WO2015086885A1 - Nuevas sesquiterpeno sintasas aisladas de la piel de naranja - Google Patents

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WO2015086885A1
WO2015086885A1 PCT/ES2014/070916 ES2014070916W WO2015086885A1 WO 2015086885 A1 WO2015086885 A1 WO 2015086885A1 ES 2014070916 W ES2014070916 W ES 2014070916W WO 2015086885 A1 WO2015086885 A1 WO 2015086885A1
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cstps3
polypeptide
sequence
synthase
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PCT/ES2014/070916
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English (en)
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Inventor
Omar José RUIZ RIVERO
Esther CARRERA BERGUA
Marís Jesús RODRIGO ESTEVE
Lorenzo Ángel ZACARÍAS GARCÍA
Manuel TALÓN CUBILLO
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Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias IVIA
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias IVIA
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)

Definitions

  • the present invention relates to a natural orange sesquiterpene synthase enzyme (CsTPS3) with ⁇ -cadineno synthase activity. Furthermore, the invention relates to a natural nucleic acid molecule isolated from the skin of orange fruits (Citrus sinensis) encoding the natural sesquiterpene synthase CsTPS3, with in vitro modified nucleic acid molecules derived from the natural sequence Cstps3, with their respective modified sesquiterpene synthase encoded enzymes, with methods for preparing sesquiterpene synthases, and with host bacterial cells expressing the nucleic acids encoding the polypeptides of the invention.
  • the present invention also relates to methods for synthesizing sesquiterpenes.
  • the sesquiterpenes synthases object of the invention can be used to convert the farnesyl pyrophosphate precursor (FPP) into several bicyclic sesquiterpenes including ⁇ -cadineno, ⁇ -cubebeno, a-copaeno, germacreno D, ⁇ -cadineno and cubebol, and Monocyclic sesquiterpene elemol with a high mosquito repellent activity.
  • FPP farnesyl pyrophosphate precursor
  • Terpenoids are important natural products, of which more than 30,000 compounds have been identified in the plant kingdom. Among them, monoterpenes (C10) and sesquiterpenes (C15) are the main constituents of essential oils of plant origin (Dewick, [2009] In Medicinal Natural Products, John Wiley & Sons Ltd, Chichester-West Wales, pp 187-310 ; Fraga, [2006] Nat Prod Rep. 23, 943-972).
  • Sesquiterpenes are usually volatile compounds that can act as signal molecules for the attraction of pollinators and seed dispersers, herbivore predators or pest repellents, as well as having an important role in inter-plant communication (reviewed by Gershenzon and Dudareva, [2007 ] Nat Chem Biol. 3, 408-414).
  • TPS Terpene synthases
  • austrocaledonicum SauSSy
  • S. spicatum S. spicatum
  • WO 2012/058636 modified Valencian synthase
  • terpenes of plant origin have immense commercial value due to their use as fragrances in cosmetics and perfumery, as organoleptic additives for food and beverages or to add desirable fragrances to cleaning products.
  • essential phyto-oils, as well as their components in isolation mainly monoterpenes and sesquiterpenes
  • repellents of mosquitoes that transmit certain high-risk infectious tropical diseases such as: malaria, dengue hemorrhagic fever, yellow fever, filariasis or fever West Nile (West Nile Virus Infection WNV)
  • malaria dengue hemorrhagic fever
  • yellow fever yellow fever
  • filariasis or fever West Nile (West Nile Virus Infection WNV)
  • West Nile Virus Infection WNV also gives them great medical and pharmaceutical interest (reviewed by Pohlit et al., [201 1] Planta Medica 77, 598-617).
  • DEET DEET
  • repellents and insecticides of plant origin are considered as a promising alternative to synthetic repellents, due to their low toxicity and environmental safety (Katz et al., [2008] J Am Acad Dermatol. 58, 865-871 ).
  • elemol and ⁇ -eudesmol in addition to being effective as larvicides also exhibit high repellency against female adult mosquitoes (Coats et al., [2003] US Patent No. 6,524,605; [2005] US Patent No. 6,524,043; Schultz et al., [2004] Environ Entomol. 33, 1562-1569; Palauch et al., [2009] J Agri Food Chem.
  • elemol has been shown to be a potent repellent of nymphs of the black-legged tick (Ixodes scapularis), and the lone star tick (Amblyomma americanum), transmitters of Lyme disease and human monocytotropic Ehrlichiosis, respectively ( Carrol et al., [2010] Exp Appl Acarol. 51, 383-392). In vitro and in vivo tests have shown that relatively low concentrations of elemol are sufficient to repel ticks and mosquitoes (adult females and larvae).
  • An objective of the present invention is to provide new sesquiterpene synthases (TPS) capable of catalyzing the transformation of FPP into cyclic sesquiterpenes based on the chemical structure of germacrene or elemene. It is also an objective of this invention, to provide modified TPS capable of synthesizing sesquiterpenes for which no citrus enzyme has been isolated.
  • TPS sesquiterpene synthases
  • the object of the present invention to provide a way to synthesize the oxygenated monocyclic sesquiterpene elemol, which has a potent mosquito repellent activity, through the expression of modified in vitro TPS derived from the natural ⁇ -cadinine synthase TPS isolated from the skin of orange fruits, object of this invention.
  • the present invention contemplates: (/) natural nucleic acid molecules isolated from the skin of oranges encoding sesquiterpene synthase that catalyzes the synthesis of cyclic sesquiterpenes, (// ') sesquiterpene synthases recombinant, (//' / ') recombinant expression vectors in which the sequences have been cloned polynucleotides encoding the sesquiterpene synthases object of the invention, (/ V) bacterial cells that have been transformed with the recombinant vectors object of the invention, and (v) methods for in vitro production of cyclic sesquiterpenes, including the introduction steps of the recombinant vectors in the bacterial cells, under conditions that ensure the expression of the nucleotide sequences object of the invention, as well as the induction of the synthesis of the proteins encoded in the transformed bacterial cells.
  • the present invention also describes the methods used for the modification of the natural orange sesquiterpene synthase object of this invention, as well as the modified versions derived therefrom.
  • Representative DNA molecules of that natural TPS isolated from the flavedo (skin) of oranges object of the present invention were cloned and sequenced, their amino acid sequence was deduced and their enzymatic activity was tested in vitro.
  • the natural nucleotide sequence isolated from orange fruit flavedo (Citrus sinensis) encodes the enzyme ⁇ -cadineno synthase SEQ ID NO: 2 (CsTPS3).
  • modified enzymes object of this invention have an altered specificity and rationalization of products. Examples of these are those modified enzymes that produce higher relative levels of germacrene D and small amounts of ⁇ -elemene and ⁇ -gurjuneno, or those that produce higher levels of elemol compared to the corresponding levels produced by the natural version CsTPS3. It should be noted that elemol is a potent repellent of mosquitoes that transmit diseases that are considered high risk for public health, as well as being a fragrant ingredient widely used in cosmetics and perfumery.
  • this patent provides the bacterial cells that were transformed with the recombinant expression vectors in which the DNA sequences object of the invention were cloned.
  • the recombinant plasmids that express the orange ⁇ -cadineno synthase (CsTPS3) orange tree sesquiterpene synthase are provided, as well as the modified versions derived from it, in which amino acid changes have been introduced that alter their catalytic activity and / or product specificity.
  • biofactories can be used for the production, isolation and purification of significant amounts of the natural enzymes ⁇ -cadineno synthase (CsTPS3) and its modified versions, as well as the sesquiterpenes resulting from its catalytic activity.
  • CsTPS3 ⁇ -cadineno synthase
  • FIG. 1 DNA sequence of the Cstps3 gene (SEQ ID NO: 1), and of the mutant versions derived therefrom, and deduced amino acid sequence of the encoded polypeptides.
  • A DNA sequence of the Cstps3 gene (SEQ ID NO: 1), and of the encoded polypeptide (CsTPS3, SEQ ID NO: 2).
  • B DNA sequence of the Cstps3-VB2 version (SEQ ID NO: 3), of the encoded polypeptide (CsTPS3-VB2, SEQ ID NO: 4).
  • C DNA sequence of the Cstps3-VB5 version (SEQ ID NO: 5), and of the encoded polypeptide (CsTPS3-VB5, SEQ ID NO: 6).
  • FIG. 3 Multiple alignment of the deduced amino acid sequence of the CsTPS3 polypeptides (SEQ ID NO: 2), and of the mutant versions VB2 (SEQ ID NO: 4), VB5 (SEQ ID NO: 6), VC1 (SEQ ID NO: 8), and VC2 (SEQ ID NO: 10).
  • the deduced amino acid sequence of the CSTPS3 polypeptide is shown at the top of the alignment.
  • the substituted amino acids in each of the mutant versions are indicated.
  • the dots represent identical amino acids between the variant polypeptides and the natural sequence CsTPS3.
  • FIG. 4 Multiple alignment of truncated ESTs that share similarity with the Cstps3 nucleotide sequence encoding the orange sesquiterpene synthase CsTPS3 (C. sinensis var. Washington Navel) object of the invention.
  • the oligonucleotides used as primers in PCR assays for amplification of the complete coding sequence of the Cstps3 gene are indicated.
  • the white letters on a black background represent identical nucleotides in the same position.
  • the letters on gray background they represent different nucleotides in the same position.
  • the dashes represent gaps in the nucleotide sequence.
  • AdGerD ⁇ Actinidia deliciosa GerD, AAAX16121), CcGerB ⁇ Cistus creticus GerB, ACF94469), Nt5EAS ⁇ Nicotiana tabacum TEAS, Q40577); PtdGerD ⁇ Populus tnchocarpa x deltoides GerD, AAR99061), RhGerD ⁇ Rosa hybrida GerD, BQ105086), and VvGerD ⁇ Vitis vinifera GerD, AAS66357).
  • ( ⁇ ) Indicates amino acids involved in the catalysis of TEAS.
  • the residues indicated with (T) were mutagenized to know their role in the catalytic activity of the CsTPS3 enzyme.
  • ( ⁇ ) It indicates amino acids that, in the same position, are different in the CsTPS3 polypeptide compared to the rest of the TPS activity polypeptides used in the alignment.
  • FIG. 6 Phylogenetic tree of vegetable sesquiterpene synthases of the TPS-a subfamily, including the CsTPS3 polypeptide. The tree was constructed using maximum likelihood analysis, using the amino acid sequence of enzymes with activity cubebeno (Cub), cadineno (Cad) and germacreno (Ger) synthase.
  • Cub cubebeno
  • Cad cadineno
  • Ger germacreno
  • AaGerA Artemisia annua GerA, AAX16121), AdGerD ⁇ Actinidia deliciosa GerD, AAAX16121), CcGerB ⁇ Cistus creticus GerB, ACF94469), CiGerA ⁇ Cichorium intybus GerA, AAM21658, CmGerD ⁇ Cucumis s3, C3USs C3USs T3, CsnisPS3) , Ga (+) - 8-Cad ⁇ Gossypium arboreum (+) - 8-Cad, CAA77191), Gh (+) - 8-Cad ⁇ Gossypium hirsitum (+) - 8-Cadineno, AAX44033), HaCad ⁇ Helianthus annuus Cad , AAY41422), IdGerA ⁇ Ixeris dentate GerA, AAL92481), LhGerB ⁇ Lycopersi
  • FIG. 7 Profile of volatile sesquiterpenes produced by the CsTPS3 protein, and each of its mutant versions, under the conditions of the enzymatic assay I. Sesquiterpenes were identified by gas chromatography analysis coupled to mass spectrophotometry.
  • the number on each peak of the gas chromatogram indicates the volatile sesquiterpene identified by mass spectrophotometry.
  • FIG. 8 Profile of volatile sesquiterpenes produced by the CsTPS3 protein, and each of its mutant versions, under the conditions of enzyme assay II. Sesquiterpenes were identified by gas chromatography analysis coupled to mass spectrophotometry. The volatile sesquiterpenes identified in enzymatic assays in which the FPP substrate was exposed to: (A) the CsTPS3 polypeptide (SEQ ID NO: 2) are shown; (B) CsTPS3-VB2 modified polypeptide (SEQ ID NO: 4); (C) the modified polypeptide CsTPS3-VB5 (SEQ ID NO: 6); (D) the modified polypeptide CsTPS3-VC1 (SEQ ID NO: 8); (E) the modified polypeptide CsTPS3-VC2 (SEQ ID NO: 10).
  • FIG. 10 Three-dimensional (3D) structure of the CsTPS3 polypeptide.
  • the simulation of the structure of the CsTPS3 protein was performed using as a standard the 3D structure of the 5-ep / -aristoloquene synthase obtained by X-ray crystallography (TEAS, PDB code: 5EAT) (Starks et al., [1997 ] Science 277, 1815-1820).
  • the boxes show a detail of the active site CsTPS3 protein.
  • the side chains of the amino acids that form the catalytic cavity, and the neighboring bonds are represented with lines. Likewise, the position of the amino acids involved in catalysis is indicated.
  • the 3D structure of the CsTPS3 polypeptide is imposed on that of TEAS forming a complex with the farnesyl hydroxyphosphate analog substrate (FHP).
  • the images were obtained by in silico modeling using the Discovery Studio v3.5 software (Accelrys Software Inc.).
  • FIG 11 Detail of the 3D structure of the catalytic cavity at the active site of the CsTPS3 polypeptide, compared to the corresponding active site of the 5-epi-aristoloquene synthase protein (TEAS, PDB code: 5EAT).
  • the imposition of the CsTPS3 polypeptide on the 3D structure of the TEAS shows the differences in identity and spatial location of the side chains of the amino acids within the cavity of the active site.
  • the 3D structure of TEAS is shown forming a complex with the farnesyl hydroxyphosphate analog substrate (FHP). Dates indicate amino acid residues that differ in identity or spatial location.
  • the images were obtained by in silico modeling using the Discovery Studio v3.5 software (Accelrys Software Inc.).
  • FIG. 12 Detail of the structure of the catalytic cavity at the active site of the modified polypeptides CsTPS3-VB2 (SEQ ID NO: 4) and CsTPS3-VC1 (SEQ ID NO: 8), compared to the corresponding active site of the 5-ep / -aristoloquene synthase protein (TEAS, PDB code: 5EAT).
  • the imposition of CsTPS3-VB2 (A) or CsTPS3- polypeptides VC1 (B) on the 3D structure of TEAS shows the differences in identity and spatial location of the side chains of the amino acids replaced within the cavity of the active site.
  • the side chains of the amino acids that form the catalytic cavity, and the neighboring bonds are represented with lines.
  • the amino acids selected for the directed mutagenesis of the CsTPS3 polypeptide are represented in light gray, while the substituted residues in the modified polypeptides are indicated by arrows.
  • the structure of the modified polypeptides is shown overlapping with TEAS (although not shown in the image) forming complex with the farnesyl hydroxyphosphate analog substrate (FHP).
  • the images were obtained by in silico modeling using the Discovery Studio v3.5 software (Accelrys Software Inc.).
  • Terpene is a hydrocarbon molecule with a basic chemical structure of five carbon atoms called isoprene (C 5 H 8 ), which can be closed (cyclic) or open (acyclic). Terpenes include among others ⁇ -cadineno, a-copaeno, ⁇ -cubebeno, germacreno D, a-gurjuneno, ⁇ -elemeno and elemol. In this sense, the terms “terpenes” and “terpenoids” are used here to refer to terpenes and derived terpenes, including those that have undergone one or more stages of modification (hydroxylation, isomerization, oxido-reductions, methylation or acylation). As used herein, the term “sesquiterpene” refers to a terpene formed by five isoprene units (Ci 5 ), including those that have undergone one or several stages of modification and / or functionalization.
  • sesquiterpene synthase refers to an enzyme that catalyzes, in the presence of magnesium and molecular oxygen, the transformation of the acyclic farnesyl pyrophosphate (FPP) precursor into one or more cyclic or acyclic sesquiterpenes.
  • FPP farnesyl pyrophosphate
  • the main product or major sesquiterpene can be obtained depending on the conditions employed with a relative abundance of between 25% and 100%, preferably between 25% and 90%, more preferably between 45% and 90%, even more preferably between 65% and 90%, and still more preferably between 75% and 90%, with respect to the total amount of sesquiterpenes produced.
  • sesquiterpene synthase produces more than one sesquiterpene
  • minor sesquiterpene or sesquiterpenes are obtained with a relative abundance of less than 25%, preferably between 1% and 25%, more preferably between 2.5%. and 25%, more preferably between 4% and 23%, even more preferably between 8% and 23%, and even more preferably between 1 1% and 20%, with respect to the Total amount of sesquiterpenes produced.
  • nucleic acid or “nucleic acid molecule” refers to polymers of deoxyribonucleotides (nucleotides) in the form of a double stranded molecule (DNA: deoxyrribonucleic acid).
  • nucleotide refers to the monomeric unit of DNA, which is formed by a sugar molecule of five carbon atoms (pentose), a phosphate group and a nitrogen base (adenine [A], guanine [G], cytosine [C] and thymine [T]).
  • the order of nucleotides in the main strand of DNA determines the order of amino acids along the polypeptide chain or protein.
  • the DNA sequence encodes the amino acid sequence of a protein.
  • CDS Coding DNA Sequence
  • the integral CDS of any gene comprises the nucleotide sequence between the start codon (ATG), at its 5 'end, and the stop codon (TAG, TAA or TGA), at the 3' end.
  • amino acid refers to natural molecules (H 2 NCHRCOOH) that contain an amide (-NH 2 ) and a carboxylic (-COOH) group, in addition to a side chain (R) that is specific of each amino acid.
  • Amino acids are identified by an international nomenclature established by the IUPAC (International Union or Puré and Applied Chemistry), as they appear in Table 1.
  • oligonucleotides refers to short sequences or single stranded polydeoxyribonucleotides, which are used as primers for amplification of specific DNA fragments by PCR assays (Polymerase Chain Reaction), widely known in the state of The technique.
  • the oligonucleotides are chemically synthesized, and purified by different methods, which include the use of reverse phase cartridges, HPLC (High Performance Liquid Chromatography), or polyacrylamide gels.
  • percent identity refers to the percentage of amino acids that in a comparison of two or more proteins occupy the same relative position along the alignment.
  • similarity percentage is a statistical measure of the degree of kinship of two or more protein sequences, based on the chemical properties of each group of amino acids compared throughout the sequences. Both parameters, the percentage of identity and similarity, are calculated by computer programs that assign a numerical value to each group of amino acids compared along the sequence of aligned proteins.
  • the similarity leaves room for conservative variation, this is the substitution of a hydrophobic residue such as isoleucine, valine, leucine or methionine amino acids for another, or the substitution of one polar residue for another, such as arginine for lysine, glutamic acid for aspartic acid. , or asparagine glutamine.
  • the homology percentages indicated herein refer to sequence identity percentages.
  • the amino acid sequence identity in percent (%) with respect to a particular reference sequence may be the percentage of amino acid residues in a candidate sequence that are identical to the amino acid residues in the reference sequence. If necessary, gaps can be introduced in the aligned sequences to achieve the maximum percentage of sequence identity, without being considered conservative substitutions of sequence identity.
  • modified nucleic acid molecule refers to a DNA molecule that has differences in its sequence of deoxyribonucleotides (deletions, insertions, transitions and transitions) with respect to the wild or natural molecule (wild type). ). Consequently, such changes or “mutations” are transmitted to the proteins encoded in the form of substituted, deleted or added amino acids (insertions).
  • the mutation may have no effect on the enzymatic activity of the mutated protein, or on the contrary it may increase, reduce or completely annihilate it. In other cases, the replaced amino acid corresponds to a conservative or non-conservative substitution.
  • a hydrophobic amino acid to a hydrophilic (charged or polar) amino acid at the active site of a protein or in surrounding layers could affect the activity of the protein.
  • modifications can be introduced into a nucleic acid molecule by techniques known as site-directed mutagenesis.
  • site-directed mutagenesis there are several commercial kits based on PCR techniques, such as Stratagen single or multiple directed mutagenesis systems. These systems allow the generation of single or multiple mutations simultaneously in a given nucleotide sequence, which has been previously cloned into a plasmid or expression vector, without the need for subsequent subcloning or the generation of single-chain phagemids.
  • Both methods require the use of specific oligonucleotides that contain the desired mutation and several nucleotides on each side that perfectly match the target sequence.
  • the oligonucleotide that carries the mutation, and which functions as a primer can hybridize with the target DNA sequence that is used as a template for synthesis by a PCR reaction of DNA sequences that will carry the desired mutation in The selected position.
  • expression vector refers to a plasmid (circular double-stranded DNA molecule capable of replicating autonomously and independently of the genomic DNA of the host bacterial strain), which contains regulatory elements ( promoters, operators and / or enhancers) that control the expression of a foreign DNA sequence encoding the polypeptide of interest. Since expression vectors are generally relatively small plasmids that can be up to hundreds of copies per bacterial cell (multicopy plasmids), induction of foreign DNA sequence expression ensures rapid accumulation of high levels of transcripts (molecules of messenger RNA) and hence of the encoded protein.
  • transformed cell refers to the introduction by different methods (chemical or electroporation) well known in the state of the art, of recombinant plasmids or plasmids into a cell here called "host cell".
  • This can be a prokaryotic cell such as the different strains of the Escherichia coli bacteria (TOP10, Novablue, BL21 [DE3] pLysS, etc).
  • the present invention describes a natural nucleotide sequence corresponding to the coding sequence of a gene here isolated from the flavedo (skin) of orange fruits (Citrus sinensis) of the Navel variety. This sequence encodes a multiproduct TPS that catalyzes the synthesis of several cyclic sesquiterpenes. Representative cDNA molecules of said gene were sequenced and the amino acid sequence of the encoded polypeptide was deduced. In this sense, the present invention relates in the first instance to: (a) A polynucleotide sequence corresponding to an orange tree gene, hereinafter referred to as Cstps3, comprising the sequence shown in Fig.
  • SEQ ID NO: 1A which encodes a polypeptide, hereinafter CsTPS3, with a Major activity ⁇ -cadineno synthase, which has the deduced amino acid sequence shown in Fig. 1 B (SEQ ID NO: 2).
  • in vitro mutated nucleic acid molecules are also described, which encode modified polypeptides that contain at least one amino acid change with respect to the natural polypeptide sequence of the CsTPS3 protein (SEQ ID NO: 2) (Table 2).
  • the present invention provides modified nucleic acid molecules that contain:
  • the invention further provides modified sesquiterpene synthases containing amino acid changes with respect to the natural polypeptide sequence of the CsTPS3 polypeptide.
  • modified polypeptides are those containing:
  • modified sesquiterpene synthases encoded by the in vitro mutated nucleic acid molecules provided herein are those modified polypeptides that:
  • (d) Contains replacement C 455 G (hereinafter version VB2, identified as SEQ ID NO: 4), or a combination of substitutions S 418 H and C 455 G (S 418 H / C 455 G) (version VB5 , identified as SEQ ID NO: 6), or a combination of amino acid replacements S 416 T / G 417 T / S 418 Y (hereinafter version VC1, identified as SEQ ID NO: 8), or a combination of amino acid replacements S 416 T / G 417 T / S 418 Y / S 422 A (hereinafter VC2, identified as SEQ ID NO: 10), numbered according to the relative positions of SEQ ID NO: 2.
  • the nucleic acid molecule provided here encodes a modified CsTPS3 containing the C 455 amino acid replacement that is C 455 G (Fig. 3).
  • the modified sesquiterpene synthases provided herein have an altered catalytic activity.
  • the effect of the amino acid changes introduced in the polypeptide sequence of the modified proteins was such that it altered the specificity and / or distribution / rationalization of the products (i.e. alteration of the quantities and / or types of sesquiterpenes produced), compared to the activity of natural sesquiterpene synthase CsTPS3 identified as SEQ ID NO: 2.
  • a first aspect of the invention relates to a polypeptide, herein referred to as a polypeptide of the invention, which has sesquiterpene synthase activity and comprises a sequence with at least 90% identity, preferably with at least 95 %, and more preferably with at least 98%, and even more preferably with at least 99% identity, at SEQ ID NO: 14.
  • Said sesquiterpene synthase activity of the polypeptide SEQ ID No: 14 is preferably at least one selected from the group consisting of: ⁇ -cadineno synthase activity, elemol synthase activity and germacrene D synthase activity.
  • SEQ ID NO: 14 consists of a polypeptide sequence where:
  • amino acid at position 416 is independently selected from Thr or Ser; the amino acid at position 417 is independently selected from Thr or Gly; the amino acid at position 418 is independently selected from Ser, Hys or Tyr, and preferably is Ser or Tyr;
  • amino acid at position 422 is independently selected from Ser or Ala, and preferably is Ser; Y
  • amino acid at position 455 is independently selected from Cys or Gly; and comprises the sequence of the CsTPS3 protein isolated from orange or one of its mutants with sesquiterpene synthase activity.
