WO2015071592A1 - Dispositif à filtration et aspiration par capillarité pour retenir des cellules contenues dans un échantillon liquide - Google Patents

Dispositif à filtration et aspiration par capillarité pour retenir des cellules contenues dans un échantillon liquide Download PDF

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WO2015071592A1
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liquid
filtration
absorption
pore
pores
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PCT/FR2014/052880
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Yvon Cayre
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Biocarecell
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    • B01L2300/06—Auxiliary integrated devices, integrated components
    • B01L2300/0681—Filter

Definitions

  • the invention relates to the field of devices for retaining cells contained in a liquid sample.
  • the invention is especially suitable for retaining and isolating particular cells present in a liquid, especially blood, for example tumor cells or trophoblasts present in a blood sample taken from an individual.
  • the method is especially adapted to retain cells present in very small amounts in the liquid sample, such as trophoblasts in a maternal blood sample, also called rare cells.
  • the average number of rare cells such as trophoblasts in maternal blood, or isolated tumor cells is evaluated at about one to three cells per milliliter of blood (see, for example, Bianchi DW et al., "Current knowledge about fetal blood cells in the maternal circulation ", J. Perinat, Med, 1998, vol 26, p.175-185, for trophoblasts, and Vona G. et al.," A new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells. J. Pathol., 2000, 156, P.57-63, for tumor cells isolated from patients with liver cancer). In order to isolate such rare cells, it is therefore necessary to be able to filter a liquid sample of a large volume and in particular of at least several milliliters.
  • Methods and filtration machines of the ISET type are known, as described for example in the applications FR 2 782 730, FR 2 824 144 and WO 91/1 1245. These methods have been developed to offer non-invasive diagnostic methods and early detection of rare cells in blood samples taken from patients. These methods consist in drawing up a sample of liquid, possibly supplemented with a specific buffer solution, through a porous filter whose pore size is calibrated to be less than a minimum dimension of the desired cells. The cells sought can not cross the pores of the filter and then form on the latter a filter residue that can be recovered and analyzed.
  • ISET devices however, have a number of disadvantages.
  • the suction of the liquid sample through the filter is performed by creating a vacuum of the air contained in a tank hermetically fixed on the underside of the filter.
  • a micro-pump system is necessary to create this depression and imposes a power supply of the device which limits its portability.
  • this micro-pump system generates increased bulk, complexity of use, fragility and cost of the device.
  • the invention relates to a device for retaining rare cells contained in a liquid sample, comprising a filtering means of a liquid sample comprising a liquid inlet and a liquid outlet and a plurality of through filtration pores each connecting the liquid inlet to the liquid outlet by means of an inner surface of the filter pore, the filtration pores each having a filter pore inlet opening at the location of the liquid inlet and a filter pore outlet opening at the liquid outlet a liquid absorbing means having a liquid port associated with the liquid outlet of the filter means, the absorption means being capable of absorbing liquid through the filtration means, the liquid absorption means comprising a porous material able to absorb liquid by capillarity through the filtration means, the liquid absorbing means being capable of absorbing a quantity of liquid greater than a hundred microliters.
  • the porous material includes a plurality of absorption pores, each absorption pore extending through an interior absorption pore surface from an absorption pore inlet opening to the place of liquid access.
  • a maximum dimension of the inlet opening of the absorption pores is greater than a maximum dimension of the outlet opening of the filtration pores.
  • a maximum dimension of the inlet opening of the absorption pores is greater than fifty micrometers, and a maximum dimension of the outlet opening of the filtration pores is less than twenty micrometers.
  • the inlet opening of each absorption pore is able to register between a concentric first and second circle respectively having a diameter of fifty micrometers and two hundred micrometers, and the outlet opening.
  • each filter pore is able to register between a first and a second concentric circle having a diameter of four micrometers and twenty micrometers respectively.
  • the inner surface of each absorption pore has superhydrophilic properties. In this way, the accumulation of the cells of the liquid is prevented effectively.
  • the inner surface of each filter pore has super-hydrophilic properties, so as to ensure, if necessary, a super-hydrophilic continuity between the filtering means and the porous material.
  • the inner surfaces of absorption and / or filtration pore having hydrophilic properties comprise a super-hydrophilic layer such as a layer of poly (vinylpyrrolidinone), hyaluronic acid, titanium dioxide or another super-hydrophilic material.
  • the super-hydrophilic layer has a thickness of less than one micrometer. In this way, the size and pore density of the filter means and the pore size and density of the absorption means are optimized.
  • the porous material comprises glass fibers, polymer fibers, in particular polyethylene, polyester or polyester / polyethylene fibers, or ceramic fibers.
  • the porous material comprises an open cell porous structure, in particular a crosslinked structure.
  • the liquid access of the liquid absorbing means and the liquid outlet of the filtering means each have a generally planar flat shape and are in contact with each other.
  • the porous pore volume material is capable of absorbing liquid by capillarity preferentially in a direction of height oriented perpendicularly to the general flat surface shape of the liquid access.
  • the liquid access comprises a super-hydrophilic layer such as a layer of poly (vinylpyrrolidinone), hyaluronic acid, titanium dioxide or another super-hydrophilic material, said layer being in contact with the liquid outlet.
  • a super-hydrophilic layer such as a layer of poly (vinylpyrrolidinone), hyaluronic acid, titanium dioxide or another super-hydrophilic material, said layer being in contact with the liquid outlet.
  • the pore volume material extends in a direction of height oriented perpendicularly to the general flat surface shape of the liquid access of the absorption means, from the liquid access of the absorption means to a termination of the porous volume material by a lateral surface of the porous volume material,
  • the porous volume material has a maximum dimension of height, measured perpendicular to the overall flat surface shape of the liquid port, greater than or equal to a maximum extent of extension of the overall flat surface shape of the access of liquid.
  • the pore volume material has a generally cylindrical or polyhedral shape having a maximum dimension substantially between one and fifteen centimeters, preferably about seven centimeters.
  • the absorption means is capable of absorbing a quantity of liquid of between one and fifty milliliters, preferably between two and twenty milliliters, preferably about ten milliliters.
  • the liquid access of the absorption means has a general disk or polygon shape having a maximum dimension substantially between five and fifty millimeters, preferably about twenty millimeters.
  • the liquid access of the absorption means has a plurality of prominences extending at least in part within the filtration pores from the outlet openings of said pores.
  • a maximum dimension of the outlet opening of each filtration pore is greater than a maximum dimension of the inlet opening of said filtration pore, the inner surface of the filtration pores having a generally truncated shape, in particular a frustoconical general shape.
  • the inlet opening of each filter pore is able to register between a first and a second concentric circle having a diameter of three micrometers and ten micrometers, preferably having a diameter of four micrometers, respectively. and nine micrometers, and the outlet opening of each filter pore is able to register between a first and a second concentric circle having respectively a diameter of eight micrometers and twenty-five micrometers, preferably having respectively a diameter thirteen micrometers and twenty micrometers.
  • the inlet opening of each filtration pore has a generally circular or oval shape
  • the outlet opening of each filter pore has a generally circular, oval shape or a general shape of a convex polygon, in particular a hexagon.
  • the inlet apertures of the filtration pores are disposed at the place of the liquid inlet in a honeycomb type arrangement. In this way, the filtration of the liquid sample is carried out quickly.
  • the inlet openings of the filtration pores at the place of the liquid inlet have a surface density of the order of ten thousand pores / cm 2 . In this way, the flow of liquid through the filtration means is improved.
  • the device further comprises a liquid supply tank having a cavity adapted to contain a liquid, the cavity being provided with a liquid supply opening through which liquid is able to be supplied, the inlet of liquid of the filtration means being associated with the liquid supply opening.
  • the liquid supply reservoir is capable of containing a quantity of liquid of between one and fifty milliliters, preferably between two and twenty milliliters, preferably about ten milliliters.
  • the liquid inlet and the liquid outlet of the filtering means each have a generally planar flat shape, said flat flat general shapes being substantially parallel to each other, the liquid inlet and the liquid outlet being separated by a distance of thickness, measured perpendicular to the general flat surface shape of the liquid inlet, substantially between twenty and sixty-five microns and preferably between twenty and thirty microns.
  • the liquid inlet and the liquid outlet of the filtration means each have a general disc or polygon shape having a maximum dimension substantially between five and ten millimeters
  • the filtering means has a generally cylindrical or polyhedral shape having a maximum dimension substantially between ten and twenty millimeters.
  • the filtration means extends between a first end face and a second end face, said first and second end faces respectively comprising the liquid inlet and the liquid outlet, the second end face of the filtration means has a maximum dimension greater than a maximum dimension of the liquid outlet, so as to have a non-porous peripheral portion. In this way, it is possible to removably fix the filtering means to the device and to extract it to carry out an analysis of the selected cells.
  • the peripheral portion of the filtering means has a general circular or polygonal ring shape having an inner maximum dimension substantially between five and ten millimeters and an outer maximum dimension substantially between ten and twenty millimeters.
  • the peripheral portion of the filtration means comprises an inactive adhesive coating, in particular a pressure-activatable adhesive or an adhesive coated with a detachable protective membrane, so as to allow a subsequent sizing of the filtration means on an observation support.
  • the filtering means comprises a transparent material in wavelengths of the visible spectrum.
  • the filtration means comprises a material chosen from a polysulfone, a polyethylene and a glass.
  • filtration pores are made by a method comprising at least one step of microlithography, laser etching, particle bombardment, etching or nano-printing lithography.
  • the filtering means is sealingly mounted on the liquid supply tank.
  • the device further comprises a detachment ring mounted on a thread of the liquid supply reservoir, the detachment ring having a contact portion arranged to come into contact with the filtration means during rotating the detachment ring and allowing detachment of the filter means from the liquid supply reservoir.
  • the subject of the invention is a method for retaining cells contained in a liquid sample, comprising a step of aspiration and filtration of a liquid sample by a liquid absorption means and a means for filtration, the filtering means of a liquid sample comprising a liquid inlet and a liquid outlet, the liquid absorption means being associated with the liquid outlet of the filtration means and able to absorb liquid through the medium filtering means, the filtering means being provided with a plurality of filtering pores each connecting the liquid inlet to the liquid outlet by means of an inner pore surface, the filtering pores each having an inlet opening at the place of the liquid inlet and an outlet opening at the place of the liquid outlet, the liquid absorbing means comprising a porous material capable of absorbing liquid by capill
  • the liquid absorbing means is adapted to absorb a quantity of liquid greater than one hundred microliters.
  • the method further comprises recovering the filtering means after aspiration and filtration of the liquid sample. In this way it is possible to analyze the cells retained after filtration.
  • Figure 1 is a general diagram of a device according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 2 corresponding to a longitudinal section of the device of FIG. 1.
  • Figures 3 and 4 schematically illustrate a filtration means of the device of Figure 1 seen respectively by its first and second face.
  • FIGS. 5 and 6 are three-dimensional and two-dimensional diagrams illustrating a longitudinal section of the filtration means of FIGS. 3 and 4.
  • Figures 7 and 8 are detailed views respectively of an inlet opening and a pore outlet opening of the filter means of Figures 3 to 6.
  • Figure 9 is a detailed diagram of the device of Figures 1 and 2 illustrating the attachment of the filter means on the liquid supply tank.
  • Figure 10 schematically illustrates a longitudinal section of the porous material of the liquid absorbing means of a device according to one embodiment of the invention.
