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Die Erfindung betrifft ein Verfahren sowie eine Vorrichtung zur Diagnose eines Nasopharynx-Karzinoms (NPC), bei dem ein Substrat mit wenigstens zwei darauf immobilisierten Antigenen mit einer Körperflüssigkeit eines Patienten inkubiert wird. Die Antigene sind hierbei derart gewählt, dass diese wenigstens bereichsweise unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes an einen in der Körperflüssigkeit des Patienten befindlichen, bei Auftreten einer Eppstein-Barr-Virus-Infektion spezifischen Antikörper binden. Die Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes wird mit Hilfe einer Kennzeichnung auf dem Substrat sichtbar gemacht, die mit einer optischen Einrichtung aufgenommen wird. Diese Aufnahme wird schließlich an eine Auswerteeinheit übertragen, in der auf der Grundlage wenigstens einer Eigenschaft der aufgenommenen Kennzeichnung ein Diagnosevorschlag generiert wird.
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Ein Nasopharynx-Karzinom, das häufig auch mit „NPC” für Nasopharyngeal Carcinoma abgekürzt wird, ist eine Krebserkrankung des Nasenrachens. Der Nasenrachenkrebs gehört zu der Gruppe der Kopf-Hals-Tumore. Als wesentliche Ursache des endemischen Nasopharynx-Karzinoms gelten das Epstein-Barr-Virus (EBV), verschiedene Umweltfaktoren, Ernährungsgewohnheiten und genetische Eigenheiten des jeweiligen Patienten. Die Erkrankung ist weltweit verbreitet, kommt aber gehäuft in bestimmten Regionen Südchinas vor. Neben genetischer Disposition gelten auch Umwelteinflüsse, wie zum Beispiel Ernährungsgewohnheiten, als Ko-Faktor.
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Aufgrund der Korrelation zwischen einer EBV-Infektion und dem Auftreten eines Nasopharynx-Karzinoms werden EBV-Testsysteme vielfach zur Diagnose einer entsprechenden Tumorerkrankung verwendet. In diesem Zusammenhang sind für die Diagnose einer EBV-Infektion unterschiedliche Testsysteme bekannt, wobei die Infektion entweder über einen Antigen-Direktnachweis oder aber über serologische Methoden diagnostiziert wird. Aufgrund des hohen technischen und zeitlichen Aufwandes bei der Durchführung des Direktnachweises ist die Serologie die Methode der Wahl, da sie zudem eine Unterscheidung der verschiedenen Phasen einer EBV-Infektion zulässt. Hierbei ist es durchaus üblich, einen entsprechenden serologischen Nachweis über den Nachweis spezifischer Antikörper mittels Immunfluoreszenztest, ELISA oder Immunoblot-Verfahren zu führen. Geeignete Testsysteme werden beispielsweise als Mikrotiter-ELISA unter der Produktbezeichnung Anti-EBV-EA (EI 2795-9601 A, G oder M), als Linienblot unter der Produktbezeichnung EBV-Profil 2 (DN 2790-1601-2 G oder M) oder als Westernblot unter der Produktbezeichnung Anti-EBV (DY 2790-1501 G oder M) von der Firma EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG angeboten.
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Die Antikörperantwort nach einer EBV-Infektion fällt aufgrund der Komplexität der Viren und der Variabilität der verschiedenen Infektionsphasen sehr unterschiedlich aus. So treten kurz nach einer Infektion vor allem Antikörper der Antikörperklasse IgM auf, die gegen das EA (Early Antigen) und das VCA (Virus Capsid Antigen) gerichtet sind und nach Abklingen der akuten Infektion nicht mehr oder nur in sehr geringer Aktivität vorhanden sind. Dahingegen persistieren die etwa zeitgleich oder etwas verzögert gebildeten Anti-VCA-IgG-Antikörper lebenslang. Weiterhin ist bekannt, dass einerseits sehr hohe Titer der VCA-IgG-Antikörper charakteristisch für das Auftreten eines Nasopharynx-Karzinoms sind und dass andererseits dem Nachweis von Anti-VCA-IgA-Antikörpern bei der NPC-Diagnose eine unterstützende Aussage zukommt. Ebenso ist ein erhöhter Anti-EA-Antikörperspiegel charakteristisch bei Patienten mit Nasopharynx-Karzinom.
