WO2014136932A1

WO2014136932A1 - 抗炎症剤

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Publication number: WO2014136932A1
Application number: PCT/JP2014/055932
Authority: WO
Inventors: 浩司浦園; 朋樹高橋; 友葵水野; 孝一郎吉岡; 敏也小林; 加藤　健
Original assignee: 雪印メグミルク株式会社
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2014-03-07
Publication date: 2014-09-12
Also published as: CN105025915A; JP2014172861A; AU2014226865A1; AU2014226865B2; TW201511769A; HK1211843A1

Abstract

　ラクトアドヘリン及び／又はラクトアドヘリンをタンパク質分解酵素で処理した分解物を有効成分として含有する抗炎症剤。抗炎症剤は、哺乳類の乳を原料としているため、簡便且つ経済的に製造することができ、日常的に安全に摂取することが可能である。

Description

抗炎症剤

　本発明は、炎症性サイトカインの産生を抑制する効果に優れ、生体における過剰な炎症を改善し、膠原病やアレルギー疾患、代謝性疾患、感染症などの予防や治療に有用で、安定性及び安全性に優れた抗炎症剤に関する。本発明は、さらに抗炎症剤を含有する、抗炎症用飲食品、抗炎症用栄養組成物又は抗炎症用飼料に関する。

　炎症性サイトカインとは、リンパ球やマクロファージなどから産生され、細菌やウイルス感染、腫瘍、組織損傷に伴う炎症反応に関与する物質であり、例えば、インターロイキ－１（ＩＬ－１）やインターロイキン－６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α）、ＧＭ－ＣＳＦ等が知られている。これらの炎症性サイトカインは、生体内で肝臓に働き、急性期タンパク質の合成と分泌を誘導したり、好中球の内皮細胞への接着を亢進させるほか、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、ＭＣＰ－１等のケモカインを誘導することによって炎症部位に好中球、単球、あるいはリンパ球を遊走させ、炎症を惹起する作用があることが知られている。一方、この炎症性サイトカインの過剰な産生により引き起こされる病態には、全身性炎症反応症候群、慢性関節リュウマチ等の膠原病やアレルギー疾患、ならびに動脈硬化やインスリン抵抗性、糖尿病等の代謝性疾患、多発性硬化症や移植片対宿主症、ウイルス肝炎、ＨＩＶ感染等の感染症等があり、炎症性サイトカインの産生を抑制することは、これらの病態の予防や治療、改善、再発防止に非常に有益であることが報告されている。また、生体内の過剰な炎症を抑制するための医薬として、抗ヒスタミン薬やステロイド剤等が知られているが、これらの医薬品を用いた場合、耳鳴り、頭痛、食欲不振等の副作用を伴うことがある。さらに、これらの物質は、安全性及びコスト等の面から、現在のところ、飲食品に添加することができない。そのため、日常的に安全に摂取することが可能で、炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制できるような飲食品や飼料の開発が望まれている。

　ラクトアドヘリンは、乳の脂肪球膜を構成する糖タンパク質のひとつであり、牛乳では、脂肪球膜に含まれるタンパク質の約１０％を占める。その分子量は４３ｋＤａ～５３ｋＤａ、等電点は７．０であり、上皮成長因子様の２つのドメインを有する。また、ラクトアドヘリンは、ウシでは、ＰＡＳ－ＶＩ－ＶＩＩ（ＰＡＳ６／７）とも呼ばれ、マウスの乳に含まれるラクトアドヘリンは、ＭＦＧ－Ｅ８とも表現される。さらに、ラクトアドヘリンは、新生児の消化管機能を整える役割を担っていると考えられており、新生児のロタウイルスへの感染防止を目的として育児用人工粉乳に配合されている。
　これまで、炎症性サイトカインの過剰な産生を抑制する食品成分として、スフィンゴミエリンやラクトパーオキシダーゼ、酸性キシロオリゴ糖が知られている。しかしながら、ラクトアドヘリン及び／又はその分解物が炎症性サイトカインの産生を抑制する効果に優れ、生体における過剰な炎症を改善することは知られていない。

