WO2015015784A1 - メタクリリル－ＣｏＡの製造法 - Google Patents

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WO2015015784A1
WO2015015784A1 PCT/JP2014/003934 JP2014003934W WO2015015784A1 WO 2015015784 A1 WO2015015784 A1 WO 2015015784A1 JP 2014003934 W JP2014003934 W JP 2014003934W WO 2015015784 A1 WO2015015784 A1 WO 2015015784A1
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coa
pseudomonas
methacrylyl
dehydratase
hydroxyisobutyryl
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佐藤　栄治
不二夫 湯
永二 中島
倫子 山崎
渉 水無
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三菱レイヨン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/52—Propionic acid; Butyric acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing methacrylyl-CoA using an enzyme catalyst.
  • Methacrylic acid esters are mainly used as raw materials for acrylic resins.
  • other comonomers in the fields of paints, adhesives, resin modifiers and the like.
  • There are several industrial production methods such as the ACH (acetone cyanohydrin) method using acetone and hydrogen cyanide as raw materials, and the direct acid method using isobutylene and t-butyl alcohol as raw materials. These chemical production methods depend on fossil raw materials and require a lot of energy.
  • Patent Documents 1 and 2 For example, a method for producing 2-hydroxyisobutyric acid and 3-hydroxyisobutyric acid, which are precursors of methacrylic acid, from natural products such as sugars by using naturally occurring microorganisms has been proposed (Patent Documents 1 and 2). And Non-Patent Document 1). In addition, a method for producing methacrylic acid from glucose using a non-naturally occurring recombinant microorganism into which an enzyme gene has been introduced has been proposed. These methods combine a known enzyme reaction and a hypothetical enzyme reaction inferred therefrom. However, it has not been demonstrated (see Patent Documents 3 to 5).
  • Non-Patent Document 2 describes that enoyl-CoA hydratase purified from poly-3-hydroxybutyrate-producing bacteria has activity of dehydration of 3-hydroxybutyryl-CoA and its reverse reaction (hydration reaction). However, it is unclear whether other enoyl-CoA hydratases will react in both directions. Furthermore, in these prior arts, it has not been reported whether methacrylyl-CoA can be synthesized using 3-hydroxyisobutyryl-CoA as a raw material. Considering the diversity of enzymes and substrate specificity, it was unclear whether it was possible to produce methacrylyl-CoA having a structure different from the original substrate with an enzyme that catalyzes a similar reaction.
  • methacrylyl-CoA is known as an intermediate in the valine degradation pathway. It is also said to have cytotoxicity. In vivo, methacrylyl-CoA is rapidly hydrated by the action of enoyl CoA hydratase, and passes through 3-hydroxyisobutyryl-CoA to 3-hydroxyisobutyric acid. It is estimated to be metabolized.
  • Non-Patent Document 3 shows an example of hydration reaction by crotonase from methacrylyl-CoA to 3-hydroxyisobutyryl-CoA. Although there is a description that this reaction reaches equilibrium at a low conversion rate compared with other reactions (acrylyl-CoA ⁇ hydroxypropionyl-CoA), this reaction is hydrated using methacrylyl-CoA as a raw material. In this case, it was completely unknown whether the dehydration reaction actually proceeds using 3-hydroxyisobutyryl-CoA as a raw material. Furthermore, Non-Patent Document 4 describes that methacrylyl-CoA is spontaneously hydrated.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing methacrylyl-CoA using an enzyme catalyst.
  • methacrylyl-CoA can be synthesized from the action of an enzyme having dehydratase activity from 3-hydroxyisobutyryl-CoA, and the present invention has been completed. That is, the present invention is as follows.
  • a process for producing methacrylyl-CoA, wherein 3-hydroxyisobutyryl-CoA is converted to methacrylyl-CoA in the presence of dehydratase (2) The production method of (1), wherein a dehydratase having a conversion rate from 3-hydroxyisobutyryl-CoA to methacrylyl-CoA of 50% or more is used. (3) The process according to (1) or (2), wherein the reaction is converted to methacrylyl-CoA under reaction conditions of pH 4 to 10. (4) The production method of any one of (1) to (3), wherein the reaction is converted to methacrylyl-CoA under reaction conditions of a temperature of 5 to 80 ° C.
  • B A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and having dehydratase activity.
  • (C) a protein having 90% or more identity with a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and having dehydratase activity.
  • (D) a protein encoded by DNA consisting of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 4;
  • (E) A protein encoded by DNA that hybridizes under stringent conditions with DNA consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4, and having dehydratase activity.
  • (F) a protein encoded by a DNA having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2 or 4 and having a dehydratase activity, encoded by DNA showing 90% or more identity.
  • a 3-hydroxyisobutyryl-CoA aqueous solution prepared in an aqueous medium containing an osmotic pressure adjusting agent of 1 mM or more in the presence of a transformant expressing a gene encoding a dehydratase derived from a microorganism is adjusted to pH 4-10.
  • the present invention makes it possible to produce methacrylyl-CoA by an enzyme catalyst, and by combining the production method of the present invention with in vivo metabolism and the like, fermentation production of methacrylic acid and its ester can also be achieved. As a result, compared with the conventional chemical manufacturing process, the load on energy, resources, and the environment can be remarkably reduced, and the methacrylic acid ester can be efficiently manufactured.
  • methacrylyl-CoA is a compound represented by the following formula (1) and is known in vivo as a metabolic intermediate of valine.
  • 3-Hydroxyisobutyryl-CoA which is a raw material for producing methacrylyl-CoA in the present invention, is a compound represented by the following formula (2), and is known in vivo as a metabolic intermediate of valine.
  • 3-hydroxyisobutyryl-CoA used in the present invention those produced by a known or novel method can be used.
  • synthesis method an organic chemical synthesis method (Angew. Chem. 1953, 65, 186-187) or a synthesis method using an enzyme reaction is known.
  • synthesis method an organic chemical synthesis method (Angew. Chem. 1953, 65, 186-187) or a synthesis method using an enzyme reaction is known.
  • metabolic engineering Fermentation
  • dehydratase activity refers to an activity that catalyzes a reaction for removing water molecules from a substrate molecule, and in particular, removes water molecules from 3-hydroxyisobutyryl-CoA to produce methacrylyl-CoA. It means the activity of catalyzing the reaction.
  • Specific enzymes having dehydratase activity include enzymes classified into enoyl CoA hydratase (EC 4.2.1.17), crotonase and the like. These enzymes are generally involved in fatty acid ⁇ -oxidation, acetone / butanol fermentation, and metabolism of branched chain amino acids.
  • the enzyme having dehydratase activity used in the present invention is any catalyst having the ability to convert 3-hydroxyisobutyryl-CoA to methacrylyl-CoA.
  • the type and origin are not particularly limited.
  • it is a biologically derived catalyst, more preferably ⁇ -oxidation of fatty acids, acetone / butanol fermentation, and a dehydratase derived from a microorganism having a resolution of branched chain amino acids.
  • Dehydratase effective for the present invention can utilize the whole genome sequence of these organisms. Sequence homology using homology search from gene sequence information encoding protein having dehydratase activity or gene sequence information encoding general enoyl-CoA hydratase or crotonase protein revealed by the present inventors from whole genome sequence An enzyme suitable for the present invention can be selected by searching for highly gene sequences and the following method. For those organisms in which the whole genome sequence is unknown, it can be carried out in the same manner after the whole genome sequence is determined. With the widespread use of next-generation sequencers, the entire genome sequence can be easily analyzed by those skilled in the art.
  • the selection of the dehydratase used in the present invention is carried out by isolating an enzyme gene presumed to have dehydratase activity in the organism or the like, or totally synthesizing it by a known method and introducing it into a general host vector system.
  • the candidate protein is expressed by the microorganism transformed with, added to a solution containing 3-hydroxyisobutyryl-CoA, and reacted at 30 ° C., for example, and confirmed by methacrylyl-CoA formation by liquid chromatography In addition, the synthetic activity can be confirmed.
  • preferable enzyme origins include those derived from microorganisms belonging to the genus Pseudomonas or Rhodococcus.
