WO2015003531A1 - 利用核酸裂解后片段分子量进行物种鉴定的方法 - Google Patents

利用核酸裂解后片段分子量进行物种鉴定的方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2015003531A1
WO2015003531A1 PCT/CN2014/077870 CN2014077870W WO2015003531A1 WO 2015003531 A1 WO2015003531 A1 WO 2015003531A1 CN 2014077870 W CN2014077870 W CN 2014077870W WO 2015003531 A1 WO2015003531 A1 WO 2015003531A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
species
nucleic acid
similarity cluster
cluster
acid cleavage
Prior art date
Application number
PCT/CN2014/077870
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
凌庆东
钟牧桦
郑瑞通
Original Assignee
旦华科技有限公司
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 旦华科技有限公司 filed Critical 旦华科技有限公司
Priority to EP14823083.2A priority Critical patent/EP3021118B1/en
Priority to CN201480037258.7A priority patent/CN105358974B/zh
Priority to US14/903,258 priority patent/US20160153060A1/en
Publication of WO2015003531A1 publication Critical patent/WO2015003531A1/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C12Q1/708—Specific hybridization probes for papilloma
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6872—Methods for sequencing involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16C—COMPUTATIONAL CHEMISTRY; CHEMOINFORMATICS; COMPUTATIONAL MATERIALS SCIENCE
    • G16C99/00—Subject matter not provided for in other groups of this subclass

Definitions

  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • DNA microarray Although many other methods have been developed in the future, such as: DNA microarray, Real time PCR, next-generation DNA sequencing technology, etc., but there are technical instability leading to uncertainty of results (such as: DNA microarray, Real time PCR) and high Cost (eg: next generation DNA sequencing).
  • DNA microarray typing method of human papillomavirus as an example, when the DNA probe is designed, the hybridization reaction causes the non-specificity to increase and the misjudgment is caused by the higher similarity of the DNA sequence.
  • the type of detection at the time of product design is The limitation of the virus, the high variability of virus development, the inability to finalize the original method, etc., has become an urgent problem to be solved.
  • said known species and said another said known species are selected from the species of said high similarity cluster.
  • the nuclease is RNase.
  • the detected species is a microorganism.
  • the microorganism is a bacterium or a virus.
  • the detected species is an animal.
  • multitype infection is a common phenomenon in HPV epidemiology, it refers to an individual infected with HPV of many different viral types, and HPV types infected by individuals at different time periods can also It is different. Therefore, it is possible to contain a plurality of HPV virus types in the same sample, which further increases the difficulty in identifying the HPV virus type, and thus the present invention provides a method for solving this problem.
  • the method compares each HPV virus type in the database with the detected HPV virus type, and distinguishes a cluster of virus types with high similarity from the database, and the virus type in the high similarity cluster It is a highly probable single or complex infection virus type. When there is only one HPV virus type in a high similarity cluster, it is a single virus type infection. When there are multiple HPV virus types in a high similarity cluster, it is a composite type. infection.
  • Step (S74) calculating an average value of the ratios N/M of all virus types in the high similarity cluster as a center of a new high similarity cluster, and calculating all virus types in the low similarity cluster The average of the ratios N/M is taken as the center of the new low similarity cluster;
  • Step (S76) if the difference between the virus type and the center of the high similarity cluster is smaller than the difference of the center of the low similarity cluster, the virus type is reassigned to The high similarity cluster; conversely, if the difference between the virus type and the center of the low similarity cluster is smaller than the difference of the center of the high similarity cluster, the virus Type is reassigned to the low similarity cluster;
  • Table 8A and Table 8B shows the similarity ratio of each virus type to the detected virus in the database, and the cluster to which it belongs.
  • 0 in the cluster column represents a cluster of high similarity
  • X represents a cluster of low similarity.
  • HPV006, HPV070, HPV075, HPV130, HPV004 and their similarities are 88.89%, 82.61%, 60.87%, respectively. 57. 89%, 57.89%.
  • HPV075 60. 87%) was randomly taken as the high similarity cluster center and HPV130 (57. 89%) as the low similarity cluster center.
  • HPV006 88. 89%)
  • HPV070 82.61%
  • HPV075 60.87%)
  • HPV130 57. 89%)
  • HPV004 57. 89%)
  • the average value of the similarity of each virus type in the high similarity cluster is calculated to be 77. 46% as a new high similarity cluster center
  • the similarity of each virus type in the low similarity cluster The average of degrees is 57.
  • the method of species classification of the present invention may further comprise a deduplication step. This is done by omitting the comparison of the nucleic acid cleavage fragments of the HPV virus type with low variability in the database to reduce the ratio of the interference to the similarity ratio N/M.
  • the N/M ratio of a truly similar virus type will not be greatly affected by this deduplication.
  • the N/M ratio of the less similar virus type will be greatly reduced, and this step is used to highlight each The difference in similarity of the virus type, by which the accuracy of the similarity is increased.
  • FIG. 3 is a flow chart of another embodiment of the species typing identification method of the present invention, which includes a deduplication step.
  • the implementation of the deduplication step is as follows:
  • Table 8A and Table 8B shows the similarity ratio of each virus type to the detected virus in the database, the similarity ratio after the cluster and the deduplication step.
  • patient 1 the most similar virus type HPV006 (88. 89%) and the second highest similarity virus type HPV070 (82.61%)
  • the nucleic acid cleavage fragments are compared, confirming the same nucleic acid cleavage fragment between the two, while in the calculation
  • the ratio of HPV006 is N/M
  • the nucleic acid fragment which is identified as the same is omitted, and the similarity ratio N/M 83.33% after re-reduction is recalculated.
  • the virus of the highest degree of similarity 1 ⁇ 070 (82.61%) was compared with the nucleic acid cleavage fragment of the most similar viral HPV006 (88. 89%), confirming the same nucleic acid cleavage fragment between the two, and
  • the ratio N/M of HPV070 the nucleic acid cleavage fragment which was identified as the same was omitted, and the similarity ratio N/M 76.47% after deduplication was recalculated.
  • the third highest virus type HPV075 (60.87%) was compared with the most similar viral type HPV006 (88. 89%), and the same nucleic acid cleavage fragment was confirmed between the two.
  • the ratio of HPV075 is N/M
  • the nucleic acid cleavage fragment which is identified as the same is omitted, and the similarity ratio N/M 47.06% after deduplication is recalculated.
  • the viral HPV130 (57. 89%) with the fourth highest similarity was compared with the nucleic acid cleavage fragment of the most similar viral HPV006 (88.
  • HPV006's similarity ratio N/M decreased by only 5.56% after de-repetition, and HPV070's similarity ratio N/M decreased by only 6.4% after de-sequencing, however HPV075, HPV130 and The similarity ratio N/M of the HPV004 after de-sequencing was decreased by 13.81%, 19.43% and 15.03%, respectively. It can be seen that the similarity of truly similar virus types is less likely to be drastically reduced by the effects of deduplication.