  • FIG. 11 is a view of a liquid access of the liquid absorption means of a device according to one embodiment of the invention.
  • Figure 12 is a detail sectional view of a filter means and a liquid absorption means of a device according to one embodiment of the invention.
  • the invention relates to a device 1 for retaining rare cells 2 contained in a liquid sample 3 having a volume substantially greater than one hundred microliters, for example a few milliliters, for example between one and fifty milliliters.
  • the invention can be applied to any liquid sample containing rare cells to be isolated. It is particularly applicable to the isolation of rare cells in a blood sample, for example tumor cells or trophoblasts present in a blood sample taken from an individual.
  • the blood sample may previously have been diluted in a suitable liquid buffer as is known from the state of the art.
  • the cells 2 are present in extremely small quantities in the blood samples studied, typically only a few cells per sample or a single cell, despite the large volumes of the blood samples in question, between one and fifty milliliters. .
  • a device 1 for this purpose and referring first to FIGS. 1 and 2, a device 1 according to the invention comprises a filtration means 4 of the liquid sample 3 and a liquid absorption means 5.
  • the device 1 can understand in in addition to a liquid supply reservoir 6 having a cavity 7 adapted to contain a liquid and in particular the liquid sample 3.
  • the liquid supply reservoir 6 is able to contain a quantity of liquid of between one and fifty milliliters, preferably between two and twenty milliliters, preferably about ten milliliters.
  • the liquid sample 3 may be provided by a liquid supply circuit such as to allow the integration of a device according to the invention into a system. Automated blood test.
  • the cavity 7 is provided with a liquid supply opening 8 through which liquid is able to be supplied, the filtration means 4 comprises a liquid inlet 9 and a liquid outlet 10, and the absorption means liquid 5 has a liquid access 1 1.
  • a displacement of liquid in the device 1 can be allowed as follows.
  • the liquid supply opening 8 of the cavity 7 is associated with the liquid inlet 9 of the filtration means 4 while the liquid outlet 10 of the filtration means 4 is associated with the liquid access 1 1 of the means liquid absorption 5.
  • the device 1 may have a symmetry of revolution about a longitudinal axis X and the liquid supply reservoir 6, the filtration means 4 and the liquid absorption means 5 may be aligned and juxtaposed along this longitudinal axis X.
  • the longitudinal axis X may be vertical but may also be inclined or horizontal without the device being affected. In particular, if the longitudinal axis X is inclined or horizontal, the device 1 may not have symmetry of revolution about this axis to facilitate the filling of the liquid supply reservoir 6 and the circulation of the liquid in the device 1.
  • a plurality of filtering through pores 12 each connect the liquid inlet 9 to the liquid outlet 10 by means of an inner filter pore surface 13.
  • the filtration pores 12 each include a filter pore inlet opening 14 at the liquid inlet 9 and a filter pore outlet opening 15 at the liquid outlet location 10. The filtration means 4 thus form a porous filter.
  • liquid of the liquid sample 3 can flow from the liquid supply reservoir 6 to the absorption means 5, through the liquid filtration means 4, and in particular through the pores of the liquid. filtration 12 of the liquid filtration means 4.
  • the inlet opening 14 of each through pore 12 is adapted to retain the rare cells 2 sought in the liquid sample 3.
  • a maximum dimension Def of the inlet opening 14 of each through pore 12 may advantageously be chosen to be less than a minimum average size of the rare cells 2 sought and, as far as possible, greater than the dimensions of the constituents of the liquid sample 2 that it is not desirable to isolate (for example micro -organisms, cells or elements of the blood plasma not sought).
  • a maximum dimension Dsf of the outlet opening 15 of each through pore 12 is greater than the maximum dimension Def of the inlet opening 14 of said through pore 12.
  • the term "Maximum dimension" of a considered element the greater distance separating two points from the element.
  • each through pore 12 thus has a general trunk shape, in particular a generally frustoconical shape.
  • each through pore 12 is for example adapted to register between a concentric first and a second circle Cef1, Cef2 having respectively a diameter of three micrometers and ten micrometers.
  • said first and second concentric circles Cef1, Cef2 may have a diameter of four micrometers and nine micrometers, respectively.
  • each through pore 12 may, for its part, be able to register between a concentric first and second circle Csf1, Csf2 having a diameter of eight micrometers and twenty-five micrometers, respectively, and having advantageously respectively a diameter of thirteen micrometers and twenty micrometers.
  • the inlet opening 14 of each through pore 12 has a generally circular or oval shape, so as to be adapted to the cells to be isolated and can be made simply and inexpensively.
  • the outlet opening 15 of each through pore 12 may also have a generally circular, oval shape or a general shape of a convex polygon, in particular a hexagon for the reasons detailed hereinafter.
  • the inlet openings 14 of the through pores 12, at the location of the liquid inlet 9, may be arranged in a honeycomb type arrangement.
  • the exit apertures 15 of the through pores 12 at the location of the liquid outlet 10 can then also be arranged in a honeycomb arrangement.
  • the entry openings 14 of the pores passing through 12, at the location of the 9, have a surface density of about 1 x 10 5 pores / cm 2 .
  • the filtering means 4 may have a suitable thickness.
  • the liquid inlet 9 of the filtration means 4 may have a generally planar flat shape 16.
  • the liquid outlet 10 may also have a generally planar flat shape 17, said flat flat general shapes 16, 17 being substantially parallel to each other.
  • the liquid inlet 9 and the liquid outlet 10 can then be separated by a distance of thickness E substantially between twenty and sixty-five microns and preferably between twenty and thirty microns.
  • the thickness distance E is measured in a direction of thickness X 'perpendicular to the general flat surface shape 16 of the liquid inlet 9.
  • the direction of thickness X' may in particular be substantially parallel with the longitudinal axis X.
  • each through pore 12 having a generally frustoconical shape can thus have a non-zero opening angle A, measured between said surface and the direction of thickness X '.
  • the opening angle A can be between four and thirty degrees.
  • the liquid inlet 9 and the liquid outlet 10 of the filtration means 4 may each have a general disk shape 16, 17 or polygon having a maximum dimension Del, Dsl substantially between five and ten millimeters.
  • the liquid inlet 9 and the liquid outlet 10 of the filtration means 4 may be substantially identical in shape.
  • the filtration means 4 has a generally cylindrical or polyhedral shape 18 having a maximum dimension Df substantially between ten and twenty millimeters.
  • the filtering means 4 has a distance of small thickness E in front of the maximum dimensions Del, Dsl of the liquid inlet 9 and the liquid outlet 10.
  • the filtration means 4 thus has the shape of a flat pellet. It is advantageously made of a single piece, rigid and integral.
  • the maximum dimension Df of the filtration means 4 then corresponds, for example, to a diameter of an end face of the filtration means 4.
  • the liquid filtration means 4 has a symmetry of revolution around the direction of thickness X ', but it should be noted that the liquid filtration means 4 may also have a polyhedron shape. for example square-based polyhedron. It then adopts for example a form of square, rectangular or polygonal lozenge.
  • the filtration means 4 extends between a first end face 19 and a second end face 20, said first and second end faces respectively comprising the liquid inlet 9 and the outlet of Nquidel O.
  • the second end face 20 of the filtration means 4 advantageously has a maximum dimension Dse greater than the maximum dimension Ds1 of the liquid outlet 10, so as to have a non-porous peripheral portion 21.
  • the first end face 19 may also have a maximum dimension Dpe greater than the maximum dimension Del of the liquid inlet 9, so as to also have a non-porous peripheral portion 21
  • the maximum dimension D of the second end face 20 may be substantially equal to the maximum dimension Df of the filtering means 4 when the thickness E of the latter is small in front of the maximum dimension D 1 of the second end face 20.
  • the filtration means 4 then forms a thin plate having a non-porous peripheral portion.
  • the peripheral portion 21 of the filtering means then has a general shape in a circular or polygonal ring.
  • the peripheral portion 21 has a maximum internal dimension Dppi substantially between five and ten millimeters and a maximum external dimension Dppe substantially between ten and twenty millimeters.
  • the peripheral portion 21 of the filtration means 4 may comprise an inactive adhesive coating 23, in particular a pressure-activatable adhesive or an adhesive coated with a detachable protective membrane.
  • the filtration means 4 comprises, or is entirely made of, a transparent material in wavelengths of the visible spectrum.
  • the filtration means 4 may advantageously comprise a material chosen from a polysulfone, a polyethylene or a glass.
  • each pore 12 passing through may have super-hydrophilic properties.
  • each pore 12 through is covered with a super-hydrophilic layer such as a layer of poly (vinylpyrrolidinone), hyaluronic acid or titanium dioxide.
  • a super-hydrophilic layer such as a layer of poly (vinylpyrrolidinone), hyaluronic acid or titanium dioxide.
  • the super-hydrophilic layer has a thickness Ec less than one micrometer.
  • the through pores may for example be made by a method comprising at least one step of microlithography, laser etching, particle bombardment, etching or nano-printing lithography.
  • the absorption means 5 comprises a liquid suction device adapted to create a vacuum at the liquid outlet 10 of the filtering means, for example by means of a pump connected to a reservoir placed in sealing contact with the filtering means.
  • the absorption means 5 comprises a porous material capable of absorbing liquid by capillarity through the filtration means 4.
  • the liquid absorbing means 5 may be capable of absorbing a liquid quantity substantially greater than one hundred microliters, and in particular greater than one milliliter, for example a quantity of liquid of between one and fifty milliliters.
  • the liquid absorbing means 5 is capable of absorbing a quantity of liquid of between two and twenty milliliters, preferably about ten milliliters.
  • the device 1 according to the invention can make it possible to implement a method for retaining cells contained in a liquid sample, for example as follows.
  • Such a method may comprise a step of filling the cavity 7 of the liquid supply reservoir 6 with the liquid sample 3 containing the cells 2.
  • this process may comprise a step of aspiration and filtration of the liquid sample 3 during which the liquid absorption means 5 absorbs or draws liquid from the liquid sample 3 through the filtration means 4 .
  • a subsequent step involves the recovery of the filtration means 4 after aspiration and filtration of the liquid from the liquid sample 3.
  • the filtration means 4 can advantageously be removably mounted on the liquid supply reservoir 6.
  • the liquid supply reservoir 6 has a sealing portion 25 at the location of the liquid supply opening 8.
  • the sealing portion 25 is in particular adapted to seal with the filtration means 4 of the in order to allow a passage of the liquid present in the cavity 7 in the filtration means 4.
  • the sealing portion 25 has a funnel shape.
  • the sealing portion 25 has at its end a prominent or recessed annular rib 26 on which is mounted an annular seal 27 adapted to be in contact with the filtering means 4, in particular with its first end face 19, for example with the peripheral portion 21 of the first end face 19, so as to ensure a seal between the liquid supply reservoir 6 and the filtration means 4.
  • the liquid supply reservoir 6 also has a retaining ring 28 to hold the filtration means 4 fixed relative to the reservoir.
  • the retaining ring 28 may comprise for this purpose an annular shoulder 29 in which the fixing means is adapted to be housed.
  • the annular shoulder 29 can thus come into contact with the second end face 20 of the filtering means and allow, with the annular seal 27, to immobilize in translation along the longitudinal axis X of the device 1, the filtering means 4 with respect to the liquid supply reservoir 6.
  • the filtration means 4 may further come into close contact with an inner surface 30 of the retaining ring 28 so as to ensure complete immobilization, in all directions, of the filtration means 4 relative to to the liquid supply tank 6.
