WO2014118151A1 - Verfahren und vorrichtung zur diagnose eines nasopharynx-karzinoms - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur diagnose eines nasopharynx-karzinoms Download PDF

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WO2014118151A1
WO2014118151A1 PCT/EP2014/051584 EP2014051584W WO2014118151A1 WO 2014118151 A1 WO2014118151 A1 WO 2014118151A1 EP 2014051584 W EP2014051584 W EP 2014051584W WO 2014118151 A1 WO2014118151 A1 WO 2014118151A1
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patient
substrate
antigen
antigens
antibody
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PCT/EP2014/051584
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Thomas Scheper
Wolfgang Meyer
Jana LANGNER
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Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag
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    • G01—MEASURING; TESTING
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
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    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • G01N2333/05—Epstein-Barr virus
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for diagnosing a nasopharyngeal carcinoma (NPC), in which a substrate having at least two immobilized thereon
  • NPC nasopharyngeal carcinoma
  • Antigens is incubated with a body fluid of a patient.
  • the antigens are selected in such a way that they bind at least in regions to form an antigen-antibody complex to an antibody which is located in the patient's body fluid and which is specific when an epstein-Barr virus infection occurs.
  • the formation of the antigen-antibody complex is visualized by means of a label on the substrate, which is recorded with an optical device. This recording is finally transmitted to an evaluation unit in which a diagnosis proposal is generated on the basis of at least one characteristic of the recorded identification.
  • Nasopharyngeal carcinoma also commonly referred to as "NPC” for nasopharyngeal carcinoma, is a nasopharyngeal cancer that belongs to the group of head and neck tumors, a major cause of endemic cancer
  • Nasopharyngeal carcinoma is the Epstein-Barr virus (EBV), various others.
  • Nasopharyngeal carcinoma EBV test systems are often used to diagnose a
  • Suitable test systems are described for example as a microtiter ELISA under the product name Anti-EBV-EA (El 2795-9601 A, G or M), as a line blot under the product name EBV profile 2 (DN 2790-1601 -2 G or M) or as Western blot under the product name Anti-EBV (DY 2790-1501 G or M) offered by the company EUROIMMUN Medical Laboratory Diagnostics AG.
  • the antibody response after EBV infection is very different due to the complexity of the viruses and the variability of the different infection phases.
  • antibodies of the antibody class IgM which are directed against the EA (early antigen) and the VCA (virus capsid antigen) and after the termination of the acute infection no longer exist or only in very low activity, occur shortly after an infection.
  • the anti-VCA-IgG antibodies formed at about the same time or somewhat delayed persist throughout their lifetime.
  • very high titres of the VCA IgG antibodies are characteristic of the occurrence of a nasopharyngeal carcinoma and, on the other hand, that the detection of anti-VCA IgA antibodies has a supporting effect in the NPC diagnosis.
  • elevated anti-EA antibody levels are characteristic in patients with nasopharyngeal carcinoma.
  • the ELI SA test systems which are used in many cases are distinguished by the fact that the antigens used, in particular VCA and EA, are present as a mixture and thus, in the examination of a patient sample, only the presence of at least one
  • Antibody can be diagnosed from a group of antibodies.
  • blotting systems offer the advantage that the individual antigens are present on a membrane separately from one another, so that all antigen bands can be evaluated separately from each other, which ultimately allows a very detailed evaluation of a band pattern for diagnosis.
  • optical devices in particular scanners or cameras, are used for the evaluation of band patterns in blot systems, and the evaluation of the recorded images is realized with the aid of suitable laboratory software.
  • BlotstMail Evaluation of BlotstMail known.
  • the described device is characterized in that images of the incubated blot strips are digitized with the aid of a scanner and thus supplied to an electronic evaluation unit.
  • the evaluation of the blot strips finally takes place taking into account the colorations or the intensities of the blots on the BlotstMail.
  • the individual blot strips are preferably positioned on the scanner such that it is possible to discrete discoloration of the blots in comparison to
  • test systems are available for diagnosing EBV infection.
  • none of the known test systems is able to make a direct statement, in particular a diagnostic suggestion, to a physician regarding the question of how far the risk of nasopharyngeal carcinoma exists in a patient. This is mainly due to the fact that a reliable diagnosis is only possible if the presence of specific antibodies in a patient sample, in particular their occurrence in combination, and preferably also the antibody titer, can be reliably determined.
  • the invention is therefore based on the object to provide a test system with which a decision on the presence of a nasopharyngeal carcinoma in a patient can be made with great certainty.
  • the test system to be specified should be based on known methods and be relatively simple and safe to carry out. At the same time, it should enable the most cost-effective diagnosis while at the same time ensuring high sensitivity and specificity of the test.
  • the invention is based on a method for diagnosing a nasopharyngeal carcinoma in a patient in which a substrate having at least two antigens immobilized thereon is incubated with a body fluid of the patient.
  • the antigens are in this case selected such that they each bind at least partially to form an antigen-antibody complex to a body fluid located in the patient and specific in the occurrence of Epstein-Barr virus infection antibody.
  • the formation of the respective antigen-antibody complex is to be visualized by means of at least one label on the substrate which appears after incubation of the substrate with a positive patient sample.
  • the surface of the substrate in particular a region in which at least one visible label appears when an antigen-antibody complex is formed, is recorded with an optical device and the recording is fed to an evaluation unit.
  • the recording is fed to an evaluation unit.
  • Evaluation unit generates a diagnosis proposal.
  • the method has been developed in such a way that a membrane-based substrate, in particular a blot strip or blot piece is used, in each case a value for a color contrast between
  • Marking surface of the substrate is determined and the Diagnosis proposal is generated on the basis of a color contrast involving mathematical calculation rule.
  • the essential idea of the invention thus lies in the contrast between at least two identifications appearing on the incubated substrate, ie the
  • Diagnosis proposal the contrast values of the appearing on the substrate when antigen-antibody binding bands are detected and evaluated using a statistical computational model.
  • a statistical calculation model is preferably a logistic regression model, in particular a binomial logistic or a
  • each recorded band in a grayscale resolution and to give a corresponding value for the contrast.
  • the value 0 (zero) and for the maximum value, ie a maximum contrast the value 255
  • the contrast of a recorded marking is thus preferably scaled within a value range of 0 ⁇ L ⁇ 255.
  • Blot strips and / or blot pieces which have more than two antigens immobilized thereon are preferably suitable for the evaluation carried out according to the invention. Particularly advantageous is the use of at least five immobilized on a blot substrate antigens, preferably the antigens VCA GP 125, VCA P 19, EBNA-1, P 22 and EA-D.
  • the blot strip and / or the Blot Market used in each case is equipped with antigens that a
  • Patient sample is examined for the presence of antibodies at least two different antibody classes.
  • the patient sample intended for the examination is examined for the presence of antibodies of the antibody classes IgA, IgG and IgM by using suitable enzyme conjugates.
