circundante, creando así una presión hidrodinámica persistente en capilares tumorales. Como resultado, el coágulo recientemente formado puede romperse y provocar sangrado en el cuerpo del tumor (es decir, hemorragia). Tras la hemorragia, la trombosis total del lecho capilar tumoral puede progresar para detener todo el flujo sanguíneo hacia el tumor, incluyendo el suministro posterior de glóbulos rojos. De esta manera, el efecto de NME puede conducir a necrosis de células tumorales.
Alternativas a moléculas de unión a NO:
En diversas realizaciones, otras moléculas que afectan a la inhibición de NO pueden ser encapsuladas en las nanopartículas además de, o en lugar de, portadores de oxígeno que se unen a moléculas de unión a NO. Tales agentes pueden incluir compuestos que inhiben la producción de NO (por ejemplo, inhibidores de NO sintasa (NOS)), compuestos que capturan radicales de NO, y reactivos de unión a NO comercialmente disponibles.
NO es producido enzimáticamente por tres NOSs diferentes: NOS neuronal (nNOS) y NOS endotelial (eNOS) son enzimas constitutivas importantes para los procesos homeostáticos, tales como neurotransmisión y tono vascular, respectivamente, y NOS inducible (iNOS), que normalmente no es expresada, sino más bien es sintetizada de novo en respuesta a la inflamación. De este modo, se pueden crear nanopartículas de diversas realizaciones que encapsulan inhibidores de nNOS, inhibidores de eNOS, y/o inhibidores de iNOS. Además, puesto que las enzimas NOS fabrican NO a partir de L-arginina, los análogos competitivos de L-arginina pueden evitar que las enzimas NOS produzcan NO, y también pueden encapsularse en algunas nanopartículas de la realización. Estos análogos encapsulados pueden incluir, pero no se limitan a, NG-monometil-L-arginina (L-NMMA), Nm-nitro-L-arginina (L-NNA) y éster metílico de NG-nitroarginina (L-NAME).
Los compuestos que capturan NO se pueden encapsular y usar en las diversas formulaciones de nanopartículas de la realización. Dichos compuestos pueden incluir, pero no se limitan a, nitróxidos de nitronilo (por ejemplo, carboxi-PTIO), derivados de ditiocarbamato, un conjugado de hemoglobina derivada de ser humano modificada químicamente hemoglobina piridoxalada-polioxietileno (PHP), etc. Los compuestos que capturan NO adicionales que son específicos para radicales de NO se pueden desarrollar en el futuro para uso en las diversas realizaciones.
Además, los reactivos de unión a NO comercialmente disponibles pueden encapsularse en nanopartículas para uso en las formulaciones de nanopartículas de las diversas realizaciones. Tales reactivos pueden ser aquellos que han mostrado que inducen cierto grado de secuestro del NO para otros fines/tratamientos. Los ejemplos de tales reactivos de unión a NO pueden incluir inhibidores de NO de tipo pequeña molécula, y compuestos metabolíticos de óxido nítrico de bajo peso molecular desarrollados por Medinox, Inc., para el tratamiento de choque séptico, diabetes tipo 2, artritis y otras enfermedades inflamatorias, y anemia falciforme.
Alternativas a polimerosomas (no es parte de la invención reivindicada):
En diversas realizaciones, las formulaciones de nanopartículas distintas de polimerosomas se pueden usar en lugar de o además de polimerosomas para encapsular moléculas de unión a NO o que afectan el NO. Además, se puede usar una variedad de HBOCs acelulares comercialmente disponibles además de, o como alternativas a, desarrollar las moléculas de unión a NO encapsuladas. Estos HBOCs comercialmente disponibles pueden ser, sin limitación, productos de hemoglobina polimerizada (por ejemplo, PolyHeme™ por Northfield Laboratories Inc., EE. UU., Hemopure™ y Oxyglobin™ por Biopure, Inc., EE. UU.), productos de hemoglobina conjugada (por ejemplo, Hemospan™ por Sangart Inc., EE. UU.), que pueden tener partículas globales más grandes en base a la modificación de la superficie con polímeros inertes (por ejemplo, polietilenglicol (PEG, con un peso molecular mayor que 5 kDa)), y/o productos de hemoglobina reticulada (por ejemplo, HemoAssist™ por Baxter, Optro™ por Somatogen, etc.). Sin embargo, puesto que carecen de la capacidad para autorregular el estado oxidativo del hierro en sus grupos hemo, el hierro en los HBOCs puede convertirse libremente desde el estado ferroso al estado férrico, creando una cantidad mayor de la normal de methemoglobina.
Además, en algunas realizaciones, las micropartículas y/o nanopartículas que encapsulan portadores de oxígeno/moléculas de unión a NO o que afectan el NO pueden modificarse mediante glicoproteínas de superficie, ácidos nucleicos, o pequeñas moléculas que median el reconocimiento inmunitario. En un ejemplo, CD47, que media el sistema fagocítico mononuclear (MPS) (principalmente el hígado y el bazo) vía el acoplamiento del receptor de CD172 a, puede conjugarse sobre las superficies de las nanopartículas.
Otras diversas nanopartículas comercialmente disponibles que pueden usarse para encapsular una molécula que inhibe el NO/afecta el NO, en lugar de las formulaciones de nanopartículas explicadas anteriormente, pueden incluir, sin limitación, Abraxane® (es decir, una nanopartícula de albúmina unida a paclitaxel), Doxil® (es decir, doxorrubicina encapsulada por liposomas), y/u otras diversas nanopartículas que se han desarrollado específicamente para la terapia del cáncer.
Aplicaciones específicas para NME:
En diversas realizaciones, el uso de las moléculas que inhiben el NO/que afectan el NO encapsuladas (por ejemplo, PEM) para provocar NME puede ser especialmente eficaz para tumores muy vascularizados, tales como RCC, HCC, GBM y MM, todos los cuales son cánceres con opciones de tratamiento nada satisfactorias. En algunas realizaciones, PEM puede ser eficaz con muchos o todos los tumores sólidos, incluyendo tumores vasculares con opciones pobres de tratamiento, tales como cáncer de ovario, cáncer pulmonar no microcítico, cáncer de mama y cáncer de colon. En diversas realizaciones, el uso de moléculas que afectan el NO encapsuladas para provocar NME puede usar los constructos de PEM que se describen anteriormente con respecto a la oxigenación tumoral para aumentar la radiación y/o la quimioterapia.
La desregulación de la angiogénesis es un factor patofisiológico clave en el desarrollo de tumores muy vascularizados, tales como tumores de RCC. En particular, RCC convencional o de células claras es el subtipo histológico más común de cáncer renal, y se caracteriza por pérdida somática, como consecuencia de mutación o silenciamiento por metilación, del gen supresor de tumores de von Hippel-Lindau (VHL). Estas aberraciones de VHL conducen al aumento del factor inducible por hipoxia (HIF), un factor de transcripción que amplifica múltiples moléculas proangiogénicas, incluyendo el receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR).
Por lo tanto, los inhibidores de tirosina cinasas de VEGFR (TKIs) han surgido como tratamientos de primera línea para RCC, tales como sunitinib, pazopanib, y sorafenib. Además, los inhibidores de la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR), tales como temsirolimus y everolimus, han demostrado beneficios al incrementar la supervivencia libre de progresión tras el desarrollo de enfermedad resistente a TKI de VEGFR. Ninguna terapia de combinación ha dado como resultado mejoras adicionales, y solamente ha incrementado enormemente los efectos secundarios.
En primer lugar, la eficacia y seguridad de PEM como una nueva modalidad terapéutica para tumores muy vasculares pueden ser demostradas mostrando el uso terapéutico como un único agente en modelos murinos de RCC, y desarrollando niveles óptimos de dosis y programas de dosificación. Después, se pueden demostrar la eficacia y seguridad de PEM en la combinación sinérgica con terapias dirigidas contra VEGFR (terapia de primera línea), y/o en casos de enfermedad resistente a TKI de VEGFR (terapia de segunda línea). PEM también puede tener utilidad como un nuevo tratamiento paliativo con y sin radioterapia (XRT), mejorando los resultados (o en lugar de) de la nefrectomía paliativa. De este modo, en diversas realizaciones se pueden mostrar combinaciones eficaces de PEM con terapias contra la angiogénesis establecidas y/o XRT usando modelos murinos de RCC.
En particular, PEM puede usarse en combinaciones sinérgicas con una variedad de diferentes cánceres, clases de agentes y nombres de agentes a continuación.
Como se explica anteriormente, algunas nanopartículas de la realización también pueden usarse para coincorporar múltiples agentes dentro de una única nanopartícula. Por ejemplo, los constructos de PEM de la realización pueden cargarse con dos cualquiera o más de moléculas de unión a NO y moléculas que afectan el NO (por ejemplo, inhibidores de NOS, TKIs de VEGFR, e inhibidores de mTOR), produciendo así actividad máxima contra la angiogénesis e inhibición del crecimiento tumoral. Además, NME inducida por PEM es probablemente sinérgica con terapias contra la angiogénesis (por ejemplo, TKIs de VEGFR o inhibidores de mTOR), y puede demostrar una eficacia similar en poblaciones de pacientes sin tratamiento previo, tratadas recurrentemente, y de bajo riesgo.
Las diversas realizaciones pueden ilustrarse, pero no se limitan a, los siguientes ejemplos.
Ejemplo I
Métodos y materiales para construir dispersiones de PEM biodegradables con propiedades fisicoquímicas variables:
Para formar dispersiones de PEM biodegradables, se usa poli(óxido de etileno)-bloque-poli(e-caprolactona) (PEO-b-PCL) que posee un tamaño de bloques de PEO de ~1,5-4 kDa y con una fracción de bloques de PEO de ~10-20% en peso. Posteriormente se incorporan copolímeros de poli(óxido de etileno)-bloque-poli(g-metil e-caprolactona) (PEO-b-PMCL) y poli(óxido de etileno)-bloque-poli(trimetilcarbonato) (PEO-b-PTMC) de peso molecular, de fracción de bloques hidrófobos a hidrófilos, y de grosor de membrana-núcleo del polimerosoma resultante variables para generar constructos de PEM que no solo son biodegradables lentamente sino también deformables de forma única, permitiendo el paso a través de lechos capilares comprometidos, vía más arriba. PMCL, como derivado de PCL, es un polímero totalmente biorreabsorbible de forma similar que se degrada vía escisión no enzimática de sus enlaces de éster. Los polimerosomas compuestos de PEO-b-PTMC y/o PEO-b-PMCL se forman espontáneamente a menores temperaturas, con grandes rendimientos, y poseen membranas más deformables y viscoelásticas en comparación con los compuestos de PEO-b-PCL. También se degradan de forma similar mucho más lentamente que las vesículas formadas a partir de PEO-b-PGA, PEO-b-PLA o PEO-b-PLGA. Como tal, las dispersiones de PEM derivadas de PEO-b-PCL y de PEO-b-PMCL demuestran mayores eficiencias de encapsulamiento de Mb, diámetros promedios más pequeños de partículas, y menores niveles de generación de met-mioglobina en comparación con MBOCs celulares biodegradables reivindicados en la bibliografía.
Síntesis de dispersiones PEM:
Para sintetizar dispersiones de PEM, Mb humana purificada se puede adquirir de Sigma-Aldrich® para ser usada como material de partida. Se ha mostrado previamente que los copolímeros de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC, con un peso molecular de PEO que oscila de 1 kDa-4 kDa, dan un rendimiento estable y elevado de polimerosomas53. Por ejemplo, el PEO puede tener un peso molecular de 2 kDa, y el PMCL puede tener un peso molecular de 9,4 kDa. Variando las cantidades iniciales de polímero (de 5 mg - 20 mg por muestra), así como las concentraciones iniciales de Mb usadas en la formación del polimerosoma (de 100 mg/ml a 300 mg/ml), se generan dispersiones de PEM que difieren en el grado de encapsulamiento de Mb.