  • a detachment ring 31 can be mounted on the retaining ring 28 or on the sealing part 25.
  • the detachment ring 31 is mounted on the retaining ring 28 by means of a thread 32.
  • the detachment ring 31 has an outer portion 33 for gripping by a user and a contact portion 34 adapted to come into contact with the filtration means 4.
  • the outer portion 33 is disposed outside the retaining ring 28 while the contact portion 34 is disposed within said ring.
  • the outer portion 33 and the contact portion 34 are integral and form a rigid integral assembly. They are interconnected by one or more connecting portions 35 through openings in the retaining ring 28 (not shown in Figure 9).
  • the thread 32 makes it possible to transform a rotation of the detachment ring 31 with respect to the liquid supply reservoir 6, made by a user, in a translation of the detachment ring 31 with respect to the liquid supply reservoir 6 according to the longitudinal axis X of the device 1.
  • the contact portion 34 comes into contact with the filtration means 4, at the location of its first end face 19, and in particular at the location of the peripheral portion 21 of the first end face 19. If the rotation is prolonged by the user, the force exerted by the contact portion 34 on the first end face 19 may then be sufficient to cause elastic deformation of the holding ring 28 and in particular the annular shoulder 29 of said ring, so as to allow extraction of the filtering means 4 out of the retaining ring 28.
  • the filtration means 4 can thus be recovered after aspiration and filtration of the liquid of the liquid sample 3.
  • the liquid absorbing means 5 of the device 1 comprises a porous material 36 adapted to absorb liquid by capillarity through the filtration means 4.
  • the liquid absorption means 5 is more precisely capable of absorbing a quantity of liquid substantially greater than one hundred microliters, and in particular greater than one milliliter, for example a quantity of liquid of between one and fifty milliliters.
  • the liquid absorbing means 5 is capable of absorbing a quantity of liquid of between two and twenty milliliters, preferably about ten milliliters.
  • the porous material 36 is able to absorb the entire volume of the liquid sample 3 or the entire volume of liquid contained in the liquid supply reservoir 6.
  • the porous material 36 is able to absorb only a portion of the liquid sample 3 and may for example comprise a liquid release outlet 37 adapted to allow a liquid outlet out of the porous material 36.
  • the liquid absorbing means 5 may in particular comprise a disengagement reservoir 38, said reservoir comprising a disengagement cavity 39 in which the porous material 36 is housed at least partially.
  • the liquid release outlet 37 of the porous material 36 may be disposed inside the clearance cavity 39 so that the clearance cavity 39 is adapted to receive liquid coming out of the porous material 36.
  • the clearance cavity 39 is made of a liquid-tight material and thus adapted to contain liquid coming out of the porous material 36.
  • the liquid access 1 1 of the liquid absorbing means 5 and the liquid outlet 10 of the filtration means 4 may each have a generally flat surface shape 12 and be in intimate contact with each other.
  • a spring 52 can urge the porous material 36 against the filtration means 4.
  • the spring 52 may in particular be a spring elastically constrained between the clearance cavity 39 and the porous material 36, biasing the porous material 36 on a face of said porous material 36 axially opposite to the liquid inlet 1 1 of the absorption means of 5.
  • the spring 52 may be a spring washer.
  • the liquid access 1 1 of the absorption means 5 may thus have a general shape 45 disk or polygon having a maximum dimension Dal substantially between five and fifty millimeters, preferably about twenty millimeters.
  • the porous volume material 36 may for example comprise an open cell porous structure, in particular a crosslinked structure, so as to allow an adaptation of the volume capacity and the transfer rate of the liquid.
  • the porous volume material 36 thus comprises, for example, synthetic fibers 40 of polyethylene and polyester, for example synthetic fibers comprising a polyester or polyethylene core surrounded by a sheath made of polyethylene or polyester.
  • the porous material 36 has a plurality of absorption pores 41 extending through an interior absorption pore surface 42 from an absorption pore inlet opening 43 at the location of the access port.
  • liquid 1 1.
  • the absorption pores 41 may each extend to an absorption pore outlet opening 44, for example disposed at the location of the liquid outlet 37.
  • the porous volume material 36 can extend in a direction of height X "oriented perpendicularly to the overall flat surface shape 45 of the liquid inlet 11.
  • the height direction X" can in particular be substantially parallel with the longitudinal axis X.
  • the porous volume material 36 may be adapted to achieve a liquid absorption preferably in the direction of height X "oriented perpendicularly to the general flat surface 45 of the liquid access 11.
  • the porous volume material 36 may preferentially allow a flow of liquid along the longitudinal axis X, or in the direction of height X ", and less preferably a flow of liquid in lateral directions Y", Z "perpendicular to said height direction X", or perpendicular to said longitudinal axis X.
  • the synthetic fibers 40 of the porous volume material 36 can be oriented so as to allow absorption and a flow of liquid preferably in the direction of height X "oriented perpendicular to the general flat surface 45 of the liquid access 1.
  • the porous volume material 36 may comprise the liquid inlet 11 of the absorption means 5 and extend therefrom to a termination 46 of the porous volume material 36 by a lateral surface 47 of the porous volume material 36 .
  • the porous volume material 36 does not have absorption pores on the lateral surface 47 and the absorption pores extend substantially along the height direction X ", but it should be noted. that in alternative embodiments of the invention, the absorption pores may also extend along the lateral directions Y ", Z" and the porous volume material 36 may have absorption pores on the lateral surface 47.
  • the porous volume material 36 may thus have a maximum dimension of height Dh greater than or equal to a maximum extension dimension Dal of the general flat surface shape 45 of the liquid access 1 1.
  • the porous volume material 36 may in particular have a generally cylindrical shape 48, having for example a rotation symmetry around the height direction X ", or a general polyhedral shape, the porous volume material 36 may have a maximum dimension Dm that is substantially between one and fifteen centimeters, preferably about seven centimeters.
  • the absorption means 5 and in particular the porous volume material 36 may comprise glass fibers, polymer fibers, in particular polyethylene, polyester or polyester / polyethylene fibers, or ceramic fibers.
  • the inner surface 42 of each absorption pore 41 has super-hydrophilic properties.
  • the inner surface 13 of each filtration pore 12 also has super-hydrophilic properties as detailed above, so as to ensure, where appropriate, a superhydrophilic continuity between the filtration means 4 and the means of filtration. absorption 5.
  • the inner absorption pore surfaces having hydrophilic properties may in particular comprise a super-hydrophilic layer 50 such as a layer of Poly (vinylpyrrolidinone), hyaluronic acid, titanium dioxide or other super-hydrophilic material. hydrophilic, as detailed above concerning the inner surface 13 of the filtration pores 12.
  • the super-hydrophilic layer 50 has a thickness of less than one micrometer so as not to significantly reduce the diameter of said pores.
  • the liquid access 1 1 of the liquid absorbing means 5 may comprise a super-hydrophilic layer 50 such as a layer of poly (vinylpyrrolidinone), hyaluronic acid, titanium dioxide or other super material hydrophilic, said layer being in contact with the liquid outlet 10 of the filtration means 4.
  • a super-hydrophilic layer 50 such as a layer of poly (vinylpyrrolidinone), hyaluronic acid, titanium dioxide or other super material hydrophilic, said layer being in contact with the liquid outlet 10 of the filtration means 4.
  • the liquid access 1 1 of the absorption means 5 may also have a plurality of prominences 51 extending at least partly inside the filtration pores 12 to from the outlet openings 15 of said pores. In this way, the contact between the porous material 36 and the filtration means is maximal.
  • the dimensions of the absorption and filtration pores can be determined so as to maximize the absorption by capillarity through the filter.
  • a maximum dimension Dea of the inlet opening 43 of the absorption pores 41 is greater than a maximum dimension Dsf of the outlet opening 15 of the filtration pores 12 .
  • the maximum dimension Dea of the inlet opening 43 of the absorption pores 41 may be greater than fifty micrometers, and the maximum dimension Dsf of the outlet opening 15 of the filtration pores 12 may be less than twenty. micrometers.
  • the porous material can thus be able to absorb at least one milliliter of blood in less than one minute.
  • the inlet opening 43 of the absorption pores 41 may be able to register between a first and a second concentric circle Cea1, Cea2 having a diameter of fifty micrometers and two hundred micrometers, respectively.
  • the outlet opening 15 of each filtration pore 12 may be able to register between a concentric first and second circle Csf1, Csf2 having respectively a diameter of four micrometers and twenty micrometers.
  • the absorption pores 41 can be strongly anisotropic, and their dimensions can vary significantly.
  • At least half of the absorption pores 41 whose inlet opening 43 is in contact with the filtration means 4 are able to register between a first and a second port.
  • second concentric circle Cea1, Cea2 respectively having a diameter of fifty micrometers and two hundred micrometers.

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Abstract

Dispositif pour retenir des cellules rares contenues dans un échantillon liquide, comprenant un moyen de filtration d'un échantillon liquide comportant une entrée de liquide et une sortie de liquide ainsi qu'une pluralité de pores de filtration traversants reliant chacun l'entrée de liquide à la sortie de liquide au moyen d'une surface intérieure de pore de filtration, les pores de filtration comportant chacun une ouverture d'entrée de pore de filtration à l'endroit de l'entrée de liquide et une ouverture de sortie de pore de filtration à l'endroit de la sortie de liquide et un moyen d'absorption de liquide comportant un accès de liquide associé à la sortie de liquide du moyen de filtration, le moyen d'absorption étant apte à absorber du liquide à travers le moyen de filtration. Le moyen d'absorption de liquide comporte un matériau poreux apte à absorber du liquide par capillarité à travers le moyen de filtration, le moyen d'absorption de liquide étant apte à absorber une quantité de liquide supérieure à une centaine de microlitres.

Description

Dispositif à filtration et aspiration par capillarité pour retenir des cellules contenues dans un échantillon liquide L'invention concerne le domaine des dispositifs pour retenir des cellules contenues dans un échantillon liquide.
L'invention est tout spécialement adaptée à retenir et isoler des cellules particulières présentes dans un liquide, notamment le sang, par exemple des cellules tumorales ou des trophoblastes présentes dans un échantillon sanguin prélevé sur un individu. Le procédé est en particulier spécialement apte à retenir des cellules présentes en très faible quantités dans l'échantillon liquide, tels que les trophoblastes dans un prélèvement sanguin maternel, aussi appelées cellules rares.
Le nombre moyen de cellules rares telles que les trophoblastes dans le sang maternel, ou les cellules tumorales isolées, est évalué à environ une à trois cellules par millilitre de sang (voir par exemple Bianchi DW et al., « Current knowledge about fœtal blood cells in the maternai circulation », J. Perinat. Med. 1998, vol. 26, p.175- 185, pour les trophoblastes, et Vona G. et al., « A new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulating tumor cells », Am. J. Pathol., 2000, vo. 156, P.57-63, pour les cellules tumorales isolées de patients atteints d'un cancer du foie). Pour pouvoir isoler de telles cellules rares, il est donc nécessaire de pouvoir filtrer un échantillon liquide d'un volume conséquent et en particulier d'au moins plusieurs millilitres.
