WO2015030211A1 - 疲労のバイオマーカーおよびその利用 - Google Patents

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WO2015030211A1
WO2015030211A1 PCT/JP2014/072834 JP2014072834W WO2015030211A1 WO 2015030211 A1 WO2015030211 A1 WO 2015030211A1 JP 2014072834 W JP2014072834 W JP 2014072834W WO 2015030211 A1 WO2015030211 A1 WO 2015030211A1
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WO
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ratio
concentration
fatigue
ornithine
citrulline
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PCT/JP2014/072834
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French (fr)
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弘彦 倉恒
洋祐 片岡
慧嗣 久米
大和　正典
世貴 田島
恭良 渡辺
早苗 福田
朋義 曽我
恵美 山野
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Osaka Metropolitan University
RIKEN
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Osaka City University PUC
RIKEN
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to a biomarker for evaluating fatigue and evaluation and diagnosis of fatigue using the biomarker.
  • Chronic Fatigue Syndrome Chronic Fatigue Syndrome
  • QOL quality of life
  • Patent Document 1 discloses a technique for evaluating viral behavior as an indicator of fatigue level, focusing on viral infections listed as one of the causes of immunity decline.
  • Non-Patent Document 1 discloses an attempt to objectively measure / evaluate fatigue using an acceleration pulse wave.
  • Japanese Published Patent Publication Japanese Patent Laid-Open No. 2007-330263 (Publication Date: December 27, 2007) Japanese published patent publication: JP-A-9-77688 (published date: March 25, 1997) Japanese published patent publication: JP-A-9-59161 (published date: March 4, 1997) Japanese Published Patent Publication: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-177194 (Publication Date: September 15, 2011) Japan Published Patent Gazette: Japanese Patent Laid-Open No. 2013-111001 (Publication Date: June 17, 2013) Japanese Published Patent Publication: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2011-182661 (Publication Date: September 22, 2011) Japanese Published Patent Gazette: Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • Patent Document 1 collects the body fluid of a subject, measures the amount of human herpesvirus in the body fluid, and evaluates the relationship with the degree of fatigue.
  • this technique observes the behavior of a virus infecting a human (host), and does not measure a biomarker that reflects the cause or mechanism of fatigue in humans. Therefore, the technique described in Patent Document 1 cannot evaluate the fatigue state of individual subjects or provide a treatment or prevention method.
  • the technique described in Non-Patent Document 1 has an advantage that it can be implemented non-invasively, but requires measurement of fingertip volume pulse waves by a special device and data processing based on a special principle. Poor sex.
  • the present invention has been made in view of the above problems, and an object of the present invention is to provide a method that enables objective and simple evaluation and diagnosis of fatigue.
  • the present inventors have conducted a comprehensive and comprehensive metabolomic analysis study using plasma samples from patients with chronic fatigue syndrome, chronic fatigue patients, and healthy subjects.
  • the concentration of various metabolites present in each plasma sample involved in metabolism was examined.
  • a method for evaluating fatigue (2) A kit for evaluating fatigue, comprising a reagent for measuring ornithine concentration and a reagent for measuring citrulline concentration.
  • a calculation unit that receives a reference value for evaluating fatigue and a ratio of the ornithine concentration to the citrulline concentration (OC ratio) and generates evaluation information for evaluating fatigue, and the evaluation information
  • a fatigue evaluation system including an evaluation unit that receives and evaluates fatigue.
  • biomarker values are 1) 2-aminobutyric acid (2AB), 2-oxoglutarate (3-oxoglutarate), 3-hydroxybutyrate (3-Hydroxybutyrate), 3-methylhistidine (3-Methylhistidine), 4-Hydroxy-3-methoxybenzoate, 4-methyl-2-oxopentanoate, 5-oxoproline, alanine ( Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), azelate (Azelate), beta-alanine (beta-Ala), betaine (Betaine), carnitine (Carnitine), choline (Ch oline), citrulline, creatine, creatine, cystine, gamma-butyrobetaine,
  • the present invention enables objective and simple evaluation and diagnosis of fatigue.
  • the present invention may further provide techniques useful for treating fatigue.
  • FIG. 6 shows the results of running a random forest program for all populations of study 2 using all parameters including metabolite measurements in plasma samples of healthy (HC) and chronic fatigue syndrome (CFS) patients.
  • biological sample is intended to include any tissue (including body fluids such as blood) or cells collected from a subject, and prepared therefrom. Organized tissue sections or cell lysates can also be included in the biological sample.
  • tissue samples for use in the present invention include, but are not limited to, blood, saliva, urine, interstitial fluid, sweat, and preparations thereof (eg, serum, plasma, etc.).
  • the biological sample is preferably blood or a blood preparation (serum, plasma, etc.).
  • CDC The US Center for Disease Control and Prevention (CDC) reported a chronic fatigue syndrome called “chronic fatigue syndrome” in 1988, elucidating the mechanism, searching for biomarkers, and developing treatment prevention methods.
  • Various researches have been made with a focus on.
  • the onset mechanism of chronic fatigue syndrome has not yet been elucidated, and no objective biomarker has been developed.
  • diagnosis of chronic fatigue syndrome is made using the criteria of symptom and physical findings published by CDC in 1994.
  • a chronic fatigue patient does not include a patient with chronic fatigue syndrome.
  • the term “chronic fatigue” refers to a case where chronic fatigue syndrome has not been diagnosed by a doctor's diagnosis, although the main complaint is fatigue or feeling of fatigue intermittently for 6 months or longer.
  • Chronic fatigue syndrome is a revised version of the diagnostic criteria for chronic fatigue syndrome (Ann Intern Med. 1994; 121: 953-959) created by the American Center for Disease Control and Prevention (CDC). As described in 671-677), the latest symptom of fatigue and science from Japan: Proposals for anti-fatigue / anti-overwork (1) Strong fatigue that significantly impairs life as the main symptom, at least 6 months or more Repeat or continue recurrence for a period of 50% or more. In addition, the disease is excluded based on medical history, physical findings, and laboratory findings. Furthermore, (2) refers to a case that meets 8 or more symptom criteria, or 6 symptom criteria and 2 or more physical criteria.
  • Biomarker of the Present Invention The biomarker for fatigue according to one embodiment of the present invention is as follows.
  • Metabolites related to the urea cycle and biomarkers of metabolites related to the flow of metabolism from the urea cycle to the TCA cycle include the metabolites shown in FIG. 1 or 4, ornithine, citrulline, urea (Urea), Urate, 4-hydroxy-3-methoxybenzoate, Hydroxyproline, 4-Methyl-2-oxopentanoate, and Gamma-butyrobetaine.
  • biomarker ornithine, citrulline, urea, and the like are more preferable, and ornithine and citrulline are particularly preferable because they exhibit different behavior depending on the fatigue state.
  • Any number of the above biomarkers may be used for analysis simultaneously.
  • biomarkers described in 1) above cis-aconitic acid (Cis-aconitate), citric acid (Citrate), isocitrate (Isocitrate), lactic acid (Lactate), malic acid (Malate), and succinic acid ( Succinate) is not used alone, but may be used in combination with the biomarkers described above in 1).
  • biomarkers are obtained, for example, as concentrations in a biological sample, and compared with a predetermined threshold value (reference value) to be used for fatigue evaluation.
  • the predetermined threshold is appropriately set for each biomarker according to the analysis method and the like.
  • the analysis method is not particularly limited as long as it is generally used for measuring the concentration of a metabolite in a living body.
  • CE-MS / MS capillary electrophoresis mass spectrometry
  • LC-MS / MS liquid chromatography mass spectrometry
  • An example of the predetermined threshold is a mode value obtained from an average value of biomarker concentrations in a biological sample in a plurality of healthy subjects, a binomial distribution, or the like. Also, for example, as shown in FIGS. 2, 3, 4, 6, 7, 8, and 11, and the examples, the amount of the biomarker is in what state (for example, If it is above or below a threshold value, it is possible to evaluate whether it is fatigue (or whether it is chronic fatigue, chronic fatigue syndrome, etc.).
  • the biomarkers described in FIGS. 2, 3, 4, 7, and 8 are particularly useful as markers for evaluating whether a subject is a healthy person or a patient with chronic fatigue syndrome. It is. More specifically, for example, Ornithine, Citrulline, Urea, Hydroxyproline, Urate, 4-Hydroxy-3-methoxybenzoate, Isocitrate, Citrate, Pyruvate, Cis-aconitate, Gamma-Butyrobetaine, 4-methyl-2-oxopentanoate, and 2-oxoglutarate is a particularly useful biomarker with statistically significant differences between healthy individuals and patients with chronic fatigue syndrome.
  • Succinate, Pro, Leu, 3-Methylhistidine, Creatinine, His, Ala, N, N-Dimethylglycine, Ser, Lys, Betaine, Glu, Taurine, 2AB, Arg, 3-Hydroxybutyrate, Creatine, Trp , Mucate, Cystine, Asp, Sarcosine, Thr, and Val can be markers for evaluating whether a subject is a healthy person or a patient with chronic fatigue syndrome as a result of random forest analysis.
  • the markers from Succinate to Val are listed in order from the top (ie, promising as a marker) as a result of random forest analysis.
  • the subject evaluates whether the subject is a healthy person or a patient with chronic fatigue (especially a patient with chronic fatigue who is not chronic fatigue syndrome). It is particularly useful as a marker. More specifically, for example, Choline, Gly, Tarine, Asn, Gamma-Butyrobetaine, Gln, Lys, Trp, 4-methyl-2-oxopentanoate, and Succinate are used for healthy subjects and chronic fatigue patients (especially chronic fatigue). It is a particularly useful biocar car with statistically significant differences from patients with chronic fatigue who are not syndromes).
  • Cis-Aconitate Lactate, Arg, Mucate, His, Azelate, N, N-Dimethylglycine, Creatinine, beta-Ala, Tyr, Ornithine, 2AB, Leu, Isocitrate, Hydroxyproline, Phe, Met, 3 -Methylhistidine, Sarcosine, Ile, Betaine, Pyruvate, Urate, 4-Hydroxy-3-methoxybenzoate, Ser, Asp, Carnitine, Urea, 5-oxoproline, and Citrate, as a result of random forest analysis, the subject is healthy It can be a marker for evaluating whether the patient is chronic fatigue (particularly chronic fatigue who is not chronic fatigue syndrome).
  • the markers from Cis-Aconitate to Citrate are listed in order from the top (that is, promising as a marker) as a result of random forest analysis.
  • the biomarker described in FIG. 11 and FIG. 17 is a marker for evaluating whether a subject is a patient with chronic fatigue syndrome or a patient with chronic fatigue syndrome that is not chronic fatigue syndrome. It is particularly useful. More specifically, for example, Choline, Succinate, Gln, Taurine, Asn, Lys, Arg, His, Urate, and 4-Hydroxy-3-methoxybenzoate are used in patients with chronic fatigue syndrome and chronic but not chronic fatigue syndrome. It is a particularly useful biomarker with statistically significant differences from fatigue patients.
  • a biomarker configured as a correlation between a plurality of biomarkers of 1) above.
  • the ratio of the concentration of the plurality of biomarkers in 1) above in the biological sample, the difference in the concentration in the biological sample, and the like are applicable.
  • the ratio of ornithine concentration and citrulline concentration in a biological sample (OC ratio, for example, O / C or C / O), which is the biomarker specifically shown in FIGS. 9 and 10;
  • PI ratio ratio of pyruvic acid concentration and isocitrate concentration in a sample
  • AP ratio any number of biomarkers may be used for analysis simultaneously.
  • metabolites located at the top in random forest analysis see Fig. 3: for example, Ornithine, Citrulline, Urea, Urate, 4-hydroxy-3-methoxybenzoate, Hydroxyproline, 4-Methyl-2-oxopentanoate, Gamma-butyrobetaine, etc.
  • concentration ratio of two metabolites selected from the group consisting of can also be used as a biomarker in combination with the OC ratio or in combination with the OC ratio, or alternatively with the OC ratio or in combination with the OC ratio
  • concentration ratio of two metabolites selected from the group consisting of can also be used as a biomarker in combination with the OC ratio or in combination with the OC ratio, or alternatively with the OC ratio or in combination with the OC ratio
  • biomarkers are used, for example, for fatigue evaluation by comparison with a predetermined threshold (reference value).
  • the predetermined threshold is appropriately set for each biomarker according to the analysis method and the like.
  • An example of the predetermined threshold is a mode value obtained from an average value of biomarker values in a plurality of healthy subjects, a binomial distribution, or the like. Further, for example, as shown in FIG. 9 and FIG. 10 and the description of the examples, if the value of the biomarker is in any state (for example, whether it is greater than or less than the threshold), fatigue (Or, for example, whether it is chronic fatigue, whether it is chronic fatigue syndrome, etc.).
  • biomarkers described in FIGS. 9 and 10 are particularly useful as markers for evaluating whether a subject is a healthy person or a patient with chronic fatigue syndrome.
  • one aspect of the biomarker of the present invention is observed by comprehensively analyzing the changes in metabolites in the plasma of patients with chronic fatigue syndrome and patients with chronic fatigue and the plasma of healthy subjects. This is an objective fatigue biomarker based on the mechanism of fatigue disease. Therefore, as one aspect of the biomarker of the present invention, it is possible to objectively and easily evaluate and diagnose fatigue. Furthermore, by using the biomarker of the present invention, diagnostic methods and treatment methods for chronic fatigue and chronic fatigue syndrome can be developed.
  • the biomarker of the present invention it is possible to create an inexpensive and simple fatigue diagnosis system by using the biomarker of the present invention, and further, an effective treatment method can be found based on the diagnosis result.
  • an effective treatment method can be found based on the diagnosis result.
  • blood is collected and the biomarker of the present invention is examined to determine whether the patient is chronic fatigue or chronic fatigue syndrome.
  • This evaluation can be examined in a general medical facility without a high level of knowledge about fatigue.
  • the subject can be determined whether or not the subject belongs to chronic fatigue syndrome by measuring the blood component of the subject.
  • the main symptom is severe fatigue that significantly impairs life, and it continues or repeats for a period of at least 6 months (recognized for a period of 50% or more).