  • said orange tree CsTPS3 protein has a majority activity ⁇ -cadineno synthase, and consists of the sequence SEQ ID NO: 2, which corresponds to the sequence SEQ ID NO: 14 where: the amino acid at position 416 is Ser, the amino acid at position 417 is Gly, the amino acid at position 418 is Ser, the amino acid at position 422 is Ser, and the amino acid at position 455 is Cys.
  • the CsTPS3 polypeptide corresponds to a multi-product enzyme that can also be used for the preparation of other cyclic sesquiterpenes such as a-copaene, ⁇ -cubebeno, germacrene D, and elemol, in addition to ⁇ -cadinine (Fig. 2).
  • the polypeptide comprises a sequence that has at least 90% identity with SEQ ID NO: 2, or with SEQ ID NO: 2 modified with at least one substitution in an amino acid that alters sesquiterpene synthase activity and / or product specificity.
  • Said substitution is preferably selected from at least one of the group consisting of:
  • the optionally modified SEQ ID NO: 2 may further comprise another substitution in an amino acid of its sequence, also to alter the specificity and / or distribution / rationalization of the sesquiterpenes it produces, and which is select between:
  • NO: 2 comprises the C 455 G substitution, or b. a substitution of the serine at position 422 with alanine (SA), preferably when SEQ ID NO: 2 comprises the triple substitution S 416 T / G 417 T / S 418 Y.
  • SA alanine
  • the polypeptide of the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 2 modified with the C 455 G substitution, it mostly exhibits elemol synthase activity, which can be further increased when the additional S 418 H substitution.
  • it is capable of producing elemol with a relative abundance, preferably in a range between 65% and 90%, and more preferably between 65% and 85% or between 75% and 90% , with respect to the total amount of the different sesquiterpenes produced with said polypeptide.
  • the polypeptide of the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 2 modified with the triple substitution S 416 T / G 417 T / S 418 Y, it mostly shows germacrene D synthase activity. And in fact, in a preferred example and under certain conditions, it is capable of producing germacrene D with a relative abundance, preferably in a range between 75% and 80%, and more preferably between 75% and 80% or between 80% and 85%, with respect to the total amount of the different sesquiterpenes produced with said polypeptide.
  • the polypeptide of the invention comprises a sequence that is selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 18.
  • the sequence polypeptide SEQ ID NO: 16 has elemol synthase activity, that is, it is an elemol synthase, which consists of the natural polypeptide sequence SEQ ID NO: 2 of the CsTPS3 polypeptide modified at least with the substitution of the Cys at position 455 by Gly (C 455 G), and in which the amino acid 418 of its sequence is Ser or His, and more preferably is His.
  • the sequence polypeptide SEQ ID NO: 18 has germacrene D synthase activity, that is, it is a germacrene D synthase, which consists of the natural polypeptide sequence SEQ ID NO: 2 of the CsTPS3 polypeptide modified at least with the triple substitution S 416 T / G 417 T / S 418 Y, and wherein amino acid 422 of its sequence is Ser or Ala, and more preferably is Ser.
  • the polypeptide is a sesquiterpene synthase selected from the group consisting of: ⁇ -cadineno synthase CsTPS3 consisting of SEQ ID NO: 2, elemol synthase VB2 which consists of SEQ ID NO: 4, the elemol synthase VB5 consisting of SEQ ID NO: 6, the germacrene D synthase VC1 consisting of SEQ ID NO: 8 and the germacrene D synthase VC2 consisting of SEQ ID NO: 10.
  • nucleic acid or polynucleotide comprising a sequence encoding a polypeptide of the invention, according to any one of those defined above.
  • said nucleic acid or polynucleotide as well as in any of its preferred embodiments set forth below, can also be found interchangeably as “nucleic acid of the invention” or "polynucleotide of the invention”.
  • the nucleic acid of the invention encodes a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 13. And more preferably, it encodes a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2 modified with at least one substitution in an altering amino acid sesquiterpene synthase activity and / or product specificity, as defined above.
  • nucleic acid when the nucleic acid encodes a polypeptide comprising the sequence SEQ ID NO: 2 corresponding to the natural sesquiterpene synthase CsTPS3, it consists of a polynucleotide comprising SEQ ID NO: 1.
  • nucleic acid when the nucleic acid encodes a polypeptide comprising the modified sequence SEQ ID NO: 2, it consists of a polynucleotide comprising SEQ ID NO: 1 with at least one mutation in its sequence selected from the group consisting of:
  • the nucleic acid comprises another additional mutation in the sequence polynucleotide SEQ ID NO: 1 that is selected from: to. a transverse / transition AG ⁇ CA at positions +1252/1253 with respect to the start codon of SEQ ID NO: 1, when SEQ ID NO: 1 comprises the transversion T ⁇ G; Y
  • the nucleic acid comprises the sequence SEQ ID NO: 15, which comprises said T ⁇ G transposition in position +1363 and said AG ⁇ CA transversion / transition in positions +1252/1253; or the sequence SEQ ID NO: 17, comprising said group of substitutions T ⁇ A / G ⁇ A / AGC ⁇ TAT in positions + 1246/1249 / 1252-1254 and said transversion T ⁇ A in position +1264.
  • the nucleic acid comprises at least one polynucleotide sequence selected from the group consisting of: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8. And preferably, it consists of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8.
  • Another aspect of the invention relates to a gene construct comprising at least one nucleic acid of the invention, as any of those defined above.
  • vectors that contain the nucleic acid molecules described herein, thus constituting another aspect of the present invention.
  • Vectors include plasmids (self-replicating double stranded circular DNA molecules) for heterologous eukaryotic protein expression in bacterial cells.
  • plasmids self-replicating double stranded circular DNA molecules
  • bacterial cells or strains containing said vectors are also provided in another aspect of the invention.
  • the bacterial cells provided here can be cultured to induce the expression of the natural Cstps3 sequence, or in the absence of any of its modified (mutated) derivatives, and consequently the synthesis of the natural CTPS3 polypeptide, or in its defect of the corresponding modified polypeptide ( CsTPS3-VB2, CsTPS3-VB5, CsTPS3-VC1 or CsTPS3-VC2).
  • the invention refers to a method for obtaining a polypeptide of the invention with sesquiterpene synthase activity, which comprises culturing a bacterial cell transformed with a nucleic acid of the invention, or with a gene construct or a recombinant vector that understand, as defined above, in suitable conditions to favor or induce the expression of said nucleic acid.
  • the induction method used depends to some extent on the type of expression vector used, which as a general rule in the case of commercial vectors is indicated by the manufacturer.
  • other variables such as temperature, induction time, culture medium used, etc. can be modified.
  • the expression of sesquiterpene synthase type proteins in bacteria the growth and induction conditions are well known and available to the skilled person in the state of the art, and can be varied at the discretion of the specialist. Technician in question.
  • the polypeptide of the invention makes it possible to synthesize a sesquiterpene that is selected from at least one of the group consisting of: ⁇ -cubebeno, a-copaeno, ⁇ -cubebeno, ⁇ -elemene, a- gurjuneno, ⁇ - ⁇ - Caryophylene, ⁇ -humulene, germacrene D, bicyclogermacrene, ⁇ -muurolene, a-bulneseno, cubebol, ⁇ -cadineno, elemol, germacreno D-4-ol, bulnesol, guaiol and any combination of two or more of the above. More preferably, the sesquiterpene that is synthesized is at least one selected from the group consisting of: ⁇ -cadinine, elemol and
  • ⁇ -cadineno synthase CsTPS3 (SEQ ID NO: 2) on the one hand can be used in the synthesis ⁇ -cadineno and also of other cyclic sesquiterpenes such as a-copaeno, ⁇ -cubebeno, germacrene D, and / or elemol.
  • the modified TPS product of the invention can be used to improve the production and / or biosynthesis of elemol, germacrene D, ⁇ -gurjuneno, bicyclogermacrene, guaiol, bulnesol and ⁇ -elemene, increasing the distribution of these sesquiterpenes in comparison to the relative amount of ⁇ -cadineno, ⁇ -cubebeno, cubebol and a-copaeno, main products of the catalytic activity of the natural reference protein CsTPS3.
  • This fact can result in methods to increase the production and / or purity of elemol, germacrene D, ⁇ -gurjuneno and bicyclogermacrene, guaiol, bulnesol and ⁇ -elemene, increasing the recovery of these cyclic sesquiterpenes from the reaction medium.
  • An example of this are those modified polypeptides that generate elemol as a main product, in addition to a small part of guaiol and bulnesol, and only traces of a-copane, Germacrene D, ⁇ -cadinen, compared to the relative abundance of these sesquiterpenes produced by natural polypeptide CsTPS3 (SEQ ID NO: 2) under the same conditions.
  • modified polypeptides are that identified with the reference SEQ ID NO: 4 (CsTPS3-VB2), which contains the C 455 G replacement.
  • the introduction of the S 418 H change into the CsTPS3-VB2 polypeptide has a synergistic effect. about the production of elemol.
  • An example of such a modified polypeptide is that identified by reference SEQ ID NO: 6 (CsTPS3-VB5).
  • the invention also provides a modified polypeptide that produces a greater relative abundance of germacrene D, and a decrease in the percentage of other minor sesquiterpenes, compared to the relative abundance of this sesquiterpene produced under the same reaction conditions by the natural polypeptide CsTPS3 (SEQ ID NO: 2).
  • the modified polypeptides of the invention can be used for the preparation of elemol (Fig. 2), a cyclic sesquiterpene present in some essential phytoaceites.
  • elemol a potent repellent agent for different species of mosquitoes that transmit contagious diseases, and even an effective cockroach repellent. This fact has made elemol a promising and powerful natural repellent that can be used in pharmacological formulas designed to repel insects that transmit serious infectious and contagious diseases.
  • the polypeptide of the invention is used for the preparation or synthesis, preferably in vitro, of elemol, preferably when said polypeptide comprises the sequence SEQ ID NO: 16, more preferably when it comprises the sequence SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6, and even more preferably when its sequence is SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 6.
  • another aspect of the invention relates to a method for synthesizing at least one of said sesquiterpenes, hereinafter the method of the invention, comprising: to. incubating the farnesyl pyrophosphate substrate with at least one polypeptide of the invention, a single polypeptide or a combination of polypeptides can be used according to their ability or activity to synthesize different sesquiterpenes, and depending on the sesquiterpene or combination of sesquiterpenes to be prepared, and
  • cyclic sesquiterpenes in which the acyclic farnesyl pyrophosphate (FPP) precursor is added to the reaction mixture containing the natural protein CsTPS3, or failing any of the modified polypeptides are also provided (CsTPS3-VB2, CsTPS3-VB5, CsTPS3-VC1 or CsTPS3-VC2), under reaction conditions that favor the formation of cyclic sesquiterpenes.
  • FPP farnesyl pyrophosphate
  • the average expert can easily identify and have at his disposal the conditions of the process of the invention that favor the formation of cyclic sesquiterpenes, being widely known and customary for any expert in the field of enzymes (eg buffers, cofactors, temperature , solvent, induction time, etc.) and in particular those referred to enzymes with sesquiterpene synthase activity, and which by way of example would include, among others, those explicitly specified in Example 4 of the present invention.
  • Such conditions will be suitable, for example, to produce the substrate binding to the active center responsible for the sesquiterpene synthase activity, to preserve the enzymatic function, etc.
  • the step of contacting the FPP with sesquiterpene synthases is performed in vitro, adding the crude protein extract containing the natural TPS CsTPS3 or any of the modified polypeptides to the reaction mixture containing the substrate FPP and magnesium as cofactor.
  • the sesquiterpenes produced by the methods of the invention include, but are not limited to ⁇ -cadineno, a-copaeno, ⁇ -copaeno, ⁇ -cubebeno, germacreno D and elemol (Fig. 2). In some cases, at least one of the major cyclic sesquiterpenes is ⁇ -cadinen, germacrene D or elemol.
  • citrus fruits the essential oils rich in terpenes accumulate in the flavedo (skin), and specifically inside the oil glands (multicellular secretory structures).
  • the flavedo is the outer and colored part of the skin of citrus fruits (exocarp), which consists of a protective cuticle and an epidermis formed by parenchymal cells that surround the oil glands.
  • Citrus essential oils are a mixture of different volatile compounds that are characterized by having a high content of hydrocarbon terpenes and relatively low amounts of oxygenated terpenes (Hógnadóttir and Rouseff, [2003] J. Chromatogr. A. 998, 201-21 1 ).
  • the organoleptic properties (taste and aroma) of citrus essential oils are the result of the combination of all of them.
  • composition of sesquiterpenes of the flavedo of oranges of the Navel variety was studied at different stages of the development of the fruit (green-immature, green-ripe, and ripe colored fruits), by analysis of gas chromatography coupled to the spectrophotometry mass (GC-MS) (Rodr ⁇ guez et al. [201 1]. Plant Physiol. 156, 793-802). To do this, the flavedo was mounted with the use of a sharp knife and immediately frozen in liquid nitrogen (N 2 ). The frozen flavedo was triturated in liquid N 2 with the help of a mortar hand until it formed a very fine powder.
  • GC-MS gas chromatography coupled to the spectrophotometry mass
  • the aqueous phase was extracted twice with 3 ml of pentane, each time recovering the organic phase in the same tube.
  • a 2 ⁇ ota aliquot of the organic phase was injected directly into the GC-MS for volatile analysis. At least two extractions and two independent injections were performed for each sample.
  • a Thermo Trace GC Ultra gas chromatograph coupled to a Thermo DSQ mass spectrophotometer with an electron ionization method (El) set to 70eV was used.
  • the ion source and transfer line were set at 200 and 260 ° C, respectively.
  • Volatile compounds were separated on an HP-INNOWax column (Agilent J&C Columns) 30 m long x 0.25 mm internal diameter x 0.25 ⁇ phase thickness. Column heating was programmed at 40 ° C for 5 min, increasing to 150 ° C at 5 ° C / min, and then at 250 ° C at 20 ° C / min, keeping at 250 ° C for 2 min. The temperature of injector was 220 ° C. As carrier gas, helium was used at a flow rate of 1.5 ml / min and the sample was injected without fragmentation. The mass spectrum produced by the impact of electrons was recorded at a speed of 0.5 / scan.
  • Volatile compounds were identified by approximation of the mass spectrum obtained with that corresponding to that of the compounds present in the reference libraries (Wiley6 and NIST), or by their identity with the standard compound.
  • the relative abundance of the volatile sesquiterpenes identified was calculated by integrating the area of the total ion chromatogram (TIC) peaks and normalizing the values with the recovery rate of the standard used as internal control (2-octanol).
  • composition of sesquiterpenes of the flavedo of Navel oranges Sesquiterpene analysis was performed on flavedo extracts using GC-MS. Sesquiterpenes were identified by coincidence of retention time (RT) and mass spectrum (MS) of the available standards, or by coincidence the mass spectrum of the compounds present in the reference libraries.
  • RT retention time
  • MS mass spectrum
  • the data correspond to the relative amounts of each sesquiterpene identified, represented in the form of percentage (%) of area with respect to the total area of the chromatogram peaks.
  • the results correspond to the average value of three biological replicates and their corresponding standard deviations.
  • Germacrene D 0.0135 ⁇ 0.0022 0.0279 ⁇ 0.0018 0.0153 ⁇ 0.0003 a-Muuroleno n.d. 0.0093 ⁇ 0.0024 0.0082 ⁇ 0.0010
  • the concentration of the total RNA solution was determined with an ND-1000 spectrophotometer (NanoDrop Technologies, Inc.). Total RNA quality was evaluated by the standardized 3% agarose denaturing gel electrophoresis method, visualizing the integrity of ribosomal RNA bands of different sizes.
  • the total RNA of the orange flavedo was used to synthesize polyadenylated RNA (poly (A) + RNA) using the MicroPoly (A) Purist TM (Ambion) system, following the manufacturer's instructions.
  • the integrity of the total poly (A) + RNA was verified by electrophoresis in a denaturing gel of 1.6% agarose.
  • Oligonucleotides designed on truncated EST sequences encoding a polypeptide with sesquiterpene synthase homology were used as primers in PCR reactions.
  • the oligonucleotides listed in Table 4 and the Advantage® -HF 2 PCR system (Clontech) were used as primers, following the manufacturer's instructions.
  • both oligonucleotides were added a unique restriction site at their 5 'end, both protected by two additional nucleotides.
  • the purified DNA fragment was cloned into the plasmid pCR ® 4Blunt-TOPO using the Zero Blunt ® TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen) system. 2 ⁇ of the ligation reaction was used to transform electrocompetent cells of the strain One Shot ® TOP10 (Invitrogen) of the Escherichia coli bacteria, following the manufacturer's instructions.
  • Plasmid DNA was isolated from the transformants using the Wizard ® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega) system, and the cDNA fragment of the cloned Cstps3 gene was sequenced using primers T3 (5'-ATTAACCCTCACTAAAGG-3 ') and T7 ( 5'-TAATACGACTCACTATAGGG- 3 '). The sequences obtained were analyzed using the Sequencher v4.9 software (Genes Codes Corporation, Ann Harbor, Michigan).
  • the consensus sequence was assembled using the "Assambly” algorithm of the Sequencher v4.8 software (Gene Codes Corporation, Ann Harbor, Michigan).
  • the consensus sequence predicted a cDNA with an open reading frame (ORF: Open Reading Frame) of 1695 nucleotides in length, encoding a 564 amino acid polypeptide.
  • ORF Open Reading Frame
  • nucleotide sequence assembled here could effectively correspond to the cDNA of an orange gene that encodes a new sesquiterpene synthase
  • primers were designed on the consensus sequence in order to amplify the ORF proposed here.
  • oligonucleotides listed in Table 4 as primers and as a single stranded cDNA prepared from the total RNA isolated from the flavedo of Navel oranges, a DNA fragment of the expected size (1695 bp) was amplified. The size of the amplified fragment was confirmed by electrophoresis on an agarose gel (1%).
  • the PCR product was cloned into the pCR ® 4Blunt-TOPO vector (Invitrogen), and the nucleotide sequence of the recombinant clone insert was determined. Sequence analysis confirmed that the cloned cDNA fragment effectively corresponded to the complete ORF of the Cstps3 gene isolated from the Navel orange flavedo, which was identified with the reference number SEQ ID NO: 1.
  • EXAMPLE 3 Sequence and phylogenetic analysis of orange tree cDNA encoding sesquiterpene synthase CsTPS3 (SEQ ID NO: 2)
  • the estimated PM of the CsTPS3 protein is consistent with that estimated for other vegetable sesquiterpene synthases, which supports our initial hypothesis that the PCR fragment isolated here corresponds to an OFR that encodes a complete protein.
  • the BLASTP analysis revealed that the deduced amino acid sequence of the CsTPS3 polypeptide (SEQ ID NO: 2) has similarity to germacrene D synthases (GerD) of other species of Rósidas, as well as to the GerD of kiwi (Asteracea).
  • the CsTPS3 polypeptide showed between 54-66% sesquiterpene synthase identity of the Tps-a subfamily (Bohlman et al., [1997] J. Biol. Chem.
  • the sesquiterpenes synthases of the Tps-a subfamily contain two structural domains: (/) an N-terminal domain with glycosyl hydrolase activity, and (// ' ) a C-terminal domain comprising the active site of the enzyme.
  • the conserved domains DDXXD, NSE / DTE and RXR that are present in all plant sesquiterpenes synthases are also conserved in the CsTPS3 polypeptide (Fig. 5).
  • the DDXXD and NSE / DTE domains are involved in the cooperative bond of three Mg +2 atoms that stabilize the pyrophosphate group of the FPP substrate.
  • the RXR domain is involved in the sequestration of the diphosphate group, so that it keeps it away from the hydrophobic cavity while promoting the formation of different highly reactive carbocations that are formed during catalysis.
  • the G 417 residue is conserved in the GerD of populus and kiwi, as well as in the GerB of C. creticus.
  • the last position of the tetrad is occupied by a serine residue (S 418 ) in the CsTPS3 polypeptide, while in the rest of the proteins present in the alignment they have a tyrosine residue (Y) conserved in said position.
  • S 418 serine residue
  • Y tyrosine residue conserved in said position.
  • the phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequence of the CsTPS3 protein (SEQ ID NO: 4) object of the invention with that of other sesquiterpene synthases with proven germacrene D and cadineno (Cad) synthase activity, groups the CsTPS3 with GerD of other species of Rósidas (Vitis vinefera, Rosa hybrid, Populus trichorcapa, and Cistus creticus,) and with the asterácea Actinia deliciosa (Fig. 6).
  • EXAMPLE 4 Biochemical characterization of Sesquiterpene Syntase activity: Heterologous expression of CsTPS3 protein in bacterial cells, Preparation of cell-free protein extracts and in vitro assay of Sesquiterpene Syntase activity
  • the catalytic activity of the CsTPS3 protein was tested in vitro using protein extracts prepared from cells of the bacterial strain Escherichia coli BL21 (DE3) carrying the coding region of the Cstps3 gene (SEQ ID NO: 1 ). which had previously been cloned into the expression vector pET45b (+). Protein extracts prepared from E. coli BL21 (DE3) cells transformed with the empty vector pET45b (+) were used as a negative control.
  • Recombinant plasmids pET45b (+) carrying the DNA encoding the new orange sesquiterpene synthase CsTPS3 (SEQ ID NO: 2) were selected in Luria-Bertani (LB) medium supplemented with ampicillin (50 ⁇ g / ml). Plasmid DNA extracted from recombinant clones was sequenced to verify the presence of the coding region of the Cstps3 gene (SEQ ID NO: 1) in the correct orientation and reading frame, before transforming an appropriate expression host. For the production of the CsTPS3 protein, as well as their respective mutant forms, the recombinant plasmids were transformed into the BL21 (DE3) expression cells (Novagen).
  • This strain is a ⁇ 3 bacteriophage lysogen, a ⁇ bacteriophage derivative that carries the bacteriophage 21 immunity region and a DNA fragment of the lacl gene, the lacUV5 promoter, and the T7 transposon RNA polymerase gene.
  • This fragment inserted into the int gene prevents the integration or excision of the chromosome DE3 lysogen in the absence of an assistant bacteriophage.
  • the only promoter that directs the transcription of the T7 RNA polymerase gene is the lacUV5 promoter, which is induced by adding IPTG to the culture medium.
  • the expression of the target gene fused in phase to the open reading frame of the T7 promoter is activated after induction of RNA T7 polymerase.
  • Ezymatic test I A colony of the bacterial strain (lysogen ⁇ 3) carrying the recombinant pET45 vector was inoculated in 10 ml of LB medium supplemented with 50 ⁇ g / ml carbenicillin, 34 ⁇ g / ml chloramphenicol and 0.5% glucose. The pre-inoculum was incubated overnight at 37 ° C with shaking (250 rpm). The culture was used to inoculate 100 ml of supplemented LB medium as described above, and grown at 37 ° C to a D0 6 or 0.6 . Induction was carried out after adding 1 mM of IPTG to the culture. Incubation was continued overnight at 18 ° C.
  • the cells were precipitated by centrifugation and resuspended in 1 ml of the SSAB buffer (100 mM sodium phosphate pH 7.0, 10 mM MgCI2, 1 mM DTT, 10% v / v glycerol; Prosser et al., [2002] Phytochemistry 60, 691-702).
  • the cells were lysed by three / five freeze / thaw cycles, followed by the addition of 7.5 KU of rLisozyme (Novagen) for each ml of the SSAB buffer.
  • the cell suspension was incubated at room temperature on a platform with low speed agitation for 15 min.
  • the DNA present in the lysate was digested with 25 U of Benzonase Nuclease (Novagen) for each ml of the SSAB buffer.
  • the cell suspension was incubated at room temperature and at low speed for 20 min until the viscosity completely disappeared. At this time the tubes were incubated on ice.
  • the cell debris was removed by centrifugation at 13,000 rpm for 30 min at 4 ° C. Crude protein extracts were used for in vitro testing of sesquiterpene synthase activity, using FPP (16 ⁇ g FPP / ml protein extract) as a substrate.
  • Enzymatic tests were carried out in glass vials with PTFE stopper using 500 ⁇ of crude lysate supplemented with 16 ⁇ g of FPP.
  • the reaction was covered with 500 ⁇ of pentane and the tubes were incubated overnight at 30 ° C. After the incubation period, volatiles were recovered from the pentane layer and extracted twice from the aqueous phase using 1 ml of pentane each time.
  • the pentane fractions were combined and concentrated to 50 [mu] - under nitrogen atmosphere, and finally analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrophotometry (GC-MS).
  • GC-MS mass spectrophotometry
  • Volatile compounds were separated on an HP-INNOWax column (30 mx 0.25 mm id x 0.25 ⁇ of film) (Agilent J&C Columns). The sample was injected without fragmentation and the oven was programmed as follows: 40 ° C for 5 min, subsequently the temperature was increased to 150 ° C at a rate of 5 ° C / min, and finally at 250 ° C for 2 min (at a rate of 20 ° C / min). The injector temperature was 220 ° C, and helium was used as the carrier gas at a constant flow of 1.5 ml / min.