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Computing Systems (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

一种利用核酸裂解片段的分子量进行物种分型鉴定的方法，包含以下步骤：进行一聚合酶连锁反应及一核酸酶裂解反应，将被检测物种的核酸序列裂解产生分子量大小不同的核酸裂解片段，以质谱仪检测各被检测核酸裂解片段的分子量大小，将被鉴定物种的各被检测核酸裂解片段的分子量大小逐一与一资料库中预存的已知物种的数个已知核酸裂解片段的分子量比较，以确认两者之间相同的核酸裂解片段数量N，以及计算认定为相同的核酸裂解片段的数量N相对于已知物种的核酸裂解片段的总数M的一比值N/M，以所述比值N/M代表被检定物种与已知物种的一核酸序列相似度。

Description

利用核酸裂解后片段分子量进行物种鉴定的方法 技术领域
本发明涉及一物种鉴定方法， 更具体而言是根据核酸裂解后片段的分子 量大小， 来进行物种鉴定的方法。
背景技术
生物物种或同种异型的辨识大部分都是以 DNA序列定序的方法进行， 此方 法在临床应用时会遇到过程繁杂， 效率低及费用高的问题。 另一种方法是使 用限制性片段长度多态性 (RFLP) , 然而此方法的精确性却不够高， 因为在胶 体电泳时， 相近长度的核酸裂解片段将无法轻易的被分辨出来， 或是相同长 度但不同序列的核酸裂解片段也无法由胶体电泳而分辨出来。 虽然后续有很 多其他的方法被开发， 例如： DNA microarray, Real time PCR , 次世代 DNA 定序技术等，但是都存在技术不稳定导致结果的不确定（如： DNA microarray, Real time PCR)及高费用（如： 次世代 DNA定序）。 以人类乳突病毒 DNA microarray分型方法为例， DNA探针设计时由于 DNA序列的相似度较高区域导 致杂交反应使得非专一性增加而误判； 另外， 当初产品设计时之检测类型的 拘限， 病毒发展之高变异性使得原方法无法定型等已成为目前急需解决的问 题。
发明内容
本发明之目的， 在于提供一种物种分型鉴定的方法， 其利用核酸裂解后 的片段分子量， 而非利用胶体电泳或探针杂合反应， 因此本方法稳定性及准 确度高， 不会因非专一性的杂合而发生误判， 在辨识核酸裂解片段时， 精准 度非常高，一碱基的些微大小差距都能被备侦测， 由于不同分子的分子量皆 不同， 因此同样核酸裂解片段长度， 但是不同的序列， 皆能被本发明所提供 的方法所所侦测。 此外在本发明的方法操作歩骤简便， 费用低廉且具有高效 为达上述目的并解决习知技术之缺点， 本发明提供一种物种分型鉴定的 方法， 包括以下歩骤：
(S 10)进行一聚合酶连锁反应， 通过至少一对特定引子， 扩增一被检测物 种的一段核酸序列；
(S20)进行一核酸酶裂解反应， 通过至少一个核酸酶， 将所述被检测物种 的所述核酸序列裂解， 而产生数段分子量大小不同的被检测核酸裂解片段； (S30)以一质谱仪检测各被检测核酸裂解片段的分子量大小；
(S40)将所述被鉴定物种的各被检测核酸裂解片段的分子量大小逐一与 一资料库中预存的一已知物种的数个已知核酸裂解片段的分子量比较；
(S50)当所述被检测核酸裂解片段与其中一个所述已知核酸裂解片段两 者的分子量之间相差小于一特定道尔吞值时， 则认定两者为相同的核酸裂解 片段； 以及
(S60)计算所述认定为相同的被检测核酸裂解片段的数量 N相对于所述已 知物种的已知核酸裂解片段的总数 M的一比值 N/M , 并以所述比值 N/M代表 所述被检定物种与所述已知物种的一核酸序列相似度。
根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 所述特定道尔吞值为 2道尔吞。 根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 当所述歩骤（S40)中的资料库中 的已知物种为 2个或以上时， 在歩骤（S60)后进一歩包含以下歩骤：
(571)从所述资料库中多个物种的多个所述比值 N/M中， 随机取一较大的 比值， 做为一高相似度丛集的中心， 随机取一较小的比值， 做为一低相似度 丛集的中心；
(572)计算所述所有物种的所述比值 N/M与所述高相似度丛集的中心及所 述低相似度丛集的中心的差值；
(573)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似 度丛集的中心的所述差值为小， 则所述物种被分配到所述高相似度丛集； 相 反地， 若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度丛 集的中心的所述差值为小， 则所述物种被分配到所述低相似度丛集；
(574)计算出所述高相似度丛集中所有物种的所述比值 N/M的平均值做为 新的高相似度丛集的中心， 计算出所述低相似度丛集中所有物种的所述比值 N/M的平均值做为新的低相似度丛集的中心；
(575)再次计算所述所有物种的所述比值 N/M与所述高相似度丛集的中心 及所述低相似度丛集的中心的差值；
(576)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似 度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种重新被分配到所述高相似度丛集； 相反地， 若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度 丛集的中心的所述差值为小， 则所述物种重新被分配到所述低相似度丛集； 及
(577)当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种所之 前相同， 则所述高相似度丛集中的物种即判断为所述被检测检物种， 而所述 低相似度丛集中的物种即判断为不是所述被检测物种；
其中当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种与之前 不相同， 则重复歩骤（S74)、歩骤（S75)及歩骤（S76)直到被分配到所述高相似 度丛集及所述低相似度丛集的物种所之前相同， 则所述高相似度丛集中的物 种即判断为所述被检测检物种， 而所述低相似度丛集中的物种即判断为不是 所述被检测物种。
根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 所述已知物种及所述另一所述 已知物种接选自于所述高相似度丛集中的物种。
根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 所述第一特定值为 χχ%。
根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 在所述歩骤（S40)前， 先将资料 库中预存的所述已知物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小与资料库中预 存的另一已知相近物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小比较， 以确定两 者之间具有那些重复的已知核酸裂解片段；接着在进行歩骤（S40)时，使所述 被检测物种的各被检测核酸裂解片段省略执行与所述重复的已知核酸裂解片 段的比较作业。
根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 所述核酸序列为 DNA序列。 根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 在所述歩骤（S20)之前， 先进行 一转录反应， 将 DNA序列转录为 RNA序列。
根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 所述核酸酶为 RNase。