  • the method executed according to the invention is essentially based on the fact that the diagnosis proposal is made with the aid of a mathematical calculation model
  • a binomial logistic regression model is determined.
  • Such a model forms a ratio of probability and counter-probability, which are determined by means of suitable e-functions.
  • the contrast values of the individual bands are used as parameters of the binomial logistic regression model and at least partially form the exponents of the e-functions used.
  • the likelihood of detecting the presence of a nasopharyngeal carcinoma in the patients examined is finally determined.
  • the patient samples examined are each assigned to one of two groups, namely either the group of positive or negative patient samples. In order to ensure a corresponding division of the patient sample is a suitable
  • an optical recording unit is provided with which the color contrast of the individual bands of an incubated one
  • Such a recording unit is either a camera or a scanner. If the corresponding substrates are incubated with a positive patient sample, so-called antigen-antibody complexes are formed so that dark bands form as labels.
  • the bands will vary in color, so that the contrast between a band and the substrate region surrounding this band can vary accordingly.
  • the bands of the incubated substrates are recorded and determined the color difference or contrast to the environment.
  • the image taken with the help of a camera or a scanner is recorded in the
  • Evaluation unit with respect to its discoloration with grayscale images having staining values from 0 to 255, compared and classified accordingly. On the basis of the thus determined color intensity of a band or the contrast between the band and the substrate region surrounding this band, the generation of the
  • the determined contrast values are used in the mathematical calculation model, in particular a logistic regression model, and are based on the Based on the result determined, whether the patient sample is a positive or a negative sample.
  • the method described and the apparatus used therefor are characterized in particular by the fact that a calibration of the automatic recording device only has to be made before the device is put into operation and then at relatively long intervals. On the other hand, a calibration at the beginning of each measurement is not necessary.
  • Fig. 1 Incubated EUROLine EBV profile 2 of the company EUROIMMUN medical
  • Fig. 2 Incubated Western blot anti-EBV the company EUROIMMUN medical
  • the EURO-LINE test set from EUROIMMUN shown in FIG. 1 has hitherto primarily been used for the qualitative in-vitro determination of human antibodies, primarily the immunoglobulin class IgG, against the five EBV antigens VCA GP 125, VCA P 19, EBNA-1, P 22 and EA-D in serum or plasma. With the exception of the antigen VCA GP 125, which is natively purified in affinity chromatographic form, these are recombinant antigens.
  • VCA GP 125 which is natively purified in affinity chromatographic form
  • test strips coated with the described antigens are incubated in a first incubation step with diluted patient serum.
  • specific antibodies bind to the respective antigens.
  • the test strips are incubated with an enzyme conjugate, namely an enzyme-labeled anti-human IgG, IgA or IgM conjugate, which catalyzes a subsequent color reaction.
  • an enzyme conjugate namely an enzyme-labeled anti-human IgG, IgA or IgM conjugate, which catalyzes a subsequent color reaction.
  • an enzyme conjugate namely an enzyme-labeled anti-human IgG, IgA or IgM conjugate, which catalyzes a subsequent color reaction.
  • antibodies of the immunoglobulin class IgG, IgM or IgA can be detected in a patient sample in this way. If there is formation of antigen-antibody complexes, the respective bands appear as markings at the sites of the test strips provided for this purpose.
  • IgG antibodies do not bind to EBNA-1 but IgG and IgM antibodies to VCA can be assumed to be caused by a primary or fresh EBV infection. If IgG antibodies bind to EBNA-1 and VCA, but no binding of IgM antibodies to VCA takes place, an expired EBV infection can be assumed. On the other hand, although binding of IgG antibodies to p22 and VCA takes place while IgG antibodies Antibodies do not bind to EBNA-1 may be due to an elapsed EBV infection with loss of EBNA-1 antibodies.
  • the incubation troughs are diluted according to the number of patient samples to be examined with 1.5 ml each of ready-to-use
  • test strips are mounted on an evaluation protocol
  • the contrast of the individual bands with respect to the surface of the test strip in its immediate vicinity is determined.
  • the contrast or the color intensity of the recorded bands is determined by an evaluation unit with the aid of a gray scale scaling and classified accordingly. For this purpose, a grayscale scale from 0 to 255 is provided, so that each band is assigned a corresponding contrast value. In this way, first finds one
  • Test evaluation held.
  • the contrast values of the different bands obtained in this way are used as parameters in a logistic regression model and finally a probability value is determined with the aid of the model. If this probability value lies above a predetermined limit value, then the examined patient sample is classified as a positive sample and a corresponding diagnosis proposal is generated. In this case, it is expected that a nasopharyngeal carcinoma will be present in the patient from whom the sample originates. If, on the other hand, a probability value is determined which is below the predetermined limit value, then it can be assumed that no corresponding tumor is present in the examined patient.
  • Patient serum antibodies of the antibody classes IgG, IgM or IgA could be detected or the contrast values of the individual bands (for example, IgG-p22 and IgA-EBNA) were suitably used as parameters in the regression model.
  • particularly advantageous calculation models provide a binary logistic regression model with the variants inclusion (all parameters) and exclusion
  • Variants Main effects (all parameters and stepwise backward).
  • the corresponding regression models to determine the likelihood of the occurrence of nasopharyngeal carcinoma at least two, usually more
  • Each recorded band which thus has a color difference from the environment, in this case represents the formation of a complex of antigen and antibody contained in the patient's serum.
  • the patient sample is likewise tested for the presence of antibodies of different antibody classes, namely the classes IgA, IgG and IgM.
  • the evaluation unit With the aid of the logistic regression model stored in the evaluation unit, by which an incidence probability is compared with a counter-probability, the patient samples examined are divided into two groups, namely the positive and the negative samples. On the basis of this division, the evaluation unit finally generates a diagnosis proposal that provides information on whether the patient whose serum has been examined has the risk of an existing one
  • Nasopharyngeal carcinoma exists.
  • the evaluation of the emerging on the incubated test strip band pattern taking into account the color contrast or the Color intensity of the individual bands provides a comparatively simple way to create a very accurate diagnosis in relation to the presence of a nasopharyngeal carcinoma by using known statistical methods.
  • Figure 2 shows a Western blot test strip, which was previously provided mainly for the qualitative in vitro determination of human antibodies, especially the immunoglobulin class IgG against EBV antigens from serum or plasma.
  • the blot strip is coated with an electrophoretically separated antigen extract from Epstein-Barr viruses.
  • the blot strip is first incubated with a diluted patient sample.
  • specific antibodies bind to the corresponding antigens.
  • the correspondingly required enzyme conjugate ie enzyme-labeled anti-human IgG, IgA or IgM conjugate, which catalyses a subsequent color reaction, is incubated in a second step.