Las dispersiones de PEM se formarán usando tres metodologías diferentes: 1) “rehidratación de película delgada”, que implica la deposición de una disolución orgánica de polímero disuelto sobre una película de Teflon, secar la película en un horno de vacío toda la noche para eliminar todo el disolvente orgánico, sumergir la película delgada seca de polímero en una disolución acuosa de Mb purificada y someter subsiguientemente a ultrasonidos de alta frecuencia con calor, y, finalmente, extruir a través de una serie de membranas de tamaños de poros diferentes a fin de producir la dispersión PEM nanométrica deseada; 2) “hidratación directa”116- 117, en la que el polímero seco se mezcla con un peso igual de PEG 500 DME a una relación molar 1:1, se calienta hasta 95°C durante 30 minutos, se mezcla vigorosamente, se deja enfriar hasta la temperatura ambiente durante 20 minutos antes de la adición de la disolución de Mb, seguido después del mezclamiento vigoroso y tratamiento con ultrasonidos posterior, extrusión a través de una serie de membranas de tamaños de poros diferentes a fin de producir la dispersión de PEM nanométrica deseada, y finalmente, separación de PEG 500 al hacerlo pasar en una columna de exclusión por tamaño; y 3) hidratación directa de película delgada, en la que el polímero seco se mezcla con un peso igual de PEG 500 DME a una relación molar 1:1 antes de la deposición sobre Teflon, seguido entonces del secado de esta película durante la noche, calentando hasta 95°C durante 30 minutos, mezclando vigorosamente, permitiendo enfriar hasta la temperatura ambiente durante 20 minutos antes de la adición de la disolución de Mb, mezclando vigorosamente además y sometiendo a ultrasonidos, extruyendo a través de una serie de membranas de tamaños de poros diferentes a fin de producir la dispersión de PEM nanométrica deseada, y finalmente, separando PEG 500 al hacerlo pasar en una columna de exclusión de tamaño.
Cualquiera de estos métodos produce un rendimiento elevado de polimerosomas estables que se pueden controlar de forma eficaz a través de la extrusión de membrana para producir suspensiones unilaminares monodispersas de PEMs que varían de 100 nm - 1 pm de diámetro en tamaño promedio. Aunque la rehidratación de película delgada puede producir una distribución muy estrecha de tamaños de PEM, y un % de encapsulamiento de Mb relativamente mayor debido a mayores volúmenes de núcleo disponibles para el encapsulamiento116, la estabilidad de Mb y las dispersiones de PEM resultantes pueden ser demostrablemente menores163; estos resultados pueden ser debidos al hecho de que las temperaturas de hidratación y de ultrasonidos óptimas necesarias para generar una composición polimérica dada de polimerosomas pueden estar cerca de la temperatura de desnaturalización de Mb libre (por ejemplo, 60°C usada para generar dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL vía rehidratación de película delgada). Los polimerosomas de PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC se formarán mediante hidratación directa o hidratación directa de película delgada a temperatura ambiente (a pO2 ambiente) y producirán previsiblemente un mayor rendimiento de PEMs con una mayor eficiencia de encapsulamiento de Mb. Para estudios de formación de imágenes de NIR concomitantes, se pueden generar constructos de PEM emisores de NIR vía la coincorporación de NIRFs a base de oligo(porfirina) con polímero seco (en una relación molar de 1:40)166, antes de la exposición a la disolución acuosa de Mb. La Mb sin encapsular se puede separar de todas las dispersiones de PEM usando diálisis, ultrafiltración y/o cromatografía de exclusión por tamaño.
Ejemplo II
Caracterización de propiedades fisicoquímicas de dispersiones de PEM:
Para verificar la generación de PEMs, cada formulación de Mb/polímero se caracteriza para una distribución de tamaños de partículas usando dispersión de luz dinámica (DLS). La estructura y morfología de PEMs se visualiza directamente usando microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM). La viscosidad de las diversas dispersiones de PEM se mide usando un microviscómetro. Para medir el % de encapsulamiento de Mb, se usan dos métodos independientes. En el primer método, las dispersiones de PEM se lisan inicialmente con un detergente (por ejemplo, triton X-100), y se mide la absorbancia de UV del lisado resultante para determinar la masa de Mb y el % de encapsulamiento de Mb subsiguiente de la composición de PEM original162. Si bien este cálculo es relativamente directo, puede sobreestimar el porcentaje de encapsulamiento a través de algunas suposiciones sobre el volumen de dispersión de Mb total. Como tal, para medir la concentración de Mb no encapsulada que eluye a partir del % de encapsulamiento, se usa un fraccionador de flujo de campo asimétrico acoplado con un refractómetro interferométrico diferencial162- 176. A partir de estas medidas, se calcula posteriormente la relación en peso final de Mb:polímero en las diversas dispersiones de PEM. El % de metMb en cada una de las dispersiones de PEM se determina mediante una metodología análoga al ensayo de cianometMb bien establecido162’ 163.
Ejemplo III
Caracterización de las propiedades portadoras de oxígeno de las dispersiones de PEM biodegradables:
Las propiedades de unión a oxígeno de las dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL y PEO-b-PMCL se miden usando técnicas establecidas. Las propiedades de unión a oxígeno en el equilibrio se caracterizan a conciencia, así como la cinética de difusión del oxígeno a través de las membranas de los polimerosomas. Con la ayuda de estas medidas, se determinan las permeabilidades del oxígeno y los coeficientes de difusión de oxígeno-membrana para estas diversas dispersiones de PEM. Estos parámetros muy fundamentales son críticos para el diseño óptimo de un MBOC celular con éxito. Además, se determinan las propiedades de unión a óxido nítrico (NO) de diversas dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL y PEO-bPMCL. Se puede esperar que los MBOCs acelulares induzcan vasoconstricción, hipertensión, flujo sanguíneo reducido, y daño vascular en animales debido a su atrapamiento de NO derivado del endotelio. Sin embargo, no se espera que la Mb encapsulada en nanopartículas tales como polimerosomas, liposomas, micelas, etc., sea similarmente “vasoactiva”; análogas a las de los RBCs naturales, las membranas de liposomas y de polimerosomas deberían retrasar efectivamente la unión a NO a través del secuestro eficaz de Mb del entorno vascular circundante. Las dispersiones de PEM probablemente exhibirán más resistencias a la captura de NO debido a sus membranas más gruesas y a sus menores permeabilidades. Finalmente, se realizarán diferentes medidas en dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL y PEO-b-PMCL a fin de analizar su estabilidad e integridad en condiciones fisiológicas durante tiempos prolongados.
Experimental:
Caracterización de propiedades de unión a oxígeno:
Las propiedades de unión a oxígeno en el equilibrio, tal como P50, de las dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC se miden usando un analizador Hemox51,52. La dependencia de estas propiedades con la composición de las dispersiones de PEM se determina usando una serie de concentraciones de carga de Mb, así como añadiendo un efector alostérico tal como hexafosfato de inositol en la fase acuosa de los polimerosomas. Esto es especialmente importante a fin de determinar la idoneidad de los constructos de PEM a base de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC para suministrar oxígeno a los tejidos que experimentan oxigenación normal así como en condiciones de baja oxigenación. Los resultados de estos experimentos se compararán con respecto a los valores de P50 y de n de la disolución de Mb libre, así como con respecto a aquellos valores de Oxyglobin® (Biopure Corp., Cambridge, MA), que es la única sustancia terapéutica de oxígeno aprobada por la FDA para uso veterinario.
Además de estas medidas en el equilibrio, la cinética de la difusión de oxígeno a través de membranas de PEM, y la unión a/liberación de Mb para diferentes dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC, se determinan usando un microelectrodo de oxígeno muy sensible. Las medidas de diversas PEMs se comparan con aquellas de Mb libre y dispersiones de polimerosomas vacíos (sin Mb), a fin de delinear los papeles de difusión y unión en la absorción de O2. Los resultados de estos experimentos se analizan con la ayuda de un modelo de transporte de reacción de difusión para determinar la permeabilidad al oxígeno de diferentes membranas de polimerosomas; se espera una correlación entre propiedades difusivas de diversas membranas de copolímeros de dibloques y las propiedades de unión a oxígeno medidas de las formulaciones de PEM.
Caracterización de propiedades de unión a NO:
La unión a NO de dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC, en condiciones oxigenadas y desoxigenadas, se estudia sistemáticamente usando espectroscopía de flujo parado177, 178. El transcurso de tiempo de la unión se mide realizando barridos de absorbancia rápidos de las diversas dispersiones de PEM oxigenadas o desoxigenadas mezcladas rápidamente con disolución que contiene NO. Se espera que un intervalo de concentraciones de carga de Mb, concentraciones de dispersión de PEM, y tamaños de PEMs alteren los resultados de estos experimentos. De forma similar, los papeles de la difusión de NO y la unión en la absorción de NO por constructos de PEM a base de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC se caracterizan adicionalmente llevando a cabo experimentos que comparan PEM, Mb libre, y polimerosomas vacíos, usando un microelectrodo de NO. A través de estos estudios completos, se establecen las constantes de velocidad de unión a NO para dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC en diferentes condiciones, y se comparan con los resultados para Mb libre en disolución, Mb encapsulada en liposomas (LEM), y Oxyglobin®.
Caracterización de la estabilidad e integridad de dispersiones de PEM:
Para estudiar la estabilidad de diversas dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC, se almacenan en disolución salina y en plasma sanguíneo a 4°C y a 37°C durante varios días; los cambios en la morfología y distribución de tamaños de PEMs se evalúan usando crio-TEM y DLS, respectivamente. De forma similar, usando técnicas descritas aquí, se estudian los cambios in situ en la concentración de Mb, en el nivel de metMb, la absorción de NO, y la liberación de Mb a partir de PEMs biodegradables en diversas condiciones de disolución (por ejemplo, temperatura, pH, pO2 , y pNO) y a diversos puntos de tiempo. Estos estudios usan espectroscopía de absorción electrónica y cálculos de concentración basados en coeficientes de extinción conocidos para Mb metilada, unida a NO, y oxigenada179-188.
Medida de la tensión de lisis crítica, deformación de área crítica, usando aspiración por micropipeta:
La aspiración por micropipeta de polimerosomas que encapsulan Mb sigue procedimientos análogos a los descritos en referencias previas. De forma breve, las micropipetas hechas de tubo de vidrio de borosilicato (Friedrich y Dimmock, Milville, NJ) se preparan usando un extractor de aguja/pipeta (modelo 730, David Kopf Instruments, Tujunga, CA) y se microforjan usando una perla de vidrio para dar a la punta un borde liso y plano. Los diámetros internos de las micropipetas oscilan de 1 um a 6 um, y se miden usando software de formación de imágenes por ordenador. Las pipetas se usan para recoger los polímerosomas cargados con Mb y sin cargar, y para aplicar tensión a sus membranas. Las micropipetas se llenan con una disolución de PBS y se conectan a una estación de aspiración montada en el lado de un microscopio invertido Zeiss, equipado con un manómetro, un transductor de presión Validyne (modelos DP 15-32 y DP 103-14, Validyne Engineering Corp., Northridge, CA), lecturas de presión digitales, micromanipuladores (modelo WR-6, Narishige, Tokio, Japón), y milimanipuladores MellesGriot (control de ruta x, y, z). Se aplica presión de succión mediante una jeringa conectada al manómetro. Los experimentos se llevan a cabo en disoluciones de PBS que tienen osmolalidades de 310-320 mOsm, a fin de hacer flácidos a los polimerosomas (la disolución de vesícula interna era típicamente sacarosa de 290-300 mOsm). Las osmolalidades de las disoluciones se miden usando un osmómetro. Puesto que la sacarosa y la PBS tienen diferentes densidades e índices de refracción, los polimerosomas se depositan en disolución y son fácilmente visibles en instrumentos ópticos de contraste de fase o DIC.
Ejemplo IV
Desarrollo de dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC que son capaces de almacenamiento en seco, rehidratación en el punto de atención, y suministro in vivo:
Síntesis de polímeros:
Los copolímeros de dibloques modificados con acrilato (por ejemplo, un polímero a base de PEO-b-PCL modificado con acrilo, denominado PEO-b-PCL-acrilo) se sintetizan según procedimientos estándar usando octoato estannoso como catalizador. Por ejemplo, se encuentra que PEO-b-PCL-acrilo tiene un peso molecular medio numérico de 14 kDa (12 y 2 kDa para los bloques de PCL y de PEO, respectivamente). Estos se determinan calibrando los picos de RMN al grupo metoxi terminal en el PEO a aproximadamente 3,4 ppm. La polidispersidad del polímero es < 1,5. La acrilación del término OH del bloque de PCL no conduce a un cambio significativo en el tamaño o distribución del polímero tras la segunda purificación. Se ha encontrado que la eficiencia de la acrilación es 99%.