  • the disease is excluded based on medical history, physical findings, and laboratory findings.
  • urea metabolism system urea circuit
  • ammonia which is extremely toxic in the liver
  • urea chronic fatigue syndrome
  • diagnosis of chronic fatigue Can also be used.
  • urea circuit urea metabolism system
  • chronic fatigue syndrome and chronic fatigue can be objectively diagnosed faster, cheaper.
  • the biomarker of the present invention can be used in combination with a known biomarker related to fatigue.
  • Known biomarkers are not particularly limited, and examples thereof include those based on energy (ATP) -producing metabolites reported in International Publication WO2011 / 161544 A2 (US Patent Serial No. 13 / 805,449).
  • ATP energy
  • By analyzing in combination with the biomarker described in International Publication WO2011 / 161544 A2 it is possible to more accurately estimate which part of the living body is abnormal, and for life guidance for patients with chronic fatigue syndrome and patients with chronic fatigue. In addition to being able to make use of it, it is also possible to provide a remedy that corrects the metabolic system considered to be the cause.
  • the change of the urea circuit and its surrounding metabolism is used as an index.
  • a biomarker it becomes possible to particularly improve the ability to evaluate fatigue with respect to individual individual variations and provide a more suitable treatment policy.
  • the present invention provides a method, kit and system for evaluating fatigue based on the biomarker described above.
  • a method for evaluating fatigue according to the present invention includes a step of obtaining the above-described biomarker value of the present invention in a biological sample obtained from a subject (biomarker value acquisition step), And a step of evaluating using the value of the marker (evaluation step).
  • the biomarker value acquisition step can be appropriately performed according to the type of biomarker.
  • the concentration of the metabolite in the biological sample can be measured by an appropriate method according to the type of metabolite, regardless of the method of the embodiment.
  • a commercially available kit for measuring the substrate concentration using the enzyme reaction may be used.
  • those skilled in the art can successfully measure the concentration of a metabolite in a biological sample by arbitrarily using such various techniques.
  • the biological sample to be measured for the concentration of the metabolite is subjected to a treatment for suppressing the activity of the enzyme involved in the degradation reaction of arginine contained in the biological sample.
  • a treatment for suppressing the activity of the enzyme involved in the degradation reaction of arginine contained in the biological sample When a biomarker related to arginine, ornithine, citrulline, or the like is used, it may be preferable for the purpose of further improving measurement accuracy.
  • the suppression of the activity of the enzyme involved in the degradation reaction of arginine by the treatment means that the biological sample after the treatment is inhibited more than the biological sample before the treatment.
  • An example of such treatment includes adding an inhibitor of arginase and / or nitric oxide synthase, which is an enzyme involved in the degradation reaction of arginine, to a biological sample (for example, blood or blood preparation).
  • a biological sample for example, blood or blood preparation.
  • the kind of inhibitor is not specifically limited, A specific illustration is demonstrated in the [3-2] column regarding a fatigue evaluation kit.
  • the evaluation step can be appropriately performed according to the method of performing the evaluation.
  • the evaluation is performed by comparing the value of the biomarker with a predetermined threshold (reference value) or the value of the biomarker is set to the threshold (reference value). You can also evaluate without comparing with).
  • a threshold value For example, by performing analysis such as discriminant analysis, PartialPartLeast Square, or Support Vector Machine, depending on the type of biomarker, fatigue can be evaluated (diagnosis or determination) without using a threshold value (reference value). it can.
  • a threshold value even if the threshold value is a predetermined value, the healthy person is sampled simultaneously with the sampling from the subject, and the concentration of each metabolite in the biological sample obtained in the healthy person is calculated. It may be a value calculated based on this.
  • An example of the predetermined threshold is a mode value obtained from an average value of biomarker values in a plurality of healthy persons, a binomial distribution, or the like.
  • the evaluation process is not particularly limited. For example, 1) evaluation of whether or not the subject is fatigued, 2) evaluation of whether or not the subject is chronic fatigue other than chronic fatigue syndrome, and 3) the subject is Evaluation of whether or not the patient has chronic fatigue syndrome, 4) A combination of at least two evaluations selected from 1) to 3) (for example, whether the subject has chronic fatigue syndrome or chronic fatigue syndrome that is not chronic fatigue syndrome) 5) Evaluation of the degree of fatigue, etc. are performed.
  • a specific example of the method for evaluating fatigue according to the present invention includes a step (1) of obtaining a ratio (OC ratio) between an ornithine concentration and a citrulline concentration in a biological sample obtained from a subject. Furthermore, the process (2) which compares the threshold value corresponding to the said OC ratio with the said OC ratio is included after the said process (1) as needed. Furthermore, if necessary, the ratio (PI ratio) between the pyruvic acid concentration and the isocitrate concentration in the biological sample obtained from the same subject, assuming that the step (1) or the step (2) is performed. Obtaining step (3) is included. Further, if necessary, a step (4) of comparing the PI ratio with a threshold corresponding to the PI ratio is included after the step (3).
  • the step (3) of obtaining the ratio (PI ratio) between the pyruvate concentration and the isocitrate concentration in the biological sample obtained from the subject, the threshold corresponding to the ratio (PI ratio), and the ratio (PI ratio) It is highly positive to perform the step (2) of comparing the threshold corresponding to the OC ratio and the OC ratio on the subject who has been evaluated for fatigue by performing the step (4) of comparing the OC ratio) In some cases, it is preferable to obtain a discrimination rate and a low misclassification rate. For example, the evaluation by the decision tree shown in FIGS. 9 and 10 is also referred to. In FIGS.
  • a step of directly taking out tissue or cells from a human subject as a first step of sample acquisition is performed by a doctor.
  • a step in which a doctor makes a diagnosis as to whether or not the patient is fatigue (including chronic fatigue and chronic fatigue syndrome) using the result obtained by the evaluation step is also performed as necessary.
  • kits having a reagent used for carrying out the fatigue evaluation method as described above are also within the scope of the present invention. That is, the kit according to the present invention includes a reagent for measuring the concentration of a metabolite in a biological sample necessary for obtaining the value of the biomarker of the present invention in order to evaluate fatigue. As an example, when ornithine is used as a biomarker, the kit according to the present invention includes a reagent for measuring the ornithine concentration in a biological sample.
  • the kit according to the present invention includes a reagent for measuring the ornithine concentration and the citrulline concentration in the biological sample.
  • the reagent for measuring the ornithine concentration include ornithine cyclase that reacts with ornithine to generate ammonia.
  • the reagent for measuring the citrulline concentration include argininosuccinate synthase that reacts with citrulline and consumes ATP. It is done.
  • the kit may also preferably contain an inhibitor of the activity of the enzyme involved in the degradation reaction of arginine contained in the biological sample, particularly when measuring the concentration of arginine, ornithine or citrulline, etc. In some cases, it is preferable for the purpose of further improving the accuracy of measurement.
  • the enzyme involved in the degradation reaction of arginine includes arginase and nitric oxide synthase (NOS) involved in the reaction of producing nitric oxide and citrulline from arginine. Included in biological samples such as blood preparations.
  • the arginase inhibitor include N ⁇ -Hydroxy-nor-L-arginine (nor-NOHA) or a salt thereof (for example, diacetate).
  • Is for example, N G -Nitro-L-Arginine (L-NNA) or a salt thereof.
  • L-NNA N G -Nitro-L-Arginine
  • a necessary amount may be charged in advance in a container for storing a biological sample.
  • kits having a configuration for visually detecting the biomarker of the present invention is also within the scope of the present invention. That is, the second kit according to the present invention includes a presentation unit that indicates the value of the biomarker of the present invention in order to evaluate fatigue.
  • the presenting part for example, at least one of a first presenting part indicating the ratio of the ornithine concentration to the citrulline concentration (OC ratio) and a second presenting part indicating the ratio of the pyruvic acid concentration to the isocitrate concentration (PI ratio)
  • the provided kit is also a category of the kit according to the present invention.
  • kit is intended as a package with a container (eg, bottle, plate, tube, dish, etc.) containing a particular material, but as a composition. Forms containing the material in the substance are also encompassed by the term “kit”.
  • the kit preferably includes instructions for using each material.
  • the instruction sheet may further display a predetermined threshold value (reference value) for evaluation by comparison with the value of the biomarker, if necessary.
  • threshold value reference value
  • “comprising” is intended to mean being contained in any of the individual containers that make up the kit.
  • the kit which concerns on this invention may be the packaging which packed several different compositions in one, and in the case of a solution form, you may enclose in the container.
  • the kit according to the present invention may be provided with a plurality of components mixed in the same container or in separate containers.
  • the “instructions” may be written or printed on paper or other media, or may be affixed to electronic media such as magnetic tape, computer readable disk or tape, CD-ROM, etc. .
  • the kit according to the present invention may also include a container containing a diluent, a solvent, a washing solution or other reagent.
  • the kit according to the present invention may include instruments and reagents necessary for collecting a biological sample.
  • the kit according to the present invention may be provided with instruments and reagents necessary for preparing a target preparation from a biological sample.
  • the kit according to the present invention can be used easily in an actual medical field, so that it is possible to provide an objective diagnosis with faster and cheaper fatigue.
  • the kit according to the present invention not only can evaluate fatigue and propose a treatment method, but can also provide a criterion for determining fatigue (including chronic fatigue and chronic fatigue syndrome). It becomes easy to diagnose whether or not That is, the kit according to the present invention diagnoses a kit (for example, fatigue (including chronic fatigue and chronic fatigue syndrome)) for providing a diagnostic standard or a criterion for fatigue (including chronic fatigue and chronic fatigue syndrome). Or a kit for acquiring data for determination).
  • a kit for example, fatigue (including chronic fatigue and chronic fatigue syndrome)
  • each member constituting the fatigue evaluation system according to the present invention is a functional block realized by executing a program code stored in a recording medium such as a ROM or a RAM by a calculation means such as a CPU.
  • a program code stored in a recording medium such as a ROM or a RAM by a calculation means such as a CPU.
  • a case of “some” will be described as an example, but it may be realized by hardware that performs the same processing.
  • the hardware for performing a part of the processing and the arithmetic means for executing the program code for performing the control of the hardware and the remaining processing It can also be realized in combination.
  • the arithmetic means may be a single unit, or a plurality of arithmetic means connected via a bus inside the apparatus or various communication paths may execute the program code jointly.
  • the fatigue evaluation system includes at least an input receiving unit 11A, a storage unit 12, a CPU 13, and a display unit 14 as functional blocks.
  • the input receiving unit 11A is an interface that receives an input of a measurement result from the measuring unit 11, and is configured as an interface that connects the measuring unit 11 and the fatigue evaluation system, or as an input device such as a keyboard or a mouse in some cases. Composed.
  • the measurement unit 11 has a function of a measurement device that measures the concentration of a metabolite (for example, ornithine or citrulline) related to the biomarker of the present invention.
  • the storage unit 12 functions as a measurement value receiving unit 12a that receives a measurement value of the concentration of the metabolite and a reference value storage unit 12b that stores a reference value (threshold value) for evaluating fatigue.
  • the CPU 13 has a function as an operation unit 13a that generates information for evaluating fatigue and an evaluation unit 13b that receives evaluation information from the operation unit 13a and evaluates fatigue.
  • the display unit 14 has a function as the evaluation result display unit 14 that displays the evaluation result by the evaluation unit 13b (for example, configured as a liquid crystal display device). This functional block is realized by the CPU 13 executing a program stored in the storage unit 12 and controlling peripheral circuits such as an input / output circuit.
  • the measuring unit 11 measures the ornithine concentration and the citrulline concentration in the biological sample.
  • the measured value receiving unit 12a receives (stores) the ornithine concentration and citrulline concentration measured in step 1 through the input receiving unit 11A.
  • the calculation unit 13a reads the ornithine concentration and citrulline concentration stored in the measurement value receiving unit 12a, and calculates the ratio (OC ratio) between the ornithine concentration and the citrulline concentration.
  • the OC ratio is stored in the storage unit 12 as necessary.
  • the calculation unit 13a generates evaluation information for evaluating fatigue from the calculated OC ratio and the reference value stored in the reference value storage unit 12b.
  • the evaluation unit 13 b evaluates fatigue based on the evaluation information generated at step 4.
  • the fatigue evaluation result generated by the evaluation unit 13 b is displayed on the display unit 14.
  • the ratio (or OC ratio) between the ornithine concentration and the citrulline concentration may be received by the measurement value receiving unit 12a via the input receiving unit 11A.
  • the calculation unit 13a reads the OC ratio stored in the measurement value receiving unit 12a, and the OC ratio and the reference value stored in the reference value storage unit 12b. From this, evaluation information for evaluating fatigue is generated. Step 5 is as described above. Note that the steps from generation of evaluation information to fatigue evaluation can be executed by operating an evaluation program (for example, a decision tree analysis program) stored in the storage unit 12, for example. For example, when the results shown in FIGS.
  • the system according to the present invention diagnoses a system (for example, fatigue (including chronic fatigue and chronic fatigue syndrome)) for providing a diagnosis standard or determination standard for fatigue (including chronic fatigue and chronic fatigue syndrome). Or a system for obtaining data for determination).
  • a system for example, fatigue (including chronic fatigue and chronic fatigue syndrome)
  • a diagnosis standard or determination standard for fatigue including chronic fatigue and chronic fatigue syndrome.
  • a system for obtaining data for determination can be provided.
  • One aspect of the present invention includes, for example, the following inventions.
  • a method for evaluating fatigue (2) The method according to (1), comprising a step of comparing a threshold corresponding to the ratio (OC ratio) and the ratio (OC ratio).
  • the method according to (1) or (2) comprising: (4) The method according to (3), comprising a step of comparing a threshold corresponding to the ratio (PI ratio) with the ratio (PI ratio).
  • a kit for evaluating fatigue comprising a reagent for measuring ornithine concentration and a reagent for measuring citrulline concentration.
  • the kit according to (6) further including a first presenting unit indicating a ratio (OC ratio) between the ornithine concentration and the citrulline concentration.