特開２００７－１１２７９３特開２００７－２２３９１０

Journal of Nutritional Science and Vitaminology, 56, 54-59, 2010

　本発明は、顕著な炎症性サイトカインの産生抑制効果を有し、生体における過剰な炎症を改善することにより、膠原病やアレルギー疾患、代謝性疾患、感染症などの予防や治療に有用な抗炎症剤、及び抗炎症剤を配合した抗炎症用飲食品、抗炎症用栄養組成物又は抗炎症用飼料を提供することを課題とする。

　本発明者らは、上記の課題を解決するため鋭意検討を進めたところ、ラクトアドヘリン及び／又はその分解物に、優れた炎症性サイトカインの産生抑制効果があることを見出した。
　すなわち本発明は、以下の様態を含むものである。
　（１）ラクトアドヘリン及び／又はその分解物を有効成分とする抗炎症剤。
　（２）ラクトアドヘリン及び／又はその分解物が牛乳由来である（１）に記載の抗炎症剤。
　（３）ラクトアドヘリン分解物が、ラクトアドヘリンをタンパク質分解酵素を用いて分解したものである（１）又は（２）に記載の抗炎症剤。
　（４）タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパインからなる群から選択される少なくとも１種である（３）に記載の抗炎症剤。
　（５）（１）から（４）のいずれか１つに記載の抗炎症剤を含む抗炎症用飲食品、抗炎症用栄養組成物又は抗炎症用飼料。
　（６）（１）から（４）のいずれか１つに記載の抗炎症剤を経口摂取することによる生体における炎症改善方法。
　（７）ラクトアドヘリン及び／又はその分解物を有効成分とする抗炎症剤を、炎症患者に適用する抗炎症剤の使用方法。

　本発明の抗炎症剤は、炎症性サイトカインの産生を抑制する効果が顕著であり、膠原病やアレルギー疾患、代謝性疾患、感染症などの予防や治療に有用である。

　抗炎症剤の有効成分であるラクトアドヘリンは、例えば、（Ａ）生乳からバターを製造する際に生ずる水相成分であるバターミルクや、（Ｂ）生乳のセパレーター分離で得られる脂肪分４０～５０％のクリームを再度セパレーターで分離することで得られる６０％以上の高脂肪クリームに対し加熱処理もしくは剪断処理を行い、高脂肪クリームが転相した際に排出される水相成分、又は、（Ｃ）バターを加熱溶解した際に分離する水相成分であるバターゼラムを、限外濾過（ＵＦ）膜や精密濾過（ＭＦ）膜、逆浸透膜（ＲＯ）膜、イオン交換樹脂等を用いて脱塩や濃縮することにより、得ることができる。また、バターゼラムに塩酸を添加してｐＨを４．４に調整した後、塩化カルシウムを添加し、５０℃で３０分間保持して分離した沈殿を、再度、水等に溶解又は懸濁した後、限外濾過（ＵＦ）膜や精密濾過（ＭＦ）膜、逆浸透膜（ＲＯ）膜、イオン交換樹脂等を用いて脱塩や濃縮することにより、得ることができる。さらに、抗炎症剤の有効成分であるラクトアドヘリン分解物は、上記のラクトアドヘリンを任意のタンパク質分解酵素で分解して得ることができる。タンパク質分解酵素としては、プロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ（商品名）、サモアーゼＰＣ１０Ｆ（商品名）、プロチンＳＤ－ＡＹ１０（商品名）等の市販の食品・工業用プロテアーゼ剤のほか、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパイン等を例示することができ、またこれらを複数組み合わせて使用してもよい。上記のように調製したラクトアドヘリン及び／又はその分解物は、凍結乾燥や噴霧乾燥等により乾燥することも可能である。

　ラクトアドヘリン及び／又はその分解物は、ヒト、ウシ、水牛、ヤギ、ヒツジ等の哺乳類の乳から調製されるものや遺伝子工学的手法により生産されるもの、血液や臓器から精製されたもの等が使用可能である。簡便且つ経済的に製造することができ、日常的に安全に摂取することが可能であるからである。なかでも牛乳由来のものが好ましい。また、精製され、市販されているラクトアドヘリン及び／又はその分解物の試薬を使用することも可能である。