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Die vielfach verwendeten ELISA-Testsysteme zeichnen sich dadurch aus, dass die verwendeten Antigene, insbesondere VCA und EA, als Gemisch vorliegen und somit bei der Untersuchung einer Patientenprobe lediglich das Vorhandensein wenigstens eines Antikörpers aus einer Gruppe von Antikörpern diagnostiziert werden kann. Demgegenüber bieten Blotsysteme den Vorteil, dass die einzelnen Antigene getrennt voneinander auf einer Membran vorliegen, so dass alle Antigenbanden getrennt voneinander ausgewertet werden können, was letztendlich eine sehr detaillierte Auswertung eines Bandenmusters zur Diagnoseerstellung zulässt. In diesem Zusammenhang ist es bekannt, dass zur Auswertung von Bandenmustern bei Blotsystemen optische Einrichtungen, insbesondere Scanner oder Kameras verwendet werden und die Auswertung der aufgenommenen Bilder mit Hilfe einer geeigneten Laborsoftware realisiert wird.
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Entsprechende Systeme zur automatischen Auswertung membranbasierter Testsysteme werden beispielweise von der Firma EUROIMMUN Medizinische Labordiagnostika AG unter der Bezeichnung EUROBlotCamera bzw. EUROBlotScanner angeboten und vertrieben. Die entsprechend aufgenommenen Bilder können mit Hilfe einer geeigneten Software, die unter der Produktbezeichnung EUROLINESCAN angeboten wird, vollautomatisch verwaltet, dokumentiert und elektronisch archiviert werden.
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Aus der
DE 100 61 352 A1 ist ebenfalls eine Vorrichtung sowie ein Verfahren zur Auswertung von Blotstreifen bekannt. Die beschriebene Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, dass Bilder der inkubierten Blotstreifen mit Hilfe eines Scanners digitalisiert und so einer elektronischen Auswerteeinheit zugeführt werden. Die Auswertung der Blotstreifen erfolgt schließlich unter Berücksichtigung der Färbungen bzw. der Intensitäten der Blots auf den Blotstreifen. Hierzu werden bevorzugt die einzelnen Blotstreifen auf dem Scanner derart positioniert, dass es möglich ist, diskrete Verfärbungen der Blots im Vergleich zu Hintergrundfärbung der Blotstreifen zu erfassen.
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Zusammenfassend kann somit festgestellt werden, dass unterschiedliche Testsysteme zur Diagnose einer EBV-Infektion vorhanden sind. Keines der bekannten Testsysteme ist allerdings in der Lage, einem Arzt in Bezug auf die Fragestellung, in wieweit das Risiko eines Nasopharynx-Karzinoms bei einem Patienten besteht, eine direkte Aussage, insbesondere einen Diagnosevorschlag, zu machen. Dies ist vor allem darauf zurückzuführen, dass eine zuverlässige Diagnose nur möglich ist, wenn zuverlässig das Vorhandensein spezieller Antikörper in einer Patientenprobe, insbesondere deren Auftreten in Kombination, sowie vorzugsweise auch der Antikörpertiter bestimmt werden kann.
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Ausgehend von den bekannten Vorrichtungen und Verfahren zur Diagnose einer EBV-Infektion liegt der Erfindung somit die Aufgabe zu Grunde, ein Testsystem anzugeben, mit dem mit großer Sicherheit eine Entscheidung über das Vorliegen eines Nasopharynx-Karzinoms bei einem Patienten getroffen werden kann. Das anzugebene Testsystem soll hierbei auf bekannten Verfahren aufbauen und verhältnismäßig einfach und sicher auszuführen sein. Gleichzeitig soll es eine möglichst kostengünstige Diagnose bei gleichzeitig hoher Sensivität und Spezifität des Tests ermöglichen.
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Die vorstehend geschilderte Aufgabe wird mit einem Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie einer Vorrichtung nach Anspruch 8 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind Gegenstand der abhängigen Ansprüche und werden in der folgenden Beschreibung unter teilweiser Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.