Formación de dispersiones de PEM:
Para sintetizar dispersiones de PEM compuestas de polímeros modificados con acrilo (por ejemplo, dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL-acrilo), se usa Mb humana pura como material de partida. Mb humana pura se puede adquirir de Sigma-Aldrich®. El polímero de PEO(2k)-b-PCL(12k)-acrilo y la 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (Dm PA) se secan en Teflon® áspero mediante disolución en cloruro de metileno a una relación molar de 1:1, deposición sobre Teflon®, y evaporación del disolvente orgánico. Variando la cantidad de polímero modificado con acrilo (por ejemplo, polímero PEO(2k)-b-PCL(12k)-acrilo, de 5 mg - 20 mg por muestra), así como las concentraciones iniciales de Mb acuosa usadas en la formación de los polimerosomas (de 100 mg/ml a 300 mg/ml), se generan dispersiones de PEM que compartimentalizan DMPA en sus membranas, y que difieren en el grado de encapsulamiento de Mb acuosa. Las dispersiones de PEM se forman usando tres metodologías bien establecidas: 1) rehidratación de película delgada, 2) hidratación directa, y 3) hidratación directa de película delgada (véase el Ejemplo I). Cada uno de estos métodos produce un alto rendimiento de polimerosomas estables que se puede controlar eficazmente a través de extrusión de membrana para producir suspensiones monodispersas unilaminares de PEMs que varían de 100 nm - 1 pm de diámetro en tamaño promedio. Aunque la rehidratación de película delgada puede producir una distribución muy estrecha de tamaños de PEMs, y posiblemente un mayor % de encapsulamiento de Mb debido a mayores volúmenes de núcleo disponibles para el encapsulamiento116, la estabilidad de Mb y las dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL resultantes pueden ser demostrablemente bajas163; estos resultados pueden ser debidos al hecho de que la temperatura de hidratación para PEO-b-PCL está próxima a la temperatura de desnaturalización de Mb libre. Los polimerosomas de PEO-b-PMCL y de PEO-b-PTMC se forman mediante hidratación directa o hidratación directa de película delgada a temperatura ambiente (a pO2 ambiente), y permiten previsiblemente un mayor rendimiento de PEMs con una mayor eficiencia de encapsulamiento de Mb. Para estudios de formación de imágenes mediante NIR concomitantes, se generan constructos de PEM emisores de NIR vía la coincorporación de NIRFs a base de oligo(porfirina) con polímero seco (a una relación en moles de 1:40)166, antes de la exposición a la disolución de Mb acuosa. La Mb sin encapsular se separa de todas las dispersiones de PEM usando diálisis, ultrafiltración, o cromatografía de exclusión por tamaño.
Estabilización de membranas de PEMs tras la formación:
Una vez ensamblados, los polimerosomas modificados con acrilo que comprenden las membranas de las dispersiones de PEM (por ejemplo, PEO-b-PCL-acrilo) pueden reticularse mediante exposición a luz UV que induce una polimerización radicálica de los grupos acrilo vía activación del fotoiniciador DMPA incorporado en las membranas de los polimerosomas. Este enfoque no impide la hidrólisis del bloque biodegradable (por ejemplo, la cadena de PCL de PEO-b-PCL-acrilo) y produce monómeros degradados (por ejemplo, unidades de oligo-caprolactona), PEO, y cadenas cinéticas de poli(ácido acrílico) como los productos de degradación. Mb está protegida de la degradación fotoinducida de la formación de metMb por el coencapsulamiento de NAC o azul de metileno con Mb dentro del núcleo acuoso de los polimerosomas. La polimerización de las membranas de las vesículas transcurre mediante exposición de los polímeros modificados con acrilo que incorporan DMPA (por ejemplo PEO-b-PCL-acrilo), que componen las dispersiones de PEM, usando luz UV generada a partir de una lámpara de curado de punto OmniCure Serie 1000 con una lente colimadora (Exfo, Ontario, Canadá; 365 nm, 55 mW/cm2) durante 10-30 min.
Liofilización y almacenamiento en fase seca:
La liofilización transcurre secando por congelación las dispersiones de PEM modificadas con acrilo (por ejemplo, PEM de PEO-b-PCL-acrilo) tras la exposición a luz UV mediante colocación en nitrógeno líquido hasta que cesa el burbujeo. Las dispersiones de PEM congeladas se colocan entonces en un liofilizador de laboratorio (FreeZone 4.5 L Benchtop Freeze Dry System, Labconco, Kansas City, MO; Modelo 77500) durante 24 h hasta que las muestras estén secas. Las dispersiones de PEM secas, colapsadas, se almacenan entonces en un desecador bajo gas argón, y se colocan a 4°C.
Hidratación en el punto de atención:
Las dispersiones de PEM modificadas con acrilo secas se extraen del desecador y se colocan en un vial. Se añade nuevamente a las muestras el mismo volumen original de disolución acuosa, para hidratar las vesículas. La rehidratación de los polimerosomas se aumenta adicionalmente sometiendo a un ligero vórtice durante 10 minutos para lograr la resuspensión total de las vesículas. Los polimerosomas intactos se verifican mediante DLS, que muestra una agregación mínima de las vesículas y ninguna destrucción en micelas. La retención de Mb se verifica haciendo pasar la dispersión de PEM a lo largo de una columna de exclusión por tamaño acuosa, y tomando alícuotas de las bandas que pasan, para el análisis de UV-vis. Solamente las bandas que corresponden a los polimerosomas, como se verifica adicionalmente mediante DLS de las alícuotas de elución, contienen Mb, según se evalúa mediante espectroscopía de UV-vis. La estabilidad de la Mb retenida se verifica adicionalmente mediante los espectros de UV-vis, que no muestran bandas que corresponden a la generación de metMb o ningún producto adicional de la ruptura de Mb.
Desarrollo de dispersiones de PEM a base de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL y PEO-b-PTMC dirigidas molecularmente:
Mediante métodos de conjugación química bien establecidos, las superficies de los polimerosomas se modifican con diversos ligandos biológicos para impartir adhesión biológica de multiavidez específica. Se puede adoptar una metodología similar para generar dispersiones de PEM encapsuladas en polimerosomas dirigidas molecular y celularmente que son capaces de promover, entre otros, la cicatrización de heridas y una eficacia mejorada de la radioterapia a tejidos hipóxicos. Los ligandos biológicos se conjugan a estas nanopartículas vía reacciones en fase acuosa mediadas por carbodiimida-polivinilsulfona. El grado de recubrimiento de la superficie de polimerosomas con el ligando se varía sistemáticamente (de 1% a > 10% del área superficial total de los polimerosomas) usando ligandos de diferentes concentraciones y dispersiones de PEM que se sintetizan a partir de mezclas que contienen diferentes relaciones de polímeros funcionalizados a no funcionalizados. Tras verificar la conjugación peptídica a las superficies de los polimerosomas, la unión cinética de las formulaciones de PEM resultantes a dianas/receptores moleculares recombinantes se caracteriza vía medidas de resonancia de plasmones de superficie (Biacore SPR); las curvas dependientes de la dosis se analizan de manera similar a lo descrito para el ligando biológico libre. Estos estudios revelan parámetros cinéticos de la interacción entre dispersiones de PEM y las dianas moleculares (constante de asociación, kon, y constante de disociación, koff) y el cambio en la afinidad de los ligandos (constante de disociación, K) según se ve afectada por su conjugación a los polimerosomas.
Experimental:
Para funcionalizar el extremo de PEO de los polímeros biodegradables (por ejemplo copolímeros de dibloques de PEO-b-PCL) con grupos carboxilo, y para verificar las reacciones mediante espectroscopía de RMN 1H, se usan procedimientos de modificación química establecidos. Se crean dispersiones de PEM y se purifican a partir de diversas combinaciones de copolímeros funcionalizados y no funcionalizados usando métodos de separación estándar para producir suspensiones monodispersas de vesículas unilaminares que son estables durante varios meses. Las distribuciones de tamaños de PEM se determinan mediante dispersión de luz dinámica (DLS). La identidad y pureza de los ligandos se confirma mediante cromatografía de líquidos de altas prestaciones de fase inversa y mediante espectrometría de masas MALDI. La conjugación de los ligandos a los grupos de PEO terminados en carboxilo, en la superficie de los polimerosomas, se realiza en una reacción acuosa mediada por 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) y Nhidroxisuccinimida (NHS). El grado de conjugación del ligando se determina usando un ensayo de micro-BCA. Las dispersiones de PEM seleccionadas resultantes se fotografían ampliamente mediante microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM) para verificar su estabilidad tras la conjugación de los ligandos. Sus distribuciones de tamaños se miden nuevamente mediante DLS. El grado de conjugación de los ligandos se verifica usando citometría de flujo. Las medidas de SPR se llevan a cabo en instrumentos biosensores Biacore X y Biacore 2000 (Biacore AG, Uppsala, Suecia) a 25°C. Las dianas de ligandos recombinantes purificadas recombinantes (por ejemplo, receptores de proteínas) se adquieren comercialmente, y se inmovilizan mediante unión al hidrogel de dextrano en la superficie del sensor. Los constructos de PEM seleccionados como dianas se inyectan en diversas concentraciones, y su unión se monitoriza en tiempo real. Las constantes cinéticas de velocidad (kon y koff) y la constante de unión en el equilibrio (KD) para la unión receptor/PEM se estiman a partir de análisis cinéticos de los sensogramas. Como controles, se usan PEMs sin ligandos seleccionadores de dianas, o PEMs conjugadas a ligandos irrelevantes.
También se pueden emplear químicas alternativas de conjugación de ligandos. Por ejemplo, son posibles reacciones de fase orgánica en las que el polímero de dibloques se funcionaliza químicamente y se conjuga con ligandos selectos (pequeñas moléculas, péptidos que tienen solubilidad en fase orgánica) antes de formar las dispersiones de PEM; estos métodos de acoplamiento orgánico aseguran que el extremo de PEO se conjuga con el ligando antes de que se exponga a la disolución acuosa, en la que puede perder muchos de sus grupos reactivos de superficie modificados, vía hidrólisis de competición. También, como un método alternativo para variar el grado de conjugación de la superficie al ligando, se crean dispersiones de PEM compuestas de copolímeros de PEO-b-PCL que varian con respecto a los tamaños de los bloques de PEO y de PCL. Este enfoque controla la cinética de la conjugación de los ligandos a las superficies de los polimerosomas, así como también el grado de recubrimiento de la superficie por el ligando para una formulación de PEM dada. Es posible que las formulaciones de PEM seleccionadas se unan a la superficie del sensor de una manera no específica durante las medidas de SPR, afectando de ese modo a su regeneración y a su relación de señal a fondo. Si no se puede realizar una medida fiable, las características de unión de PEM conjugada a ligando también se estudian usando ELISA o calorimetría de valoración isotérmica, que son otras técnicas establecidas para estudiar la unión de nanopartículas.
Modulación de la oxigenación tumoral in vivo mediante PEM:
Las dispersiones de PEM formadas a partir de PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL, PEO-b-PTMC y/o versiones modificadas con acrilo de estos polímeros se evalúan para determinar sus capacidades para alterar la oxigenación tumoral in vivo con la inyección en la vena de la cola en ratones que portan tumores xenotrasplantados. También se analizan los efectos codependientes del tamaño de partículas, la deformabilidad y la concentración sobre el suministro eficaz de Mb, y la oxigenación tumoral resultante. Para evaluar la eficacia de un constructo de PEM dado para alterar las tensiones de oxígeno tumoral medias y mínimas (pO2), se usa un sistema de formación de imágenes óptico hiperespectral, que puede analizar espacialmente el transporte de O2 cinético en tiempo real151- 154156158. Si bien las pO2s medias se han estudiado previamente y se han medido fácilmente mediante otras técnicas, las pO2s tumorales mínimas distribuidas espacialmente son quizás las más responsables de llevar a cabo la tumorigénesis y proporcionar a las células madre cancerosas el nicho que ayuda a los tumores a escapar del tratamiento eficaz151' 154 155189. Un sistema de formación de imágenes óptico hiperespectral permite el cartografiado espacial de las pO2s cinéticas, en tiempo real, y se usa para visualizar y cuantificar el grado de modulación de PEM de áreas de baja pO2 tumoral. Además, el calentamiento localizado suave de los tumores aumenta los tamaños de los poros de los vasos en tumores sólidos durante hasta varias horas, ayudando a la extravasación de las nanopartículas190, 191. Como tal, la hipertermia tumoral localizada es además capaz de incrementar el suministro de O2 por las PEMs. Finalmente, la mioglobinuria relacionada con PEMs, y sus efectos sobre el aclaramiento de creatinina (CCr), se monitoriza para evaluar nefrotoxicidad aguda tras el tratamiento.
Enjaulado de animales, manipulación, e inyecciones de PEM:
Los ratones se adquirieron y enjaularon en instalaciones apropiadas para animales. Se implantaron quirúrgicamente en cada animal cámaras de ventana de pliegue cutáneo dorsal aproximadamente 1 semana antes del tratamiento. Durante el procedimiento quirúrgico, se inyectaron 10.000 células de carcinoma mamario 4T1 en el dorso o flanco del ratón. Estas células se manipulan para expresar constitutivamente RFP, con expresión de GFP inducida en respuesta a la actividad de HIF-1192. Los tumores se dejan crecer durante aproximadamente 1 semana, momento en el cual son suficientemente grandes para ser hipóxicos y tener actividad de HIF-1158. Se preparan 100 pl de suspensiones de PEM como se describe anteriormente, y se inyectan vía la vena de la cola a t = 0 y t = 24 h. Estos parámetros experimentales permiten la evaluación de los efectos de las PEMs que se han acumulado en el espacio perivascular, que se espera que alcancen un máximo a aproximadamente 24 h. Para estudios de hipertermia, se usa una unidad de alojamiento especial, para variar la cámara de ventana/temperatura del tumor190, 191.