　ラクトアドヘリン及び／又はその分解物は、そのまま抗炎症剤として使用してもよいが、必要に応じて、常法に従い、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、ドリンク剤等に製剤化して用いることも出来る。また、凍結乾燥や噴霧乾燥等により乾燥したラクトアドヘリン及び／又はその分解物についても、そのまま抗炎症剤として使用することも可能であり、常法に従い、製剤化して用いることもできる。
　さらに、これらを製剤化した後に、これを栄養剤やヨーグルト、飲料、ウエハース等の飲食品、栄養組成物又は飼料に配合することも可能である。

　抗炎症用飲食品、抗炎症用栄養組成物及び抗炎症用飼料とは、このラクトアドヘリン及び／又はその分解物の他に、安定剤や糖類、脂質、フレーバー、ビタミン、ミネラル、フラボノイド、ポリフェノール等、他の飲食品、飼料に通常含まれる原材料等を含有することができる。また、有効成分であるラクトアドヘリン及び／又はその分解物に加えて、抗炎症作用を示す成分、例えば、スフィンゴミエリンやラクトパーオキシダーゼ、酸性キシロオリゴ糖等とともに使用することも可能である。

　抗炎症用飲食品、抗炎症用栄養組成物及び抗炎症用飼料におけるラクトアドヘリン及び／又はその分解物の配合量については、特に制限はないが、本発明で炎症性サイトカインの産生抑制効果を発揮させるためには、成人一人一日あたりラクトアドヘリン及び／又はその分解物を５ｍｇ以上経口摂取できように、医薬品や飲食品、飼料への配合量を調整することが好ましい。

　抗炎症剤は、有効成分であるラクトアドヘリン及び／又はその分解物に適当な助剤を添加して任意の形態に製剤化することができる。製剤化に際して、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、滑沢剤等の希釈剤又は賦形剤を用いることができる。賦形剤としては、例えばショ糖、乳糖、デンプン、結晶性セルロース、マンニット、軽質無水珪酸、アルミン酸マグネシウム、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素カルシウム、カルボキシルメチルセルロースカルシウム等の１種又は２種以上を組み合わせて加えることができる。

　上記のように、本発明は実施形態によって記載したが、この開示の一部をなす論述はこの発明を限定するものであると理解すべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施例及び運用技術が明らかとなろう。
　例えば、実施形態において説明したラクトアドヘリン及び／又はその分解物を有効成分とする抗炎症剤を、炎症患者に適用する抗炎症剤の使用方法が提供される。この場合、ラクトアドヘリン及び／又はその分解物としては、例えば、後述の実施例の欄で説明するようにして原料から単離、精製されたものを用いることができる。また抗炎症剤は、ヒトその他の哺乳類、例えば犬、サル、ネコ、牛、馬、豚、鶏、羊等の家畜にも適用され得る。

　以下に実施例、試験例を示し、本発明について詳細に説明するが、これらは単に例示するのみであり、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない。

　凍結乾燥した未殺菌のバターミルク粉末１０ｋｇにアセトン１００ｋｇを添加した後、クワルクセパレーターで処理することにより、沈殿を完全に除去して上清を得た。エバポレーターを用いて、上清からアセトンを除去して脱イオン水に再度溶解した後、分画分子量６０ｋＤａの限外濾過膜で処理し、透過液を回収した。次に、この透過液を分画分子量３０ｋＤａの限界濾過膜で不純物を除去し、脱塩、濃縮した後、凍結乾燥してラクトアドヘリンの粉末（実施例品１）６８ｇを得た。このラクトアドヘリンの粉末には、ラクトアドヘリンが、７８％含まれていた。このようにして得られたラクトアドヘリンは、そのまま抗炎症剤として使用可能である。

　実施例１で調製したラクトアドヘリンの粉末５００ｍｇを精製水１００ｍｌに溶解し、重曹を用いてｐＨを８に調整した。その後、最終濃度０．０１％となるようにタンパク質分解酵素であるトリプシン（シグマ社製）を加え、３７℃で１時間酵素処理した。そして、８５℃で１０分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥してラクトアドヘリン分解物の粉末（実施例品２）４６３ｍｇを得た。このようにして得られたラクトアドヘリン分解物の分子量は５ｋＤａ以下であり、そのまま抗炎症剤として使用可能である。