  • Pseudomonas for example, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas agarici, Pseudomonas algae, Pseudomonas algae, Puchidomonas anguilizeptica, Pseudomonas anti-microbica, Pseudomonas aspleni, Pseudomonas aspleni, Pseudomonas aurantia (Pseudomonas aurantiaca), Pseudomonas aureofaciens (Pseudomonas aureofaciens), Pseudomonas Aberanae (Pseudomonas avellanae), Pseudomonas azo door folder performance (Pseudomonas azotoformans), Pseudomonas Barearika (Pseudomonas as aeruginosa, Ps
  • Rhodococcus The microorganisms are classified into (Rhodococcus) genus, for example, Rhodococcus rhodochrous (Rhodococcus rhodocrous), Rhodococcus erythropolis (Rhodococcus erythropolis), Rhodococcus equi (Rhodococcus equi), Rhodococcus Opakasu (Rhodococcus opacus), Rhodococcus Josutii (Rhodococcus jostii) Rhodococcus pyridinovorans, Rhodococcus rhodoni, Rhodococcus coralulinus, Rhodococcus corallinus, Rhodococcus corallinus, Rhodococcus corallinus, Rhodococcus corallinus, Rhodococcus corallinus Le bromide per Tink task (Rhodococcus rubropertinctus), Rhodococcus coprophilus (R
  • Dehydratase derived from these microorganisms is preferable, and an enzyme having a conversion rate from 3-hydroxyisobutyryl-CoA to methacrylyl-CoA of 50% or more is particularly preferable.
  • the conversion rate is more preferably 55% or more, and still more preferably 60% or more.
  • the conversion rate of 50% or more means that more than half of the raw material 3-hydroxyisobutyryl-CoA is converted to methacrylyl-CoA, and the amount of methacrylyl-CoA produced at the end of the reaction is It means that the residual amount of 3-hydroxyisobutyryl-CoA is exceeded.
  • the conversion rate in this invention is calculated
  • a particularly useful dehydratase is any protein selected from the group consisting of the following (a) to (f).
  • a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3.
  • B A protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3, and having dehydratase activity.
  • C a protein having 90% or more identity with a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 3 and having dehydratase activity.
  • dehydratase has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3.
  • the dehydratase is not limited to the one having the above-described sequence, and is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more, with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3. More preferably, it contains an amino acid sequence having homology or identity of about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, more particularly preferably about 95% or more, and most preferably about 98% or more, and has dehydratase activity. Proteins are also included in the dehydratase of the present invention.
  • the numerical value of the homology is obtained by executing a command of the maximum matching method, for example, using DNASIS (Hitachi Software Engineering) which is sequence analysis software.
  • the parameters at that time are default settings (initial settings).
  • the dehydratase includes an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted, added and / or inserted in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 or 3, and has dehydratase activity. Protein is also included.
  • 1 to 20 for example, 1 to 10, preferably 1 to 5, more preferably 1 to 2
  • amino acids are classified into hydrophobic amino acids (A, I, L, M, F, P, W, Y, V), hydrophilic amino acids (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T), an amino acid having an aliphatic side chain (G, A, V, L, I, P), an amino acid having a hydroxyl group-containing side chain (S, T, Y), sulfur Amino acids having atom-containing side chains (C, M), amino acids having carboxylic acid and amide-containing side chains (D, N, E, Q), amino acids having base-containing side chains (R, K, H), aromatic It is classified into amino acids (H, F, Y, W) having a containing side chain.
  • hydrophobic amino acids A, I, L, M, F, P, W, Y, V
  • hydrophilic amino acids R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T
  • G, A, V, L, I, P amino acid having
  • amino acids classified into each group are likely to maintain the activity of the polypeptide when substituted with each other, and such mutual substitution of amino acids is preferred.
  • examples thereof include substitution between glycine and proline, glycine and alanine or valine, leucine and isoleucine, glutamic acid and glutamine, aspartic acid and asparagine, cysteine and threonine, threonine and serine or alanine, and lysine and arginine.
  • the gene encoding dehydratase includes, for example, DNA comprising the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 or 4.
  • the gene encoding dehydratase is not limited to the above sequence, and is about 50% or more, preferably about 60% or more, more preferably about 70% or more with the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4. More preferably, DNA having a base sequence having a homology (identity) of about 80% or more, particularly preferably about 90% or more, more particularly preferably about 95% or more, and most preferably about 98% or more is also used. So long as it encodes a protein having dehydratase activity, it is included in the gene encoding dehydratase.
  • deletion, substitution, addition and / or insertion of the amino acid sequence described above deletion, substitution, addition and / or insertion, etc. in several bases in the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 2 or 4
  • the base sequence in which the mutation has occurred is also included in the gene encoding dehydratase as long as it encodes a protein having dehydratase activity in the present invention.
  • the number of bases to be deleted, substituted, added and / or inserted is 30 or less, preferably 15 or less, particularly preferably 6 or less.
  • a DNA that hybridizes under stringent conditions with a DNA consisting of a base sequence complementary to the DNA consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 4 also has a dehydratase activity as long as it encodes a protein having dehydratase activity. Included in the encoding gene.
  • stringent conditions are, for example, “2 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.”, “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.” as washing conditions after hybridization.
  • Examples of more stringent conditions include “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”, “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 50 ° C.”, and the like.
  • Hybridization can be performed by a known method. Hybridization methods are described in, for example, “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.” (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), “Current Protocols in Molecular Biology” (see Jon & S can do.
  • the above-described gene encoding dehydratase in the present invention can be introduced into a host to produce a transformant.
  • a host for example, it is possible to construct one or more expression vectors comprising the gene in an operably linked state with an expression control sequence that is functional in the host.
  • Expression vectors that can be used in the present invention include plasmid vectors, phage (virus) vectors, cosmid vectors, artificial chromosome vectors, and the like.
  • expression vectors include one or more selectable marker genes and an appropriate vector. Expression control sequences can be included. Many host / vector systems are known, but if necessary, they can be developed in the same manner.
  • a vector for expressing dehydratase can be constructed.
  • An expression plasmid containing the vector can be prepared and introduced into a host such as Escherichia coli to prepare a recombinant (transformant).
  • methacrylyl-CoA can be produced from 3-hydroxyisobutyryl-CoA.
  • Examples of hosts for expressing dehydratase include Escherichia coli, Rhodococcus genus, Pseudomonas genus, Corynebacterium genus, Bacillus genus, Streptococcus genus, Streptomyces genus, Saccharomyces genus, Candida,
  • Examples of filamentous fungi include the genus Aspergillus. Among these, it is particularly convenient to use E. coli, because it is simple and efficient.
  • Methacrylyl-CoA can be produced using a transformant introduced with a gene encoding dehydratase. Specifically, a transformant is produced by introducing a gene encoding dehydratase into a host, and dehydratase is expressed.
  • methacrylyl-CoA can be obtained by contacting 3-hydroxyisobutyryl-CoA with a substrate under conditions where dehydratase acts.
  • a culture solution obtained by culturing a recombinant microorganism can be used as it is, or a microbial cell obtained by a collection operation such as centrifugation from the culture solution or a processed product thereof can be used.
  • treated cells include cells treated with acetone, toluene, etc., freeze-dried cells, disrupted cells, cell-free extracts obtained by disrupting cells, and crude enzymes or purified enzymes extracted from these.
  • the transformant is cultured and the protein is collected from the cells by a method such as crushing, extraction, or centrifugation.
  • methacrylyl-CoA synthesis reaction is performed using a transformant introduced with a gene encoding dehydratase and converting 3-hydroxyisobutyryl-CoA to methacrylyl-CoA in the presence of the transformant. Can also be converted.
  • a transformant was prepared in which an enzyme gene group capable of synthesizing 3-hydroxyisobutyryl-CoA was introduced at the same time, and a precursor of 3-hydroxyisobutyryl-CoA was used as a raw material. -CoA may be manufactured. By doing so, methacrylyl-CoA can be efficiently produced from biomass or the like by metabolic engineering (fermentation) as described above.
  • methacrylyl-CoA can be performed by the following method. Dehydratase is brought into contact with an aqueous solution or suspension of 3-hydroxyisobutyryl-CoA, and the reaction is performed while controlling conditions such as temperature. By the reaction, 3-hydroxyisobutyryl-CoA is dehydrated to produce methacrylyl-CoA.
  • the aqueous solution containing 3-hydroxyisobutyryl-CoA is usually prepared in an aqueous medium such as a buffer solution.
  • an aqueous medium such as a buffer solution.
  • the osmotic pressure adjusting agent (which may also be used as a pH buffer solution) is a water-soluble substance added for the purpose of adjusting to be isotonic or hypertonic with respect to the osmotic pressure of the solution inside the cell or the like.
  • organic and inorganic salts or saccharides are preferable, and salts are preferable.
  • the salt is preferably a metal salt or an inorganic acid salt, more preferably an alkali metal salt or a hydrochloride, for example, an alkali metal salt with phosphoric acid, an amino acid, or an amino group and hydrochloric acid such as trishydroxymethylaminomethane. Salt, sodium chloride and potassium chloride.