根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 所述 RNase为 RNase A , 其针对 所述 RNA序列中的 T位进行点裂解。
根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 所述被检测物种为微生物。 根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 所述微生物为细菌或病毒。 根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 所述被检测物种为动物。
根据本发明的一个实施例的进一歩特征， 所述被检测物种为人类。 國删
本文所述的本发明， 仅作为示例， 参考附图， 其中：
图 1为本发明的物种分型鉴定方法的一实施例的流程图。
图 2为本发明的物种分型鉴定方法中， 所述的丛集分析的流程图。 图 3为本发明的物种分型鉴定方法的另一实施例的流程图， 其中包含一 去重复歩骤。
图 4A-4B为 HPV病毒型案例分布图， 其显示分别以序列定序方法及本发 明的物种分型鉴定方法鉴定 HPV案例的结果。
雄 现在仅用参考下面非限制性的实施力的方式进一歩描述本发明。 但是应 当理解， 下面的实施例仅仅是用做为例证的， 不应以任何方式当作上述本发 明总体的限制。 在此一实施例中， 利用分型鉴定人类乳突病毒 HPV来解释本 发明所提供的方法， 然而此方法也可以被运用于其他物种的分型鉴定， 例如 微生物 (细菌或病毒)、 动物、 人类 (例如基因突变的检测）。
人类乳突状病毒 (HPV) :
人类乳突病毒 （Human Papil lomavirus , HPV) 是一种 DNA病毒， 属于 乳头瘤病毒科乳头瘤病毒属。 该类病毒感染人体的表皮与粘膜组织， 目前约 有 Π0种类型的 HPV被判别出来， 有些类型的 HPV入侵人体后会引起疣或癌 症， 但其他则没有任何症状。 大概有 30到 40类型的 HPV会透过性行为传染 到生殖器及周边皮肤， 而其中又有些会引起性器疣。 若反复感染某些高危险 性， 且又没有疣等症状的 HPV类型， 可能发展成为癌前病变， 甚至是侵袭性 癌症。 经研究 99. 7%的子宫颈癌， 都是因感染 HPV所造成。 依照危险度来分， 像是 HPV-6、 HPV-1 K HPV-4K HPV_42、 HPV_43、 HPV-44, 这些为低危险型 HPV; 至于 HPV-16、 HPV- 18, HPV-3 K HPV-33等高危险型 HPV, 易造成子宫 颈癌。 虽然 HPV是造成子宫颈癌的主因， 但不是所有的 HPV都会发展成 CIN 和子宫颈癌， 因此鉴定 HPV的类型在临床诊断上显得十分重要。 然而多型别 感染在 HPV流行病学中是一种非常常见的现象， 且一个体在不同的时间段所 感染的 HPV型别可以有所不同， 因此在一检体中可能包含多种 HPV的病毒， 而增加 HPV的分型鉴定的困难度。 而本发明中的一技术特征是在于提供一能 够从一检体中鉴定出多个型别的病毒的方法。 请参考图 1， 其为本发明的物 种分型鉴定方法的一实施例的流程图。 本发明的所提供的方法， 包含以下歩 骤： （S10) 聚合腾连锁反应 （polymerase chain reaction, PCR) 、 (S15) SAP (shrimp alkal ine phosphatase)消化酶反应、 （S20)转录作用及核 酸酶裂解反应、 （S25)纯化、 （S30)质谱仪检测核酸裂解片段大小、 （S40)比较 核酸裂解片段、 （S50)确认相同核酸裂解片段、 （S60)计算代表相似度的比值 N/M、 （S70)丛集分析、 （S35、 S40 ' )去重复歩骤， 如图 1所示。
聚合嗨连锁反应 (polymerase chain react ion, PCR)：
以市售 DNA萃取套件萃取 DNA , 例如 QIAGEN Blood Mini Kit®。 先以裂 解溶液（Lys i s buffer)溶解从患者内皮粘膜取样的细胞， 使 DNA从细胞内游 离出来。 在特定条件下 DNA通过萃取套件所附的管柱（column)时会与管柱内 的一硅胶膜（si l ica-gel membrane)结合而留在膜上， 此时以酒精及冲洗液 (wash buffer)清洗， 再离心后去除杂质， 最后以纯水将 DNA 溶出， 而萃取 DNA , (详细的萃取歩骤请参阅 DNA萃取套件的使用说明书）。 以上 DNA萃取方 法为一实施范例， 各种 DNA萃取方法皆可以被利用于本法明的物种分型鉴定 方法， 因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
萃取 DNA后， 再以 PCR反应侦测是否有 HPV的 DNA片段， 本发明中， 使 用 MY09引子（primer)及 MYl 1引子（primer)扩增 L 1外鞘（casp id)蛋白的基因 中的一特定 DNA片段作为目标， 此片段为低变异性的一片段， 因此所述引子 能在各种不同型态的 HPV的 DNA中， 辨识并扩增所述片段， 此外此引子还包 含 T7序列，其用以做为之后转录作用（transcript ion)的启动子（promoter)。 所述引子的正向（forward)序列为： 所述引子的反向（reverse)序列为： 之后， 以市售的 PCR套件进行 PCR反应， 例如 Takara Ex Taq Hot Start Vers ion Kit®。 每个单一反应的总体积为 25 uL， 而各反应试剂及样本的浓 度和体积， 如表 1所示， 其中 10X缓冲液含有 20 nM Mg2+。
表 1 :
Figure imgf000008_0001
浓度 2.5 nM 5 units/ uL 最终浓度 依样本不同
0.2-1.0 uM 而有差异
体积 2.5 uL 2 uL 0.125 uL 5 uL 依引子的体
积有差异 依照以上表配制各反应试剂及样本的浓度和体积， 进行 35循环的 PCR, 而获得反应后 PCR 产物， 其中变性反应（denature)、 粘合反应（annealing) 及延伸反应（extension)的温度如表二所： /」、
表 2:
Figure imgf000009_0002
同时另外以相同 PCR方法，扩增 Beta-actin基因中的一片段，做为阳性 对照组（positive control)进行监控， 确认实验过程和采样品质。 在 PCR反 应完成后， 取得 PCR产物， 使用毛细管电泳以确认 PCR产物中包含所述 DNA 片段， 例如 E-gene HDA GT12 Capillary Electrophoresis®。 再以市售软体 分析， 例如 QUAxcel Screening Gel®, 结果如表三所示。 以上聚酶连锁反应
(PCR)为一实施范例， 各种聚酶连锁反应（PCR)皆可以被利用于本法明的物种 分型鉴定方法， 因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
表 3:
Figure imgf000009_0003
表 3中， 片段 3为所述 L1外鞘（caspid)蛋白的 DNA片段。 SAP消化反应：
SAP (shrimp alkaline phosphatase)虾碱性磷酸酶， 被利用于将 DNA的 5' 端的磷酸根去除， 以避免 DNA的 5' 端连接至同一 DNA片段的 3' 端， 而 维持 DNA片段为线状。 其所用的 SAP消化反应的反应试剂的浓度及体积， 如 表四所示。
Figure imgf000009_0001
最终浓度 每一反应 96孔洞的微孔板
体积 (microp late)的体积
RNase-free纯水 3. 4 408. 0
SAP (lU/ul) 0. 04U/ul 0. 6 72. 0
总体积 4 480. 0