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Die Erfindung beruht auf einem Verfahren zur Diagnose eines Nasopharynx-Karzinoms bei einem Patienten, bei dem ein Substrat mit wenigstens zwei darauf immobilisierten Antigenen mit einer Körperflüssigkeit des Patienten inkubiert wird. Die Antigene sind hierbei derart gewählt, dass diese jeweils wenigstens bereichsweise unter Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes an einen in der Körperflüssigkeit des Patienten befindlichen und bei Auftreten einer Eppstein-Barr-Virus-Infektion spezifischen Antikörper binden. Die Bildung des jeweiligen Antigen-Antikörper-Komplexes ist mit Hilfe zumindest einer Kennzeichnung auf dem Substrat, die nach Inkubation des Substrats mit einer positiven Patientenprobe erscheint, sichtbar zu machen. Nach erfolgter Inkubation wird die Oberfläche des Substrats, insbesondere ein Bereich, in dem bei Bildung eines Antigen-Antikörper-Komplexes wenigstens eine sichtbare Kennzeichnung erscheint, mit einer optischen Einrichtung aufgenommen und die Aufnahme einer Auswerteeinheit zugeführt. Auf der Grundlage wenigstens einer Eigenschaft der aufgenommenen Kennzeichnung wird durch die Auswerteeinheit ein Diagnosevorschlag generiert. Erfindungsgemäß ist das Verfahren derart weitergebildet worden, dass ein membranbasiertes Substrat, insbesondere ein Blotstreifen oder Blotstück verwendet wird, jeweils ein Wert für einen Farbkontrast zwischen aufgenommener, in Form einer Bande ausgeführten Kennzeichnung und einer die Kennzeichnung umgebenden Oberfläche des Substrats bestimmt wird und der Diagnosevorschlag auf der Grundlage einer den Farbkontrast einbeziehenden mathematischen Rechenvorschrift generiert wird.
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Der wesentliche Gedanke der Erfindung liegt somit darin, den Kontrast wenigstens zweier auf dem inkubierten Substrat erscheinender Kennzeichnungen, also den Helligkeitsunterschied zwischen den in Form von Banden erscheinenden Kennzeichnungen und den diese Banden umgebenden Substratoberflächenbereichen, zu ermitteln und derart zu quantifizieren, dass durch eine geeignete Auswertung der ermittelten Kontrastwerte eine Aussage über das Risiko für den jeweiligen Patienten, dass dieser über ein Nasopharynx-Karzinom verfügt, getroffen werden kann. Zur Auswertung und Generierung eines Diagnosevorschlags werden die Kontrastwerte der auf dem Substrat bei Auftreten einer Antigen-Antikörper-Bindung erscheinenden Banden erfasst und mit Hilfe eines statistischen Rechenmodells ausgewertet. Als statistisches Rechenmodell wird bevorzugt ein logistisches Regressionsmodell, insbesondere ein binomiales logistisches oder ein multinomiallogistisches Regressionsmodell, verwendet, wobei die für die einzelnen Banden aufgenommenen und quantifizierten Kontrastwerte als Parameter in das Rechenmodell eingefügt werden. Auf der Grundlage des Ergebnisses, das das Rechenmodell unter Verwendung der Kontrastwerte liefert, wird in der Auswerteeinheit ein Diagnosevorschlag generiert, der letztendlich dem untersuchenden Arzt Auskunft darüber gibt, ob die untersuchte Patientenprobe darauf schließen lässt, dass beim Patienten ein Nasopharynx-Karzinom vorhanden ist.
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Um einen quantifizierten Wert für den Kontrast einer Kennzeichnung zu erhalten, wird auf bevorzugte Weise jede aufgenommene Bande nach Graustufen aufgelöst untersucht und für den Kontrast ein entsprechender Wert angegeben. Gemäß einer speziellen Ausführungsform wird hierbei für einen minimalen Kontrastwert einer Bande, also für den Fall, dass sich eine Bande farblich nicht gegenüber der umgebenden Substratoberfläche abhebt, der Wert 0 (Null) und für den Maximalwert, also einen maximalen Kontrast, der Wert 255 (Zweihundertfünfundfünfzig) vergeben. Der Kontrast einer aufgenommenen Kennzeichnung wird somit bevorzugt innerhalb eines Wertebereichs von 0 ≤ L ≤ 255 skaliert.
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Für die erfindungsgemäß ausgeführte Auswertung eignen sich bevorzugt Blotstreifen und/oder Blotstücke, die mehr als zwei darauf immobilisierte Antigene aufweisen. Besonders vorteilhaft ist die Verwendung von mindestens fünf auf einem Blot-Substrat immobilisierten Antigenen, vorzugsweise der Antigene VCA GP 125, VCA P 19, EBNA-1, P 22 und EA-D.