  • the saccharide is preferably a monosaccharide or oligosaccharide, more preferably a monosaccharide or disaccharide, and examples thereof include glucose, sucrose, and mannitol.
  • the osmotic pressure adjusting agent is preferably added at a concentration of 1 mM or more, and particularly preferably adjusted to be isotonic or hypertonic as compared with the solution in the living cell to be used.
  • concentration of the osmotic pressure adjusting agent in the aqueous solution containing 3-hydroxyisobutyryl-CoA is preferably 1 mM or more, more preferably 50 mM or more.
  • the concentration of 3-hydroxyisobutyryl-CoA in the reaction solution is arbitrary and is not particularly limited. Moreover, the usage-amount or reaction conditions of the enzyme which has dehydratase activity are suitably determined according to the raw material to be used. Usually, the concentration of 3-hydroxyisobutyryl-CoA is set in the range of 0.00001 to 10% by weight. Preferably, it is in the range of 0.0001 to 1% by weight.
  • reaction temperature or reaction time are appropriately determined depending on the raw materials used, the activity of the biocatalyst, etc., and are not particularly limited, but the reaction is usually carried out at 5 to 80 ° C. for 1 minute to 1 week. Just do it. Preferably, it is 10 to 70 ° C. and 1 minute to 120 hours, and more preferably 10 minutes or more. It is preferable to select conditions under which the reaction is completed under such conditions.
  • the pH of the reaction solution is not particularly limited as long as the reaction proceeds efficiently, but it is, for example, in the range of pH 4 to 10, preferably pH 5.5 to 8.5.
  • dehydratase preferably has a conversion rate of 3-hydroxyisobutyryl-CoA of 50% or more.
  • the conversion rate is more preferably 55% or more, and still more preferably 60% or more. It is preferable that the reaction conditions are adjusted appropriately so as to be in a range suitable for various properties of dehydratase.
  • organic solvent for example, linear, branched or cyclic, saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon, saturated or unsaturated aromatic hydrocarbon, etc. can be used alone or in admixture of two or more.
  • hydrocarbon solvents eg, pentane, hexane, cyclohexane, benzene, toluene, xylene, etc.
  • halogenated hydrocarbon solvents eg, methylene chloride, chloroform, etc.
  • ether solvents eg, diethyl ether, Dipropyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, t-butyl methyl ether, dimethoxyethane and the like
  • ester solvents for example, methyl formate, methyl acetate, ethyl acetate, butyl acetate, methyl propionate
  • the methacrylyl-CoA produced by the method of the present invention can be measured or quantitatively analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) as necessary. Isolation of methacrylyl-CoA from the reaction solution can be performed by a known isolation method such as column separation.
  • the obtained methacrylyl-CoA can be converted into methacrylic acid or, similarly, by reacting with an alcohol by cleaving the thioester bond chemically or enzymatically. That is, the method of the present invention can further include a step of producing methacrylic acid or a methacrylic acid ester from methacrylyl-CoA.
  • the methacrylic acid or methacrylic ester thus obtained can remarkably reduce the load on energy, resources, and the environment, and has a low environmental impact compared to conventional chemical products made from petroleum products. As such, it has very great social value.
  • PCR method using the obtained genomic DNA as a template so that a restriction endonuclease recognition site that can be easily introduced into an expression vector is added to a DNA fragment containing a gene presumed to encode dehydratase It was prepared by.
  • Oligonucleotide primer MMA-031: 5'-GGTCATGACCGAACTTCAACACCCATCATCCTC-3 '(SEQ ID NO: 5)
  • MMA-032 5′-GGCCTGCAGGGTTCAGCTGTTCGAAAGTTCAGCGC-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • Reaction solution composition Sterile water 22 ⁇ l 2 ⁇ PrimeSTAR (Takara Bio Inc.) 25 ⁇ l MMA-031 (SEQ ID NO: 5) 1 ⁇ l MMA-032 (SEQ ID NO: 6) 1 ⁇ l Genomic DNA 1 ⁇ l Total volume 50 ⁇ l Temperature cycle: 30 cycles of reaction at 98 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 15 seconds and 72 ° C for 150 seconds
  • the obtained band of the amplified product of about 0.8 kb was purified with QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).
  • the purified DNA was cleaved with restriction enzymes BspHI (contains a cleavage recognition site in oligonucleotide MMA-031) and Sse8387I (contains a cleavage recognition site in oligonucleotide MMA-032). Separation was performed by agarose gel electrophoresis, and the target band was purified from the gel using Gel / PCR Purification Kit (manufactured by FAVORGEN) and eluted in 30 ⁇ L of sterilized water.
  • E. coli JM109 strain was inoculated into 1 mL of LB medium and pre-cultured aerobically at 37 ° C. for 5 hours. 2.5 mM KCl, 1 mM MgSO 4 , 1 mM MgCl 2 ), and cultured at 18 ° C. for 20 hours. After the culture was collected by centrifugation, 13 mL of a cold TF solution (20 mM PIPES-KOH (pH 6.0), 200 mM KCl, 10 mM CaCl2, 40 mM MnCl2) was added and left at 0 ° C. for 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged again and the supernatant was removed. Then, the precipitated Escherichia coli was suspended in 3.2 mL of a cold TF solution, 0.22 mL of dimethyl sulfoxide was added, and the mixture was allowed to stand at 0 ° C. for 10 minutes.
  • a cold TF solution (20 mM
  • LBAmp agar medium LB medium containing ampicillin 100 mg / L, 1.5% agar
  • a plurality of transformant colonies grown on an agar medium were cultured overnight at 37 ° C. in 1.5 mL of LBAmp medium (LB medium containing ampicillin 100 mg / L), and after collection, QIAprep Spin Miniprep kit (QIAGEN Was used to prepare plasmid DNA.
  • the base sequence of the obtained recombinant plasmid DNA was confirmed using CEQ DTCS Quick Start Kit and fluorescent sequencer CEQ 2000XL DNA Analysis (both BECKMAN COULTER, USA) and named plasmid pMMA011. Escherichia coli JM109 strain was transformed with plasmid pMMA011 to produce a dehydratase-expressing recombinant.
  • Bacteria were collected from the obtained culture by centrifugation (3,700 ⁇ g, 10 minutes, 4 ° C.), washed twice with 10 mM phosphate-sodium buffer (pH 7.0), and then the same buffer. The suspension was suspended so that the OD 630 nm was 6.
  • a cell disruption solution was prepared from 1 ml of the obtained cell suspension as follows. Using an ultrasonic homogenizer VP-300 (Tytec, Japan), the mixture was crushed for 5 minutes while cooling with ice under the conditions of output (amplitude): 15% / On: 1 second, off: 1 second.
  • Oligonucleotide primer MMA-025: 5'-GGTCATGAACACTGCCGTCGAACCTCATACAAG-3 '(SEQ ID NO: 7)
  • MMA-026 5'-GGCCTGCAGGCTCAGCAGTTGCCGACTACTGGGATC-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • This DNA fragment was digested with BspHI and Sse8387I and then incorporated into the vector pTrc99A in the same manner as in Example 1.
  • the resulting plasmid was named pMMA015.
  • Escherichia coli JM109 strain was transformed with plasmid pMMA015 to prepare a dehydratase-expressing recombinant.