On connaît des procédés et des machines de filtration de type ISET tels que décrit par exemple dans les demandes FR 2 782 730, FR 2 824 144 et WO 91/1 1245. Ces procédés ont été développés pour offrir des méthodes de diagnostic non invasives et précoces permettant de rechercher des cellules rares dans des échantillons sanguins prélevés sur des patients. Ces méthodes consistent à aspirer un échantillon de liquide, éventuellement additionné d'une solution tampon spécifique, au travers d'un filtre poreux dont la taille des pores est calibrée pour être inférieure à une dimension minimale des cellules recherchées. Les cellules recherchées ne peuvent franchir les pores du filtre et forment alors sur ce dernier un résidu de filtration qui peut être récupéré et analysé.
Les dispositifs de type ISET présentent cependant un certain nombre d'inconvénients. L'aspiration de l'échantillon de liquide à travers le filtre est réalisée en créant une dépression de l'air contenu dans un réservoir hermétiquement fixé sur la face inférieur du filtre. Un système de micro-pompe est nécessaire pour créer cette dépression et impose une alimentation électrique du dispositif qui limite sa portabilité. En outre, ce système de micro-pompe génère un encombrement, une complexité d'utilisation, une fragilité et un coût accrus du dispositif.
Il a également été proposé d'employer un tube à vide tel que décrit par exemple dans les demandes FR 2 952 069 et WO 201 1/055091. Un tel tube à vide impose cependant l'utilisation d'une aiguille fine, adaptable de façon étanche sur une face inférieure du filtre et apte à percer le bouchon du tube à vide pour réaliser l'aspiration de l'échantillon liquide à travers le filtre. Le tube à vide et l'aiguille fine sont des composants fragiles et leur utilisation peut être malaisée voire dangereuse si la force à appliquer pour faire pénétrer l'aiguille dans le tube à vide est trop élevée. II est connu d'utiliser des éléments absorbants en feuille plate ou en languette comme des papiers de cellulose ou des textiles non-tissés pour absorber des éléments liquides du sang à travers un filtre et transporter de tels éléments entre un filtre et un élément d'analyse tel que cela est décrit par exemple dans les documents EP 0 122 581 , WO 03 100402 A1 et US 6,258,045. Ces éléments absorbants ne permettent cependant d'absorber qu'une quantité réduite de liquide, typiquement de l'ordre du microlitre, et ne sont donc pas adaptés à l'isolement et la retenue de cellules rares dans un échantillon de liquide de l'ordre du millilitre, c'est-à-dire de taille mille fois supérieure. L'utilisation de tels éléments absorbants conduirait à leur saturation et requerrait un temps de mise en contact largement prohibitif.
Il existe par conséquent le besoin de proposer un dispositif réalisant une isolation et une retenue améliorée de cellules rares contenues dans un échantillon liquide de façon simple, rapide, peu coûteuse et fiable.
Ci-après, un exposé de l'invention telle que caractérisée dans les revendications.
Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un dispositif pour retenir des cellules rares contenues dans un échantillon liquide, comprenant un moyen de filtration d'un échantillon liquide comportant une entrée de liquide et une sortie de liquide ainsi qu'une pluralité de pores de filtration traversants reliant chacun l'entrée de liquide à la sortie de liquide au moyen d'une surface intérieure de pore de filtration, les pores de filtration comportant chacun une ouverture d'entrée de pore de filtration à l'endroit de l'entrée de liquide et une ouverture de sortie de pore de filtration à l'endroit de la sortie de liquide un moyen d'absorption de liquide comportant un accès de liquide associé à la sortie de liquide du moyen de filtration, le moyen d'absorption étant apte à absorber du liquide à travers le moyen de filtration, le moyen d'absorption de liquide comportant un matériau poreux apte à absorber du liquide par capillarité à travers le moyen de filtration, le moyen d'absorption de liquide étant apte à absorber une quantité de liquide supérieure à une centaine de microlitres.
Selon une réalisation, le matériau poreux comporte une pluralité de pores d'absorption, chaque pore d'absorption s'étendant par une surface intérieure de pore d'absorption à partir d'une ouverture d'entrée de pore d'absorption à l'endroit de l'accès de liquide.
Selon une réalisation une dimension maximale de l'ouverture d'entrée des pores d'absorption est supérieure à une dimension maximale de l'ouverture de sortie des pores de filtration.
Selon un mode de réalisation, une dimension maximale de l'ouverture d'entrée des pores d'absorption est supérieure à cinquante micromètres, et une dimension maximale de l'ouverture de sortie des pores de filtration est inférieure à vingt micromètres. Selon une réalisation, l'ouverture d'entrée de chaque pore d'absorption est apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques ayant respectivement un diamètre de cinquante micromètres et de deux-cent micromètres, et l'ouverture de sortie de chaque pore de filtration est apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques ayant respectivement un diamètre de quatre micromètres et de vingt micromètres. Selon une réalisation, la surface intérieure de chaque pore d'absorption présente des propriétés superhydrophiles. De cette façon, l'accumulation des cellules du liquide est prévenu de façon efficace.
Selon une réalisation, la surface intérieure de chaque pore de filtration présente des propriétés super-hydrophiles, de façon à assurer le cas échéant une continuité super-hydrophile entre le moyen de filtration et le matériau poreux. Selon une réalisation, les surfaces intérieures de pore d'absorption et/ou de filtration présentant des propriétés hydrophiles comportent une couche super-hydrophile telle qu'une couche de Poly(vinylpyrrolidinone), d'acide hyaluronique, de dioxyde de titane ou d'un autre matériau super-hydrophile.
Selon une réalisation, la couche super-hydrophile a une épaisseur inférieure à un micromètre. De cette façon, la taille et la densité des pores du moyen de filtration et la taille et la densité des pores du moyen d'absorption sont optimisées. Selon une réalisation, le matériau poreux comporte des fibres de verre, des fibres de polymère, en particulier des fibres de polyéthylène, de polyester ou de polyester/polyéthylène, ou des fibres de céramique.
Selon une réalisation, le matériau poreux comporte une structure poreuse à cellules ouvertes, en particulier une structure réticulée.
Selon une réalisation, l'accès de liquide du moyen d'absorption de liquide et la sortie de liquide du moyen de filtration présentent chacun une forme générale surfacique plate et sont en contact l'un avec l'autre.
Selon une réalisation, le matériau poreux volumique poreux est apte à absorber du liquide par capillarité préférentiellement selon une direction de hauteur orientée perpendiculairement à la forme générale surfacique plate de l'accès de liquide.
Selon une réalisation, l'accès de liquide comporte une couche super-hydrophile telle qu'une couche de Poly(vinylpyrrolidinone), d'acide hyaluronique, de dioxyde de titane ou d'un autre matériau super-hydrophile, ladite couche étant en contact avec la sortie de liquide.
Selon une réalisation, le matériau poreux volumique s'étend selon une direction de hauteur orientée perpendiculairement à la forme générale surfacique plate de l'accès de liquide du moyen d'absorption, depuis l'accès de liquide du moyen d'absorption jusqu'à une terminaison du matériau poreux volumique par une surface latéral du matériau poreux volumique,
et dans lequel le matériau poreux volumique a une dimension maximale de hauteur, mesurée perpendiculairement à la forme générale surfacique plate de l'accès de liquide, supérieure ou égale à une dimension maximale d'extension de la forme générale surfacique plate de l'accès de liquide. Selon une réalisation, le matériau poreux volumique présente une forme générale cylindrique ou polyédrique ayant une dimension maximale sensiblement comprise entre un et quinze centimètres, de préférence environ sept centimètres.
Selon une réalisation, le moyen d'absorption est apte à absorber une quantité de liquide comprise entre un et cinquante millilitres, de préférence comprise entre deux et vingt millilitres, de préférence environ dix millilitres.
Selon une réalisation, l'accès de liquide du moyen d'absorption présente une forme générale de disque ou de polygone ayant une dimension maximale sensiblement comprise entre cinq et cinquante millimètres, de préférence environ vingt millimètres.
Selon une réalisation, l'accès de liquide du moyen d'absorption présente une pluralité de proéminences s'étendant au moins en partie à l'intérieur des pores de filtration à partir des ouvertures de sortie desdits pores. Selon une réalisation, une dimension maximale de l'ouverture de sortie de chaque pore de filtration est supérieure à une dimension maximale de l'ouverture d'entrée dudit pore de filtration, la surface intérieure des pores de filtration présentant une forme générale de tronc, en particulier une forme générale tronconique.
Selon une réalisation, l'ouverture d'entrée de chaque pore de filtration est apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques ayant respectivement un diamètre de trois micromètres et de dix micromètres, de préférence ayant respectivement un diamètre de quatre micromètres et de neuf micromètres, et l'ouverture de sortie de chaque pore de filtration est apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques ayant respectivement un diamètre de huit micromètres et de vingt-cinq micromètres, de préférence ayant respectivement un diamètre de treize micromètres et de vingt micromètres.
Selon une réalisation, l'ouverture d'entrée de chaque pore de filtration présente une forme générale circulaire ou ovale, et l'ouverture de sortie de chaque pore de filtration présente une forme générale circulaire, ovale ou une forme générale de polygone convexe, en particulier un hexagone.
Selon une réalisation, les ouvertures d'entrée des pores de filtration sont disposées à l'endroit de l'entrée de liquide en un arrangement de type nid d'abeille. De cette façon, la filtration de l'échantillon liquide est effectuée de façon rapide.
Selon une réalisation, les ouvertures d'entrée des pores de filtration à l'endroit de l'entrée de liquide présentent une densité surfacique de l'ordre de dix mille pores/cm2. De cette façon, l'écoulement de liquide à travers le moyen de filtration est amélioré.
Selon une réalisation, le dispositif comprend en outre un réservoir de fourniture de liquide comportant une cavité apte à contenir un liquide, la cavité étant munie d'une ouverture de fourniture de liquide par laquelle du liquide est apte à être fourni, l'entrée de liquide du moyen de filtration étant associée à l'ouverture de fourniture de liquide. Selon une réalisation, le réservoir de fourniture de liquide est apte à contenir une quantité de liquide comprise entre un et cinquante millilitres, de préférence comprise entre deux et vingt millilitres, de préférence environ dix millilitres.
Selon une réalisation du dispositif, l'entrée de liquide et la sortie de liquide du moyen de filtration présentent chacune une forme générale surfacique plate, lesdites formes générales surfaciques plates étant sensiblement parallèles entre elles, l'entrée de liquide et la sortie de liquide étant séparées par une distance d'épaisseur, mesurée perpendiculairement à la forme générale surfacique plate de l'entrée de liquide, sensiblement comprise entre vingt et soixante-cinq micromètres et de préférence entre vingt et trente micromètres. Selon un mode de réalisation, l'entrée de liquide et la sortie de liquide du moyen de filtration présentent chacune une forme générale de disque ou de polygone ayant une dimension maximale sensiblement comprise entre cinq et dix millimètres
Selon une réalisation, le moyen de filtration présente une forme générale cylindrique ou polyédrique ayant une dimension maximale sensiblement comprise entre dix et vingt millimètres. Selon un mode de réalisation, le moyen de filtration s'étend entre une première face d'extrémité et une deuxième face d'extrémité, lesdites première et deuxième faces d'extrémité comportant respectivement l'entrée de liquide et la sortie de liquide, la deuxième face d'extrémité du moyen de filtration a une dimension maximale supérieure à une dimension maximale de la sortie de liquide, de façon à présenter une partie périphérique non poreuse . De cette façon, il est possible de fixer de façon amovible le moyen de filtration au dispositif et de l'extraire pour réaliser une analyse des cellules retenues.