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Um auf bevorzugte Weise ein zuverlässiges Testergebnis zu realisieren, ist der Blotstreifen und/oder das jeweils verwendete Blotstück derart mit Antigenen bestückt, dass eine Patientenprobe auf das Vorhandensein von Antikörpern wenigstens zweier unterschiedlicher Antikörperklassen untersucht wird. Gemäß einer ganz speziellen Weiterbildung der Erfindung wird die für die Untersuchung vorgesehene Patientenprobe mittels Einsatz geeigneter Enzymkonjugate auf das Vorhandensein von Antikörpern der Antikörperklassen IgA, IgG und IgM untersucht.
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Das erfindungsgemäß ausgeführte Verfahren beruht im Wesentlichen darauf, dass der Diagnosevorschlag unter Zuhilfenahme eines mathematischen Rechenmodells, insbesondere eines binomialen logistischen Regressionsmodels, ermittelt wird. Ein derartiges Modell bildet ein Verhältnis aus Wahrscheinlichkeit und Gegenwahrscheinlichkeit, die mit Hilfe geeigneter e-Funktionen ermittelt werden. Gemäß einer speziellen Weiterbildung der Erfindung werden die Kontrastwerte der einzelnen Banden als Parameter des binomialen logistischen Regressionsmodels verwendet und bilden zumindest teilweise die Exponenten der verwendeten e-Funktionen. Mit Hilfe der so durchgeführten Berechnung wird letztendlich die Wahrscheinlichkeit ermittelt, mit der bei den untersuchten Patienten auf das Vorhandensein eines Nasopharynx-Karzinoms geschlossen werden kann. Die untersuchten Patientenproben werden hierbei jeweils einer von zwei Gruppen zugeordnet, nämlich entweder der Gruppe der positiven oder der negativen Patientenproben. Um eine entsprechende Aufteilung der Patientenprobe zu gewährleisten wird ein geeigneter Wahrscheinlichkeitswert als Grenzwert festgelegt.
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Um dem in der Auswerteeinheit verwendeten Rechenmodell geeignete Kontrastwerte der Banden als Parameter zur Verfügung stellen zu können, ist eine optische Aufnahmeeinheit vorgesehen, mit der der Farbkontrast der einzelnen Banden eines inkubierten Patientenstreifens oder eines inkubierten Blotstücks (EUROAssay) gegenüber ihrer Umgebung aufgenommen wird. Bei einer derartigen Aufnahmeeinheit handelt es sich entweder um eine Kamera oder einen Scanner. Werden die entsprechenden Substrate mit einer positiven Patientenprobe inkubiert, kommt es zur Bildung von sogenannten Antigen-Antikörper-Komplexen, so dass sich dunkle Banden als Kennzeichnungen bilden. In Abhängigkeit des Antikörper-Titers einer Patientenprobe verfärben sich die Banden unterschiedlich stark, so dass der Kontrast zwischen einer Bande und dem diese Bande umgebenden Substratbereich entsprechend variieren kann. Mit Hilfe der optischen Aufnahmeeinheit werden die Banden der inkubierten Substrate aufgenommen und der Farbunterschied bzw. der Kontrast gegenüber der Umgebung ermittelt.
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Das mit Hilfe einer Kamera oder eines Scanners aufgenommene Bild wird in der Auswerteeinheit hinsichtlich seiner Verfärbung mit Graustufenbildern, die Verfärbungswerte von 0 bis 255 aufweisen, verglichen und entsprechend klassifiziert. Auf der Grundlage der so ermittelten Farbintensität einer Bande bzw. dem Kontrast zwischen der Bande und dem diese Bande umgebenden Substratbereich, erfolgt schließlich die Generierung des Diagnosevorschlags. Hierfür werden die ermittelten Kontrastwerte in das mathematische Rechenmodell, insbesondere ein logistisches Regressionsmodell, eingesetzt und auf der Basis des ermittelten Ergebnisses festgelegt, ob es sich bei der Patientenprobe um eine positive oder negative Probe handelt.
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Das beschriebene Verfahren sowie die hierfür verwendete Vorrichtung zeichnen sich vor allem dadurch aus, dass eine Kalibrierung der automatischen Aufnahmeeinrichtung lediglich vor Inbetriebnahme des Gerätes und dann in größeren zeitlichen Abständen erfolgen muss. Dagegen ist eine Kalibrierung zu Beginn jeder Messung nicht nötig.