  • SEQ ID NO: 5 MMA-031
  • SEQ ID NO: 6 MMA-032
  • SEQ ID NO: 7 MMA-025
  • SEQ ID NO: 8 MMA-026

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Abstract

本発明は、酵素触媒によるメタクリリル－ＣｏＡの製造方法として、デヒドラターゼ活性を有する酵素により、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ変換するメタクリリル－ＣｏＡの製造法を提供する。この製造法において、デヒドラターゼ活性を有する酵素の３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへの変換率は、５０％以上である。また、この製造法において、デヒドラターゼ活性を有する酵素は、シュードモナス属あるいはロドコッカス属に属する微生物由来のものとできる。

Description

メタクリリル－ＣｏＡの製造法
　本発明は、酵素触媒を用いたメタクリリル－ＣｏＡの製造方法に関する。
　メタクリル酸エステルは主にアクリル樹脂の原料として使われている。また、その他、塗料、接着剤、樹脂改質剤などの分野のコモノマーとしても多くの需要がある。工業的な製法としてはいくつかの方法があり、例えば、アセトンおよびシアン化水素を原料とするＡＣＨ（アセトンシアノヒドリン）法、イソブチレン、ｔ－ブチルアルコールを原料とする直酸法が知られている。これら化学的な製造方法は、化石原料に依存しており、また多くのエネルギーを必要とする。
　近年では、地球温暖化防止及び環境保護の観点から、従来の化石原料の代替となる炭素源として、バイオマスから種々の化学製品を製造する技術が注目されている。メタクリル酸及びメタクリル酸エステルもバイオマス原料からの製造が期待されている。
　例えば、天然に存在する微生物を利用し、糖などの天然物からメタクリル酸の前駆体となる２－ヒドロキシイソ酪酸及び３－ヒドロキシイソ酪酸を生産する方法が提案されている（特許文献１、２及び非特許文献１参照）。また、酵素遺伝子を導入した、天然に存在しない組換え微生物を用いてグルコースからメタクリル酸を生成する方法が提案されているが、これらは既知の酵素反応及びそれから類推される仮想の酵素反応を組み合わせたものであり、実証されたものではない（特許文献３～５参照）。これらの公報には、３－ヒドロキシイソ酪酸あるいは３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡの酵素的な脱水反応について、類似反応を触媒する酵素の利用が可能な旨の記載がある。確かに、アセトン／ブタノール発酵経路にあるエノイル－ＣｏＡヒドラターゼは脱水反応を触媒することから、これらの酵素が前記化合物を基質とするのであれば、利用可能と考えられる。一方、脂肪酸のβ－酸化あるいは分岐鎖アミノ酸の分解経路のエノイルＣｏＡヒドラターゼは水和反応を触媒する酵素であり、脱水反応を触媒するものではない。
　非特許文献２には、ポリ－３－ヒドロキシブチレート生産菌より精製されたエノイル－ＣｏＡヒドラターゼが、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡの脱水反応とその逆反応（水和反応）の活性を有していることが示されているが、他のエノイル－ＣｏＡヒドラターゼが両方向の反応を行うかどうかは不明である。さらに、これら先行技術においては、実際に３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを原料として、メタクリリル－ＣｏＡを合成可能かどうかは報告されていない。酵素の多様性、基質特異性を考慮すると、類似反応を触媒する酵素で本来の基質と構造が異なるメタクリリル－ＣｏＡの製造が可能であるかは不明であった。
　一方、メタクリリル－ＣｏＡはバリン分解経路中の中間体として知られている。また、細胞毒性を有すると言われており、生体内では、エノイルＣｏＡヒドラターゼの作用により、メタクリリル－ＣｏＡは速やかに水和され、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを経て、３－ヒドロキシイソ酪酸へと代謝されると推定されている。
　非特許文献３には、メタクリリル－ＣｏＡから３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡへのクロトナーゼによる水和反応の例が示されている。本反応は他の反応（アクリリル－ＣｏＡ→ヒドロキシプロピオニル－ＣｏＡ）に比べ、反応が低転化率で平衡に達している旨の記載があるが、本反応は原料をメタクリリル－ＣｏＡを用いた水和反応の場合であり、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを原料として実際に脱水反応が進行するかどうかは全く不明であった。さらに、非特許文献４にはメタクリリル－ＣｏＡが自発的に水和されることが記載されている。メタクリリル－ＣｏＡ自身が自発的に水和されるような水中の環境下で、実際に３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡの脱水反応が進行し、本発明の目的物であるメタクリリル－ＣｏＡの製造が可能かどうかは全く不明であった。
国際公開第２００７／１１０３９４号 国際公開第２００８／１４５７３７号 国際公開第２００９／１３５０７４号 国際公開第２０１１／０３１８９７号 国際公開第２０１２／１３５７８９号
Ｇｒｅｅｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２０１２，　１４，　１９４２－１９４８ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６９，８，２７４８－２７５５ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，２６９，１４２４８－１４２５３ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９５７，　２２４，　１－１１
　本発明は、酵素触媒によるメタクリリル－ＣｏＡの製造方法を提供することを目的とする。
　３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡからデヒドラターゼ活性を有する酵素の作用により、メタクリリル－ＣｏＡを合成しうること見出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）デヒドラターゼの存在下、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ変換するメタクリリル－ＣｏＡの製造法。
（２）３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへの変換率が５０％以上であるデヒドラターゼを用いる、（１）の製造法。
（３）ｐＨ４～１０の反応条件でメタクリリル－ＣｏＡへ変換する、（１）又は（２）の製造法。
（４）温度５～８０℃の反応条件でメタクリリル－ＣｏＡへ変換する、（１）から（３）のいずれかの製造法。
（５）時間１分～１週間の反応条件でメタクリリル－ＣｏＡへ変換する、（１）から（４）のいずれかの製造法。
（６）３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡが、１ｍＭ以上の浸透圧調整剤を含む水性媒体で調製されたものである、（１）から（５）のいずれかの製造法。
（７）デヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する形質転換体の存在下で、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ変換する、（１）から（６）のいずれかの製造法。
（８）デヒドラターゼをコードする遺伝子が微生物由来の遺伝子である、（７）の製造法。
（９）微生物が、シュードモナス属又はロドコッカス属に属する微生物である（８）の製造法。
（１０）デヒドラターゼが下記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される（７）の製造法。
（ａ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質と９０％以上の同一性を示し、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡでコードされるタンパク質。
（ｅ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｆ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を示すＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（１１）微生物由来のデヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する形質転換体の存在下、１ｍＭ以上の浸透圧調整剤を含む水性媒体で調製された３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ水溶液を、ｐＨ４～１０、温度５～８０℃、時間１分～１週間の反応条件で反応させることにより、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ変換率５０％以上で変換するメタクリリル－ＣｏＡの製造法。
　本発明により、酵素触媒によるメタクリリル－ＣｏＡの製造が可能となり、本発明の製造法と生体内代謝等を組み合わせることにより、メタクリル酸およびそのエステルの発酵生産も達成できる。その結果、従来の化学製造プロセスと比較して、エネルギー、資源、環境への負荷を格段に低減でき、かつ効率的にメタクリル酸エステルを製造することが可能になる。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明において、メタクリリル－ＣｏＡとは、以下の式（１）で示される化合物であり、生体内ではバリンの代謝中間体として知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　本発明におけるメタクリリル－ＣｏＡの製造の原料となる３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡは以下の式（２）で示される化合物であり、生体内ではバリンの代謝中間体として知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　本発明で使用する３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡは公知又は新規な方法で製造したものを使用することができる。その合成方法としては有機化学的に合成する方法（Ａｎｇｅｗ．　Ｃｈｅｍ．　１９５３，６５，　１８６－１８７）あるいは酵素反応を用いた合成方法が知られている。さらに、バイオマス等から代謝工学（発酵）的に合成されたものを用いることができる。
　本発明において、デヒドラターゼ（ｄｅｈｙｄｒａｔａｓｅ）活性とは、基質分子から水分子を除去する反応を触媒する活性を表し、特に３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡから水分子を除去してメタクリリル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する活性を意味する。デヒドラターゼ活性を有する具体的な酵素として、エノイルＣｏＡヒドラターゼ（ＥＣ４．２．１．１７）、クロトナーゼ（ｃｒｏｔｏｎａｓｅ）などに分類される酵素が挙げられる。これらの酵素は一般に、脂肪酸のβ－酸化、アセトン／ブタノール発酵、および分岐鎖アミノ酸の代謝に関与している。
　本発明において使用するデヒドラターゼ活性を有する酵素（以下、単に「デヒドラターゼ」と表記する場合がある。）とは、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへ変換する能力を有する触媒であれば、特に限定されず、その種類及び起源を問わない。好ましくは、生体由来の触媒であり、さらに好ましくは、脂肪酸のβ－酸化、アセトン／ブタノール発酵、および分岐鎖アミノ酸の分解能を有する微生物由来のデヒドラターゼである。
　これら生物からの本発明に有効なデヒドラターゼの選択はこれら生物の全ゲノム配列を利用することができる。全ゲノム配列から本発明者らが明らかにしたデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子配列情報あるいは一般的なエノイルＣｏＡヒドラターゼまたはクロトナーゼのタンパク質をコードする遺伝子配列情報から相同性検索を用いて配列の相同性の高い遺伝子配列を探し、以下に示す方法により、本発明に適した酵素を選択することが可能である。前記生物で全ゲノム配列の不明なものについては、全ゲノム配列決定後、同様に実施することができる。なお、次世代シーケンサーの普及により、同業者であれば、全ゲノム配列は容易に解析可能である。