  • the kit according to (6) or (7) further comprising a reagent for measuring pyruvic acid concentration and a reagent for measuring isocitrate concentration.
  • the kit according to (8) further including a second presentation unit indicating a ratio (PI ratio) between the pyruvic acid concentration and the isocitrate concentration.
  • a calculation unit that receives a reference value for evaluating fatigue and a ratio of the ornithine concentration to the citrulline concentration (OC ratio) and generates evaluation information for evaluating fatigue, and the evaluation information
  • a fatigue evaluation system with an evaluation unit that receives and evaluates fatigue.
  • biomarker values are 1) 2-aminobutyric acid (2AB), 2-oxoglutarate (3-oxoglutarate), 3-hydroxybutyrate (3-Hydroxybutyrate), 3-methylhistidine (3-Methylhistidine), 4-Hydroxy-3-methoxybenzoate, 4-methyl-2-oxopentanoate, 5-oxoproline, alanine ( Ala), arginine (Arg), asparagine (Asn), aspartic acid (Asp), azelate (Azelate), beta-alanine (beta-Ala), betaine (Betaine), carnitine (Carnitine), choline Choline), Citrulline, Creatine, Creatinine, Cystine, Gamma-Butyrobetaine,
  • a concentration of at least one biomarker selected from the group consisting of (Malate) and succinate (Succinate) in a biological sample is used as the value of the biomarker.
  • a method for evaluating fatigue which is a ratio or difference in the concentration of biomarkers in a biological sample.
  • the biological sample has been subjected to treatment for suppressing the activity of arginase and / or nitric oxide synthase involved in the degradation reaction of arginine, (1) to (5), (12) to (15 ).
  • the kit according to (6) which contains an inhibitor of arginase or nitric oxide synthase involved in the degradation reaction of arginine.
  • Chronic fatigue syndrome in Trials 1 and 2 is a revised version of the diagnostic criteria for chronic fatigue syndrome (Ann Intern Med. 1994; 121: 953-959) prepared by the American Center for Disease Control and Prevention (CDC) ( As described in the special issue of Ayumi, “The latest science of fatigue—from Japan: Proposals for anti-fatigue / anti-overwork” (671-677) Repeat for at least 6 months or repeat (receive at least 50%), and exclude the disease by medical history, physical findings, and laboratory findings.
  • CDC American Center for Disease Control and Prevention
  • Chronic fatigue in Test 2 is a person who has not been satisfied with the diagnosis of chronic fatigue syndrome described above by a doctor, but who has seen fatigue or a feeling of fatigue intermittently for 6 months or longer and has visited the hospital.
  • healthy subjects in Tests 1 and 2 were recruited in consideration of age, fatigue level, presence or absence of mental illness, presence or absence of sleep disorders, presence or absence of medications for mental illness or sleep disorders, etc. recruiter).
  • Random Forest The random forest (Random Forest) program was executed using the analysis software R (free software, version 3.0.1) on the measured values of metabolites in the plasma samples for the population to which test 1 and test 2 were added. Also, the same random forest program was run on the test 2 population. Random Forest is an algorithm used for identification, regression, and clustering.
  • TCA circuit-related metabolites such as Isocitrate, Succinate, and Cis-Aconitate among a plurality of measurement items.
  • Related metabolites appeared at the top.
  • the urea cycle-related metabolite also appeared in the upper rank in the same analysis only for test 2 (FIG. 3).
  • Ornithine, Citrulline, and Urea Urate, 4-hydroxy-3-methoxybenzoate, Hydroxyproline, 4-Methyl-2-oxopentanoate, and Gamma-butyrobetaine also appeared at the top.
  • these metabolites were significantly increased or decreased in the comparison between the normal group and the chronic fatigue syndrome (FIG. 4).
  • FIG. 16 shows a random forest (Random) using all parameters including the measured values of metabolites in plasma samples of healthy subjects (HC) and chronic fatigue (CF) patients for the population of Study 2.
  • FIG. 17 shows a random forest (Random Forest) for all populations, including metabolite measurements in plasma samples of patients with chronic fatigue (CF) and chronic fatigue syndrome (CFS), for the study 2 population. It is a figure which shows the result of having executed the program.
  • the correct discrimination rate can be increased and the misclassification rate can be reduced even with a smaller number of trees.
  • the classification into 3 trees with Pyruvate / Isocitrate (PI ratio) of 20.61 or less or Ornithine / Citrulline (OC ratio) of 3.215 or less is only 80.6. It is possible to discriminate patients with chronic fatigue syndrome with a positive discrimination rate of 50% (50 out of 62 CFS) and an incorrect discrimination rate of 20.0% (13 out of 65 HC).
  • one form of the present invention it is possible to infer which part of the energy (ATP) production metabolic system and urea circuit system in the living body is abnormal, so that it can be used only for patient life guidance.
  • ATP energy
  • FIG. 12 graph data shows measured values of liver samples), urea circuit and TCA The abnormality of the circuit and the flow of metabolism peculiar to the fatigue condition from the urea circuit to the TCA circuit can be confirmed.
  • the PLS-DA method (Partial least squares discriminant analysis) is a method used for constructing a prediction model using regression analysis. Using this method, discrimination between HC (healthy person) and CFS (chronic fatigue syndrome), HC and CF (chronic fatigue), and CF and CFS was performed. R (free software, version 3.0.1) was used as software for performing analysis by the PLS-DA method.
  • HC and CFS showed different distributions in the PLS-DA score plot. Moreover, the metabolite in which the statistical significance difference was recognized showed the high load amount with respect to discrimination of 2 groups. Note that one plot in FIG. 18 corresponds to one person, HC indicates a healthy person, and CFS indicates a patient with chronic fatigue syndrome.
  • HC and CF showed different distributions.
  • metabolites that were found to have a statistically significant difference showed a high load for discrimination between the two groups.
  • One plot in FIG. 19 corresponds to one person, HC indicates a healthy person, and CF indicates a patient with chronic fatigue.
  • CF and CFS showed different distributions.
  • metabolites that were found to have a statistically significant difference showed a high load for discrimination between the two groups. Note that one plot in FIG. 20 corresponds to one human, CF indicates a patient with chronic fatigue, and CFS indicates a patient with chronic fatigue syndrome.
  • the blood contains an enzyme called arginase that promotes the reaction from arginine to ornithine, and nitric oxide synthase (NOS) involved in the reaction that produces nitric oxide and citrulline from arginine. It was suggested that the enzymatic reaction was progressing in the test tube.
  • arginase that promotes the reaction from arginine to ornithine
  • NOS nitric oxide synthase
  • 0h is a state immediately after blood collection
  • 2h is a state after blood collection and left for 2 hours at room temperature without addition of an inhibitor
  • 5h is room temperature after blood collection without addition of an inhibitor.
  • 100 ⁇ M nor-NOHA (5 h) is 100 ⁇ M nor-NOHA added at a final concentration and left at room temperature for 5 hours.
  • 100 ⁇ M nor-NOHA + 100 ⁇ M L-NNA (5 h) is Add 100 ⁇ M nor-NOHA and L-NNA at final concentration and let stand for 5 hours at room temperature.
  • 300 ⁇ M nor-NOHA + 100 ⁇ M L-NNA (5 h) shows the state after adding 300 ⁇ M nor-NOHA and 100 ⁇ M L-NNA at final concentrations and left at room temperature for 5 hours.
  • the use of the present invention makes it possible to objectively and easily perform fatigue evaluation and diagnosis.
  • the present invention may further provide techniques useful for treating fatigue. Because fatigue is a very significant health problem, the realization of fatigue assessment, diagnosis and treatment contributes greatly across all industries.