  • the mass spectra were recorded in the range of 30-400 m / z with a scanning speed of 0.5 scans / s.
  • the identification of the compounds was made by coincidence of the acquired mass spectra and the retention rates (Rl) with those corresponding to that of the authentic patterns available, or with those sesquiterpenes present in the reference database (Wiley and NIST) .
  • Enzymatic assay II BL21 (DE3) cells carrying the recombinant pET45b vector expressing sesquiterpene synthase CsTPS3 or any of its modified versions were grown at 37 ° C in Terrific Broth medium (TB) supplemented with 50 ⁇ g / ml carbenicillin to a D0 6 oo of 0.6. Cells were induced with 1 mM IPTG for 16 h at 18 ° C. Bacterial cultures grown overnight and expressing recombinant proteins were centrifuged to collect the cells. The cells were resuspended in wash buffer (20 mM Tris-HCI, pH 7.0, 50 mM KCI) by vortexing, and subsequently centrifuged.
  • wash buffer (20 mM Tris-HCI, pH 7.0, 50 mM KCI
  • the cells were washed with 1 ml of protein extraction buffer (50 mM 3- (N-morpholino) -2-hydroxypropanesulfonic acid, pH 7.0, 10% [v / v] glycerol, 5 mM MgCI 2 , 5 mM DTT, 5 mM sodium ascorbate, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride), and then stirred, sonicated and centrifuged.
  • protein extraction buffer 50 mM 3- (N-morpholino) -2-hydroxypropanesulfonic acid, pH 7.0, 10% [v / v] glycerol, 5 mM MgCI 2 , 5 mM DTT, 5 mM sodium ascorbate, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride
  • the extraction buffer was changed by the enzyme assay buffer (10 mM 3- (N-morpholino) -2-hydroxypropanesulfonic acid, pH 7.0, 10% [v / v] glycerol, 1 mM DTT ) using PD-10 columns (GE Healthcare Life Sciences).
  • Enzymatic assays were carried out in glass vials with PTFE screw cap, using 500 ⁇ of crude lysate supplemented with 10 ⁇ g FPP, MgCI 2 (20 mM), and phosphatase inhibitors (0.2 mM NaW0 4 , 0.1 mM NaF) .
  • the reaction mixtures were covered with 500 ⁇ of hexane and the tubes were incubated overnight at 30 ° C.
  • hexane phase was stirred with the aqueous phase and after centrifugation it was used for metabolite analysis.
  • the hexane fractions were concentrated to 50 ⁇ under a nitrogen atmosphere and analyzed by gas chromatography coupled to mass spectrophotometry (GC-MS).
  • GC-MS mass spectrophotometry
  • the equipment used was a Hewlett Packard 6890 GC coupled to a selective mass detector (MSD) 5973 equipped with a 7683 multiple automatic injector, and equipped with an HP-5MS capillary column.
  • MSD selective mass detector
  • HP-5MS capillary column The injection was performed without fragmentation and the oven was programmed as follows: from 50 ° C (5 min wait) to 250 ° C (5 min wait) at 5 ° C / min a.
  • the injector temperature was 200 ° C and helium was used as a carrier gas with a constant flow of 1.5 ml / min.
  • the source temperature of ions and quadrupole were 250 and 150 ° C, respectively.
  • the mass spectrum after the impact of electrons was recorded in the range of 40-300 m / z.
  • the identification of the compounds was made by coincidence of the acquired mass spectra and the retention indexes (R1) with those corresponding to those of the authentic patterns available, or with those sesquiterpenes present in the NIST and MassFinder reference databases.
  • the abundance of each product detected was quantified by integrating the areas of each peak using the Enhanced Chemstation software version B.01.00 (Agilent Technologies).
  • Enzymatic assay I The results of the GS-MS analysis showed that the crude lysates of the bacterial cells expressing the recombinant protein CsTPS3, prepared according to enzymatic assay I, form as the main product ⁇ -cadinine (46.91%), in addition to other minor cyclic sesquiterpenes (Table 5 and Fig. 7A). The identification of the smallest peaks showed that these corresponded to the cyclic sesquiterpenes ⁇ -cubebeno (14.55%), germacrene D (1 1, 8%), a-copaene (9.65%), cubebol (7.1 1%), elemol (5.93%), and bicyclogermacrene (4.05%).
  • the CsTPS3 polypeptide (SEQ ID NO: 4), encoded by the Cstps3 cDNA (SEQ ID NO: 2), was classified as a ⁇ -cadineno synthase, based on the relative abundance of ⁇ -cadinine .
  • the designation of multifunctional sesquiterpene synthases based on their majority product is a general standard well known in the state of the art.
  • the molecular structure of the products formed by the CsTPS3 polypeptide is shown in Fig. 2.
  • the control corresponding to the BL21 cells (DE3) transformed with the empty pET45b vector did not produce any of the volatile compounds synthesized by the multifunctional enzyme CsTPS3, which demonstrates that the volatile sesquiterpenes identified in the extracts prepared from the cells that express the coding region of the Cstps3 gene (SEQ ID NO: 1), are the product of the catalytic activity of the CsTPS3 enzyme.
  • Enzymatic assay II When the cyclase activity of the CsTPS3 polypeptide was tested under the conditions of enzymatic assay II, a greater number of sesquiterpenes was identified (Table 6). This difference may be a consequence of the greater sensitivity of the GC-MS equipment used in this test.
  • the sesquiterpenes produced by the CsTPS3 polypeptide in enzyme tests I and II cannot be compared with each other, since the amount of recombinant protein added in each type of assay was not quantified.
  • SEQ ID NO: 2 the profile of Volatile sesquiterpenes produced by the CsTPS3 polypeptide (SEQ ID NO: 2) identified several sesquiterpenes, of which ⁇ -cadinine was the majority product (27.36%) (Table 6 and Fig. 8A).
  • ⁇ -cadineno was the majority product of the enzymatic activity of the CsTPS3 protein (SEQ ID NO: 2), it was classified as a ⁇ -cadineno synthase.
  • the molecular structure of sesquiterpenes produced by the CsTPS3 polypeptide is shown in Fig. 2.
  • Sesquiterpene%%%%% a-cubebeno 1.12 traces traces traces traces a-copaeno 19.60 1.66 traces traces traces ⁇ -cubebeno 14.30 - traces - - ⁇ -elemeno - 2.40 traces 3.43 3.96 a-gurjuneno traces - - 5.44 5.70
  • ⁇ - ⁇ -Caryophylene 1.48 1.63 traces traces traces a-humulene 3.58 2.71 traces - - germacrene D 9.36 2.01 traces 84.46 83.10 bicyclogermacrene 3.56 - - 2.53 2.91 a-muurolene 1.92 - - - - a-bulneseno 1 .69 1 .48 traces - - cubebol 4.42 1.07 traces - - ⁇ -cadineno 27.36 3.19 1.15 traces traces elemol 7.49 66.70 83.86 - - germacreno D-4-ol 1 .90 traces traces 2.12 2.40 bulnesol traces 15.48 11.44 - -
  • the resulting cationic intermediaries undergo several intramolecular rearrangements such as: cyclisations, changes of hydride groups (migration of a hydrogen atom in a carbocation to the carbon atom with +1 charge from an adjacent carbon), or conformational transitions, until the reaction culminates by the loss of protons or activated by the addition of a nucleophilic molecule (a chemical species such as a hydroxyl group that donates a pair of electrons to an electrophilic molecule to form a chemical bond).
  • a nucleophilic molecule a chemical species such as a hydroxyl group that donates a pair of electrons to an electrophilic molecule to form a chemical bond.
  • the structural diversity of the products formed by sesquiterpene synthases is due to the large carbon skeleton (glue tail) of the FPP and the presence of three bonds double.
  • the phosphate group is released forming the £, £ - farnesyl cation (cation franso / d-farnesil ), which may undergo a cyclization stage (ring closure 1 1, 1; route a in Fig. 9A) to generate the C1 1 humulil macrocyclic cation.
  • This can be deprotonated to form a-humulene (3.58% [Table 6]), or undergo a 2.10 ring closure, followed by detonation of C3 carbon to form ⁇ -cariophylene [Table 6].
  • the Z, £ -farnesil cation could undergo a 10.1 ring closure to form the 3Z, £ 7 -germacradienyl cation.
  • Direct detonation of the 3Z, £ 7 -germacradienyl cation would form the minor germacrene D product.
  • the hydroxylation of the 3Z E-germacradienyl cation in the C3 carbon would form the Germacrene D-4-ol (route c in Fig. 9A). Since germacranos are flexible molecules, the 3Z, £ 7 -germacradienyl cation could easily undergo further transformations through the interconversion of the chair conformations of their respective isomers.
  • Cadinenil cation generated by the CsTPS3 enzyme could suffer detonation in C7 and the subsequent formation of the double C6-C7 bond to generate ⁇ -cadinen as a major product (46.91% according to the results of the enzymatic test I [Table 5], and 27.36% according to Enzymatic assay II [Table 6]).
  • ⁇ -cubebeno one of the two most abundant by-products produced by CsTPS3 (14.55% [Table 5], and 14.30% [Table 6]), could be generated by migration of the hydrogen atom in C1 to C2 (migration of hydrogen 1, 2), followed by electrophilic closure in 1, 2 and detonation of the cationin cadinenil.
  • cadinenyl cation could also undergo other rearrangements (migration of hydrogen atoms, ring closure and oxidation) to form cubebol as a minor collateral product (4.42% according to enzymatic test II).
  • the cationic muurolenyl could undergo the migration of hydrogen 1, 2, followed by the formation of a bond between C2-C7 (ring closure 2.7) to generate a transient macrocycle from which it would be formed by detonation in C3 the collateral product a-copane (9.65% [Table 5], and 19.60% [Table 6]).
  • the cationic muurolenyl could be detoned to form the ⁇ -muurolene as a minor collateral product (1.92% [Table 6]).
  • residue Y 520 (Y 520 F) of TEAS, generates a modified TEAS that produces germacrene A and not 5-epi-aristoloquene as the final product (Rising et al., [2000] J Am Chem Soc. 122, 1861 - 1866). Therefore, residue Y 520 would prevent the exit of the germacrene intermediate A from the catalytic cavity of the TEAS protein, while residue Y 527 would be involved in activation of the germacrene A necessary for the formation of 5-ep / -aristoloqueno.
  • the mutagenesis analysis of the multi-product terpene synthase ZmTPS4 of corn showed that the first stages in the FPP transformation pathway until the formation of the monocyclic intermediate bisabolyl cation, are catalyzed in compartment I; while the secondary stages of cyclization until the formation of bicyclic sesquiterpenes takes place in compartment II (Kóllner et al., [2006] Arch Biochem Biophys. 448: 83-92).
  • the structural similarities of the different sesquiterpene synthases and their reaction products suggest that small changes in the geometry of the active center of the enzyme, due to differences in identity and spatial location of the Side chains of certain key amino acids are sufficient to alter the specificity of their reaction mechanisms.
  • the amino acid residues located in the layers surrounding the active site can also influence the conformation and product specificity of sesquiterpene synthases.
  • biotechnology through the use of recombinant DNA techniques and genetic engineering constitutes a powerful strategy to manipulate the catalytic activity of sesquiterpene synthases, allowing to increase the yield and / or specificity of certain sesquiterpenes of interest.
  • Materials and Methods The modified versions of the ⁇ -cadineno synthase (CsTPS3, SEQ ID NO: 2) object of the invention, were generated in vitro by directed mutagenesis.
  • modified cDNAs object of the invention encode modified polypeptides that contain specific substitutions in their amino acid sequence, with respect to the natural sequence of the orange ⁇ -cadineno synthase enzyme (CsTPS3, SEQ ID NO: 4).
  • CsTPS3, SEQ ID NO: 4 the QuickChange® II Site-direct and QuickChange® Multi Site-Direct Mutagenesis kits
  • Both types of systems allowed the introduction of specific mutations (point or multiple) in a single assay, in the nucleotide sequence of the cDNA encoding the natural polypeptide CsTPS3 (SEQ ID NO: 2), which had previously been cloned into the vector of pET45b (+) expression.
  • Both methods require the synthesis of modified oligonucleotides of 25-45 bases in length, which carry the mutation or mutations of interest and that will be used as primers in a single PCR reaction. The substitution of the desired bases should be located in the center of the oligonucleotide and with a correct sequence on both sides of 10-15 nucleotides.
  • Oligonucleotides used as primers for the cDNA mutagenesis of the Cstps3 gene (SEQ ID NO: 1) encoding the orange ⁇ -cadineno synthase (CsTPS3, SEQ ID NO: 2).
  • Table 2 shows the single and multiple amino acid substitutions that were introduced into the amino acid sequence of the natural polypeptide CsTPS3 (SEQID NO: 2), as a consequence of the base pair substitutions introduced into the natural nucleotide sequence of the cDNA of the Cstps3 gene (SEQ ID NO: 1) (Fig. 1A).
  • the nucleotide sequence of the mutated nucleic acid molecules object of the present invention, which encode modified variants of the orange ⁇ -cadinine synthase (CsTPS3, SEQ ID NO: 2) correspond to the VB2 versions (SEQ ID NO: 3; Fig .1 B), VB5 (SEQ ID NO: 5; Fig.
  • the mutated cDNA molecules encode modified polypeptides containing the unserved substitution S 418 H or C 455 G, or the conserved substitution S 416 T in combination with the unconserved substitutions G 417 T and S 418 Y (Fig. 3).
  • the high degree of similarity that has been found among hundreds of vegetable sesquiterpene synthases suggests that the catalytic activity of these enzymes is a direct consequence of protein folding.
  • Comparison of the sequence of vegetable sesquiterpene synthases has shown that their highly conserved motifs control cyclization reactions common to all of them, while variable regions contribute to differences in active site folding.
  • CsTPS3 The in silico modeling of the CsTPS3 polypeptide performed based on homology with the crystallized structure of the tobacco 5-ep / -aristoloquene synthase (TEAS, PBD: 5EAT; Starks et al., [1997] Science 277, 1815-1820) , showed that the CsTPS3 enzyme has in effect the typical folding of sesquiterpene synthase enzymes (Fig. 10).
  • Molecular modeling of orange ⁇ -cadineno synthase (CsTPS3) also revealed that most of the amino acids involved in the catalysis of the FPP substrate are highly conserved, and that they have a spatial arrangement almost identical to that corresponding to the TEAS model protein ( Fig. 11).
  • the amino acids of the tetrad 401 JJJY 404 I involved in the stabilization of the carbocationic intermediate through partial charges distributed locally in the catalytic cavity of the TEAS correspond to sequence 415 TSGS 418 in the CsTPS3 polypeptide (Figs. 5 and 11).
  • residues S 416 (T 402 in TEAS), G 417 (T 403 in TEAS), and S 418 (T 404 in TEAS) were modified by directed mutagenesis (Table 2).
  • the mutations introduced caused increase / and / or suppression of the performance of specific sesquiterpenes, compared to those produced by the natural enzyme CsTPS3 of orange.
  • residue C 455 located near the NSE / DTE motif; Fig.
  • the CsTPS3-VB2 polypeptide produced mostly elemol (77.49% [Table 5], 66.70% [Table 6]), in addition to guaiol (22.51% [Table 5]), or a discrete amount bulnesol (15, 48% [Table 6]) together with a small amount of ⁇ -cadinen (3.19% [Table 6]). Additionally, the CG substitution caused a drastic reduction in the rationalization of all minor collateral products formed by the natural enzyme ⁇ -cadineno synthase (CsTPS3) (Fig. 7 and 8, Tables 5 and 6). It is likely that the C 455 G substitution has affected the isomerization of Z, £ -germacradienyl cation (Fig.
  • the modified CsTPS3-VB5 polypeptide (SEQ ID NO: 6), which carries the C 455 G and S 418 H substitutions, produced elemol in an almost exclusive manner (87.78% [Table 5], 83.86% [ Table 6]).
  • the modified CsTPS3-VB5 polypeptide also produced a discrete amount of guaiol (12.22%, [Table 5]), or bulnesol (1 1.4%, [Table 6]) together with a small amount of ⁇ -cadinine (1 , 15% [Table 6]), and only traces of other collateral sesquiterpenes.

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Abstract

La presente invención se relaciona con un enzima natural sesquiterpeno sintasa de naranjo (CsTPS3) con actividad δ-cadineno sintasa, así como con las variantes de dicha enzima modificadas por la substitución de al menos un aminoácido que altera su actividad catalítica, transformándolas preferentemente en enzimas con actividad elemol sintasa o germacreno D sintasa. Son asimismo objeto de la presente invención, el ácido nucleico que codifica el enzima natural CsTPS3 así como las versiones modificadas derivadas de éste, además de las construcciones génicas, vectores de expresión y cepas bacterianas que los comprenden. La invención también se refiere al uso de estas enzimas para sintetizar sesquiterpenos, preferentemente δ-cadineno, elemol y germacreno D, y proporciona un método para la obtención de los mismos.

Description

NUEVAS SESQUITERPENO SINTASAS AISLADAS DE LA PIEL DE NARANJA
DESCRIPCIÓN
Sector de la técnica
La presente invención se relaciona con un enzima natural sesquiterpeno sintasa de naranjo (CsTPS3) con actividad δ-cadineno sintasa. Además, la invención se relaciona con una molécula natural de ácido nucleico aislada de la piel de frutos de naranjo (Citrus sinensis) que codifica la sesquiterpeno sintasa natural CsTPS3, con moléculas de ácidos nucleicos modificadas in vitro que derivan de la secuencia natural Cstps3, con sus respectivos enzimas codificadas sesquiterpeno sintasas modificadas, con métodos para preparar sesquiterpeno sintasas, y con las células bacterianas huésped que expresan los ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos de la invención. La presente invención se relaciona también con métodos para sintetizar sesquiterpenos. Por ejemplo, las sesquiterpenos sintasas objeto de la invención pueden usarse para convertir el precursor farnesil-pirofosfato (FPP) en varios sesquiterpenos bicíclicos que incluyen δ-cadineno, β-cubebeno, a-copaeno, germacreno D, α-cadineno y cubebol, y el sesquiterpeno monocíclico elemol con una alta actividad repelente de mosquitos.
Estado de la técnica anterior
Los terpenoides (isoprenoides) son importantes productos naturales, de los cuales se han identificado más de 30,000 compuestos en el reino vegetal. Entre ellos, los monoterpenos (C10) y sesquiterpenos (C15) son los principales constituyentes de los aceites esenciales de origen vegetal (Dewick, [2009] En Medicinal Natural Products, John Wiley & Sons Ltd, Chichester-West Sussex, pp 187-310; Fraga, [2006] Nat Prod Rep. 23, 943-972). Los sesquiterpenos son usualmente compuestos volátiles que pueden actuar como moléculas señales para la atracción de polinizadores y dispersores de semillas, depredadores de herbívoros o repelentes de plagas, además de tener un papel importante en la comunicación entre plantas (revisado por Gershenzon y Dudareva, [2007] Nat Chem Biol. 3, 408-414).
Las terpeno sintasas (TPS) son los enzimas responsables para la formación de la gran diversidad de terpenos identificados en el reino vegetal (revisado por Chen y col., [201 1] Plant J. 66, 212-219). Las sesquiterpeno sintasas convierten el substrato farnesil-pirofosfato (FPP) en diversos sesquiterpenos que pueden tener diferentes estructuras químicas. La mayoría de las TPS vegetales que se han caracterizado bioquímicamente son enzimas multicatalíticas y multiproducto con una alta promiscuidad y plasticidad de aminoácidos. Al parecer, varios aminoácidos localizados en el sitio activo y capas circundantes de las TPS multifuncionales actúan colectivamente para controlar la cascada en reacción que conduce a la formación de mezclas complejas de sesquiterpenos (Miller y Allemann, [2012] Nat Prod Rep. 29, 60-71 ).
Aunque han sido muchos los monoterpenos y sesquiterpenos que se han identificado en varias especies del género Citrus (revisado por Tadeo y col., [2008] Ad Bot Res 47, 147- 223), pocos han sido los genes y enzimas monoterpeno y sesquiterpeno sintasas que se han aislado y caracterizado bioquímicamente. Con respecto a las sesquiterpeno sintasas, el gen Cstpsi de naranjo (Citrus sinensis) el cual codifica una valenceno sintasa (CVS) (Sharon-Asa y col., [2003] Plant J. 36, 664-676), fue patentado por el Ministerio de Agricultura de Israel (WO 2005/021705, 10 de Marzo de 2005). Hasta la fecha, se han patentado otras monoterpeno y sesquiterpeno sintasas vegetales tales como: la E-a- bisaboleno sintasa, δ-selineno sintasa y γ-humuleno sintasa del abeto gigante Abies grandis (US 6451576, Washington State University Research Foundation, 17 de Septiembre de 2002); γ-curcumeno sintasa, (+)-germacreno A sintasa, (-)-germacreno D sintasas y pachoulol sintasas de pachouli (Pogostemon cablin) (WO 2005/052163, Firmenich S.A., 9 de June de 2005); sesquiterpeno sintasas multifuncional de Vetiveria zizanoides, que catalizan la formación de ciclocopacanfeno, (+)-ep/-p-santaleno, frans-a-bergamoteno, c/'s-a- bergamoteno, β-bisaboleno y/o frans-y-bisaboleno (WO 2006/134523, Firmenich S.A., 21 de Diciembre de 2006); germacreno D sintasa multifuncional del fruto del kiwi (WO2004/058814, The Horticulture and Food Research Institute of New Zealand Limited, 15 de Julio de 2004); santaleno sintasa (SSy) de las especies Santalum álbum (SaSSy), S. austrocaledonicum (SauSSy) y S. spicatum (SspiSSy) (WO 201 1/000026, 6 de Junio de 201 1 , The University of Western Australia, Forest Products Commission, University of British Columbia, y Joerg Bohlmann); y valenceno sintasas modificadas (WO 2012/058636, Allylix INC, 3 de Mayo de 2012).
La comercialización de los terpenos vegetales a nivel mundial alcanza los 20 billones de dólares anuales. La creciente demanda de terpenos de origen vegetal por la industria cosmética y perfumera, ha forzado la búsqueda de nuevas fuentes y la subsecuente aceptación de equivalentes sintéticos con menos olor y calidad. La síntesis química de terpenos (usando substancias pesadas), resulta en mezclas altamente complejas (productos colaterales e isómeros), los cuales requieren posteriormente de laboriosas y costosas etapas de purificación. Hasta la fecha no existe ningún método de síntesis química de terpenos que sea respetuoso con el medio ambiente y que además sea notoriamente eficiente. Por el contrario, existen diversos ejemplos que muestras como la biotecnología puede ser una estrategia económica y fiable frente a la síntesis química o la destilación convencional a partir de materias primas de origen vegetal (revisado por Krings y Berger, [2010] Nat Prod Commun. 5, 1507-1522). La tecnología del DNA recombinante y herramientas de biología molecular, la disponibilidad de base de datos de ácidos nucleicos y proteínas, así como el diseño de programas informáticos para el modelaje in silico y acoplamiento molecular de proteínas, han contribuido al rápido progreso de la biosíntesis de terpenos.
Además de su importancia biológica como señales químicas, los terpenos de origen vegetal tienen un inmenso valor comercial debido a su uso como fragancias en cosmética y perfumería, como aditivos organolépticos de alimentos y bebidas o para adicionar fragancias deseables a productos de limpieza. El uso de fitoaceites esenciales, así como de sus componentes en forma aislada (principalmente monoterpenos y sesquiterpenos), como repelentes de mosquitos transmisores de ciertas enfermedades tropicales infecciosas de alto riesgo, tales como: paludismo, dengue hemorrágico, fiebre amarilla, filariasis o fiebre del Nilo Occidental (West Nile Virus Infection WNV), les confiere además un gran interés médico y farmacéutico (revisado por Pohlit y col., [201 1 ] Planta Medica 77, 598-617). En septiembre de 2012, el mosquito doméstico del norte (Culex pipens), causó 2.636 casos de infección del WNV en el este de los Estados Unidos de América, produciendo 1 18 defunciones. Del total de casos detectados, el 53% mostraron complicaciones neuroinvasivas (meningitis y encefalitis) (http://www.cdc.gov/ncidod/dvbid/westnile/index.htm).