依照以上表配制各反应试剂的浓度和体积形成 SAP混合溶液，将上述 4ul SAP混合溶液加入 384孔盘中， 再加入 2. 5ul的 PCR 产物。 以胶膜封好 384 孔盘后震荡， 以 1000RPM离心一分钟。 加热至 37° C进行 20分钟， 加热至 85 ° C进行 10分钟， 冷却至 4° C以保存 SAP消化反应后所得到的产物。 以上 SAP消化反应为一实施范例， 各种 SAP消化反应皆可以被利用于本法明 的物种分型鉴定方法， 因此不应以此限制本发明的申请专利范围。
转录作用及核酸酶裂解反应：
利用 T7 DNA&RNA聚合酶于 T7启动子（promoter)处启动体外转录作用（in vitro transcription) , 反应使用去氧三磷酸胞苷（dCTP)与三磷酸尿苷、 三 磷酸腺苷及三磷酸鸟苷（UTP， ATP, GTP)作为聚合原料合成去氧与非去氧核醣 核酸混合产物。 在同一时间 RNase A 酵素在产物上的尿嘧啶（U)位置上进行 RNA 核酸酶裂解反应， 将 RNA切成不同大小的核酸裂解片段， 由于相同病毒 型的核酸序列相同或极相似， 因此相同病毒型的核酸序列经过 RNase核酸酶 裂解反应后会产生相同或相似的核酸裂解片段大小。
上述的转录作用及裂解反应的实施方式， 如下所表述。 先依照表 5所示 的各反应试剂的浓度及体积， 配制一转录裂解混合液。
表 5 :
Figure imgf000010_0001
5X 聚合酶缓冲液 IX 0. 9 108. 0
Cleavage Mix NA 0. 12 14. 4
DTT lOOmM 5. 6mM 0. 14 16. 8
T7 RNA polymerase 4. 4 U/反应 0. 22 26. 4
RNase A 0. 08mg/ml 0. 7ng/ul 0. 04 4. 8
Total Volume 2. 5 300. 0 将上述 2. 5ul的转录裂解混合液加入 384孔盘的各孔洞中。将 2ul的 SAP 消化反应后产物加入 384孔盘的各孔洞中。 以胶膜封好 384孔盘后震荡， 以 1000RPM离心一分钟。 加热至 37 °C进行 3小时， 冷却至 4°C保存所得到的产 物。 以上转录作用及核酸裂解反应为一实施范例， 各种转录作用及核酸裂解 反应皆可以被利用于本法明的物种分型鉴定方法， 因此不应以此限制本发明 的申请专利范围。
纯化：
使用刮勺将 6 mg清洁树脂（Clean Resin)填入凹孔板（dimp le plate) , 静置 20-30分钟， 使之稍微干燥。 在 384孔盘的各孔洞中加入 21. 5ul水，及 7ul的转录裂解产物， 再离心 30秒。 将凹孔版倒扣到 384孔盘上， 将清洁树 脂填入各孔洞中。 以胶膜封好 384孔盘后震荡， 以 1000RPM离心一分钟。 旋 转反应 15分钟后， 以 3200 g 离心 5分钟， 准备进行点片。 以上纯化歩骤为 一实施范例， 各种纯化歩骤皆可以被利用于本法明的物种分型鉴定方法， 因 此不应以此限制本发明的申请专利范围。
质谱仪检测核酸裂解片段大小：
纯化后的产物使用纳升点样仪（nanodi spenser®, 美国 Sequenom公司）， 点至含基质的芯片（SpectroCHIP ®， 美国 Sequenom公司）， 并使用飞行时间 质谱仪激发核酸裂解片段群于真空电场中飞行， 通过感应器撷取各核酸裂解 片段的分子量讯号， 而衍伸出各核酸裂解片段的分子量大小。 之后以一预建 的核酸裂解片段资料库与被检测物种的核酸裂解片段进行比较分析和分型结 果判断。
核酸裂解片段资料库：
在传统的方法中， 例如以胶体电泳分离不同核酸裂解片段大小， 最多只 能分离大小差距在 1-5个碱基以上的两核酸裂解片段， 相同碱基数但是不相 同序列的两核酸裂解片段， 在胶体电泳中无法被分离。 而在本发明中， 是利 用质谱仪测定各核酸裂解片段的分子量， 而非利用胶体电泳来测定核酸咧解 片段的大小。 由于各种核苷酸皆有其各自分子量， 如表 6所述。
表 6 :
Figure imgf000012_0001
因此不但不同大小的核酸裂解片段会有不同大小的分子量， 而且不同序 列的片段也会有不同大小的分子量， 由此可知， 使用质谱仪做为核酸裂解片 段的侦测方法将能精密地分辨差距在 1个碱基以内的两核酸裂解片段， 甚至 是碱基数目相同但是序列不相同的两核酸裂解片段， 因此其精密度将会远大 于传统的胶体电泳的方法。
这种 HPV病毒型的序列可以从美国 NIH (Nat ional Inst itutes of Health) 的 NIAID (Nat ional Inst itute of Al lergy and Infect ious Di sease)网站 (http： / / pave, niaid. nih. gov/ index. htmlffprototypes^Ptype^uman)査得 0 经由表 6中的各种核苷酸的分子量，以及 RNase会在尿嘧啶（U)位置上进 行 RNA裂解的特性（相对应于 HPV的 DNA的胸腺嘌呤（T)的位置），可以推算出 各 HPV病毒型在经过核酸酶裂解反应之后， 各核酸裂解片段的分子量， 将各 HPV病毒型的各核酸裂解片段分子量储存而建立起一 HPV核酸裂解片段分子 量的资料库， 如表 7A至 7B所示。 图 2显示本发明中所述资料库的各 HPV病 毒型的核酸裂解片段大小。
表 7A :
表 7B :
病毒型 HPV011 HPV012 HPV013 HPV014 HPV015 HPV016 HPV017 HPV018 HPV019 HPV020 片段 1 1907. 191 1907. 191 1963. 215 1891. 192 1931. 216 1851. 167 1931. 216 1851. 167 1891. 192 1907. 191 片段 2 1931. 216 1931. 216 1995. 214 1907. 191 1963. 215 1931. 216 1979. 214 1891. 192 1907. 191 1923. 19 片段 3 1963. 215 1947. 216 2252. 4 1947. 216 2252. 4 1971. 241 1995. 214 1923. 19 1931. 216 1931. 216 片段 4 2003. 24 1963. 215 2268. 399 1963. 215 2276. 425 2180. 377 2276. 425 1931. 216 1963. 215 1947. 216 片段 5 2212. 376 1971. 241 2276. 425 1971. 241 2348. 449 2236. 401 2292. 425 1963. 215 2228. 375 1971. 241 片段 6 2268. 399 2196. 376 2292. 425 2220. 402 2549. 611 2276. 425 2332. 449 1987. 24 2236. 401 1979. 214 片段 7 2332. 449 2236. 401 2380. 447 2236. 401 2621. 635 2300. 451 2525. 586 2003. 24 2260. 426 2196. 376 片段 8 2364. 448 2260. 426 2541. 585 2260. 426 2653. 633 2332. 449 2597. 609 2220. 402 2276. 425 2236. 401 片段 9 2380. 447 2276. 425 2621. 635 2276. 425 2677. 658 2348. 449 2637. 634 2236. 401 2316. 45 2276. 425 片段 10 2637. 634 2332. 449 2653. 633 2324. 423 2878. 821 2364. 448 2677. 658 2268. 399 2661. 659 2597. 609 片段 11 2653. 633 2613. 609 2661. 659 2661. 659 2910. 82 2509. 587 2709. 657 2292. 425 2677. 658 2621. 635 片段 12 2709. 657 2637. 