Visualización y cuantificación de la modulación de oxígeno tumoral cinético mediante PEM:
En los puntos de tiempo especificados anteriormente, la formación de imágenes hiperespectrales se usa para evaluar los efectos de los diversos constructos de PEM sobre la modificación de la pO2 tumoral. Las temperaturas se ajustan entre 34 - 422C190- 191. La formación de imágenes hiperespectrales de la absorción de Mb se usa para cuantificar la saturación de O2 de Mb158, mientras que la evaluación radiométrica de la fluorescencia y fosforescencia de nanopartículas de boro se usa para cuantificar la pO2 tumoral absoluta153. La actividad de HIF-1 también se evalúa midiendo la emisión de GFP. Esto permite la cuantificación de la oxigenación tanto vascular como tisular, así como la presencia del fenotipo hipóxico tumoral, de forma independiente y simultánea.
Ejemplo V
Como se discutió anteriormente, diversas nanopartículas de la realización que exhiben altas concentraciones de portadores de oxígeno biológicamente activos pueden acumularse en los tumores cuando se inyectan en la circulación de un modelo animal de cáncer de mama humano. Dentro de los tumores de estos animales, las nanopartículas pueden dar como resultado un cierre generalizado del flujo vascular, hemorragia y necrosis de las células cancerosas, pero sin efectos secundarios tóxicos obvios para el tejido normal.
Las siguientes prácticas generales pueden usarse para modelos murinos en las realizaciones de ejemplos específicos discutidas a continuación.
Anestesia durante la administración terapéutica:
La anestesia se puede realizar usando isofluorano (1,5-2,5%, a través del cono de la nariz) para obtener imágenes. La ketamina/xilazina (100/10 mg/kg, i.p.) puede usarse para procedimientos quirúrgicos. Se puede monitorizar a los animales para determinar la profundidad adecuada de la anestesia mediante la respuesta de pellizco de los dedos y la frecuencia respiratoria. También se pueden mantener a una temperatura corporal adecuada usando una almohadilla térmica de agua circulante. Se puede colocar ungüento hidratante en sus ojos.
Inyección de animales con PEM:
La PEM y los polimerosomas vacíos (es decir, un control negativo) pueden prepararse en condiciones de buenas prácticas de laboratorio (GLP) estériles en NaCl USP al 0,9%. La viscosidad, el pH y la osmolalidad de cada inyectado pueden medirse y verificarse que están dentro del intervalo fisiológico estándar de la sangre (por ejemplo, 4-5 kPa, pH 7,4, 290 mOsm). Debido a la aplicación clínica esperada del compuesto a la NME específica del tumor inducido después de la acumulación, y a las preocupaciones por la potencial vasoactividad sistémica a dosis más altas, se puede usar inyección intravenosa lenta (IV) en el transcurso de 5-10 min. Se puede usar preferentemente una aguja de mariposa, pero se puede colocar una cánula intravenosa en una vena superficial (corto plazo) o colocarla quirúrgicamente algún tiempo antes del uso (más a largo plazo o inyecciones múltiples, por ejemplo para la aplicación semanal de tres ciclos). La infusión inicial puede intentarse en volúmenes de 10 ml/kg y a una velocidad de 1 ml/kg/min; pero estos pueden incrementarse, a la espera de concentraciones exactas de PEM. Se puede establecer un volumen máximo de 20 ml/kg, infundido a 5 ml/kg/min, para evitar angustia significativa o desarrollo de lesiones pulmonares.
Extracciones de sangre:
Las extracciones frecuentes de sangre pueden ser necesarias para estudios toxicocinéticos de animales tratados con diversas dosis y programas de PEM (según las evaluaciones de toxicidad a continuación). Se pueden usar preferentemente extracciones de sangre de la vena del tarso lateral (safena), ya que permiten la eliminación del 7,5% del volumen de sangre circulante sin la necesidad de anestesia. Para estudios con ratones, esto puede suponer una extracción de sangre de 0,1 ml (el volumen sanguíneo total de un ratón de 25 g es 1,8 ml). La vena safena se encuentra en la cara lateral de la articulación del tarso, y puede ubicarse fácilmente después de afeitarse el pelaje y limpiar el área con alcohol. El animal puede colocarse en un dispositivo de sujeción adecuado, tal como un tubo de plástico, y el operario puede extender la pata trasera. La vena puede elevarse mediante una presión suave sobre la articulación, y el vaso se perfora usando la aguja de calibre más pequeño que permite la extracción de sangre suficientemente rápida sin hemólisis (por ejemplo, calibre 25-27 para ratones). Para volúmenes pequeños, un simple pinchazo conduce a una gota de sangre que se forma inmediatamente en el sitio de la punción, y se puede usar un tubo de microhematocrito para recoger un volumen estándar. Una vez que se ha recogido la sangre, la presión sobre el sitio puede ser suficiente para detener la hemorragia adicional. La eliminación de la costra puede permitir la toma de muestras en serie. Para las extracciones de sangre que ocurren con una frecuencia no mayor a la semanal, el volumen máximo retirado por extracción puede establecerse en 10% del volumen circulatorio (0,2 ml en ratones). Para las extracciones de sangre que ocurren con menos frecuencia que cada 3 semanas, el volumen máximo retirado por extracción puede establecerse en 20% del volumen circulatorio (0,4 ml en ratón). Para las extracciones de sangre terminal en el sacrificio, se puede emplear punción cardíaca bajo anestesia general.
Evaluaciones de toxicidad:
Los parámetros cinéticos y los puntos finales que pueden evaluarse incluyen signos clínicos (cada hora durante las primeras 6 h, luego cada 12 horas durante 3 días, y luego semanalmente), pesos y cambios corporales (2-3 veces por semana), consumo de alimentos (2-3 veces por semana), batería de observación funcional abreviada (2-3 veces por semana), evaluaciones oftalmológicas (2-3 veces por semana), perfiles serológicos (hematología, coagulación, química clínica, y análisis de orina realizados (semanalmente), parámetros toxicocinéticos (cada hora durante las primeras 6 h, luego cada 12 horas durante 3 días, y luego semanalmente), hallazgos de necropsia macroscópica (al sacrificio después de completar el tercer ciclo), pesas de órganos (al sacrificio) y exámenes histopatológicos (al sacrificio).
Cirugía de cámara de ventana:
Los animales pueden anestesiarse con 100/10 mg/kg de ketamina/xilazina. Puede usarse disolución de exidina para desinfectar la piel del animal y lavarla con etanol al 70%. En un campo estéril, la piel dorsal del animal se puede suturar a un marco en C de metal, y entonces se puede insertar quirúrgicamente y suturar en el lugar un marco de metal de titanio. Se puede extirpar una sección circular de 12 mm de la piel. Entonces se pueden inyectar en la parte posterior ahora visible de la piel subyacente alrededor de 10.000 células RCC, suspendidas en 20 microlitros de disolución salina amortiguada con fosfato (PBS). A continuación, se puede insertar una ventana de vidrio de cubierta y mantenerla en el lugar con un anillo de metal con resorte. Posteriormente, se puede retirar el marco en C, y se puede permitir que el animal se recupere de la anestesia. La temperatura puede mantenerse durante todo el procedimiento usando una almohadilla de cera calentada. Se puede inyectar buprenorfina por vía subcutánea inmediatamente después de la cirugía, y luego a las 8-12 horas después de la cirugía, según sea necesario para el alivio del dolor.
Formación de imágenes de NME:
Un animal con un sistema de captura activo puede anestesiarse con isofluorano (1,5-2,5% a través del cono de la nariz) y colocarse en la platina de formación de imágenes. Se puede aplicar tópicamente una suspensión de bacitracina/neomicina/polimixina B (BNP), y se pueden tomar imágenes de la saturación de hemoglobina y la fluorescencia de la proteína fluorescente verde (GFP) (HIF-1) hasta 30 minutos para establecer los niveles de oxigenación de referencia. La formación de imágenes se puede realizar usando un microscopio de fluorescencia (por ejemplo, un Zeiss). Se puede imponer un tratamiento de hipertermia de 42 grados Celsius durante 1 hora, después de lo cual se puede inyectar una suspensión de PEM en la vena de la cola del animal (por ejemplo, 100 pl). La formación de imágenes puede continuarse durante 1 hora, y pueden llevarse a cabo sesiones de seguimiento de la formación de imágenes a las 24 y 48 horas después del tratamiento, con una segunda dosis de PEM administrada a las 24 horas. El tiempo total de la formación de imágenes y de tratamiento para cada punto de tiempo puede ser inferior a 2 horas.
Administración de sunitinib:
Se puede adquirir sal de malato de sunitinib (un TKI de VEGFR) (por ejemplo, de LC Laboratories (Japón), 99% de USP). La formulación oral puede prepararse mediante concentraciones cuatro veces mayores (por ejemplo, 3,2 mg para un ratón de 20 g) en una disolución de Cremephor EL/etanol (50:50). Este lote de concentración cuádruple se puede preparar reciente diariamente. Las disoluciones finales de dosificación pueden generarse el día del uso mediante dilución hasta concentración normal con agua destilada libre de endotoxinas y mezclarse mediante agitación vorticial inmediatamente antes de la dosificación a 40 mg/kg al día (0,8 mg para un ratón de 20 g) mediante administración oral.
Monitorización del crecimiento tumoral mediante formación de imágenes de luciferasa:
Células 786-O, que se han manipulado para expresar de forma constitutiva luciferasa, se pueden usar para generar animales portadores de tumores de RCC ortotópicamente xenoinjertados. La formación de imágenes de luciferasa se puede usar para monitorizar el tamaño del tumor y rastrear las metástasis. La intensidad de la luciferasa tumoral y los pesos corporales se pueden registrar dos o tres veces por semana a partir del primer día de tratamiento. El volumen tumoral puede determinarse mediante una curva de calibración preliminar para relacionar la radiancia total de la luciferasa con el volumen tumoral, en el que se pueden tomar imágenes de los animales y luego sacrificarlos directamente para medir el volumen tumoral.
Establecimiento de enfermedad resistente a TKI de VEGFR:
Pueden generarse animales portadores de tumores de RCC ortotópicamente xenoinjertados, y se pueden someter a tratamiento diario con PO Sunitinib (40 mg/kg por día), que puede iniciarse cuando los tumores alcanzan 100 mm3 y que puede continuarse hasta que crecen 1,5 veces su tamaño inicial. Entonces, puede tener lugar la administración terapéutica adicional con PEM con y/o sin temsirolimus, o con nanopartículas de control.
Toxicidad potencial, dosis, y medidas cinéticas de formulaciones de PEM
En diversos estudios de la realización, se puede realizar un panel completo de química del suero e histología hepática de ratones inyectados con PEM frente a controles (es decir, polimerosomas solos o mioglobina sola). También se puede identificar la dosis eficaz mínima (MED) de PEM necesaria para inducir NME de RCC. Para estudios terapéuticos adicionales, su dosis máxima para una administración segura puede establecerse como la STD10 (la dosis severamente tóxica en 10% de los animales) o la MTD75 (la dosis máxima tolerada que da como resultado una pérdida de peso inferior a 15-20% en 75% de animales), si no se descubren toxicidades limitantes de la dosis (DLT).
Desarrollo de constructos de PEM:
En diversas realizaciones, se pueden desarrollar constructos de PEM que tienen una eficiencia de encapsulamiento de mioglobina superior a 50%, una relación en peso de mioglobina encapsulada a polímero superior a 5% en peso, un nivel de metmioglobina en disolución que era inferior a 5% de la mioglobina total, una viscosidad de la suspensión entre 3-4 cP, una P50 similar a la mioglobina libre, y una constante de velocidad de unión a NO de un orden de magnitud menor que la medida para mioglobina libre. Tales constructos de PEM pueden desarrollarse usando copolímeros biocompatibles de poli(óxido de etileno)-bloque-poli(butadieno) (PEO-b-PBD). Además, tales constructos de PEM pueden desarrollarse usando cualquiera de varios copolímeros biodegradables. El encapsulamiento de la mioglobina se puede lograr usando métodos que incluyen la rehidratación de película delgada, la rehidratación directa de película delgada, la electroporación, y la rehidratación directa.
En particular, se puede emplear un método de hidratación directa modificado para maximizar la carga de mioglobina y la eficiencia de encapsulamiento de mioglobina. Varias variables, incluyendo la temperatura, velocidad de mezclamiento, potencia/tiempo de sonicación, y reducción de mioglobina, se pueden cambiar para optimizar la carga de mioglobina en las formulaciones de PEM. Las FIGs. 11 y 12 ilustran etapas para la generación y la medida de formulaciones de PEM según algunas realizaciones. Como se muestra en la FIG. 11, se pueden calentar cantidades equivalentes de OB18 y polímero PEG (Mw = 500 Da, “PEG500”) durante 1 hora a 95°C, seguido del mezclamiento a conciencia y del enfriamiento de la muestra hasta temperatura ambiente (RT). Se pueden añadir 10 mg de disolución de mioglobina reducida (150 mg/ml de metmioglobina (metMb) en PBS 10 mM a pH 7,4), y se pueden reducir por adición de 1% en peso de ditionito de sodio. La mezcla puede agitarse y sonicarse durante 0,5 horas a temperatura ambiente, y la suspensión de polímero puede diluirse adicionalmente por adición de alícuotas tituladas (10, 20, 50, y finalmente 100 nl) de la disolución de Mb reducida con sonicación a conciencia después de cada etapa de dilución. La muestra puede someterse a diálisis adicional frente a amortiguador de PBS estéril a 4°C, y a caracterización de las formulaciones de PEM resultantes mediante dispersión dinámica de luz (DLS) para determinar el tamaño. La muestra puede someterse a microscopía electrónica de transmisión criogénica (crio-TEM) para verificar la morfología.
Como se muestra en el conjunto de gráficos en la FIG. 12, la muestra puede someterse adicionalmente a espectrometría UV-vis para calcular las concentraciones finales de Mb y los porcentajes en peso de Mb a polímero (% en peso de Mb/polímero) en los constructos finales de PEM. Las concentraciones de muestra de Mb funcional pueden verificarse independientemente midiendo el contenido de hierro en las suspensiones de PEM, usando espectroscopía de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES), que se correlaciona bien con los datos de UV-Vis (% en peso de Mb/polímero = 6% por UV-Vis y 8% por ICP-OES). Los tamaños de partículas pueden ajustarse entre 100 y 200 nm de diámetro mediante la selección de la composición del polímero y el peso molecular.
Dado que las superficies externas e internas de los polimerosomas están compuestas de polímeros hidrófilos (PEG), la mioglobina puede encapsularse dentro de las cavidades acuosas y unirse a las superficies de los polimerosomas. Para obtener PEM pura, la mioglobina asociada a la superficie puede eliminarse mediante proteólisis usando pronasa (es decir, una mezcla de diversas proteinasas aisladas de Streptomyces griseus que digiere las proteínas en aminoácidos individuales). Dado que la pronasa no puede atravesar la membrana de la bicapa del polimerosoma, se puede usar para digerir toda la mioglobina asociada a la superficie mientras deja sin afectar la Mb encapsulada. En resumen, se puede añadir una disolución de pronasa a muestras de PEM para obtener una concentración final de enzima de 4% en peso. La disolución puede mezclarse adicionalmente durante al menos 2 h a RT, puede centrifugarse, y dializarse para eliminar la enzima. La Mb retenida en suspensiones de PEM se cuantificó posteriormente y se encontró que estaba entre 3% en peso (por UV-Vis) y 5% en peso de Mb/polímero (por ICP-OES).
La hidratación directa también se puede usar para obtener composiciones pequeñas de PEM (es decir, alrededor de 100-150 nm de diámetro) generadas a partir de copolímeros biodegradables de PEO-b-poli(caprolactona) (PEO-b-PCL) y PEO-b-poli(PCL/carbonato de trimetileno) (PEO-b-PTMC). El % en peso de mioglobina/polímero, así como las eficiencias de encapsulamiento de mioglobina, pueden ser similares en formulaciones de PEM tanto biocompatibles como biodegradables.
El hierro en la mioglobina se oxida a Fe3+ cuando se expone a condiciones atmosféricas. De este modo, se pueden usar diversos agentes para la reducción química de met-mioglobina a fin de permitir la unión O2/NO, tal como ditionito de sodio (Na2S2O4). El uso de mioglobina reducida puede dar como resultado una generación más eficiente y mayores rendimientos de PEM que los que se pueden lograr al usar met-mioglobina. Mientras que la met-mioglobina puede reducirse a oximioglobina (con 1% en peso de Na2S2O4) antes de la generación de PEM, la mayoría de las PEM se pueden volver a oxidar a met-mioglobina después del almacenamiento a largo plazo. Por lo tanto, la PEM puede reducirse nuevamente a oximioglobina antes de la infusión inmediata. En diversas realizaciones, tal nueva reducción se puede realizar mediante un procedimiento que consiste en utilizar ultrasonidos en cantidades diluidas de Na2S2O4, seguido de diálisis, en el que se pueden examinar y optimizar los efectos del poder de los ultrasonidos y el tiempo. Para evitar una oxidación posterior, para estudios en animales se puede usar inmediatamente PEM reducida.
Unión de gases en el equilibrio:
Las curvas de unión en el equilibrio a oxígeno de PEM y dispersiones de Mb libre se pueden medir usando un analizador Hemox™ a temperatura fisiológica (37°C). De forma breve, se puede permitir que las muestras se saturen a una pÜ2 de 147 mm Hg usando aire comprimido, y después se desoxigenan usando una corriente de nitrógeno comprimido. Las medidas de absorbancia de UV-Vis de muestras oxigenadas y desoxigenadas se pueden registrar en función de pO2 mediante espectroscopía de longitud de onda dual. Las curvas en el equilibrio de oxígeno-PEM/mioglobina pueden ajustarse a un modelo de Hill de cuatro parámetros (A0 , A®, P50, n):
Y _ Abs ~Abs0 _ po*
~ An-Ao ~ pO?+Psno (Ec. 1),
en el que A0 y A® representan la absorbancia a 0 mm Hg y a saturación total de O2, respectivamente. La pO2 representa la presión parcial de O2, y P50 representa la presión parcial de O2 en la que PEM/Mb está saturada al 50% con oxígeno. Por último, ‘n’ representa el coeficiente de cooperatividad de PEM/Mb. En estudios de ejemplo, se encontró que la P50 para PEM antes (PEM-SE) y después de la proteólisis (PEM-E) fue de 7,9 y 17,1 mm Hg, respectivamente, que fueron ambas significativamente más altas que la P50 para Mb libre (~2 mm Hg). Estos resultados se muestran en la FIG. 13A, que ilustra la saturación con oxígeno de PEM que tiene mioglobina asociada tanto en la superficie como en las cavidades acuosas de los polimerosomas (es decir, PEM-SE), de PEM que tiene mioglobina asociada solamente en las cavidades acuosas de los polimerosomas (es decir, PEM-E), y de mioglobina libre, en función de la presión parcial de oxígeno. La menor afinidad por O2 (mayor P5o) de PEM que la mioglobina libre puede atribuirse al efecto de apantallamiento de la membrana del polimerosoma, que se descubrió adicionalmente que retrasa la cinética de la unión de O2 a PEM.
En diversas realizaciones, las medidas cinéticas de unión/liberación para diversos ligandos gaseosos (O2 y NO) a PEM y mioglobina libre se pueden realizar usando un espectrofotómetro de flujo parado de microvolumen Applied Photophysics SX-20. Las medidas de ejemplo de curvas cinéticas se ajustaron a una ecuación exponencial de primer orden para revertir las constantes de velocidad de pseudo-orden, que se encontró que eran de primer orden en el caso de NO y de orden cero para la disociación del O2. Midiendo los cursos de tiempo cinéticos a diferentes concentraciones de NO, las constantes de velocidad de primer orden aparentes se representaron gráficamente frente a las concentraciones de NO, y la pendiente de la línea ajustada produjo la constante de velocidad de segundo orden para la desoxigenación de n O. La FIG. 13B muestra cursos de tiempo de disociación de O2 de PEM, en la que toda la mioglobina no encapsulada y asociada a la superficie se había eliminado mediante proteólisis, y en la que la mioglobina restante se había reducido a oximioglobina en presencia de 1,5 mg/ml de Na2S2O4.
La FIG. 14 es una tabla que muestra las constantes cinéticas de velocidad para la disociación de oxígeno (Koff, O2) y la desoxigenación mediada por NO (Kox, no) para diversas formulaciones de PEM en comparación con la mioglobina libre (sin encapsular) (Mb).
La FIG. 13C muestra el curso de tiempo cinético para la desoxigenación de PEM mediada por NO, en la que toda la mioglobina no encapsulada y asociada a la superficie se había eliminado mediante proteólisis, y en la que la mioglobina restante se había reducido a oximioglobina. La absorbancia de la reacción de desoxigenación se observó a 437,5 nm en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS) 0,1 M, pH 7,4 a 20°C. Los cursos de tiempo de desoxigenación de NO de PEM se adquirieron en base a los cambios de absorbancia a 420 nm y 20°C después de una mezcla rápida de PEM oxigenada (7,5 mM de hemo) y diluciones apropiadas de la disolución madre de NO.
En diversas realizaciones, las constantes de disociación de oxígeno (koff, 02 ), así como las constantes de desoxigenación de NO (kox,No), de PEM-SE y PEM-E pueden ser significativamente más bajas que las de mioglobina libre. Tales diferencias pueden deberse al efecto de apantallamiento de la membrana gruesa del polimerosoma, que puede servir eficazmente como barrera entre PEM y ligandos gaseosos en el medio ambiente, retrasando así la disociación de O2 , la desoxigenación de NO, y la unión en el equilibrio de estos gases a PEM. El efecto de apantallamiento también es consistente con las diferencias observadas en la unión cinética y en el equilibrio de ligandos gaseosos en polimerosomas que tienen mioglobina tanto encapsulada como asociada a la superficie (PEM-SE) en comparación con las formulaciones de PEM que se han tratado con pronasa para eliminar la mioglobina de superficie unida no específicamente (PEM-E). La mioglobina asociada a la superficie puede reaccionar rápidamente con los gases expuestos, y por lo tanto PEM-SE puede presentar una mayor koff, 02 que PEM-E. En general, PEM puede presentar una afinidad por O2 que es mayor que la hemoglobina unida a RBC y menor que la mioglobina libre. En la tabla de la FIG. 14 se muestran ejemplos de constantes cinéticas de velocidad para la disociación de oxígeno (Koff, 02 ) y la desoxigenación mediada por NO (Kox, no) para diversas formulaciones de PEM en comparación con la mioglobina libre (sin encapsular) (Mb).
En diversas realizaciones, los controles negativos pueden prepararse usando infrarrojo cercano (NIR) - mioglobina. Por ejemplo, un fluoróforo de infrarrojo cercano (IRDye800cw NHS) puede unirse covalentemente a las lisinas en la mioglobina esquelética de caballo para formar el control NIR-mioglobina. En los modelos de ratones, las venas de la cola se pueden cateterizar con agujas 30G, y se pueden administrar mediante inyección intravenosa (IV) disolución salina heparinizada, polimerosomas vacíos (un primer control), NIR-mioglobina (un segundo control), y suspensiones de PEM. Después de la inyección, los catéteres pueden enjuagarse con disolución salina heparinizada, para garantizar una dosificación precisa.
Resultados de estudio de ejemplo
En estudios de ejemplo, se inyectaron 0,5 x 106 a 1 x 106 células de carcinoma mamario de ratón 4T1 en las almohadillas de grasa mamaria de ratones balb/c. Una vez que los tumores tenían más de 5 mm de diámetro, los ratones se distribuyeron aleatoriamente y se trataron mediante un catéter en la vena de la cola con PEMs (a 100 pl de 2,5 mg/ml de Mb, que corresponden a suspensiones poliméricas de 50 mg/ml), polimerosomas vacíos (a dosis de polímero equivalentes), y NIR-Mb (a dosis equivalentes de mioglobina) (n = 5 por grupo). NIR-Mb y PEM se redujeron a su forma de oxi-mioglobina antes del tratamiento, siguiendo protocolos explicados anteriormente. Los ratones se sacrificaron a las 24 h (para estudios de biodistribución/farmacocinéticos) o a los 6-9 días (para la evaluación de histología y toxicología tras los estudios de eficacia tumoral). En ambos casos, se usó EF-5 para teñir la hipoxia, y disolución de Hoechst para perfusión. Los tumores se recogieron en el sacrificio. La inmunofluorescencia (IF) se llevó a cabo para formar la imagen de la distribución de EF-5 y de Hoechst en todos los tumores. Las mismas secciones tumorales también se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para el análisis inmunohistológico (IHC). Se recogió sangre mediante punción cardíaca en el sacrificio; el plasma se aisló y se almacenó a -80°C para análisis posteriores.