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Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen ohne Beschränkungen des allgemeinen Erfindungsgedanken unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert.
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Dabei zeigen:
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1: Inkubiertes EUROLine-EBV-Profil 2 der Firma EUROIMMUN medizinische Labordiagnostika AG sowie
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2: Inkubierter Westernblot-Anti-EBV der Firma EUROIMMUN medizinische Labordiagnostika AG.
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Der in 1 dargestellte EUROLine-Testsatz der Firma EUROIMMUN diente bislang vornehmlich der qualitativen In-vitro-Bestimmung humaner Antikörper, vornehmlich der Immunglobulinklasse IgG, gegen die fünf EBV-Antigene VCA GP 125, VCA P 19, EBNA-1, P 22 und EA-D in Serum oder Plasma. Mit Ausnahme des Antigens VCA GP 125, das nativ in affinitätschromatographisch aufgereinigter Form vorliegt, handelt es sich hierbei um rekombinante Antigene. Durch Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, mit Hilfe des vorgenannten Tests auch quantitative Aussagen, insbesondere in Bezug auf die Wahrscheinlichkeit, mit der bei einem untersuchten Patienten ein Nasopharynx-Karzinom vorliegt, zu machen.
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Die mit den beschriebenen Antigenen beschichteten Teststreifen werden in einem ersten Inkubationsschritt mit verdünntem Patientenserum inkubiert. Bei positiven Proben binden sich spezifische Antikörper an die jeweiligen Antigene. In einem zweiten Schritt werden die Teststreifen mit einem Enzymkonjugat, nämlich einem enzymmarkierten Anti-human-IgG, -IgA oder IgM-Konjugat, das eine sich anschließende Farbreaktion katalysiert, inkubiert. In Abhängkeit des verwendeten Enzymkonjugats können auf diese Weise Antikörper der Immunglobulinklasse IgG, IgM oder IgA in einer Patientenprobe nachgewiesen werden. Kommt es zu einer Bildung von Antigen-Antikörper-Komplexen erscheinen an den hierfür vorgesehenen Stellen der Teststreifen die jeweiligen Banden als Kennzeichnung. Binden IgG-Antikörper nicht an EBNA-1, dafür aber IgG- und IgM-Antikörper an VCA kann von einer primären bzw. frischen EBV-Infektion ausgegangen werden. Sofern IgG-Antikörper an EBNA-1 und VCA binden, allerdings keine Bindung von IgM-Antikörpern an VCA stattfindet, kann von einer abgelaufenen EBV-Infektion ausgegangen werden. Findet dagegen zwar eine Bindung von IgG-Antikörpern an p22 und VCA statt, während IgG-Antikörper nicht an EBNA-1 binden, kann von einer abgelaufenen EBV-Infektion mit Verlust an EBNA-1-Antikörpern ausgegangen werden.
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Zur Durchführung der Inkubation werden die Inkubationsrinnen entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Patientenproben mit je 1,5 ml eines gebrauchsfertig verdünnten Universalpuffers gefüllt. Die benötigte Anzahl von Teststreifen wird mit einer Pinzette der Verpackung entnommen und direkt in je eine mit Puffer gefüllt Inkubationsrinne gelegt. Im Anschluss hieran erfolgt eine erste Inkubation, wobei die Teststreifen für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Wippschüttler inkubiert werden. Anschließend wird die Flüssigkeit aus den Rinnen vollständig abgezogen.
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Nunmehr wird in jede mit einem Teststreifen gefüllte Inkubationsrinne 1,5 ml der verdünnten Patientenprobe gefüllt und 30 Minuten auf einem Wippschüttler bei Raumtemperatur (+18°C bis +25°C) inkubiert. Anschließend wird die Flüssigkeit aus jeder Rinne vollständig abgezogen und dreimal für fünf Minuten mit je 1,5 ml gebrauchsfertig verdünntem Universalpuffer auf einem Wippschüttler gewaschen. Im Anschluss wird jeweils 1,5 ml gebrauchsfertig verdünntes Enzymkonjugat, in diesem Fall alkalische-Phosphatase-markiertes-Anti-human-IgG oder -IgA, in die Inkubationsrinnen pipettiert und 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Wippschüttler inkubiert. Nach dieser Konjugat-Inkubation wird wiederum die Flüssigkeit vollständig aus den Rinnen abgezogen und dreimal für fünf Minuten mit je 1,5 ml gebrauchsfertig verdünntem Universalpuffer auf einem Wippschüttler gewaschen. Für die folgende Substrat-Inkubation werden jeweils 1,5 ml Substratlösung in die Inkubationsrinnen pipettiert und für zehn Minuten bei Raumtemperatur auf einem Wippschüttler inkubiert. Abschließend wird die Flüssigkeit aus jeder Rinne vollständig abgezogen und jeder Teststreifen dreimal eine Minute mit destilliertem oder entionisiertem Wasser gespült.