634 2830. 77 2693. 658 2926. 819 2541. 585 2854. 796 2308. 424 2830. 77 2661. 659 片段 13 2798. 772 2653. 633 2854. 796 2878. 821 3609. 264 2565. 611 2910. 82 2348. 449 2870. 795 2693. 658 片段 14 2838. 796 2677. 658 2870. 795 2886. 794 3898. 449 2597. 609 3898. 449 2846. 77 2910. 82 2886. 794 片段 15 2926. 819 2854. 796 3336. 078 3513. 215 3913. 2 2653. 633 3913. 2 2910. 82 2926. 819 2910. 82 片段 16 3159. 98 2910. 82 3569. 239 3818. 4 4725. 98 2774. 746 4171. 635 2942. 818 2934. 845 2950. 844 片段 17 3649. 288 2942. 818 3913. 2 3913. 2 8339. 261 2870. 795 4822. 028 2950. 844 2966. 844 3513. 215 片段 18 3778. 375 3913. 2 4203. 633 3914. 448 2878. 821 7198. 52 3665. 288 3159. 98 3913. 2 片段 19 3890. 423 3970. 472 4798. 003 4163. 609 2990. 869 3913. 2 3665. 288 5745. 608 片段 20 3913. 2 4750. 005 4942. 102 4782. 004 3159. 98 4509. 857 3913. 2 5905. 706
Figure imgf000014_0001
数据分析：
将被检测的 HPV病毒型的各核酸裂解片段的分子量大小逐一与资料库中 预存的各已知 HPV病毒型的数个已知核酸裂解片段的分子量比较。 当所述被 检测的 HPV病毒型的各核酸裂解片段与其中一个所述已知核酸裂解片段两者 的分子量之间相差小于一特定可容忍误差时， 在此时施例中， 设定该特定容 忍误差为 2道尔吞值， 则认定两者为相同的核酸裂解片段。 之后， 计算一比 值 N/M ,其中被认定为相同的核酸裂解片段的数量 N (做为该比值的分子 N)相 对于资料库中一已知 HPV 病毒型的核酸裂解片段的总数 M (作为该比值的分 母）。并以所述比值 N/M代表所述被检定物种与所述已知物种的一核酸序列相 似度， 相似度越高者则样本中被鉴定的病毒越有可能此病毒型。
请参阅表 8A及表 8B， 其为本发明的物种分型鉴定方法运用于 HPV病毒 型的鉴定时， 病毒型鉴定结果的范例， 其显示资料库中各病毒型与被检测病 毒的相似度比值。 病患 1 对于 HPV006、 HPV070、 HPV075 的相似度分别为 88. 89%、 82. 61%、 及 60. 87% , 即代表 HPV006、 HPV070、 HPV075的各核酸裂 解片段中， 分别有 88. 89%、 82. 61%、 及 60. 87%的核酸裂解片段是与病患 1 带有的 HPV的核酸裂解片段相同。 因此病患 1所带有的 HPV病毒型最有可能 为 HPV006 , HPV070次之， HPV075的可能性则较低。
表 8A
病患 1 病患 2
N/M (%) N/M (%)
N/M (%) N/M (%)
病毒型 丛集 去重复后 病毒型 丛集 去重复后 相似度 相似度
相似度 相似度
HPV006 88. 89 0 83. 33 HPV061 85 0 80
HPV070 82. 61 0 76. 47 HPV130 42. 11 X 21. 43
Figure imgf000015_0001
表 8B
Figure imgf000015_0002
HPV011 54. 55 X HPV072 X
HPV145 54. 55 X HPV038 40 X
HPV067 54. 17 X HPV075 39. 13 X
HPV037 52. 63 X HPV084 38. 89 X
HPV004 52. 63 X HPV133 38. 1 X
HPV130 52. 63 X HPV012 38. 1 X
HPV076 52 X HPV037 36. 84 X
HPV035 50 X HPV150 36. 84 X
HPV016 48 X HPV071 36. 84 X
HPV049 47. 83 X HPV001 36. 36 X
丛集分析：
由于多型别感染在 HPV流行病学中是一种常见的现象， 其指的是一个个 体被感染了多种不同病毒型的 HPV, 且个体在不同的时间段所感染的 HPV型 别也可以有所不同。 因此在同一检体中有可能含有多种 HPV病毒型， 更增加 了辨识 HPV病毒型的的困难度， 于是本发明提供了一方法用于解决此问题。 所述的方法将资料库中的各 HPV病毒型与被检测的 HPV病毒型别比较， 从资 料库中区分出具高相似度的病毒型的丛集， 在所述高相似度丛集内的病毒型 别即为高可能性的单一或复合感染的病毒型， 当高相似度丛集内的 HPV病毒 型只有一个即为单一病毒型感染， 当高相似度丛集内的 HPV病毒型有多个即 为复合型感染。
请参阅图 2， 其为本发明的物种分型鉴定方法中， 所述的丛集分析的流 程图。 以下为高相似度丛集的筛选方法（S70)所包含之歩骤：
歩骤（S71)从所述资料库中多个病毒型的多个所述比值 N/M中，随机取其 中一较大的比值，做为一高相似度丛集的中心， 并随机取其中一较小的比值， 做为一低相似度丛集的中心；
歩骤（S72)计算所述所有病毒型的所述比值 N/M 与所述高相似度丛集的 中心及所述低相似度丛集的中心的差值；
歩骤（S73)若所述病毒型与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述 低相似度丛集的中心的所述差值为小， 则所述病毒型被分配到所述高相似度 丛集； 相反地， 若所述病毒型与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述 高相似度丛集的中心的所述差值为小， 则所述病毒型被分配到所述低相似度 丛集；
歩骤（S74)计算出所述高相似度丛集中所有病毒型的所述比值 N/M 的平 均值做为新的高相似度丛集的中心， 计算出所述低相似度丛集中所有病毒型 的所述比值 N/M的平均值做为新的低相似度丛集的中心；
歩骤（S75)再次计算所述所有病毒型的所述比值 N/M 与所述高相似度丛 集的中心及所述低相似度丛集的中心的差值，
歩骤（S76)若所述病毒型与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述 低相似度丛集的中心的所述差值为小， 则所述病毒型重新被分配到所述高相 似度丛集； 相反地， 若所述病毒型与所述低相似度丛集的中心的所述差值较 所述高相似度丛集的中心的所述差值为小， 则所述病毒型重新被分配到所述 低相似度丛集；
歩骤（S77)当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的病毒 型所之前相同， 则所述高相似度丛集中的病毒型即判断为所述被检测检体中 可能具有的病毒， 而所述低相似度丛集中的病毒型即判断为不是所述被检测 检体中的病毒；
其中当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的病毒型所之 前不相同， 则重复歩骤（S74)、歩骤（S75)及歩骤（S76)直到被分配到所述高相 似度丛集及所述低相似度丛集的病毒型所之前相同， 则所述高相似度丛集中 的病毒型即判断为所述被检测检体中可能具有的病毒， 而所述低相似度丛集 中的病毒型即判断为不是所述被检测检体中的病毒。