  • the incubation of the Western blot strip shown in FIG. 2 takes place in the steps of blocking, sample incubation, washing, conjugate incubation, washing,
  • Band pattern again takes place automatically with the aid of an optical recording unit, in particular with a scanner or a camera, and an evaluation unit.
  • Color intensity of the individual bands ie the difference in brightness between the bands and the background determined, wherein in the evaluation unit, a gray scale based scaling to a value between 0 and 255 takes place.
  • the contrast values of the individual bands are taken into account as parameters in a binomial logistic regression model stored in the evaluation unit, the contrast values at least partially forming the exponent of an e-function.
  • a probability value is thus determined with the aid of the regression model, which is taken into account when preparing a diagnosis proposal.

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Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Diagnose eines Nasopharynx-Karzinoms bei einem Patienten, bei dem ein Substrat mit wenigstens zwei darauf immobilisierten Antigenen mit einer Körperflüssigkeit des Patienten inkubiert wird. Die Antigene sind hierbei derart gewählt, dass diese jeweils wenigstens bereichsweise unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes an einen in der Körperflüssigkeit des Patienten befindlichen und bei Auftreten einer Eppstein-Barr-Virus-Infektion spezifischen Antikörper binden. Die Bildung des jeweiligen Antigen-Antikörper-Komplexes ist mit Hilfe zumindest einer Kennzeichnung auf dem Substrat, die nach Inkubation des Substrats mit einer positiven Patientenprobe erscheint, sichtbar zu machen. Nach erfolgter Inkubation wird die Oberfläche des Substrats, insbesondere ein Bereich, in dem bei Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes wenigstens eine sichtbare Kennzeichnung erscheint, mit einer optischen Einrichtung aufgenommen und die Aufnahme einer Auswerteeinheit zugeführt. Auf der Grundlage wenigstens einer Eigenschaft der aufgenommenen Kennzeichnung wird durch die Auswerteeinheit ein Diagnosevorschlag generiert. Die beschriebene technische Lösung zeichnet sich dadurch aus, dass ein membranbasiertes Substrat, insbesondere ein Blotstreifen oder Blotstück verwendet wird, jeweils ein Wert für einen Farbkontrast zwischen aufgenommener, in Form einer Bande ausgeführten Kennzeichnung und einer die Kennzeichnung umgebenden Oberfläche des Substrats bestimmt wird und der Diagnosevorschlag auf der Grundlage einer den Farbkontrast einbeziehenden mathematischen Rechenvorschrift generiert wird.

Description

Titel:
Verfahren und Vorrichtung zur Diagnose eines Nasopharynx-Karzinoms
Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Diagnose eines Nasopharynx- Karzinoms (NPC), bei dem ein Substrat mit wenigstens zwei darauf immobilisierten
Antigenen mit einer Körperflüssigkeit eines Patienten inkubiert wird. Die Antigene sind hierbei derart gewählt, dass diese wenigstens bereichsweise unter Bildung eines Antigen- Antikörper-Komplexes an einen in der Körperflüssigkeit des Patienten befindlichen, bei Auftreten einer Eppstein-Barr-Virus-Infektion spezifischen Antikörper binden. Die Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes wird mit Hilfe einer Kennzeichnung auf dem Substrat sichtbar gemacht, die mit einer optischen Einrichtung aufgenommen wird. Diese Aufnahme wird schließlich an eine Auswerteeinheit übertragen, in der auf der Grundlage wenigstens einer Eigenschaft der aufgenommenen Kennzeichnung ein Diagnosevorschlag generiert wird.
Ein Nasopharynx-Karzinom, das häufig auch mit„NPC" für Nasopharyngeal Carcinoma abgekürzt wird, ist eine Krebserkrankung des Nasenrachens. Der Nasenrachenkrebs gehört zu der Gruppe der Kopf-Hals-Tumore. Als wesentliche Ursache des endemischen
Nasopharynx-Karzinoms gelten das Epstein-Barr-Virus (EBV), verschiedene
Umweltfaktoren, Ernährungsgewohnheiten und genetische Eigenheiten des jeweiligen Patienten. Die Erkrankung ist weltweit verbreitet, kommt aber gehäuft in bestimmten
Regionen Südchinas vor. Neben genetischer Disposition gelten auch Umwelteinflüsse, wie zum Beispiel Ernährungsgewohnheiten, als Ko-Faktor.
Aufgrund der Korrelation zwischen einer EBV-Infektion und dem Auftreten eines
Nasopharynx-Karzinoms werden EBV-Testsysteme vielfach zur Diagnose einer
entsprechenden Tumorerkrankung verwendet. In diesem Zusammenhang sind für die Diagnose einer EBV-Infektion unterschiedliche Testsysteme bekannt, wobei die Infektion entweder über einen Antigen-Direktnachweis oder aber über serologische Methoden diagnostiziert wird. Aufgrund des hohen technischen und zeitlichen Aufwandes bei der Durchführung des Direktnachweises ist die Serologie die Methode der Wahl, da sie zudem eine Unterscheidung der verschiedenen Phasen einer EBV-Infektion zulässt. Hierbei ist es durchaus üblich, einen entsprechenden serologischen Nachweis über den Nachweis spezifischer Antikörper mittels Immunfluoreszenztest, ELISA oder Immunoblot-Verfahren zu führen. Geeignete Testsysteme werden beispielsweise als Mikrotiter-ELISA unter der Produktbezeichnung Anti-EBV-EA (El 2795-9601 A, G oder M), als Linienblot unter der Produktbezeichnung EBV-Profil 2 (DN 2790-1601 -2 G oder M) oder als Westernblot unter der Produktbezeichnung Anti-EBV (DY 2790-1501 G oder M) von der Firma EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG angeboten. Die Antikörperantwort nach einer EBV-Infektion fällt aufgrund der Komplexität der Viren und der Variabilität der verschiedenen Infektionsphasen sehr unterschiedlich aus. So treten kurz nach einer Infektion vor allem Antikörper der Antikörperklasse IgM auf, die gegen das EA (Early Antigen) und das VCA (Virus Capsid Antigen) gerichtet sind und nach Abklingen der akuten Infektion nicht mehr oder nur in sehr geringer Aktivität vorhanden sind. Dahingegen persistieren die etwa zeitgleich oder etwas verzögert gebildeten Anti-VCA-lgG-Antikörper lebenslang. Weiterhin ist bekannt, dass einerseits sehr hohe Titer der VCA-lgG-Antikörper charakteristisch für das Auftreten eines Nasopharynx-Karzinoms sind und dass andererseits dem Nachweis von Anti-VCA-lgA-Antikörpern bei der NPC-Diagnose eine unterstützende Aussage zukommt. Ebenso ist ein erhöhter Anti-EA-Antikörperspiegel charakteristisch bei Patienten mit Nasopharynx-Karzinom.