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Abstract

　客観的かつ簡便な疲労の診断および評価を可能にするバイオマーカー、および該バイオマーカーを用いた疲労の診断技術を開発するため、本発明に係る疲労を評価する方法は、被験者から得た生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を得る工程を包含する。

Description

疲労のバイオマーカーおよびその利用
　本発明は、疲労を評価するバイオマーカーおよび該バイオマーカーを用いた疲労の評価および診断に関する。
　日本国における疫学調査によれば、一般大衆の約６０％が疲労を自覚しており、その半数以上が６ヶ月以上続く疲労に悩まされている。このような慢性的な疲労を感じている人の約半数が、仕事または学業の能率低下を訴えており、かかる疲労による経済的損失は１兆円以上と予測されている。
　慢性的な疲労を感じている人の中には、たとえ疲れていなくても極度の疲労を感じてしまう、未だ原因が十分解明されていない慢性疲労症候群（Chronic Fatigue Syndrome）の患者が含まれている。慢性疲労症候群患者は、身体及び思考力両方の激しい疲労を主訴とすることが多く、それに伴い、日常生活の質（QOL）も著しく阻害される。臨床上、慢性疲労症候群は、疲労の蓄積による慢性疲労と区別して扱われるが、その診断ができる医師は少なく、また、効果的な治療法も見出されていない。
　これまでの疲労診断の多くは、患者の主観と医師の診断に基づくものであるため、疲労を客観的に診断するための指標の確立が望まれている。特許文献１には、免疫力低下の原因の１つとして挙げられているウイルス感染に着目し、ウイルスの挙動を疲労度の指標として評価する技術が開示されている。非特許文献１には、疲労を加速度脈波によって客観的に測定／評価する試みが開示されている。
日本国公開特許公報：特開２００７－３３０２６３号公報（公開日：２００７年１２月２７日） 日本国公開特許公報：特開平９－７７６８８号公報（公開日：１９９７年３月２５日） 日本国公開特許公報：特開平９－５９１６１号公報（公開日：１９９７年３月４日） 日本国公開特許公報：特開２０１１－１７７１９４号公報（公開日：２０１１年９月１５日） 日本国公開特許公報：特開２０１３－１１９００１号公報（公開日：２０１３年６月１７日） 日本国公開特許公報：特開２０１１－１８２６６１号公報（公開日：２０１１年９月２２日） 日本国公開特許公報：特開２０１１－１６１１３７号公報（公開日：２０１１年８月２５日） 日本国公開特許公報：特開２０１０－２６６２３８号公報（公開日：２０１０年１１月２５日） 日本国公開特許公報：特開２０１０－８５３６９号公報（公開日：２０１０年４月１５日） 日本国公開特許公報：特開２００７－２２８８７８号公報（公開日：２００７年９月１３日） 日本国公表特許公報：特表２０００－５１６８１８号公報（公表日：２０００年１２月１９日） 国際公開ＷＯ２００６／１２３６１１（国際公開日：２００６年１１月２３日） 国際公開ＷＯ２００５／０１２９０３号公報（国際公開日：２００５年２月１０日）
「疲労の生理学的計測：加速度脈波」　山口浩二ら、医学のあゆみ　特集「最新・疲労の科学－日本発：抗疲労・抗過労への提言」 Vol.228, No.6, 646-653 (2009)。
　疲労の原因や疲労のメカニズムは複雑であり、その全貌は解明されていない。しかしながら、例えば疲労の治療等の応用を考慮した場合は特に、生体が本来有しているメカニズムや疲労の原因に則して、疲労を客観的に評価する技術の開発が望まれている。
　特許文献１に記載の技術は、被験者の体液を採取し、体液中のヒトヘルペスウイルスの量を測定し、疲労度との関係を評価している。しかし、この技術は、ヒト（宿主）に感染したウイルスの挙動を観察するものであり、ヒトにおける疲労の原因やメカニズムを反映したバイオマーカーを測定するものではない。そのため、特許文献１記載の技術では、個々の被験者の疲労状態を評価したり、治療法または予防法を提供したりすることができない。また、非特許文献１記載の技術は、非侵襲的に実施され得るという利点があるが、特殊な機器による指尖容積脈波の測定、および特殊な原理に基づくデータ処理が必要であり、汎用性に乏しい。
　本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、疲労を客観的かつ簡便に評価および診断することを可能にする方法を提供することにある。
　本発明者らは、上述の課題を解決するために、慢性疲労症候群患者、慢性疲労患者及び健常者からの血漿サンプルを用いて包括的且つ網羅的なメタボローム解析研究を行い、複雑な生体内の代謝に関わる各血漿サンプルに存在する多種の代謝物質の濃度を調べた。そして、統計解析を加えたところ、特定の代謝物質の増減パターンが疲労状態を反映していることを見出し、この増減パターンに基づいて生体代謝情報を数値化または定量化することにより、客観的かつ簡便な疲労診断を行うことが可能になることを明らかにし、本発明を完成させるに至った。即ち、本発明は、以下の通りである。
（１）被験者から得た生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を得る工程と、前記比率（ＯＣ比率）に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含する、疲労を評価する方法。
（２）オルニチン濃度を測定するための試薬とシトルリン濃度を測定するための試薬とを備えている、疲労を評価するためのキット。
（３）疲労を評価するための基準値と、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）とを受け取って、疲労を評価するための評価情報を生成する演算部、および、前記評価情報を受け取って、疲労を評価する評価部、を備えた疲労評価システム。
（４）疲労を評価する方法であって、被験者から得た生体サンプル中のバイオマーカーの値を得る工程と、前記バイオマーカーの値に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含し、前記バイオマーカーの値が、１）2-アミノ酪酸（2AB）、２－オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）、３－ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyrate）、３－メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、４-ヒドロキシ－３－メトキシベンゾエート（4-Hydroxy-3-methoxybenzoate）、４－メチル－２－オキソペンタノエート（4-methyl-2-oxopentanoate）、５-オキソプロリン（5-Oxoproline）、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、アゼライン酸（Azelate）、ベータアラニン（beta-Ala）、ベタイン（Betaine）、カルニチン（Carnitine）、コリン（Choline）、シトルリン（Citrulline）、クレアチン（Creatine）、クレアチニン（Creatinine）、シスチン（Cystine）、ガンマブチロベタイン（Gamma-Butyrobetaine）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、ムケート（Mucate）、N,N-ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、オルニチン（Ornithine）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、尿素（Urea）、ピルビン酸（Pyruvate）、サルコシン（Sarcosine）、セリン（Ser）、タウリン（Taurine）、トレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、尿酸（Urate）、及び、バリン（Val）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度であるか、２）前記群にシス－アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、リンゴ酸（Malate）、及びコハク酸（Succinate）を加えた群より選択される複数種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率または差分である、疲労を評価する方法。
　本発明は、疲労の評価および診断を客観的かつ簡便に行うことを可能にする。本発明はさらに、疲労の治療に有用な技術を提供し得る。
健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿中に含まれている種々の代謝物の濃度を比較した結果を示す図である。 試験１および試験２を加えた集団に対して、健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した結果を示す図である。 試験２の集団に対して、健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレストプログラムを実行した結果を示す図である。 健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の間で、血漿中に含まれている濃度に有意差が見られる代謝物の一例を示す図である。 健常者（ＨＣ）および慢性疲労（ＣＦ）の患者の血漿中に含まれている種々の代謝物の濃度を示す図である。 健常者（ＨＣ）および慢性疲労（ＣＦ）の患者の間で、血漿中に含まれている濃度に有意差が見られる代謝物の一例を示す図である。 健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者を分析する目的で、試験１と試験２のすべての血漿サンプル中の代謝物質の測定値を対象に決定木モデルによる解析を実行した結果の一例を示す図である。 健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者を分析する目的で、試験１と試験２のすべての血漿サンプル中の代謝物質の測定値を対象に決定木モデルによる解析を実行した結果の他の例を示す図である。 健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者を分析する目的で、試験１と試験２のすべての血漿サンプル中の代謝物質の測定値の比を対象に決定木モデルによる解析を実行した結果のさらに他の例を示す図である。 健常者（ＨＣ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者を分析する目的で、試験１と試験２のすべての血漿サンプル中の代謝物質の測定値の比を対象に決定木モデルによる解析を実行した結果のさらに他の例を示す図である。 慢性疲労（ＣＦ）の患者および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿中に含まれている種々の代謝物の濃度を比較した結果を示す図である。 疲労モデル動物（ラット）の疲労負荷実験を通じて、当該モデル動物の血液や肝臓を対象とした網羅的代謝解析から確認された、尿素回路およびＴＣＡ回路における代謝異常と、尿素回路からＴＣＡ回路への疲労病態特有の代謝の流れ込みとを示す図である（グラフデータは肝臓検体のものを示す）。 図および本明細書中で用いたアミノ酸の略語とフルネームとの対応を示す図である。 採取したヒトの全血において、オルニチンの濃度、及びアルギニンの濃度が時間の経過とともに変化する様子を示すグラフである。 ラットの全血を用いた実験において、各種酵素の阻害剤を添加することでアルギニンおよびオルニチンの時間経過による濃度変化が抑えられることを示すグラフである。 試験２の集団に対して、健常者（ＨＣ）および慢性疲労（ＣＦ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した結果を示す図である。 試験２の集団に対して、慢性疲労（ＣＦ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した結果を示す図である。 ＰＬＳ－ＤＡ法を用いて、ＨＣ群、ＣＦＳ群の２群比較を行った結果を示す図である。 ＰＬＳ－ＤＡ法を用いて、ＨＣ群、ＣＦ群の２群比較を行った結果を示す図である。 ＰＬＳ－ＤＡ法を用いて、ＣＦ群、ＣＦＳ群の２群比較を行った結果を示す図である。
　〔Ａ〕生体サンプル
　本明細書中にて使用される場合、用語「生体サンプル」は、被験体から採取された任意の組織（血液等の体液を含む。）または細胞が意図され、これらから調製された組織切片または細胞溶解物もまた生体サンプルに包含され得る。本発明に用いるに好ましい生体サンプルとしては、血液、唾液、尿、間質液、汗、およびこれらからの調製物（例えば、血清、血漿など）などが挙げられるがこれらに限定されない。生体サンプルは好ましくは血液または血液調製物（血清、血漿など）である。
　〔１〕疲労
　現在、疲労・倦怠感を主症状として医療機関へ訪れる患者(急性疲労・慢性疲労・慢性疲労症候群を含む)の数は、痛みを主症状とする患者の数に次いで２番目に多い。しかしながら、疲労を客観的に評価する方法は、これまでに開発されていない。疲労感および倦怠感は、ヒトが日常的に経験する感覚であり、生体のホメオスタシスの乱れを知らせる重要な生体シグナルである。しかし、疲労感はあくまでも主観的なものであり、疲労度を客観的に示すものではない。乳酸が疲労の原因物質であると考えられた時期もあるが、乳酸レベルの変動は、運動の指標になり得るが、疲労状態の指標にはならないということもわかってきている。さらに、疲労に効果的な治療法も見出されていない。
　アメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）が、「慢性疲労症候群」という、原因不明の強い疲労を呈する疾患を１９８８年に報告してから、そのメカニズムの解明、バイオマーカーの探索、および治療予防法の開発を中心とした、種々の研究がなされてきた。しかし、慢性疲労症候群の発症メカニズムは未だ解明されておらず、客観的バイオマーカーについても開発されていない。現在においても、ＣＤＣが１９９４年に発表した、症状および身体所見の基準を用いて慢性疲労症候群の診断がなされている。
　一方、これまでに、慢性疲労症候群において、ウイルス活性化または自律神経異常を指標とした疲労バイオマーカーが提案されている。しかし、これらはヒトの疲労の原因やそのメカニズムに則したものではないため、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含むが、特に慢性疲労、慢性疲労症候群）に特異的なバイオマーカーとはいいがたい。さらに、これらは、ホメオスタシスの維持／回復のメカニズムの間接的な指標であっても直接的な指標ではないため、具体的な治療法の提供にまで発展させることは試行錯誤が必要である。
　本願発明者らは、すでに、解糖系およびＴＣＡ回路を形成する代謝物の中に、健常者と比較して、慢性疲労症候群の患者群において低下しているものがあることを見出している（参考文献：国際公開ＷＯ２０１１／１６１５４４　Ａ２（米国特許シリアル番号１３／８０５，４４９））。今回、より大きな、異なる集団から得られたデータを加えることで、新たに尿素回路に関係する代謝物において、疲労患者群と健常者との間で特徴的な変化を見出した。より具体的な一例では、疲労患者群において、尿素回路からＴＣＡ回路へ流入する代謝経路が促進し、その結果、アンモニアを代謝する反応系が抑制されるといった特徴的な代謝病態が同定された。こうした疲労病態を表す代謝異常は、ラットに疲労負荷したモデル実験系でも裏付けられた。
　なお、本明細書において、特に断りのない限り、慢性疲労患者とは、慢性疲労症候群の患者を包含しないものである。なお、慢性疲労とは、６カ月以上断続的に疲労あるいは疲労感を主訴に持つものの、医師の診断によって慢性疲労症候群とは診断されなかったケースを指す。慢性疲労症候群とは、アメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）によって作成された慢性疲労症候群診断基準（Ann Intern Med. 1994;121:953-959）を日本国内用に改定したもの（医学のあゆみ 特集「最新・疲労の科学 －日本発：抗疲労・抗過労への提言」６７１－６７７）に記されているように（１）生活が著しく損なわれるような強い疲労を主症状とし、少なくとも６ヵ月以上の期間持続または再発を繰り返す（５０％以上の期間認められること）。かつ、病歴、身体所見、検査所見で疾患を除外する。さらに、（２）症状基準８項目以上か、症状基準６項目・身体基準２項目以上を満たすケースを指す。
　〔２〕本発明のバイオマーカー
　本発明の一形態にかかる、疲労のバイオマーカーは、以下の通りである。
