WO2014123156A1 - 塊状細胞評価方法および塊状細胞評価装置 - Google Patents

塊状細胞評価方法および塊状細胞評価装置 Download PDF

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秀直 岩井
卓治 片岡
山本　諭
範和 杉山
豊彦 山内
謙太郎 後藤
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浜松ホトニクス株式会社
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    • G01N21/4788—Diffraction
    • G01N2021/479—Speckle

Definitions

  • the present invention relates to a lump cell evaluation method and a lump cell evaluation apparatus.
  • cardiomyocytes were isolated and extracted from heart organs of experimental animals, and primary cultured cells were prepared by culturing them in a petri dish or the like, and cardiomyocytes were evaluated using the primary cultured cells.
  • primary culture When primary culture is performed, the cells proliferate in a horizontal direction in a single layer state (sheet-like) in a certain period, and each myocardial cell pulsates (contracts / relaxes) synchronously.
  • the primary cultured cells are not suitable for use in cardiotoxicity evaluation of human cardiomyocytes because they are not human but have different species.
  • a myocardial mass which is a three-dimensional aggregate of cardiomyocytes made from human iPS cells or human ES cells, is a mixture of not only cardiomyocytes but also fibroblasts that hold the periphery of the cells, and is cultured. It is possible to evaluate under conditions that approximate the heart.
  • a non-patent document 1 proposes an evaluation method for sheet-like cells that are two-dimensional aggregates of cells. Since the sheet-like myocardium is obtained by sorting and culturing cardiomyocytes to be almost 100%, the evaluation of the sheet-like myocardium is performed in a state different from the actual heart. In addition, since individual cells are adhered to a substrate such as the bottom of a petri dish, sheet-like cells cannot be evaluated accurately because changes in movement due to medicinal effects are suppressed by the adhesion. .
  • the movement of cells in the vicinity of the substrate is suppressed by adhesion to the substrate, but the movement of cells in a place away from the substrate has a small suppression effect. Therefore, lump cells can accurately evaluate movement compared to sheet-like cells, and it is easy to physiologically reflect changes in movement caused by medicinal effects. This is a preferred state.
  • Non-Patent Document 1 The method described in Non-Patent Document 1 is intended to evaluate sheet-like cells that move two-dimensionally, and it is difficult to evaluate massive cells that move three-dimensionally.
  • the present invention has been made to solve the above-described problems, and an object of the present invention is to provide a method and an apparatus capable of easily evaluating the movement of massive cells.
  • a lump cell is irradiated with a laser beam, and speckle images by forward scattered light generated in the lump cell by the laser beam irradiation are time-sequentially time t 1 to t N.
  • the lump cell evaluation apparatus of the present invention includes (1) a laser light source that outputs a laser beam, and (2) forward scattered light generated in the lump cell by irradiating the lump cell with laser light output from the laser light source.
  • a speckle image acquisition unit for acquiring the respective times t 1 ⁇ t N chronologically speckle image by, (3) each time t of the times t 1 ⁇ t N obtained by the speckle image acquisition unit calculating the speckle contrast value K n for n speckle image of the standard the maximum value K max of these speckle contrast value K 1 ⁇ K n, each speckle contrast value K n with the maximum value K max
  • an SC calculation unit for obtaining a normalized speckle contrast value K n ′, and (4) a normalized speckle contrast value K n ′ at each time t n obtained by the SC calculation unit or the same
  • an evaluation unit that evaluates the movement of the lump cells based on the correlation time ⁇ n or the speed V n obtained from the above.
  • the movement of massive cells can be easily evaluated.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of the lump cell evaluation device 1 of the present embodiment.
  • FIG. 2 is a photograph of the speckle image obtained in this example.
  • FIG. 3 is a graph showing the speed V n at each time t n obtained in this example.
  • FIG. 1 is a diagram showing a configuration of the lump cell evaluation apparatus 1 of the present embodiment.
  • FIG. 1 shows the configuration of an inverted microscope.
  • the lump cell evaluation apparatus 1 includes a laser light source 10, a speckle image acquisition unit 20, an SC calculation unit 30, an evaluation unit 40, and a storage unit 50.
  • the lump cell evaluation apparatus 1 evaluates the movement of lump cells 90 that are three-dimensional aggregates of cells.
  • Lumped cells 90 are contained in a petri dish 92 together with a culture solution 91, and the petri dish 92 is placed on a stage 93.
  • the clump cell 90 is a myocardial mass that is a three-dimensional aggregate of cardiomyocytes made from human iPS cells or human ES cells, for example.
  • the myocardial mass is a mixture of not only cardiomyocytes but also fibroblasts and the like cultured.
  • the laser light source 10 is provided above the stage 93.
  • the laser light source 10 outputs laser light and irradiates the massive cells 90 in the petri dish 92 with the laser light. Any laser light source 10 can be used.
  • the laser light output from the laser light source 10 may be applied to the massive cells 90 after the beam diameter is expanded by a beam expander.
  • the speckle image acquisition unit 20 acquires a two-dimensional speckle image by forward scattered light generated in the massive cells 90 when the massive cells 90 are irradiated with the laser light output from the laser light source 10.
  • the speckle image acquisition unit 20 acquires such speckle images in time series from time t 1 to time t N.
  • the speckle image acquisition unit 20 includes an objective lens 21, a mirror 22, an imaging lens 23, and an imaging unit 24.
  • the objective lens 21 is provided below the stage 93.
  • the objective lens 21 receives forward scattered light generated in the massive cells 90 when the massive cells 90 are irradiated with the laser light output from the laser light source 10.
  • the forward scattered light reaches the imaging surface of the imaging unit 24 via the objective lens 21, the mirror 22 and the imaging lens 23.
  • the imaging unit 24 is configured by, for example, a CCD camera or a CMOS camera.
  • the laser light incident direction on the lump cell 90 and the optical axis direction of the objective lens 21 are formed so that light that is not scattered by the lump cell 90 out of the laser light output from the laser light source 10 does not enter the objective lens 21.
  • the angle is preferably set appropriately. By doing so, the light received by the imaging surface of the imaging unit 24 is mainly the forward scattered light generated in the massive cells 90, and a clear speckle image can be obtained.