　本発明に用いられるデヒドラターゼの選択は、前記生物等のデヒドラターゼ活性を有すると推定される酵素遺伝子を単離、あるいは公知の方法で全合成し、一般的な宿主ベクター系に導入し、該ベクター系で形質転換した微生物によって候補タンパクを発現させ、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを含む溶液に添加し、例えば、３０℃で反応させ、液体クロマトグラフィーによりメタクリリル－ＣｏＡの生成の有無を確認することにで、合成活性を確認可能である。
　本発明において、好ましい酵素の由来としては、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属またはロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に属する微生物由来のものが挙げられる。
　具体的にはシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に分類される微生物として、例えば、シュードモナス　エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス　アガリシ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｇａｒｉｃｉ）、シュードモナス　アルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス　アミグダレ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｍｙｇｄａｌｅ）、シュードモナス　アングイリセプチカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｎｇｕｉｌｉｓｅｐｔｉｃａ）、シュードモナス　アンチミクロビカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉｃａ）、シュードモナス　アスプレニ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｓｐｌｅｎｉ）、シュードモナス　オーランチアカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｕｒａｎｔｉａｃａ）、シュードモナス　オーレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス　アベラナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｖｅｌｌａｎａｅ）、シュードモナス　アゾトフォルマンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ）、シュードモナス　バレアリカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂａｌｅａｒｉｃａ）、シュードモナス　ベイジェリンスキイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂｅｉｊｅｒｉｎｓｃｋｉｉ）、シュードモナス　ベテリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂｅｔｅｌｉ）、シュードモナス　ボレオポリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂｏｒｅｏｐｏｌｉｓ）、シュードモナス　カルボキシヒドロゲナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃａｒｂｏｘｙｈｙｄｒｏｇｅｎａ）、シュードモナス　カリカパパヤエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃａｒｉｃａｐａｐａｙａｅ）、シュードモナス　シコリイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｃｈｏｒｉｉ）、シュードモナス　シッシコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｓｓｉｃｏｌａ）、シュードモナス　シトロネロリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｉｔｒｏｎｅｌｌｏｌｉｓ）、シュードモナス　コロナファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｏｒｏｎａｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス　コルガテ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｏｒｒｕｇａｔｅ）、シュードモナス　ドゥードロフィイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｏｕｄｏｒｏｆｆｉｉ）、シュードモナス　エキノイズス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｅｃｈｉｎｏｉｄｓ）、シュードモナス　エロンガテ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｅｌｏｎｇａｔｅ）、シュードモナス　フィクセレクタエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｉｃｕｓｅｒｅｃｔａｅ）、シュードモナス　フラベッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス　フレクテンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｅｃｔｅｎｓ）、シュードモナス　フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス　フラギ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｒａｇｉ）、シュードモナス　フルバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｕｌｖａ）、シュードモナス　フスコバギナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｕｓｃｏｖａｇｉｎａｅ）、シュードモナス　ゲリディコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｅｌｉｄｉｃｏｌａ）、シュードモナス　ゲニクラタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｅｎｉｃｕｌａｔａ）、シュードモナス　グラテイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｇｌａｔｈｅｉ）、シュードモナス　ハロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｈａｌｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス　ヒビシコラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｈｉｂｉｓｃｉｃｏｌａ）、シュードモナス　フッチエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｈｕｔｔｉｅｎｓｉｓ）、シュードモナス　イネルス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｉｎｅｒｓ）、シュードモナス　ランセロタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｌａｎｃｅｌｏｔａ）、シュードモナス　レモイグネイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｌｅｍｏｉｇｎｅｉ）、シュードモナス　ルンデンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｌｕｎｄｅｎｓｉｓ）、シュードモナス　ルテオラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｌｕｔｅｏｌａ）　、シュードモナス　マルギナリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍａｒｇｉｎａｌｉｓ）、シュードモナス　メリアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｌｉａｅ）、シュードモナス　メンドシナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｅｎｄｏｃｉｎａ）、シュードモナス　ムシドレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｕｃｉｄｏｌｅｎｓ）、シュードモナス　モンテイリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｍｏｎｔｅｉｌｌｉ）、シュードモナス　ナウチカ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｎａｕｔｉｃａ）、シュードモナス　ニトロレデュセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｎｉｔｒｏｒｅｄｕｃｅｎｓ）、シュードモナス　オレオボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス　オリジハビタンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｏｒｙｚｉｈａｂｉｔａｎｓ）、シュードモナス　パーツシノゲナ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｅｒｔｕｃｉｎｏｇｅｎａ）、シュードモナス　フェナジニウム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）、シュードモナス　ピクトルム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｉｃｔｏｒｕｍ）、シュードモナス　シュードアルカリゲネス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｓｅｕｄｏａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シュードモナス　プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス　ピロシニア（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｙｒｒｏｃｉｎｉａ）、シュードモナス　レシノボランス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｓｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、シュードモナス　ローデシアエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｒｈｏｄｅｓｉａｅ）、シュードモナス　サッカロフィラ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａ）、シュードモナス　サバスタノイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓａｖａｓｔａｎｏｉ）、シュードモナス　スピノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｉｎｏｓａ）、シュードモナス　スタニエリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔａｎｉｅｒｉ）、シュードモナス　ストラミナエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔｒａｍｉｎａｅ）、シュードモナス　スツッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、シュードモナス　シンキサンタ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｎｘａｎｔｈａ）、シュードモナス　シリンガエ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｒｉｎｇａｅ）、シュードモナス　シジギイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｙｚｙｇｉｉ）、シュードモナス　タエロレンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔａｅｔｒｏｌｅｎｓ）、シュードモナス　トラアシイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｔｏｌａａｓｉｉ）、シュードモナス　ベロニイ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖｅｒｏｎｉｉ）、シュードモナス　ビリディフラバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖｉｒｉｄｉｆｌａｖａ）、シュードモナス　ブルガリス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｖｕｌｇａｒｉｓ）、シュードモナス　ウィスコンシエンシス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｗｉｓｃｏｎｓｉｎｅｎｓｉｓ）等が挙げられる。
　ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属に分類される微生物としては、例えば、ロドコッカス　ロドクロウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｏｃｒｏｕｓ）、ロドコッカス　エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、ロドコッカス　エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）、ロドコッカス　オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｏｐａｃｕｓ）、ロドコッカス　ジョスティイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｊｏｓｔｉｉ）、　ロドコッカス　ピリジノボランス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｐｙｒｉｄｉｎｏｖｏｒａｎｓ）、ロドコッカス　ロドニ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｈｏｄｎｉｉ）、　ロドコッカス　コラリヌス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｒａｌｌｉｎｕｓ）、ロドコッカス　ルブロペルチンクタス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒｕｂｒｏｐｅｒｔｉｎｃｔｕｓ）、ロドコッカス　コプロフィラス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｏｐｒｏｐｈｉｌｕｓ）、ロドコッカス　グロベルルス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｌｏｂｅｒｕｌｕｓ）、ロドコッカス　クロロフェノリカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｌｉｃｕｓ）、ロドコッカス　ルテウス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｌｕｔｅｕｓ）、ロドコッカス　アイシェンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ａｉｃｈｉｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス　チュブエンシス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｃｈｕｂｕｅｎｓｉｓ）、ロドコッカス　マリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｍａｒｉｓ）、ロドコッカス　ファシエンス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｆａｓｃｉｎｅｓ）等が挙げられる。
　これらの微生物を由来とするデヒドラターゼが好ましく、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへ変換率が５０％以上である酵素が特に好ましい。変換率は、より好ましくは５５％以上であり、さらに好ましくは６０％以上である。
　ここで、変換率が５０％以上とは、原料３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡの半量以上がメタクリリル－ＣｏＡへ変換したことを意味し、反応終了時のメタクリリル－ＣｏＡの生成量が、原料の３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡの残存量を超えた状態にあることを意味する。
　本発明おける変換率は、以下の式で求められる。
[メタクリリル－ＣｏＡ生成量]／[３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ残存量＋メタクリリル－ＣｏＡ生成量]×１００
　本発明において、特に有用なデヒドラターゼは以下の（ａ）～（ｆ）からなる群より選択されるいずれかのタンパク質である。
（ａ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｃ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質と９０％以上の同一性を示し、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｄ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡでコードされるタンパク質。
（ｅ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
（ｆ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を示すＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
　本発明において、デヒドラターゼは配列番号１または３に示されるアミノ酸配列を有する。
　本発明において、デヒドラターゼは、上記配列を有するものに限定されるものではなく、配列番号１または３記載のアミノ酸配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性あるいは同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質も本発明のデヒドラターゼに含まれる。
　上記の相同性の数値は、配列解析ソフトウェアであるＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウェアエンジニアリング）を用いて、例えば、マキシマムマッチング法のコマンドを実行することにより求められる。その際のパラメータは、デフォルトの設定（初期設定）とする。また、本発明においてデヒドラターゼには、配列番号１または３記載のアミノ酸配列において、１個または数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入されたアミノ酸配列を含み、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質も含まれる。
　（ｉ）配列番号１または３記載のアミノ酸配列において、１～２０個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（ｉｉ）配列番号１または３記載のアミノ酸配列の１～２０個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列、（ｉｉｉ）配列番号１または３記載のアミノ酸配列に１～２０個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（ｉｖ）配列番号１または３記載のアミノ酸配列に１～２０個（例えば１～１０個、好ましくは１～５個、さらに好ましくは１～２個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（ｖ）上記（ｉ）～（ｉｖ）を組み合わせたアミノ酸配列が挙げられる。
　アミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸が置換する場合は、類似するアミノ酸残基間の保存的置換が好ましい。例えばアミノ酸は、その側鎖の性質に基づいて、疎水性アミノ酸（Ａ，Ｉ，Ｌ，Ｍ，Ｆ，Ｐ，Ｗ，Ｙ，Ｖ）、親水性アミノ酸（Ｒ，Ｄ，Ｎ，Ｃ，Ｅ，Ｑ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｓ，Ｔ）、脂肪族側鎖を有するアミノ酸（Ｇ，Ａ，Ｖ，Ｌ，Ｉ，Ｐ）、水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｓ，Ｔ，Ｙ）、硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（Ｃ，Ｍ）、カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（Ｄ，Ｎ，Ｅ，Ｑ）、塩基含有側鎖を有するアミノ酸（Ｒ，Ｋ，Ｈ）、芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（Ｈ，Ｆ，Ｙ，Ｗ）に分類される。各群に分類されたアミノ酸は、相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いことが知られており、そのようなアミノ酸相互の置換が好ましい。例えば、グリシンとプロリン、グリシンとアラニンまたはバリン、ロイシンとイソロイシン、グルタミン酸とグルタミン、アスパラギン酸とアスパラギン、システインとスレオニン、スレオニンとセリン又はアラニン、リジンとアルギニン間での置換を挙げることができる。
　本発明において、デヒドラターゼをコードする遺伝子は、例えば配列番号２または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡを含む。
　本発明において、デヒドラターゼをコードする遺伝子は、上記配列に限定されるものではなく、配列番号２または４記載の塩基配列と約５０％以上、好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上、さらに特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性（同一性）を有する塩基配列を有するＤＮＡも、それがデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、デヒドラターゼをコードする遺伝子に含まれる。
　また、前述したアミノ酸配列の欠失、置換、付加及び／又は挿入に対応して、配列番号２または４記載の塩基配列において、数個の塩基に欠失、置換、付加及び／又は挿入等の変異が生じた塩基配列も、それが本発明においてデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、デヒドラターゼをコードする遺伝子に含まれる。なお、欠失、置換、付加及び／又は挿入される塩基の個数は、３０個以下、好ましくは１５個以下、特に好ましくは６個以下である。
　さらに、配列番号２または４に記載の塩基配列からなるＤＮＡと相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡも、これがデヒドラターゼ活性を有するタンパク質をコードする限り、デヒドラターゼをコードする遺伝子に含まれる。
　本明細書において、ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件として、例えば、「２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」、よりストリンジェントな条件としては、例えば、「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」、「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、５０℃」等の条件を挙げることができる。
　ハイブリダイゼーションは、公知の方法によって行うことができる。ハイブリダイゼーションの方法は、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　２ｎｄ　ｅｄ．」（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９８９））、「Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　Ｓｏｎｓ（１９８７－１９９７））等を参照することができる。
　上述した本発明におけるデヒドラターゼをコードする遺伝子は、宿主に導入して形質転換体を作成することができる。例えば、前記遺伝子を、宿主内で機能的である発現調節配列に作動可能に連結された状態で含む、１つまたは複数の発現ベクターを構築することで可能となる。本発明において使用可能な発現ベクターには、プラスミドベクター、ファージ（ウィルス）ベクター、コスミドベクターおよび人工染色体ベクターなどが含まれ、さらに、発現ベクターは、１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子および適当な発現調節配列を含むことができる。多くの宿主・ベクター系が知られているが、必要に応じて、同様の手法にて開発することができる。