　１）　図２、図３、図４、図６、図７、図８、図１１、図１６、及び図１７の何れかにおいて具体的に記載されているバイオマーカー。より具体的に列挙すれば、例えば、2-アミノ酪酸（2AB）、２－オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）、３－ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyrate）、３－メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、４-ヒドロキシ－３－メトキシベンゾエート（4-Hydroxy-3-methoxybenzoate）、４－メチル－２－オキソペンタノエート（4-methyl-2-oxopentanoate）、５-オキソプロリン（5-Oxoproline）、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、アゼライン酸（Azelate）、ベータアラニン（beta-Ala）、ベタイン（Betaine）、カルニチン（Carnitine）、コリン（Choline）、シス－アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、シトルリン（Citrulline）、クレアチン（Creatine）、クレアチニン（Creatinine）、シスチン（Cystine）、ガンマブチロベタイン（Gamma-Butyrobetaine）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、イソロイシン（Ile）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、リンゴ酸（Malate）、メチオニン（Met）、ムケート（Mucate）、N,N-ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、オルニチン（Ornithine）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、尿素（Urea）、ピルビン酸（Pyruvate）、サルコシン（Sarcosine）、セリン（Ser）、コハク酸（Succinate）、タウリン（Taurine）、トレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、尿酸（Urate）、及び、バリン（Val）である。これらの中で、特に、２－オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）、４-ヒドロキシ－３－メトキシベンゾエート（4-Hydroxy-3-methoxybenzoate）、４－メチル－２－オキソペンタノエート（4-methyl-2-oxopentanoate）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、コリン（Choline）、シス－アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、シトルリン（Citrulline）、クレアチン（Creatine）、ガンマブチロベタイン（Gamma-Butyrobetaine）、グルタミン（Gln）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、イソクエン酸（Isocitrate）、リジン（Lys）、オルニチン（Ornithine）、尿素（Urea）、ピルビン酸（Pyruvate）、コハク酸（Succinate）、タウリン（Taurine）、トリプトファン（Trp）、及び、尿酸（Urate）は、実施例にも示す通り、異なる疲労状態の間で、統計的な有意差がある、特に有用なバイオマーカーである。
これらの中でも、尿素回路に関連する代謝物や尿素回路からＴＣＡ回路への代謝の流れ込みに関わる代謝物がバイオマーカーとしてより好ましい。尿素回路に関連する代謝物や尿素回路からＴＣＡ回路への代謝の流れ込みに関わる代謝物のバイオマーカーとしては、図１又は図４に示される代謝物、オルニチン（Ornithine）、シトルリン（Citrulline）、尿素（Urea）、Urate、4-hydroxy-3-methoxybenzoate、Hydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、およびGamma-butyrobetaineなどが挙げられる。中でも、上記バイオマーカーとしては、疲労状態によって異なる挙動を示すことから、オルニチン（Ornithine）、シトルリン（Citrulline）、尿素（Urea）等がさらに好ましく、オルニチン（Ornithine）、シトルリン（Citrulline）が特に好ましい。上記バイオマーカーは任意の複数個を同時に解析に用いてもよい。
なお、１）で上述したバイオマーカーのうち、シス－アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、リンゴ酸（Malate）、及び、コハク酸（Succinate）は、単独で用いるのではなく、これら以外の１）で上述したバイオマーカーと組み合わせて用いる場合がある。
　これらバイオマーカーは、例えば、生体サンプル中の濃度として取得され、所定の閾値（基準値）と比較されて疲労の評価に用いられる。所定の閾値は、分析の手法等に応じて、バイオマーカー毎に適宜設定される。
　上記分析の手法としては、通常生体中の代謝物の濃度測定に用いられるものであればよく、特に限定されない。例えば、ＣＥ－ＭＳ／ＭＳ(キャピラリー電気泳動質量分析法)やＬＣ－ＭＳ／ＭＳ(液体クロマトグラフィー質量分析法)等が広く用いられている。
　所定の閾値の一例は、複数の健常者における生体サンプル中のバイオマーカーの濃度の平均値や、二項分布等から得られる最頻値である。また、例えば、図２、図３、図４、図６、図７、図８、及び図１１、並びに実施例に示す通り、バイオマーカーの量が、閾値を基準としてどのような状態（例えば、閾値以上か、閾値未満か）にあれば、疲労であるか否か（或いは、例えば、慢性疲労であるか否か、慢性疲労症候群であるか否か、等）の評価が可能である。
　特に限定されないが、図２、図３、図４、図７、及び、図８に記載のバイオマーカーは、被験者が健常者であるか慢性疲労症候群の患者であるかを評価するマーカーとして特に有用である。より具体的には、例えば、Ornithine、Citrulline、Urea、Hydroxyproline、Urate、4-Hydroxy-3-methoxybenzoate、Isocitrate、Citrate、Pyruvate、Cis-aconitate、Gamma-Butyrobetaine、4-methyl-2-oxopentanoate、及び、2-oxoglutarateは、健常者と慢性疲労症候群の患者との間で、統計的な有意差がある、特に有用なバイオマーカーである。また、これら以外としては、Succinate、Pro、Leu、3-Methylhistidine、Creatinine、His、Ala、N,N-Dimethylglycine、Ser、Lys、Betaine、Glu、Taurine、2AB、Arg、3-Hydroxybutyrate、Creatine、Trp、Mucate、Cystine、Asp、Sarcosine、Thr、及びValが、ランダムフォレスト解析の結果として、被験者が健常者であるか慢性疲労症候群の患者であるかを評価するマーカーとなり得るものである。なお、SuccinateからValまでのマーカーは、ランダムフォレスト解析の結果として上位（すなわちマーカーとして有望）に来るものから順に列挙をしている。
また、特に限定されないが、図６、及び、図１６に記載のバイオマーカーは、被験者が健常者であるか慢性疲労の患者（特に慢性疲労症候群ではない慢性疲労の患者）であるかを評価するマーカーとして特に有用である。より具体的には、例えば、Choline、Gly、Taurine、Asn、Gamma-Butyrobetaine、Gln、Lys、Trp、4-methyl-2-oxopentanoate、及び、Succinateは、健常者と慢性疲労の患者（特に慢性疲労症候群ではない慢性疲労の患者）との間で、統計的な有意差がある、特に有用なバイオカーカーである。また、これら以外としては、Cis-Aconitate、Lactate、Arg、Mucate、His、Azelate、N,N-Dimethylglycine、Creatinine、beta-Ala、Tyr、Ornithine、2AB、Leu、Isocitrate、Hydroxyproline、Phe、Met、3-Methylhistidine、Sarcosine、Ile、Betaine、Pyruvate、Urate,4-Hydroxy-3-methoxybenzoate、Ser、Asp、Carnitine、Urea、5-oxoproline及び、Citrateが、ランダムフォレスト解析の結果として、被験者が健常者であるか慢性疲労の患者（特に慢性疲労症候群ではない慢性疲労の患者）であるかを評価するマーカーとなり得るものである。なお、Cis-AconitateからCitrateまでのマーカーは、ランダムフォレスト解析の結果として上位（すなわちマーカーとして有望）に来るものから順に列挙をしている。
また、特に限定されないが、図１１、及び、図１７に記載のバイオマーカーは、被験者が、慢性疲労症候群の患者であるか、慢性疲労症候群ではない慢性疲労の患者であるかを評価するマーカーとして特に有用である。より具体的には、例えば、Choline、Succinate、Gln、Taurine、Asn、Lys、Arg、His、Urate、及び、4-Hydroxy-3-methoxybenzoateは、慢性疲労症候群の患者と、慢性疲労症候群ではない慢性疲労の患者との間で、統計的な有意差がある、特に有用なバイオマーカーである。また、これら以外としては、N,N-Dimethylglycine、3-Methylhistidine、Azelate、Ile、Trp、4-methyl-2-oxopentanoate、Ser、Cis-Aconitate、Met、Phe、Gly、Lactate、Ala、Leu、Citrulline、Malate、gamma-Butyrobetaine、Sarcosine、beta-Ala、Glu、2-Oxoglutarate、Pyruvate、Asp、Urea、Creatinine、Carnitine、2AB、Betaine、Citrate、及びTyrが、ランダムフォレスト解析の結果として、被験者が慢性疲労症候群の患者であるか慢性疲労の患者（慢性疲労症候群ではない）であるかを評価するマーカーとなり得るものである。なお、N,N-DimethylglycineからTyrまでのマーカーは、ランダムフォレスト解析の結果として上位（すなわちマーカーとして有望）に来るものから順に列挙をしている。
　２）　上記１）の複数個のバイオマーカーの相関関係として構成されるバイオマーカー。例えば、上記１）の複数のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率、および、当該生体サンプル中の濃度の差分、等が該当する。一例としては、図９、および図１０に具体的に示されたバイオマーカーである、生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率、例えば、Ｏ／ＣまたはＣ／Ｏ）；生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）；生体サンプル中のアラニン濃度とヒドロキシプロリン濃度との比率（ＡＰ比率）；等が該当する。バイオマーカーは任意の複数個を同時に解析に用いてもよい。なお、ランダムフォレスト解析で上位に位置する代謝物（図３参照：例えば、Ornithine、Citrulline、Urea、Urate、4-hydroxy-3-methoxybenzoate、Hydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、Gamma-butyrobetaine等）からなる群より選択される２つの代謝物の濃度比率を、上記ＯＣ比率と代替的にかＯＣ比率と組み合わせて、バイオマーカーとして用いることもでき、上記ＯＣ比率と代替的にかＯＣ比率と組み合わせて用いるバイオマーカーとして好ましくは、生体サンプル中のオルニチン濃度と、Urea、Urate、4-hydroxy-3-methoxybenzoate、Hydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、Gamma-butyrobetaineから選択される何れかの濃度との比率を挙げることが出来る。
　これらバイオマーカーは、例えば、所定の閾値（基準値）と比較されて疲労の評価に用いられる。所定の閾値は、分析の手法等に応じて、バイオマーカー毎に適宜設定される。
　所定の閾値の一例は、複数の健常者におけるバイオマーカーの値の平均値や、二項分布等から得られる最頻値である。また、例えば、図９、及び図１０、並びに実施例の記載に示す通り、バイオマーカーの値が、閾値を基準としてどのような状態（例えば、閾値以上か、閾値未満か）にあれば、疲労であるか否か（或いは、例えば、慢性疲労であるか否か、慢性疲労症候群であるか否か、等）の評価が可能である。
　特に限定されないが、図９、及び図１０に記載のバイオマーカーは、被験者が健常者であるか慢性疲労症候群の患者であるかを評価するマーカーとして特に有用である。
　実施例も参照される通り、本発明のバイオマーカーの一側面は、慢性疲労症候群の患者および慢性疲労の患者の血漿と健常者の血漿とにおける代謝物質の変動を網羅的に解析することにより見出された、疲労疾患のメカニズムに基づく客観的な疲労バイオマーカーである。従って、本発明のバイオマーカーの一側面として、客観的かつ簡便な、疲労の評価および診断を可能にする。さらに、本発明のバイオマーカーを用いれば、慢性疲労や慢性疲労症候群の診断法および治療法を開発し得る。
　また、本発明の他の側面として、本発明のバイオマーカーを用いれば、安価で簡単な疲労診断システムを作成することが可能になり、さらに、診断結果を受けて、効果的な治療法が見出せる可能性もある。例えば、強い疲労感や長期に続く疲労感を訴える患者に対し、血液を採取し、本発明のバイオマーカーを調べることで、慢性疲労か否かや慢性疲労症候群か否かの判別や、疲労度の客観的評価ができる。この評価は、疲労に関する高度な知識がなくとも、一般の医療施設で検査可能である。
　また、本発明の一側面として、被験者の血液成分を測定することで被験者が慢性疲労症候群に属するか否かを判断できる。従来の診断基準では、（１）生活が著しく損なわれるような強い疲労を主症状とし、少なくとも６ヵ月以上の期間持続または再発を繰り返す（５０％以上の期間認められること）。かつ、病歴、身体所見、検査所見で疾患を除外する。さらに、（２）症状基準８項目以上か、症状基準６項目・身体基準２項目以上を満たすことが必要であり（医学のあゆみ 特集「最新・疲労の科学 －日本発：抗疲労・抗過労への提言」６７１－６７７）、診断されるまでの測定項目の多さ・長期間にわたる観察（測定）時間・経済的な負担・医者の判断基準の個人差などが問題として挙げられる。本発明の一側面として、限られた血液中の代謝物を測定することで、客観的な診断が下せるだけでなく、診断結果が病態そのものを表すため、治療方針を立てることにも役立つ。また、本発明で明らかになった代謝物の多くは肝臓において猛毒であるアンモニアを尿素へ代謝する尿素代謝系（尿素回路）に深く関係しており、慢性疲労症候群のみでなく、慢性疲労の診断にも利用できる。特に、実際の医療現場で使用できる測定キットを生産することにより、慢性疲労症候群・慢性疲労をより速く、安く、客観的に診断できるものと考えられる。
　本発明のバイオマーカーは、疲労に関する既知のバイオマーカーと組み合わせて用いることもできる。既知のバイオマーカーは特に限定されないが、例えば、国際公開ＷＯ２０１１／１６１５４４ Ａ２（米国特許シリアル番号１３／８０５，４４９）で報告されたエネルギー（ＡＴＰ）産生系代謝物に基づくものが挙げられる。国際公開ＷＯ２０１１／１６１５４４ Ａ２に記載のバイオマーカーと組み合わせて解析することで、生体内のどの部分に異常があるかがより正確に推測でき、慢性疲労症候群の患者および慢性疲労の患者の生活指導に活かせるたけでなく、原因と考えられる代謝系を是正する食薬の提供も可能となる。また、本発明の一側面として、解糖系やＴＣＡ回路といったエネルギー産生系代謝物のみで疲労患者群を判定する方法と組み合わせて、尿素回路およびその周辺の代謝の変化を指標とする本発明のバイオマーカーを用いれば、個人個人の代謝のばらつきに対して疲労の評価能力を特段に改善し、さらにより適した治療方針を提供することが可能となる。
　〔３〕本発明のバイオマーカーの利用
　本発明は、上述したバイオマーカーに基づいた、疲労を評価するための方法、キットおよびシステムを提供する。
　〔３－１〕疲労評価方法
　本発明に係る疲労を評価する方法は、被験者から得た生体サンプル中の上記した本発明のバイオマーカーの値を得る工程（バイオマーカー値取得工程）と、当該バイオマーカーの値を用いて評価を行う工程（評価工程）とを含んでいる。
　バイオマーカー値取得工程は、バイオマーカーの種類に応じて適宜実施することができる。バイオマーカー値取得工程を実行するに際し、生体サンプル中の代謝物質の濃度を測定する必要がある。生体サンプル中の代謝物質の濃度の測定は、実施例の方法によらずとも、代謝物質の種類に応じた適切な方法で行うことができる。一例として、代謝物質を基質とする酵素反応がよく知られている場合は、酵素反応を利用して基質濃度を測定する市販のキットを用いてもよい。すなわち、当業者は、このような種々の技術を任意に利用して、生体サンプル中の代謝物質の濃度測定を首尾よく行い得る。なお、代謝物質の濃度の測定対象となる生体サンプルは、当該生体サンプルに含まれている、アルギニンの分解反応に関わる酵素の活性を抑制する処理を受けていることが好ましい場合があり、特に、アルギニン、オルニチンまたはシトルリン等が関連するバイオマーカーを使う場合は、測定の精度をより向上させる目的で好ましい場合がある。なお、ここで、処理によってアルギニンの分解反応に関わる酵素の活性を抑制するとは、処理後の生体サンプルの方が処理前の生体サンプルよりも当該酵素の活性が抑制されていることを意図する。係る処理の一例としては、生体サンプル（例えば、血液または血液調製物）に対して、アルギニンの分解反応に関わる酵素であるアルギナーゼ及び／または一酸化窒素合成酵素の阻害剤を添加することが挙げられる。なお、阻害剤の種類は特に限定されず、具体的な例示は、疲労評価キットに関する〔３－２〕欄で説明する。
　評価工程は、評価を行う手法に応じて適宜実施することができ、例えば、バイオマーカーの値を所定の閾値（基準値）と比較して評価をするか、バイオマーカーの値を閾値（基準値）と比較せずに評価をすることもできる。例えば、判別分析、Partial Least Square、またはSupport Vector Machine等の分析を行うことによって、バイオマーカーの種類によっては、閾値（基準値）を用いることなく、疲労の評価（診断または判定）をすることができる。なお、閾値を用いる場合において、当該閾値は予め規定された値であっても、被験者からのサンプリングと同時に健常者のサンプリングを行い、健常者において得られた生体サンプル中の各代謝物質の濃度に基づいて算出された値であってもよい。所定の閾値の一例は、複数の健常者におけるバイオマーカーの値の平均値や、二項分布等から得られる最頻値である。
　なお、評価工程においては、特に限定されないが、例えば、１）被験者が疲労であるか否かの評価、２）被験者が慢性疲労症候群ではない慢性疲労であるか否かの評価、３）被験者が慢性疲労症候群であるか否かの評価、４）これら１）～３）より選択される少なくとも２つの評価の組み合わせ（例えば、被験者が慢性疲労症候群ではない慢性疲労であるか慢性疲労症候群であるかの評価、等）、５）疲労の程度の評価、等の評価が行われる。