Selon une réalisation, la partie périphérique du moyen de filtration présente une forme générale en anneau circulaire ou polygonal ayant une dimension maximale intérieure sensiblement comprise entre cinq et dix millimètres et une dimension maximale extérieure sensiblement comprise entre dix et vingt millimètres.
Selon un mode de réalisation, la partie périphérique du moyen de filtration comporte un revêtement adhésive inactif, en particulier une colle activable par pression ou une colle recouverte d'une membrane de protection détachable, de façon à permettre un encollage ultérieur du moyen de filtration sur un support d'observation.
Selon une réalisation, le moyen de filtration comporte un matériau transparent dans des longueurs d'onde du spectre visible. Selon une réalisation, le moyen de filtration comporte un matériau choisit parmi un polysulfone, un polyéthylène et un verre.
Selon un mode de réalisation, des pores de filtration sont réalisés par un procédé comportant au moins une étape de microlithographie, de gravure laser, de bombardement de particules, d'attaque chimique ou de lithographie par nano-impression.
Selon une réalisation, le moyen de filtration est monté de façon étanche sur le réservoir de fourniture de liquide.
Selon un mode de réalisation, le dispositif comprend en outre une bague de détachement montée sur un pas de vis du réservoir de fourniture de liquide, la bague de détachement comportant une partie de contact disposée de sorte à venir en contact avec le moyen de filtration lors d'une rotation de la bague de détachement et à permettre un détachement du moyen de filtration par rapport au réservoir de fourniture de liquide.
Selon un deuxième premier aspect, l'invention a pour objet un procédé pour retenir des cellules contenues dans un échantillon liquide, comprenant une étape d'aspiration et filtration d'un échantillon de liquide par un moyen d'absorption de liquide et un moyen de filtration, le moyen de filtration d'un échantillon liquide comportant une entrée de liquide et une sortie de liquide, le moyen d'absorption de liquide étant associé à la sortie de liquide du moyen de filtration et apte à absorber du liquide à travers le moyen de filtration, le moyen de filtration étant muni d'une pluralité de pores de filtration reliant chacun l'entrée de liquide à la sortie de liquide au moyen d'une surface intérieure de pore, les pores de filtration comportant chacun une ouverture d'entrée à l'endroit de l'entrée de liquide et une ouverture de sortie à l'endroit de la sortie de liquide, le moyen d'absorption de liquide comportant un matériau poreux apte à absorber du liquide par capillarité à travers le moyen de filtration, le moyen d'absorption de liquide étant apte à absorber une quantité de liquide supérieure à une centaine de microlitres. Selon une réalisation du procédé en question, le procédé comporte en outre la récupération du moyen de filtration après l'aspiration et la filtration de l'échantillon de liquide. De cette façon il est possible d'analyser les cellules retenues après filtration. On décrit maintenant brièvement les figures des dessins. La figure 1 est un schéma général d'un dispositif selon un mode de réalisation de l'invention.
La figure 2 correspondant à une coupe longitudinale du dispositif de la figure 1.
Les figures 3 et 4 illustrent de façon schématique un moyen de filtration du dispositif de la figure 1 vu respectivement par sa première et sa deuxième face.
Les figures 5 et 6 sont des schémas tridimensionnel et bi-dimensionnel illustrant une coupe longitudinale du moyen de filtration des figures 3 et 4.
Les figures 7 et 8 sont des vues de détail respectivement d'une ouverture d'entrée et d'une ouverture de sortie d'un pore du moyen de filtration des figures 3 à 6.
La figure 9 est un schéma de détail du dispositif des figures 1 et 2 illustrant la fixation du moyen de filtration sur le réservoir de fourniture de liquide.
La figure 10 illustre schématiquement une coupe longitudinale du matériau poreux du moyen d'absorption de liquide d'un dispositif selon un mode de réalisation de l'invention.
La figure 1 1 est une vue d'un accès de liquide du moyen d'absorption de liquide d'un dispositif selon un mode de réalisation de l'invention.
La figure 12 est une vue de détail en coupe d'un moyen de filtration et d'un moyen d'absorption de liquide d'un dispositif selon un mode de réalisation de l'invention.
Ci-après un exposé détaillé de plusieurs modes de réalisation de l'invention assorti d'exemples et de référence aux dessins. On notera que les dessins ne sont pas à l'échelle et en particulier que les proportions et les dimensions des pores de filtration du moyen de filtration ainsi que leurs dimensions d'épaisseurs ont été considérablement agrandies pour permettre une représentation schématique des éléments du dispositif selon l'invention.
L'invention est relative à un dispositif 1 pour retenir des cellules rares 2 contenues dans un échantillon liquide 3 ayant un volume nettement supérieur à une centaine de microlitres, par exemple de quelques millilitres, par exemple entre un et cinquante millilitres.
L'invention peut être appliquée à tout échantillon de liquide contenant des cellules rares à isoler. Elle s'applique tout particulièrement à l'isolement de cellules rares dans un échantillon sanguin, par exemple des cellules tumorales ou des trophoblastes présentes dans un échantillon sanguin prélevé sur un individu. L'échantillon sanguin peut auparavant avoir été dilué dans un tampon liquide approprié comme cela est connu de l'état de l'art.
Du fait de leur rareté particulière les cellules 2 sont présentes en quantités extrêmement faibles dans les échantillons sanguins étudiés, typiquement seulement quelques cellules par échantillon voir une cellule unique, et ce malgré les volumes importants des échantillons sanguins en question, compris entre un et cinquante millilitres.
Il est donc souhaitable d'opérer une absorption et une aspiration du liquide aussi progressive et délicate que possible afin de conserver autant que possible les cellules rares sur le filtre en prévenant le franchissement forcé du filtre par ces cellules ou leur endommagement par une dépression trop importante.
A cette fin et en se référant tout d'abord aux figures 1 et 2, un dispositif 1 selon l'invention comprends un moyen de filtration 4 de l'échantillon liquide 3 et un moyen d'absorption de liquide 5. Le dispositif 1 peut comprendre en outre un réservoir de fourniture de liquide 6 comportant une cavité 7 apte à contenir un liquide et en particulier l'échantillon liquide 3. Ainsi, le réservoir de fourniture de liquide 6 est apte à contenir une quantité de liquide comprise entre un et cinquante millilitres, de préférence comprise entre deux et vingt millilitres, de préférence environ dix millilitres.
Dans une variante de l'invention non-illustrée sur les schémas, l'échantillon liquide 3 peut être fourni par un circuit d'alimentation en liquide de façon par exemple à permettre l'intégration d'un dispositif selon l'invention dans un système d'analyse sanguine automatisé.
La cavité 7 est munie d'une ouverture de fourniture de liquide 8 par laquelle du liquide est apte à être fourni, le moyen de filtration 4 comporte une entrée de liquide 9 et une sortie de liquide 10, et, le moyen d'absorption de liquide 5 comporte un accès de liquide 1 1.
Un déplacement de liquide dans le dispositif 1 peut être permis de la façon suivante.
L'ouverture de fourniture de liquide 8 de la cavité 7 est associée à l'entrée de liquide 9 du moyen de filtration 4 tandis que la sortie de liquide 10 du moyen de filtration 4 est associée à l'accès de liquide 1 1 du moyen d'absorption de liquide 5.
Le dispositif 1 peut présenter une symétrie de révolution autour d'un axe longitudinal X et le réservoir de fourniture de liquide 6, le moyen de filtration 4 et le moyen d'absorption de liquide 5 peuvent être alignés et juxtaposés selon cet axe longitudinal X.
On notera que l'axe longitudinal X peut être vertical mais peut également être incliné ou horizontal sans que le dispositif n'en soit affecté. En particulier si l'axe longitudinal X est incliné ou horizontal, le dispositif 1 pourra ne pas présenter de symétrie de révolution autour de cet axe pour faciliter le remplissage du réservoir de fourniture de liquide 6 et la circulation du liquide dans le dispositif 1.
Enfin, en se référant à présent également aux figures 3 à 8 une pluralité de pores de filtration 12 traversants relient chacun l'entrée de liquide 9 à la sortie de liquide 10 au moyen d'une surface intérieure de pore de filtration 13. A cette fin, les pores de filtration 12 comportent chacun une ouverture d'entrée de pore de filtration 14 à l'endroit de l'entrée de liquide 9 et une ouverture de sortie de pore de filtration 15 à l'endroit de la sortie de liquide 10. Le moyen de filtration 4 forme ainsi un filtre poreux.
De cette manière, du liquide de l'échantillon de liquide 3 peut circuler depuis le réservoir de fourniture de liquide 6 jusqu'au moyen d'absorption 5, à travers le moyen de filtration de liquide 4, et en particulier à travers les pores de filtration 12 du moyen de filtration de liquide 4.
L'ouverture d'entrée 14 de chaque pore traversant 12 est adaptée pour retenir les cellules rares 2 recherchées dans l'échantillon liquide 3. Ainsi, une dimension maximale Def de l'ouverture d'entrée 14 de chaque pore traversant 12 peut avantageusement être choisie de façon à être inférieure à une dimension minimale moyenne des cellules rares 2 recherchées et, autant que possible, supérieure aux dimensions des constituants de l'échantillon de liquide 2 qu'il n'est pas souhaitable d'isoler (par exemple des micro-organismes, cellules ou éléments du plasma sanguin non recherchés). En outre, une dimension maximale Dsf de l'ouverture de sortie 15 de chaque pore traversant 12 est supérieure à la dimension maximale Def de l'ouverture d'entrée 14 dudit pore traversant 12. Dans l'ensemble de la description, on entend par « dimension maximale » d'un élément considéré, la plus grande distance séparant deux points de l'élément. Ainsi, si l'élément considéré est un disque, une « dimension maximale » est par exemple un diamètre de ce disque. Si l'élément est un cube, une « dimension maximale » est par exemple une diagonale de ce cube. La surface intérieure 13 de chaque pore traversant 12 présente donc une forme générale de tronc, en particulier une forme générale tronconique.
De cette façon, dès lors que les constituants de l'échantillon de liquide 2 qu'il n'est pas souhaitable d'isoler ont franchi l'ouverture d'entrée 14 du pore, la section de ce dernier va en s'agrandissant en direction de l'ouverture de sortie 15 réduisant ainsi fortement la probabilité de voir lesdits constituants se bloquer et s'accumuler dans le pore.
Plus précisément, l'ouverture d'entrée 14 de chaque pore traversant 12 est par exemple apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques Cef1 , Cef2 ayant respectivement un diamètre de trois micromètres et de dix micromètres. Dans un mode de réalisation avantageux, lesdits premier et second cercles concentriques Cef1 , Cef2 peuvent avoir respectivement un diamètre de quatre micromètres et de neuf micromètres.
L'ouverture de sortie 15 de chaque pore traversant 12 peut-être, quant à elle, apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques Csf1 , Csf2 ayant respectivement un diamètre de huit micromètres et de vingt- cinq micromètres et ayant avantageusement respectivement un diamètre de treize micromètres et de vingt micromètres.
L'ouverture d'entrée 14 de chaque pore traversant 12 présente une forme générale circulaire ou ovale, de façon à être adaptée aux cellules à isoler et à pouvoir être réalisée de façon simple et peu coûteuse. L'ouverture de sortie 15 de chaque pore traversant 12 peut également présenter une forme générale circulaire, ovale ou une forme générale de polygone convexe, en particulier un hexagone pour les raisons détaillées ci-après.