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Zur Auswertung werden die Teststreifen auf ein Auswerteprotokoll aufgezogen, luftgetrocknet und die Bandenmuster der Teststreifen mit Hilfe eines Scanners oder einer Kamera aufgenommen. Die aufgenommenen Bilder werden in elektronischer Form einer Auswerteeinheit zugeführt. Innerhalb der Auswerteeinheit wird der Kontrast der einzelnen Banden gegenüber der Oberfläche des Teststreifens in ihrer unmittelbaren Umgebung ermittelt. Der Kontrast bzw. die Farbintensität der aufgenommenen Banden wird durch eine Auswerteeinheit mit Hilfe einer Graustufenskalierung ermittelt und entsprechend klassifiziert. Hierfür ist eine Graustufenskala von 0 bis 255 vorgesehen, so dass jeder Bande ein entsprechender Kontrastwert zugeordnet wird. Auf diese Weise findet zunächst eine Quantifizierung in Bezug auf die farbliche Intensität der einzelnen Banden bei der Testauswertung statt.
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Die auf diese Weise erhaltenen Kontrastwerte der verschiedenen Banden werden in ein logistisches Regressionsmodell als Parameter eingesetzt und schließlich mit Hilfe des Modells ein Wahrscheinlichkeitswert ermittelt. Liegt dieser Wahrscheinlichkeitswert oberhalb eines vorbestimmten Grenzwerts so wird die untersuchte Patientenprobe als positive Probe eingestuft und ein entsprechender Diagnosevorschlag generiert. In diesem Fall ist zu erwarten, dass bei dem Patienten, von dem die Probe stammt, ein Nasopharynx-Karzinom vorhanden ist. Wird hingegen ein Wahrscheinlichkeitswert ermittelt, der unterhalb des vorbestimmten Grenzwerts liegt, so kann davon ausgegangen werden, dass bei dem untersuchten Patienten kein entsprechender Tumor vorhanden ist.
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Grundsätzlich ist es denkbar, entweder ein binärlogistisches oder ein multinomiallogistisches Regressionsmodell zu verwenden und die aufgenommenen Kontrastwerte der einzelnen Banden als Parameter in das entsprechende Modell einzusetzen. In Abhängigkeit des jeweils verwendeten Rechenmodells wird eine unterschiedliche Anzahl von Kontrastwerten der verschiedenen Antigenbanden verwendet. Zusätzlich wird berücksichtigt, ob im Patientenserum Antikörper der Antikörperklassen IgG, IgM oder IgA nachgewiesen werden konnten bzw. die Kontrastwerte der einzelnen Banden (z. B. IgG-p22 und IgA-EBNA) auf geeignete Weise als Parameter in das Regressionsmodell eingesetzt. Besonders vorteilhafte Rechenmodelle stellen bei Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens ein binärlogistisches Regressionsmodell mit den Varianten Einschluss (alle Parameter) und Ausschluss (rückwärts) nach Wald sowie ein multinomiallogistisches Regressionsmodell mit den Varianten Haupteffekte (alle Parameter und schrittweise rückwärts gerichtet) dar. In die entsprechenden Regressionsmodelle werden zur Ermittlung der Wahrscheinlichkeit für das Auftreten eines Nasopharynx-Karzinoms wenigstens zwei, in der Regel noch mehr Kontrastwerte der verschiedenen aufgenommenen Banden als Parameter eingesetzt. Jede aufgenommene Bande, die somit einen Farbunterschied gegenüber der Umgebung aufweist, repräsentiert hierbei die Bildung eines Komplexes aus Antigen und im Patientenserum enthaltenem Antikörper. Um einen möglichst genauen Diagnosevorschlag generieren zu können, wird die Patientenprobe gleichermaßen auf das Vorhandensein von Antikörpern unterschiedlicher Antikörperklassen, nämlich der Klassen IgA, IgG und IgM getestet.