　本発明に係る疲労を評価する方法の具体的な一例では、被験者から得た生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を得る工程（１）、が包含される。さらに、必要に応じて、上記工程（１）の後に、上記ＯＣ比率に対応する閾値と当該ＯＣ比率とを比較する工程（２）が包含される。さらに、必要に応じて、上記工程（１）または工程（２）が行われることを前提として、同じ被験者から得た上記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程（３）が包含される。さらに、必要に応じて、上記工程（３）の後に、上記ＰＩ比率に対応する閾値と当該ＰＩ比率とを比較する工程（４）が包含される。なお、上記被験者から得た上記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程（３）と、当該比率（ＰＩ比率）に対応する閾値と当該比率（ＰＩ比率）とを比較する工程（４）とを行って疲労の評価がなされた被験者に対して、上記ＯＣ比率に対応する閾値と当該ＯＣ比率とを比較する工程（２）を行うことが、高い正判別率と低い誤判別率とを得る上で好ましい場合がある。例えば、図９および図１０に示す決定木による評価も参照される。図９および図１０では、ＰＩ比率としてピルビン酸濃度／イソクエン酸濃度を用いて決定木分析を行って２群に分けた被験者に対して、さらに、ＯＣ比率としてオルニチン濃度／シトルリン濃度を用いて決定木分析を行うことが示されている。また、同様の効果を得る観点から、上記ＯＣ比率を得る工程（１）と、当該ＯＣ比率に対応する閾値と当該ＯＣ比率とを比較する工程（２）とを行って疲労の評価がなされた被験者に対して、上記ＰＩ比率に対応する閾値と当該ＰＩ比率とを比較する工程（４）を行うことが好ましい場合がある。
　なお、バイオマーカー値取得工程に先立って、サンプル取得の第一段階として組織または細胞をヒト被験体から直接取り出す工程は、医師によって行われる。また、上記評価工程によって得られた結果を用いて、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）であるか否かの診断を医師が下す工程も必要に応じて行われる。これらの工程は、上記バイオマーカー値取得工程と上記評価工程とには含まれない別の工程として区別される。
　〔３－２〕疲労評価キット
　上述したような疲労評価方法を実施するために用いられる試薬を併せ持つキットもまた、本発明の範囲内である。すなわち、本発明にかかるキットは、疲労を評価するために、本発明のバイオマーカーの値を取得する上で必要な、生体サンプル中の代謝物質の濃度を測定するための試薬を備えている。一例として、オルニチンをバイオマーカーとする場合は、本発明にかかるキットは、生体サンプル中のオルニチン濃度を測定するための試薬を備えている。他の例として、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率をバイオマーカーとする場合は、本発明にかかるキットは、生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度とを測定するための試薬を備えている。オルニチン濃度を測定するための試薬としては例えばオルニチンと反応してアンモニアを発生するornithine cyclaseが挙げられ、シトルリン濃度を測定するための試薬としては例えばシトルリンと反応してATPを消費するargininosuccinate synthaseが挙げられる。キットはまた、生体サンプルに含まれている、アルギニンの分解反応に関わる酵素の活性の阻害剤を含んでいることが好ましい場合があり、特に、アルギニン、オルニチンまたはシトルリン等の濃度を測定する場合は、測定の精度をより向上させる目的で好ましい場合がある。なお、ここで、アルギニンの分解反応に関わる酵素とは、アルギナーゼ、及び、アルギニンから一酸化窒素とシトルリンとを生成する反応に関わる一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）が挙げられ、これらはとりわけ血液または血液調製物等の生体サンプルに含まれる。なお、アルギナーゼの阻害剤としては、例えば、Ｎω-Hydroxy-nor-L-arginine（ｎｏｒ－ＮＯＨＡ）又はその塩（例えば、二酢酸塩等）が挙げられ、一酸化窒素合成酵素の阻害剤としては、例えば、NG-Nitro-L-Arginine(Ｌ－ＮＮＡ)又はその塩が挙げられる。なお、これらの阻害剤は、キットの他の構成とは別体として備えられていてもよいが、例えば、生体サンプルを保存する容器内に必要量が予め仕込まれていてもよい。
　また、本発明のバイオマーカーを、目視にて検出する構成を有するキットもまた、本発明の範囲内である。すなわち、本発明にかかる第２のキットは、疲労を評価するために、本発明のバイオマーカーの値を示す呈示部を備えている。呈示部として例えば、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を示す第一呈示部、および、ピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を示す第二呈示部の少なくとも一方を備えているキットも、本発明にかかるキットの範疇である。
　本明細書中において使用される場合、用語「キット」は、特定の材料を内包する容器（例えば、ボトル、プレート、チューブ、ディッシュなど）を備えた包装が意図されるが、組成物としての一物質中に材料を含有している形態もまた、用語「キット」に包含される。キットは、各材料を使用するための指示書を備えていることが好ましい。指示書にはさらに必要に応じて、バイオマーカーの値と比較して評価するための、所定の閾値（基準値）が表示されていてもよい。本明細書中においてキットの局面において使用される場合、「備えた（備えている）」は、キットを構成する個々の容器のいずれかの中に内包されている状態が意図される。また、本発明に係るキットは、複数の異なる組成物を１つに梱包した包装であり得、溶液形態の場合は容器中に内包されていてもよい。本発明に係るキットは、その複数の構成要素を同一の容器に混合して備えていても別々の容器に備えていてもよい。「指示書」は、紙またはその他の媒体に書かれていても印刷されていてもよく、あるいは磁気テープ、コンピューター読み取り可能ディスクまたはテープ、ＣＤ－ＲＯＭなどのような電子媒体に付されてもよい。本発明に係るキットはまた、希釈剤、溶媒、洗浄液またはその他の試薬を内包した容器を備え得る。さらに、本発明に係るキットは、生体サンプルを採取するために必要な器具および試薬を備えていてもよい。また、本発明に係るキットは、生体サンプルから目的の調製物を調製するために必要な器具および試薬を備えていてもよい。
　上記構成を有することによって、本発明にかかるキットは、実際の医療現場にて簡便に使用することができるので、疲労をより速く、安く、客観的な診断を提供し得る。
　なお、本発明にかかるキットを用いれば、疲労を評価し、治療法を提案し得るだけでなく、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）の判断基準を提供することができるので、疲労の状態であるか否かの診断が容易になる。すなわち、本発明にかかるキットは、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）の診断基準または判定基準を提供するためのキット（例えば、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）を診断または判定するためのデータを取得するためのキット）でもあり得る。
　〔３－３〕疲労評価システム
　上述したような疲労評価方法を実行するために用いられるシステムもまた、本発明の範囲内である。下記実施形態では、本発明に係る疲労評価システムを構成する各部材が、「ＣＰＵなどの演算手段がＲＯＭやＲＡＭなどの記録媒体に格納されたプログラムコードを実行することによって実現される機能ブロックである」場合を例にして説明するが、同様の処理を行うハードウェアによって実現してもよい。また、処理の一部を行うハードウェアと、当該ハードウェアの制御や残余の処理を行うプログラムコードを実行する上記演算手段とを組み合わせて実現することもできる。さらに、上記各部材のうち、ハードウェアとして説明した部材であっても、処理の一部を行うハードウェアと、当該ハードウェアの制御や残余の処理を行うプログラムコードを実行する上記演算手段とを組み合わせて実現することもできる。なお、上記演算手段は、単体であってもよいし、装置内部のバスや種々の通信路を介して接続された複数の演算手段が共同してプログラムコードを実行してもよい。
　本発明にかかる疲労評価システムは、その機能ブロックとして、入力受付部１１Ａ、格納部１２、ＣＰＵ１３、および表示部１４を少なくとも備えている。入力受付部１１Ａは、測定部１１での測定結果の入力を受付けるインターフェースであり、測定部１１と疲労評価システムとを接続するインターフェースとして構成されるか、場合によってはキーボードやマウスなどの入力装置として構成される。測定部１１は、本発明のバイオマーカーに関連した代謝物質（例えば、オルニチンやシトルリン）の濃度を測定する測定装置の機能を有している。格納部１２は、当該代謝物質の濃度の測定値を受容する測定値受容部１２ａ、および疲労を評価するための基準値（閾値）を格納した基準値格納部１２ｂとしての機能を有している（例えば、メモリーとして構成される）。ＣＰＵ１３は、疲労を評価するための情報を生成する演算部１３ａ、および演算部１３ａからの評価情報を受け取って疲労を評価する評価部１３ｂとしての機能を有している。表示部１４は、評価部１３ｂによる評価結果を表示する評価結果表示部１４としての機能を有している（例えば、液晶表示装置として構成される）。なお、この機能ブロックは、ＣＰＵ１３が格納部１２に格納されたプログラムを実行し、入出力回路などの周辺回路を制御することによって実現される。
　以下、疲労評価システムの一態様として、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）をバイオマーカーの一つとして疲労を評価するシステムにつき具体的に説明する。このシステムでは、ステップ１として、測定部１１において、生体サンプルにおけるオルニチン濃度とシトルリン濃度とを測定する。次いで、ステップ２として、ステップ１で測定したオルニチン濃度とシトルリン濃度とを、入力受付部１１Ａを介して、測定値受容部１２ａが受容する（格納する）。次いで、ステップ３として、演算部１３ａが、測定値受容部１２ａに格納されたオルニチン濃度とシトルリン濃度とを読みだして、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を算出する。必要に応じてＯＣ比率は格納部１２に格納される。次いで、ステップ４として、演算部１３ａが、前記算出したＯＣ比率と、基準値格納部１２ｂに格納された基準値とから、疲労を評価するための評価情報を生成する。次いで、ステップ５として、ステップ４で生成した評価情報に基づいて、評価部１３ｂが疲労を評価する。次いで、ステップ６として、評価部１３ｂが生成した疲労の評価結果が、表示部１４に表示される。なお、ステップ２として、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を、入力受付部１１Ａを介して、測定値受容部１２ａが受容してもよい。この場合は、上記ステップ３～４に代えて、演算部１３ａが、測定値受容部１２ａに格納されたＯＣ比率を読み出して、当該ＯＣ比率と、基準値格納部１２ｂに格納された基準値とから、疲労を評価するための評価情報を生成する。ステップ５は上述の通りである。なお、評価情報の生成から疲労の評価までのステップは、例えば、格納部１２内に格納されている評価用のプログラム（例えば、決定木解析プログラム等）を動作させることにより実行可能である。例えば、図９や図１０に示す結果を得る場合には、ＯＣ比率と同様にして、被験者の生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）、および、被験者の生体サンプル中のアラニン濃度とヒドロキシプロリン濃度との比率を、疲労評価システム内（例えば、格納部１２）に格納した上で、評価用のプログラムを動作させればよい。
　なお、本発明にかかるシステムを用いれば、疲労を評価し、治療法を提案し得るだけでなく、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）の判断基準を提供することができるので、疲労の状態であるか否かの診断が容易になる。すなわち、本発明にかかるシステムは、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）の診断基準または判定基準を提供するためのシステム（例えば、疲労（慢性疲労、慢性疲労症候群を含む。）を診断または判定するためのデータを取得するためのシステム）でもあり得る。
　〔４〕本発明の一態様
　本発明の一態様には、例えば、以下のような発明も含まれる。
（１）被験者から得た生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を得る工程と、前記比率（ＯＣ比率）に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含する、疲労を評価する方法。
（２）前記比率（ＯＣ比率）に対応する閾値と前記比率（ＯＣ比率）とを比較する工程を包含する、（１）に記載の方法。
（３）さらに、前記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程と、前記比率（ＰＩ比率）に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含する、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記比率（ＰＩ比率）に対応する閾値と前記比率（ＰＩ比率）とを比較する工程を包含する、（３）に記載の方法。
（５）前記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程と、前記比率（ＰＩ比率）に対応する閾値と前記比率（ＰＩ比率）とを比較する工程とを行って疲労の状態の評価がなされた被験者に対して、前記比率（ＯＣ比率）に対応する閾値と前記比率（ＯＣ比率）とを比較する前記工程を行う、（２）に記載の方法。
（６）オルニチン濃度を測定するための試薬とシトルリン濃度を測定するための試薬とを備えている、疲労を評価するためのキット。
（７）オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を示す第一呈示部を備えている、（６）に記載のキット。
（８）ピルビン酸濃度を測定するための試薬とイソクエン酸濃度を測定するための試薬とをさらに備えている、（６）又は（７）に記載のキット。
（９）ピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を示す第二呈示部を備えている、（８）に記載のキット。
（１０）疲労を評価するための基準値と、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）とを受け取って、疲労を評価するための評価情報を生成する演算部、および、前記評価情報を受け取って、疲労を評価する評価部を備えた疲労評価システム。
（１１）１）オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）の入力を受付ける入力受付部を備えるか、２）オルニチン濃度およびシトルリン濃度の測定値の入力を受付ける入力受付部を備え、前記演算部が、入力が受付けられた測定値からオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を算出する、（１０）に記載の疲労評価システム。
（１２）オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）に代えて、前記生体サンプル中のオルニチン濃度と、Urea、Urate、4-hydroxy-3-methoxybenzoate、Hydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、Gamma-butyrobetaineから選択される何れかの濃度との比率を用いる、（１）から（５）の何れかに記載の方法。
（１３）疲労を評価する方法であって、被験者から得た生体サンプル中のバイオマーカーの値を得る工程と、前記バイオマーカーの値に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含し、前記バイオマーカーの値が、１）2-アミノ酪酸（2AB）、２－オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）、３－ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyrate）、３－メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、４-ヒドロキシ－３－メトキシベンゾエート（4-Hydroxy-3-methoxybenzoate）、４－メチル－２－オキソペンタノエート（4-methyl-2-oxopentanoate）、５-オキソプロリン（5-Oxoproline）、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、アゼライン酸（Azelate）、ベータアラニン（beta-Ala）、ベタイン（Betaine）、カルニチン（Carnitine）、コリン（Choline）、シトルリン（Citrulline）、クレアチン（Creatine）、クレアチニン（Creatinine）、シスチン（Cystine）、ガンマブチロベタイン（Gamma-Butyrobetaine）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、ムケート（Mucate）、N,N-ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、オルニチン（Ornithine）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、尿素（Urea）、ピルビン酸（Pyruvate）、サルコシン（Sarcosine）、セリン（Ser）、タウリン（Taurine）、トレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、尿酸（Urate）、及び、バリン（Val）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度であるか、２）前記群にシス－アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、リンゴ酸（Malate）、及びコハク酸（Succinate）を加えた群より選択される複数種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率または差分である、疲労を評価する方法。