Los fitoaceites esenciales extraídos de citronela (Cymbopogon spp.), eucalipto (Eucalyotus L'Hér. spp), y albahaca (Ocimum spp), se han utilizado tradicionalmente como repelentes de mosquitos en la fabricación de velas, lociones, geles, aspersores y toallas higiénicas. No obstate, la eficiacia de estos productos como repelentes de insectos es cuestionable. Recientemente, 70 fitoaceites esenciales utilizados en diferentes patentes de formulas repelentes de mosquitos han sido objeto de revisiones exhaustivas (Nerio y col., [2010] Bioresour Techonol. 101 , 372-378; Pohlit y col., [201 1 ] Planta Medica 77, 618-630). En contraparte a los repelentes de insectos de origen vegetal, el ingrediente sintético activo presente en la mayoría de las formulas farmacéuticas que se comercializan como repelentes de mosquito hematófagos, es el DEET (Ά/,/V-dietil-m-toluamida). Sin embargo, su uso tiene ciertos inconvenientes, ya que tiene un olor desagradable y su aplicación cutánea puede resultar irritante, además de conferírsele ciertos efectos perjuicios para la salud, especialmente en niños. En este sentido, los repelentes e insecticidas de origen vegetal se consideran como una prometedora alternativa frente a los repelentes sintéticos, debido a su baja toxicidad y seguridad medioambiental (Katz y col., [2008] J Am Acad Dermatol. 58, 865- 871 ). Los consumidores, cada vez más conscientes de temas relacionados con la salud pública y seguridad ambiental, demandan formulas repelentes de insectos que no representen un peligro para su salud ni para el medio ambiente. Es por ello que las industrias farmacéuticas continúan trabajando en la búsqueda de formulas repelentes de insectos inocuas para la salud pública, y en mejorar las ya existentes mediante la incorporación de terpenos vegetales con una alta capacidad y amplio espectro de acción repelente.
Los fitoaceites ricos en sesquiterpenos, así como sus componentes purificados, que contienen radicales alcohol, aldehido, cetona o ácido, tienen un mayor interés científico debido a su mayor eficacia como repelentes naturales alternativos, que aquellos sintéticos que contienen DEET. Así, por ejemplo, el elemol y el β-eudesmol además de ser efectivos como larvicidas exhiben también una alta repelencia contra hembras mosquitos adultas (Coats y col., [2003] US Patente N° 6.524.605; [2005] US Patente N° 6.524.043; Schultz y col., [2004] Environ Entomol. 33, 1562-1569; Palauch y col., [2009] J Agri Food Chem. 57, 7618- 7625; Zhu y col., [2008] J Am Mosq Control Assoc. 24,161 -168). Recientemente, se ha demostrado que el elemol es un potente repelente de ninfas de la garrapa de patas negras (Ixodes scapularis), y de la garrapata estrella solitaria (Amblyomma americanum), transmisores de la enfermedad de Lyme y la Ehrlichiosis monocitotrópica humana, respectivamente (Carrol y col., [2010] Exp Appl Acarol. 51 , 383-392). Ensayos in vitro e in vivo han demostrado que concentraciones relativamente bajas de elemol son suficientes para repeler garrapatas y mosquitos (hembras adultas y larvas). Además, el hecho de que el elemol sea tan efectivo o más que la DEET (el repelente estándar utilizado para la comparación de la eficacia de los demás repelentes), apoya fuertemente su uso como un repelente eficaz para ser utilizado en formulas comerciales. En este sentido, existe un registro de una patente internacional (WO 2007/109736, lowa State University Research Foundation, 27th September 2007), relacionada con el diseño de mezclas de fitoaceites esenciales que contienen elemol, o fitoaceites y elemol, o elemol mezclado con estabilizadores, para ser utilizadas como repelentes del mosquito del norte (Culex pipens), vector de la fiebre amarilla (A. aegypti), y de la cucaracha común (Blattella germánica). En la actualidad, el elemol que se utiliza con fines comerciales se destila del aceite de citronela (C. winterianus) (http://gbffchina.en.alibaba.com/), y su comercio mundial es de 1 - 10 toneladas métricas por año (revisado por Bahtia y col., [2008] Food & Chemical Toxico!. 46, S147-S148.)- Un objetivo de la presente invención es proveer nuevas sesquiterpenos sintasas (TPS) capaces de catalizar la transformación del FPP en sesquiterpenos cíclicos basados en la estructura química del germacreno o elemeno. Es además un objetivo de esta invención, el proveer TPS modificadas capaces de sintetizar sesquiterpenos para los cuales no se ha aislado ninguna enzima de cítricos. En particular, es del objetivo de la presente invención proveer la forma de sintetizar el sesquiterpeno monocíclico oxigenado elemol, el cual tiene una potente actividad repelente de mosquitos, a través de la expresión de TPS modificadas in vitro derivadas de la TPS natural δ-cadineno sintasa aislada de la piel de frutos de naranja, objeto de esta invención. Breve descripción de la invención
La gran mayoría de los sesquiterpenos que se utilizan en cosmética y perfumería se extraen de plantas en forma de aceites esenciales (fitoaceites). El precio y disponibilidad de los fitoaceites depende en gran medida de la distribución geográfica de las especies vegetales utilizadas como materia prima para su extracción, así como de la abundancia y rendimiento de los mismos. Debido a la complejidad de su estructura, la síntesis química de los terpenos está limitada por sus laboriosos procesos y altos costes de producción. La baja abundancia de las terpeno sintasas vegetales y la elevada dificultad de purificarlas a partir de las mezclas de resinas y compuestos fenólicos, hace casi imposible aislar estos enzimas a partir de los tejidos que expresan los genes que las codifican. El constante incremento del conocimiento de las rutas de biosíntesis de terpenos, así como la caracterización bioquímica de la actividad de sus enzimas biosintéticos, ha abierto nuevas perspectivas para la producción biotecnológica de terpenos y garantizar la sostenibilidad del sector. El diseño de procesos bioquímicos para la producción de terpenos es, por lo tanto, de gran interés, pero requiere del aislamiento y manipulación mediante técnicas de ingeniería genética de las secuencias nucleotídicas que codifican terpenos sintasas.
Específicamente, la presente invención contempla: (/) moléculas naturales de ácidos nucleicos aisladas de la piel de naranjas que codifican una sesquiterpeno sintasa que cataliza la síntesis de sesquiterpenos cíclicos, (//') sesquiterpeno sintasas recombinantes, (//'/') vectores de expresión recombinantes en los cuales se han clonado las secuencias polinucleotídicas que codifican las sesquiterpeno sintasas objeto de la invención, (/V) células bacterianas que han sido transformadas con los vectores recombinantes objeto de la invención, y (v) métodos para la producción in vitro de sesquiterpenos cíclicos, incluyendo las etapas de introducción de los vectores recombinantes en las células bacterianas, en condiciones que aseguran la expresión de las secuencias nucleotídicas objeto de la invención, así como la inducción de la síntesis de las proteínas codificadas en las células bacterianas transformadas. En la presente invención también se describen los métodos utilizados para la modificación de la sesquiterpeno sintasa natural de naranjo objeto de esta invención, así como las versiones modificadas derivadas de ésta. Moléculas de DNA representativas de aquella TPS natural aislada del flavedo (piel) de naranjas objeto de la presente invención, fueron clonadas y secuenciadas, se dedujo su secuencia de aminoácidos y se ensayó in vitro su actividad enzimática. Específicamente, la secuencia nucleotídica natural aislada del flavedo de frutos de naranjo (Citrus sinensis) codifica el enzima δ-cadineno sintasa SEQ ID NO:2 (CsTPS3).
Además del enzima natural δ-cadineno sintasa de naranjo objeto de la presente invención, también se describe la obtención de versiones modificadas derivadas de ésta, las cuales están contempladas dentro de la protección de la invención, salvo en la medida en que estuviesen limitadas por el estado de la técnica. Los enzimas modificados objeto de esta invención, tienen una alterada especificidad y racionalización de productos. Ejemplo de estos, son aquellos enzimas modificados que producen mayores niveles relativos de germacreno D y pequeñas cantidades de β-elemeno y α-gurjuneno, o aquellas que producen mayores niveles de elemol en comparación con los correspondientes niveles producidos por la versión natural CsTPS3. Cabe destacar que el elemol es un potente repelente de mosquitos transmisores de enfermedades infecciones consideradas de alto riesgo para la salud pública, además de ser un ingrediente fragante muy utilizado en cosmética y perfumería.
En otros aspectos, está patente provee las células bacterianas que fueron transformadas con los vectores de expresión recombinantes en los cuales se clonaron las secuencias de DNA objeto de la invención. En este sentido, y de forma específica se proveen los plásmidos recombinantes que expresan la sesquiterpeno sintasa natural δ-cadineno sintasa (CsTPS3) de naranjo, así como las versiones modificadas que se derivan de ésta, en las cuales se han introducidos cambios de aminoácidos que alteran su actividad catalítica y/o especificidad de producto. Por lo tanto, microorganismos (células bacterianas) o plantas transgénicas que expresen las secuencias nucleotídicas que codifican las sesquiterpeno sintasas objeto de la presente invención, pueden usarse como biofactorías para la producción, aislamiento y purificación de cantidades significativas de los enzimas naturales δ-cadineno sintasa (CsTPS3) y de sus versiones modificadas, así como de los sesquiterpenos producto de su actividad catalítica.
Descripción de las figuras
Figura 1. Secuencia de DNA del gen Cstps3 (SEQ ID NO:1 ), y de las versiones mutantes derivadas de éste, y secuencia deducida de aminoácidos de los polipéptidos codificados. (A) Secuencia de DNA del gen Cstps3 (SEQ ID NO:1 ), y del polipéptido codificado (CsTPS3, SEQ ID NO:2). (B) Secuencia de DNA de la versión Cstps3-VB2 (SEQ ID NO:3), del polipéptido codificado (CsTPS3-VB2, SEQ ID NO:4). (C) Secuencia de DNA de la versión Cstps3-VB5 (SEQ ID NO:5), y del polipéptido codificado (CsTPS3-VB5, SEQ ID NO:6). (D) Secuencia de DNA de la versión Cstps3-VC1 (SEQ ID NO:7), y del polipéptido codificado (CsTPS3-VC2, SEQ ID NO:8). (E) Secuencia de DNA de la versión Cstps3-VC2 (SEQ ID NO:9), y del polipéptido codificado (CsTPS3-VC2, SEQ ID NO:10).
Figura 2. Estructura química de los sesquiterpenos volátiles emitidos por el flavedo de naranjas Navel. Algunos de ellos corresponden a los sesquiterpenos identificados como productos de la actividad catalítica de la sesquiterpeno sintasa natural CsTPS3 y sus versiones modificadas objetos de la invención.
Figura 3. Alineamiento múltiple de la secuencia deducida de aminoácidos de los polipéptidos CsTPS3 (SEQ ID NO:2), y de las versiones mutantes VB2 (SEQ ID NO:4), VB5 (SEQ ID NO: 6), VC1 (SEQ ID NO:8), y VC2 (SEQ ID NO:10). La secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido CSTPS3 se muestra en la parte superior del alineamiento. Los aminoácidos substituidos en cada una de las versiones mutantes están indicados. Los puntos representan aminoácidos idénticos entre los polipéptidos variantes y la secuencia natural CsTPS3.
Figura 4. Alineamiento múltiple de los ESTs truncados que comparten similitud con la secuencia nucleotídica Cstps3 que codifica la sesquiterpeno sintasa natural CsTPS3 de naranjo (C. sinensis var. Washington Navel) objeto de la invención. Se indican los oligonucleotidos utilizados como cebadores en ensayos de PCR para la amplificación de la secuencia codificante completa del gen Cstps3. Las letras blancas sobre fondo negro representan nucleótidos idénticos en la misma posición. Las letras sobre fondo gris representan nucleótidos diferentes en la misma posición. Los guiones representan huecos {gaps) en la secuencia de nucleótidos.
Figura 5. Alineamiento múltiple de la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido natural CsTPS3 (SEQ ID NO:2) y otras germacreno sintasas vegetales (Ger) filogenéticamente relacionadas. El alineamiento se realizó con el programa informático Expresso 3D Coffee (http://www.tcoffee.org/), utilizando como modelo la estructura cristalográfica de la 5-ep/-aristoloqueno sintasa de tabaco (TEAS. PDB: 5EAT [DOI:10.2210/pdb5eat/pdb]). Los aminoácidos absolutamente conservados se muestran sobre fondo negro, mientras que los residuos altamente conservados se muestran sobre fondo gris (pálido u obscuro). Los motivos conservados RRX8W, RXR, GVYFEP, DDX2D, NSE/DTE de las sesquiterpenos sintasas vegetales se indican sobre el alineamiento. AdGerD {Actinidia deliciosa GerD, AAAX16121 ), CcGerB {Cistus creticus GerB, ACF94469), Nt5EAS {Nicotiana tabacum TEAS, Q40577); PtdGerD {Populus tnchocarpa x deltoides GerD, AAR99061 ), RhGerD {Rosa hybrida GerD, BQ105086), y VvGerD {Vitis vinifera GerD, AAS66357). (Δ) Señala aminoácidos involucrados en la catálisis de la TEAS. Los residuos señalados con (T ) se mutagenizaron para conocer su papel en la actividad catalítica del enzima CsTPS3. (§) Señala aminoácidos que, en la misma posición, son diferentes en el polipéptido CsTPS3 en comparación al resto de los polipéptidos con actividad TPS utilizadas en el alineamiento.
Figura 6. Árbol filogenético de sesquiterpeno sintasas vegetales de la subfamilia TPS-a, incluyendo el polipéptido CsTPS3. El árbol se construyó mediante análisis de máxima verosimilitud {máximum likelihood analysis), utilizando la secuencia de aminoácidos de enzimas con actividad cubebeno (Cub), cadineno (Cad) y germacreno (Ger) sintasa. AaGerA {Artemisia annua GerA, AAX16121 ), AdGerD {Actinidia deliciosa GerD, AAAX16121 ), CcGerB {Cistus creticus GerB, ACF94469), CiGerA {Cichorium intybus GerA, AAM21658, CmGerD {Cucumis meló GerD, ABX83200), CsTPS3 {Citrus sinensis TPS3), Ga(+)-8-Cad {Gossypium arboreum (+)-8-Cad, CAA77191 ), Gh(+)-8-Cad {Gossypium hirsitum (+)-8-Cadineno, AAX44033), HaCad {Helianthus annuus Cad, AAY41422), IdGerA {Ixeris dentate GerA, AAL92481 ), LhGerB {Lycopersicum hirsitum GerB, AAG41891 ), LhGerD (/_. hirsitum GerD, AAG41892), LsGerA {Lactuca sativa GerA, AAM1 1627), Mg-p-Cub {Magnolia grandiflora β-Cub, ACC66281 ), MtTPS5 {Medicago truncatula TPS5, ABB01625), Ob(+)-GerD {Ocimum basilicum (+)-GerD, AAV63786), PcGerA {Pogostemon cablin GerA, AAS86321 ), Pc(-)-GerD {P. cablin (-)-GerD, AAS86320), Pt(-)-GerD {Populus trichorcapa x deltoids (-)-GerD, AAR99061 ), RhGerD {Rosa hybrida GerD, BQ105086), SaGerD {Santalum álbum GerD, ACF24768), ScGerA {Solidago canadiensis GerA, CAC36896), Sc(+)-GerD (S. canadiensis (+)-GerD, AAR31 14), Sc(-)-GerD (S. canadiensis GerD, AAR31 15), SIGerC {Solanum lycopersicon GerC, AAC39431 ), Vv(-)-GerD {Vitis vinifera (-)-GerD, AAS66357), y Zo(+)-GerD {Zingiber officinale (+)-GerD, AAX40665).
Figura 7. Perfil de sesquiterpenos volátiles producidos por la proteína CsTPS3, y cada una de sus versiones mutantes, en las condiciones del ensayo enzimático I. Los sesquiterpenos se identificaron mediante análisis de cromatografía de gases acoplada a la espectrofotometría de masas. Se muestran los sesquiterpenos volátiles identificados en ensayos enzimáticos en los cuales el substrato FPP se expuso a: (A) el polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2); (B) el polipéptido modificado CsTPS3-VB2 (SEQ ID NO:4); (C) el polipéptido modificado CsTPS3-VB5 (SEQ ID NO:6); (D) el polipéptido modificado CsTPS3-VC1 (SEQ ID NO:8); (E) el polipéptido modificado CsTPS3-VC2 (SEQ ID NO:10). El número sobre cada pico del cromatograma de gases indica el sesquiterpeno volátil identificado mediante espectrofotometría de masas. (F) Espectro de masas de cada uno de los sesquiterpenos identificados. Para cada pico se muestra el espectro de masas, el nombre común y el índice de retención calculado. Se muestra también, con fines comparativos y de autenticidad de los sesquiterpeno identificados, el espectro de masas de cada uno de los estándares de la librería de sesquiterpenos volátiles utilizada.
Figura 8. Perfil de sesquiterpenos volátiles producidos por la proteína CsTPS3, y cada una de sus versiones mutantes, en las condiciones del ensayo enzimático II. Los sesquiterpenos se identificaron mediante análisis de cromatografía de gases acoplada a la espectrofotometría de masas. Se muestran los sesquiterpenos volátiles identificados en ensayos enzimáticos en los cuales el substrato FPP se expuso a: (A) el polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2); (B) el polipéptido modificado CsTPS3-VB2 (SEQ ID NO:4); (C) el polipéptido modificado CsTPS3-VB5 (SEQ ID NO:6); (D) el polipéptido modificado CsTPS3-VC1 (SEQ ID NO:8); (E) el polipéptido modificado CsTPS3-VC2 (SEQ ID NO:10). El número sobre cada pico del cromatograma de gases indica el sesquiterpeno volátil identificado mediante espectrofotometría de masas. (F) Espectro de masas de cada uno de los sesquiterpenos identificados. Para cada pico se muestra el espectro de masas, el nombre común y el índice de retención calculado. Se muestra también, con fines comparativos y de autenticidad de los sesquiterpeno identificados, el espectro de masas de cada uno de los estándares de la librería de sesquiterpenos volátiles utilizada. Figura 9. Mecanismos de ciclización del FPP propuestos para explicar la especificidad de los sesquiterpenos cíclicos producidos por la actividad enzimática del polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2). Cada ruta de ciclización involucra la transformación del Z,£-germacradienil catión (A) o £,£-germacradienil catión (B). Se muestra el nombre de los intermediarios catiónicos macrocíclicos propuestos para cada ruta de ciclización. Las posibles rutas que conducen a la formación de múltiple productos se indican con letras minúsculas en negritas y entre paréntesis. Los productos finales de cada ruta se resaltan en negrita. (Δ) Calentamiento en el puerto de inyección. Las estructuras químicas se dibujaron con el programa informático ChemBioDraw Ultra 1 1 .0.1 (CambridgeSoft).
Figura 10. Estructura tridimensional (3D) del polipéptido CsTPS3. La simulación de la estructura de la proteína CsTPS3 se realizó utilizando como patrón la estructura 3D de la 5-ep/-aristoloqueno sintasa de tabaco obtenida mediante cristalografía de rayos X (TEAS, PDB código: 5EAT) (Starks y col., [1997] Science 277, 1815-1820). Los recuadros muestran un detalle del sitio activo la proteína CsTPS3. Las cadenas laterales de los aminoácidos que forman la cavidad catalítica, y los enlaces vecinos se representan con líneas. Asimismo, se indica la posición de los aminoácidos involucrados en la catálisis. La estructura 3D del polipéptido CsTPS3 se muestra impuesta sobre aquella de la TEAS formando un complejo con el substrato análogo farnesil hidroxifosfato (FHP). Las imágenes se obtuvieron mediante modelaje in silico utilizando el programa informático Discovery Studio v3.5 (Accelrys Software Inc.).
Figura 11. Detalle de la estructura 3D de la cavidad catalítica en el sitio activo del polipéptido CsTPS3, en comparación con el correspondiente sitio activo de la proteína 5-epi- aristoloqueno sintasa (TEAS, PDB código: 5EAT). La imposición del polipéptido CsTPS3 sobre la estructura 3D de la TEAS muestra las diferencias de identidad y localización espacial de las cadenas laterales de los aminoácidos dentro de la cavidad del sitio activo. La estructura 3D de la TEAS se muestra formando un complejo con el substrato análogo farnesil hidroxifosfato (FHP). Las fechas señalan los residuos de aminoácidos que difieren en identidad o localización espacial. Las imágenes se obtuvieron mediante modelaje in silico utilizando el programa informático Discovery Studio v3.5 (Accelrys Software Inc.).
Figura 12. Detalle de la estructura de la cavidad catalítica en el sitio activo de los polipéptidos modificados CsTPS3-VB2 (SEQ ID NO: 4) y CsTPS3-VC1 (SEQ ID NO: 8), en comparación con el correspondiente sitio activo de la proteína 5-ep/-aristoloqueno sintasa (TEAS, PDB código: 5EAT). La imposición de los polipéptidos CsTPS3-VB2 (A) o CsTPS3- VC1 (B) sobre la estructura 3D de la TEAS muestra las diferencias de identidad y localización espacial de las cadenas laterales de los aminoácidos reemplazados dentro de la cavidad del sitio activo. Las cadenas laterales de los aminoácidos que forman la cavidad catalítica, y los enlaces vecinos se representan con líneas. Los aminoácidos seleccionados para la mutagénesis dirigida del polipéptido CsTPS3 se representan en gris claro, mientras que los residuos substituidos en los polipéptidos modificados se muestran indicados con flechas. La estructura de los polipéptidos modificados se muestra solapada con la TEAS (aunque no se muestra en la imagen) formando complejo con el substrato análogo farnesil hidroxifosfato (FHP). Las imágenes se obtuvieron mediante modelaje in silico utilizando el programa informático Discovery Studio v3.5 (Accelrys Software Inc.).
Descripción detallada
A continuación se describe de forma minuciosa aspectos específicos de la presente invención, tales como los términos técnicos usados, las técnicas empleadas, los experimentos llevados a cabo y los resultados obtenidos. Asimismo, en el texto se hace referencia a las figuras adjuntas, las cuales forman a su vez parte de la invención, y tienen por finalidad ilustrar los conceptos discutidos y/o resultados obtenidos. Se entiende que aunque se realicen modificaciones o cambios estructurales en algunos aspectos de la invención, ello no implica la pérdida de la novedad ni de la protección de la invención. Por lo tanto, la descripción detallada de la invención, y el rango de protección de la presente patente no debe ser considerada en un sentido limitado. El rango de protección de la presente patente se subyuga a las reivindicaciones adjuntas, protegiendo en su totalidad todos y cada uno de los equivalentes a los cuales tales reivindicaciones dan derecho.
Primero se definen los términos científicos y técnicos empelados en la presente patente. A continuación, se describe la secuencia nucleotídica natural correspondiente a la región codificante del gen Cstps3 aislado del flavedo de frutos de naranjo, así como el polipéptido codificado (CsTPS3). Posteriormente, se describen las secuencias nucleotídicas modificadas in vitro que derivan de la secuencia natural Cstps3, así como los correspondientes polipéptidos variantes codificados. Por último se describe también de forma detallada los materiales y métodos y resultados obtenidos, como ejemplos específicos de la presente invención. Definición de términos Un "terpeno" es una molécula hidrocarbonada con una estructura química básica de cinco átomos de carbono llamada isopreno (C5H8), la cual puede ser cerrada (cíclica) o abierta (acíclica). Los terpenos incluyen entre otros δ-cadineno, a-copaeno, β-cubebeno, germacreno D, a-gurjuneno, β-elemeno y elemol. En este sentido, los términos "terpenos" y "terpenoides", se usan aquí para referirse a terpenos y terpenos derivados, incluyendo aquellos que han sufrido una o más etapas de modificación (hidroxilación, isomerización, oxido-reducciones, metilación o acilación). Tal como se usa aquí, el término "sesquiterpeno" se refiere a un terpeno formado por cinco unidades de isoprenos (Ci5), incluyendo aquellos que han sufrido una o varias etapas de modificación y/o funcionalización.
Tal como se usa aquí, el término "sesquiterpeno sintasa" se refiere a un enzima que cataliza, en presencia de magnesio y oxígeno molecular, la transformación del precursor acíclico farnesil-pirofosfato (FPP) en uno o más sesquiterpenos cíclicos o acíclicos. En este sentido, si una sesquiterpeno sintasa multifuncional (aquella que es capaz de producir más de un sesquiterpeno), produce β-copaeno como principal producto, el enzima recibe en consecuencia el nombre de β-copaeno sintasa. Según la invención, el producto principal o sesquiterpeno mayoritario puede obtenerse en función de las condiciones empleadas con una abundancia relativa de entre un 25% y un 100%, preferentemente de entre un 25% y un 90%, más preferentemente de entre un 45% y un 90%, aún más preferentemente de entre un 65% y un 90%, y aún todavía más preferentemente de entre un 75% y un 90%, respecto a la cantidad total de sesquiterpenos producidos. Del mismo modo, cuando la sesquiterpeno sintasa produce más de un sesquiterpeno, el sesquiterpeno o sesquiterpenos minoritarios se obtienen con una abundancia relativa inferior al 25%, preferentemente de entre un 1 % y un 25%, más preferentemente de entre un 2,5% y un 25%, más preferentemente de entre un 4% y un 23%, aún más preferentemente de entre un 8% y un 23%, y aún todavía más preferentemente de entre un 1 1 % y un 20%, con respecto a la cantidad total de sesquiterpenos producido.