Die vielfach verwendeten ELI SA-Testsysteme zeichnen sich dadurch aus, dass die verwendeten Antigene, insbesondere VCA und EA, als Gemisch vorliegen und somit bei der Untersuchung einer Patientenprobe lediglich das Vorhandensein wenigstens eines
Antikörpers aus einer Gruppe von Antikörpern diagnostiziert werden kann. Demgegenüber bieten Blotsysteme den Vorteil, dass die einzelnen Antigene getrennt voneinander auf einer Membran vorliegen, so dass alle Antigenbanden getrennt voneinander ausgewertet werden können, was letztendlich eine sehr detaillierte Auswertung eines Bandenmusters zur Diagnoseerstellung zulässt. In diesem Zusammenhang ist es bekannt, dass zur Auswertung von Bandenmustern bei Blotsystemen optische Einrichtungen, insbesondere Scanner oder Kameras verwendet werden und die Auswertung der aufgenommenen Bilder mit Hilfe einer geeigneten Laborsoftware realisiert wird.
Entsprechende Systeme zur automatischen Auswertung membranbasierter Testsysteme werden beispielweise von der Firma EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG unter der Bezeichnung EUROBIotCamera bzw. EUROBIotScanner angeboten und vertrieben. Die entsprechend aufgenommenen Bilder können mit Hilfe einer geeigneten Software, die unter der Produktbezeichnung EUROLINESCAN angeboten wird, vollautomatisch verwaltet, dokumentiert und elektronisch archiviert werden.
Aus der DE 100 61 352 A1 ist ebenfalls eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur
Auswertung von Blotstreifen bekannt. Die beschriebene Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, dass Bilder der inkubierten Blotstreifen mit Hilfe eines Scanners digitalisiert und so einer elektronischen Auswerteeinheit zugeführt werden. Die Auswertung der Blotstreifen erfolgt schließlich unter Berücksichtigung der Färbungen bzw. der Intensitäten der Blots auf den Blotstreifen. Hierzu werden bevorzugt die einzelnen Blotstreifen auf dem Scanner derart positioniert, dass es möglich ist, diskrete Verfärbungen der Blots im Vergleich zu
Hintergrundfärbung der Blotstreifen zu erfassen. Zusammenfassend kann somit festgestellt werden, dass unterschiedliche Testsysteme zur Diagnose einer EBV-Infektion vorhanden sind. Keines der bekannten Testsysteme ist allerdings in der Lage, einem Arzt in Bezug auf die Fragestellung, in wieweit das Risiko eines Nasopharynx-Karzinoms bei einem Patienten besteht, eine direkte Aussage, insbesondere einen Diagnosevorschlag, zu machen. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, dass eine zuverlässige Diagnose nur möglich ist, wenn zuverlässig das Vorhandensein spezieller Antikörper in einer Patientenprobe, insbesondere deren Auftreten in Kombination, sowie vorzugsweise auch der Antikörpertiter bestimmt werden kann.
Ausgehend von den bekannten Vorrichtungen und Verfahren zur Diagnose einer EBV- Infektion liegt der Erfindung somit die Aufgabe zu Grunde, ein Testsystem anzugeben, mit dem mit großer Sicherheit eine Entscheidung über das Vorliegen eines Nasopharynx- Karzinoms bei einem Patienten getroffen werden kann. Das anzugebene Testsystem soll hierbei auf bekannten Verfahren aufbauen und verhältnismäßig einfach und sicher auszuführen sein. Gleichzeitig soll es eine möglichst kostengünstige Diagnose bei gleichzeitig hoher Sensivität und Spezifität des Tests ermöglichen.
Die vorstehend geschilderte Aufgabe wird mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie einer Vorrichtung nach Anspruch 8 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.
Die Erfindung beruht auf einem Verfahren zur Diagnose eines Nasopharynx-Karzinoms bei einem Patienten, bei dem ein Substrat mit wenigstens zwei darauf immobilisierten Antigenen mit einer Körperflüssigkeit des Patienten inkubiert wird. Die Antigene sind hierbei derart gewählt, dass diese jeweils wenigstens bereichsweise unter Bildung eines Antigen- Antikörper-Komplexes an einen in der Körperflüssigkeit des Patienten befindlichen und bei Auftreten einer Eppstein-Barr-Virus-Infektion spezifischen Antikörper binden. Die Bildung des jeweiligen Antigen-Antikörper-Komplexes ist mit Hilfe zumindest einer Kennzeichnung auf dem Substrat, die nach Inkubation des Substrats mit einer positiven Patientenprobe erscheint, sichtbar zu machen. Nach erfolgter Inkubation wird die Oberfläche des Substrats, insbesondere ein Bereich, in dem bei Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes wenigstens eine sichtbare Kennzeichnung erscheint, mit einer optischen Einrichtung aufgenommen und die Aufnahme einer Auswerteeinheit zugeführt. Auf der Grundlage wenigstens einer Eigenschaft der aufgenommenen Kennzeichnung wird durch die
Auswerteeinheit ein Diagnosevorschlag generiert. Erfindungsgemäß ist das Verfahren derart weitergebildet worden, dass ein membranbasiertes Substrat, insbesondere ein Blotstreifen oder Blotstück verwendet wird, jeweils ein Wert für einen Farbkontrast zwischen
aufgenommener, in Form einer Bande ausgeführten Kennzeichnung und einer die
Kennzeichnung umgebenden Oberfläche des Substrats bestimmt wird und der Diagnosevorschlag auf der Grundlage einer den Farbkontrast einbeziehenden mathematischen Rechenvorschrift generiert wird.
Der wesentliche Gedanke der Erfindung liegt somit darin, den Kontrast wenigstens zweier auf dem inkubierten Substrat erscheinender Kennzeichnungen, also den
Helligkeitsunterschied zwischen den in Form von Banden erscheinenden Kennzeichnungen und den diese Banden umgebenden Substratoberflächenbereichen, zu ermitteln und derart zu quantifizieren, dass durch eine geeignete Auswertung der ermittelten Kontrastwerte eine Aussage über das Risiko für den jeweiligen Patienten, dass dieser über ein Nasopharynx- Karzinom verfügt, getroffen werden kann. Zur Auswertung und Generierung eines
Diagnosevorschlags werden die Kontrastwerte der auf dem Substrat bei Auftreten einer Antigen-Antikörper-Bindung erscheinenden Banden erfasst und mit Hilfe eines statistischen Rechenmodells ausgewertet. Als statistisches Rechenmodell wird bevorzugt ein logistisches Regressionsmodell, insbesondere ein binomiales logistisches oder ein
multinomiallogistisches Regressionsmodell, verwendet, wobei die für die einzelnen Banden aufgenommenen und quantifizierten Kontrastwerte als Parameter in das Rechenmodell eingefügt werden. Auf der Grundlage des Ergebnisses, das das Rechenmodell unter Verwendung der Kontrastwerte liefert, wird in der Auswerteeinheit ein Diagnosevorschlag generiert, der letztendlich dem untersuchenden Arzt Auskunft darüber gibt, ob die untersuchte Patientenprobe darauf schließen lässt, dass beim Patienten ein Nasopharynx- Karzinom vorhanden ist.