En effet, dans un mode de réalisation de l'invention, les ouvertures d'entrée 14 des pores traversant 12, à l'endroit de l'entrée de liquide 9, peuvent être disposées en un arrangement de type nid d'abeille. Les ouvertures de sortie 15 des pores traversant 12, à l'endroit de la sortie de liquide 10, peuvent alors être également disposées en un arrangement de type nid d'abeille.
De cette façon il est possible d'avoir une dimension maximale Dsf de l'ouverture de sortie 15 de chaque pore traversant 12 la plus grande possible. A cette fin, on peut choisir d'employer une forme générale d'hexagone pour les ouvertures de sortie 15 de chaque pore traversant 12.
Dans un mode de réalisation de l'invention plus particulièrement adapté à retenir des cellules rares 2 telles que des cellules tumorales ou des trophoblastes contenues dans un échantillon liquide 3, les ouvertures d'entrée 14 des pores traversant 12, à l'endroit de l'entrée de liquide 9, présentent une densité surfacique de l'ordre de 1 x 105 pores/cm2. Pour permettre un élargissement appréciable de l'ouverture de sortie 15 des pores par rapport à l'ouverture d'entrée 14 des pores, le moyen de filtration 4 peut présenter une épaisseur adaptée. Ainsi, l'entrée de liquide 9 du moyen de filtration 4 peut présenter une forme générale surfacique plate 16.
La sortie de liquide 10 peut également présenter une forme générale surfacique plate 17, lesdites formes générales surfaciques plates 16,17 étant sensiblement parallèles entre elles. L'entrée de liquide 9 et la sortie de liquide 10 peuvent alors être séparées par une distance d'épaisseur E sensiblement comprise entre vingt et soixante-cinq micromètres et de préférence entre vingt et trente micromètres. La distance d'épaisseur E est mesurée selon une direction d'épaisseur X' perpendiculaire à la forme générale surfacique plate 16 de l'entrée de liquide 9. La direction d'épaisseur X' peut en particulier être sensiblement parallèle avec l'axe longitudinal X.
La surface intérieure 13 de chaque pore traversant 12 ayant une forme générale tronconique peut ainsi présenter un angle d'ouverture A non-nulle, mesuré entre ladite surface et la direction d'épaisseur X'. Avantageusement, l'angle d'ouverture A peut être compris entre quatre et trente degrés. Pour permettre une filtration rapide de l'échantillon liquide, l'entrée de liquide 9 et la sortie de liquide 10 du moyen de filtration 4 peuvent présenter chacune une forme générale 16, 17 de disque ou de polygone ayant une dimension maximale Del, Dsl sensiblement comprise entre cinq et dix millimètres.
L'entrée de liquide 9 et la sortie de liquide 10 du moyen de filtration 4 peuvent être de formes sensiblement identiques.
De façon plus générale, le moyen de filtration 4 présente une forme générale 18 cylindrique ou polyédrique ayant une dimension maximale Df sensiblement comprise entre dix et vingt millimètres. Comme décrit ci-avant, dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le moyen de filtration 4 a une distance d'épaisseur E faible devant les dimensions maximales Del, Dsl de l'entrée de liquide 9 et de la sortie de liquide 10. Le moyen de filtration 4 présente ainsi la forme d'une pastille plate. Il est avantageusement fait d'une pièce unique, rigide et intégrale. La dimension maximale Df du moyen de filtration 4 correspond alors par exemple à un diamètre d'une face d'extrémité du moyen de filtration 4.
Dans l'exemple de la figure 1 , le moyen de filtration de liquide 4 présente une symétrie de révolution autour de la direction d'épaisseur X' mais il est à noter que le moyen de filtration de liquide 4 peut également avoir une forme de polyèdre, par exemple de polyèdre à base carré. Il adopte alors par exemple une forme de pastille carré, rectangulaire ou polygonale.
Le moyen de filtration 4 s'étend entre une première face d'extrémité 19 et une deuxième face d'extrémité 20, lesdites première et deuxième faces d'extrémité comportant respectivement l'entrée de liquide 9 et la sortie de Nquidel O. La seconde face d'extrémité 20 du moyen de filtration 4 a avantageusement une dimension maximale Dse supérieure à la dimension maximale Dsl de la sortie de liquide 10, de façon à présenter une partie périphérique 21 non poreuse. La première face d'extrémité 19 peut présenter également une dimension maximale Dpe supérieure à la dimension maximale Del de l'entrée de liquide 9, de façon à présenter également une partie périphérique 21 non poreuse
La dimension maximale Des de la seconde face d'extrémité 20 peut être sensiblement égale à la dimension maximale Df du moyen de filtration 4 lorsque l'épaisseur E de ce dernier est faible devant la dimension maximale Des de la seconde face d'extrémité 20.
Le moyen de filtration 4 forme alors une plaque de faible épaisseur comportant une partie périphérique non- poreuse. La partie périphérique 21 du moyen de filtration présente alors une forme générale en anneau circulaire ou polygonal. La partie périphérique 21 a une dimension maximale intérieure Dppi sensiblement comprise entre cinq et dix millimètres et une dimension maximale extérieure Dppe sensiblement comprise entre dix et vingt millimètres. Ainsi, la partie périphérique 21 du moyen de filtration 4 peut comporter un revêtement adhésif inactif 23, en particulier une colle activable par pression ou une colle recouverte d'une membrane de protection détachable.
De cette façon il est possible de réaliser un encollage ultérieur du moyen de filtration 4 sur un support d'observation externe (non représenté), par exemple pour pratiquer une observation des cellules rares 2 retenue sur le moyen de filtration 4.
A cette fin, il est encore avantageux que le moyen de filtration 4 comporte, ou soit entièrement réalisé en, un matériau transparent dans des longueurs d'onde du spectre visible. Ainsi, le moyen de filtration 4 peut avantageusement comporter un matériau choisit parmi un polysulfone, un polyéthylène ou encore un verre.
Afin d'améliorer encore les propriétés de filtration du moyen de filtration 4 et de diminuer la quantité de cellules restant bloquées dans les pores 12 du moyen de filtration 4, il est possible de conférer des propriétés super- hydrophiles au moyen de filtration.
Ainsi, la surface intérieure 13 de chaque pore 12 traversant peut présenter des propriétés super-hydrophiles.
La surface intérieure 13 de chaque pore 12 traversant est recouverte d'une couche super-hydrophile telle qu'une couche de Poly(vinylpyrrolidinone), d'acide hyaluronique ou de dioxyde de titane.
La couche super-hydrophile a une épaisseur Ec inférieure à un micromètre.
Les pores traversants peuvent par exemple être réalisés par un procédé comportant au moins une étape de microlithographie, de gravure laser, de bombardement de particules, d'attaque chimique ou de lithographie par nano-impression. Dans un mode de réalisation de l'invention, le moyen d'absorption 5 comporte un dispositif d'aspiration de liquide adapté pour créer une dépression au niveau de la sortie de liquide 10 du moyen de filtration, par exemple au moyen d'une pompe reliée à un réservoir placé en contact étanche avec le moyen de filtration.
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le moyen d'absorption 5 comporte un matériau poreux apte à absorber du liquide par capillarité à travers le moyen de filtration 4.
Le moyen d'absorption de liquide 5 peut être apte à absorber une quantité de liquide nettement supérieure à une centaine de microlitres, et en particulier supérieure à un millilitre, par exemple une quantité de liquide comprise entre un et cinquante millilitres.
Dans des modes de réalisation d'un dispositif 1 selon l'invention, le moyen d'absorption de liquide 5 est apte à absorber une quantité de liquide comprise entre deux et vingt millilitres, de préférence environ dix millilitres.
Le dispositif 1 selon l'invention peut permettre de mettre en œuvre un procédé pour retenir des cellules contenues dans un échantillon liquide, par exemple de la façon suivante.
Un tel procédé peut comprendre une étape de remplissage de la cavité 7 du réservoir de fourniture de liquide 6 par l'échantillon de liquide 3 contenant les cellules 2.
Puis ce procédé peut comporter une étape d'aspiration et filtration de l'échantillon de liquide 3 au cours de laquelle le moyen d'absorption de liquide 5 absorbe ou aspire du liquide de l'échantillon de liquide 3 à travers le moyen de filtration 4.
Enfin, une étape ultérieure comporte la récupération du moyen de filtration 4 après l'aspiration et la filtration du liquide de l'échantillon de liquide 3.
A cette fin, et en se référant à présent également à la figure 9, le moyen de filtration 4 peut avantageusement être monté de façon amovible sur le réservoir de fourniture de liquide 6.
Ainsi, le réservoir de fourniture de liquide 6 comporte une partie d'étanchéité 25 à l'endroit de l'ouverture de fourniture de liquide 8. La partie d'étanchéité 25 est en particulier apte à faire étanchéité avec le moyen de filtration 4 de façon à permettre un passage du liquide présent dans la cavité 7 dans le moyen de filtration 4.
Sur l'exemple des figures 1 et 9 la partie d'étanchéité 25 présente une forme en entonnoir. La partie d'étanchéité 25 possède à son extrémité une nervure annulaire 26 proéminente ou en retrait sur laquelle est monté un joint annulaire 27 apte à être en contact avec le moyen de filtration 4, en en particulier avec sa première face d'extrémité 19, par exemple avec la partie périphérique 21 de la première face d'extrémité 19, de façon à assurer une étanchéité entre le réservoir de fourniture de liquide 6 et le moyen de filtration 4.
Le réservoir de fourniture de liquide 6 comporte également un anneau de maintien 28 pour maintenir le moyen de filtration 4 fixement par rapport au réservoir. L'anneau de maintien 28 peut comporter à cette fin un épaulement annulaire 29 dans lequel le moyen de fixation est apte à venir se loger. L'épaulement annulaire 29 peut ainsi venir en contact avec la deuxième face d'extrémité 20 du moyen de filtration et permettre, avec le joint annulaire 27, d'immobiliser en translation selon l'axe longitudinal X du dispositif 1 , le moyen de filtration 4 par rapport au réservoir de fourniture de liquide 6. Dans un mode de réalisation, le moyen de filtration 4 peut en outre venir en contact rapproché avec une surface intérieure 30 de l'anneau de maintien 28 de façon à assurer une immobilisation complète, dans toutes les directions, du moyen de filtration 4 par rapport au réservoir de fourniture de liquide 6.
Pour permettre de retirer le moyen de filtration 4 de façon aisée, une bague de détachement 31 peut être montée sur l'anneau de maintien 28 ou sur la partie d'étanchéité 25. Sur l'exemple de la figure 9, la bague de détachement 31 est montée sur l'anneau de maintien 28 au moyen d'un pas de vis 32.
La bague de détachement 31 comporte une partie extérieure 33 permettant une préhension par un utilisateur et une partie de contact 34 apte à venir en contact avec le moyen de filtration 4.
Dans le mode de réalisation de la figure 9, la partie extérieure 33 est disposée à l'extérieur de l'anneau de maintien 28 tandis que la partie de contact 34 est disposée à l'intérieur dudit anneau. La partie extérieure 33 et la partie de contact 34 sont solidaires et forment un ensemble intégral rigide. Elles sont reliées entre elles par une ou plusieurs parties de liaison 35 traversant des ouvertures pratiquées dans l'anneau de maintien 28 (non- illustrées sur la figure 9). Le pas de vis 32 permet de transformer une rotation de la bague de détachement 31 par rapport au réservoir de fourniture de liquide 6, réalisée par un utilisateur, en une translation de la bague de détachement 31 par rapport au réservoir de fourniture de liquide 6 selon l'axe longitudinal X du dispositif 1.