　例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＡ０１のゲノム配列からデヒドラターゼをコードする遺伝子を増幅するためのＰｒｉｍｅｒを設計し、ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ反応により前記遺伝子を増幅し、これを大腸菌用の発現ベクターに組込むことにより、デヒドラターゼを発現するためのベクターを構築することができる。前記ベクターを含む発現プラスミドを作成し、これを大腸菌等の宿主に導入して組換え体（形質転換体）を作製することができる。前記組換え体を培養して得られた細胞抽出液を用いて、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡを生成させることができる。
　デヒドラターゼを発現させるための宿主としては、細菌では大腸菌、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属などが挙げられ、酵母ではＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属、糸状菌ではＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属などが挙げられる。これらの中で、特に大腸菌を用いることが簡便であり、効率もよく好ましい。
　デヒドラターゼをコードする遺伝子が導入された形質転換体を用いてメタクリリル－ＣｏＡを製造することができる。具体的には、デヒドラターゼをコードする遺伝子を宿主に導入して形質転換体を作製し、デヒドラターゼを発現させる。
　メタクリリル－ＣｏＡ合成反応には３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを基質にデヒドラターゼが作用する条件下で接触させることにより、メタクリリル－ＣｏＡを得ることができる。例えば、組換え微生物を培養して得られる培養液をそのまま用いるか、又は、該培養液から遠心分離等の集菌操作によって得られる菌体又はその処理物等を用いることができる。菌体処理物としては、アセトン、トルエン等で処理した菌体、凍結乾燥菌体、菌体破砕物、菌体を破砕した無細胞抽出物、これらから酵素を抽出した粗酵素又は精製酵素等が挙げられる。好ましくは、形質転換体を培養して菌体からタンパク質を破砕、抽出、遠心分離等の方法により採取する。
　また、メタクリリル－ＣｏＡ合成反応は、上記の通り、デヒドラターゼをコードする遺伝子が導入された形質転換体を用いて、該形質転換体の存在下で、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ変換することもできる。デヒドラターゼをコードする遺伝子に加え、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを合成しうる酵素遺伝子群が同時に導入された形質転換体を作成し、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡの前駆体を原料にメタクリリル－ＣｏＡを製造してもよい。そうすることで、前述のようにバイオマス等から代謝工学（発酵）的にメタクリリル－ＣｏＡを効率よく製造することができる。
　メタクリリル－ＣｏＡの製造は、以下の方法で行うことができる。３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡの水溶液に又は懸濁液に、デヒドラターゼを接触させ、温度等の条件を制御しながら反応させる。反応により、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡが脱水されて、メタクリリル－ＣｏＡが生成する。
　３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを含む水溶液は、通常、緩衝液等の水性媒体で調製する。ここで、反応を円滑に進行させるために、浸透圧調整剤等によりモル浸透圧濃度および／またはイオン強度を制御することが可能である。浸透圧調整剤（ｐＨ緩衝液としても使用されることがある）としては、細胞内部等の溶液の浸透圧に対して等張または高張になるように調節する目的で加えられる水溶性物質であればよく、例えば、有機および無機の塩又は糖類であり、好ましくは塩である。塩は、好ましくは金属塩あるいは無機酸塩であり、より好ましくはアルカリ金属塩あるいは塩酸塩であり、例えば、リン酸とのアルカリ金属塩、アミノ酸あるいはトリスヒドロキシメチルアミノメタンのようにアミノ基と塩酸との塩、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが挙げられる。糖類は、好ましくは単糖類又はオリゴ糖類、より好ましくは単糖類又は二糖類であり、例えば、グルコース、スクロース、マンニトール等が挙げられる。浸透圧調整剤は１ｍＭ以上の濃度で添加することが好ましく、使用する生体細胞内の溶液と比して等張または高張になるように調節ことが特に好ましい。３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを含む水溶液中の浸透圧調整剤の濃度は、好ましくは１ｍＭ以上、より好ましくは５０ｍＭ以上である。
　反応液中の３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡの濃度は任意であり、特に制限はない。また、デヒドラターゼ活性を有する酵素の使用量または反応条件は、用いる原料に応じて適宜決定される。通常、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡの濃度は０．００００１～１０重量％の範囲に設定する。好ましくは、０．０００１～１重量％の範囲である。
　その他の反応温度又は反応時間等の各種条件は使用する原料、生体触媒の活性等により、適宜決定されるもので、特に制限はないが、通常５～８０℃で、１分～１週間反応させればよい。好ましくは、１０～７０℃で、１分～１２０時間であり、１０分以上がより好ましい。このような条件で反応が終了する条件を選択することが好ましい。反応液のｐＨについても反応が効率良く進行すれば特に限定されないが、例えば、ｐＨ４～１０の範囲、好ましくはｐＨ５．５～８．５である。
　本発明において、デヒドラターゼは、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡの変換率が５０％以上であることが好ましい。変換率は、より好ましくは５５％以上であり、さらに好ましくは６０％以上である。反応条件は、デヒドラターゼの諸性質に適した範囲になるよう適宜調整して実施することが好ましい。
　また、効率的に反応を進行させる目的で、あらかじめ、有機溶剤を添加した系で反応させることも可能である。有機溶媒としては、例えば直鎖状、分岐状又は環状の、飽和又は不飽和脂肪族炭化水素、飽和又は不飽和芳香族炭化水素等を単独で又は２種以上を混合して用いることができる。具体的には、例えば、炭化水素系溶媒（例えばペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、トルエン、キシレンなど）、ハロゲン化炭化水素系溶媒（例えば塩化メチレン、クロロホルムなど）、エーテル系溶媒（例えばジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、ジイソプロピルエーテル、ジブチルエーテル、ｔ－ブチルメチルエーテル、ジメトキシエタンなど）、エステル系溶媒（例えばギ酸メチル、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、プロピオン酸メチル）などが挙げられる。
　本発明の方法によって生成されたメタクリリル－ＣｏＡは、必要に応じて、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などによって、測定又は定量分析することができる。反応液からのメタクリリル－ＣｏＡの単離する場合は、カラム分離等の公知の単離法のより行うことができる。
　さらに、得られたメタクリリル－ＣｏＡはチオエステル結合を化学的あるいは酵素的に切断することで、メタクリル酸へ、あるいは、同じく、アルコールと反応させ、メタクリル酸エステルへ変換すること可能である。すなわち、本発明の方法は、メタクリリル－ＣｏＡからメタクリル酸あるいはメタクリル酸エステルを製造する工程を更に含むことができる。
　デヒドラターゼをコードする遺伝子に加えて、バイオマス等から３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを合成しうる酵素遺伝子群およびチオエステル結合に作用する酵素遺伝子を全て導入された形質転換体を作製することで、バイオマス等から代謝工学（発酵）的にメタクリル酸あるいはメタクリル酸エステルの直接合成が可能となる。
　このようにして得られたメタクリル酸あるいはメタクリル酸エステルはエネルギー、資源、環境に対する負荷を格段に低減することができ、石油製品を出発原料とした従来の化学製造品と比較して環境低負荷材料として非常に大きな社会的価値を有するものである。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例の範囲に限定されるものではない。
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＰＲ４　（ＮＢＲＣ１００８８７）由来デヒドラターゼ遺伝子が導入された大腸菌組換え体の作製
　＜ＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓからのゲノムＤＮＡの調製＞
　ＬＢ寒天培地培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイーストエキス、０．５％ＮａＣｌ、１．５％寒天）上で生育させたＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＰＲ４　（ＮＢＲＣ１００８８７）株を１０ｍｌのＬＢ液体培地（１％バクトトリプトン、０．５％バクトイ－ストエキス、０．５％ＮａＣｌ）に植菌し、３０℃にて３６時間振盪培養を行った。培養終了後、２ｍｌの培養液より菌体を遠心により回収し、Ｗｉｚａｒｄ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（プロメガ株式会社）を用いてゲノムＤＮＡ１００μｌを取得した。
　＜デヒドラターゼ発現用プラスミドの作製＞
　得られたゲノムＤＮＡを鋳型にして、デヒドラターゼをコ－ドすることが推定された遺伝子を含むＤＮＡ断片を、発現ベクターに容易に導入可能な制限酵素認識部位が付加された形となるようＰＣＲ法により調製した。
オリゴヌクレオチドプライマー：
ＭＭＡ－０３１：　５’－ＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＧＡＣＴＴＣＡＡＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣ　－３’（配列番号５）
ＭＭＡ－０３２：　５’－ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＴＴＣＧＡＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＣ　－３’（配列番号６）
反応液組成：
滅菌水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　２２　μｌ
２×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（タカラバイオ社製）　　２５　μｌ
ＭＭＡ－０３１（配列番号５）　　　　　　　　　　１　μｌ
ＭＭＡ－０３２（配列番号６）　　　　　　　　　　１　μｌ
ゲノムＤＮＡ　　　　　　　　　　　　　　　　　　１　μｌ
総量　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　５０　μｌ
温度サイクル：
９８℃　１０秒、５５℃　１５秒及び７２℃　１５０秒の反応を３０サイクル
　得られた約０．８ｋｂの増幅産物のバンドをＱＩＡｑｕｉｃｋ　Ｇｅｌ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）で精製した。精製したＤＮＡを制限酵素ＢｓｐＨＩ（オリゴヌクレオチドＭＭＡ－０３１中に切断認識部位が含まれる）およびＳｓｅ８３８７Ｉ（オリゴヌクレオチドＭＭＡ－０３２中に切断認識部位が含まれる）で切断した。アガロースゲル電気泳動により分離を行い、ゲルから目的のバンドをＧｅｌ／ＰＣＲ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＦＡＶＯＲＧＥＮ社製）を用いて精製し、３０μＬの滅菌水に溶出した。精製したＤＮＡ断片（５μＬ）、ＮｃｏＩおよびＳｓｅ８３８７Ｉで予め消化しておいたベクターｐＴｒｃ９９Ａ（１μＬ）、蒸留水（４μＬ）およびｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ｉ（ＤＮＡ　Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｖｅｒ．２（タカラバイオ（株）））（１０μＬ）を混合し１２時間、１６℃でインキュベ－トして、ＰＣＲ増幅産物とベクターをライゲーションした。