请参阅表 8A及表 8B , 其显示资料库中各病毒型与被检测病毒的相似度 比值、 所属丛集， 图中丛集栏的 0代表高相似度丛集， X代表低相似度丛集。 以患者 1的 5个最高相似度的病毒型做为例子， 其分别为 HPV006、 HPV070、 HPV075、HPV130、HPV004，而其相似度分别为 88. 89%, 82. 61%、 60. 87%, 57. 89%、 57. 89%。 在歩骤 S71 中， 随机取 HPV075 (60. 87%)做为高相似度丛集中心及 HPV130 (57. 89%)做为低相似度丛集中心。 在歩骤（S72)及（S73)中， 由于 HPV006 (88. 89%)、 HPV070 (82. 61%)、 HPV075 (60. 87%)距离高相似度丛集中心 (60. 87%)较近， 所以被分配到高相似度丛集， 而 HPV130 (57. 89%) 、 HPV004 (57. 89%) )距离低相似度丛集中心（57. 89%)较近，所以被分配到低相似 度丛集。在歩骤（S74)中，计算出高相似度丛集中各病毒型的相似度的平均值 为 77. 46%做为新的高相似度丛集中心，而低相似度丛集中各病毒型的相似度 的平均值为 57. 89%做为新的低相似度丛集中心。 在歩骤 S75及歩骤 S76中， 由于 HPV006 (88. 89%)、 HPV070 (82. 61%)距离新的高相似度丛集中心（77. 89%) 较近， 以被分配到高相似度丛集， 而 HPV075 (60. 87%)、 HPV130 (57. 89%)、 HPV004 (57. 89%) )距离低相似度丛集中心（57. 89%)较近，所以被分配到低相似 度丛集。在歩骤（S77)中， 由于被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛 集的病毒型所之前不相同， 所以重复歩骤（S74)、 歩骤（S75)及歩骤（S76)。在 歩骤（S74)中， 计算出高相似度丛集中各病毒型的相似度的平均值为 85. 75% 做为新的高相似度丛集中心， 而计算低相似度丛集中各病毒型的相似度的平 均值为 58. 88%做为新的低相似度丛集中心。 在歩骤（S75)及歩骤（S76)中， 由 于 HPV006 (88. 89%)、 HPV070 (82. 61%)距离新的高相似度丛集中心（85. 75%)较 近， 以被分配到高相似度丛集， 而 HPV075 (60. 87%)、 HPV130 (57. 89%)、 HPV004 (57. 89%)距离低相似度丛集中心较近， 所以被分配到低相似度丛集 (58. 88%)。在歩骤（S77)中， 由于被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度 丛集的病毒型与之前相同 ， 则所述高相似度丛集中 的病毒型 HPV006 (88. 89%)、 HPV070 (82. 61%)， 即为患者 1可能带有的病毒， 而所述低 相似度丛集中的病毒型 HPV075 (60. 87%)、 HPV130 (57. 89%)、 HPV004 (57. 89%) 即为患者 1不带有的病毒。 由此可得知患者 1为一复合型感染案例。 以类似 的方似将患者 2 的多个病毒型区分为两个丛集， 其中高相似度丛集中只有 HPV061 (85%)此一病毒型， 由此可知患者 2为一单一感染的案例。
去重复歩骤： 可选择地， 本发明之物种分型的方法， 还可包含一去重复歩骤。 其通过 省略资料库中 HPV病毒型的变异度低的核酸裂解片段的比较歩骤， 以减少干 扰代表相似度的比值 N/M的计算结果。 真正相似病毒型的 N/M比值并不会受 到这个去重复歩骤引响太大， 相反的， 较不相似的病毒型的 N/M比值将会大 幅降低， 通过此歩骤来突显出各病毒型的相似度的差异性， 通过此方法增加 相似度的准确性。
请参阅图 3， 其为本发明的物种分型鉴定方法的另一实施例的流程图， 其中包含一去重复歩骤。 所述去重复歩骤的实施方式如下：
(S35)在所述数据分析之前，先将资料库中所述已知病毒型的各已知核酸 裂解片段的分子量大小与资料库另一已知相近病毒型的各已知核酸裂解片段 的分子量大小比较， 以确定两者之间具有那些重复的已知核酸裂解片段；
(S40' )接着在进行数据分析的时候， 使所述被检测的各被检测核酸裂解 片段省略执行与所述重复的已知核酸裂解片段的比较作业。
举例而言， 请参阅表 8A及表 8B , 其显示资料库中各病毒型与被检测病 毒的相似度比值、 所属丛集及去重复歩骤后的相似度比值。 在病患 1中， 相 似度最高的病毒型 HPV006 (88. 89%)与相似度次高的病毒型 HPV070 (82. 61%) 的核酸裂解片段做比较， 确认两者之间相同的核酸裂解片段， 而在计算
HPV006的比值 N/M时， 省略被认定为相同的核酸裂解片段， 而重新计算得到 一个去重复后的相似度比值 N/M 83. 33%。相似度次高的病毒型1^¥070 (82. 61%) 与相似度最高的病毒型 HPV006 (88. 89%)的核酸裂解片段做比较，确认两者之 间相同的核酸裂解片段，而在计算 HPV070的比值 N/M时，省略被认定为相同 的核酸裂解片段， 而重新计算得到一个去重复后的相似度比值 N/M 76. 47%。 相似度第三高的病毒型 HPV075 (60. 87%) 与相似度最高的病毒型 HPV006 (88. 89%)的核酸裂解片段做比较，确认两者之间相同的核酸裂解片段， 而在计算 HPV075的比值 N/M时，省略被认定为相同的核酸裂解片段，而重新 计算得到一个去重复后的相似度比值 N/M 47. 06%。 相似度第四高的病毒型 HPV130 (57. 89%)与相似度最高的病毒型 HPV006 (88. 89%)的核酸裂解片段做 比较， 确认两者之间相同的核酸裂解片段， 而在计算 HPV130的比值 N/M时， 省略被认定为相同的核酸裂解片段， 而重新计算得到一个去重复后的相似度 比值 N/M 38. 46%。相似度第五高的病毒型 HPV004 (57. 89%)与相似度最高的病 毒型 HPV006 (88. 89%)的核酸裂解片段做比较，确认两者之间相同的核酸裂解 片段， 而在计算 HPV004的比值 N/M时， 省略被认定为相同的核酸裂解片段， 而重新计算得到一个去重复后的相似度比值 N/M 42. 86%。 HPV006其相似度比 值 N/M在去重复歩骤后仅仅下降了 5. 56% , HPV070其相似度比值 N/M在去重 复歩骤后也只下降了 6. 14%, 然而 HPV075、 HPV130及 HPV004在去重复歩骤 后的相似度比值 N/M, 却分别下降了 13. 81%、 19. 43%及 15. 03%。 由此可看出 真正相似的病毒型的相似度， 较不会受到去重复歩骤的影响而大幅下降。
然而为了简化所述去重复歩骤， 可以只对高相似度丛集中的病毒型执行 所述去重复歩骤。 当高相似度丛集中的病毒型中有 2个以上的高相似度病毒 型时， 则对所述的高相似度病毒型进行所去的去重复歩骤以进行验证， 当高 相似度丛集中的病毒型中只有 1个以下的高相似度病毒型时， 则无需进行去 重复歩骤。
本发明的分型鉴定方法与传统的定序鉴定方法的结果比较：
如图 4A-4B所示， 其代表从 168个病患的检体中， 分别使用序列定序法 及使用本发明所提供的物种分型鉴定法所鉴定出来的各病毒型的案例数量， 其中横轴上的数字代表基因型， 纵轴上的数字代表案例数量， 深色柱状条代 表由序列定序所测得的结果， 浅色柱状条代表由本发明所提供的物种分型鉴 定法所测得的结果， 由于本发明所提供的方法还可以鉴定出复合感染的病毒 型， 因此案例总数为 Π4件， 较序列定序法的案例数 168件来得多。 而本发 明所提供的物种分型鉴定方法与序列定序法的鉴定结果的关联性 R 为 0. 9675， 其显示本发明的方法确实有效， 幷且可以取代序列定序法。
应当理解的是， 上述的描述仅旨在作为示例， 许多其它的实施例在本发 明所附的权利要求书所限定的范围内是可能的， 例如使用本发明所提供的方 法于不同种类的病毒、 细菌或是其他物种。