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Mit Hilfe des in der Auswerteeinheit hinterlegte logistischen Regressionsmodells, durch das eine Eintreffenswahrscheinlichkeit mit einer Gegenwahrscheinlichkeit ins Verhältnis gesetzt wird, werden die untersuchten Patientenproben in zwei Gruppen aufgeteilt, nämlich die der positiven sowie der der negativen Proben. Auf der Grundlage dieser Aufteilung generiert die Auswerteeinheit schließlich einen Diagnosevorschlag, der Auskunft darüber gibt, ob bei dem Patienten, dessen Serum untersucht worden ist, das Risiko eines vorhandenen Nasopharynx-Karzinoms besteht. Die Auswertung des sich auf dem inkubierten Teststreifen abzeichnenden Bandenmusters unter Berücksichtigung des Farbkontrastes bzw. der Farbintensität der einzelnen Banden bietet eine vergleichsweise einfache Möglichkeit, durch Einsatz an sich bekannter statistischer Verfahren eine sehr genaue Diagnose in Bezug auf das Vorhandensein eines Nasopharynx-Karzinoms zu erstellen.
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2 zeigt einen Westernblot-Teststreifen, der bislang in der Hauptsache für die qualitative In-vitro-Bestimmung humaner Antikörper, vornehmlich der Immunglobulinklasse IgG, gegen EBV-Antigene aus Serum oder Plasma vorgesehen war. Durch Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es möglich, mit Hilfe des vorgenannten Tests auch quantitative Aussagen, insbesondere in Bezug auf die Wahrscheinlichkeit, mit der bei einem untersuchten Patienten ein Nasopharynx-Karzinom vorliegt, zu machen.
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Der Blotstreifen ist mit einem elektrophoretisch getrennten Antigen-Extrakt von Epstein-Barr-Viren beschichtet. Wie bereits im Zusammenhang mit 1 erläutert, wird der Blotstreifen zunächst mit einer verdünnten Patientenprobe inkubiert. Bei positiven Proben binden spezifische Antikörper an die entsprechenden Antigene. Zur Darstellung dieser Antikörper wird in einem zweiten Schritt mit dem entsprechend benötigten Enzymkonjugat, also mit enzym-markiertem Anti-human-IgG-, -IgA- oder -IgM-Konjugat, das eine sich anschließende Farbreaktion katalysiert, inkubiert.
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Die Inkubation des in 2 dargestellten Westernblot-Streifens erfolgt in den Schritten Blockierung, Proben-Inkubation, Waschen, Konjugat-Inkubation, Waschen, Substratinkubation sowie Stoppen. Die Auswertung des sich jeweils bei Inkubation des Blotstreifens mit einer zumindest teilweise positiven Patientenprobe bildenden Bandenmusters erfolgt wiederum automatisch mit Hilfe einer optischen Aufnahmeeinheit, insbesondere mit einem Scanner oder einer Kamera, sowie einer Auswerteeinheit.
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In der Auswerteeinheit wird erfindungsgemäß wiederum der Farbkontrast bzw. die Farbintensität der einzelnen Banden, also der Helligkeitsunterschied zwischen den Banden und dem Hintergrund ermittelt, wobei in der Auswerteeinheit eine graustufenbasierte Skalierung auf einen Wert zwischen 0 und 255 erfolgt. Die Kontrastwerte der einzelnen Banden werden als Parameter in einem in der Auswerteeinheit hinterlegten binomialen logistischen Regressionsmodell berücksichtigt, wobei die Kontrastwerte zumindest teilweise den Exponenten einer e-Funktion bilden. Auf der Grundlage der ermittelten Farbkontraste der einzelnen Banden wird so mit Hilfe des Regressionsmodells ein Wahrscheinlichkeitswert ermittelt, der bei der Erstellung eines Diagnosevorschlags berücksichtigt wird. Zur Generierung des Diagnosevorschlags werden die einzelnen Patientenproben unter Zugrundelegung eines Vergleichs zwischen dem ermittelten Wahrscheinlichkeitswert und einem vorgegebenen Grenzwert in zwei Gruppen, nämlich eine mit positiven und eine mit negativen Patientenproben aufgeteilt. Bei Patienten, deren Patientenproben als positiv erkannt worden sind, kann mit hoher Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden, dass beim Patienten ein Nasopharynx-Karzinom vorhanden ist.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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