Um einen quantifizierten Wert für den Kontrast einer Kennzeichnung zu erhalten, wird auf bevorzugte Weise jede aufgenommene Bande nach Graustufen aufgelöst untersucht und für den Kontrast ein entsprechender Wert angegeben. Gemäß einer speziellen Ausführungsform wird hierbei für einen minimalen Kontrastwert einer Bande, also für den Fall, dass sich eine Bande farblich nicht gegenüber der umgebenden Substratoberfläche abhebt, der Wert 0 (Null) und für den Maximalwert, also einen maximalen Kontrast, der Wert 255
(Zweihundertfünfundfünfzig) vergeben. Der Kontrast einer aufgenommenen Kennzeichnung wird somit bevorzugt innerhalb eines Wertebereichs von 0 < L < 255 skaliert.
Für die erfindungsgemäß ausgeführte Auswertung eignen sich bevorzugt Blotstreifen und/oder Blotstücke, die mehr als zwei darauf immobilisierte Antigene aufweisen. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von mindestens fünf auf einem Blot-Substrat immobilisierten Antigenen, vorzugsweise der Antigene VCA GP 125, VCA P 19, EBNA-1 , P 22 und EA-D.
Um auf bevorzugte Weise ein zuverlässiges Testergebnis zu realisieren, ist der Blotstreifen und/oder das jeweils verwendete Blotstück derart mit Antigenen bestückt, dass eine
Patientenprobe auf das Vorhandensein von Antikörpern wenigstens zweier unterschiedlicher Antikörperklassen untersucht wird. Gemäß einer ganz speziellen Weiterbildung der Erfindung wird die für die Untersuchung vorgesehene Patientenprobe mittels Einsatz geeigneter Enzymkonjugate auf das Vorhandensein von Antikörpern der Antikörperklassen IgA, IgG und IgM untersucht.
Das erfindungsgemäß ausgeführte Verfahren beruht im Wesentlichen darauf, dass der Diagnosevorschlag unter Zuhilfenahme eines mathematischen Rechenmodells,
insbesondere eines binomialen logistischen Regressionsmodels, ermittelt wird. Ein derartiges Modell bildet ein Verhältnis aus Wahrscheinlichkeit und Gegenwahrscheinlichkeit, die mit Hilfe geeigneter e-Funktionen ermittelt werden. Gemäß einer speziellen
Weiterbildung der Erfindung werden die Kontrastwerte der einzelnen Banden als Parameter des binomialen logistischen Regressionsmodels verwendet und bilden zumindest teilweise die Exponenten der verwendeten e-Funktionen. Mit Hilfe der so durchgeführten Berechnung wird letztendlich die Wahrscheinlichkeit ermittelt, mit der bei den untersuchten Patienten auf das Vorhandensein eines Nasopharynx-Karzinoms geschlossen werden kann. Die untersuchten Patientenproben werden hierbei jeweils einer von zwei Gruppen zugeordnet, nämlich entweder der Gruppe der positiven oder der negativen Patientenproben. Um eine entsprechende Aufteilung der Patientenprobe zu gewährleisten wird ein geeigneter
Wahrscheinlichkeitswert als Grenzwert festgelegt.
Um dem in der Auswerteeinheit verwendeten Rechenmodell geeignete Kontrastwerte der Banden als Parameter zur Verfügung stellen zu können, ist eine optische Aufnahmeeinheit vorgesehen, mit der der Farbkontrast der einzelnen Banden eines inkubierten
Patientenstreifens oder eines inkubierten Blotstücks (EUROAssay) gegenüber ihrer
Umgebung aufgenommen wird. Bei einer derartigen Aufnahmeeinheit handelt es sich entweder um eine Kamera oder einen Scanner. Werden die entsprechenden Substrate mit einer positiven Patientenprobe inkubiert, kommt es zur Bildung von sogenannten Antigen- Antikörper-Komplexen, so dass sich dunkle Banden als Kennzeichnungen bilden. In
Abhängigkeit des Antikörper-Titers einer Patientenprobe verfärben sich die Banden unterschiedlich stark, so dass der Kontrast zwischen einer Bande und dem diese Bande umgebenden Substratbereich entsprechend variieren kann. Mit Hilfe der optischen
Aufnahmeeinheit werden die Banden der inkubierten Substrate aufgenommen und der Farbunterschied bzw. der Kontrast gegenüber der Umgebung ermittelt.
Das mit Hilfe einer Kamera oder eines Scanners aufgenommene Bild wird in der
Auswerteeinheit hinsichtlich seiner Verfärbung mit Graustufenbildern, die Verfärbungswerte von 0 bis 255 aufweisen, verglichen und entsprechend klassifiziert. Auf der Grundlage der so ermittelten Farbintensität einer Bande bzw. dem Kontrast zwischen der Bande und dem diese Bande umgebenden Substratbereich, erfolgt schließlich die Generierung des
Diagnosevorschlags. Hierfür werden die ermittelten Kontrastwerte in das mathematische Rechenmodell, insbesondere ein logistisches Regressionsmodell, eingesetzt und auf der Basis des ermittelten Ergebnisses festgelegt, ob es sich bei der Patientenprobe um eine positive oder negative Probe handelt.
Das beschriebene Verfahren sowie die hierfür verwendete Vorrichtung zeichnen sich vor allem dadurch aus, dass eine Kalibrierung der automatischen Aufnahmeeinrichtung lediglich vor Inbetriebnahme des Gerätes und dann in größeren zeitlichen Abständen erfolgen muss. Dagegen ist eine Kalibrierung zu Beginn jeder Messung nicht nötig.
Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen ohne Beschränkungen des allgemeinen Erfindungsgedanken unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Dabei zeigen:
Fig. 1 : Inkubiertes EUROLine-EBV-Profil 2 der Firma EUROIMMUN medizinische
Labordiagnostika AG sowie
Fig. 2: Inkubierter Western blot-Anti-EBV der Firma EUROIMMUN medizinische
Labordiagnostika AG.
Der in Figur 1 dargestellte EURO Line-Testsatz der Firma EUROIMMUN diente bislang vornehmlich der qualitativen In-vitro-Bestimmung humaner Antikörper, vornehmlich der Immunglobulinklasse IgG, gegen die fünf EBV-Antigene VCA GP 125, VCA P 19, EBNA-1 , P 22 und EA-D in Serum oder Plasma. Mit Ausnahme des Antigens VCA GP 125, das nativ in affinitätschromatographisch aufgereinigter Form vorliegt, handelt es sich hierbei um rekombinante Antigene. Durch Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, mit Hilfe des vorgenannten Tests auch quantitative Aussagen, insbesondere in Bezug auf die Wahrscheinlichkeit, mit der bei einem untersuchten Patienten ein Nasopharynx-Karzinom vorliegt, zu machen.
Die mit den beschriebenen Antigenen beschichteten Teststreifen werden in einem ersten Inkubationsschritt mit verdünntem Patientenserum inkubiert. Bei positiven Proben binden sich spezifische Antikörper an die jeweiligen Antigene. In einem zweiten Schritt werden die Teststreifen mit einem Enzymkonjugat, nämlich einem enzymmarkierten Anti-human-IgG, - IgA oder IgM-Konjugat, das eine sich anschließende Farbreaktion katalysiert, inkubiert. In Abhängkeit des verwendeten Enzymkonjugats können auf diese Weise Antikörper der Immunglobulinklasse IgG, IgM oder IgA in einer Patientenprobe nachgewiesen werden. Kommt es zu einer Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen erscheinen an den hierfür vorgesehenen Stellen der Teststreifen die jeweiligen Banden als Kennzeichnung.
Binden IgG-Antikörper nicht an EBNA-1 , dafür aber IgG- und IgM-Antikörper an VCA kann von einer primären bzw. frischen EBV-Infektion ausgegangen werden. Sofern IgG-Antikörper an EBNA-1 und VCA binden, allerdings keine Bindung von IgM-Antikörpern an VCA stattfindet, kann von einer abgelaufenen EBV-Infektion ausgegangen werden. Findet dagegen zwar eine Bindung von IgG-Antikörpern an p22 und VCA statt, während IgG- Antikörper nicht an EBNA-1 binden, kann von einer abgelaufenen EBV-Infektion mit Verlust an EBNA-1 -Antikörpern ausgegangen werden.
Zur Durchführung der Inkubation werden die Inkubationsrinnen entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Patientenproben mit je 1 ,5 ml eines gebrauchsfertig verdünnten
Universalpuffers gefüllt. Die benötigte Anzahl von Teststreifen wird mit einer Pinzette der Verpackung entnommen und direkt in je eine mit Puffer gefüllt Inkubationsrinne gelegt. Im Anschluss hieran erfolgt eine erste Inkubation, wobei die Teststreifen für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Wippschüttler inkubiert werden. Anschließend wird die
Flüssigkeit aus den Rinnen vollständig abgezogen.
Nunmehr wird in jede mit einem Teststreifen gefüllte Inkubationsrinne 1 ,5 ml der verdünnten Patientenprobe gefüllt und 30 Minuten auf einem Wippschüttler bei Raumtemperatur (+18 °C bis +25 °C) inkubiert. Anschließend wird die Flüssigkeit aus jeder Rinne vollständig abgezogen und dreimal für fünf Minuten mit je 1 ,5 ml gebrauchsfertig verdünntem
Universalpuffer auf einem Wippschüttler gewaschen. Im Anschluss wird jeweils 1 ,5 ml gebrauchsfertig verdünntes Enzymkonjugat, in diesem Fall alkalische-Phosphatase- markiertes-Anti-human-IgG oder -lgA, in die Inkubationsrinnen pipettiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Wippschüttler inkubiert. Nach dieser Konjugat-Inkubation wird wiederum die Flüssigkeit vollständig aus den Rinnen abgezogen und dreimal für fünf Minuten mit je 1 ,5 ml gebrauchsfertig verdünntem Universalpuffer auf einem Wippschüttler gewaschen. Für die folgende Substrat-Inkubation werden jeweils 1 ,5 ml Substratlösung in die Inkubationsrinnen pipettiert und für zehn Minuten bei Raumtemperatur auf einem
Wippschüttler inkubiert. Abschließend wird die Flüssigkeit aus jeder Rinne vollständig abgezogen und jeder Teststreifen dreimal eine Minute mit destilliertem oder entionisiertem Wasser gespült.
Zur Auswertung werden die Teststreifen auf ein Auswerteprotokoll aufgezogen,
luftgetrocknet und die Bandenmuster der Teststreifen mit Hilfe eines Scanners oder einer Kamera aufgenommen. Die aufgenommenen Bilder werden in elektronischer Form einer Auswerteeinheit zugeführt. Innerhalb der Auswerteeinheit wird der Kontrast der einzelnen Banden gegenüber der Oberfläche des Teststreifens in ihrer unmittelbaren Umgebung ermittelt. Der Kontrast bzw. die Farbintensität der aufgenommenen Banden wird durch eine Auswerteeinheit mit Hilfe einer Graustufenskalierung ermittelt und entsprechend klassifiziert. Hierfür ist eine Graustufenskala von 0 bis 255 vorgesehen, so dass jeder Bande ein entsprechender Kontrastwert zugeordnet wird. Auf diese Weise findet zunächst eine
Quantifizierung in Bezug auf die farbliche Intensität der einzelnen Banden bei der
Testauswertung statt. Die auf diese Weise erhaltenen Kontrastwerde der verschiedenen Banden werden in ein logistisches Regressionsmodell als Parameter eingesetzt und schließlich mit Hilfe des Modells ein Wahrscheinlichkeitswert ermittelt. Liegt dieser Wahrscheinlichkeitswert oberhalb eines vorbestimmten Grenzwerts so wird die untersuchte Patientenprobe als positive Probe eingestuft und ein entsprechender Diagnosevorschlag generiert. In diesem Fall ist zu erwarten, dass bei dem Patienten, von dem die Probe stammt, ein Nasopharynx-Karzinom vorhanden ist. Wird hingegen ein Wahrscheinlichkeitswert ermittelt, der unterhalb des vorbestimmten Grenzwerts liegt, so kann davon ausgegangen werden, dass bei dem untersuchten Patienten kein entsprechender Tumor vorhanden ist.
Grundsätzlich ist es denkbar, entweder ein binarlogistisches oder ein multinomiallogistisches Regressionsmodell zu verwenden und die aufgenommenen Kontrastwerte der einzelnen Banden als Parameter in das entsprechende Modell einzusetzen. In Abhängigkeit des jeweils verwendeten Rechenmodells wird eine unterschiedliche Anzahl von Kontrastwerten der verschiedenen Antigenbanden verwendet. Zusätzlich wird berücksichtigt, ob im
Patientenserum Antikörper der Antikörperklassen IgG, IgM oder IgA nachgewiesen werden konnten bzw. die Kontrastwerte der einzelnen Banden (z.B. lgG-p22 und IgA-EBNA) auf geeignete Weise als Parameter in das Regressionsmodell eingesetzt. Besonders vorteilhafte Rechenmodelle stellen bei Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens ein binärlogistisches Regressionsmodell mit den Varianten Einschluss (alle Parameter) und Ausschluss
(rückwärts) nach Wald sowie ein multinomiallogistisches Regressionsmodell mit den
Varianten Haupteffekte (alle Parameter und schrittweise rückwärts gerichtet) dar. In die entsprechenden Regressionsmodelle werden zur Ermittlung der Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines Nasopharynx-Karzinoms wenigstens zwei, in der Regel noch mehr
Kontrastwerte der verschiedenen aufgenommenen Banden als Parameter eingesetzt. Jede aufgenommene Bande, die somit einen Farbunterschied gegenüber der Umgebung aufweist, repräsentiert hierbei die Bildung eines Komplexes aus Antigen und im Patientenserum enthaltenem Antikörper. Um einen möglichst genauen Diagnosevorschlag generieren zu können, wird die Patientenprobe gleichermaßen auf das Vorhandensein von Antikörpern unterschiedlicher Antikörperklassen, nämlich der Klassen IgA, IgG und IgM getestet.
Mit Hilfe des in der Auswerteeinheit hinterlegte logistischen Regressionsmodells, durch das eine Eintreffenswahrscheinlichkeit mit einer Gegenwahrscheinlichkeit ins Verhältnis gesetzt wird, werden die untersuchten Patientenproben in zwei Gruppen aufgeteilt, nämlich die der positiven sowie der der negativen Proben. Auf der Grundlage dieser Aufteilung generiert die Auswerteeinheit schließlich einen Diagnosevorschlag, der Auskunft darüber gibt, ob bei dem Patienten, dessen Serum untersucht worden ist, das Risiko eines vorhandenen
Nasopharynx-Karzinoms besteht. Die Auswertung des sich auf dem inkubierten Teststreifen abzeichnenden Bandenmusters unter Berücksichtigung des Farbkontrastes bzw. der Farbintensität der einzelnen Banden bietet eine vergleichsweise einfache Möglichkeit, durch Einsatz an sich bekannter statistischer Verfahren eine sehr genaue Diagnose in Bezug auf das Vorhandensein eines Nasopharynx-Karzinoms zu erstellen.
Figur 2 zeigt einen Western blot-Teststreifen, der bislang in der Hauptsache für die qualitative In-vitro-Bestimmung humaner Antikörper, vornehmlich der Immunglobulinklasse IgG, gegen EBV-Antigene aus Serum oder Plasma vorgesehen war. Durch Einsatz des
erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, mit Hilfe des vorgenannten Tests auch quantitative Aussagen, insbesondere in Bezug auf die Wahrscheinlichkeit, mit der bei einem untersuchten Patienten ein Nasopharynx-Karzinom vorliegt, zu machen.
Der Blotstreifen ist mit einem elektrophoretisch getrennten Antigen-Extrakt von Epstein-Barr- Viren beschichtet. Wie bereits im Zusammenhang mit Figur 1 erläutert, wird der Blotstreifen zunächst mit einer verdünnten Patientenprobe inkubiert. Bei positiven Proben binden spezifische Antikörper an die entsprechenden Antigene. Zur Darstellung dieser Antikörper wird in einem zweiten Schritt mit dem entsprechend benötigten Enzymkonjugat, also mit enzym-markiertem Anti-human-IgG-, -IgA- oder -IgM-Konjugat, das eine sich anschließende Farbreaktion katalysiert, inkubiert.
Die Inkubation des in Figur 2 dargestellten Westernblot-Streifens erfolgt in den Schritten Blockierung, Proben-Inkubation, Waschen, Konjugat-Inkubation, Waschen,
Substratinkubation sowie Stoppen. Die Auswertung des sich jeweils bei Inkubation des Blotstreifens mit einer zumindest teilweise positiven Patientenprobe bildenden
Bandenmusters erfolgt wiederum automatisch mit Hilfe einer optischen Aufnahmeeinheit, insbesondere mit einem Scanner oder einer Kamera, sowie einer Auswerteeinheit.
In der Auswerteeinheit wird erfindungsgemäß wiederum der Farbkontrast bzw. die
Farbintensität der einzelnen Banden, also der Helligkeitsunterschied zwischen den Banden und dem Hintergrund ermittelt, wobei in der Auswerteeinheit eine graustufenbasierte Skalierung auf einen Wert zwischen 0 und 255 erfolgt. Die Kontrastwerte der einzelnen Banden werden als Parameter in einem in der Auswerteeinheit hinterlegten binomialen logistischen Regressionsmodell berücksichtigt, wobei die Kontrastwerte zumindest teilweise den Exponenten einer e-Funktion bilden. Auf der Grundlage der ermittelten Farbkontraste der einzelnen Banden wird so mit Hilfe des Regressionsmodells ein Wahrscheinlichkeitswert ermittelt, der bei der Erstellung eines Diagnosevorschlags berücksichtigt wird. Zur
Generierung des Diagnosevorschlags werden die einzelnen Patientenproben unter
Zugrundelegung eines Vergleichs zwischen dem ermittelten Wahrscheinlichkeitswert und einem vorgegebenen Grenzwert in zwei Gruppen, nämlich eine mit positiven und eine mit negativen Patientenproben aufgeteilt. Bei Patienten, deren Patientenproben als positiv erkannt worden sind, kann mit hoher Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden, dass beim Patienten ein Nasopharynx-Karzinom vorhanden ist.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Diagnose eines Nasopharynx-Karzinoms bei einem Patienten, bei dem ein Substrat mit wenigstens zwei darauf immobilisierten Antigenen mit einer Körperflüssigkeit des Patienten inkubiert wird, wobei die Antigene derart gewählt sind, dass diese jeweils wenigstens bereichsweise unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes an einen in der Körperflüssigkeit des Patienten befindlichen, bei Auftreten einer Eppstein-Barr-Virus- Infektion spezifischen Antikörpers binden, bei dem die Bildung des Antigen-Antikörper- Komplexes jeweils anhand zumindest einer Kennzeichnung auf dem Substrat sichtbar gemacht wird und bei dem zumindest zwei Kennzeichnungen mit einer optischen Einrichtung aufgenommen sowie einer Auswerteeinheit zugeführt werden, in der auf der Grundlage wenigstens einer Eigenschaft der aufgenommenen Kennzeichnungen ein Diagnosevorschlag generiert wird,
dadurch gekennzeichnet, dass ein membranbasiertes Substrat, insbesondere ein Blotstreifen oder ein Blotstück, verwendet wird, jeweils ein Wert für den Farbkontrast der in Form einer Bande ausgeführten Kennzeichnungen gegenüber dem diese umgebenden Hintergrund bestimmt wird und der Diagnosevorschlag auf der Grundlage eines mathematischen
Rechenmodells, in dem die ermittelten Farbkontraste wenigstens teilweise als Parameter genutzt werden, generiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 ,
dadurch gekennzeichnet, dass ein Blotstreifen oder ein Blotstück mit wenigstens zwei, insbesondere mit wenigstens fünf darauf immobilisierten Antigenen verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet, dass als Antigen VCA gp125, VCA p19, EBNA-1 , p22 und/oder EA-D verwendet wird/werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, dass die Patientenprobe auf das Vorhandensein von Antikörpern wenigstens zweier unterschiedlicher Antikörperklassen untersucht wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, dass die Patientenprobe auf das Vorhandensein von Antikörpern der Antikörperklassen IgG, IgM und IgA untersucht wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, dass als mathematisches Rechenmodell ein logistisches
Regressionsmodell verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, dass als mathematisches Rechenmodell ein binomiales logistisches Regressionsmodell verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Kontrastwert einer in Form einer Bande ausgeführten Kennzeichnung als Parameter im mathematischen Rechenmodell verwendet wird.
9. Vorrichtung zur Diagnose eines Nasopharynx-Karzinoms bei einem Patienten, mit einem Substrat, auf dem wenigstens zwei Antigene immobilisiert sind, wobei die Antigene derart ausgeführt sind, dass diese wenigstens bereichsweise unter Bildung eines Antigen- Antikörper-Komplexes an einen in der Körperflüssigkeit des Patienten befindlichen und bei Auftreten einer Eppstein-Barr-Virus-Infektion spezifischen Antikörpers binden, und auf dem bei Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes eine Kennzeichnung sichtbar wird, sowie mit einer optischen Einrichtung durch die eine Aufnahme der wenigstens einen Kennzeichnung erzeugbar und einer Auswerteeinheit zuführbar ist, in der auf der Grundlage wenigstens einer Eigenschaft der aufgenommenen Kennzeichnung ein Diagnosevorschlag generierbar ist,
dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat membranbasiert, insbesondere als Blotstreifen oder als Blotstück, ausgeführt ist, in der Auswerteeinheit ein Wert für den Farbkontrast der in Form einer Bande ausgeführten Kennzeichnungen gegenüber dem diese umgebenden Hintergrund bestimmbar ist und dass die Auswerteeinheit derart ausgeführt ist, dass mittels eines mathematischen Rechenmodells unter Berücksichtigung der ermittelten Farbkontrasts der Diagnosevorschlag generierbar ist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 9,
dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Blotstreifen oder Blotstück wenigstens zwei Antigene, ausgewählt aus der Gruppe VCA gp125, VCA p19, EBNA-1 und EA-D, immobilisiert sind.
1 1 . Vorrichtung nach Anspruch 9 oder 10,
dadurch gekennzeichnet, dass die optische Einrichtung als Scanner und/oder als Kamera ausgeführt ist.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10914737B2 (en) 2013-04-24 2021-02-09 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Method for automated evaluation of incubated immunoblot strips

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106841628A (zh) * 2017-03-02 2017-06-13 广州市康润生物科技有限公司 鼻咽癌精准诊断全自动检测系统
CN106950372A (zh) * 2017-03-02 2017-07-14 广州市康润生物科技有限公司 Eb病毒vca/ea‑iga细胞免疫荧光检测试剂

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10061352A1 (de) 2000-12-06 2002-06-13 Attomol Gmbh Molekulare Diagno Vorrichtung und Verfahren zur Auswertung von Blotstreifen
DE10307517A1 (de) * 2003-02-21 2004-09-02 Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh Von Kapsidantigenen des Epstein-Barr-Virus abgeleitete Peptide und ihre Verwendung
US6818219B1 (en) * 1997-07-04 2004-11-16 Institut Pasteur De Lille Reagent for detecting and monitoring viral infections
CN201497742U (zh) * 2009-07-17 2010-06-02 郑州安图绿科生物工程有限公司 EB病毒EA-IgG、VCA-IgA抗体联检渗滤法试剂盒

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6394952B1 (en) * 1998-02-03 2002-05-28 Adeza Biomedical Corporation Point of care diagnostic systems
US7521259B2 (en) * 2004-04-01 2009-04-21 Alverix, Inc. Assay test strips with multiple labels and reading same
KR100613521B1 (ko) 2004-11-23 2006-08-17 엘지전자 주식회사 메시지 입력시간 단축형 이동통신 단말기 및 그 동작방법
CN101393216A (zh) * 2008-10-23 2009-03-25 车宏莉 快速诊断日本血吸虫病的胶体碳试纸条

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6818219B1 (en) * 1997-07-04 2004-11-16 Institut Pasteur De Lille Reagent for detecting and monitoring viral infections
DE10061352A1 (de) 2000-12-06 2002-06-13 Attomol Gmbh Molekulare Diagno Vorrichtung und Verfahren zur Auswertung von Blotstreifen
DE10307517A1 (de) * 2003-02-21 2004-09-02 Mikrogen Molekularbiologische Entwicklungs-Gmbh Von Kapsidantigenen des Epstein-Barr-Virus abgeleitete Peptide und ihre Verwendung
CN201497742U (zh) * 2009-07-17 2010-06-02 郑州安图绿科生物工程有限公司 EB病毒EA-IgG、VCA-IgA抗体联检渗滤法试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Euroimmun - Produktkatalog", 8 March 2012 (2012-03-08), pages 1 - 147, XP055109330, Retrieved from the Internet <URL:https://web.archive.org/web/20120308005612/http://www.euroimmun.de/index.php?id=produktkatalog&L=0> [retrieved on 20140321] *
MASSIMO DE PASCHALE ET AL: "Serological diagnosis of Epstein-Barr virus infection: Problems and solutions", WORLD JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 1, no. 1, 12 February 2012 (2012-02-12), pages 31 - 43, XP055109338, ISSN: 2220-3249, DOI: 10.5501/wjv.v1.i1.31 *
YUE LIU ET AL: "Establishment of VCA and EBNA1 IgA-based combination by enzyme-linked immunosorbent assay as preferred screening method for nasopharyngeal carcinoma: a two-stage design with a preliminary performance study and a mass screening in southern China", INTERNATIONAL JOURNAL OF CANCER, vol. 131, no. 2, 19 November 2011 (2011-11-19), pages 406 - 416, XP055109326, ISSN: 0020-7136, DOI: 10.1002/ijc.26380 *
Z. LIU ET AL: "Two Epstein-Barr Virus-Related Serologic Antibody Tests in Nasopharyngeal Carcinoma Screening: Results From the Initial Phase of a Cluster Randomized Controlled Trial in Southern China", AMERICAN JOURNAL OF EPIDEMIOLOGY, vol. 177, no. 3, 19 December 2012 (2012-12-19), pages 242 - 250, XP055109333, ISSN: 0002-9262, DOI: 10.1093/aje/kws404 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10914737B2 (en) 2013-04-24 2021-02-09 Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag Method for automated evaluation of incubated immunoblot strips

Also Published As

Publication number Publication date
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KR20170015534A (ko) 2017-02-08
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KR20150004491U (ko) 2015-12-15

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