El término "ácido nucleico" o "molécula de ácido nucleico" hace referencia a polímeros de deoxirribonucleotidos (nucleótidos) en la forma de una molécula de doble cadena (DNA: deoxyrribonucleic acid). Tal como usa aquí, el término "nucleótido" se refiere a la unidad monomérica del DNA, la cual está formada por una molécula de azúcar de cinco átomos de carbono (pentosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina [A], guanina [G], citosina [C] y timina [T]). El orden de los nucleótidos en la cadena principal del DNA determina el orden de los aminoácidos a lo largo de la cadena polipeptídica o proteína. Por lo tanto, la secuencia de DNA codifica la secuencia de aminoácidos de una proteína. Tal como se usa aquí, el término "secuencia de DNA codificante" (CDS: Coding DNA Sequence), se refiere a la porción de un gene (incluyendo únicamente los exones) que codifica una proteína integra (full length). La CDS integra de cualquier gen comprende la secuencia de nucleótidos entre el codón de inicio (ATG), en su extremo 5', y el codón de parada (TAG, TAA o TGA), en el extremo 3'.
Tal como se usa aquí, el término "aminoácido" se refiere a moléculas naturales (H2NCHRCOOH) que contienen un grupo amida (-NH2) y uno carboxílico (-COOH), además de una cadena lateral (R) que es específica de cada aminoácido. Los veinte (20) aminoácidos naturales combinados en la forma de cadenas polipeptídicas, forman las unidades básicas del conjunto de proteínas (proteoma) de un organismo. Los aminoácidos se identifican mediante una nomenclatura internacional establecida por la IUPAC (International Union oí Puré and Applied Chemistry), tal como aparecen en la Tabla 1.
TABLA 1
Código de Código de Código de Código de
Aminoácido Aminoácido
una letra tres letras una letra tres letras
Alanina A Ala Metionina M Met
Cisteina C Cys Asparagina N Asn
Ácido aspártico D Asp Prolina P Pro
Ácido Glutámico E Glu Glutamina Q Gln
Fenilalanina F Phe Arginina R Arg
Glicina G Gly Serina S Ser
Histidina H His Treonina T Thr
Isoleucina I lie Valina V Val
Lisina K Lys Tirosina Y Tyr
Leucina L Leu Triptofano w Trp
Tal como se utiliza aquí, el término "oligonucleotidos" se refiere a secuencias cortas o polideoxiribonucleotidos de cadena sencilla, que se utilizan como cebadores para la amplificación de fragmentos específicos de DNA mediante ensayos de PCR (Polymerase Chain Reaction), ampliamente conocidos en estado de la técnica. Los oligonucleotidos se sintetizan de forma química, y se purifican mediante diferentes métodos, los cuales incluyen el uso de cartuchos de fase inversa, HPLC (High Performance Liquid Chromatography), o geles de poliacrilamida. Tal como se utiliza aquí, el término "porcentaje de identidad" se refiere al porcentaje de aminoácidos que en una comparación de dos o más proteínas ocupan la misma posición relativa a lo largo del alineamiento. El término porcentaje de similaridad usado aquí es una medida estadística del grado de parentesco de dos o más secuencias de proteínas, basadas en las propiedades químicas de cada grupo de aminoácidos comparados a lo largo de las secuencias. Ambos parámetros, el porcentaje de identidad y el de similaridad, se calculan mediante programas informáticos que asignan un valor numérico a cada grupo de aminoácidos comparados a lo largo de la secuencia de proteínas alineadas. La similaridad deja margen para la variación conservativa, esto es la sustitución de un residuo hidrofóbico tal como isoleucina, valina, leucina o metionina aminoácidos por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, tales como arginina por lisina, ácido glutámico por aspártico, or glutamina por asparagina. La sustitución intencionada de un aminoácido puede hacerse en base a similitud en polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad y/o la naturaleza anfipática de los residuos siempre que se conserve la actividad biológica del polipéptido. En una realización preferente, los porcentajes de homología indicados en el presente documento se refieren a porcentajes de identidad de secuencia. Por ejemplo la identidad de secuencia de aminoácidos en tanto por ciento (%) con respecto a una secuencia de referencia particular, puede ser el porcentaje de residuos de aminoácido en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácido en la secuencia de referencia. Si fuese necesario, pueden introducirse huecos en las secuencias alineadas para conseguir el máximo porcentaje de identidad de secuencia, sin que por ello sean considerados substituciones conservativas de la identidad de secuencias.
El término "molécula de ácido nucleico modificada" tal como se usa aquí, se refiere a una molécula de DNA que tienen diferencias en su secuencia de deoxiribonucleotidos (deleciones, inserciones, transiciones y transversiones) con respecto a la molécula natural o salvaje (wild type). En consecuencia, tales cambios o "mutaciones" son transmitidos a las proteínas codificadas en la forma de aminoácidos substituidos, delecionados o añadidos (inserciones). La mutación puede no tener efecto sobre la actividad enzimática de la proteína mutada, o por el contrario puede incrementarla, reducirla o aniquilarla por completo. En otros casos, el aminoácido remplazado corresponde a una substitución conservativa o no conservativa. Por ejemplo, el cambio de un aminoácido hidrofóbico por uno hidrofílico (cargado o polar) en el sitio activo de una proteína o en capas circundantes podría afectar la actividad de la proteína. Tales modificaciones pueden introducir en una molécula de ácidos nucleicos mediante técnicas conocidas con el nombre de mutagénesis dirigida (site-directed mutagenesis). Para tal fin, existen diversos kits comerciales basados en técnicas de PCR, tales como los sistemas de mutagénesis dirigida simple o múltiple de Stratagen. Estos sistemas permiten generar mutaciones simples o múltiples de forma simultánea en una secuencia de nucleótidos dada, la cual se ha clonado previamente en un plásmido o vector de expresión, sin la necesidad de llevar a cabo posteriores subclonajes o la generación de fagémidos de cadena sencilla. Ambos métodos requieren el uso de oligonucleotidos específicos que contienen la mutación deseada y varios nucleótidos a cada lado que aparen perfectamente con la secuencia diana. De esta forma el oligonucleotido que lleva la mutación, y el cual hace las funciones de cebador, puede hibridar con la secuencia de DNA diana que se utiliza como molde para la síntesis mediante una reacción de PCR de secuencias de DNA que llevaran la mutación deseada en la posición seleccionada.
El término "vector de expresión" tal como se utiliza aquí, se refiere a un plásmido (molécula circular de DNA de doble cadena capaz de replicarse de forma autónoma e independiente del DNA genómico de la cepa bacteriana huésped), el cual contiene elementos reguladores (promotores, operadores y/o potenciadores) que controlan la expresión de una secuencia de DNA foránea que codifica el polipéptido de interés. Ya que los vectores de expresión son por lo general plásmidos relativamente pequeños que pueden estar hasta cientos de copias por célula bacteriana (plásmidos multicopia), la inducción de la expresión de la secuencia de DNA foráneo garantiza la rápida acumulación de altos niveles de transcritos (moléculas de RNA mensajero) y por ende de la proteína codificada.
Como se usa aquí, el término "célula transformada", "transformada" y "transformación" se refieren a la introducción por diferentes métodos (químico o electroporación) bien conocidos en el estado de la técnica, de plásmidos o plásmidos recombinantes en una célula aquí llamada "célula huésped". Esta puede ser una célula procariota tal como las diferentes cepas de la bacteria Escherichia coli (TOP10, Novablue, BL21 [DE3]pLysS, etc).
Descripción detallada de la invención La presente invención describe una secuencia nucleotídica natural correspondiente a la secuencia codificante de un gen aquí aislado del flavedo (piel) de frutos de naranjo (Citrus sinensis) de la variedad Navel. Dicha secuencia codifica una TPS multiproducto que cataliza la síntesis varios sesquiterpenos cíclicos. Moléculas de cDNA representativas del mencionado gen fueron secuenciadas y se dedujo la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. En este sentido, la presente invención se relaciona en primera instancia con: (a) Una secuencia polinucleotídica correspondiente a un gen de naranjo, referido en lo sucesivo como Cstps3, que comprende la secuencia mostrada en la Fig. 1A (SEQ ID NO:1 ), la cual codifica un polipéptido, en adelante CsTPS3, con una actividad mayoritaria δ-cadineno sintasa, que tiene la secuencia deducida de aminoácidos mostrada en la Fig. 1 B (SEQ ID NO:2).
En la presente invención, también se describen moléculas de ácidos nucleicos mutadas in vitro (variantes), que codifican polipéptidos modificados que contienen al menos un cambio de aminoácido con respecto al secuencia polipeptídica natural de la proteína CsTPS3 (SEQ ID NO:2) (Tabla 2). En este sentido, la presente invención provee moléculas de ácidos nucleicos modificadas que contienen:
(b) Cambios en la secuencia de nucleótidos de la molécula natural de DNA identificada como SEQ ID NO:1 (Cstps3), que se traducen en cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido codificado. Ejemplo de tales moléculas de DNA modificadas son aquellas identificadas como SEQ ID NO:3 (Fig. 1 B), SEQ ID NO:5
(Fig. 1 C), SEQ ID NO:7 (Fig. 1 D), y SEQ ID NO:9 (Fig. 1 E).
La invención además provee sesquiterpeno sintasas modificadas que contienen cambios de aminoácidos con respecto a la secuencia polipeptídica natural del polipéptido CsTPS3. Entre los polipéptidos modificados se proveen aquellos que contienen:
(c) Cambios (substituciones) simples o múltiples de aminoácidos con respecto a la secuencia polipeptídica natural del polipéptido CsTPS3 identificado con la referencia SEQ ID NO:2. En un sentido más específico, las sesquiterpeno sintasas modificadas codificadas por las moléculas de ácidos nucleicos mutadas in vitro provista aquí son aquellos polipéptidos modificados que:
(d) Contienen el reemplazamiento C455G (en lo sucesivo versión VB2, identificada como SEQ ID NO:4), o una combinación de las substituciones S418H y C455G (S418H/C455G) (versión VB5, identificada como SEQ ID NO:6), o una combinación de los reemplazamientos de aminoácidos S416T/G417T/S418Y (en lo sucesivo versión VC1 , identificada como SEQ ID NO:8), o una combinación de los reemplazamientos de aminoácidos S416T/G417T/S418Y/S422A (en lo sucesivo VC2, identificada como SEQ ID NO:10), numerados de acuerdo a las posiciones relativas de la SEQ ID NO:2. Por ejemplo para la versión modificada CsTPS3-VB2 la molécula de ácido nucleico provista aquí codifica una CsTPS3 modificada que contiene el reemplazamiento de aminoácido C455 que es C455G (Fig. 3).
TABLA 2
Lista de reemplazamientos simples y múltiples introducidos en el polipéptido natural CsTPS3 (SEQ ID NO:2), como consecuencia de substituciones de pares de base (transiciones y/o transversiones) introducidas en la secuencia de nucleótidos de la región codificante integra del gen Cstps3 (SEQ ID NO:1 )
Versión SEQ ID NO mutada
Mutaciones introducidas en CsTPS3 - mutante cDNA Polipéptido
B2 C455G 3 4
B5 S416H/C455G 5 6
VC1 S416T/G417T/S418Y 7 8
VC2 S416T/G417T/S418Y/S422A 9 10
Las sesquiterpenos sintasas modificadas provistas aquí tienen una actividad catalítica alterada. El efecto de los cambios de aminoácidos introducidos en la secuencia polipeptídica de las proteínas modificadas fue tal que alteró la especificidad y/o la distribución/racionalización de los productos (es decir, alteración de las cantidades y/o tipos de sesquiterpenos producidos), comparado a la actividad de la sesquiterpeno sintasa natural CsTPS3 identificada como SEQ ID NO:2. Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido, en la presente memoria referido como polipéptido de la invención, que presenta actividad sesquiterpeno sintasa y comprende una secuencia con al menos un 90% de identidad, preferentemente con al menos un 95%, y más preferentemente con al menos un 98%, y aun más preferentemente con al menos un 99% de identidad, a SEQ ID NO:14. Dicha actividad sesquiterpeno sintasa del polipéptido SEQ ID No:14 es, preferentemente, al menos una seleccionada del grupo compuesto por: actividad δ-cadineno sintasa, actividad elemol sintasa y actividad germacreno D sintasa.
SEQ ID NO:14 consiste en una secuencia polipeptídica en donde:
el aminoácido en posición 416 se selecciona independientemente entre Thr o Ser; el aminoácido en posición 417 se selecciona independientemente entre Thr o Gly; el aminoácido en posición 418 se selecciona independientemente entre Ser, Hys o Tyr, y preferentemente es Ser o Tyr;
el aminoácido en posición 422 se selecciona independientemente entre Ser o Ala, y preferentemente es Ser; y
- el aminoácido en posición 455 se selecciona independientemente entre Cys o Gly; y comprende la secuencia de la proteína CsTPS3 aislada de naranjo o de uno de sus mutantes con actividad sesquiterpeno sintasa.
En particular, dicha proteína CsTPS3 aislada de naranjo tiene actividad mayoritaria δ-cadineno sintasa, y consiste en la secuencia SEQ ID NO:2, que corresponde a la secuencia SEQ ID NO:14 en donde: el aminoácido en posición 416 es Ser, el aminoácido en posición 417 es Gly, el aminoácido en posición 418 es Ser, el aminoácido en posición 422 es Ser, y el aminoácido en posición 455 es Cys. No obstante, siendo considerada una δ- cadineno sintasa y que es capaz de producir preferentemente entre un 25% y un 50% de δ- cadineno en determinadas condiciones, respecto a la cantidad total de sesquiterpenos producidos por dicha sintasa, el polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2) corresponde a un enzima multiproducto que puede utilizarse también para la preparación de otros sesquiterpenos cíclicos tales como el a-copaeno, β-cubebeno, germacreno D, y elemol, además del δ-cadineno (Fig. 2).
En una realización preferida, el polipéptido comprende una secuencia que tiene al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO:2, o con la SEQ ID NO:2 modificada con al menos una susbstitución en un aminoácido que altera la actividad sesquiterpeno sintasa y/o especificidad de producto. Dicha susbtitución se selecciona preferentemente entre al menos una del grupo compuesto por:
a. una substitución de la cisteína en posición 455 por glicina (C455G), y
b. una triple substitución de la serina en posición 416 por treonina, de la glicina en posición 417 por treonina, y de la serina en posición 418 por tirosina
(S416T/G417T/S418Y)
No obstante, aparte de la substitución anterior, la SEQ ID NO:2 modificada opcionalmente puede comprender además otra substitución en un aminoácido de su secuencia, también para alterar la especificidad y/o la distribución/racionalización de los sesquiterpenos que produce, y que se selecciona entre:
a. una substitución de la serina en posición 418 por histidina (S418H), cuando la SEQ ID
NO:2 comprende la substitución C455G, o b. una substitución de la serina en posición 422 por alanina (S A), preferentemente cuando la SEQ ID NO:2 comprende la triple substitución S416T/G417T/S418Y.
Se ha comprobado que cuando el polipéptido de la invención comprende la secuencia SEQ ID NO:2 modificada con la substitución C455G, presenta mayoritariamente actividad elemol sintasa, que puede incrementarse aún más cuando la substitución adicional S418H. Así, en un ejemplo preferido y en determinadas condiciones, es capaz de producir elemol con una abundancia relativa, preferentemente en un intervalo comprendido entre el 65% y el 90%, y más preferentemente entre el 65% y el 85% ó entre el 75% y el 90%, respecto a la cantidad total de los distintos sesquiterpenos producidos con dicho polipéptido.
Además, también se comprobó que cuando el polipéptido de la invención comprende la secuencia SEQ ID NO:2 modificada con la triple substitución S416T/G417T/S418Y, éste presenta mayoritariamente actividad germacreno D sintasa. Y de hecho, en un ejemplo preferido y en determinadas condiciones, es capaz de producir germacreno D con una abundancia relativa, preferentemente en un intervalo comprendido entre el 75% y el 80%, y más preferentemente entre el 75% y el 80% ó entre el 80% y el 85%, respecto a la cantidad total de los distintos sesquiterpenos producidos con dicho polipéptido. En otra realización preferida de este aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones anteriores, y dependiendo de la actividad catalítica deseada, el polipéptido de la invención comprende una secuencia que se selecciona del grupo compuesto por: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:18. El polipéptido de secuencia SEQ ID NO:16 tiene actividad elemol sintasa, es decir, es una elemol sintasa, que consiste en la secuencia polipeptídica natural SEQ ID NO:2 del polipéptido CsTPS3 modificada al menos con la substitución de la Cys en posición 455 por Gly (C455G), y en el que el aminoácido 418 de su secuencia es Ser o His, y más preferentemete es His.
El polipéptido de secuencia SEQ ID NO:18 tiene actividad germacreno D sintasa, es decir, es una germacreno D sintasa, que consiste en la secuencia polipeptídica natural SEQ ID NO:2 del polipéptido CsTPS3 modificada al menos con la triple substitución S416T/G417T/S418Y, y en el que el aminoácido 422 de su secuencia es Ser o Ala, y más preferentemete es Ser. En otra realización preferida de este aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones anteriores, el polipéptido es una sesquiterpeno sintasa seleccionada del grupo compuesto por: la δ-cadineno sintasa CsTPS3 que consiste en SEQ ID NO:2, la elemol sintasa VB2 que consiste en SEQ ID NO:4, la elemol sintasa VB5 que consiste en SEQ ID NO:6, la germacreno D sintasa VC1 que consiste en SEQ ID NO:8 y la germacreno D sintasa VC2 que consiste en SEQ ID NO:10.
Otro aspecto de la invención se refiere a un ácido nucleico o polinucleótido que comprende una secuencia que codifica un polipéptido de la invención, según uno cualquiera de los definidos anteriormente. A lo largo de la presente memoria, dicho ácido nucleico o polinucleótido, así como en cualquiera de sus realizaciones preferidas que se indican a continuación, puede también encontrarse indistintamente referido como "ácido nucleico de la invención" o "polinucléotido de la invención". Preferentemente, el ácido nucleico de la invención codifica un polipéptido de secuencia SEQ ID NO: 13. Y más preferentemente, codifica un polipéptido de secuencia SEQ ID NO:2 ó SEQ ID NO:2 modificada con al menos una susbstitución en un aminoácido que altera la actividad sesquiterpeno sintasa y/o especificidad de producto, como se definieron anteriormente.
En una realización preferida, cuando el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:2 correspondiente a la sesquiterpeno sintasa natural CsTPS3, consiste en un polinucleótido que comprende SEQ ID NO:1.
En otra realización preferida, cuando el ácido nucleico codifica un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:2 modificada, consiste en un polinucleótido que comprende SEQ ID NO:1 con al menos una mutación en su secuencia seleccionada del grupo compuesto por:
a. una transversión T→G en la posición +1363 con respecto al codón de inicio (ATG) de SEQ ID NO:1 ; y
b. un grupo de sustituciones de los nucleótidos T→A/G→A/AGC→TAT en las posiciones +1246/1249/1252-1254 con respecto al codón de inicio (ATG) de SEQ ID
NO:1 .
En una realización preferida de la anterior, el ácido nucleico comprende otra mutación adicional en el polinucleótido de secuencia SEQ ID NO:1 que se selecciona entre: a. una transversión/transición AG→CA en las posiciones +1252/1253 con respecto al codón de inicio de SEQ ID NO:1 , cuando SEQ ID NO:1 comprende la transversión T→G; y
b. una transversión T→A en la posición +1264 con respecto al codón de inicio de SEQ ID NO:1 , cuando SEQ ID NO:1 comprende el grupo de sustituciones
T→A/G→A/AGC→TAT.
Y en una realización más preferida de la anterior, el ácido nucleico comprende la secuencia SEQ ID NO:15, que comprende dicha transversión T→G en posición +1363 y dicha transversión/transición AG→CA en posiciones +1252/1253; o la secuencia SEQ ID NO:17, que comprende dicho grupo de sustituciones T→A/G→A/AGC→TAT en posiciones +1246/1249/1252-1254 y dicha transversión T→A en posición +1264.
En otra realización preferida de este aspecto de la invención, el ácido nucleico comprende al menos una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo formado por: SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8. Y preferentemente, consiste en SEQ ID NO:1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8.
Otro aspecto de la invención se refiere a una construcción génica que comprende al menos un ácido nucleico de la invención, como cualquiera de los definidos anteriormente.
En la presente invención también se proveen los vectores que contienen las moléculas de ácidos nucleicos descritas aquí, constituyendo así otro aspecto de la presente invención. Los vectores incluyen plásmidos (moléculas circulares de DNA de doble cadena autoreplicables) para la expresión heteróloga de proteína eucariotas en células bacterianas. También se proveen en otro aspecto de la invención, las células o cepas bacterianas que contienen dichos vectores. Las células bacterianas provistas aquí pueden cultivarse para inducir la expresión de la secuencia natural Cstps3, o en su defecto de alguno de sus derivados modificados (mutados), y por consiguiente la síntesis del polipéptido natural CTPS3, o en su defecto del polipéptido modificado correspondiente (CsTPS3-VB2, CsTPS3- VB5, CsTPS3-VC1 o CsTPS3-VC2).
En otro aspecto, la invención hace referencia a un método para obtener un polipéptido de la invención con actividad sesquiterpeno sintasa, el cual comprende cultivar una célula bacteriana transformada con un ácido nucleico de la invención, o con una construcción génica o un vector recombinante que lo comprenda, según se definieron anteriormente, en condiciones adecuadas para favorecer o inducir la expresión de dicho ácido nucleico. De manera general, el método de inducción utilizado depende en cierta medida del tipo de vector de expresión utilizado, que como regla general en el caso de vectores comerciales es indicado por el fabricante. Asimismo, con la finalidad de conseguir las mejores condiciones de cultivo y de inducción posibles para cada tipo de proteína que se quiera expresar, se pueden modificar otras variables tales como temparatura, tiempo de inducción, medio de cultivo utilizado, etc. En lo que se refiere a la expresión de proteínas del tipo sesquiterpeno sintasa en bacterias, las condiciones de crecimiento e inducción son bastante conocidas y están disponibles para el experto medio en el estado de la técnica, y pueden variarse a juicio y deseo del especialista o técnico en cuestión.
Otro aspecto de la invención hace referencia al uso del polipéptido de la invención para la síntesis, preferentemente in vitro, de sesquiterpenos. Según la presente invención, el polipéptido de la invención permite sintetizar un sesquiterpeno que se selecciona entre al menos uno del grupo compuesto por: α-cubebeno, a-copaeno, β-cubebeno, β-elemeno, a- gurjuneno, Ε-β-cariofileno, α-humuleno, germacreno D, biciclogermacreno , α-muuroleno, a- bulneseno, cubebol, δ-cadineno, elemol, germacreno D-4-ol, bulnesol, guaiol y una combinación cualquiera de dos o más de los anteriores. Más preferentemente, el sesquiterpeno que se sintetiza es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: δ- cadineno, elemol y germacreno D, o una combinación cuaquiera de dos o más de los anteriores.
En particular, y como se mencionó anteriormente, la δ-cadineno sintasa CsTPS3 (SEQ ID NO:2) por una parte puede utilizarse en la síntesis δ-cadineno y también de otros sesquiterpenos cíclicos tales como a-copaeno, β-cubebeno, germacreno D , y/o elemol. Por otra parte, las TPS modificadas producto de la invención pueden usarse para mejorar la producción y/o la biosíntesis de elemol, germacreno D, α-gurjuneno, biciclogermacreno, guaiol, bulnesol y β-elemeno, incrementando la distribución de estos sesquiterpenos en comparación a la cantidad relativa de δ-cadineno, β-cubebeno, cubebol y a-copaeno, productos principales de la actividad catalítica de la proteína natural de referencia CsTPS3. Este hecho puede resultar en métodos para incrementar la producción y/o la pureza del elemol, germacreno D, α-gurjuneno y biciclogermacreno, guaiol, bulnesol y β-elemeno, incrementando la recuperación de estos sesquiterpenos cíclicos del medio de reacción. Ejemplo de ello, son aquellos polipéptidos modificado que generan como producto principal elemol, además de una pequeña parte de guaiol y bulnesol, y solo trazas de a-copaeno, germacreno D, δ-cadineno, en comparación con la abundancia relativa de estos sesquiterpenos producidos por polipéptido natural CsTPS3 (SEQ ID NO:2) bajo las mismas condiciones. Ejemplo específico de tales polipéptidos modificados es el identificado con la referencia SEQ ID NO:4 (CsTPS3-VB2), el cual contiene el reemplazamiento C455G. La introducción del cambio S418H en el polipéptido CsTPS3-VB2, tiene un efecto sinergístico sobre la producción de elemol. Ejemplo de tal polipéptido modificado es el identificado con la referencia SEQ ID NO:6 (CsTPS3-VB5). La invención también provee un polipéptido modificado que produce una mayor abundancia relativa de germacreno D, y una disminución del porcentaje de otros sesquiterpenos minoritarios, en comparación con la abundancia relativa de este sesquiterpeno producido en las mismas condiciones de reacción por el polipéptido natural CsTPS3 (SEQ ID NO:2). Por ejemplo, substituciones simultáneas de aminoácidos en las posiciones 416, 417 y 418 causan un incremento del porcentaje de germacreno D, en comparación con la abundancia relativa de este sesquiterpeno producido en las mismas condiciones por el polipéptido natural CsTPS3. Notoriamente, los reemplazamientos S416T/G417T/S418Y incrementan la producción de β-elemeno y a-gurjuneno en detrimento de la síntesis de a-copaeno, β-cubebeno y δ-cadineno. Ejemplo de tal polipéptido modificado es aquel identificado con la referencia SEQ ID NO:8 (CsTPS3-VC1 ).
Los polipéptidos modificados de la invención pueden utilizarse para la preparación de elemol (Fig. 2), un sesquiterpeno cíclico presente en algunos fitoaceites esenciales. En diversos artículos científicos publicados recientemente, se ha descrito que el elemol es un potente agente repelente de diferentes especies de mosquitos transmisores de enfermedades contagiosas, e incluso un efectivo repelente de cucarachas. Este hecho ha convertido al elemol en un prometedor y potente repelente natural que puede utilizarse en formulas farmacológicas diseñadas para repeler insectos transmisores de graves enfermedades infectocontagiosas. Así, en una realización preferida de uso, el polipéptido de la invención es utilizado para la preparación o síntesis, preferentemente in vitro, de elemol, preferentemente cuando dicho polipéptido comprende la secuencia SEQ ID NO:16, más preferentemente cuando comprende la secuencia SEQ ID NO:4 ó SEQ ID NO:6, y aún más preferentemente cuando su secuencia es SEQ ID NO:4 ó SEQ ID NO:6.
Considerando el uso anterior, referente a la síntesis de sesquiterpenos con el polipéptido de la invención, otro aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para sintetizar al menos uno de dichos sesquiterpenos, en adelante procedimiento de la invención, que comprende: a. incubar el substrato farnesil-pirofosfato con al menos un polipéptido de la invención, pudiendo utilizarse un único polipéptido o una combinación de polipéptidos según su capacidad o actividad para sintetizar distintos sesquiterpenos, y en función del sesquiterpeno o combinación de sesquiterpenos que se desea preparar, y
b. dejar reaccionar hasta obtener un producto volátil que comprende al menos un sesquiterpeno.
De este modo, también se proveen los métodos para la síntesis de sesquiterpenos cíclicos en los cuales el precursor acíclico farnesil-pirofosfato (FPP) se añade a la mezcla de reacción que contiene la proteína natural CsTPS3, o en su defecto alguno de los polipéptidos modificados (CsTPS3-VB2, CsTPS3-VB5, CsTPS3-VC1 o CsTPS3-VC2), bajo condiciones de reacción que favorecen la formación de sesquiterpenos cíclicos.
El experto medio puede identificar y tener a su disposición fácilmente las condiciones del procedimiento de la invención que favorecen la formación de sesquiterpenos cíclicos, al ser ampliamente conocidas y habituales para cualquier experto del campo de las enzimas (p. ej. tampones, cofactores, temperatura, disolvente, tiempo de inducción, etc) y en particular aquellas referidas a enzimas con actividad sesquiterpeno sintasa, y que a modo de ejemplo comprenderían entre otras las especificadas de forma explícita el ejemplo 4 de la presente invención. Dichas condiciones serán adecuadas, por ejemplo, para producir la unión del substrato al centro activo responsable de la actividad sesquiterpeno sintasa, para conservar la función enzimática, etc.
En un apartado de los métodos descritos aquí, la etapa de contacto del FPP con las sesquiterpeno sintasas se realiza in vitro, adicionando el extracto proteico crudo que contiene la TPS natural CsTPS3 o alguno de los polipéptidos modificados a la mezcla de reacción que contiene el substrato FPP y magnesio como cofactor. Los sesquiterpenos producidos por los métodos de la invención incluyen, pero no se limitan al δ-cadineno, a- copaeno, β-copaeno, β-cubebeno, germacreno D y elemol (Fig. 2). En algunos casos, al menos uno de los sesquiterpenos cíclicos mayoritarios es el δ-cadineno, el germacreno D o el elemol.
Se entiende que la tanto la anterior descripción general y la siguiente descripción detallada constituyen ejemplos y explicación de la invención, y que por tanto no son restrictivas de las reivindicaciones de la invención. A continuación se realizará una descripción detallada y explicativa de los materiales y métodos, así como de los resultados frutos de la invención. EJEMPLO 1. Análisis de sesquiterpenos extraídos del flavedo de naranjas
En los frutos cítricos los aceites esenciales ricos en terpenos se acumulan en el flavedo (piel), y de forma específica en el interior de las glándulas de aceites (estructuras secretoras multicelulares). El flavedo es la parte externa y coloreada de la piel de los frutos cítricos (exocarpo), que consta de una cutícula protectora y una epidermis formada por células parenquimatosas que rodean las glándulas de aceites. Los aceites esenciales de cítricos son una mezcla de diferentes compuestos volátiles que se caracterizan por tener un alto contenido de terpenos hidrocarbonados y cantidades relativamente bajas de terpenos oxigenados (Hógnadóttir y Rouseff, [2003] J. Chromatogr. A. 998, 201 -21 1 ). Las propiedades organolépticas (sabor y aroma) de los aceites esenciales de cítricos son el resultado de la combinación de todos ellos.
Materiales y Métodos: La composición de sesquiterpenos del flavedo de naranjas de la variedad Navel se estudió a diferentes estadios del desarrollo del fruto (verde-inmaduro, verde-maduro, y frutos maduros coloreados), mediante análisis de cromatografía de gases acoplada a la espectrofotometría de masas (GC-MS) (Rodríguez y col. [201 1]. Plant Physiol. 156, 793-802). Para ello se mondó el flavedo con el uso de un cuchillo afilado y se congeló inmediatamente en nitrógeno (N2) líquido. El flavedo congelado se trituro en N2 líquido con la ayuda de una mano de mortero hasta formar un polvo muy fino. Doscientos miligramos (200 mg) de flavedo triturado se mezclaron con 3ml de pentano frío y 25 μg de 2-octanol (Sigma-Aldrich) en un tubo Pyrex con tapa de rosca. El tejido se homogenizó en hielo durante 30 s con un Politrón (PT 10-35 GT), se agitó durante 15 s con la ayuda de un vortex, se le adicionaron 3 mi de agua Milli-Q y se agitó nuevamente en el vortex durante 30 s. La suspensión se clarificó mediante centrifugación a 1800 g durante 10 min a 4°C. La fase orgánica se extrajo con una pipeta Pasteur y se colocó en un tubo limpio. La fase acuosa se extrajo dos veces con 3 mi de pentano, recuperando cada vez la fase orgánica en el mismo tubo. Una alícuota de 2 μΙ de la fase orgánica se inyectó directamente en el GC-MS para el análisis de volátiles. Para cada muestra se realizaron al menos dos extracciones y dos inyecciones independientes. Para el análisis de los volátiles se utilizó un cromatógrafo de gases Thermo Trace GC Ultra acoplado a un espectrofotómetro de masas Thermo DSQ con un método de ionización de electrones (El) ajustado a 70eV. La fuente de iones y la línea de transferencia se ajustaron a 200 y 260°C, respectivamente. Los compuestos volátiles se separaron en una columna HP-INNOWax (Agilent J&C Columns) de 30 m de longitud x 0.25 mm de diámetro interno x 0.25 μιη de espesor de fase. El calentamiento de la columna se programó a 40°C durante 5 min, incrementándose a 150°C a razón de 5°C/min, y luego a 250°C a razón de 20°C/min, manteniéndose a 250°C durante 2 min. La temperatura del inyector fue de 220°C. Como gas portador (carrier) se utilizó helio a un flujo de 1.5 ml/min y la muestra se inyectó sin fragmentación. El espectro de masas producido por la impacto de electrones se registró a una velocidad de 0.5/scan. Los compuestos volátiles se identificaron por aproximación del espectro de masas obtenido con el correspondiente al de los compuestos presentes en las librerías de referencia (Wiley6 y NIST), o por su identidad con el compuesto estándar. La abundancia relativa de los sesquiterpenos volátiles identificados se calculó mediante la integración del área de los picos del cromatograma total de iones (TIC) y normalizando los valores con la tasa de recuperación del estándar utilizado como control interno (2-octanol).
Resultados: Los sesquiterpenos volátiles identificados en los extractos del flavedo de naranjas Navel a diferentes estadios del desarrollo se muestran en la Tabla 3. Los resultados muestran diferencias significativas en el tipo de compuestos y sus abundancias relativas entre frutos maduros e inmaduros. Un total de diez sesquiterpenos cíclicos y cinco acíclicos dan cuenta de menos del 0.7% del contenido total de terpenos volátiles identificados en el flavedo. Estos resultados están en concordancia con resultados previos de otros autores, que demuestran que el aceite del flavedo de naranjas contiene niveles relativamente bajos de sesquiterpenos hidrocarbonados (Shaw PE, [1979] J Agr Food Chem. 27, 246-257; Sawamura M, [2000] En Recent Research Development in Agricultura! and Food Chemestry, Pandalai SG [Ed], Research Signpost, Trivandrum - India, Vol. 4, pp 131 -164; Mitiku y col., [2000] Flav Frag J. 15, 240-244). Además, nuestros resultados demuestran que la abundancia relativa de cada sesquiterpeno identificado, así como la abundancia relativa de la suma de todos ellos, cambia a través del desarrollo del fruto. Con la única excepción del valenceno y el α-farneseno, todos los demás sesquiterpenos que aparecen listados en la Tabla 3 fueron identificados tanto en el flavedo de frutos verdes (inmaduros y maduros), como en frutos maduros que habían sufrido el cambio de color. El α-farneseno se identificó solamente en frutos verdes inmaduros, mientras que el valenceno - un indicador de la madurez del fruto (Elston y col., [2004] Flav Frag J. 20, 381 -386) - solo se identificó en frutos maduros que habían sufrido el cambio de color. En este sentido, la acumulación del valenceno en frutos maduros de naranja que comienzan a sufrir el cambio de color, se ha correlacionado con la inducción de la expresión del gen Cstpsl, el cual codifica una ciclasa con actividad valenceno sintasa (Sharon-Asa y col., [2003] Plant J. 36, 664-674). Como era de esperar, nuestros resultados también demuestran que los monoterpenos forman más del 98% del contenido total de volátiles del flavedo de las naranjas Navel. Aunque el limoneno es el monoterpeno hidrocarbonado más abundante (>91 %) (dato no mostrado), se ha sugerido que su aparente actividad aromática es debido a la co-elución y contaminación con otros compuestos tales como alcoholes oxigenados. Es sabido que el aroma más intenso del aceite esencial de las naranjas se debe a la presencia de terpenos cuyas concentraciones son relativamente muy bajas. El característico olor dulce y fresco de la piel de las naranjas se debe principalmente al a- y β- sinensal (0.02%), cuyo umbral de detección es tan solo de 0.05 ppb (Hógnadóttir y Rouseff, [2003] J. Chromatogr. A. 998, 201-21 1 ).
TABLA 3
Composición de sesquiterpenos del flavedo de naranjas Navel. El análisis de sesquiterpenos se realizó en extractos de flavedo mediante GC-MS. Los sesquiterpenos se identificaron por coincidencia del tiempo de retención (RT) y el espectro de masas (MS) de los estándares disponibles, o por la coincidencia el espectro de masas de los compuestos presentes en las librerías de referencia. Los datos corresponden a las cantidades relativas de cada sesquiterpeno identificado, representados en la forma de porcentaje (%) de área respecto al área total de los picos del cromatograma. Los resultados corresponden al valor de la media de tres réplicas biológicas y sus correspondientes desviaciones estándar.
Verde-inmaduro Verde-maduro Maduros
% % %
Sesquiterpenos cíclicos
a-Copaeno 0.0213 ± 0,0013 0.0304 ± 0.0036 0.0261 ± 0.0010 β-Cubebeno 0.0169 ± 0.0056 0.0226 ± 0.0001 0.0180 ± 0.0007 β-Elemeno 0.0424 ± 0.0018 0.0422 ± 0.0022 0.0485 ± 0.0055 β-Copaeno 0.0029 ± 0.0004 0.0245 ± 0.0001 0.0294 ± 0.0004 a-Humuleno 0.0122 ± 0.0010 0.01 1 1 ±0.001 1 0.0054 ± 0.0005
Germacreno D 0.0135 ± 0.0022 0.0279 ± 0.0018 0.0153 ± 0.0003 a-Muuroleno n.d. 0.0093 ± 0.0024 0.0082 ± 0.0010
Valenceno n.d. n.d. 0.0915 ± 0.0049 δ-Cadineno 0.0340 ± 0.0022 0.0542 ± 0.0001 0.0425 ± 0.0029 β-Sesquifelandreno 0.0093 ± 0.0021 0.01 15 ± 0.0004 0.0055 ± 0.0001
Elemol 0.0078 ± 0.0020 0.0161 ± 0.0004 0.0132 ± 0.0012
Total relativo 0.1603 0.2497 0.3035
Sesquiterpenos acíclicos
Ζ-β-Farneseno 0.0310 ± 0.0004 0.0170 ± 0.0003 0.0102 ± 0.0034 a-Farneseno 0.0540 ± 0.0081 n.d. n.d
Nerolidol 0.0022 ± 0.0003 0.0065 ± 0.0007 0.0053 ± 0.0015 β-Sinensal 0.0781 ± 0.0029 0.0463 ± 0.0020 0.0277 ± 0.0012 a-Sinensal 0.1073 ± 0.0024 0.0468 ± 0.0004 0.0295 ± 0.0013
Total relativo 0.2726 0.1166 0.0727 Aunque muchos han sido los sesquiterpenos que se han identificado en aceites esenciales de cítricos, solo se han aislado y clonado dos genes de cítricos que codifican enzimas con actividad sesquiterpeno sintasa. El gen CjFS (N° de acceso GenBank: AF374462), el cual codifica un polipéptido con actividad farneseno sintasa, se aisló de hojas jóvenes de kuzu {Citrus junos) (Maruyama y col., [2001 ] Biol Pharm Bull. 24, 1 171 -1 175); y el gen Cstpsl (N° de acceso GenBank: AF441 124) que codifica una valenceno sintasa, se aisló del flavedo de naranjas (Sharon-Asa y col., [2003] Plant J. 36, 664-674; WO 2005/021705, Ministerio of Agricultura de Israel, 10 de Marzo de 2005). La gran diversidad de los sesquiterpenos con actividad aromática que se han identificado en cítricos y la escasa información de la que se dispone sobre los enzimas TPS encargados de su biosíntesis, fue el motivo por el cual nos animamos a aislar y clonar nuevos genes sesquiterpeno sintasa de naranja.
EJEMPLO 2. Aislamiento de la región codificante de un nuevo gen sesquiterpeno sintasa de naranjo
Materiales y Métodos. Aislamiento de RNA total del flavedo de naranjas y síntesis de cDNA. El flavedo (exocarpo) de naranjas Navel (Citrus sinensis var Washington Navel) se separó cuidadosamente del albedo (mesocarpo) para evitar su contaminación, y se congeló inmediatamente en N2 líquido. A continuación el flavedo se trituró también en N2 líquido con la ayuda de un molinillo hasta formar un polvo muy fino, y el RNA total se aisló utilizando el sistema RiboPure™ (Ambion). El DNA genómico contaminante se removió del RNA total mediante digestión enzimática con DNase utilizando el sistema Turbo DNA-free™ (Ambion), siguiendo las recomendaciones del fabricante. La concentración de la solución de RNA total se determinó con un espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop Technologies, Inc.). La calidad del RNA total se evaluó mediante el método estandarizado de electroforesis en gel desnaturalizante de agarosa al 3%, visualizando la integridad de las bandas de los RNA ribosomales de diferente tamaño. El RNA total del flavedo de naranjas se utilizó para sintetizar RNA poliadenilado (RNA poli(A)+) utilizando el sistema MicroPoly(A)Purist™ (Ambion), siguiendo las instrucciones del fabricante. La integridad del RNA total poli(A)+ se verificó mediante electroforesis en un gel desnaturalizante de agarosa al 1 .6%. La síntesis de la 1a cadena de cDNA (1 st cDNA) del RNA poli(A)+ se realizó utilizando el sistema RetroScript® (Ambion) y oligo(dT) como cebador para la Transcriptasa Inversa MMLV, siguiendo las instrucciones del fabricante. La solución de 1 st cDNA se almacenó a -20°C hasta su uso. Aislamiento de la región codificante del gen Cstps3 del flavedo de naranjo: La solución de 1 cDNA preparada como se describe arriba se utilizó como molde para la amplificación de la región codificante (cDNA) entera de un gen de naranjo (Cstps3) que codifica una nueva sesquiterpeno sintasa. Oligonucleotidos diseñados sobre secuencias de ESTs truncados que codifican un polipéptido con homología a sesquiterpenos sintasas se utilizaron como cebadores en reacciones de PCR. Para la amplificación del cDNA del gen Cstps3 se utilizaron como cebadores los oligonucleotidos listados en la Tabla 4 y el sistema Advantage® -HF 2 PCR (Clontech), siguiendo las indicaciones del fabricante. Para facilitar el clonaje del fragmento amplificado, a ambos oligonucleotidos se les adicionó un sitio de restricción único en su extremo 5', ambos protegidos por dos nucleótidos adicionales. Al cebador directo (TPS3-F) se le adicionó la secuencia correspondiente al sitio de restricción de la endonuclease BamH I (GGATCC), justo antes del codón ATG. Al cebador inverso (TPS3-R) se le adicionó el sitio de restricción de la endonuclease Sal I (GTCGAC), justo después del codón de parada (TGA). El fragmento de DNA amplificado se purificó de un gel de agarosa al 1 % utilizando el sistema PureLink™ Quick Gel Extraction (Invitrogen), siguiendo las indicaciones del fabricante. El fragmento de DNA eluido se concentró mediante centrifugación con el sistema Microcon® Centrifugal Filters (Millipore) hasta un volumen de 10 μΙ, siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de DNA purificado se clonó en el plásmido pCR®4Blunt-TOPO utilizando el sistema Zero Blunt® TOPO PCR Cloning Kit for Sequencing (Invitrogen). 2μΙ de la reacción de ligación se utilizaron para transformar células electrocompetentes de la cepa One Shot® TOP10 (Invitrogen) de la bacteria Escherichia coli, siguiendo las instrucciones del fabricante. El DNA plasmídico se aisló de los transformantes usando el sistema Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System (Promega), y el fragmento de cDNA del gen Cstps3 clonado se secuenció utilizando los cebadores T3 (5'-ATTAACCCTCACTAAAGG-3') y T7 (5'-TAATACGACTCACTATAGGG- 3'). Las secuencias obtenidas se analizaron utilizando el programa informático Sequencher v4.9 (Genes Codes Corporation, Ann Harbor, Michigan).
Resultados: La expresión de un EST (Expressed Sequenced Tag) del híbrido mandarina x naranja Citrus reticulata var. Clementina (N° de acceso GenBank: CX292608), con homología a terpeno ciclasas de plantas de la Clase I (NCBI CDD: cd00868), se determinó que estaba inducida en el flavedo de frutos verdes-maduros de naranjo Navel, con respecto a frutos maduros que habían sufrido el cambio de color. La secuencia nucleotídica de este fragmento de DNA se utilizo como cebo para buscar secuencias homologas de naranjo en la base de datos de ESTs del GenBank, mediante el algoritmo BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). El análisis permitió la identificación de varios ESTs truncados de naranjo Navel: CK935484, CK935772, CK937172, EY703037, EY708586, EY731065, EY713717, EY722034, y EY732650, los cuales solapaban el EST de clementino utilizado como cebo. El alineamiento de los ESTs identificados mediante análisis de CLUSTALW (Thompson y col., [1994] Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680) (Fig. 4), reveló un alto grado de similaridad entre de las regiones solapadas. Este hecho permitió el ensamblaje de las secuencias solapadas en una secuencia consenso de tamaño completo (desde el codon ATG al codon de parada de lectura). El ensamblaje de la secuencia consenso se realizó con el algoritmo "Assambly" del programa informático Sequencher v4.8 software (Gene Codes Corporation, Ann Harbor, Michigan). La secuencia consenso predijo un cDNA con un marco de lectura abierto (ORF: Open Reading Frame) de 1695 nucleótidos de longitud, codificando un polipéptido de 564 aminoácidos. La comparación de la secuencia deducida de aminoácidos de este polipéptido con las secuencias de proteínas de la base de datos no redundantes del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), mediante el algoritmo BLASTP, reveló que el dicho polipéptido tenía homología con sesquiterpeno sintasas vegetales. Ya que no existía evidencia previa de que la secuencia nucleotídica aquí ensamblada pudiese efectivamente corresponder al cDNA de un gen de naranjo que codificase una nueva sesquiterpeno sintasa, se diseñaron cebadores sobre la secuencia consenso con la finalidad de amplificar el ORF aquí propuesto. Utilizando como cebadores los oligonucleotidos listados en la Tabla 4 y como templado el cDNA de cadena sencilla preparado a partir del RNA total aislado del flavedo de naranjas Navel, se amplificó un fragmento de DNA del tamaño esperado (1695 pb). El tamaño del fragmento amplificado se confirmó mediante electroforesis en un gel de agarosa (1 %). El producto de PCR se clonó en el vector pCR®4Blunt-TOPO (Invitrogen), y se determinó la secuencia nucleotídica del inserto de clones recombinantes. El análisis de secuencia confirmó que el fragmento de cDNA clonado correspondía efectivamente al ORF completo del gen Cstps3 aislado del flavedo de naranjas Navel, el cual se identificó con el número de referencia SEQ ID NO:1 . El análisis de BLASTN de la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido codificado por la secuencia SEQ ID NO:1 , aquí identificado como SEQ ID NO:2, reveló que la proteína codificada tenía homología a sesquiterpeno sintasas vegetales de la clase Tps-a (NCBI Conserved Domain Datábase: cd00684). La secuencia de nucleótidos del ORF aquí aislado (SEQ ID NO:1 ), así como la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada (SEQ ID NO:2) se muestra en las Figs. 1A y 2A. El fragmento de cDNA aquí aislado fue nombrado como Cstps3 (SEQ ID NO:1 ), siguiendo la nomenclatura de Sharon-Asa y col., [2003] Plant J. 36, 664-674. Estos autores aislaron el primer gen sesquiterpeno sintasa de naranjo, al cual denominaron Cstpsl (Solicitud de Patente Internacional WO 2005/021705, Ministerio de Agricultura de Israel, 10 de Marzo de 2005). TABLA 4
Lista de los oligonucleotidos utilizados como cebadores para la amplificación de la región codificante del gen Cstps3 del flavedo de frutos de naranja Navel.