  • the evaluation apparatus 1 may be an upright microscope instead of an inverted microscope.
  • the laser light source 10 is provided below the stage 93, and the objective lens 21 is provided above the stage 93.
  • the clumped cells 90 are cells each having a size of about 10 ⁇ m gathered in three dimensions, and have a size of several hundred ⁇ m as a whole.
  • the magnification of the objective lens 21 is low in order to secure an observation field.
  • the magnification of the objective lens 21 is, for example, 4 times or 10 times.
  • a part of the clump cell 90 may be accommodated in the field of view.
  • the lump cell 90 has a thickness in the optical axis direction of the objective lens 21 and may not be within the focal depth of the objective lens 21. However, since the speckle image has a property of being formed not only on the focal plane but also off the focal plane, the position of the objective lens 21 in the optical axis direction is not important.
  • the focal plane of the objective lens 21 may be inside the massive cell 90.
  • the exposure time when each speckle image is acquired by the speckle image acquisition unit 20 affects the contrast of the speckle image obtained from the moving cell 90, so that a clear speckle image can be obtained. It is preferable to set an appropriate time of about 1 ms to 30 ms. In this embodiment, the exposure time is an important parameter. In the first place, the reason that the speckle contrast changes depending on the movement of the sample is that the light intensity of the speckle image is temporally averaged by repeating light and dark within the exposure time with the movement of the sample. Therefore, when the exposure time is sufficiently short with respect to the movement of the sample, the speckle contrast does not change. On the other hand, when the exposure time is sufficiently long with respect to the movement of the sample, the speckle contrast does not change. Therefore, it is necessary to set an appropriate exposure time.
  • the time required to reach the contraction peak is about 200 to 400 msec
  • the time required for relaxation is about 400 to 800 msec.
  • it is necessary to assume a speed of about 1/10 to 10 times, and the time range to be considered in the analysis of contraction and relaxation is 20 to 8000 msec.
  • the beat rate differs depending on species such as animals and humans, the time range for analyzing contraction and relaxation should be further expanded and 1 to 10,000 msec should be considered.
  • the exposure time ⁇ t should be considered from the following two conditions.
  • the first condition is that the frequency of the heart beat of the heart muscle mass and f B, when the camera frame rate (Hz) was f s, there must be an exposure time ⁇ t satisfying f S> f B.
  • f S the frequency of the heart beat of the heart muscle mass
  • f B the camera frame rate
  • the second condition is that if the speed at which the myocardial mass moves is V and the exposure time when the speckle image is obtained without blurring is ⁇ , the phase change amount of light due to the speed change (2 ⁇ ) together with the sampling theorem. / ⁇ ) V ⁇ t needs to be at least ⁇ or less. That is, it is necessary that ⁇ t ⁇ / V.
  • the appropriate exposure time is taken once with a sufficiently short exposure time (or a sufficiently high frame rate) until a speckle image generated from a moving object can be taken without blurring, and the time-series speckle image is stored in a computer memory. After accumulation, an appropriate number of frames may be integrated on the computer to adjust the exposure time in a pseudo manner.
  • Speckle contrast varies depending on exposure time. Therefore, it is preferable to normalize the speckle contrast value by the exposure time T when obtaining the speed quantitatively from the speckle contrast.
  • the exposure time is sufficiently short with respect to the sample movement and when the exposure time is sufficiently long with respect to the sample movement, the correct speed is obtained even if the speckle contrast value is normalized by the exposure time T. I can't get it.
  • the storage unit 50 stores the speckle image I n (x, y) acquired by the speckle image acquisition unit 20 at each time t n among the times t 1 to t N.
  • x and y are coordinate values representing the position in the two-dimensional speckle image, and are coordinate values representing the pixel position when the imaging unit 24 has a two-dimensional pixel structure as in the case of the CCD.
  • the storage unit 50 also stores results obtained by the SC calculation unit 30 described later.
  • SC calculating section 30 calculates the speckle contrast value K n of the speckle image I n at each time t n, which is stored in the storage unit 50.
  • the SC calculation unit 30 obtains a maximum value K max among these speckle contrast values K 1 to K N.
  • SC calculating section 30 finds the normalized speckle contrast value K n 'normalized by speckle contrast value K n the maximum value K max of the time t n. Then, the evaluation unit 40 evaluates the movement of the block cell 90 based on the normalized speckle contrast value K n ′ at each time t n obtained by the SC calculation unit 30.
  • the evaluation of the movement of the massive cell 90 may be based on any of the normalized speckle contrast value K n ′, the correlation time ⁇ n and the speed V n at each time t n .
  • a drug administration means is provided.
  • This drug administration means administers the drug to the massive cells 90 before or during the speckle image acquisition by the speckle image acquisition unit 20.
  • the evaluation unit 40 evaluates the influence of the drug administered by the drug administration unit on the massive cell 90 based on the evaluation result of the movement of the massive cell 90.
  • the lump cell evaluation method of the present embodiment can be performed using the lump cell evaluation apparatus 1.
  • the lump cell evaluation method of the present embodiment sequentially performs a speckle image acquisition step, an SC calculation step, and an evaluation step.
  • the laser light is applied to the massive cells 90 by the laser light source 10. Then, the speckle image acquisition unit 20 acquires speckle images by forward scattered light generated in the lump cells 90 by the laser light irradiation at each of the times t 1 to t N in time series.
  • the speckle image I n (x, y) acquired at each time t n is stored in the storage unit 50.
  • the SC calculating unit 30 the speckle contrast value K n of the speckle images of the time t n is calculated, the maximum value K max of these speckle contrast value K 1 ⁇ K N is obtained , speckle contrast value K n at each time t n is normalized normalized speckle contrast value K n 'is determined by the maximum value K max.
  • the evaluation unit 40 evaluates the movement of the massive cells based on the normalized speckle contrast value K n ′ at each time t n .
  • the evaluation unit 40 evaluates the influence of the drug on the massive cells based on the evaluation result of the movement of the massive cells.
  • the speckle contrast value K n for each position (x, y), is calculated from these mean values I mean and standard deviation ⁇ by the following equation (1).
  • the speckle contrast image K n (x, y) for the speckle image I n (x, y) is obtained.
  • y) is calculated.
  • An average value (average speckle contrast value) K n_mean of the speckle contrast values of all pixels of the speckle contrast image K n (x, y) at each time t n is obtained.
  • the reason for such standardization is as follows. That is, it is theoretically known that the contrast value of a fully developed speckle obtained from a stationary sample under ideal conditions is 1. Further, it is generally known that the speckle contrast value is 1 or less. On the other hand, even if the sample is stationary, the actual conditions are different from the ideal conditions. In practice, the speckle contrast value obtained from a stationary sample may not be 1 due to, for example, the coherence distance of stray light or laser light. Such a difference between the theoretical value and the actually measured value becomes a problem when evaluating the movement of the sample. Therefore, normalization as described above is performed.
  • T is an exposure time when each speckle image is acquired
  • ⁇ is a laser beam wavelength.
  • the arithmetic operation for obtaining the average speckle contrast value K n_mean from the speckle contrast image K n (x, y) at each time t n may be performed after the equation (2).
  • the average correlation time ⁇ n_mean is calculated from the correlation time image ⁇ n (x, y).
  • the average calculation may be performed after the equation (3).
  • the speed image V n (x, y) is obtained from the correlation time image ⁇ n (x, y), and then the average speed V n may be obtained.
  • the SC calculation unit 30 may partition the obtained speckle image I n (x, y) into a plurality of section images I n (m) composed of appropriate plural pixels. In this case, thereafter, K n , K n ′, ⁇ n and speed V n are calculated for each section image I n (m) , and a two-dimensional mapping image of these parameters is obtained to obtain massive cells. Evaluate 90 moves. Note that m of I n (m) represents a partition number.
  • the normalized speckle contrast value K n ′ As shown in the equations (2) and (3), there is an interdependency among the three components of the normalized speckle contrast value K n ′, the correlation time ⁇ n and the speed V n at each time t n. Exists. Therefore, the normalized speckle contrast value K n ′, the correlation time ⁇ n and the speed V n at each time t n are all equivalent in evaluating the movement of the massive cell 90, and the movement of the massive cell 90 is It can be used as an index of evaluation.
  • the massive cell 90 to be evaluated was a myocardial mass having a size of about 600 ⁇ m.
  • the laser light source 10 was a HeNe laser light source that outputs laser light having a wavelength of 633 nm.
  • the magnification of the objective lens 21 was 10 times.
  • the imaging unit 24 is a CCD camera having 512 ⁇ 512 pixels, and the size of one pixel is 16 ⁇ 16 ⁇ m.
  • the exposure time at the time of imaging by the imaging unit 24 was 10 ms, and the frame rate was 100 fps.
  • FIG. 2 is a photograph of the speckle image obtained in this example.
  • the field size of each of the speckle images A to C shown in FIG. 2 is 0.82 ⁇ 0.82 ⁇ m.
  • the speckle image A is an image when the myocardial mass is in the stop period.
  • the speckle image B is an image when the myocardial mass is in a systole.
  • the speckle image C is an image when the myocardial mass is in the relaxation period.
  • the speckle pattern is reduced in the speckle image B when the myocardial mass is in the systole.
  • the speckle pattern repeats light and dark. Since the light and darkness is repeated sufficiently quickly with respect to the exposure time, the speckle pattern B appears blurred in the speckle image B when the myocardial mass is in the systole, in other words, the contrast is lowered.
  • the correlation time ⁇ n can be obtained from the speckle contrast K n ′, and further the speed V n can be obtained.
  • FIG. 3 is a graph showing the speed V n at each time t n obtained in this example.
  • peaks 1, 3, 5, 7, and 9 represent the maximum acceleration during the contraction period of the myocardial mass
  • peaks 2, 4, 6, 8, and 10 represent the maximum acceleration during the relaxation period of the myocardial mass.
  • the times when the speckle images A to C in FIG. 2 are acquired are indicated by A to C in FIG. From this FIG. 3, the movement of the myocardial mass (for example, the interval at which each peak appears, the size of the systolic peak, the size of the diastolic peak, the difference or ratio of the sizes of the systolic peak and the diastolic peak) is evaluated. can do.
  • the influence of the drug on the myocardial mass can be evaluated based on the evaluation result of the motion of the myocardial mass.
  • the lump cell evaluation method and lump cell evaluation apparatus according to the present invention are not limited to the above-described embodiments and configuration examples, and various modifications are possible.
  • the lump cell is irradiated with laser light, and speckle images due to forward scattered light generated in the lump cell by the laser light irradiation are time-sequentially displayed at times t 1 to t N.
  • a speckle image acquisition step for each acquisition and (2) calculating a speckle contrast value K n of the speckle image at each time t n out of the times t 1 to t N acquired in the speckle image acquisition step.
  • SC that is, the maximum value K max of these speckle contrast value K 1 ⁇ K n, determine the normalized speckle contrast value K n 'is normalized by the maximum value K max each speckle contrast value K n A calculation step, and (3) a normalized speckle contrast value K n ′ at each time t n obtained in this SC calculation step or a phase obtained therefrom And an evaluation step for evaluating the movement of the massive cells based on the relation time ⁇ n or the speed V n .
  • a laser light source that outputs a laser beam
  • forward scattering that occurs in the lump cell when the lump cell is irradiated with the laser beam output from the laser light source.
  • a speckle image acquisition unit for acquiring the respective times t 1 ⁇ t N chronologically speckle image by light, (3) each time of the acquired time t 1 ⁇ t N the speckle image acquisition unit calculating the speckle contrast value K n of the speckle image of t n, the maximum value K max of these speckle contrast value K 1 ⁇ K n determined, each speckle contrast value K n with the maximum value K max
  • An SC calculation unit for obtaining a normalized speckle contrast value K n ′ by normalization; and (4) a normalized speckle contrast value K n at each time t n obtained by the SC calculation unit.
  • an evaluation unit that evaluates the movement of the massive cells based on the correlation time ⁇ n or the speed V n obtained therefrom.
  • the lump cell evaluation method having the above configuration preferably further includes a drug administration step of administering a drug to the lump cells before or during the speckle image acquisition step.
  • the evaluation step the movement of the lump cells is performed. It is preferable to evaluate the influence of the drug on the massive cells based on the evaluation result.
  • the lump cell evaluation apparatus having the above configuration preferably further includes a drug administration unit that administers a drug to the lump cells before or during speckle image acquisition by the speckle image acquisition unit. It is preferable to evaluate the influence of the drug on the massive cells based on the evaluation result of the movement of the massive cells.
  • the SC calculation unit partitions the speckle image at each time t n into a plurality of section images composed of a plurality of pixels, and the speckle contrast value K for each section image. It is preferable to calculate n . In this case, thereafter, K n ′, ⁇ n and speed V n are calculated for each section image, and a two-dimensional mapping image of these parameters is obtained to evaluate the movement of the massive cells.
  • the present invention can be used as a method and apparatus that can easily evaluate the movement of massive cells.

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Abstract

　塊状細胞評価装置１は、レーザ光源１０、スペックル像取得部２０、ＳＣ算出部３０、評価部４０および記憶部５０を備える。スペックル像取得部２０は、レーザ光源１０から出力されたレーザ光が塊状細胞９０に照射されることにより塊状細胞９０において生じた前方散乱光による２次元スペックル像を取得する。ＳＣ算出部３０は、各時刻ｔｎのスペックル像Ｉｎのスペックルコントラスト値Ｋｎを算出し、スペックルコントラスト値Ｋ１～ＫＮのうちの最大値Ｋmaxを求め、各時刻ｔｎのスペックルコントラスト値Ｋｎを最大値Ｋmaxで規格化して規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'を求める。評価部４０は、各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'に基づいて、塊状細胞９０の動きを評価する。これにより、塊状細胞の動きを容易に評価することができる方法および装置が実現される。

Description

塊状細胞評価方法および塊状細胞評価装置
　本発明は、塊状細胞評価方法および塊状細胞評価装置に関するものである。
　従来、例えば実験用動物の心臓臓器から心筋細胞を分離・摘出し、それをシャーレ等において培養した初代培養細胞を作成し、この初代培養細胞を用いて心筋細胞の評価を行っていた。初代培養すると、或る期間で細胞が単層の状態（シート状）にて水平方向に増殖し、各心筋細胞が同期して拍動（収縮・弛緩）をするようになる。しかし、このように初代培養された細胞は、ヒトの物ではなく、種の違いがあることから、ヒトの心筋細胞についての心毒性評価等での利用に適していない。
　近年では、ｉＰＳ細胞またはＥＳ細胞等の幹細胞を培養する技術の進歩に伴い、細胞の３次元集合体である塊状細胞を人工的に作成することができるようになり、この塊状細胞の評価（例えば、薬剤が投与されたときの塊状細胞の変化の評価）が重要になってきている。ヒトｉＰＳ細胞またはヒトＥＳ細胞から作られる心筋細胞を試料として用い薬効評価を行うことは、ヒト由来の細胞を利用することができることから、薬の薬効および安全性を評価する上で極めて重要なことである。ヒトｉＰＳ細胞またはヒトＥＳ細胞から作られる心筋細胞の３次元集合体である心筋塊は、心筋細胞だけでなく細胞周辺を保持する繊維芽細胞等も混合されて培養されたものであり、ヒトの心臓に近似した条件で評価することが可能である。
　ところで、細胞の２次元集合体であるシート状細胞については評価方法が非特許文献１に提案されている。シート状心筋は心筋細胞をほぼ１００％になるように分取して培養されたものであるから、シート状心筋の評価は実際の心臓とは異なる状態での評価となる。また、シート状細胞は、個々の細胞がシャーレの底面等の基板に接着していることから、薬効による動きの変化が当該接着によって抑制されているので、正確な動きの評価を行うことができない。
　これに対して、塊状細胞では、基板近傍の細胞の動きは基板との接着により抑制されるものの、基板から離れた箇所にある細胞の動きは上記抑制効果が少ない。それ故、塊状細胞は、シート状細胞と比べて正確に動きを評価することができ、また、薬効による動きの変化を生理的に反映し易く、創薬上の心毒性評価等をする上で好適な状態である。
Hayakawa T, "Noninvasive evaluation of contractile behavior of cardiomyocyte monolayers based on motion vector analysis", Tissue Engineering Part C, Vol.18, No.1, pp.21-32, 2012 Peterson DW, Griffith DW Jr, Napolitano CA., "Decreased myocardial contractility in papillary muscles from atherosclerotic rabbits", Circ Res. 1979 Sep;45(3), pp.338-346 茆原るり、"心筋細胞興奮収縮連関におよぼす第３のキナーゼ系Ｒｈｏキナーゼの役割について"埼玉医科大学雑誌　第３１巻　第２号　平成１６年４月　pp.103-113
　非特許文献１に記載された方法は、２次元的な動きをするシート状細胞を評価することを意図したものであり、３次元的な動きをする塊状細胞を評価することは困難である。
　本発明は、上記問題点を解消する為になされたものであり、塊状細胞の動きを容易に評価することができる方法および装置を提供することを目的とする。
　本発明の塊状細胞評価方法は、（１）塊状細胞にレーザ光を照射して、そのレーザ光照射により塊状細胞において生じた前方散乱光によるスペックル像を時系列で時刻ｔ１～ｔＮそれぞれに取得するスペックル像取得ステップと、（２）このスペックル像取得ステップにおいて取得された時刻ｔ１～ｔＮのうちの各時刻ｔｎのスペックル像のスペックルコントラスト値Ｋｎを算出し、これらスペックルコントラスト値Ｋ１～ＫＮのうちの最大値Ｋmaxを求め、各スペックルコントラスト値Ｋｎを最大値Ｋmaxで規格化して規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'を求めるＳＣ算出ステップと、（３）このＳＣ算出ステップにおいて求められた各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ' またはこれから得られる相関時間τｎもしくは速さＶｎに基づいて、塊状細胞の動きを評価する評価ステップと、を備えることを特徴とする。
　本発明の塊状細胞評価装置は、（１）レーザ光を出力するレーザ光源と、（２）このレーザ光源から出力されたレーザ光が塊状細胞に照射されることにより塊状細胞において生じた前方散乱光によるスペックル像を時系列で時刻ｔ１～ｔＮそれぞれに取得するスペックル像取得部と、（３）このスペックル像取得部により取得された時刻ｔ１～ｔＮのうちの各時刻ｔｎのスペックル像のスペックルコントラスト値Ｋｎを算出し、これらスペックルコントラスト値Ｋ１～ＫＮのうちの最大値Ｋmaxを求め、各スペックルコントラスト値Ｋｎを最大値Ｋmaxで規格化して規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'を求めるＳＣ算出部と、（４）このＳＣ算出部により求められた各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ' またはこれから得られる相関時間τｎもしくは速さＶｎに基づいて、塊状細胞の動きを評価する評価部と、を備えることを特徴とする。
　本発明によれば、塊状細胞の動きを容易に評価することができる。
図１は、本実施形態の塊状細胞評価装置１の構成を示す図である。 図２は、本実施例で取得されたスペックル像の写真である。 図３は、本実施例で求められた各時刻ｔｎの速さＶｎを示すグラフである。
　以下、添付図面を参照して、本発明を実施するための形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。
　図１は、本実施形態の塊状細胞評価装置１の構成を示す図である。図１は倒立顕微鏡の構成を示している。塊状細胞評価装置１は、レーザ光源１０、スペックル像取得部２０、ＳＣ算出部３０、評価部４０および記憶部５０を備える。塊状細胞評価装置１は、細胞の３次元集合体である塊状細胞９０の動きを評価するものである。塊状細胞９０は培養液９１とともにシャーレ９２に容れられ、このシャーレ９２はステージ９３上に置かれる。塊状細胞９０は、例えば、ヒトｉＰＳ細胞またはヒトＥＳ細胞から作られる心筋細胞の３次元集合体である心筋塊である。心筋塊は、心筋細胞だけでなく繊維芽細胞等も混合されて培養されたものである。
　レーザ光源１０は、ステージ９３に対し上方に設けられている。レーザ光源１０は、レーザ光を出力して該レーザ光をシャーレ９２内の塊状細胞９０に照射する。レーザ光源１０として任意のものが用いられ得る。レーザ光源１０から出力されるレーザ光は、ビームエクスパンダによりビーム径が拡大された後に塊状細胞９０に照射されてもよい。
　スペックル像取得部２０は、レーザ光源１０から出力されたレーザ光が塊状細胞９０に照射されることにより塊状細胞９０において生じた前方散乱光による２次元スペックル像を取得する。スペックル像取得部２０は、このようなスペックル像を時系列で時刻ｔ１～ｔＮそれぞれに取得する。スペックル像取得部２０は、対物レンズ２１、ミラー２２、結像レンズ２３および撮像部２４を含む。
　対物レンズ２１は、ステージ９３に対して下方に設けられている。対物レンズ２１は、レーザ光源１０から出力されたレーザ光が塊状細胞９０に照射されることにより該塊状細胞９０において生じた前方散乱光を受光する。この前方散乱光は、対物レンズ２１、ミラー２２および結像レンズ２３を経て、撮像部２４の撮像面に到達する。撮像部２４は例えばＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラにより構成される。
　レーザ光源１０から出力されたレーザ光のうち塊状細胞９０で散乱されなかった光が対物レンズ２１に入射しないように、塊状細胞９０へのレーザ光入射方向と対物レンズ２１の光軸方向とがなす角度は適切に設定されているのが好ましい。このようにすることで、撮像部２４の撮像面が受光する光は、塊状細胞９０において生じた前方散乱光が主な成分となり、鮮明なスペックル像を得ることができる。
　評価装置１は、倒立顕微鏡の構成ではなく正立顕微鏡の構成であってもよい。後者の場合には、ステージ９３に対し下方にレーザ光源１０が設けられ、ステージ９３に対し上方に対物レンズ２１が設けられる。
　塊状細胞９０は、個々には１０μｍ程度の大きさの細胞が３次元に集合したものであり、全体として数百μｍの大きさを有する。塊状細胞９０の全体を観察したい場合には、観察視野を確保するために対物レンズ２１の倍率は低い方が好ましい。対物レンズ２１の倍率は例えば４倍または１０倍である。または、塊状細胞９０の全体を視野内に収めることができない場合には、塊状細胞９０の一部を視野内に収めるようにしてもよい。
　塊状細胞９０は、対物レンズ２１の光軸方向に厚みを有し、対物レンズ２１の焦点深度内に収まらない場合がある。しかし、スペックル像は、焦点面だけでなく焦点面を外れたところでも形成される性質を有することから、対物レンズ２１の光軸方向位置は重要ではない。対物レンズ２１の焦点面は塊状細胞９０の内部にあればよい。
　スペックル像取得部２０により各スペックル像を取得する際の露光時間は、動きのある塊状細胞９０から得られるスペックル像のコントラストに影響するので、鮮明なスペックル像を得ることができるように１ｍｓ～３０ｍｓ程度の適切な時間に設定されることが好ましい。本実施形態では露光時間は重要なパラメータである。そもそも、試料の動きによってスペックルコントラストが変化する理由は、試料の動きに伴ってスペックル像の光強度が露光時間内に明暗を繰り返すことで時間的に平均化されるからである。したがって、露光時間が試料の動きに対して十分に短い場合には、スペックルコントラストは変化しないことになる。一方、露光時間が試料の動きに対して十分に長い場合には、スペックルコントラストは変化しないことになる。したがって、適当な露光時間に設定する必要がある。
　動物の心筋及び乳頭筋の場合、非特許文献２，３によると、収縮ピークに達するまでの時間は約２００～４００msec、弛緩に要する時間は約４００～８００msecである。拍動を強める又は弱める薬効評価を考えた場合には、速度は１／１０～１０倍程度を想定する必要があり、収縮と弛緩の解析で考慮すべき時間範囲は２０～８０００msecとなる。ただし、動物とヒト等の種によってビートレートは異なるので、収縮と弛緩を解析する時間範囲としてはさらに広げて、１～１００００msecを考慮すべきと考える。
　露光時間Δｔは、以下の２つの条件から考慮されるべきである。第１の条件は、心筋塊の心拍の周波数をｆＢとし、カメラのフレームレート（Ｈｚ）をｆｓとしたとき、ｆＳ＞ｆＢ を満たす露光時間Δｔである必要がある。この関係式を満たさないカメラのフレームレートでは、心筋塊の収縮・弛緩時の速度の分離が不可能である。なお、カメラのフレームレートｆｓと露光時間Δｔとの間には ｆｓ＜１／Δｔ の関係があることから、ｆＳ＞ｆＢ を満たす露光時間Δｔを決定することができる。
　第２の条件は、心筋塊が動く速さをＶとし、スペックル像がぶれなく得られるときの露光時間をΔとすれば、サンプリング定理と併せて、速度変化による光の位相変化量（２π／λ）ＶΔｔが、少なくともπ以下である必要がある。つまり、Δｔ＜λ／Ｖ であることが必要となる。たとえば、中心波長０.６３３μｍのＨｅＮｅレーザーを照明光に使用し、心筋塊の速さをＶ＝１０μ／ｓとしたとき、露光時間は約Δｔ＝６３ｍｓと試算される。実際にはこの得られた数値の１／２から１／１０の値の露光時間が好ましい。
　前記適切な露光時間は、移動する物体から発生するスペックル像がぶれなく撮影できるまでの充分短い露光時間（または十分早いフレームレート）にて一旦撮影し、その時系列スペックル画像をコンピュータのメモリに蓄積した後、コンピュータ上にて適当な枚数のフレーム間の積算を行い、疑似的に適切な露光時間に調整してもよい。
　露光時間によってスペックルコントラストは変動する。したがって、スペックルコントラストから速さを定量的に求める際に、スペックルコントラスト値を露光時間Ｔで規格化するのが好ましい。なお、露光時間が試料の動きに対して十分短い場合、および、露光時間が試料の動きに対して十分長い場合には、スペックルコントラスト値を露光時間Ｔで規格化しても、正しい速さは得られない。
　記憶部５０は、スペックル像取得部２０により時刻ｔ１～ｔＮのうちの各時刻ｔｎに取得されたスペックル像Ｉｎ(ｘ,ｙ)を記憶する。ｘ，ｙは、２次元スペックル像における位置を表す座標値であり、撮像部２４がＣＣＤである場合のように２次元画素構造を有する場合には画素位置を表す座標値である。また、記憶部５０は、後述するＳＣ算出部３０により得られた結果をも記憶する。
　ＳＣ算出部３０は、記憶部５０により記憶された各時刻ｔｎのスペックル像Ｉｎのスペックルコントラスト値Ｋｎを算出する。ＳＣ算出部３０は、これらスペックルコントラスト値Ｋ１～ＫＮのうちの最大値Ｋmaxを求める。ＳＣ算出部３０は、各時刻ｔｎのスペックルコントラスト値Ｋｎを最大値Ｋmaxで規格化して規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'を求める。そして、評価部４０は、ＳＣ算出部３０により求められた各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'に基づいて、塊状細胞９０の動きを評価する。
　なお、後述するように、各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'，相関時間τｎおよび速さＶｎの三者の間には、相互依存性が存在する。したがって、塊状細胞９０の動きの評価は、各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'，相関時間τｎおよび速さＶｎの何れに基づいてもよい。
　図１中に薬剤投与部９５によって模式的に示すように、薬剤投与手段が設けられるのが好適である。この薬剤投与手段は、スペックル像取得部２０によるスペックル像取得の前または途中に塊状細胞９０に薬剤を投与する。このとき、評価部４０は、塊状細胞９０の動きの評価結果に基づいて、薬剤投与手段により投与された薬剤が塊状細胞９０に与える影響を評価する。
　本実施形態の塊状細胞評価方法は、塊状細胞評価装置１を用いて行われ得る。本実施形態の塊状細胞評価方法は、スペックル像取得ステップ、ＳＣ算出ステップおよび評価ステップを順に行う。
　スペックル像取得ステップにおいて、レーザ光源１０により塊状細胞９０にレーザ光が照射される。そして、スペックル像取得部２０により、そのレーザ光照射により塊状細胞９０において生じた前方散乱光によるスペックル像が時系列で時刻ｔ１～ｔＮそれぞれに取得される。各時刻ｔｎに取得されたスペックル像Ｉｎ(ｘ,ｙ)は記憶部５０により記憶される。
　ＳＣ算出ステップにおいて、ＳＣ算出部３０により、各時刻ｔｎのスペックル像のスペックルコントラスト値Ｋｎが算出され、これらスペックルコントラスト値Ｋ１～ＫＮのうちの最大値Ｋmaxが求められ、各時刻ｔｎのスペックルコントラスト値Ｋｎが最大値Ｋmaxで規格化されて規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'が求められる。そして、評価ステップにおいて、評価部４０により、各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'に基づいて、塊状細胞の動きが評価される。
　スペックル像取得ステップの前または途中に薬剤投与手段により塊状細胞９０に薬剤を投与する薬剤投与ステップを更に備えるのが好適である。この場合、評価ステップにおいて、評価部４０により、塊状細胞の動きの評価結果に基づいて、薬剤が塊状細胞に与える影響が評価される。
　次に、ＳＣ算出部３０および評価部４０それぞれの処理（スペックル像取得ステップおよびＳＣ算出ステップそれぞれの処理）の内容について更に詳細に説明する。
　先ず、スペックル像Ｉｎ(ｘ,ｙ)の各位置(ｘ,ｙ)を中心とするウィンドウサイズ２Ｗ＋１の領域にある (２Ｗ＋１)２個の画素の輝度の平均値Ｉmeanおよび標準偏差σを求める。各位置(ｘ,ｙ)のスペックルコントラスト値Ｋｎを、これら平均値Ｉmeanおよび標準偏差σから下記（１）式により算出する。各時刻ｔｎのスペックル像Ｉｎ(ｘ,ｙ)の全画素についてスペックルコントラスト値Ｋｎを求めることで、スペックル像Ｉｎ(ｘ,ｙ)に対するスペックルコントラスト像Ｋｎ(ｘ,ｙ)を算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　各時刻ｔｎのスペックルコントラスト像Ｋｎ(ｘ,ｙ)の全画素のスペックルコントラスト値の平均値（平均スペックルコントラスト値）Ｋｎ_meanを求める。Ｎ個の平均スペックルコントラスト値Ｋ１_mean～ＫＮ_meanのうちの最大値Ｋmaxを求める。そして、各時刻ｔｎの平均スペックルコントラスト値Ｋｎ_meanを最大値Ｋmaxで規格化して規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'（＝Ｋｎ_mean／Ｋmax）を求める。
　このような規格化を行うのは以下の理由による。すなわち、理論的には、理想的な条件下で静止試料から得られる十分発達したスペックル（fully developed speckle）のコントラスト値は１であることが知られている。また、一般にスペックルコントラスト値は１以下であることが知られている。一方、試料が静止していても、実際の条件は理想的な条件と異なっている。実際には、例えば迷光やレーザ光の可干渉距離により、静止試料から得られるスペックルのコントラスト値は１とならない場合がある。このような理論値と実測値との相違は、試料の動きの評価を行う際には問題となる。そこで、上述したような規格化を行う。
　そして、各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'から下記（２）式により相関時間τｎを求め、各時刻ｔｎの相関時間τｎから下記（３）式により速さＶｎを求める。なお、Ｔは各スペックル像を取得する際の露光時間であり、λはレーザ光波長である。また、スペックルコントラスト値と相関時間との間の関係式としては（２）式以外のものも知られている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000003
　なお、各時刻ｔｎのスペックルコントラスト像Ｋｎ(ｘ,ｙ)から平均スペックルコントラスト値Ｋｎ_meanを求める演算操作は（２）式の後に行ってもよい。その場合は、相関時間像τｎ(ｘ,ｙ)から平均相関時間τｎ_meanを演算する。また、上記平均演算は（３）式の後に行ってもよく、この場合、相関時間像τｎ(ｘ,ｙ)から速さ像Ｖｎ(ｘ,ｙ)を求め、その後に平均速さＶｎを求めてもよい。
　また、ＳＣ算出部３０は、得られたスペックル像Ｉｎ(ｘ,ｙ)を、適当な複数画素で構成される複数の区画像Ｉｎ （ｍ）に区画化してもよい。この場合、以後、それぞれの区画像Ｉｎ （ｍ）に対して、Ｋｎ、Ｋｎ’、τｎおよび速さＶｎを算出して、これらのパラメータの２次元マッピング像を得て塊状細胞９０の動きを評価する。なおＩｎ （ｍ）のｍは、区画番号を表す。
　（２）式および（３）式に示されるように、各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'，相関時間τｎおよび速さＶｎの三者の間には相互依存性が存在する。したがって、各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'，相関時間τｎおよび速さＶｎの何れも、塊状細胞９０の動きを評価する点では同等であり、塊状細胞９０の動きの評価の指標として用いられ得る。
　（実施例１）
　次に、本実施形態の塊状細胞評価装置および塊状細胞評価方法の実施例について説明する。本実施例では、評価対象の塊状細胞９０は、大きさ約６００μｍの心筋塊であった。レーザ光源１０は、波長６３３ｎｍのレーザ光を出力するＨｅＮｅレーザ光源であった。対物レンズ２１の倍率は１０倍であった。撮像部２４は、画素数が５１２×５１２であるＣＣＤカメラであり、１画素の大きさが１６ｘ１６μｍであった。撮像部２４による撮像の際の露光時間は１０ｍｓであり、フレームレートは１００ｆｐｓであった。
　図２は、本実施例で取得されたスペックル像の写真である。図２に示されるスペックル像Ａ～Ｃそれぞれの視野の大きさは０.８２×０.８２μｍである。スペックル像Ａは、心筋塊が停止期間にあるときの像である。スペックル像Ｂは、心筋塊が収縮期にあるときの像である。また、スペックル像Ｃは、心筋塊が弛緩期にあるときの像である。
　心筋塊が停止期間にあるときのスペックル像Ａでは、スペックルパターン（明暗パターン）が鮮明に観察される。これに対して、心筋塊が収縮期にあるときのスペックル像Ｂでは、スペックルパターンが低減している。心筋塊の拍動（伸縮）に伴い、スペックルパターンは明暗を繰り返す。露光時間に対して十分に早く明暗を繰りかえすことから、心筋塊が収縮期にあるときのスペックル像Ｂでは、スペックルパターンがぶれて見え、言い換えればコントラストの低下を招いている。このように、スペックルパターンのコントラストと試料の動きの速さとの間には相関がある。この相関に基づいて、スペックルコントラストＫｎ'から相関時間τｎを求めることができ、更に速さＶｎを求めることができる。
　図３は、本実施例で求められた各時刻ｔｎの速さＶｎを示すグラフである。図３中で、ピーク１，３，５，７，９は心筋塊の収縮期の最大加速時を表し、ピーク２，４，６，８，１０は心筋塊の弛緩期の最大加速時を表している。また、図２のスペックル像Ａ～Ｃそれぞれを取得した時刻を、図３中でＡ～Ｃにより表している。この図３から、心筋塊の動き（例えば、各ピークが現れる間隔、収縮期ピークの大きさ、弛緩期ピークの大きさ、収縮期ピークおよび弛緩期ピークそれぞれの大きさの差または比）を評価することができる。さらに、心筋塊の動きの評価結果に基づいて、薬剤が心筋塊に与える影響を評価することができる。
　本発明による塊状細胞評価方法及び塊状細胞評価装置は、上記した実施形態、及び構成例に限られるものではなく、様々な変形が可能である。
　上記実施形態による塊状細胞評価方法では、（１）塊状細胞にレーザ光を照射して、そのレーザ光照射により塊状細胞において生じた前方散乱光によるスペックル像を時系列で時刻ｔ１～ｔＮそれぞれに取得するスペックル像取得ステップと、（２）このスペックル像取得ステップにおいて取得された時刻ｔ１～ｔＮのうちの各時刻ｔｎのスペックル像のスペックルコントラスト値Ｋｎを算出し、これらスペックルコントラスト値Ｋ１～ＫＮのうちの最大値Ｋmaxを求め、各スペックルコントラスト値Ｋｎを最大値Ｋmaxで規格化して規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'を求めるＳＣ算出ステップと、（３）このＳＣ算出ステップにおいて求められた各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ' またはこれから得られる相関時間τｎもしくは速さＶｎに基づいて、塊状細胞の動きを評価する評価ステップと、を備える構成としている。
　上記実施形態による塊状細胞評価装置では、（１）レーザ光を出力するレーザ光源と、（２）このレーザ光源から出力されたレーザ光が塊状細胞に照射されることにより塊状細胞において生じた前方散乱光によるスペックル像を時系列で時刻ｔ１～ｔＮそれぞれに取得するスペックル像取得部と、（３）このスペックル像取得部により取得された時刻ｔ１～ｔＮのうちの各時刻ｔｎのスペックル像のスペックルコントラスト値Ｋｎを算出し、これらスペックルコントラスト値Ｋ１～ＫＮのうちの最大値Ｋmaxを求め、各スペックルコントラスト値Ｋｎを最大値Ｋmaxで規格化して規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'を求めるＳＣ算出部と、（４）このＳＣ算出部により求められた各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ' またはこれから得られる相関時間τｎもしくは速さＶｎに基づいて、塊状細胞の動きを評価する評価部と、を備える構成としている。
　上記構成の塊状細胞評価方法は、スペックル像取得ステップの前または途中に塊状細胞に薬剤を投与する薬剤投与ステップを更に備えるのが好適であり、この場合、評価ステップにおいて、塊状細胞の動きの評価結果に基づいて、薬剤が塊状細胞に与える影響を評価するのが好適である。
　上記構成の塊状細胞評価装置は、スペックル像取得部によるスペックル像取得の前または途中に塊状細胞に薬剤を投与する薬剤投与手段を更に備えるのが好適であり、この場合、評価部が、塊状細胞の動きの評価結果に基づいて、薬剤が塊状細胞に与える影響を評価するのが好適である。
　上記構成の塊状細胞評価方法では、ＳＣ算出ステップにおいて、各時刻ｔｎのスペックル像を、複数画素で構成される複数の区画像に区画化し、各区画像に対してスペックルコントラスト値Ｋｎを算出するのが好適である。また、上記構成の塊状細胞評価装置では、ＳＣ算出部が、各時刻ｔｎのスペックル像を、複数画素で構成される複数の区画像に区画化し、各区画像に対してスペックルコントラスト値Ｋｎを算出するのが好適である。この場合、以降、各区画像に対して、Ｋｎ’、τｎおよび速さＶｎを算出して、これらのパラメータの２次元マッピング像を得て塊状細胞の動きを評価することになる。
　本発明は、塊状細胞の動きを容易に評価することができる方法および装置として利用可能である。
　１…塊状細胞評価装置、１０…レーザ光源、２０…スペックル像取得部、２１…対物レンズ、２２…ミラー、２３…結像レンズ、２４…撮像部、３０…ＳＣ算出部、４０…評価部、５０…記憶部、９０…塊状細胞、９１…培養液、９２…シャーレ、９３…ステージ。

Claims (6)

  1. 　塊状細胞にレーザ光を照射して、そのレーザ光照射により前記塊状細胞において生じた前方散乱光によるスペックル像を時系列で時刻ｔ１～ｔＮそれぞれに取得するスペックル像取得ステップと、
    　このスペックル像取得ステップにおいて取得された時刻ｔ１～ｔＮのうちの各時刻ｔｎのスペックル像のスペックルコントラスト値Ｋｎを算出し、これらスペックルコントラスト値Ｋ１～ＫＮのうちの最大値Ｋmaxを求め、各スペックルコントラスト値Ｋｎを最大値Ｋmaxで規格化して規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'を求めるＳＣ算出ステップと、
    　このＳＣ算出ステップにおいて求められた各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ' またはこれから得られる相関時間τｎもしくは速さＶｎに基づいて、前記塊状細胞の動きを評価する評価ステップと、
    　を備えることを特徴とする塊状細胞評価方法。
  2. 　前記スペックル像取得ステップの前または途中に前記塊状細胞に薬剤を投与する薬剤投与ステップを更に備え、
    　前記評価ステップにおいて、前記塊状細胞の動きの評価結果に基づいて、前記薬剤が前記塊状細胞に与える影響を評価する、
    　ことを特徴とする請求項１に記載の塊状細胞評価方法。
  3. 　前記ＳＣ算出ステップにおいて、各時刻ｔｎのスペックル像を、複数画素で構成される複数の区画像に区画化し、各区画像に対してスペックルコントラスト値Ｋｎを算出する、ことを特徴とする請求項１または２に記載の塊状細胞評価方法。
  4. 　レーザ光を出力するレーザ光源と、
    　このレーザ光源から出力されたレーザ光が塊状細胞に照射されることにより前記塊状細胞において生じた前方散乱光によるスペックル像を時系列で時刻ｔ１～ｔＮそれぞれに取得するスペックル像取得部と、
    　このスペックル像取得部により取得された時刻ｔ１～ｔＮのうちの各時刻ｔｎのスペックル像のスペックルコントラスト値Ｋｎを算出し、これらスペックルコントラスト値Ｋ１～ＫＮのうちの最大値Ｋmaxを求め、各スペックルコントラスト値Ｋｎを最大値Ｋmaxで規格化して規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ'を求めるＳＣ算出部と、
    　このＳＣ算出部により求められた各時刻ｔｎの規格化スペックルコントラスト値Ｋｎ' またはこれから得られる相関時間τｎもしくは速さＶｎに基づいて、前記塊状細胞の動きを評価する評価部と、
    　を備えることを特徴とする塊状細胞評価装置。
  5. 　前記スペックル像取得部によるスペックル像取得の前または途中に前記塊状細胞に薬剤を投与する薬剤投与手段を更に備え、
    　前記評価部が、前記塊状細胞の動きの評価結果に基づいて、前記薬剤が前記塊状細胞に与える影響を評価する、
    　ことを特徴とする請求項４に記載の塊状細胞評価装置。
  6. 　前記ＳＣ算出部が、各時刻ｔｎのスペックル像を、複数画素で構成される複数の区画像に区画化し、各区画像に対してスペックルコントラスト値Ｋｎを算出する、ことを特徴とする請求項４または５に記載の塊状細胞評価装置。
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