La FIG. 15A muestra la biodistribución, la acumulación tumoral, y la farmacocinética de NIR-Mb, polimerosomas vacíos, y PEM en puntos posteriores a la inyección IV. Los polimerosomas vacíos y los constructos de PEM tuvieron un colorante fluorescente NIR (PZn3) incorporado para permitir la formación de imágenes ópticas in vivo de la biodistribución de partículas, así como para permitir determinaciones farmacocinéticas de las concentraciones plasmáticas mediante la cuantificación de las señales de fluorescencia, que posteriormente se compararon con los valores iniciales de fluorescencia y se correlacionaron con las concentraciones de Mb determinadas mediante ICP-OES antes de la administración. La FIG. 15B muestra tales concentraciones plasmáticas de polimerosomas vacíos, PEM y NIR-mioglobina en función del tiempo, mientras que la FIG. 15C muestra las concentraciones de mioblobina correlacionadas en función del tiempo. Como se ilustra mediante las FIGs. 15A-15C, la absorción y la farmacocinética de PEM parecían ser similares a las de los polimerosomas vacíos, lo que demostró una fase de distribución rápida, una fase de aclaramiento más lenta, y una vida media plasmática global de aproximadamente 15 h. Por otro lado, NIR-Mb exhibió un aclaramiento plasmático extremadamente rápido (a través de los riñones y hacia la vejiga), como se esperaba de la biodistribución y el aclaramiento conocidos de Mb libre.
Para todos los estudios de biodistribución, la obtención de imágenes NIR de polimerosomas, NIR-Mb y PEM se realizó con un sistema de formación de imágenes cinéticas MS® (Perkin Elmer, AeX = 745 nm, Aem = 810-875 nm) equipado con un sistema de anestesia de gas Xenogen XGI-8. Las imágenes de fluorescencia se analizaron con el software Living Image® 4.2 midiendo la eficiencia radiante de regiones de interés (ROI). La eficiencia radiante ([fotones/s]/[pW/cm2]) corrige la excitación no uniforme y las diferencias en los tiempos de exposición, proporcionando una medida consistente entre muestras.
Para los estudios farmacocinéticos, se extrajeron muestras de sangre de 15-100 pl (usando una lanceta de 5,5 mm, Goldenrod) de la vena submandibular del ratón, y se recogieron directamente en tubos capilares heparinizados (Kimble). Los tubos capilares se centrifugaron durante 3-5 minutos, e inmediatamente se tomaron imágenes usando el Sistema de Formación de Imágenes Cinéticas MS®. La eficiencia radiante total del plasma en cada tubo capilar se midió en una región de interés de dimensiones consistentes. Las concentraciones plasmáticas de PEM y de polimerosomas vacíos se calcularon en base a una curva estándar, que en primer lugar se determinó añadiendo disoluciones de concentraciones conocidas de polimerosomas emisivos cargados con PZn3 a plasma no tratado y midiendo la fluorescencia de los tubos capilares. Los resultados farmacocinéticos se representaron gráficamente como concentraciones plasmáticas de PEM y polimerosomas vacíos frente al tiempo. La concentración de mioglobina frente al tiempo se estimó en base a la fluorescencia de PZn3 de la PEM y la fluorescencia de IRDye800 de NIR-Mb, respectivamente, con el supuesto de que toda la mioglobina permaneció asociada con la PEM después de la inyección.
Respuesta tumoral ortotópica a la administración de PEM:
Como se muestra en la FIG. 16, en aproximadamente 3-6 horas, 5 de 5 tumores comenzaron a cambiar de su color rosa inicial (como se ve en el tejido normal circundante) a un color rojo oscuro o negro. Estos resultados corresponden a una acumulación de hemoglobina (Hb) unida a glóbulos rojos, según se evalúa mediante espectroscopía óptica (de Zenascope, por Zenalux, Inc.). Los resultados de la espectroscopía se muestran en la FIG. 17, que proporciona la concentración de hemoglobina total en función del tiempo para formulaciones de PEM, de polimerosomas vacíos y de NIR-mioglobina. Sin desear ceñirse a una teoría particular, este fenómeno puede deberse a la oclusión vascular tumoral y a la embolización microvascular mediada por nanopartículas (NME) producida por PEM. La NME inducida por PEM no se observó en el hígado, el bazo u otros tejidos normales de biodistribución de PEM, y de este modo se muestra que es específica del tumor.
Estudios de cámara de ventana de alta resolución de la actividad de PEM a nivel microvascular:
Las cámaras de ventana del pliegue cutáneo dorsal se usaron para obtener imágenes del microambiente del tumor como se describió anteriormente. Para llevar a cabo estudios de cámara de ventana, se afeitaron ratones Balb/c y se aplicó Nair antes de la cirugía. Durante la cirugía, se inyectaron 1-1,5 x 105 células 4T1 en la fascia. 7-9 días después de la cirugía, los tumores eran visibles dentro de las ventanas. Los ratones se trataron entonces mediante un catéter en la vena de la cola con 150-200 pl de suspensiones poliméricas de 50 mg/ml, que corresponden a polimerosomas vacíos o a PEMs. Los ratones se anestesiaron con isofluorano a través del cono de la nariz, y las ventanas se aseguraron a la platina del microscopio. La adquisición de las imágenes se llevó a cabo antes y durante la inyección de los tratamientos, y en diversos momentos durante el transcurso del experimento hasta las 48 h.
Se tomaron imágenes de los polimerosomas vacíos y de constructos de PEM en las cámaras de ventana usando formación de imágenes de fluorescencia de la emisión de NIR de fluoróforos PZn3 dentro de sus membranas. También se recopilaron imágenes de campo brillante a lo largo del tiempo. La formación de imágenes hiperespectrales se usó para determinar la concentración de hemoglobina y la saturación de oxígeno en base a los espectros de absorbancia de Hb en sangre. Con iluminación de campo brillante, se usó un filtro sintonizable de cristal líquido para reunir imágenes de alrededor de 500-620 nm. La deconvolución espectral para cada píxel se llevó a cabo usando MatLab para crear imágenes de saturación de hemoglobina oxigenada. También se estudiaron las propiedades hemodinámicas de los tumores. Se hicieron videos del flujo sanguíneo en las cámaras de ventana, con el filtro sintonizable ajustado a 560 nm, a la que la hemoglobina tiene una alta absorción. Se aplicó a los videos la correlación cruzada píxel a píxel, y se analizó usando MatLab para crear mapas de velocidades de flujo dentro de los vasos sanguíneos tumorales.
La FIG. 18A muestra un tumor de ratón típico durante el tratamiento con PEM y polimerosomas vacíos. Las oclusiones vasculares se hacen evidentes dentro de una hora después de la administración de PEM, y se vuelven más graves con el tiempo. Para el punto de tiempo de 4 h, el oscurecimiento de la región tumoral se vuelve pronunciado, y continúa aumentando en severidad hasta 48 h.
La FIG. 18B muestra una imagen de campo brillante (izquierda) y una imagen de fluorescencia de infrarrojo cercano (NIR) del uso de PZn3 (derecha) del tumor mostrado en la FIG. 18A a las 24 horas después de la administración de PEM, en la que la fluorescencia NIR corresponde a la localización de PEM dentro del tumor.
Las FIGs. 19A y 19B muestran mapas de saturación de hemoglobina y velocidad de flujo sanguíneo para un tumor representativo, respectivamente. Cada uno de estos mapas muestra el tumor representativo antes y después del tratamiento con PEM y polimerosomas vacíos (control). El tratamiento con PEM da como resultado una reducción sustancial en la saturación de hemoglobina oxigenada después del tratamiento, así como una marcada disminución en el flujo sanguíneo, que se vuelve más pronunciada en severidad con el tiempo. Estos resultados no se observan con tratamientos con polimerosomas vacíos.
Los resultados de los tumores extirpados demuestran NME inducida por PEM:
La FIG. 20 ilustra imágenes representativas de inmunohistoquímica (IHC) y hematoxilina y eosina (H&E) de tumores extirpados para un animal tratado con el control de NIR-mioglobina y con PEM. En los animales tratados con PEM, existen áreas de necrosis enormemente mejoradas, que comprenden la mayoría de las secciones tumorales, así como la obliteración casi completa de los vasos perfundidos correspondientes a la NME de los tumores. Estos efectos no se observaron con la administración de polimerosomas vacíos.
La FIG. 21 proporciona resultados de un panel de química del suero realizado para un conjunto de ratones portadores de tumores inyectados con cada uno de los siguientes tratamientos (n = 5 ratones por tratamiento): NIR-mioglobina (control), polimerosomas vacíos (control), y PEM. Si bien hubo algunos valores individuales elevados distribuidos en los grupos, no hubo niveles consistentemente elevados para ningún parámetro, independientemente de los tratamientos con PEM o con el control.
El hígado es el órgano principal de acumulación de polimerosomas/PEM, y de este modo, puede realizarse la histología de los hígados para determinar cualquier daño microvascular correspondiente a los tejidos normales. En estudios de ejemplo, cada suspensión de tratamiento puede mezclarse con Na2S2O4 para regenerar oxi-mioglobina antes de la infusión. A los animales se les inyectó directamente tanto esta mezcla de disolución (de PEM y Na2S2O4) así como suspensiones de PEM dializadas (en las que se había eliminado Na2S2O4), para determinar cualquier efecto potenciador. Los hígados de ratones xenoinjertados ortotópicamente con 4T1, tratados con PEMs y polimerosomas vacíos (control), también se extirparon después del sacrificio (6-9d tras el tratamiento, 14-17d tras la inyección de tumor) para la tinción de H&E y la microscopía. Cada suspensión de tratamiento también se mezcló con Na2S2O4 para regenerar oxi-mioglobina antes de la infusión. A los animales se les inyectó directamente tanto esta mezcla de disolución (PEM y Na2S2O4) así como suspensiones de PEM dializadas (en las que se había eliminado Na2S2O4), para determinar cualquier efecto potenciador. Las FIGs. 22A y 22B son imágenes de H&E aumentadas 20x y aumentadas 40x, respectivamente, de hígados extirpados de ratones con tumor tratados con PEM y polimerosomas vacíos. Como se muestra en estas imágenes de H&E, se observó hepatotoxicidad en cualquier formulación, lo que confirma nuevamente la especificidad tumoral de la NME inducida por PEM.
Ejemplo VI
En base al mecanismo de acción propuesto de PEM (es decir, su efecto de NME sobre los tumores), PEM puede ser particularmente eficaz como terapia de primera línea para los tumores muy altamente vascularizados. Una diana de ejemplo puede ser RCC de células claras (CC-RCC), que es resistente a la quimioterapia pero responde a sustancias terapéuticas contra el cáncer que inhiben la angiogénesis. En diversas realizaciones, puede usarse un modelo de ratón de RCC para ensayar la eficacia de PEM en la promoción de la NME selectiva de tumores de RCC y en la inhibición de su crecimiento.
En diversos estudios, se pueden usar xenoinjertos ectópicos y ortotópicos de células tumorales de RCC humanas y/o aloinjertos de células tumorales de RCC de ratón en ratones inmunocomprometidos (NCr nu/nu) para generar modelos de ratón de RCC. Como se discutió anteriormente, PEM es capaz de inducir NME específica del tumor después de una única administración a 10-15 mg/kg de Mb (correspondiente a 200-300 mg/kg de polímero). Para establecer su eficacia para el RCC, se pueden determinar los niveles de dosis óptimos que logran un efecto máximo con una toxicidad mínima.
La FIG. 22C muestra tumores de RCC de ratón aproximadamente antes del tratamiento con PEM, y aproximadamente 28 horas después del tratamiento. El cambio de color de su luz inicial (como se observa en el tejido normal circundante) a un color oscuro puede corresponder a una acumulación de hemoglobina (Hb) unida a RBC, según lo evaluado mediante espectroscopía óptica (de Zenascope, por Zenalux, Inc.). En comparación, la FIG. 22D muestra tumores de RCC de ratón aproximadamente antes y aproximadamente 28 horas después del tratamiento con polimerosomas vacíos. Cualquier cambio de color observado en los tumores en la FIG. 22D es significativamente menor que los de la FIG. 22C. Sin desear ceñirse a una teoría particular, estos resultados pueden mostrar que la NME inducida por PEM ocurre en tumores de ratón distintos de los tumores mamarios, tales como en tumores de RCC.