SEQ ID NO Oligonucleotido Secuencia (5'→3')
1 1 TPS3-F CGGGATCCCATGTCTTTGGAAGTTTCAGCCTC
12 TPS3-R CGGTCGACTCATACACATATCGGCACAGG
EJEMPLO 3. Análisis de secuencia y filogenético del cDNA de naranjo que codifica la sesquiterpeno sintasa CsTPS3 (SEQ ID NO:2)
Resultados: En general las sesquiterpeno sintasa vegetales tienen un peso molecular de 50 - 100 KDa, con una longitud entre 550 - 580 aminoácidos (Bohlman y col., [1998] Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 95, 4126-4133). El cDNA del gen Cstps3 (SEQ ID NO:1 ) aislado a partir del flavedo de naranjas Navel objeto de la invención, codifica una proteína de 564 aminoácidos (SEQ ID NO:2) con un peso molecular (PM) de 65.38 KDa. El PM estimado de la proteína CsTPS3 está en concordancia con el estimado para otras sesquiterpeno sintasas vegetales, lo cual apoya nuestra hipótesis inicial de que el fragmento de PCR aquí aislado corresponde a un OFR que codifica una proteína completa. El análisis de BLASTP reveló que la secuencia deducida de aminoácidos del polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2) tiene similaridad a germacreno D sintasas (GerD) de otras especies de Rósidas, así como a la GerD de kiwi (Asterácea). El polipéptido CsTPS3 mostró entre un 54 - 66% de identidad a sesquiterpeno sintasas de la subfamilia Tps-a (Bohlman y col., [1997] J. Biol. Chem. 272, 21784-21792), incluyendo la GerD de uva (AAS66357), rosa (BQ105086), álamo de California (AAR99061 ), y kiwi (AAAX16121 ), y la GerB de Cistus creticus (ACF94469). Las sesquiterpenos sintasas de la subfamilia Tps-a contienen dos dominios estructurales: (/) un dominio N-terminal con actividad glicosil hidrolasa, y (//') un domino C-terminal que comprende el sitio activo del enzima. Los dominios conservados DDXXD, NSE/DTE y RXR que se encuentran presentes en todas las sesquiterpenos sintasas vegetales (revisado por Degenhardt y col., [2009] Phytochemistry 70, 1621 -1637), también se encuentran conservados en el polipéptido CsTPS3 (Fig. 5). Los dominios DDXXD y NSE/DTE están involucrados en el enlace cooperativo de tres átomos de Mg+2 que estabilizan el grupo pirofosfato del substrato FPP. Por su parte, el dominio RXR está implicado en el secuestro del grupo difosfato, de tal forma que lo mantiene alejado de la cavidad hidrofóbica a la vez que favorece la formación de diferentes carbocationes altamente reactivos que se forman durante la catálisis. Además, la comparación de la secuencia de los polipéptidos analizados reveló que otros residuos de aminoácidos altamente conservados y que son esenciales para la actividad de la proteína modelo 5-ep/-aristoloqueno sintasa de tabaco (TEAS) (Starks y col., [1997] Science 277, 1815-1820), están también conservados en polipéptido CsTPS3. Interesantemente, solo el primer residuo de treonina de la tétrada 401JJJY405 involucrada en la actividad catalítica de TEAS, está conservado en la secuencia homologa 415TSGS418 del polipéptido CsTPS3 (Fig. 5). El residuo G417 está conservado en las GerD de populus y kiwi, así como en la GerB de C. creticus. Por otra parte, la última posición de la tétrada está ocupada por un residuo de serina (S418) en el polipéptido CsTPS3, mientras que en el resto de las proteínas presentes en el alineamiento tienen un residuo de tirosina (Y) conservado en dicha posición (Fig. 5). Estas observaciones sugieren que los aminoácidos que conforman la tétrada 415TSGS418 podrían estar involucrados en el especificidad de producto de la proteína CsTPS3 (SEQ ID NO:2) de naranjo objeto de la invención. El residuo de tirosina en la posición 278 (Y278) de TEAS, el cual está conservado en todas las sesquiterpenos sintasas cíclicas, también lo está en el polipéptido CsTPS3. Este hecho apoya nuestra hipótesis de que la proteína CsTPS3 corresponde a una sesquiterpeno sintasa cíclica. Se ha sugerido que el residuo Y278 estabiliza la carga positiva del intermediario carbocatiónico que precede a la etapa de ciclización del FPP (Maruyama y col., [2001 ] Biol Pharm Bull. 24, 1 171 -1 175; Chang y col., [2005] Biotechnol. Lett. 27, 285- 288).
El análisis filogenético de la secuencia deducida de aminoácidos de la proteína CsTPS3 (SEQ ID NO:4) objeto de la invención, con el de otras sesquiterpeno sintasas con probada actividad germacreno D y cadineno (Cad) sintasa, agrupa a la CsTPS3 con GerD de otras especies de Rósidas (Vitis vinefera, Rosa hybrid, Populus trichorcapa, y Cistus creticus,) y con la asterácea Actinia deliciosa (Fig. 6). La GerD de la monocotiledónea Zingiber officinale y la cubebeno sintasa (Cub) de la gimnosperma Magnolia grandiflora agrupan separadamente de las sesquiterpeno ciclasas de dicotiledóneas.
EJEMPLO 4. Caracterización bioquímica de la actividad Sesquiterpeno Sintasa: Expresión heterologa de la proteína CsTPS3 en células bacterianas, Preparación de extractos proteicos libres de células y ensayo in vitro de la actividad Sesquiterpeno Sintasa
La actividad catalítica de la proteína CsTPS3 (SEQ ID NO:2) se ensayó in vitro utilizando extractos proteicos preparados a partir de células de la cepa bacteriana Escherichia coli BL21 (DE3) portadoras de la región codificante del gen Cstps3 (SEQ ID NO:1 ). que había sido previamente clonado en el vector de expresión pET45b(+). Extractos proteicos preparados a partir de células de E. coli BL21 (DE3) transformadas con el vector pET45b(+) vacio se utilizaron como control negativo. La caracterización funcional de la nueva sesquiterpeno sintasa de naranjo CsTPS3 (SEQ ID NO:2) aquí aislada, reveló que dicha proteína es una sesquiterpeno sintasas multifuncional. La biosíntesis de múltiples sesquiterpenos es una característica de la gran mayoría de sesquiterpenos sintasas aisladas de diferentes especies vegetales, y se encuentra bien documentado en el estado de la técnica (Lesburg y otros, [1997] Science 277, 1820-1824; Starks y col., [1997] Science 277, 1815-1820; Steel y col., [1998] J. Biol. Chem. 273, 2078-2089; Caruthers y col., [2000] J. Biol. Chem. 275, 25533-25539; Rynkiewicz y col., [2001 ] Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 98, 13543-13548; Arimura y col., [2004] Plant J. 37, 603-616; Lücker y col., [2004] Photochemistry 65, 2649-2659; Deguerry y col., [2006] Aren. Biochem. Biophys. 454, 123- 136; Picaud y col., [2006] Aren. Biochem. Biophys. 452, 17-28; Jones y col., [2008] Arch Biochem Biophys. 477, 121 -130; Sungbeom y Chappell [2008] Plant Physiol. 147, 1017- 1033; Nieuwenhuizen y col., [2009] J Exp Bot. 60, 3203-3219; Dunner y col., [201 1] Phytochemistry 72, 897-908).
Materiales y Métodos: El fragmento de cDNA de naranjo con el correcto ORF que codifica un polipéptido con homología a sesquiterpeno sintasas, se subclonó en fase entre los sitios de restricción BamH I y Sal I del vector de expresión pET45b(+) (Novagen), usando el sistema Rapid DNA Ligation Kit (Roche). Células competentes NovaBlue (Novagen) se transformaron con una pequeña alícuota de la reacción de ligación, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los plásmidos recombinantes pET45b(+) portadores del DNA codificante de la nueva sesquiterpeno sintasa de naranjo CsTPS3 (SEQ ID NO:2) se seleccionaron en medio Luria-Bertani (LB) suplementado con ampicilina (50 μg/ml). El DNA plasmídico extraído de clones recombinantes se secuenció para verificar la presencia de la región codificante del gen Cstps3 (SEQ ID NO:1 ) en la orientación y el marco lectura correcto, antes de transformar un huésped de expresión apropiado. Para la producción de la proteína CsTPS3, así como de sus respectivas formas mutantes, los plásmidos recombinantes se transformaron en las células de expresión BL21 (DE3) (Novagen). Esta cepa es un lisógeno del bacteriófago λϋΕ3, un derivado de bacteriófago λ que lleva la región de inmunidad del bacteriófago 21 y un fragmento de DNA del gen lacl, el promotor lacUV5, y el gen de la RNA polimerasa del transposón T7. Este fragmento insertado dentro del gen int, evita la integración o escisión del lisógeno DE3 del cromosoma en ausencia de un bacteriófago ayudante. El único promotor que dirige la transcripción del gen de la RNA T7 polimerasa es el promotor lacUV5, el cual se induce al añadir IPTG al medio de cultivo. La expresión del gene diana fusionado en fase al marco de lectura abierto del promotor T7 es activado tras la inducción de la RNA T7polimerasa. Tras la producción de la proteína de interés en el citoplasma de las células bacterianas recombinantes, se utilizaron dos métodos para la preparación de los extractos proteicos libres de células y el posterior ensayo in vitro de actividad sesquiterpeno sintasa.
Ensayo ezimático I: Se inoculó una colonia de la cepa bacteriana (lisógeno λϋ3) portadora del vector pET45 recombinante en 10 mi de medio LB suplementado con 50 μg/ml carbenicilina, 34 μg/ml cloranfenicol y 0.5% glucosa. El pre-inóculo se incubó durante toda la noche a 37°C con agitación (250 rpm). El cultivo se utilizó para inocular 100 mi de medio LB suplementado como se describe arriba, y se creció a 37°C hasta una D06oo de 0.6. La inducción se llevó a cabo tras añadir al cultivo 1 mM de IPTG. La incubación se continuó durante toda la noche a 18°C. Las células se precipitaron por centrifugación y se resuspendieron en 1 ml del tampón SSAB (100 mM fosfato de sodio pH 7.0, 10 mM MgCI2, 1 mM DTT, 10% v/v glicerol; Prosser y col., [2002] Phytochemistry 60, 691 -702). Las células se lisaron mediante tres/cinco ciclos de congelación/descongelación, seguido por la adición de 7.5 KU de rLisozima (Novagen) por cada mi del tampón SSAB. La suspensión celular se incubó a temperatura ambiente en una plataforma con agitación a baja velocidad durante 15 min. El DNA presente en el lisado se digirió con 25 U de Benzonasa Nucleasa (Novagen) por cada mi del tampón SSAB. La suspensión celular se incubó a temperatura ambiente y a baja velocidad durante 20 min hasta que la viscosidad desapareció por completo. En este momento los tubos se incubaron en hielo. El debrís celular se eliminó mediante centrifugación a 13.000 rpm durante 30 min a 4°C. Los extractos proteicos crudos se utilizaron para el ensayo in vitro de la actividad sesquiterpeno sintasa, utilizando FPP (16 μg FPP/ml de extracto proteico) como substrato. Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo en viales de vidrio con tapón de PTFE utilizando para ello 500 μΙ de lisado crudo suplementado con 16 μg de FPP. La reacción se cubrió con 500 μΙ de pentano y los tubos se incubaron toda la noche a 30°C. Tras el período de incubación, los volátiles se recuperaron de la capa de pentano y se extrajeron dos veces de la fase acuosa utilizando 1 mi de pentano cada vez. Las fracciones de pentano se combinaron y se concentraron hasta 50 μ\- bajo atmósfera de nitrógeno, y finalmente se analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrofotometría de masas (GC-MS). Un equipo Thermo Trace GC se utilizó acoplado a un espectrofotómetro de masas con modo de ionización de electrones (El) a 70 eV. Los compuestos volátiles se separaron en una columna de HP-INNOWax (30 m x 0.25 mm i.d. x 0.25 μΐη de película) (Agilent J&C Columns). La inyección de la muestra se realizó sin fragmentación y el horno se programó como sigue: 40°C durante 5 min, posteriormente la temperatura se incrementó hasta los 150°C a razón de 5°C/min, y finalmente a 250°C durante 2 min (a razón de 20°C/min). La temperatura del inyector fue de 220°C, y se utilizó helio como el gas portador a un flujo constante de 1 .5 ml/min. Tras el impacto de electrones, los espectros de masas se registraron en el rango de 30-400 m/z con una velocidad de exploración de 0,5 barridos/s. La identificación de los compuestos se realizó por coincidencia de los espectros de masas adquiridos y los índices de retención (Rl) con aquellos correspondientes al de los patrones auténticos disponibles, o con aquellos sesquiterpenos presentes en la base de datos de referencia (Wiley y NIST). Ensayo enzimático II: Las células BL21 (DE3) portadoras del vector pET45b recombinante que expresa la sesquiterpeno sintasa CsTPS3 o cualquiera de sus versiones modificadas se crecieron a 37°C en medio Terrific Broth (TB) suplementado con 50 μg/ml carbenicilina hasta una D06oo de 0.6. Las células se indujeron con 1 mM IPTG durante 16 h a 18 °C. Los cultivos bacterianos crecidos durante toda la noche y que expresan las proteínas recombinantes se centrifugaron para recolectar las células. Las células se resuspendieron en tampón de lavado (20 mM Tris-HCI, pH 7.0, 50 mM KCI) mediante agitación en vortex, y posteriormente se centrifugaron. Las células se lavaron con 1 mi de tampón de extracción de proteínas (50 mM 3-(N-morfolino)-ácido 2-hidroxipropanosulfónico, pH 7.0, 10% [v/v] glicerol, 5 mM MgCI2, 5 mM DTT, 5 mM ascorbato de sodio, 0.5 mM fluoruro de fenilmetilsulfonilo), y posteriormente se agitaron, sonicaron y centrifugaron. Tras recuperar el sobrenadante se realizó el cambio de tampón de extracción por el tampón de ensayo enzimático (10 mM de ácido 3-(N-morfolino)-2-hidroxipropanosulfónico, pH 7.0, 10% [v/v] glicerol, 1 mM DTT) usando columnas PD-10 (GE Healthcare Life Sciences). Los ensayos enzimáticos se llevaron a cabo en viales de vidrio con tapa de rosca PTFE, usando 500 μΙ de lisado crudo suplementado con 10 μg FPP, MgCI2 (20 mM), e inhibidores de fosfatasas (0.2 mM NaW04, 0.1 mM NaF). Las mezclas de reacción se cubrieron con 500 μΙ de hexano y los tubos se incubaron durante toda la noche a 30°C. Posteriormente, la fase superior de hexano se agitó con la fase acuosa y tras centrifugar se utilizó para el análisis de metabolitos. Las fracciones de hexano se concentraron hasta 50 μΙ bajo una atmósfera de nitrógeno y se analizaron por cromatografía de gases acoplada a espectrofotometría de masas (GC-MS). El equipo utilizado fue un Hewlett Packard 6890 GC acoplado a un detector selectivo de masas (MSD) 5973 provisto de un inyector automático múltiple 7683, y equipado con una columna capilar HP-5MS. La inyección se realizó sin fragmentación y el horno se programó de la siguiente manera: de 50°C (5 min de espera) hasta 250°C (5 min de espera) a razón de 5°C/min a. La temperatura del inyector fue de 200°C y se utilizó helio como gas portador con un flujo constante de 1 .5 ml/min. La temperatura de la fuente de iones y del cuádrupolo era de 250 y 150°C, respectivamente. El espectro de masas tras el impacto de electrones se registró en el rango de 40-300 m/z. La identificación de los compuestos se realizó mediante coincidencia de los espectros de masas adquiridos y los índices de retención (Rl) con aquellos correspondientes a los de los patrones auténticos disponibles, o con aquellos sesquiterpenos presentes en las bases de datos de referencia NIST y MassFinder. La abundancia de cada producto detectado se cuantificaron mediante integración de las áreas de cada pico utilizando el programa informático Enhanced Chemstation versión B.01.00 (Agilent Technologies). Resultados: El ensayo in vitro de la actividad sesquiterpeno sintasa realizado en cualquiera de los ensayos enzimáticos I y //, demostraron que el cDNA del gen Cstps3 codifica inequívocamente un polipéptido con actividad sesquiterpeno sintasa. Dicha actividad se determinó por la capacidad del polipéptido CsTPS3 de transformar el substrato FPP en sesquiterpenos cíclicos. Ensayo enzimático I: Los resultados del análisis GS-MS mostraron que los lisados crudos de las células bacterianas que expresan la proteína recombinante CsTPS3, preparados según en ensayo enzimático I, forman como principal producto δ- cadineno (46,91 %), además de otros sesquiterpenos cíclicos minoritarios (Tabla 5 y Fig. 7A). La identificación de los picos más pequeños mostró que estos correspondían a los sesquiterpenos cíclicos β-cubebeno (14,55%), germacreno D (1 1 ,8%), a-copaeno (9,65%), cubebol (7,1 1 %), elemol (5,93%), y biciclogermacreno (4,05%). A pesar de su actividad multifuncional, el polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:4), codificado por el cDNA Cstps3 (SEQ ID NO:2), se clasificó como una δ-cadineno sintasa, en función de la abundancia relativa del δ-cadineno. La denominación de las sesquiterpenos sintasas multifuncionales en función de su producto mayoritario es una norma general bien conocida en estado de la técnica. La estructura molecular de los productos formados por el polipéptido CsTPS3 se muestra en la Fig. 2. El control correspondiente a las células BL21 (DE3) transformadas con el vector pET45b vacío, no produjo ninguno de los compuestos volátiles sintetizados por el enzima multifuncional CsTPS3, lo cual demuestra que los sesquiterpenos volátiles identificados en los extractos preparados a partir de las células que expresan la región codificante del gen Cstps3 (SEQ ID NO:1 ), son producto de la actividad catalítica del enzima CsTPS3. Ensayo enzimático II: Cuando la actividad ciclasa del polipéptido CsTPS3 se probó bajo las condiciones del ensayo enzimático II, se identificó un mayor número de sesquiterpenos (Tabla 6). Ésta diferencia puede ser consecuencia de la mayor sensibilidad del equipo GC- MS utilizado en este ensayo. Los sesquiterpenos producidos por el polipéptido CsTPS3 en los ensayos enzimáticos I y II no pueden compararse entre sí, ya que no se cuantificó la cantidad de proteína recombinante añadida en cada tipo de ensayo. En el perfil de sesquiterpenos volátiles producidos por el polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2) se identificaron varios sesquiterpenos, de los cuales el δ-cadineno fue el producto mayoritario (27,36%) (Table 6 y Fig. 8A). La identificación de los picos minoritarios reveló que correspondían a los sesquiterpenos cíclicos a-copaeno (19,60%), β-cubebeno (14,30%), germacreno D (9,36%), elemol (7,49%), cubeol (4,42%), biciclogermacreno (3,58%), a- muuroleno (1 ,92%), germacreno D-4-ol (1 ,90%), a-bulneseno (1 ,69%), E-cariofileno (1 ,48%), a-cubebeno (1 ,12%). Ya que el δ-cadineno fue el producto mayoritario de la actividad enzimática de la proteína CsTPS3 (SEQ ID NO:2), esta se clasificó como una δ-cadineno sintasa. La estructura molecular de los sesquiterpenos producidos por el polipéptido CsTPS3 se muestra en la Fig. 2.
TABLA 5
Abundancia relativa de los sesquiterpenos producidos in vitro por el polipéptido natural CsTPS3 y sus respectivas versiones modificadas. La actividad catalítica de los enzimas se ensayó según el método descrito en el ensayo enzimático I. Los datos corresponden a porcentajes (%) de área de cada sesquiterpeno con respecto al total del área de los picos detectados en el perfil de volátiles.
Polipéptidos modificados
CsTPS3 VB2 VB5 VC1 VC2
Sesquiterpeno % % % % % a-Copaeno 9,65 - - - - a-Gurjuneno - - - 13,98 10,59 β-Cubebeno 14,55 - - - -
Germacreno D 1 1 ,8 - - 77,61 75,91
Biciclogermacreno 4,05 - - 8,4 13,5 δ-Cadineno 46,91 - - - -
Cubebol 7,1 1 - - - -
Elemol 5,93 77,49 87,78 - -
Guaiol - 22,51 12,22 - - TABLA 6
Abundancia relativa de los sesquiterpenos producidos in vitro por el polipéptido natural CsTPS3 y sus respectivas versiones modificadas. La actividad catalítica de los enzimas se ensayó según el método descrito en el ensayo enzimático II. Los datos corresponden a porcentajes (%) de área de cada sesquiterpeno con respecto al total del área de los picos detectados en el perfil de volátiles. Productos con abundancias relativas del 1 % o menos se indica como trazas.
Polipéptidos modificados
CsTPS3 VB2 VB5 VC1 VC2
Sesquiterpeno % % % % % a-cubebeno 1.12 trazas trazas trazas trazas a-copaeno 19.60 1.66 trazas trazas trazas β-cubebeno 14.30 - trazas - - β-elemeno - 2.40 trazas 3.43 3.96 a-gurjuneno trazas - - 5.44 5.70
Ε-β-cariofileno 1.48 1.63 trazas trazas trazas a-humuleno 3.58 2.71 trazas - - germacreno D 9.36 2.01 trazas 84.46 83.10 biciclogermacreno 3.56 - - 2.53 2.91 a-muuroleno 1.92 - - - - a-bulneseno 1 .69 1 .48 trazas - - cubebol 4.42 1.07 trazas - - δ-cadineno 27.36 3.19 1.15 trazas trazas elemol 7.49 66.70 83.86 - - germacreno D-4-ol 1 .90 trazas trazas 2.12 2.40 bulnesol trazas 15.48 11.44 - -
Se ha establecido que la formación de múltiples sesquiterpenos por enzimas sesquiterpeno sintasas multifuncionales se produce a través de la formación de diferentes estructuras carbocatiónicas intermediarias (revisado por Degenhardt y col., [2009] Photochemistry 70, 1621 -1637). La reacción en cascada se inicia con la ionización dependiente de iones metálicos divalentes y/o por la isomerización del precursor farnesil-pirofosfato (FPP). Los intermediarios cationicos resultantes sufren varios rearreglos intramoleculares tales como: ciclaciones, cambios de grupos hídridos (migración de un átomo de hidrógeno en un carbocation al átomo de carbono con carga +1 desde un carbón adyacente), o transiciones conformacionales, hasta que la reacción culmina por la pérdida de protones o activada mediante la adicción de una molécula nucleofílica (una especie química tal como un grupo hidroxilo que dona un par de electrones a una molécula electrofílica para formar un enlace químico). La diversidad estructural de los productos formados por las sesquiterpeno sintasas se debe al gran esqueleto carbonado (cola prenil) del FPP y a la presencia de tres enlaces dobles. El esquema mecanístico propuesto para la formación de sesquiterpenos por el polipéptido natural CsTPS3 y que se muestra en las Figs. 9A y 9B, trata de explicar la relación de sus múltiples productos basados en la información de los mecanismos de reacción propuestos para otras sesquiterpenos sintasas vegetales (Deguerry y col., [2006] Arch Biochem Biophys. 454, 123-136; Jones y col., [2008] Arch Biochem Biophys. 477, 121 - 130; Lee y Chappell, [2008] Plant Physiol. 147, 1017-1033; O'Maille y col., [2006] Arch Biochem Biophys. 448, 73-82; Picaud y col., [2006] Arch Bioche Biophys. 452, 17-28; Starks y col., [1997] Science 277, 1815-1820; Yoshikuni y col., [2006], Chem Biol. 13, 91 -98). La formación de sesquiterpenos cíclicos a partir del precursor FPP por la sesquiterpeno sintasa CsTPS3 de naranjo producto de la invención, puede proceder a través de la formación de intermediarios carbocatiónicos altamente reactivos e inestables. Este hipotético mecanismo explicaría la formación de múltiples productos por la proteína CsTPS3 recombinante expresada en bacterias, los cuales fueron posteriormente identificados mediante análisis de GC-MS. Cuando el substrato £,£-FPP se une al sitio activo de la enzima a través de los cationes divalentes de magnesio (Mg2+), el grupo fosfato se libera formándose el £,£- farnesyl catión (catión franso/d-farnesil), el cual puede sufrir una etapa de ciclización (cierre de anillo 1 1 ,1 ; ruta a en Fig. 9A) para generar el C1 1 humulil catión macrocíclico. Éste puede deprotonarse para formar el a-humuleno (3,58% [Tabla6]), o sufrir un cierre de anillo 2,10, seguido por deprotonación del carbono C3 para formar β-cariofileno [Tabla 6]. Alternativamente, la isomerización del £,£-farnesil catión en el enlace C2 - C3 (ruta b en Fig. 9A) formaría el intermediario nerolidil catión necesario para la formación de sesquiterpenos tipo germacranos y cadinanos. Diferentes estudios relacionados con el uso de análogos radiactivos del FPP y del nerolidil difosfato apoyan la intermediación del nerolidil catión en el mecanismo de reacción catalizado por sesquiterpenos sintasas (revisado por Degenhardt y col., [2009] Photochemistry 70, 1621 -1637). En una posterior etapa de reacción, el Z,£-farnesil catión podría sufrir un cierre de anillo 10,1 para formar el 3Z, 7£-germacradienil catión. La deprotonación directa del 3Z, 7£-germacradienil catión formaría el producto minoritario germacreno D. Alternativamente, la hidroxilación del 3Z E- germacradienil catión en el carbono C3 formaría el Germacreno D-4-ol (ruta c en Fig. 9A). Ya que los germacranos son moléculas flexibles, el 3Z, 7£-germacradienil catión podría fácilmente sufrir posteriores transformaciones a través de la interconversión de las conformaciones de silla de sus respectivos isómeros. La formación de diferentes esqueletos de carbón implicaría la subsecuente ciclización de los confórmeros a través del ataque de carbocationes sobre cualquiera de los dos dobles enlaces. Así, los dos conformeros del 3Z, 7£-germacradienil catión darían lugar a la formación de los cationes cadinenil (ruta d en Fig. 9A) y muurolenil (ruta e en Fig. 9A), respectivamente. El cadinenil catión generado por el enzima CsTPS3 podría sufrir deprotonación en C7 y la subsecuente formación del doble enlace C6 - C7 para generar δ-cadineno como producto mayoritario (46,91 % según los resultados del ensayo enzimático I [Tabla 5], y 27,36% según el ensayo enzimático II [Tabla 6]). El β-cubebeno, uno de los dos productos secundarios más abundantes producidos por la CsTPS3 (14,55% [Tabla 5], y 14,30% [Tabla 6]), podría generarse mediante la migración del átomo de hidrógeno en C1 al C2 (migración de hidrógeno 1 ,2), seguido por cierre electrofílico en 1 ,2 y deprotonación del cadinenil catión. Alternativamente, el cadinenil catión podría sufrir también otros rearreglos (migración de átomos de hidrógeno, cierre de anillo y oxidación) para formar cubebol como producto colateral minoritario (4,42% según el ensayo enzimático II). Por su parte, el muurolenil catión podría sufrir la migración de hidrógeno 1 ,2, seguido de la formación de un enlace entre C2 - C7 (cierre de anillo 2,7) para general un macrociclo transitorio del cual se formaría por deprotonación en C3 el producto colateral a- copaeno (9,65% [Tabla 5], y 19,60% [Tabla 6]). Alternativamente, el muurolenil catión podría deprotonarse para formar el α-muuroleno como producto colateral minoritario (1 ,92% [Tabla 6]). En una reacción mecanística adicional, el 3Z, 7£-germacradienil catión podría transformarse en germacreno D (1 1 ,8% [Tabla 5] y 9,36% [Tabla 6]), y biciclogermacreno (4,05% [Tabla 5], y 3,56% [Tabla 6]) (ruta f en Fig. 9A). La biosíntesis de sesquiterpenos derivados del elemano o gauiano por la proteína CsTPS3 podría ocurrir a través de la formación transitoria del intermediario germacreno A (Fig. 9B). En este escenario mecanístico, la cilcización del £,£-farnesyl catión entre los carbonos 10 y 1 (ruta g en Fig. 9B), formaría el £,£-germacradienyl catión. La posterior deprotonación del £,£- germacradienil catión generaría el intermediario neutro germacreno A. Éste no podría dejar el sitio activo del enzima CsTPS3, ya que su naturaleza hidrofóbica no permitiría que entrase de nuevo en dicha cavidad. Un mecanismo similar se ha sugerido para explicar la actividad catalítica de la SasesquiTPSI del árbol del sándalo (Santalum álbum) (Jones y col.. [2008], Arch Biochem Biophys. 447: 121 -130). Los residuos de Tyr que ocupan las posiciones 520 (Y520) y 527 (Y527) en la secuencia de aminoácidos de la proteína TEAS, y que se han involucrado en la formación del germacreno A, están conservados en la sesquiterpeno sintasa CsTPS3 de naranjo (Fig. 5). El germacreno A se ha postulado como un producto intermediario en el mecanismo de reacción que da lugar a la formación del 5- ep/-aristolocheno. El residuo Y527 de TEAS parece estar implicado en la protonación del germacreno A (Starks y col., [1997] Science 277, 1815-1820). La mutagénesis del residuo Y520 (Y520F) de TEAS, genera una TEAS modificada que produce germacreno A y no 5-epi- aristoloqueno como producto final (Rising y col., [2000] J Am Chem Soc. 122, 1861 -1866). Por lo tanto, el residuo Y520 evitaría la salida del intermediario germacreno A de la cavidad catalítica de la proteína TEAS, mientras que el residuo Y527 estaría implicado en la activación del germacreno A necesaria para la formación del 5-ep/-aristoloqueno. La formación del producto colateral a-bulneseno (1 ,69% [Tabla 6]) por la CsTPS3, tendría lugar como consecuencia de la formación del guianil catión por la protonación del germacreno A y cierre de anillo 6,2. Los elemanos son considerados productos de degradación de los germacrenos debido a Cope rearreglos (reacciones esteroespecíficas que proceden vía estados de transiciones de conformaciones de silla), inducidas por las elevadas temperaturas del inyector durante el análisis de GC-MS (revisado por Adió, [2009] Tetrahedron 65, 1533- 1552). Así, por ejemplo el Cope rearreglo del germacreno A y germacreno B conducen a la formación de β-elemeno y γ-elemeno, respectivamente. También se ha sugerido que el elemol es probablemente el producto de ruptura térmica del hedicariol, ya que el aceite esencial rico en elemol de la morera australiana (Hedycarya angustifolia A. Cunn) produce principalmente hedicariol y solo trazas de elemol cuando el aceite se extrae a temperatura ambiente. EJEMPLO 5. Mutagénesis y caracterización bioquímica de las versiones modificadas del polipéptido CsTPS3 de naranjo
Una de las características más interesantes de los enzimas sesquiterpeno sintasa vegetales es su capacidad de formar múltiples productos con diferente estructura (esqueleto de átomos de carbón), aun cuando comparten una estructura tridimensional (3D) común. La actividad catalítica y diversidad química de sus productos radica en gran medida en el plegamiento diferencial del substrato FPP en el interior de la cavidad catalítica (Starks y col., [1997] Science 277, 1815-1820; Bouwmeester y col., [2002] Plant Physiol. 129, 134-144; Deligeorgopoulou y Alleman [2003] Biochemistry 42, 7741 -7747). La localización espacial de las cadenas laterales de algunos aminoácidos en el sitio activo de la proteína, distingue catalíticamente una sesquiterpeno sintasa del resto. Además se ha sugerido que el carácter multiproducto de las sesquiterpenos sintasas vegetales puede ser también una consecuencia de la presencia de dos compartimentos independientes en el interior del sitio activo del enzima. Así, el análisis de mutagénesis de la terpeno sintasa multirpoducto ZmTPS4 de maíz, demostró que las primeras etapas en la vía de transformación del FPP hasta la formación del intermediario monocíclico bisabolil catión, se catalizan en el compartimento I; mientras que las etapas secundarias de ciclización hasta la formación de los sesquiterpenos bicíclicos tiene lugar en la compartimento II (Kóllner y col., [2006] Arch Biochem Biophys. 448:83-92). Las semejanzas estructurales de las diferentes sesquiterpeno sintasas y sus productos de reacción, sugieren que pequeños cambios en la geometría del centro activo del enzima, debido a las diferencias de identidad y localización espacial de las cadenas laterales de ciertos aminoácidos claves, son suficientes para alterar la especificidad de sus mecanismos de reacción. Los residuos de aminoácidos localizados en las capas que rodean el sitio activo pueden también influenciar la conformación y la especificidad de producto de las sesquiterpenos sintasas. En este sentido, se ha demostrado que la biotecnología a través del uso de técnicas del DNA recombinante e ingeniería genética constituye una poderosa estrategia para manipular la actividad catalítica de las sesquiterpeno sintasas, permitiendo incrementar el rendimiento y/o especificidad de ciertos sesquiterpenos de interés. Materiales y Métodos: Las versiones modificadas de la δ-cadineno sintasa (CsTPS3, SEQ ID NO:2) objeto de la invención, se generaron in vitro mediante mutagénesis dirigida. Para ello se introdujeron de forma específica mutaciones puntuales o combinación de múltiples mutaciones puntuales en la secuencia nucleotídica del cDNA del gen Cstps3 (SEQ ID NO:2). Los cDNAs modificados objetos de la invención codifican polipéptidos modificados que contienen substituciones específicas en su secuencia de aminoácidos, con respecto a la secuencia natural del enzima δ-cadineno sintasa de naranjo (CsTPS3, SEQ ID NO:4). Para generar sustituciones individuales o múltiples de pares de bases, se utilizaron los sistemas comerciales QuickChange® II Site-direct y QuickChange® Multi Site-Direct Mutagénesis kits (Stratagene), respectivamente. Ambos tipos de sistemas permitieron la introducción de mutaciones específicas (puntuales o múltiples) en un único ensayo, en la secuencia nucleotídica del cDNA que codifica el polipéptido natural CsTPS3 (SEQ ID NO:2), el cual había sido previamente clonado en el vector de expresión pET45b(+). Ambos métodos requieren la síntesis de oligonucleotidos modificados de 25 - 45 bases de longitud, que llevan la mutación o mutaciones de interés y que se utilizaran como cebadores en una única reacción de PCR. La substitución de las bases deseadas debe localizarse en el centro del oligonucleotido y con una secuencia correcta a ambos lados de 10-15 nucleótidos. Para el diseño de los cebadores se utilizó el programa informático QuickChange (http:://www.stratagene.com/qcprimerdesign), según las instrucciones del fabricante. Los cebadores utilizados para la mutagénesis del cDNA del gen Cstps3 se muestran en la Tabla 7. TABLA 7
Oligonucleotidos usados como cebadores para la mutagénesis del cDNA del gen Cstps3 (SEQ ID NO:1 ) que codifica la δ-cadineno sintasa de naranjo (CsTPS3, SEQ ID NO:2).
SEQ ID
Oligonucleótido Sequence (5'→3')
NO
13 CsTPS3_S418H GATGTGGTTGACAACATTGGGTGGCCAGATGTAACT
AATGCAAC
14 CsTPS3_C455G ATCCATGAGTCGGCCAACTATAGAAGAAGCCCTAAT
AAATCT
15 CsTPS3 S416T, G417T, GATGAGTACATGACGGTTGCATTAGTTACAACTACC
S418Y_Forward TATCCAATGTTGTCAACCACATCC
16 CsTPS3 S416T, G417T, GGATGTGGTTGACAACATTGGATAGGTAGTTGTAAC
S418Y_Reverse TAATGCAACCGTCATGTACTCATC
Resultados: En la Tabla 2 se muestran las sustituciones simples y múltiples de aminoácidos que fueron introducidas en la secuencia de aminoácidos del polipéptido natural CsTPS3 (SEQID NO:2), como consecuencia de las sustituciones de pares de bases introducidas en la secuencia nucleotídica natural del cDNA del gen Cstps3 (SEQ ID NO:1 ) (Fig. 1A). La secuencia nucleotídica de las moléculas de ácidos nucleicos mutados objeto de la presente invención, que codifican variantes modificadas de la δ-cadineno sintasa de naranjo (CsTPS3, SEQ ID NO:2) corresponden a las versiones VB2 (SEQ ID NO:3; Fig. 1 B), VB5 (SEQ ID NO:5; Fig. 1 C), VC1 (SEQ ID NO: 7; Fig. 1 D) y VC2 (SEQ ID NO: 9; Fig. 1 E). Las moléculas mutadas de cDNA codifican polipéptidos modificados que contienen la substitución no conservada S418H o C455G, o la substitución conservada S416T en combinación con las substituciones no conservadas G417T y S418Y (Fig. 3). El alto grado de similaridad que se ha encontrado entre cientos de sesquiterpeno sintasas vegetales sugiere que la actividad catalítica de estos enzimas es consecuencia directa del plegamiento de la proteína. La comparación de la secuencia de las sesquiterpeno sintasas vegetales ha demostrado que sus motivos altamente conservados controlan reacciones de ciclización comunes a todas ellas, mientras que las regiones variables contribuyen a las diferencias en el plegamiento del sitio activo. Los cambios en la geometría del sitio activo pueden forzar diferentes conformaciones del sustrato FPP y de los intermediarios macrocíclicos que controlan la catálisis selectiva y la racionalización de sus diferentes productos. La identificación de los residuos de aminoácidos implicados en los mecanismos de la reacción de diferentes TPS y la generación de variantes con propiedades catalíticas alteradas, ha sido posible gracias a la comparación y análisis de secuencias en combinación con el modelaje in silico usando como molde la estructura 3D de algunas sesquiterpeno sintasas (Chang y col., [2005] Biotechnol Lett. 27, 285-288; Deligeorgopoulo y Alleman, [2003] Biochemistry 42, 7741 -7747; Kampranis y col., [2007] Plant Cell 19, 1994-2005; Yoshikuni y col., [2006], Chem Biol. 13, 91 -98). El alineamiento de la secuencia de aminoácidos del polipéptido natural CsTPS3 de naranjo con sesquiterpeno sintasas filogenéticamente relacionadas, reveló algunos cambios de aminoácidos en su región C-terminal, en posiciones análogas a aquellos residuos que se han implicado en la formación de varios sesquiterpenos bicíclicos (Fig. 5). El modelaje in silico del polipéptido CsTPS3 realizado en base a la homología con la estructura cristalizada de la 5-ep/-aristoloqueno sintasa de tabaco (TEAS, PBD: 5EAT; Starks y col., [1997] Science 277, 1815-1820), demostró que el enzima CsTPS3 tiene en efecto el plegamiento típico de enzimas sesquiterpeno sintasas (Fig. 10). El modelaje molecular de la δ-cadineno sintasa de naranjo (CsTPS3) reveló además que la mayoría de los aminoácidos involucrados en la catálisis del substrato FPP están altamente conservados, y que tienen una disposición espacial casi idéntica a la correspondiente a la proteína modelo TEAS (Fig. 11 ). Sin embargo, la identidad y localización espacial de algunos aminoácidos que están en contacto directo con el substrato FPP en la cavidad catalítica de la CsTPS3, difieren con respecto a la observada en la proteína modelo TEAS (Fig. 10). Por ejemplo, los aminoácidos de la tétrada 401JJJY404 I involucrados en la estabilización del intermediario carbocatiónico mediante cargas parciales distribuidas localmente en la cavidad catalítica de la TEAS (Starks y col., [1997] Science 277, 1815-1820), corresponden a la secuencia 415TSGS418 en el polipéptido CsTPS3 (Figs. 5 y 11 ). Para analizar el impacto de estos residuos en la racionalización de los sesquiterpenos producidos por la ciclasa CsTPS3, los residuos S416 (T402 in TEAS), G417 (T403 in TEAS), y S418 (T404 in TEAS) se modificaron mediante mutagénesis dirigida (Tabla 2). La mutagénesis de los aminoácidos seleccionados (Tabla 2), de forma individual o múltiple, resultó en proteínas enzimáticamente competentes pero con una actividad catalítica alterada. Las mutaciones introducidas causaron incremento/ y/o supresión del rendimiento de los sesquiterpenos específicos, en comparación con los producidos por el enzima natural CsTPS3 de naranjo. Para investigar la posible contribución del residuo C455 (ubicado cerca del motivo NSE/DTE; Fig. 5) a la especificidad de producto del polipéptido natural CsTPS3, su cadena lateral nucleofílica se reemplazó por la cadena lateral menos reactiva del aminoácido Gly (G). El reemplazamiento C455G causó la conversión de la actividad δ- cadineno sintasa del polipéptido natural CsTPS3 (SEQ ID NO:2), en la actividad elemol sintasa exhibida por el polipéptido modificado CsTPS3-VB2 (Fig. 7B y 8B). El polipéptido CsTPS3-VB2 produjo mayoritariamente elemol (77,49% [Tabla 5], 66,70% [Tabla 6]), además de guaiol (22,51 % [Tabla 5]), o una cantidad discreta bulnesol (15,48% [Tabla 6]) junto con una pequeña cantidad de δ-cadineno (3,19% [Tabla 6]). Adicionalmente, la substitución C G causó una drástica reducción de la racionalización de todos los productos colaterales minoritarios formados por el enzima natural δ-cadineno sintasa (CsTPS3) (Fig. 7 y 8, Tablas 5 y 6). Es probable que la substitución C455G haya afectado la isomerización del Z,£-germacradienil catión (Fig. 9A), a la vez que favorecería el cierre del £,£-farnesil catión entre los carbonos C10 - C1 . Esta etapa de ciclización daría lugar a la formación del hedicariol, el precursor del elemol (Fig. 9B). La substitución múltiple de C455G y S418H en la secuencia natural del polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2), tuvo un efecto aditivo sobre la producción de elemol (Fig. 7C y 8C). Asimismo, la combinación de las mutaciones C455G y S418H tuvo además de un efecto negativo sobre la producción de otros productos colaterales minoritarios (Fig. 7C y 8C, Tablas 5 y 6). Así el polipéptido modificado CsTPS3-VB5 (SEQ ID NO:6), el cual lleva las substituciones C455G y S418H, produjo elemol de una forma casi exclusiva (87,78% [Tabla 5], 83,86% [Tabla 6]). El polipéptido modificado CsTPS3-VB5 produjo además una cantidad discreta de guaiol (12,22%, [Tabla 5]), o bulnesol (1 1 ,4%, [Tabla 6]) junto con una pequeña cantidad de δ-cadineno (1 ,15% [Tabla 6]), y solo trazas de de otros sesquiterpenos colaterales. El efecto sinergístico de las mutaciones C455G y S418H sobre la producción de elemol se estimó entre un 13 - 29%, dependiendo del método enzimático utilizado (Tablas 5 y 6). En el escenario mecanístico, parece probable que la substitución del grupo hidroxilo de la Ser en la posición 418 (S418) por la cadena lateral más larga y voluminosa de la His (S418H), estabilice el £,£-germacradienil catión en la parte inferior hidrofóbica de la cavidad catalítica del polipéptido modificado CsTPS3-VB5 (SEQ ID NO:6). El modelaje in silico del polipéptido CsTPS3-VB5 realizado sobre la estructura de la proteína TEAS, mostró que las cadenas laterales de los aminoácidos mutados alteran la geometría de la cavidad catalítica del sitio activo del enzima, en comparación con la correspondiente al polipéptido natural CsTPS3 (SEQ ID NO:2) (Fig. 12).
En un intento de transmutar la actividad δ-cadineno sintasa del polipéptido natural CsTPS3 (SEQI ID NO:4), en una germacreno D sintasa, la triada 416SGS418 se reemplazó por la secuencia 416ττγ418 (Figs. 1 D y 3), ya que la mayoría de estos residuos se encuentran bien conservados en casi todas las germacreno D sintasas filogenéticamente relacionadas con la CsTPS3 de naranjo, incluyendo la proteína modelo 5-ep/-aristoloqueno sintasa (Fig. 5 y 6). Efectivamente, la sustitución de la triada 416SGS418 por 416ττγ418 transformó la actividad δ- cadineno sintasa del polipéptido CsTPS3 (SEQ ID NO:2), en una germacreno D sintasa altamente eficiente correspondiente al polipéptido modificado CsTPS3-VC1 (SEQ ID NO:8) (Figs. 7D y 8D; Tabla 5 y 6). Así, el polipéptido CsTPS3-VC1 produjo casi exclusivamente germacreno D (77,61 % [Tabla 5], 84,46% [Tabla 6]). El modelaje in silico del polipéptido modificado CsTPS2-VC1 sobre la estructura de la proteína TEAS, mostró que las cadenas laterales de los aminoácidos 41bTTY alteran la geometría de la cavidad del sitio activo, en comparación con el correspondiente a la del enzima natural CsTPS3 (Fig. 12). La sustitución del grupo hidroxilo del residuo S422 por la corta cadena lateral alifática, de la Ala, cuya posición se encuentra conservada en todos los enzimas germacreno D sintasas relacionados filogenéticamente (Fig. 5), tuvo poco efecto sobre la actividad de la variante polipeptídica CsTPS-VC2 (SEQ ID NO:10), ya que esta mutación no alteró la producción de germacreno D (Fig. 7E y 8E, Tablas 5 y 6).

Claims

REIVINDICACIONES
1 . Un polipéptido caracterizado porque presenta actividad sesquiterpeno sintasa y su secuencia comprende al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO:14.
2. Un polipéptido según la reivindicación 1 , donde la actividad sesquiterpeno sintasa es al menos una seleccionada del grupo que consiste en: actividad δ-cadineno sintasa, actividad elemol sintasa y actividad germacreno D sintasa.
3. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que su secuencia comprende al menos un 90% de identidad con SEQ ID NO:2, o con la SEQ ID NO:2 modificada con al menos una susbstitución en un aminoácido que altera la actividad sesquiterpeno sintasa y/o especificidad de producto, y donde dicha susbtitución se selecciona entre al menos una del grupo compuesto por:
a. una substitución de la cisteína en posición 455 por glicina (C455G), y
b. una triple substitución de la serina en posición 416 por treonina, de la glicina en posición 417 por treonina, y de la serina en posición 418 por tirosina
(S416T/G417T/S418Y)
4. Un polipéptido según la reivindicación 3, donde la SEQ ID NO:2 modificada comprende además otra substitución en un aminoácido de su secuencia, y que:
a. cuando la SEQ ID NO:2 comprende la substitución C455G, es una substitución de la serina en posición 418 por histidina (S418H), y
b. cuando la SEQ ID NO:2 comprende la triple substitución S416T/G417T/S418Y, es una substitución de la serina en posición 422 por alanina (S422A).
5. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 que comprende una secuencia seleccionada del grupo compuesto por: SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:16 y SEQ ID NO:18.
6. Un polipéptido según la reivindicación 5, en el que:
a. cuando su secuencia comprende SEQ ID NO:2, presenta actividad δ-cadineno sintasa,
b. cuando su secuencia comprende SEQ ID NO:16, presenta actividad elemol sintasa, o c. cuando su secuencia comprende SEQ ID NO:18, presenta actividad germacreno D sintasa.
7. Un polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es una sesquiterpeno sintasa seleccionada del grupo compuesto por: la δ-cadineno sintasa CsTPS3 que consiste en SEQ ID NO:2, la elemol sintasa CsTPS3-VB2 que consiste en SEQ ID NO:4, la elemol sintasa CsTPS3-VB5 que consiste en SEQ ID NO:6, la germacreno D sintasa CsTPS3-VC1 que consiste en SEQ ID NO:8 y la germacreno D sintasa CsTPS3-VC2 que consiste en SEQ ID NO:10 .
8. Un ácido nucleico caracterizado porque comprende una secuencia que codifica un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Un ácido nucleico según la reivindicación 8, que cuando codifica un polipéptido comprendiendo SEQ ID NO:2, consiste en un polinucleótido que comprende SEQ ID NO:1.
10. Un ácido nucleico según la reivindicación 8 que, cuando codifica un polipéptido que comprende la secuencia SEQ ID NO:2 modificada, consiste en un polinucleótido que comprende la secuencia SEQ ID NO:1 con al menos una mutación seleccionada del grupo compuesto por:
a. una transversión T→G en la posición +1363 con respecto al codón de inicio (ATG) de SEQ ID NO:1 ; y
b. un grupo de sustituciones de los nucleótidos T→A/G→A/AGC→TAT en las posiciones
+1246/1249/1252-1254 con respecto al codón de inicio (ATG) de SEQ ID NO:1.
1 1 . Un ácido nucleico según la reivindicación 10 que consiste en un polinucleótido en el que, adicionalmente a la mutación en el polinucleótido de secuencia SEQ ID NO:1 , comprende además otra mutación en SEQ ID NO:1 que se selecciona entre:
a. una transversión/transición AG→CA en las posiciones +1252/1253 con respecto al codón de inicio, cuando SEQ ID NO:1 comprende la transversión T→G; y
b. una transversión T→A en la posición +1264 con respecto al codón de inicio de SEQ ID NO:1 , cuando SEQ ID NO:1 comprende el grupo de sustituciones T→A/G→A/AGC→TAT.
12. Un ácido nucleico según la reivindicación 8 que comprende una secuencia polinucleotídica seleccionada del grupo que consiste en: SEQ ID NO: 1 , SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:9.
13. Una construcción génica caracterizada porque comprende al menos un ácido nucleico definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12.
14. Un vector de expresión caracterizado porque comprende una construcción génica definida en la reivindicación 13.
15. Una cepa bacteriana caracterizada porque comprende un vector de expresión definido en la reivindicación 14.
16. Un método para obtener un polipéptido con actividad sesquiterpeno sintasa, caracterizado porque comprende cultivar una célula bacteriana transformada con un ácido nucleico definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, o con un vector recombinante que lo comprende, en condiciones adecuadas para favorecer o inducir la expresión de dicho ácido nucleico.
17. Uso de al menos un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la síntesis sesquiterpenos.
18. Uso según la reivindicación 17 caracterizado porque dicha síntesis se lleva a cabo in vitro.
19. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17 ó 18 caracterizado porque el sesquiterpeno sintetizado es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: a-cubebeno, a-copaeno, β-cubebeno, β-elemeno, a-gurjuneno, Ε-β-cariofileno, α-humuleno, germacreno D, biciclogermacreno, α-muuroleno, a-bulneseno, cubebol, δ-cadineno, elemol, germacreno D-4-ol, bulnesol y guaiol, o una combinación cuaquiera de dos o más de los anteriores.
20. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 caracterizado porque el sesquiterpeno sintetizado es al menos uno seleccionado del grupo que consiste en: δ-cadineno, elemol y germacreno D, o una combinación cuaquiera de dos o más de los anteriores.
21 . Un procedimiento para sintetizar al menos un sesquiterpeno caracterizado porque comprende:
a. incubar el substrato farnesil-pirofosfato con al menos un polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
b. dejar reaccionar hasta obtener un producto volátil que comprende el sesquiterpeno.
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