Claims

权 利 要 求 书
1. 一种利用核酸裂解片段的分子量进行物种分型鉴定的方法， 其特征在于： 所述方法包含歩骤：
(S 10)进行一聚合酶连锁反应， 通过至少一对特定引子， 扩增一被检测物 种的一段核酸序列；
(S20)进行一核酸酶裂解反应， 通过至少一个核酸酶， 将所述被检测物种 的所述核酸序列裂解， 而产生数段分子量大小不同的被检测核酸裂解片 段；
(S30)以一质谱仪检测各被检测核酸裂解片段的分子量大小；
(S40)将所述被鉴定物种的各被检测核酸裂解片段的分子量大小逐一与一 资料库中预存的一已知物种的数个已知核酸裂解片段的分子量比较；
(S50)当所述被检测核酸裂解片段与其中一个所述已知核酸裂解片段两者 的分子量之间相差小于一特定道尔吞值时，则认定两者为相同的核酸裂解 片段； 以及
(S60)计算所述认定为相同的被检测核酸裂解片段的数量 N相对于所述已 知物种的已知核酸裂解片段的总数 M的一比值 N/M , 并以所述比值 N/M代 表所述被检定物种与所述已知物种的一核酸序列相似度。
2. 如权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 所述特定道尔吞值为 2道尔吞。
3. 如权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 当所述歩骤（S40)中的资料库中 的已知物种为 2个或以上时， 在歩骤（S60)后进一歩包含以下歩骤：
(S71)从所述资料库中多个物种的多个所述比值 N/M中， 随机取其中一较 大的比值， 做为一高相似度丛集的中心， 并随机取其中一较小的比值， 做 为一低相似度丛集的中心；
(572)计算所述所有物种的所述比值 N/M与所述高相似度丛集的中心及所 述低相似度丛集的中心的差值；
(573)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度 丛集的中心的所述差值为小， 则所述物种被分配到所述高相似度丛集； 相 反地，若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高相似度 丛集的中心的所述差值为小， 则所述物种被分配到所述低相似度丛集；
(574)计算出所述高相似度丛集中所有物种的所述比值 N/M的平均值做为 新的高相似度丛集的中心，计算出所述低相似度丛集中所有物种的所述比 值 N/M的平均值做为新的低相似度丛集的中心；
(575)再次计算所述所有物种的所述比值 N/M与所述高相似度丛集的中心 及所述低相似度丛集的中心的差值；
(576)若所述物种与所述高相似度丛集的中心的所述差值较所述低相似度 丛集的中心的所述差值为小， 则所述物种重新被分配到所述高相似度丛 集； 相反地，若所述物种与所述低相似度丛集的中心的所述差值较所述高 相似度丛集的中心的所述差值为小，则所述物种重新被分配到所述低相似 度丛集； 及
(577)当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种所之前 相同， 则所述高相似度丛集中的物种即判断为所述被检测检物种，而所述 低相似度丛集中的物种即判断为不是所述被检测物种； 其中当在被分配到所述高相似度丛集及所述低相似度丛集的物种与之前 不相同， 则重复歩骤（S74)、 歩骤（S75)及歩骤（S76)直到被分配到所述高 相似度丛集及所述低相似度丛集的物种所之前相同，则所述高相似度丛集 中的物种即判断为所述被检测检物种，而所述低相似度丛集中的物种即判 断为不是所述被检测物种。
4. 如权利要求 1或 3所述的方法， 其特征在于： 在所述歩骤（S40)前， 先将 资料库中预存的所述已知物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小与资 料库中预存的另一已知相近物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小比 较， 以确定两者之间具有那些重复的已知核酸裂解片段； 接着在进行歩骤 (S40)时， 使所述被检测物种的各被检测核酸裂解片段省略执行与所述重 复的已知核酸裂解片段的比较作业。
5. 如权利要求 4所述的方法， 其特征在于：将资料库中预存的所述已知物种 的各已知核酸裂解片段的分子量大小与资料库中预存的所述另一已知相 近物种的各已知核酸裂解片段的分子量大小比较时，所述已知物种及所述 另一所述已知物种皆选自于所述高相似度丛集中的物种。
6. 如权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 所述核酸序列为 DNA序列。
7. 如权利要求 6所述的方法， 其特征在于： 在所述歩骤（S20)之前， 先进行 一转录反应， 将 DNA序列转录为 RNA序列。
8. 如权利要求 7所述的方法， 其特征在于： 所述核酸酶为 RNase。
9. 如权利要求 8所述的方法， 其特征在于： 所述 RNase为 RNase A , 其针对 所述 RNA序列中的 U位进行点裂解。
10.如权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 所述被检测物种为微生物。
11.如权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 所述微生物为细菌或病毒。
12.如权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 所述被检测物种为动物。
13.如权利要求 1所述的方法， 其特征在于： 所述被检测物种为人类。
PCT/CN2014/077870 2013-07-09 2014-05-20 利用核酸裂解后片段分子量进行物种鉴定的方法 WO2015003531A1 (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14823083.2A EP3021118B1 (en) 2013-07-09 2014-05-20 Method for identifying species using molecular weights of nucleic acid cleavage fragments
CN201480037258.7A CN105358974B (zh) 2013-07-09 2014-05-20 利用核酸裂解后片段分子量进行物种鉴定的方法
US14/903,258 US20160153060A1 (en) 2013-07-09 2014-05-20 Method for species identification by using molecular weights of nucleic acid cleavage fragments