　実施例１で調製したラクトアドヘリンの粉末１０ｇを精製水２００ｍｌに溶解した後、４５℃に保持して、２ｇのプロテアーゼＡ「アマノ」ＳＤ（天野エンザイム社製）を加え、２時間酵素処理した。そして、８０℃で１０分間加熱処理して酵素を失活させた後、凍結乾燥してラクトアドヘリン分解物の粉末（実施例品３）８．２ｇを得た。このようにして得られたラクトアドヘリン分解物の分子量は５ｋＤａ以下であり、そのまま本発明の抗炎症剤として使用可能である。

　［試験例１］
　実施例１で得られたラクトアドヘリン及び実施例２で得られたラクトアドヘリン分解物が、炎症性サイトカインであるＩＬ－６とＩＬ－８の産生を抑制する効果を調べた。小腸上皮細胞様の特徴を示すヒト結腸腺癌細胞株Ｃａｃｏ－２を、２４穴のマイクロタイタープレートに播種し、１０％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ変法基礎培地（ＤＭＥＭ）で２週間培養した後、実施例１で得られたラクトアドヘリンの粉末（終濃度：ラクトアドヘリンとして、０．５，５，５０，５００μｇ／ｍｌ）又は、実施例２で得られたラクトアドヘリン分解物の粉末（終濃度：ラクトアドヘリン分解物として、０．５，５，５０，５００μg／ｍｌ）を添加し、１２時間培養した。また、陽性対象として、ラクトパーオキシダーゼ（終濃度：ラクトパーオキシダーゼとして、５，５０，５００μg/ｍｌ）を添加し、１２時間培養した。その後、それぞれに、ＩＬ－１β（終濃度０．２ｎｇ／ｍｌ）を添加して２４時間培養した後、培養上清を回収して、培養上清中に含まれるＩＬ－６濃度とＩＬ－８濃度をＥＬＩＳＡ法で測定した。その結果を、表１と表２に示す。

　表１、表２の結果から、ラクトアドヘリンとその分解物を、それぞれ終濃度で５μｇ／ｍｌ以上添加した場合に、培養上清中のＩＬ－６濃度とＩＬ－８濃度が有意に低下した。また、その効果は、同様に添加したラクトパーオキシダーゼよりも有意に高かった。この結果から、ラクトアドヘリン及びその分解物には抗炎症効果があることがわかった。

　［試験例２］
　ラクトアドヘリン及びラクトアドヘリン分解物の抗炎症効果を特開２００７－１１２７９３に記載の方法により、カラゲニン誘発ラット足浮腫モデルを用いて調べた。すなわち、ウイスター系雄ラット（体重：１１０～１３０ｇ、１群：１０匹）に、実施例１で得られたラクトアドヘリンの粉末と実施例３で得られたラクトアドヘリン分解物の粉末を、それぞれ、体重１ｋｇあたり、ラクトアドヘリン又はラクトアドヘリン分解物として、５ｍｇ又は５０ｍｇになるように０．５重量％のカルボキシメチルセルロース水溶液に懸濁して経口投与した。また、陽性対象として、同様の方法で、ラクトパーオキシダーゼを体重１ｋｇあたり５０ｍｇになるように経口投与した。その１時間後に、起炎物質として生理食塩水に１重量％になるように懸濁したλ－カラゲニンを、ラットの右後肢足蹠に０．１ｍｌ皮下注入して浮腫を惹起させた。λ－カラゲニン注入前ならびに注入５時間後に、それぞれ右後肢足蹠の面積を測定し、足蹠容量の増加率（Ｖ１）を求めた。陰性対象として、ラクトアドヘリンやその分解物、ラクトパーオキシダーゼを含有しない０．５重量％のカルボキシメチルセルロース水溶液のみを経口投与したラットに、起炎物質として生理食塩水に１重量％になるように懸濁したλ－カラゲニンを、ラットの右後肢足蹠に０．１ｍｌ皮下注入した際の足蹠容量の増加率（Ｖ０）を測定し、（Ｖ０－Ｖ１）／Ｖ０×１００の計算式により、カラゲニン浮腫抑制率を算出した。したがって、この値が大きいほど、抗炎症効果が高いことを示す。その結果を表３に示す。

　表３の結果から、ラクトアドヘリンとその分解物を、それぞれ体重１ｋｇあたり５ｍｇ以上経口投与した場合に、カラゲニン浮腫抑制率が増加し、その効果は、同様に経口投与したラクトパーオキシダーゼよりも有意に高かった。この結果から、ラクトアドヘリンとその分解物には抗炎症効果があることがわかった。