Las FIGs. 22E y 22F ilustran imágenes representativas de IHC y H&E de tumores extirpados de modelos de ratón de RCC tratados con PEM y con polimerosomas vacíos, respectivamente. En los animales tratados con PEM, hay áreas de necrosis enormemente mejoradas que se muestran en la FIG. 22E, que comprende la mayoría de las secciones tumorales. Tales áreas no se muestran de manera similar en la FIG. 22F para el tratamiento con polímeros vacíos.
Se pueden generar preparaciones de PEM a escala de gramos en condiciones de GLP, y se pueden realizar estudios de escalado de dosis para determinar su ventana terapéutica como agente único. La tabla de la FIG. 23A proporciona parámetros para estudios para determinar cualquier DLT, y la tabla de la FIG. 23B proporciona parámetros para estudios para determinar la MED de PEM para promover la NME del RCC. La dosis más alta de PEM para una administración segura puede establecerse como STD10 (la dosis severamente tóxica en el 10% de los animales) o MTD75 (la dosis máxima tolerada que da como resultado una pérdida de peso inferior a 15-20% en el 75% de los animales), si no se descubren las DLT.
Las dispersiones de PEM biodegradables pueden formarse usando mioglobina humana purificada y copolímeros de dibloques de PEO(2k)-b-PCL(12k) y PEO(2k)-b-PMCL(9.4k). La formación de PEMs se puede realizar mediante un protocolo de rehidratación directa modificado, como se discutió anteriormente. Para estudios de formación de imágenes ópticas in vivo, se pueden generar constructos de PEM emisores de NIR mediante la coincorporación de fluoróforos de PZn3, como también se discutió anteriormente. Para cada lote de PEM, los tamaños de partículas pueden determinarse mediante dispersión dinámica de luz (DLS), y la viscosidad puede medirse usando un microviscosímetro; la unión de oxígeno y NO, así como las concentraciones de mioglobina, el % en peso final de mioglobina/polímero y el % en peso de met-mioglobina se pueden determinar siguiendo la metodología establecida. Los cambios in situ en el nivel de met-mioglobina, la absorción de NO y la liberación de mioglobina a partir de formulaciones de PEM biodegradables se pueden analizar en diversas condiciones de disolución (por ejemplo, temperatura, pH, pO2 , y pNO) y en diversos puntos de tiempo, para verificar la estabilidad del producto. Se pueden evaluar los siguientes parámetros cinéticos y puntos finales: signos clínicos (cada hora durante las primeras 24 h, luego cada 12 h durante 3 días, y luego semanalmente), pesos y cambios corporales (2-3 veces por semana), consumo de alimentos (2-3 veces por semana), batería de observación funcional abreviada (2-3 veces/semana), evaluaciones oftalmológicas (2-3 veces por semana), perfiles serológicos (hematología, coagulación, química clínica y análisis de orina (realizado semanalmente), parámetros toxicocinéticos (extracción de sangre cada hora durante las primeras 24 h, luego cada 12 h durante 3 días, y semanalmente a partir de entonces, hallazgos de necropsia macroscópica (al sacrificio después de completar el tercer ciclo de tratamiento), pesos de órganos (al sacrificio), y exámenes histopatológicos (al sacrificio).
Generación de xenoinjertos ectópicos y ortotópicos de RCC en ratones NCr nu/nu:
Una línea celular de RCC humana, 786-0 (VHL-/-), puede obtenerse de la colección de cultivos tipo americana (ATCC), se puede mantener y propagar en medio RPMI 1640 (GIBCO), y puede suplementar con suero fetal bovino inactivado por calor al 10% a 37°C y 5% de CO2. A ratones atímicos NCr nu/nu hembras se pueden implantar por vía subcutánea fragmentos tumorales de 1 mm3 de células 786-0 para los modelos de xenoinjerto ectópico de RCC. Para los modelos de xenoinjerto ortotópico de RCC, a ratones atímicos NCr nu/nu machos se les pueden implantar volúmenes de fragmentos tumorales similares haciendo una incisión en la cápsula renal y colocando el fragmento de donante debajo de la vaina de la cápsula.
Determinación de MED para inducir NME:
Las cámaras de ventana pueden implantarse quirúrgicamente en animales portadores de tumores de RCC ectópicamente xenoinjertados. Las suspensiones de PEM se pueden preparar como se discutió anteriormente, y se pueden inyectar a través de la vena de la cola cuando los tumores alcanzan 4-6 mm de diámetro. La formación de imágenes hiperespectrales de la absorción de hemoglobina se puede usar para cuantificar la saturación de oxígeno de la hemoglobina, y la actividad de HIF-1 se puede evaluar midiendo la emisión de GFP. Para determinar la ubicación de PEM, se pueden obtener imágenes ópticas in vivo antes y después de cada inyección de PEM en la vena de la cola a t = 0, 2, 4, 6, 24, 48 y 72 h, durante las cuales los animales se pueden anestesiar con 1 -2,5% de isofluorano y se pueden mantener en una almohadilla térmica.
Dado que, en contraste con terapias convencionales antiangiogénicas e inmunes, el mecanismo de NME no depende de la expresión del tumor de dianas moleculares específicas; por lo tanto, PEM puede demostrar ser una terapia de primera línea de RCC más uniformemente eficaz. En diversas realizaciones, PEM se puede administrar en diferentes niveles y programas de dosificación, con y sin el TKI de VEGFR sunitinib, para determinar la combinación terapéutica que logra la actividad máxima contra el r Cc sin tratamiento previo. La eficacia preclínica de PEM puede establecerse si algún tratamiento logra una duración de la inhibición del crecimiento tumoral mayor de 1,5 veces la de sunitinib solo, y no se observan DLT asociadas.
Además, dado que NME funciona mediante un mecanismo de acción diferente al de los TKI de VEGFR, PEM puede mejorar la respuesta tumoral observada con estos agentes. Como tal, se pueden observar los efectos terapéuticos de dos niveles de dosis diferentes y dos programas de dosificación, cuando PEM se administra tanto como un único agente como en combinación con sunitinib, en modelos murinos de RCC. La FIG. 24A proporciona parámetros para un estudio para desarrollar una única combinación de nivel de dosis de PEM, programa, y tratamiento (es decir, como un único agente o con sunitinib) en una terapia de primera línea que da como resultado la inhibición máxima del crecimiento tumoral y sin toxicidades graves para animales tratados.
Determinación de la inhibición del crecimiento tumoral en respuesta a los programas de dosificación de PEM y combinaciones:
Para generar animales portadores de tumores de RCC ortotópicamente xenoinjertados, se pueden utilizar células 786­ 0 que se han manipulado para expresar luciferasa de forma constitutiva. Subsiguientemente se puede usar la formación de imágenes de luciferasa para monitorizar el tamaño tumoral y rastrear la metástasis. La intensidad de la luciferasa y el peso corporal se pueden registrar dos o tres veces por semana, comenzando con el primer día de tratamiento. Se puede generar una curva de calibración preliminar para relacionar la radiancia tumoral total con el volumen del tumor, que se puede medir directamente en el momento del sacrificio. Los tratamientos pueden iniciarse cuando los tumores alcanzan 100 mm3, y la eficacia del tratamiento puede medirse como un porcentaje de inhibición del crecimiento tumoral (TGI) con respecto a grupos de control. La TGI puede calcularse mediante la Ecuación 2 a continuación:
TGI = (1 - T/C) (Ec. 2),
en la que T y C representan la masa tumoral media en el último día de terapia en los grupos tratados (T) y de control (C), respectivamente. Una TGI de más del 50%, en la que T también es significativamente más pequeña que C (según lo evaluado por la prueba de la t), puede considerarse eficaz. Las barras de error pueden calcularse como el error estándar de las medias. La salud general de los animales puede monitorizarse diariamente hasta que los tamaños de los tumores hayan aumentado 5 veces, los tumores alcancen un volumen de 500 mm3, o se observen signos de angustia animal significativa (por ejemplo, una pérdida de masa corporal mayor del 15%). Los parámetros de toxicidad se pueden determinar para todas las combinaciones de PEM y sunitinib. Al final del tratamiento, todos los tumores pueden extirparse y tomarse microfotografías de la superficie. Los tumores se pueden fijar entonces en formalina al 10%, y se pueden embeber en parafina para el análisis de IHC, como se muestra a continuación. Se supone que los datos son normales después de la transformación, y se puede usar una prueba de la t para evaluar la significancia estadística. Suponiendo una desviación estándar del 50% de la media del control, puede ser necesario un mínimo de 10 animales por grupo para garantizar un poder superior al 80% de detección de una TGI de más del 50%. Las comparaciones múltiples pueden corregirse mediante la tasa de descubrimiento falso.
Análisis de IHC para la inhibición de la angiogénesis tumoral, la proliferación celular, el grado de apoptosis, y la señalización de HiF-1 :
La inhibición de la angiogénesis tumoral se puede evaluar midiendo los niveles de CD31 y aSMA, la proliferación celular mediante tinción con Ki-67, el grado de apoptosis tumoral mediante el marcado del extremo libre mediado por desoxinucleotidil transferasa terminal, y la hipoxia tumoral mediante el kit Hypoxyprobe-1 Plus, siguiendo protocolos previamente establecidos.
La eficacia preclínica y la seguridad de PEM, como terapia de primera línea, como agente único o en combinación con el TKI de VEGFR sunitinib, pueden establecerse si cualquier tratamiento logra una duración de TGI que sea mayor de 1,5 veces la de Sunitinib solo, y no se observan DLTs.
En otras realizaciones, se puede determinar la eficacia de PEM como terapia de segunda línea (es decir, en RCC resistente a TKI de VEGFR). PEM puede administrarse en diferentes niveles y programas de dosificación, con y sin el inhibidor de mTOR temsirolimus, para determinar la combinación terapéutica más eficaz contra RCC resistente a TKI de VGFR.
Actualmente, los inhibidores de mTOR alcanzan tasas de respuesta moderadas contra RCC resistente a TKI de VEGFR, pero están activos solo durante un período limitado. La selectividad tumoral de la NME, junto con la falta de toxicidades sistémicas aparentes, puede hacer que PEM sea particularmente adecuada para esta población de pacientes muy tratados. La FIG. 24B proporciona parámetros para un estudio para determinar los efectos terapéuticos de diferentes niveles de dosis y programas de dosificación cuando PEM se administra como una terapia de segunda línea, tanto como un agente único como en combinación con temsirolimus.
En diversas realizaciones, pueden generarse animales portadores de tumor de RCC ortotópicamente xenoinjertado, y pueden someterse a tratamiento con sunitinib (40 mg administrados por vía oral por día), que puede iniciarse cuando los tumores alcanzan 100 mm3 y continuarse hasta que crecen 1,5 veces su tamaño inicial. En este punto, se pueden distribuir aleatoriamente para terapia de segunda línea, y se pueden monitorizar, como se discutió anteriormente. La eficacia preclínica y la seguridad de PEM, como agente único o en combinación con el inhibidor de mTOR temsirolimus, pueden establecerse si algún tratamiento logra una duración de TGI que sea mayor de 1,5 veces la de temsirolimus solo, y no se observan DLTs.
En diversas realizaciones, se pueden determinar los beneficios de combinar PEM con XRT como tratamiento paliativo para RCC. PEM se puede administrar después de XRT para evaluar su capacidad para prolongar el control local de RCC.
Actualmente, la radioterapia paliativa después de la nefrectomía se usa en pacientes de alto riesgo para mejorar el control local, pero no tiene un beneficio de OS. Estos pacientes tienen una alta propensión a desarrollar metástasis distante, lo que puede explicar la falta de supervivencia. De este modo, PEM puede usarse para aumentar la XRT como tratamiento paliativo para RCC. La FIG. 25 proporciona parámetros para un estudio para determinar un nivel de una dosis única de PEM y un programa en un tratamiento paliativo que den como resultado la inhibición máxima del crecimiento tumoral y una disminución en el número de nuevas metástasis, medido en intervalos semanales durante un mes. Los animales portadores de tumores de RCC ortotópicamente xenoinjertados pueden establecerse, como se discutió anteriormente, y tratarse diariamente con una dosis fraccionada de 3Gy x5 al lecho renal (a través de PXi X-Rad 225Cx, irradiador guiado por imagen de ortovoltaje). Después de la administración de PEM, se puede evaluar el crecimiento tumoral a intervalos semanales durante 1 mes, y se puede determinar el número de metástasis en el sacrificio. El beneficio de combinar PEM y XRT puede establecerse si la administración da como resultado más del 50% de TGI y hay un 25% de reducción en el número de metástasis en comparación con los animales que se someten a XRT sola, un mes después del tratamiento.
En diversas realizaciones, el aumento de escala de PEM también se puede lograr a través de un aparato de filtración de flujo tangencial, siguiendo técnicas establecidas. Para estudios en animales, si la MTD75 no se establece dentro de los cinco primeros niveles de dosis iniciales, se pueden seleccionar dos niveles de dosis de PEM adicionales (por ejemplo, 200 y 500 mg/kg de mioglobina). Además de las células 786-0, pueden usarse las líneas celulares A498, 769-P, Caki-1, Caki-2, SW839, ACHN, G401 y/o SK-NEP-1 (todas disponibles de ATCC) para generar modelos de ratón de RCC. Además, pueden utilizarse ratones NOD/SCID para generar xenoinjertos tumorales, si los tumores en los ratones NCr nu/nu no crecen ni responden de manera eficaz. Alternativamente, se puede emplear el modelo transgénico de cáncer de riñón (es decir, el ratón “TRACK”), que expresa un HIF-1a constitutivamente activo en células del túbulo proximal del riñón. Se pueden examinar diferentes dosis de temsirolimus y/o, alternativamente, everolimus si los animales experimentan un exceso de toxicidad con el tratamiento con temsirolimus después de sunitinib, según lo evaluado para animales de control positivo (solo temsirolimus). Además, se pueden emplear dosis alternativas (por ejemplo, 30 Gy) o modos de XRT (es decir, SBRT) si el crecimiento tumoral es refractario al tratamiento.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una composición que comprende un agente inhibidor de óxido nítrico (NO) y un vehículo portador, en la que el agente inhibidor de (NO) es para uso en el tratamiento de tumores altamente vascularizados causando embolización microvascular en el tumor,
en la que el vehículo portador es una nanopartícula, y en la que la nanopartícula es un polimerosoma, en la que el agente inhibidor de (NO) comprende una molécula de unión a (NO);
en la que la unión a NO se habilita solo a tensiones de oxígeno de menos de 10 mm Hg;
en la que la molécula de unión a (NO) se selecciona de una o más de mioglobina humana no modificada, mioglobina no modificada de otra especie biológica, y mioglobina modificada química o genéticamente de seres humanos o de otra especie biológica;
en la que la molécula de unión a (NO) está precargada con oxigeno; y
en la que el agente inhibidor de NO está encapsulado dentro del vehículo portador.
2. La composición para uso de la reivindicación 1, en la que la unión a NO se habilita solo a tensiones de oxígeno de menos de 5 mmHg.
3. La composición para uso de la reivindicación 1, en la que la composición comprende además al menos uno de un inhibidor de NO sintasa (NOS) y un antioxidante coencapsulado con las moléculas de unión a NO en los polimerosomas.
4. La composición para uso de la reivindicación 1, en la que la composición comprende además al menos uno de un agente de quimioterapia y de un agente inhibidor de la angiogénesis coencapsulado con las moléculas de unión a NO en los polimerosomas.
5. La composición para uso de la reivindicación 1, en la que la composición comprende además al menos uno de un inhibidor de tirosina cinasa (TKI) del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR) y de un inhibidor de la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR) coencapsulado con las moléculas de unión a NO en los polimerosomas.
6. La composición para uso de la reivindicación 1, en la que el polimerosoma:
a) comprende una vesícula de polímero sintético, y en la que el agente inhibidor de NO está dentro de un núcleo acuoso de la vesícula de polímero;
b) comprende una vesícula de polímero sintético, y el agente inhibidor de NO está dentro de una porción membranosa de la vesícula de polímero;
c) es un polimerosoma uni- o multilaminar;
d) comprende una pluralidad de polímeros biodegradables, opcionalmente en el que la pluralidad de polímeros biodegradables forman una nanopartícula, opcionalmente en el que la nanopartícula tiene menos de 200 o menos de 100 nanómetros de diámetro; o
e) coencapsula el agente inhibidor de NO con al menos otro agente quimioterapéutico o sensibilizador a la radiación.
7. La composición para uso de la reivindicación 6, en la que la composición comprende además:
una pluralidad de polimerosomas configurados para acumularse en sitios de interés mediante difusión pasiva o mediante una modalidad seleccionadora de dianas compuesta de una conjugación de una molécula seleccionadora de dianas separada de las nanopartículas, opcionalmente en la que al menos parte de la pluralidad de polimerosomas son vesículas de polímero biodegradable y al menos parte de la pluralidad de vesículas de polímero son vesículas de polímero biocompatible; y opcionalmente
en la que las vesículas de polímero biocompatible están compuestas en parte de poli(óxido de etileno) o poli(etilenglicol);
en la que las vesículas de polímero biodegradable están compuestas de al menos un copolímero de bloques de poli(óxido de etileno) y poli(e-caprolactona), poli(óxido de etileno) y poli(g-metil e-caprolactona), o poli(óxido de etileno) y poli(trimetilcarbonato); o
en la que las vesículas de polímero biodegradable son puras o mezclas de copolímeros de múltiples bloques, en las que el copolímero incluye al menos uno de poli(óxido de etileno) (PEO), poli(lactida) (PLA), poli(glicolida) (PLGA), poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA), poli(e-caprolactona) (PCL), y poli(carbonato de trimetileno) (PTMC), poli(ácido láctico), poli(metil e-caprolactona).
8. La composición para uso de la reivindicación 7, en la que el polimerosoma se forma a partir de uno cualquiera de: PEO-b-PCL, PEO-b-PMCL, y PEO-b-PTMC.
9. Una composición para uso según la reivindicación 1, en la que el tumor altamente vascularizado se selecciona del grupo que consiste en: carcinoma de células renales (RCC), carcinoma hepatocelular (HCC), tumor cerebral de glioblastoma multiforme (GBM) y mieloma múltiple (MM).
10. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que la composición se administra al tumor introduciendo la composición en la circulación sistémica, en la que:
la composición se acumula dentro del tumor.
11. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que el agente inhibidor de NO comprende moléculas de unión a NO que se unen competitivamente a oxígeno (O2) y a NO, y en la que:
las moléculas de unión a NO oxigenadas se introducen en la circulación sistémica; y
las moléculas de unión a NO se desoxigenan al acumularse las partículas portadoras en el tumor, permitiendo así la captura selectiva de NO en la microvasculatura tumoral.
12. La composición para uso según la reivindicación 11, en la que la acumulación de la composición en el tumor permite la difusión de NO en las partículas portadoras, en la que la captura selectiva de NO se realiza al menos en parte por desoxigenación de las moléculas de unión a NO encapsuladas.
13. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que la prevención selectiva de la actividad normal de NO en la vasculatura tumoral causa vasoconstricción y agregación plaquetaria en la vasculatura tumoral, opcionalmente en la que la presión hidrodinámica persistente en la vasculatura tumoral provoca la ruptura de la agregación plaquetaria y el sangrado en el tumor, y opcionalmente en la que el sangrado en el tumor provoca trombosis de la vasculatura tumoral y necrosis del tejido tumoral.
14. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que la composición se administra al tumor junto con al menos uno de un inhibidor de tirosina cinasa (TKI) del receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR), un inhibidor de la diana de la rapamicina en mamíferos (mTOR), y radioterapia.
15. La composición para uso según la reivindicación 1, en la que la composición se administra al tumor junto con al menos uno de un agente de quimioterapia y un agente inhibidor de la angiogénesis.
ES15829211T 2014-08-08 2015-08-06 Composiciones y su uso para inducir la embolización microvascular de tumores mediada por nanopartículas Active ES2822557T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14/455,082 US20140363496A1 (en) 2011-01-07 2014-08-08 Compositions and Methods for Inducing Nanoparticle-mediated Microvascular Embolization of Tumors
PCT/US2015/044017 WO2016022805A1 (en) 2014-08-08 2015-08-06 Compositions and methods for inducing nanoparticle-mediated microvascular embolization of tumors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2822557T3 true ES2822557T3 (es) 2021-05-04

Family

ID=55264557

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES15829211T Active ES2822557T3 (es) 2014-08-08 2015-08-06 Composiciones y su uso para inducir la embolización microvascular de tumores mediada por nanopartículas

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP3177713B1 (es)
JP (1) JP6764864B2 (es)
AU (1) AU2015301014B2 (es)
CA (1) CA2957552C (es)
ES (1) ES2822557T3 (es)
WO (1) WO2016022805A1 (es)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10456452B2 (en) 2015-07-02 2019-10-29 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for improved encapsulation of functional proteins in polymeric vesicles
ES2865481T3 (es) 2016-04-29 2021-10-15 Poseida Therapeutics Inc Micelas basadas en poli(histidina) para la complejación y el aporte de proteínas y ácidos nucleicos
US20190119636A1 (en) 2017-10-23 2019-04-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
EP3519561A1 (en) 2016-09-30 2019-08-07 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory t cells, methods of making and methods of using same
WO2018068022A1 (en) 2016-10-06 2018-04-12 Poseida Therapeutics, Inc. Inducible caspases and methods for use
US10329543B2 (en) 2017-10-23 2019-06-25 Poseida Therapeutics, Inc. Modified stem cell memory T cells, methods of making and methods of using same

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5612310A (en) * 1993-05-24 1997-03-18 Duke University Methods for improving therapeutic effectiveness of agents for the treatment of solid tumors and other disorders
GB9624540D0 (en) * 1996-11-26 1997-01-15 Nycomed Imaging As Compositions
EP1131106B1 (en) * 1998-11-12 2009-06-24 Novolytics Inc. Compositions and methods for producing vascular occlusion
EP1278547B1 (en) * 2000-04-26 2004-11-03 Cellegy Pharmaceuticals, Inc Formulations and methods of using nitric oxide mimetics against a malignant cell phenotype
DE60227538D1 (de) * 2001-09-12 2008-08-21 Virexx Medical Corp Festphasenmittel zur vaskulären okklusion mit immo
WO2009126705A2 (en) * 2008-04-10 2009-10-15 Virginia Commonwealth University Induction of tumor hypoxia for cancer therapy
US9044454B2 (en) * 2010-03-10 2015-06-02 Northwestern University Regulation of microvasculature occlusion
US8808748B2 (en) 2010-04-20 2014-08-19 Vindico NanoBio Technology Inc. Biodegradable nanoparticles as novel hemoglobin-based oxygen carriers and methods of using the same
DK2661275T3 (en) * 2011-01-07 2019-04-15 Poseida Therapeutics Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR ADMINISTRATING THE HIGH OXYGEN EFFICIENCY TO TUMORS FOR THE ADMINISTRATION

Also Published As

Publication number Publication date
EP3177713B1 (en) 2020-08-05
JP6764864B2 (ja) 2020-10-07
EP3177713A4 (en) 2018-01-24
JP2017526740A (ja) 2017-09-14
WO2016022805A1 (en) 2016-02-11
AU2015301014A1 (en) 2017-03-02
EP3177713A1 (en) 2017-06-14
CA2957552A1 (en) 2016-02-11
CA2957552C (en) 2024-01-16
AU2015301014B2 (en) 2021-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200338361A1 (en) Compositions and methods for inducing nanoparticle-mediated microvascular embolization for tumors
ES2718308T3 (es) Composiciones y métodos para la administración a tumores de agentes de unión de alta afinidad al oxígeno
US20200138716A1 (en) Compositions and methods for inducing nanoparticle-mediated microvascular embolization of tumors
ES2822557T3 (es) Composiciones y su uso para inducir la embolización microvascular de tumores mediada por nanopartículas
Dong et al. Enhanced drug delivery by nanoscale integration of a nitric oxide donor to induce tumor collagen depletion
US9421247B2 (en) Biodegradable nanoparticles as novel hemoglobin-based oxygen carriers and methods of using the same
US10780164B2 (en) Multifunctional nanoparticle compositions and uses thereof
Zhang et al. Engineering supramolecular nanomedicine for targeted near infrared-triggered mitochondrial dysfunction to potentiate cisplatin for efficient chemophototherapy
Li et al. Disulfiram loaded calcium phosphate nanoparticles for enhanced cancer immunotherapy
Batool et al. A detailed insight of the tumor targeting using nanocarrier drug delivery system
Li et al. Advances and challenges in the treatment of lung cancer
Wang et al. Codelivery of adavosertib and olaparib by tumor-targeting nanoparticles for augmented efficacy and reduced toxicity
Xu et al. Ferroptosis boosted oral cancer photodynamic therapy by carrier-free Sorafenib-Ce6 self-assembly nanoparticles
Yamamoto et al. Systemic administration of hemoglobin vesicle elevates tumor tissue oxygen tension and modifies tumor response to irradiation
Feng et al. A CuS-Based Nanoplatform Catalyzing NO Generation for Tumor Vessel Improvement and Efficient Chemotherapy
AU2017202175A1 (en) Biodegradable nanoparticles as novel hemoglobin-based oxygen carriers and methods of using the same