（１４）（１３）に記載の、疲労を評価する方法であって、さらに、シス－アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、リンゴ酸（Malate）、及び、コハク酸（Succinate）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度を、前記バイオマーカーの値として用いる、疲労を評価する方法。
（１５）（１３）又は（１４）に記載の、疲労を評価する方法であって、前記バイオマーカーの値が、１）シトルリン（Citrulline）、イソクエン酸（Isocitrate）、ピルビン酸（Pyruvate）、及び、オルニチン（Ornithine）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度であるか、２）シトルリン、イソクエン酸、ピルビン酸、及び、オルニチンからなる群より選択される複数種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率または差分である、疲労を評価する方法。
（１６）上記生体サンプルは、アルギニンの分解反応に関わるアルギナーゼの活性及び／または一酸化窒素合成酵素の活性を抑制する処理を受けている、（１）～（５）、（１２）～（１５）の何れかに記載の方法。
（１７）アルギニンの分解反応に関わるアルギナーゼまたは一酸化窒素合成酵素の阻害剤を含んでいる、（６）に記載のキット。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　〔１．ヒトでの評価〕
　試験１では、健常者２０名（男性１０名、女性１０名；平均年齢＝３６．１０歳；大阪市立大学附属病院から提供）、慢性疲労症候群２０名（男性１０名、女性１０名；平均年齢＝３６．１５歳；大阪市立大学附属病院から提供）を対象とした。また、試験２では健常者４６名（男性５名、女性４１名；平均年齢＝３８．７８歳；大阪市立大学附属病院から提供）、慢性疲労症候群４７名（男性６名、女性４１名；平均年齢＝３７．９６歳；大阪市立大学附属病院から提供）、慢性疲労１３名（男性５名、女性８名；平均年齢＝３３．６２歳；大阪市立大学附属病院から提供）を対象とした。
　試験１・２における慢性疲労症候群とは、アメリカ疾病予防管理センター（ＣＤＣ）によって作成された慢性疲労症候群診断基準（Ann Intern Med. 1994;121:953-959）を日本国内用に改定したもの（医学のあゆみ 特集「最新・疲労の科学 －日本発：抗疲労・抗過労への提言」６７１－６７７）に記されているように「（１）生活が著しく損なわれるような強い疲労を主症状とし、少なくとも６ヵ月以上の期間持続または再発を繰り返す（５０％以上の期間認められること）。かつ、病歴、身体所見、検査所見で疾患を除外する。さらに、（２）症状基準８項目以上か、症状基準６項目・身体基準２項目以上を満たす。」といった診断基準に従って病気と診断された者である。試験２における慢性疲労とは、医師による上記の慢性疲労症候群の診断は満たさないが、６カ月以上断続的に疲労あるいは疲労感が見られ、来院した者である。また、試験１・２における健常者とは、年代、疲労度、精神疾患の有無、睡眠障害の有無、精神疾患や睡眠障害の治療薬の服用の有無等を考慮して募集をした（健常者リクルート）者である。
　試験１，２ともに、健常者（ＨＣ）、そして慢性疲労症候群（ＣＦＳ: Chronic Fatigue Syndrome）および慢性疲労（ＣF: Chronic Fatigue）の患者から採取した血液から血漿サンプルを調製した。前処理した血漿サンプル中の代謝物質の測定を、慶応義塾大学先端生命科学研究所に依頼した。血漿中の代謝物の測定には、キャピラリー電気泳動－質量分析器が用いられた。一方、血糖値の測定には、Glucose analysis kit II（Biovision）を用いた。統計解析には、SPSS 17.0およびAmos 18.0を用いた有意差検定、相関解析、およびパス解析を採用した。
　試験１および試験２を加えた集団で評価した結果、本願発明者らが国際公開ＷＯ２０１１／１６１５４４ Ａ２（米国特許シリアル番号１３／８０５，４４９）で報告の通り、健常者と慢性疲労症候群患者との間でのエネルギー産生系代謝物の変化の再現性が確認された。さらに、他の代謝経路を含めた解析を詳細に行ったところ、尿素回路関連代謝物を中心に試験１・試験２を通してきわめて再現よく変化している代謝系から、新たなバイオマーカーを見出し、既に見出したバイオマーカーとの組合せによる、より高精度の疲労診断の可能性を見出した。
　すなわち、慢性疲労症候群患者群において、オルニチン（Ornithine）の血中レベルが上昇する一方、シトルリン（Citrulline）や尿素（Urea）のレベルが低下していた(図１)。
　試験１および試験２を加えた集団に対して、血漿サンプル中の代謝物質の測定値を解析ソフトＲ（フリーソフト、バージョン3.0.1）を用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した。また、同じランダムフォレストプログラムの実行を、試験２の集団に対して行った。Random Forestは識別、回帰、クラスタリングに用いられるアルゴリズムである。
　図２に示すように、健常者と慢性疲労症候群患者とを分類する際に、複数の測定項目の中で、Isocitrate、SuccinateおよびCis-Aconitate等のＴＣＡ回路関連代謝物に交じってこれらの尿素回路関連代謝物が上位に出現した。試験２のみを対象にした同解析においても尿素回路関連代謝物が上位に出現した（図３）。Ornithine、Citrulline、Urea以外にもUrateあるいは4-hydroxy-3-methoxybenzoateやHydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、Gamma-butyrobetaineも上位に出現した。また、こうした代謝物は健常者群と慢性疲労症候群の二群比較において有意に増加あるいは減少していた(図４)。
　この結果から、被験者の個人のばらつきに対して比較的安定している尿素回路関連代謝物を単独で用いるか、或いは、エネルギー代謝系（解糖系からＴＣＡ回路）のバイオマーカーと組み合わせることにより、慢性疲労患者群や健常者の個人差による判別の安定性が向上することが予想された。
　一方、慢性疲労の患者群でも尿素回路関連代謝物に同様の変化が見られたが(図５)、これらの比であるCitrulline/Ornithine、あるいはUrea/Ornithineの値を用いて評価したところ、慢性疲労症候群患者に比べて慢性疲労患者ではその低下の程度が小さかった。なお、ureaとAspartateに関しては試験２のみで検出できた。さらに、慢性疲労症候群患者群では見出されなかったいくつかの代謝物に関して、健常者群と比較して有意に減少あるいは増加しているものが見出された(図６)。なお、図１６は、試験２の集団に対して、健常者（ＨＣ）および慢性疲労（ＣＦ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した結果を示す図である。図１７は、試験２の集団に対して、慢性疲労（ＣＦ）および慢性疲労症候群（ＣＦＳ）の患者の血漿サンプル中の代謝物質の測定値を含めた全てのパラメータを用いてランダムフォレスト（Random Forest）プログラムを実行した結果を示す図である。
　次いで、試験１と試験２のすべてのデータを対象に、疲労の有無に対応して血漿中の量が有意に変動した代謝物質と、パフォーマンス・ステイタス（ＰＳ）との相関を調べた。ＰＳは、疲労の主観的重症度の尺度であり、数値が高いほど重症であることを示す。その結果、代謝物質のうちのいくつかが、ＰＳと有意な相関を示すことがわかった（Proline; R=0.323, P=0.027: Urateあるいは4-hydroxy-3-methoxybenzoate; R=-0.334, P=0.022）。
　また、試験１と試験２のすべての血漿サンプル中の代謝物質の測定値を対象に解析ソフトＲを用いて決定木モデルによる解析を実行した。このプログラムは、決定理論の分野において、計画を立案して目標に到達するために用いられる。例えば図７のように４ツリーへ分類した場合、Isocitrateが８．１５μＭ以上か未満か、さらにOrnithineが６２μＭ 以上か未満か、Hydroxyprolineが９．３μＭ以上か未満かで分類することで、慢性疲労症候群の患者群と健常者群の集団から、慢性疲労症候群の患者を７９．０％の正判別率（ＣＦＳ６２名中４９名）で判別できることになる。この場合、誤判別率は１８．５％（ＨＣ６５名中１２名）であった。さらに分類ツリーの数を増やして９ツリーに分類した場合、図８にあるようにSuccinateが１２．５μＭ以上か未満か、Glutamine（Ｇｌｎ）が１０６９μＭ以上か未満か、Glutamate（Ｇｌｕ）が５０μＭ以上か未満か、Leucine（Ｌｅｕ）が９５μＭ以上か未満か、Lysine（Ｌｙｓ）が１８１．５μＭ以上か未満かで分類することで慢性疲労症候群の患者群と健常者群の集団から、慢性疲労症候群の患者を９０．３％の正判別率（ＣＦＳ６２名中５６名）で判別可能である。この場合、誤判別率は７．７％（ＨＣ６５名中５名）であった。さらに、代謝物の比を用いることで、より少ないツリー数でも正判別率を上昇させ、かつ誤判別率を低下させることができる。例えば、図９のように、Pyruvate/Isocitrate（ＰＩ比率）が２０．６１以上か未満か、Ornithine/Citrulline（ＯＣ比率）が３．２１５以上か未満かの３ツリーへの分類だけで８０．６％の正判別率（ＣＦＳ６２名中５０名）、２０．０％の誤判別率（ＨＣ６５名中１３名）で慢性疲労症候群の患者を判別することが可能となる。さらに、Ornithine/Citrullineが１．３２１以上か未満か、Alanine/Hydroxyprolineが３７．７１以上か未満かを加えることで、８０．６％の正判別率は維持されつつ、誤判別率が１０．７％（（ＨＣ６５名中７名）まで低下する(図１０)。ただし、上記の決定木上の分岐を決める数値は、測定条件や目的によって変わるものであり、固定された数値ではない。こうした決定木分析は診断アルゴリズムとして用いることも可能である。
　一方、慢性疲労症候群と慢性疲労との間で、代謝における差があるかを直接比較して検討した。その結果、図１１に示すように、尿素回路関連代謝物、および尿素回路からＴＣＡ回路への代謝の流れに関わる代謝物、例えばArginineやSuccinate、Glutamine等で有意な差を示した。こうした代謝物は上記のような診断のための決定木分析を行う上で有用である。
　〔２．ヒトでの評価を受けたラットでの評価〕
　本発明の一形態を用いれば、簡便なキットでの疲労診断が可能になる。さらに、本発明の一形態を用いた診断結果に基づいて、効果的な治療法を見出す可能性がある。例えば、強い疲労感や長期にわたる疲労感を訴える患者に対して、本発明の一形態を適用することによって、疲労度の客観的評価ができ、さらには慢性疲労症候群か否かの判別ができるだけでなく、代謝病態を把握することで、個人個人の疲労病態に合わせた治療・予防を実現する食薬成分の選択も可能となる。本発明による疲労度の評価は、疲労に関する高度な知識を必要としないので、一般の医療施設においても実施可能である。また、本発明の一形態を用いれば、生体内のエネルギー（ＡＴＰ）産生代謝系および尿素回路系のどの部分に異常があるかを推測することができるので、患者の生活指導に活かせるだけでなく、原因と考えられる代謝系を促進または抑制することで代謝病態を是正する食薬を提供することが可能となる。特に、上記ヒトの血液成分の解析結果のみならず、疲労モデル動物の血液や肝臓を対象とした網羅的代謝解析（図１２：グラフデータは肝臓検体の測定値を示す）から、尿素回路およびＴＣＡ回路の異常と、尿素回路からＴＣＡ回路への疲労病態特有の代謝の流れ込みを確認できている。すなわち、疲労病態においては、ＴＣＡ回路内のCitrate、cis-Aconitate、Isocitrateが有意に減少する一方、Succinate、Malateが有意に増加する。加えて、疲労病態では尿素回路におけるオルニチンが、Putrescine、ＧＡＢＡ、Succinateと順に代謝される系が優位となってＴＣＡ回路へ流れ込む。同時に、この代謝経路の促進には、尿素回路におけるオルニチンからシトルリンへの代謝が低下すること、および同回路のアルギニンからオルニチンへの代謝が増強されていることが関係している。
　疲労モデル動物の実験では、オス７週齢SD系ラット（日本SLC）を使用し、各動物は明暗周期12時間、室温23℃、湿度50%の条件にて飼育した。購入したラットは、無作為に無処理群（対照群）、食事制限群、および疲労群に群分けを行った。無処理群のラットは、エサおよび水分が十分に摂取できる環境にて５日間飼育した。疲労群のラットは、水深2.2 cmの水を張ったケージにて5日間飼育した。食事制限群のラットは、１日あたり10gのエサを与え、5日間飼育した。その後にラットを屠殺し、リン酸緩衝液を用いて血液灌流を行い、ラット肝臓を取得した。取得した肝臓試料の各代謝物は、キャピラリー電気泳動－質量分析計のカチオンモード、およびアニオンモードの両メソッドで測定を行い、約８５種類の代謝物を検出した。
　〔３．ＰＬＳ－ＤＡ法による解析〕
　ＰＬＳ－ＤＡ法（Partial least squares discriminant analysis;部分最少二乗法判別分析）は、回帰分析を用いた予測モデル構築に使用される手法である。本手法を用いて、ＨＣ（健常者）とＣＦＳ(慢性疲労症候群)、ＨＣとＣＦ（慢性疲労）、ＣＦとＣＦＳの判別を行った。ＰＬＳ－ＤＡ法による解析を行うためのソフトウェアとしては、R（フリーソフト、バージョン3.0.1）を用いた。
　＝ＨＣとＣＦＳの判別結果＝
　生体情報として、上述の試験２で、ＨＣ群、ＣＦＳ群の２群比較で統計的な有意差が認められたOrnithine、Citrulline、Urea、Hydroxyproline、Urate、4-Hydroxy-3-methoxybenzoate、Isocitrate、Citrate、Pyruvate、Cis-aconitate、Gamma-Butyrobetaine、4-methyl-2-oxopentanoate、2-oxoglutarateそれぞれの濃度、および、ランダムフォレスト解析の結果からマーカーとして有望なSuccinate、Pro、Leu、3-Methylhistidine、Creatinine、His、Ala、N,N-Dimethylglycine、Ser、Lys、Betaine、Glu、Taurine、2AB、Arg、3-Hydroxybutyrate、Creatine、Trp、Mucate、Cystine、Asp、Sarcosine、Thr、Valそれぞれの濃度を全て用いてＰＬＳ－ＤＡ解析を行った。その結果、図１８に示すように、ＰＬＳ－ＤＡスコアプロットにおいて、ＨＣとＣＦＳでは異なった分布を示した。また、統計的有意差が認められた代謝物質が、２群の判別に対する高い負荷量を示した。なお、図１８中のプロット一つはヒト一人に対応し、ＨＣは健常者、ＣＦＳは慢性疲労症候群の患者を指す。
　＝ＨＣとＣＦの判別結果＝
　生体情報として、上述の試験２で、ＨＣ群、ＣＦ群の２群比較で統計的な有意差が認められた、Choline、Gly、Taurine、Asn、Gamma-Butyrobetaine、Gln、Lys、Trp、4-methyl-2-oxopentanoate、Succinateそれぞれの濃度、および、ランダムフォレスト結果からマーカーとして有望なCis-Aconitate、Lactate、Arg、Mucate、His、Azelate、N,N-Dimethylglycine、Creatinine、beta-Ala、Tyr、Ornithine、2AB、Leu、Isocitrate、Hydroxyproline、Phe、Met、3-Methylhistidine、Sarcosine、Ile、Betaine、Pyruvate、Urate、4-Hydroxy-3-methoxybenzoate、Ser、Asp、Carnitine、Urea、5-oxoproline、Citrateそれぞれの濃度を全て用いてＰＬＳ－ＤＡ解析を行った。その結果、図１９に示すように、ＰＬＳ－ＤＡスコアプロットにおいて、ＨＣとＣＦでは異なった分布を示した。また、統計的有意差が認められた代謝物質が、２群の判別に高い負荷量を示した。なお、図１９中のプロット一つはヒト一人に対応し、ＨＣは健常者、ＣＦは慢性疲労の患者を指す。
　＝ＣＦとＣＦＳの判別結果＝
　生体情報として、上述の試験２で、ＣＦ群、ＣＦＳ群の２群比較で統計的な有意差が認められた、Choline、Succinate、Gln、Taurine、Asn、Lys、Arg、His、Urate、4-Hydroxy-3-methoxybenzoateそれぞれの濃度、および、ランダムフォレスト結果からマーカーとして有望なN,N-Dimethylglycine、3-Methylhistidine、Azelate、Ile、Trp、4-methyl-2-oxopentanoate、Ser、Cis-Aconitate、Met、Phe、Gly、Lactate、Ala、Leu、Citrulline、Malate、gamma-Butyrobetaine、Sarcosine、beta-Ala、Glu、2-Oxoglutarate、Pyruvate、Asp、Urea、Creatinine、Carnitine、2AB、Betaine、Citrate、Tyrそれぞれの濃度を全て用いてＰＬＳ－ＤＡ解析を行った。その結果、図２０に示すように、ＰＬＳ－ＤＡスコアプロットにおいて、ＣＦとＣＦＳでは異なった分布を示した。また、統計的有意差が認められた代謝物質が、２群の判別に高い負荷量を示した。なお、図２０中のプロット一つはヒト一人に対応し、ＣＦは慢性疲労の患者、ＣＦＳは慢性疲労症候群の患者を指す。
 
　図１８～図２０の結果より、検出される生体情報を用いてＨＣ、ＣＦ、ＣＦＳの生理・病態を定性的に捉えることが可能であり、疲労を評価・診断する上で有用であることが示された。
　〔４．アルギニンの分解が与える影響の評価〕
　採血後全血のまま、どのくらいの時間、室温で放置すると、バイオマーカーの値に変化が現れるかを１０名の健常者の血液（全血）を利用して検討した。その結果、採血後の血液の放置時間が長くなると、オルニチン値が上昇し、かつアルギニン値が低下することが判明した（図１４）。一方、クエン酸のように、放置をしても濃度変化を示さない代謝物もあった（図示せず）。血液中には、アルギニンからオルニチンへの反応を進めるアルギナーゼという酵素、及び、アルギニンから一酸化窒素とシトルリンとを生成する反応に関わる一酸化窒素合成酵素（ＮＯＳ）が含まれており、採血後も試験管の中で酵素反応が進行していることが示唆された。
　そこで、ラットの血液（全血）を使用して、採血した血液を入れる試験管の中にアルギナーゼ又は一酸化窒素合成酵素の阻害剤を入れることで、オルニチンやアルギニンの濃度変化が抑えられるかを検討した。アルギナーゼ阻害剤であるＮω-Hydroxy-nor-L-arginine（nor-NOHA）と一酸化窒素合成酵素阻害剤であるNG-Nitro-L-Arginine（L-NNA）とを用いて阻害実験を試み、LC-MSシステムを用いてアルギニン及びオルニチンの定量解析を行った。なお、nor-NOHAは一酸化窒素合成酵素の活性は実質的に阻害せず、L-NNAはアルギナーゼの活性は実質的に阻害しない。
　その結果、図１５に示すように、採血後にラットの血液を室温放置すると、アルギニン値、及びオルニチン値がともに高くなることが判明した。次に、nor-NOHA、あるいはnor-NOHA、L-NNA両方を採血後すぐに添加することにより、アルギニン値やオルニチン値の上昇を抑えられることが分かった。なお、図１５において、左側はアルギニン濃度の測定結果を示し、右側はオルニチン濃度の測定結果を示す。図１５において、左側から順に、０ｈは採血直後の状態を、２ｈは採血後、阻害剤を添加せずに室温で２時間放置した状態を、５ｈは採血後、阻害剤を添加せずに室温で５時間放置した状態を示し、１００μＭ　nor-NOHA（５ｈ）は、終濃度で１００μＭ　nor-NOHAを添加し、室温で５時間放置した状態を、１００μＭ　nor-NOHA＋１００μＭ　L-NNA（５ｈ）は、終濃度で１００μＭのnor-NOHAとL-NNAとを添加し、室温で５時間放置した状態を、３００μＭ　nor-NOHA（５ｈ）は、終濃度で３００μＭ　nor-NOHAを添加し、室温で５時間放置した状態を、３００μＭ　nor-NOHA＋１００μＭ　L-NNA（５ｈ）は、終濃度で３００μＭのnor-NOHAと１００μＭのL-NNAとを添加し、室温で５時間放置した状態を、それぞれ示す。
　採血後に直ちに血液試料を冷却処理することが不可能なケースを想定して、疲労診断のための血液採取用試験管に、こうした阻害剤を前もって添加しておくことで、バイオマーカー値の変化を防ぎ、検査の精度をより一層向上させうる。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　また、本明細書中で言及した全ての文献は、本明細書の一部を構成するものとして参照によって本明細書中に組み込まれる。
　本発明を用いれば、疲労の評価および診断を客観的かつ簡便に行うことが可能となる。本発明はさらに、疲労の治療に有用な技術を提供し得る。疲労は、非常に重大な健康問題であるので、疲労の評価、診断および治療が実現することは、あらゆる産業にわたって大いに貢献する。

Claims (17)

  1. 　被験者から得た生体サンプル中のオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を得る工程と、前記比率（ＯＣ比率）に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含する、疲労を評価する方法。
  2. 　前記比率（ＯＣ比率）に対応する閾値と前記比率（ＯＣ比率）とを比較する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
  3. 　さらに、前記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程と、前記比率（ＰＩ比率）に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記比率（ＰＩ比率）に対応する閾値と前記比率（ＰＩ比率）とを比較する工程を包含する、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記生体サンプル中のピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を得る工程と、前記比率（ＰＩ比率）に対応する閾値と前記比率（ＰＩ比率）とを比較する工程とを行って疲労の状態の評価がなされた被験者に対して、前記比率（ＯＣ比率）に対応する閾値と前記比率（ＯＣ比率）とを比較する前記工程を行う、請求項２に記載の方法。
  6. 　オルニチン濃度を測定するための試薬とシトルリン濃度を測定するための試薬とを備えている、疲労を評価するためのキット。
  7. 　オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を示す第一呈示部を備えている、請求項６に記載のキット。
  8. 　ピルビン酸濃度を測定するための試薬とイソクエン酸濃度を測定するための試薬とをさらに備えている、請求項６又は７に記載のキット。
  9. 　ピルビン酸濃度とイソクエン酸濃度との比率（ＰＩ比率）を示す第二呈示部を備えている、請求項８に記載のキット。
  10. 　疲労を評価するための基準値と、オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）とを受け取って、疲労を評価するための評価情報を生成する演算部、および
    　前記評価情報を受け取って、疲労を評価する評価部
    を備えた疲労評価システム。
  11. １）オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）の入力を受付ける入力受付部を備えるか、
    ２）オルニチン濃度およびシトルリン濃度の測定値の入力を受付ける入力受付部を備え、前記演算部が、入力が受付けられた測定値からオルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）を算出する、
    請求項１０に記載の疲労評価システム。
  12. 　オルニチン濃度とシトルリン濃度との比率（ＯＣ比率）に代えて、前記生体サンプル中のオルニチン濃度と、Urea、Urate、4-hydroxy-3-methoxybenzoate、Hydroxyproline、4-Methyl-2-oxopentanoate、Gamma-butyrobetaineから選択される何れかの濃度との比率を用いる、請求項１から５の何れか一項に記載の方法。
  13. 　疲労を評価する方法であって、
    　被験者から得た生体サンプル中のバイオマーカーの値を得る工程と、前記バイオマーカーの値に基づいて、前記被験者における疲労の状態を評価する工程とを包含し、
    　前記バイオマーカーの値が、１）2-アミノ酪酸（2AB）、２－オキソグルタル酸（2-oxoglutarate）、３－ヒドロキシ酪酸（3-Hydroxybutyrate）、３－メチルヒスチジン（3-Methylhistidine）、４-ヒドロキシ－３－メトキシベンゾエート（4-Hydroxy-3-methoxybenzoate）、４－メチル－２－オキソペンタノエート（4-methyl-2-oxopentanoate）、５-オキソプロリン（5-Oxoproline）、アラニン（Ala）、アルギニン（Arg）、アスパラギン（Asn）、アスパラギン酸（Asp）、アゼライン酸（Azelate）、ベータアラニン（beta-Ala）、ベタイン（Betaine）、カルニチン（Carnitine）、コリン（Choline）、シトルリン（Citrulline）、クレアチン（Creatine）、クレアチニン（Creatinine）、シスチン（Cystine）、ガンマブチロベタイン（Gamma-Butyrobetaine）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、グリシン（Gly）、ヒスチジン（His）、ヒドロキシプロリン（Hydroxyproline）、イソロイシン（Ile）、ロイシン（Leu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、ムケート（Mucate）、N,N-ジメチルグリシン（N,N-Dimethylglycine）、オルニチン（Ornithine）、フェニルアラニン（Phe）、プロリン（Pro）、尿素（Urea）、ピルビン酸（Pyruvate）、サルコシン（Sarcosine）、セリン（Ser）、タウリン（Taurine）、トレオニン（Thr）、トリプトファン（Trp）、チロシン（Tyr）、尿酸（Urate）、及び、バリン（Val）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度であるか、２）前記群にシス－アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、リンゴ酸（Malate）、及びコハク酸（Succinate）を加えた群より選択される複数種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率または差分である、
    疲労を評価する方法。
  14. 　請求項１３に記載の、疲労を評価する方法であって、
    　さらに、シス－アコニット酸（Cis-aconitate）、クエン酸（Citrate）、イソクエン酸（Isocitrate）、乳酸（Lactate）、リンゴ酸（Malate）、及び、コハク酸（Succinate）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度を、前記バイオマーカーの値として用いる、
    疲労を評価する方法。
  15. 　請求項１３又は１４に記載の、疲労を評価する方法であって、
    　前記バイオマーカーの値が、１）シトルリン（Citrulline）、イソクエン酸（Isocitrate）、ピルビン酸（Pyruvate）、及び、オルニチン（Ornithine）からなる群より選択される少なくとも一種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度であるか、２）シトルリン、イソクエン酸、ピルビン酸、及び、オルニチンからなる群より選択される複数種のバイオマーカーの生体サンプル中の濃度の比率または差分である、
    疲労を評価する方法。
  16. 　上記生体サンプルは、アルギニンの分解反応に関わるアルギナーゼの活性及び／または一酸化窒素合成酵素の活性を抑制する処理を受けている、請求項１～５、１２～１５の何れか一項に記載の方法。
  17. 　アルギニンの分解反応に関わるアルギナーゼまたは一酸化窒素合成酵素の阻害剤を含んでいる、請求項６に記載のキット。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015159942A (ja) * 2014-02-27 2015-09-07 花王株式会社 疲労の評価方法
EP3376229A4 (en) * 2015-11-12 2019-08-28 Kyushu University National University Corporation BIOMARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF DEPRESSIONS AND THE USE OF THE BIOMARKER
JP2020180897A (ja) * 2019-04-26 2020-11-05 株式会社東レリサーチセンター 疲労状態の検出を補助する方法
CN116626276A (zh) * 2023-07-14 2023-08-22 汤臣倍健股份有限公司 弹性稳态模型及其使用方法
CN116660421A (zh) * 2023-06-13 2023-08-29 中国民用航空总局第二研究所 基于柱色谱法的工业生产中健康人员脑疲劳程度划分方法
KR20240140257A (ko) * 2023-03-16 2024-09-24 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 소변 대사 산물을 이용한 유소년 운동 선수의 건강 상태 진단 방법

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010266238A (ja) * 2009-05-12 2010-11-25 Osaka City Univ 疲労度の判定方法および疲労度判定キット
JP2011161137A (ja) * 2010-02-15 2011-08-25 Hitachi Ltd 疲労度評価システムおよびそれを用いた企業内疲労度評価システム並びに疲労度評価方法
JP2011182661A (ja) * 2010-03-05 2011-09-22 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology 生理的疲労状態の評価方法および装置
JP2012024555A (ja) * 2010-06-24 2012-02-09 Institute Of Physical & Chemical Research 疲労のバイオマーカーおよびその利用
JP2013076692A (ja) * 2011-09-13 2013-04-25 Taisho Pharmaceutical Co Ltd リン脂質酸化体を用いた疲労の判定方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010266238A (ja) * 2009-05-12 2010-11-25 Osaka City Univ 疲労度の判定方法および疲労度判定キット
JP2011161137A (ja) * 2010-02-15 2011-08-25 Hitachi Ltd 疲労度評価システムおよびそれを用いた企業内疲労度評価システム並びに疲労度評価方法
JP2011182661A (ja) * 2010-03-05 2011-09-22 National Institute Of Advanced Industrial Science & Technology 生理的疲労状態の評価方法および装置
JP2012024555A (ja) * 2010-06-24 2012-02-09 Institute Of Physical & Chemical Research 疲労のバイオマーカーおよびその利用
JP2013076692A (ja) * 2011-09-13 2013-04-25 Taisho Pharmaceutical Co Ltd リン脂質酸化体を用いた疲労の判定方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SATOSHI KUME ET AL.: "Study on pathophysiology of fatigue and development of biomarkers for diagnosis of chronic fatigue syndrome by metabolome analysis", JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE, vol. 249, no. 4, 26 April 2014 (2014-04-26), pages 299 - 303 *
SATOSHI KUME ET AL.: "Suishin Hiro Fuka Model Dobutsu ni Okeru TCA Kairo Oyobi Nyoso Kairo Nai Taishabutsu Level no Henka", NIPPON HIRO GAKKAISHI, vol. 9, no. 1, 7 June 2013 (2013-06-07), pages 86 *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015159942A (ja) * 2014-02-27 2015-09-07 花王株式会社 疲労の評価方法
EP3376229A4 (en) * 2015-11-12 2019-08-28 Kyushu University National University Corporation BIOMARKERS FOR THE DIAGNOSIS OF DEPRESSIONS AND THE USE OF THE BIOMARKER
EP3677914A1 (en) * 2015-11-12 2020-07-08 Kyushu University National University Corporation Biomarker for diagnosing depression and use of biomarker
JP2020180897A (ja) * 2019-04-26 2020-11-05 株式会社東レリサーチセンター 疲労状態の検出を補助する方法
JP7360807B2 (ja) 2019-04-26 2023-10-13 株式会社東レリサーチセンター 疲労状態の検出を補助する方法
KR20240140257A (ko) * 2023-03-16 2024-09-24 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 소변 대사 산물을 이용한 유소년 운동 선수의 건강 상태 진단 방법
KR102829879B1 (ko) 2023-03-16 2025-07-04 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 소변 대사 산물을 이용한 유소년 운동 선수의 건강 상태 진단 방법
CN116660421A (zh) * 2023-06-13 2023-08-29 中国民用航空总局第二研究所 基于柱色谱法的工业生产中健康人员脑疲劳程度划分方法
CN116626276A (zh) * 2023-07-14 2023-08-22 汤臣倍健股份有限公司 弹性稳态模型及其使用方法
CN116626276B (zh) * 2023-07-14 2024-04-09 汤臣倍健股份有限公司 弹性稳态模型及其使用方法

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