　（抗炎症用カプセル剤の調製）
　表４に示す配合で原材料を混合後、常法により造粒し、カプセルに充填して、抗炎症用カプセル剤を製造した。

　（抗炎症用錠剤の調製）
　表５に示す配合で原材料を混合後、常法により１ｇに成型、打錠して抗炎症用錠剤を製造した。

　（抗炎症用液状栄養組成物の調製）
　５０ｇの実施例品１を４，９５０ｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＴＫＲＯＢＯＭＩＣＳ；特殊機化工業社製）にて、６，０００ｒｐｍで３０分間撹拌混合してラクトアドヘリン含量３９ｇ／５ｋｇのラクトアドヘリン溶液を得た。このラクトアドヘリン溶液５．０ｋｇに、カゼイン５．０ｋｇ、大豆タンパク質５．０ｋｇ、魚油１．０ｋｇ、シソ油３．０ｋｇ、デキストリン１７．０ｋｇ、ミネラル混合物６．０ｋｇ、ビタミン混合物１．９５ｋｇ、乳化剤２．０ｋｇ、安定剤４．０ｋｇ、香料０．０５ｋｇを配合し、２００ｍｌのレトルトパウチに充填し、レトルト殺菌機 (第１種圧力容器、ＴＹＰＥ: ＲＣＳ－４ＣＲＴＧＮ、日阪製作所製)で１２１℃、２０分間殺菌して、抗炎症用液状栄養組成物５０ｋｇを製造した。

　（抗炎症用飲料の調製）
　脱脂粉乳３００ｇを４０９ｇの脱イオン水に溶解した後、実施例品３、１ｇを溶解し、５０℃まで加熱後、ウルトラディスパーサー（ＵＬＴＲＡ－ＴＵＲＲＡＸＴ－２５；ＩＫＡジャパン社製）にて、９，５００ｒｐｍで３０分間撹拌混合した。マルチトール１００ｇ、酸味料２ｇ、還元水飴２０ｇ、香料２ｇ、脱イオン水１６６ｇを添加した後、１００ｍｌのガラス瓶に充填し、９５℃、１５秒間殺菌後、密栓し、抗炎症用飲料１０本（１００ｍｌ入り）を調製した。

　（イヌ用抗炎症用飼料の調製）
　２ｋｇの実施例品１を９８ｋｇの脱イオン水に溶解し、５０℃まで加熱後、ＴＫホモミクサー（ＭＡＲＫＩＩ１６０型；特殊機化工業社製）にて、３，６００ｒｐｍで４０分間撹拌混合してラクトアドヘリン含量１．５６ｇ／１００ｇのラクトアドヘリン溶液を得た。このラクトアドヘリン溶液１０ｋｇに大豆粕１２ｋｇ、脱脂粉乳１４ｋｇ、大豆油４ｋｇ、コーン油２ｋｇ、パーム油２３．２ｋｇ、トウモロコシ澱粉１４ｋｇ、小麦粉９ｋｇ、ふすま２ｋｇ、ビタミン混合物５ｋｇ、セルロース２．８ｋｇ、ミネラル混合物２ｋｇを配合し、１２０℃、４分間殺菌して、抗炎症用飼料１００ｋｇを製造した。
　
　

Claims

　ラクトアドヘリン及び／又はその分解物を有効成分とする抗炎症剤。
　前記ラクトアドヘリン及び／又はその分解物が牛乳由来である請求項１に記載の抗炎症剤。
　前記ラクトアドヘリン分解物が、ラクトアドヘリンをタンパク質分解酵素を用いて分解したものである請求項１又は請求項２に記載の抗炎症剤。
　前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、パンクレアチン、キモトリプシン、ペプシン、パパインからなる群から選択される少なくとも１種である請求項３記載の抗炎症剤。
　請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の抗炎症剤を含む抗炎症用飲食品、抗炎症用栄養組成物又は抗炎症用飼料。
　請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の抗炎症剤を経口摂取することによる生体における炎症改善方法。
　ラクトアドヘリン及び／又はその分解物を有効成分とする抗炎症剤を、炎症患者に適用する抗炎症剤の使用方法。