　大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ培地１ｍＬに接種し３７℃、５時間好気的に前培養し、この培養物０．４ｍＬをＳＯＢ培地４０ｍＬ（２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ－ストエキス、１０ｍＭＮａＣｌ、２．５ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＭｇＳＯ４、１ｍＭＭｇＣｌ２）に加え、１８℃で２０時間培養した。この培養物を遠心分離により集菌した後、冷ＴＦ溶液（２０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ－ＫＯＨ（ｐＨ６．０）、２００ｍＭ　ＫＣｌ、１０ｍＭ　ＣａＣｌ２、４０ｍＭ　ＭｎＣｌ２）を１３ｍＬ加え、０℃で１０分間放置した。その後、再度遠心し、上澄を除いた後、沈殿した大腸菌を冷ＴＦ溶液３．２ｍＬに懸濁し、０．２２ｍＬのジメチルスルフォキシドを加え０℃で１０分間放置した。
　こうして作製したコンピテントセル２００μＬに上記のライゲーション溶液を１０μＬ加え、０℃で３０分放置後、４２℃で３０秒間ヒ－トショックを与え、０℃で２分間冷却後、ＳＯＣ培地（２０ｍＭグルコ－ス、２％バクトトリプトン、０．５％バクトイ－ストエキス、１０ｍＭ　ＮａＣｌ、２．５ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＭｇＳＯ４、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２）１ｍＬを添加して３７℃にて１時間振盪培養した。
　培養後、１００μＬずつＬＢＡｍｐ寒天培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌ、１．５％寒天を含有するＬＢ培地）に塗布し、さらに３７℃で培養した。寒天培地上に生育した形質転換体コロニ－複数個を１．５ｍＬのＬＢＡｍｐ培地（アンピシリン１００ｍｇ／Ｌを含有するＬＢ培地）にて３７℃で一晩培養し、集菌後ＱＩＡｐｒｅｐ　Ｓｐｉｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてプラスミドＤＮＡを調製した。
　得られた組換えプラスミドＤＮＡについて、その塩基配列をＣＥＱ　ＤＴＣＳ　Ｑｕｉｃｋ　Ｓｔａｒｔ　Ｋｉｔおよび蛍光シ－ケンサＣＥＱ　２０００ＸＬ　ＤＮＡ　Ａｎａｌｙｓｉｓ（いずれもＢＥＣＫＭＡＮ　ＣＯＵＬＴＥＲ、米国）を用いて確認し、プラスミドｐＭＭＡ０１１と命名した。プラスミドｐＭＭＡ０１１を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、デヒドラターゼ発現組換え体を作製した。
Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ　ＰＲ４　（ＮＢＲＣ１００８８７）由来デヒドラターゼをコードする遺伝子発現大腸菌組換え体細胞抽出液を用いた、３－ヒドロキシイソ酪酸－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡの合成
　１）デヒドラターゼ活性を有する細胞破砕液の調製
　実施例１で得られたデヒドラターゼをコードする遺伝子が導入された大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＭＭＡ０１１を２ｍｌのＬＢＡｍｐ培地に植菌し、３７℃にて２４時間前培養を行った。培養液を０．１ｍｌ取り、１ｍＭ　ＩＰＴＧを含む１００ｍｌの同培地に加え、３７℃にて２４時間振盪培養した。得られた培養液から遠心分離（３，７００×ｇ、１０分間、４℃）により菌体を回収し、１０ｍＭリン酸－ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で２回洗浄した後、同緩衝液にＯＤ６３０ｎｍが６となるように懸濁した。
　得られた菌体懸濁液から１ｍｌを以下のようにして細胞破砕液を調製した。超音波式ホモジナイザーVP-300（タイテック、日本）を用いて、出力（振幅）：１５％／Ｏｎ：１秒，ｏｆｆ：１秒の条件で氷冷しながら５分間破砕した。
　２）デヒドラターゼをコードする遺伝子発現大腸菌組換え体細胞破砕液を用いたメタクリリル－ＣｏＡ合成反応
　１．０Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．０５ｍｌ、５ｍＭ　３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを０．２ｍｌ及び水０．６５ｍｌを混合したものに、上記のようにして得られたエノイルＣｏＡヒドラターゼ活性を有する細胞破砕液０．１ｍｌを加え、反応液１ｍｌに調整した。３７℃で３時間反応させ、以下に示すＨＰＬＣ条件にて分析を行った。その結果、０．６ｍＭのメタクリリル－ＣｏＡの生成を確認した。そのとき、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ残存量は０．３３ｍＭであった。３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへ変換率は、６５％（＝0.6/(0.33＋0.6）×100）であった。
　（ＨＰＬＣ分析条件）
カラム：Ｃａｐｃｅｌｌ　Ｐａｋ ＯＤＳ-ＵＧ１２０（ｓｈｉｓｅｉｄｏ），２．０ｍｍ×２５０ｍｍ
移動相：２５％ ＭｅＯＨ，５０ｍＭ Ｈ3ＰＯ4，ｐＨ５．７
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ　
カラム温度：４０℃　
検出：ＵＶ　２５４ｎｍ
注入量１０μｌ（反応溶液を移動相で１０倍希釈）
　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＡ０１（ＮＢＲＣ１０６０５２）由来デヒドラターゼをコードする遺伝子が導入された大腸菌組換え体の作製
　＜ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓからのゲノムＤＮＡの調製＞
　１０ｍｌのＬＢ液体培地で培養したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＡ０１株より、実施例１と同様にしてゲノムＤＮＡを取得した。
　＜デヒドラターゼ発現用プラスミドの作製＞
　下記のオリゴヌクレオチドプライマーを用い、上記で得られたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＡ０１（ＮＢＲＣ１０６０５２）株ゲノムＤＮＡを鋳型として、実施例１と同様にして、デヒドラターゼをコ－ドすることが推定された遺伝子を含むＤＮＡ断片（約０．８ｋｂ）を増幅した。
オリゴヌクレオチドプライマー：
ＭＭＡ－０２５：５’－ＧＧＴＣＡＴＧＡＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＧＡＡＣＣＣＴＡＣＡＡＧ－３’（配列番号７）
ＭＭＡ－０２６：５’－ＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＴＴＧＣＧＣＣＡＣＴＴＧＧＧＡＴＣ－３’（配列番号８）
　このＤＮＡ断片をＢｓｐＨＩ及びＳｓｅ８３８７Ｉで消化後、実施例１と同様にして、ベクターｐＴｒｃ９９Ａに組み込んだ。得られたプラスミドをｐＭＭＡ０１５と命名した。プラスミドｐＭＭＡ０１５を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、デヒドラターゼ発現組換え体を作製した。
　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＡ０１（ＮＢＲＣ１０６０５２）由来デヒドラターゼをコードする遺伝子発現大腸菌組換え体細胞抽出液を用いた、３－ヒドロキシイソ酪酸－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡの合成
　１）デヒドラターゼ活性を有する細胞破砕液の調製
　実施例３で得られたデヒドラターゼ遺伝子が導入された大腸菌組換え体ＪＭ１０９／ｐＭＭＡ０１５を実施例２の１）記載の方法と同様の方法を用いて培養及び菌体の回収を行い、菌体懸濁液を得た。得られた菌体懸濁液から実施例２の１）記載の方法と同様の方法を用いて細胞破砕液を調製した。
　２）デヒドラターゼ遺伝子発現大腸菌組換え体細胞破砕液を用いたメタクリリル－ＣｏＡ合成反応
　１．０Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．４）を０．０５ｍｌ、５ｍＭ　３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡを０．２ｍｌ及び水０．６５ｍｌを混合したものに、上記のようにして得られたエノイルＣｏＡヒドラターゼ活性を有する細胞破砕液０．１ｍｌを加え、反応液１ｍｌに調整した。３７℃で３時間反応させ、実施例２の２）に示すＨＰＬＣ条件にて分析を行った。その結果、０．６ｍＭのメタクリリル－ＣｏＡの生成を確認した。そのとき、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ残存量は０．３７ｍＭであった。３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへ変換率は、６２％（＝0.6/(0.37＋0.6）×100）であった。
配列番号５：ＭＭＡ－０３１
配列番号６：ＭＭＡ－０３２
配列番号７：ＭＭＡ－０２５
配列番号８：ＭＭＡ－０２６

Claims (11)

  1. 　デヒドラターゼの存在下、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ変換するメタクリリル－ＣｏＡの製造法。
  2. 　３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡからメタクリリル－ＣｏＡへの変換率が５０％以上であるデヒドラターゼを用いる、請求項１記載の製造法。
  3. 　ｐＨ４～１０の反応条件でメタクリリル－ＣｏＡへ変換する、請求項１又は２記載の製造法。
  4. 　温度５～８０℃の反応条件でメタクリリル－ＣｏＡへ変換する、請求項１から３のいずれか１項に記載の製造法。
  5. 　時間１分～１週間の反応条件でメタクリリル－ＣｏＡへ変換する、請求項１から４のいずれか１項に記載の製造法。
  6. 　３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡが、１ｍＭ以上の浸透圧調整剤を含む水性媒体で調製されたものである、請求項１から５のいずれか１項に記載の製造法。
  7. 　デヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する形質転換体の存在下で、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ変換する、請求項１から６のいずれか１項に記載の製造法。
  8. 　デヒドラターゼをコードする遺伝子が微生物由来の遺伝子である、請求項７に記載の製造法。
  9. 　微生物が、シュードモナス属又はロドコッカス属に属する微生物である請求項８に記載の製造法。
  10. 　デヒドラターゼが下記（ａ）～（ｆ）からなる群より選択される請求項７に記載の製造法。
    （ａ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質。
    （ｂ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、付加及び／又は挿入したアミノ酸配列からなり、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
    （ｃ）配列番号１または３で示すアミノ酸配列からなるタンパク質と９０％以上の同一性を示し、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
    （ｄ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡでコードされるタンパク質。
    （ｅ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
    （ｆ）配列番号２または４で示す塩基配列からなるＤＮＡと９０％以上の同一性を示すＤＮＡでコードされ、かつデヒドラターゼ活性を有するタンパク質。
  11. 　微生物由来のデヒドラターゼをコードする遺伝子を発現する形質転換体の存在下、１ｍＭ以上の浸透圧調整剤を含む水性媒体で調製された３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡ水溶液を、ｐＨ４～１０、温度５～８０℃、時間１分～１週間の反応条件で反応させることにより、３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡをメタクリリル－ＣｏＡへ変換率５０％以上で変換するメタクリリル－ＣｏＡの製造法。

     
PCT/JP2014/003934 2013-08-01 2014-07-25 メタクリリル－ＣｏＡの製造法 WO2015015784A1 (ja)

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