Lors d'une telle rotation, la partie de contact 34 vient en contact avec le moyen de filtration 4, à l'endroit de sa première face d'extrémité 19, et en particulier à l'endroit de la partie périphérique 21 de la première face d'extrémité 19. Si la rotation est prolongée par l'utilisateur, la force exercée par la partie de contact 34 sur la première face d'extrémité 19 peut alors être suffisante pour entraîner une déformation élastique de l'anneau de maintien 28 et en particulier de l'épaulement annulaire 29 dudit anneau, de façon à permettre une extraction du moyen de filtration 4 hors de l'anneau de maintien 28.
Le moyen de filtration 4 peut ainsi être récupéré après l'aspiration et la filtration du liquide de l'échantillon de liquide 3.
En se référant à présent aux figures 2, 10 et 1 1 , le moyen d'absorption de liquide 5 du dispositif 1 comporte un matériau poreux 36 apte à absorber du liquide par capillarité à travers le moyen de filtration 4.
Le moyen d'absorption de liquide 5 est plus précisément apte à absorber une quantité de liquide nettement supérieure à une centaine de microlitres, et en particulier supérieure à un millilitre, par exemple une quantité de liquide comprise entre un et cinquante millilitres.
Dans des modes de réalisation d'un dispositif 1 selon l'invention, le moyen d'absorption de liquide 5 est apte à absorber une quantité de liquide comprise entre deux et vingt millilitres, de préférence environ dix millilitres.
Dans un mode de réalisation, le matériau poreux 36 est apte à absorber la totalité du volume de l'échantillon liquide 3 ou la totalité du volume de liquide contenu dans le réservoir de fourniture de liquide 6. En variante, le matériau poreux 36 est apte à absorber seulement une partie de l'échantillon liquide 3 et peut par exemple comporter une sortie de dégagement de liquide 37 apte à permettre une sortie de liquide hors du matériau poreux 36.
Le moyen d'absorption de liquide 5 peut en particulier comporter un réservoir de dégagement 38, ledit réservoir comportant une cavité de dégagement 39 dans laquelle est logé au moins partiellement le matériau poreux 36.
La sortie de dégagement de liquide 37 du matériau poreux 36 peut être disposée à l'intérieur de la cavité de dégagement 39 de façon à ce que la cavité de dégagement 39 soit apte à accueillir du liquide sortant du matériau poreux 36. La cavité de dégagement 39 est réalisée en un matériau étanche au liquide et ainsi apte à contenir du liquide sortant du matériau poreux 36.
L'accès de liquide 1 1 du moyen d'absorption de liquide 5 et la sortie de liquide 10 du moyen de filtration 4 peuvent présenter chacun une forme générale surfacique plate 12 et être en contact intime l'un avec l'autre.
Pour assurer le contact intime entre l'accès de liquide 1 1 du moyen d'absorption de liquide 5 et la sortie de liquide 10 du moyen de filtration 4, un ressort 52 peut solliciter le matériau poreux 36 contre le moyen de filtration 4. Le ressort 52 peut en particulier être un ressort élastiquement contraint entre la cavité de dégagement 39 et le matériau poreux 36, sollicitant le matériau poreux 36 sur une face dudit matériau poreux 36 axialement opposée à l'accès de liquide 1 1 du moyen d'absorption de liquide 5. Le ressort 52 peut être une rondelle ressort.
L'accès de liquide 1 1 du moyen d'absorption 5 peut ainsi présenter une forme générale 45 de disque ou de polygone ayant une dimension maximale Dal sensiblement comprise entre cinq et cinquante millimètres, de préférence environ vingt millimètres.
Le matériau poreux volumique 36 peut par exemple comporter une structure poreuse à cellules ouvertes, en particulier une structure réticulée, de façon à permettre une adaptation de la capacité volumique et du taux de transfert du liquide.
Le matériau poreux volumique 36 comporte ainsi par exemple des fibres synthétiques 40 de polyéthylène et de polyester, par exemple des fibres synthétiques comprenant un cœur en polyester ou en polyéthylène entouré d'une gaine en polyéthylène ou polyester. Le matériau poreux 36 comporte une pluralité de pores d'absorption 41 s'étendant par une surface intérieure de pore d'absorption 42 à partir d'une ouverture d'entrée de pore d'absorption 43 à l'endroit de l'accès de liquide 1 1.
Les pores d'absorption 41 peuvent s'étendre chacun jusqu'à une ouverture de sortie de pore d'absorption 44 par exemple disposée à l'endroit de la sortie de dégagement de liquide 37.
Pour absorber une quantité suffisante de liquide, le matériau poreux volumique 36 peut s'étendre selon une direction de hauteur X" orientée perpendiculairement à la forme générale surfacique plate 45 de l'accès de liquide 11. La direction de hauteur X" peut en particulier être sensiblement parallèle avec l'axe longitudinal X. Le matériau poreux volumique 36 peut être adapté pour réaliser une absorption de liquide préférentiellement selon la direction de hauteur X" orientée perpendiculairement à la forme générale surfacique plate 45 de l'accès de liquide 11. Ainsi en particulier, le matériau poreux volumique 36 peut permettre préférentiellement un flux de liquide selon l'axe longitudinal X, ou selon la direction de hauteur X", et moins préférentiellement un flux de liquide selon des directions latérales Y", Z" perpendiculaires à ladite la direction de hauteur X", ou perpendiculaires audit axe longitudinal X.
A cette fin, les fibres synthétiques 40 du matériau poreux volumique 36 peuvent être orientées de façon à permettre une absorption et un flux de liquide préférentiellement selon la direction de hauteur X" orientée perpendiculairement à la forme générale surfacique plate 45 de l'accès de liquide 1 1. Le matériau poreux volumique 36 peut comprendre l'accès de liquide 11 du moyen d'absorption 5 et s'étendre depuis ce dernier jusqu'à une terminaison 46 du matériau poreux volumique 36 par une surface latérale 47 du matériau poreux volumique 36.
Dans les modes de réalisation illustrés sur les figures, le matériau poreux volumique 36 ne comporte pas de pores d'absorption sur la surface latérale 47 et les pores d'absorption s'étendent sensiblement selon la direction de hauteur X" mais il est à noter que dans des variantes de réalisation de l'invention, les pores d'absorption peuvent s'étendre également selon les directions latérales Y", Z" et le matériau poreux volumique 36 peut présenter des pores d'absorption sur la surface latérale 47. Le matériau poreux volumique 36 peut ainsi avoir une dimension maximale de hauteur Dh, supérieure ou égale à une dimension maximale d'extension Dal de la forme générale surfacique plate 45 de l'accès de liquide 1 1.
Le matériau poreux volumique 36 peut en particulier présenter une forme générale 48 cylindrique, présentant par exemple une symétrie de rotation autour de la direction de hauteur X", ou une forme générale polyédrique. Le matériau poreux volumique 36 peut présenter une dimension maximale Dm sensiblement comprise entre un et quinze centimètres, de préférence environ sept centimètres.
Le moyen d'absorption 5 et en particulier le matériau poreux volumique 36, peuvent comporter des fibres de verre, des fibres de polymère, en particulier des fibres de polyéthylène, de polyester ou de polyester/polyéthylène, ou des fibres de céramique.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la surface intérieure 42 de chaque pore d'absorption 41 présente des propriétés super-hydrophiles. De façon avantageuse, la surface intérieure 13 de chaque pore de filtration 12 présente alors également des propriétés super-hydrophiles comme détaillé ci-avant, de façon à assurer, le cas échéant, une continuité superhydrophile entre le moyen de filtration 4 et le moyen d'absorption 5.
La surfaces intérieures de pore d'absorption présentant des propriétés hydrophiles peuvent en particulier comporter une couche super-hydrophile 50 telle qu'une couche de Poly(vinylpyrrolidinone), d'acide hyaluronique, de dioxyde de titane ou d'un autre matériau super-hydrophile, comme détaillé ci-avant concernant la surface intérieure 13 des pores de filtration 12.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la couche super-hydrophile 50 a une épaisseur inférieure à un micromètre de façon à ne pas réduire de façon importante le diamètre desdits pores.
De cette manière il est possible de réaliser une absorption par capillarité physico-chimique. En particulier, il a été observé qu'une couche super-hydrophile 50 de dioxyde de titane déposée sur les surfaces intérieures des pores d'absorption donne des résultats satisfaisants du point de vue de l'absorption par capillarité physico-chimique.
Il possible d'améliorer encore davantage la continuité super-hydrophile entre le moyen de filtration 4 et le moyen d'absorption 5 de la façon suivante. L'accès de liquide 1 1 du moyen d'absorption de liquide 5 peut comporter une couche super-hydrophile 50 telle qu'une couche de Poly(vinylpyrrolidinone), d'acide hyaluronique, de dioxyde de titane ou d'un autre matériau super-hydrophile, ladite couche étant en contact avec la sortie de liquide 10 du moyen de filtration 4.
Enfin, dans un mode de réalisation de l'invention, l'accès de liquide 1 1 du moyen d'absorption 5 peut également présenter une pluralité de proéminences 51 s'étendant au moins en partie à l'intérieur des pores de filtration 12 à partir des ouvertures de sortie 15 desdits pores. De cette façon, le contact entre le matériau poreux 36 et le moyen de filtration est maximal.
Les dimensions des pores d'absorption et de filtration peuvent être déterminées de façon à maximiser l'absorption par capillarité à travers le filtre.
Ainsi, dans l'exemple des figures 10 et 1 1 , une dimension maximale Dea de l'ouverture d'entrée 43 des pores d'absorption 41 est supérieure à une dimension maximale Dsf de l'ouverture de sortie 15 des pores de filtration 12.
Plus précisément, la dimension maximale Dea de l'ouverture d'entrée 43 des pores d'absorption 41 peut être supérieure à cinquante micromètres, et la dimension maximale Dsf de l'ouverture de sortie 15 des pores de filtration 12 peut être inférieure à vingt micromètres. Le matériau poreux peut ainsi être apte à absorber au moins un millilitre de sang en moins d'une minute.
Ou encore, l'ouverture d'entrée 43 des pores d'absorption 41 peut être apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques Cea1 , Cea2 ayant respectivement un diamètre de cinquante micromètres et de deux-cent micromètres, tandis que l'ouverture de sortie 15 de chaque pore de filtration 12 peut être apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques Csf1 , Csf2 ayant respectivement un diamètre de quatre micromètres et de vingt micromètres.
Les pores d'absorption 41 peuvent être fortement anisotropiques, et leurs dimensions peuvent varier de façon importante.
Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention au moins la moitié des pores d'absorption 41 dont l'ouverture d'entrée 43 est en contact avec le moyen de filtration 4, sont aptes à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques Cea1 , Cea2 ayant respectivement un diamètre de cinquante micromètres et de deux-cent micromètres.

Claims

Revendications
1. Dispositif (1 ) pour retenir des cellules (2) contenues dans un échantillon liquide (3), comprenant :
· un moyen de filtration (4) d'un échantillon liquide (3) comportant une entrée de liquide (9) et une sortie de liquide (10) ainsi qu'une pluralité de pores de filtration (12) traversants reliant chacun l'entrée de liquide à la sortie de liquide au moyen d'une surface intérieure de pore de filtration (13), les pores de filtration comportant chacun une ouverture d'entrée de pore de filtration (14) à l'endroit de l'entrée de liquide et une ouverture de sortie de pore de filtration (15) à l'endroit de la sortie de liquide, et
· un moyen d'absorption de liquide (5) comportant un accès de liquide (1 1 ) associé à la sortie de liquide
(10) du moyen de filtration (4), le moyen d'absorption étant apte à absorber du liquide à travers le moyen de filtration,
le dispositif étant caractérisé en ce que le moyen d'absorption de liquide (5) comporte un matériau poreux (36) apte à absorber du liquide par capillarité à travers le moyen de filtration (4), le moyen d'absorption de liquide étant apte à absorber une quantité de liquide supérieure à une centaine de microlitres.
2. Dispositif selon la revendication 1 , dans lequel le matériau poreux (36) comporte une pluralité de pores d'absorption (41 ), chaque pore d'absorption s'étendant par une surface intérieure de pore d'absorption (42) à partir d'une ouverture d'entrée de pore d'absorption (43) à l'endroit de l'accès de liquide (1 1 ).
3. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 2, dans lequel une dimension maximale (Dea) de l'ouverture d'entrée des pores d'absorption (43) est supérieure à une dimension maximale (Dsf) de l'ouverture de sortie des pores de filtration (15).
4. Dispositif selon la revendication 3, dans lequel
■ une dimension maximale (Dea) de l'ouverture d'entrée des pores d'absorption (43) est supérieure à cinquante micromètres, et
■ une dimension maximale (Dsf) de l'ouverture de sortie des pores de filtration (15) est inférieure à vingt micromètres.
5. Dispositif selon la revendication 4, dans lequel
■ l'ouverture d'entrée de chaque pore d'absorption (43) est apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques (Cea1 , Cea2) ayant respectivement un diamètre de cinquante micromètres et de deux-cent micromètres, et
■ l'ouverture de sortie de chaque pore de filtration (15) est apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques (Csf1 , Csf2) ayant respectivement un diamètre de quatre micromètres et de vingt micromètres.
6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel la surface intérieure (42) de chaque pore d'absorption présente des propriétés super-hydrophiles.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel la surface intérieure (13) de chaque pore de filtration présente des propriétés super-hydrophiles, de façon à assurer le cas échéant une continuité super-hydrophile entre le moyen de filtration et le matériau poreux.
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 6 et 7, dans lequel lesdites surfaces intérieures (13, 42) de pore d'absorption et/ou de filtration présentant des propriétés hydrophiles comportent une couche super- hydrophile (24, 50) telle qu'une couche de Poly(vinylpyrrolidinone), d'acide hyaluronique, de dioxyde de titane ou d'un autre matériau super-hydrophile.
9. Dispositif selon la revendication 8, dans lequel la couche super-hydrophile (24, 50) a une épaisseur (Ec) inférieure à un micromètre.
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel le matériau poreux (36) comporte des fibres de verre, des fibres de polymère, en particulier des fibres de polyéthylène, de polyester ou de polyester/polyéthylène, ou des fibres de céramique.
11 Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel le matériau poreux (36) comporte une structure poreuse à cellules ouvertes, en particulier une structure réticulée.
12. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 1 1 , dans lequel l'accès de liquide (1 1 ) du moyen d'absorption de liquide (5) et la sortie de liquide (10) du moyen de filtration (4) présentent chacun une forme générale surfacique plate (17, 45) et sont en contact l'un avec l'autre.
13 Dispositif selon la revendication 12, dans lequel le matériau poreux (36) est apte à absorber du liquide par capillarité préférentiellement selon une direction de hauteur (X") orientée perpendiculairement à la forme générale surfacique plate (45) de l'accès de liquide (1 1 ).
14. Dispositif selon la revendication 12, dans lequel l'accès de liquide (1 1 ) comporte une couche superhydrophile (50) telle qu'une couche de Poly(vinylpyrrolidinone), d'acide hyaluronique, de dioxyde de titane ou d'un autre matériau super-hydrophile, ladite couche (50) étant en contact avec la sortie de liquide (10).
15. Dispositif selon l'une des revendications 12 et 14, dans lequel le matériau poreux (36) s'étend selon une direction de hauteur (X") orientée perpendiculairement à la forme générale surfacique plate (45) de l'accès de liquide (1 1 ) du moyen d'absorption (5), depuis l'accès de liquide (1 1 ) du moyen d'absorption jusqu'à une terminaison (46) du matériau poreux par une surface latérale (47) du matériau poreux,
et dans lequel le matériau poreux a une dimension maximale de hauteur (Dh), mesurée perpendiculairement à la forme générale surfacique plate (45) de l'accès de liquide, supérieure ou égale à une dimension maximale (Dal) de la forme générale surfacique plate (45) de l'accès de liquide.
16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à14, dans lequel le matériau poreux (36) présente une forme générale (48) cylindrique ou polyédrique ayant une dimension maximale (Dm) sensiblement comprise entre un et quinze centimètres, de préférence environ sept centimètres.
17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans lequel le moyen d'absorption (5) est apte à absorber une quantité de liquide comprise entre un et cinquante millilitres, de préférence comprise entre deux et vingt millilitres, de préférence environ dix millilitres.
18. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 17, dans lequel l'accès de liquide (1 1 ) du moyen d'absorption (5) présente une forme générale de disque ou de polygone ayant une dimension maximale (Dal) sensiblement comprise entre cinq et cinquante millimètres, de préférence environ vingt millimètres.
19. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans lequel l'accès de liquide (1 1 ) du moyen d'absorption (5) présente une pluralité de proéminences (51 ) s'étendant au moins en partie à l'intérieur des pores de filtration (12) à partir des ouvertures de sortie (15) desdits pores.
20. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 19, dans lequel une dimension maximale (Dsf) de l'ouverture de sortie (15) de chaque pore de filtration est supérieure à une dimension maximale (Def) de l'ouverture d'entrée (14) dudit pore de filtration, la surface intérieure (13) des pores de filtration présentant une forme générale de tronc, en particulier une forme générale tronconique.
Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 20, dans lequel
l'ouverture d'entrée (14) de chaque pore de filtration (12) est apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques (Cea1 , Cea2) ayant respectivement un diamètre de trois micromètres et de dix micromètres, de préférence ayant respectivement un diamètre de quatre micromètres et de neuf micromètres, et
l'ouverture de sortie (15) de chaque pore de filtration (12) est apte à s'inscrire entre un premier et un second cercle concentriques (Csf1 , Csf2) ayant respectivement un diamètre de huit micromètres et de vingt-cinq micromètres, de préférence ayant respectivement un diamètre de treize micromètres et de vingt micromètres.
Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 21 , dans lequel
l'ouverture d'entrée (14) de chaque pore de filtration (12) présente une forme générale circulaire ou ovale, et
l'ouverture de sortie (15) de chaque pore de filtration (12) présente une forme générale circulaire, ovale ou une forme générale de polygone convexe, en particulier un hexagone.
23. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 22, dans lequel les ouvertures d'entrée (14) des pores de filtration (12) sont disposées à l'endroit de l'entrée de liquide (9) en un arrangement de type nid d'abeille.
24. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, dans lequel les ouvertures d'entrée (14) des pores de filtration (12) à l'endroit de l'entrée de liquide (9) présentent une densité surfacique de l'ordre de dix mille pores/cm2.
25. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 24, comprenant en outre un réservoir de fourniture de liquide (6) comportant une cavité (7) apte à contenir un liquide, la cavité étant munie d'une ouverture de fourniture de liquide (8) par laquelle du liquide est apte à être fourni, l'entrée de liquide (9) du moyen de filtration (4) étant associée à l'ouverture de fourniture de liquide.
26. Dispositif selon la revendication 25, dans lequel le réservoir de fourniture de liquide (6) est apte à contenir une quantité de liquide comprise entre un et cinquante millilitres, de préférence comprise entre deux et vingt millilitres, de préférence environ dix millilitres.
27. Procédé pour retenir des cellules contenues dans un échantillon liquide, comprenant une étape d'aspiration et filtration d'un échantillon de liquide par un moyen d'absorption de liquide (5) et un moyen de filtration (4), ■ le moyen de filtration (4) d'un échantillon liquide (3) comportant une entrée de liquide (9) et une sortie de liquide (10),
■ le moyen d'absorption de liquide (5) étant associé à la sortie de liquide du moyen de filtration et apte à absorber du liquide à travers le moyen de filtration,
le moyen de filtration étant muni d'une pluralité de pores de filtration (12) reliant chacun l'entrée de liquide à la sortie de liquide au moyen d'une surface intérieure de pore (13), les pores de filtration comportant chacun une ouverture d'entrée (14) à l'endroit de l'entrée de liquide et une ouverture de sortie à(15) l'endroit de la sortie de liquide,
le moyen d'absorption de liquide comportant un matériau poreux apte à absorber du liquide par capillarité à travers le moyen de filtration, le moyen d'absorption de liquide étant apte à absorber une quantité de liquide supérieure à une centaine de microlitres.
28. Procédé selon la revendication 27 comportant en outre la récupération du moyen de filtration (4) après l'aspiration et la filtration de l'échantillon de liquide (3).
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Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985005451A1 (fr) * 1984-05-11 1985-12-05 Hybritech Incorporated Procede et appareil pour des analyses immunologiques
EP0336483A1 (fr) * 1988-03-29 1989-10-11 Primecare B.V. Procédé et dispositif de séparation d'un liquide corporel des particules dans ce liquide et trousse d'essai pour ladite séparation et analyse du liquide corporel
US5135716A (en) * 1989-07-12 1992-08-04 Kingston Diagnostics, L.P. Direct measurement of HDL cholesterol via dry chemistry strips
WO2006137891A2 (fr) * 2004-09-29 2006-12-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Detection de substances chimiques, de particules et de biocomposes faisant appel a la nanotechnologie
US20070202536A1 (en) * 2001-10-11 2007-08-30 Yamanishi Douglas T Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples
WO2011091074A2 (fr) * 2010-01-19 2011-07-28 The Cleveland Clinic Foundation Membranes nanoporeuses, dispositifs et procédés pour échange de gaz respiratoire
DE102011017696A1 (de) * 2011-04-28 2012-10-31 Siemens Aktiengesellschaft Mikrosieb und Verfahren zum Herstellen eines Mikrosiebs

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985005451A1 (fr) * 1984-05-11 1985-12-05 Hybritech Incorporated Procede et appareil pour des analyses immunologiques
EP0336483A1 (fr) * 1988-03-29 1989-10-11 Primecare B.V. Procédé et dispositif de séparation d'un liquide corporel des particules dans ce liquide et trousse d'essai pour ladite séparation et analyse du liquide corporel
US5135716A (en) * 1989-07-12 1992-08-04 Kingston Diagnostics, L.P. Direct measurement of HDL cholesterol via dry chemistry strips
US20070202536A1 (en) * 2001-10-11 2007-08-30 Yamanishi Douglas T Methods and compositions for separating rare cells from fluid samples
WO2006137891A2 (fr) * 2004-09-29 2006-12-28 University Of Florida Research Foundation, Inc. Detection de substances chimiques, de particules et de biocomposes faisant appel a la nanotechnologie
WO2011091074A2 (fr) * 2010-01-19 2011-07-28 The Cleveland Clinic Foundation Membranes nanoporeuses, dispositifs et procédés pour échange de gaz respiratoire
DE102011017696A1 (de) * 2011-04-28 2012-10-31 Siemens Aktiengesellschaft Mikrosieb und Verfahren zum Herstellen eines Mikrosiebs

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