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361844089P 2013-07-09 2013-07-09
US61/844,089 2013-07-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015003531A1 true WO2015003531A1 (zh) 2015-01-15

Family

ID=52279349

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2014/077870 WO2015003531A1 (zh) 2013-07-09 2014-05-20 利用核酸裂解后片段分子量进行物种鉴定的方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20160153060A1 (zh)
EP (1) EP3021118B1 (zh)
CN (1) CN105358974B (zh)
WO (1) WO2015003531A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3794599A4 (en) * 2018-06-11 2022-02-23 Merck Sharp & Dohme Corp. HINGED POINT METHODS FOR IDENTIFICATION OF COMPLEX MOLECULAR SUBSTRUCTURES

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1977053A (zh) * 2004-04-09 2007-06-06 波士顿大学信托人 从头检测核酸中的序列的方法：通过片段化进行的导向测序
CN101680872A (zh) * 2007-04-13 2010-03-24 塞昆纳姆股份有限公司 序列比较分析方法和系统

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040121315A1 (en) * 2002-12-18 2004-06-24 Ecker David J. Secondary structure defining database and methods for determining identity and geographic origin of an unknown bioagent in containers thereby
US20050142584A1 (en) * 2003-10-01 2005-06-30 Willson Richard C. Microbial identification based on the overall composition of characteristic oligonucleotides
CN103060431A (zh) * 2012-08-02 2013-04-24 向华 基于16S rDNA的细菌核酸指纹特征谱的制备方法及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1977053A (zh) * 2004-04-09 2007-06-06 波士顿大学信托人 从头检测核酸中的序列的方法：通过片段化进行的导向测序
CN101680872A (zh) * 2007-04-13 2010-03-24 塞昆纳姆股份有限公司 序列比较分析方法和系统

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3021118A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20160153060A1 (en) 2016-06-02
CN105358974A (zh) 2016-02-24
EP3021118B1 (en) 2018-09-12
EP3021118A4 (en) 2017-03-08
EP3021118A1 (en) 2016-05-18
CN105358974B (zh) 2018-04-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108060269B (zh) 用于猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒以及猪轮状病毒检测的dpo引物组及其应用
Arroyo et al. Next generation sequencing for human papillomavirus genotyping
US8980555B2 (en) Rapid genotyping analysis and devices thereof
CN108676920B (zh) 一种快速检测小鼠诺如病毒引物、试剂盒及其rt-rpa方法
AU2018305609B2 (en) Enhancement of cancer screening using cell-free viral nucleic acids
JP2019162102A (ja) 末梢血中で、がんによって変化したｒｎａを検出するシステムおよび方法
US11149322B2 (en) Methods and compositions for human papillomaviruses and sexually transmitted infections detection, identification and quantification
BR112013017489B1 (pt) "métodos para genotipagem de hpv de alto risco e para distinguir entre infecções por hpv 16, hpv 18 e hpv 45".
WO2022100441A1 (zh) 一种用于检测人乳头瘤病毒hpv16和hpv18的探针组及其试剂盒
Rybicka et al. Current molecular methods for the detection of hepatitis B virus quasispecies
WO2013071520A1 (zh) 用于病毒检测的方法和系统
CN112921126A (zh) 一种人呼吸道合胞病毒分型检测多重RT-qPCR试剂盒、引物探针组合物及其使用方法
CN111676218A (zh) SARS-CoV-2病毒spike基因全长扩增测序方法及其引物
WO2015003531A1 (zh) 利用核酸裂解后片段分子量进行物种鉴定的方法
US11359251B2 (en) Methods for the detection of enterovirus D68 in complex samples
US20210180107A1 (en) Oligonucleotides and method for the detection and typing of human papillomavirus
CN110684862A (zh) 用于定量检测乙型肝炎病毒的微滴数字pcr试剂盒及检测方法
CN107653343B (zh) 一种用于检测丙型肝炎病毒基因分型的扩增引物、测序引物、试剂盒和方法
CN114214455B (zh) 乙肝病毒DNA快速定量引物探针及其CRISPR/Cas12b检测系统
WO2024001668A1 (zh) 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物及其应用
TWI293090B (en) Aparatus and methods for computer aided primer design and compositions for detection of the sars coronavirus
Taghizadeh et al. COVID-19; History, Taxonomy, and Diagnostic Molecular and Immunological Techniques
CN107435061B (zh) 突变基因的定量检测方法
Dutta et al. Nucleic Acid in Diagnostics
CN116855642A (zh) 一种检测14种高危型hpv的实时荧光核酸恒温扩增检测试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201480037258.7

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14823083

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14903258

Country of ref document: US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014823083

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE