WO2014104207A1 - 多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養方法 - Google Patents

多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養方法 Download PDF

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WO2014104207A1
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cells
cell
undifferentiated
substance capable
culture
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紀ノ岡正博
金美海
藤永由佳子
菅原庸
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国立大学法人大阪大学
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Definitions

  • the present disclosure relates to a method for culturing pluripotent stem cells, a method for removing cells that have developed or have developed an undifferentiated state during culturing of pluripotent stem cells, and undifferentiated pluripotent stem cells.
  • the present invention relates to a method for maintaining a state, a composition used in these methods, and a kit used in these methods.
  • this undifferentiated cell has a division ability almost equal to that of the undifferentiated cell and induces the conversion from the undifferentiated cell to the undifferentiated cell. That is, when de-undifferentiated cells are generated, the growth rate thereof exceeds that of undifferentiated cells, and the proliferation of undifferentiated cells is suppressed.
  • Degeneration of unundifferentiated cells is often observed in culture by unskilled culture operators. Moreover, it is known that excessive colony size and coalescence of colonies contribute to the occurrence. Therefore, the generation frequency of de-undifferentiated cells can be lowered to some extent by subculture and maintenance of uniformity during seeding. Moreover, the frequency of occurrence of de-undifferentiated cells is suppressed to some extent by the recently developed culture medium. However, de-undifferentiated cells still occur accidentally, and when they occur, it is still essential to remove colonies containing de-undifferentiated cells.
  • Colonies containing undifferentiated cells are carefully removed by pipetting under a microscope at the time of passage in order to maintain an undifferentiated state.
  • An apparatus simulating such a colony removal technique for example, an apparatus combining an observation apparatus and pipetting by robot handling has been developed.
  • Patent Document 1 discloses culturing pluripotent stem cells in the presence of activin in order to proliferate while maintaining undifferentiation of pluripotent stem cells such as iPS cells.
  • pluripotent stem cells such as human iPS cells
  • a method for maintaining undifferentiated pluripotent stem cells that requires few complicated operations and can be performed by non-experts.
  • the present disclosure in one aspect, provides a method capable of removing “cells that have been removed from an undifferentiated state” that occur in colonies in culture of stem cells having pluripotency (“pluripotency”, the same applies hereinafter).
  • the present disclosure in one aspect, relates to a method for culturing pluripotent stem cells, comprising culturing cells in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • the present disclosure provides a method for removing cells that have developed or may have developed an undifferentiated state during the culture of pluripotent stem cells, the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion. It relates to a method comprising culturing cells under.
  • the present disclosure relates to a method for maintaining an undifferentiated state of a pluripotent stem cell, the method comprising culturing the cell in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • the present disclosure relates to a composition comprising a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion for use in the above-described method according to the present disclosure.
  • the present disclosure relates to a kit including a culture medium component for pluripotent stem cells and a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • an effect of removing “cells from which an undifferentiated state has been removed” generated in a colony during pluripotent stem cell culture can be achieved.
  • FIG. 1 shows that an “undifferentiated cell” generated in a colony during pluripotent stem cell culture in one embodiment of the present disclosure is removed by adding a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • FIG. 2 shows that an “undifferentiated cell” generated in a colony during pluripotent stem cell culture in one embodiment of the present disclosure is removed by adding a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • FIG. 3 shows that in one embodiment of the present disclosure, “cells from which an undifferentiated state has been released” generated in a colony during pluripotent stem cell culture is removed by adding a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • FIG. 4 shows that in one embodiment of the present disclosure, “cells that have been left undifferentiated” generated in colonies in culture of stem cells having pluripotency are removed by the addition of a substance that can inhibit cell-cell adhesion.
  • FIG. FIG. 5 is a diagram for explaining a schedule of an experiment performed in the example.
  • FIG. 6 is an example of a microscopic observation photograph when HA-1 having a final concentration of 100 nM is added to day3.
  • FIG. 7 is an example of a microscopic observation photograph when HA-1 having a final concentration of 50 nM is added to day3.
  • FIG. 8 is an example of a microscopic observation photograph when HA-1 having a final concentration of 10 nM is added to day3.
  • FIG. 9 is an example of a microscopic observation photograph when HA-1 having a final concentration of 1 nM is added to day3.
  • FIG. 10 is an example of a microscopic observation photograph when HA-2 having a final concentration of 100 nM is added to day3.
  • FIG. 11 is an example of a microscopic observation photograph when HA-2 having a final concentration of 50 nM is added to day3.
  • FIG. 12 is an example of a microscopic observation photograph when HA-2 having a final concentration of 1 nM is added to day3.
  • FIG. 13 is an example of a microscopic observation photograph when HA-2 having a final concentration of 100 nM is added to day3.
  • FIG. 10 is an example of a microscopic observation photograph when HA-2 having a final concentration of 100 nM is added to day3.
  • FIG. 11 is an example of a microscopic observation photograph when HA-2 having a final concentration of 50 nM is added to day3.
  • FIG. 12 is an example of a
  • FIG. 14 is an example of a microscopic observation photograph when HA-3 having a final concentration of 50 nM is added to day3.
  • FIG. 15 is an example of a microscopic observation photograph when HA-3 having a final concentration of 10 nM is added to day3.
  • FIG. 16 is an example of a microscopic photograph when HA-4 having final concentrations of 100, 50, and 10 nM is added to day3.
  • FIG. 17 is an example of a microscopic observation photograph at the time of culturing pluripotent stem cells using MEF feeder cells.
  • FIG. 18 is an example of a microscopic photograph when HA-1 having a final concentration of 50 nM is added to day 5 after adding Rac-1 inhibitor to day 3.
  • FIG. 19 is an example of a microscopic observation photograph during feeder-less culture of pluripotent stem cells.
  • FIG. 20 is an example of a microscopic observation photograph when 201B7 strain or 454E-2 strain is used.
  • FIG. 21 is a diagram for explaining a schedule of an experiment performed in the example.
  • FIG. 22 is a graph showing the proportion of undifferentiated colonies during subculture.
  • a pluripotent stem cell when a pluripotent stem cell is cultured in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion, an undifferentiated state generated and / or generated in a colony in culture is released. Based on the knowledge that cells can be removed. Further, in one aspect, the present disclosure provides that, in a case where the undifferentiated cells and the cells that have departed from the undifferentiated state are mixed in the cultured cells, the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion has departed from the undifferentiated state. Based on the finding that cells can be selectively removed.
  • FIG. 1A shows a state in which cells that have been removed from an undifferentiated state are generated at the center of an undifferentiated cell colony cultured on a plate.
  • undifferentiated cells grow and undifferentiated colonies are formed (FIG. 1D).
  • FIG. 1D As shown in the figure, according to the present disclosure, in one or a plurality of non-limiting embodiments, “cells that have left the undifferentiated state” can be removed “to be erased with an eraser”.
  • the mechanism by which cells that have departed from the undifferentiated state are estimated as follows, but the present disclosure is not limited to these mechanisms.
  • cells that have left the undifferentiated state have weaker cell-cell adhesion and adhesion to the scaffold than undifferentiated cells, and a gap is likely to be formed between the cells (FIG. 2A).
  • cell-cell adhesion of cells that have left the undifferentiated state is further weakened, resulting in morphological changes and cell proliferation being suppressed ( FIG. 2B).
  • FIG. 3A shows an undifferentiated cell colony cultured on a plate.
  • a “substance that can inhibit cell-cell adhesion” is added to the culture medium in this state, even if cells that have left the undifferentiated state are generated in this colony (FIG. 3B), the cells that have departed from the undifferentiated state will not grow. Suppressed and eventually removed (FIG. 3C). Subsequent cultivation continues to form undifferentiated colonies (FIG. 3D).
  • the mechanism by which cells that have departed from the undifferentiated state are estimated as follows, but the present disclosure is not limited to these mechanisms.
  • the first is a colony of undifferentiated cells, which are thought to have strong mutual cell-cell adhesion (FIG. 4A). Cells that have accidentally left the undifferentiated state are generated in this colony (FIG. 4B). It is considered that cells that have left the undifferentiated state have weaker cell-cell adhesion than cells in the undifferentiated state, and a gap is likely to be formed between the cells.
  • the present disclosure provides a method for culturing pluripotent stem cells, which includes culturing cells in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion (hereinafter referred to as “the present disclosure”). Also referred to as “culture method”. According to the culture method according to the present disclosure, in one aspect, an effect can be obtained in which “cells that have been removed from an undifferentiated state” that are generated in a colony during culturing of pluripotent stem cells can be removed.
  • the present disclosure provides a method for removing cells that have developed or have been undifferentiated during culture of pluripotent stem cells and can inhibit intercellular adhesion.
  • the present invention relates to a method comprising culturing cells in the presence of (hereinafter also referred to as “removal method according to the present disclosure”).
  • a method comprising culturing cells in the presence of (hereinafter also referred to as “removal method according to the present disclosure”).
  • an undifferentiated state is obtained from a colony of undifferentiated cells that have been generated and deteriorated.
  • the detached cells can be removed to form undifferentiated cell colonies or undifferentiated cell colonies.
  • the present disclosure is a method of forming a colony composed of undifferentiated cells from a colony that has developed and deteriorated from cells that have degenerated from an undifferentiated state, the method comprising:
  • the present invention relates to a method comprising culturing the deteriorated colony in the presence (hereinafter, also referred to as “colony forming method according to the present disclosure”).
  • the present disclosure is a method for maintaining an undifferentiated state of stem cells having pluripotency, the method comprising culturing cells in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion (hereinafter, , Also referred to as “maintenance method according to the present disclosure”).
  • pluripotent stem cells are human pluripotent stem cells in one or more non-limiting embodiments.
  • human pluripotent stem cells are human iPS cells or human ES cells in one or more non-limiting embodiments.
  • a cell from which an undifferentiated state has been removed can be discriminated in one or a plurality of non-limiting embodiments, unlike a cell in an undifferentiated state.
  • the “cell that has been undifferentiated” may be referred to as a “de-differentiated cell” or an “undifferentiated departure cell”.
  • the undifferentiated marker is Oct3 / 4, Nanog, SSEA-4, TRA-1-60 in one or more non-limiting embodiments.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is, in one or more non-limiting embodiments, a substance having an E-cadherin function inhibitory activity.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is, in one or a plurality of non-limiting embodiments, added to the cell surface in addition to the function-inhibiting activity of E-cadherin from the viewpoint of efficiently removing undifferentiated cells. It is preferable to have the binding ability.
  • the ability to bind to the cell surface is, in one or more non-limiting embodiments, the ability to bind pluripotent stem cells to the cell surface.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is hemagglutinin (HA) in a neurotoxin complex of Clostridium botulinum in one or more non-limiting embodiments.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is, in one or more non-limiting embodiments, 3 in the neurotoxin complex of Clostridium botulinum from the viewpoint of efficiently removing undifferentiated cells.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is a complex composed of HA2 (HA17) and HA3 (HA70) from the viewpoint of efficiently removing undifferentiated cells in one or a plurality of non-limiting embodiments.
  • a complex composed of three components or a complex thereof is included.
  • the subcomponent HA3 (HA70) is an A type or a B type from the viewpoint of expressing the function-inhibiting activity of E-cadherin and efficiently removing undifferentiated cells. It is preferably that of botulinum.
  • each subcomponent may be those of any of botulinum of type A, type B, and type C in one or a plurality of non-limiting embodiments. In one or a plurality of embodiments in which HA is not limited, each subcomponent may be a recombinant or a natural type.
  • cell culture in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion can employ conventionally used and / or developed pluripotent stem cell culture conditions and culture media. This can be achieved by the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion in the medium under the culture conditions.
  • a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion may be added to the culture medium being cultured, or a medium pre-added with a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is used. It may be cultured. Commercially available culture media and culture plates may be used.
  • the “substance capable of inhibiting cell-cell adhesion” may be added to the medium after confirming the undifferentiated cells, or may be added to the medium at a stage where no undifferentiated cells are generated.
  • the concentration of the “substance that can inhibit cell-cell adhesion” to be present in the medium is a substantially effective concentration that can remove de-undifferentiated cells in one or a plurality of non-limiting embodiments, and can be set by those skilled in the art. .
  • the concentration of the “substance that can inhibit cell-cell adhesion” present in the medium is 5 nM or more, 10 nM or more, or 15 nM or more from the viewpoint of efficiently removing undifferentiated cells. Is mentioned. From the same viewpoint, it is 200 nM or less, 150 nM or less, or 100 nM or less.
  • One or a plurality of non-limiting embodiments in which the “substance capable of inhibiting cell-cell adhesion” is present in the culture medium may be a single administration, a continuous administration, an intermittent administration, with the next medium exchange as a break. Good.
  • cell culture includes, in one or more non-limiting embodiments, subculture.
  • an undifferentiated colony a non-differentiated cell formed by an undifferentiated cell
  • the passaging can be performed by a conventionally known method and a technique developed in the future.
  • the cell culture may be culture using feeder cells or feeder-less culture in one or a plurality of non-limiting embodiments.
  • the feeder cells include, but are not limited to, MEF (Mouse Embryo Fibroblast) cells, SL10, and SNL 76/7 feeder cells.
  • the feeder cell is preferably a feeder cell in which the migration rate of pluripotent stem cells is relatively slow.
  • the feeder cell has a relatively slow migration of the pluripotent stem cell, and the pluripotent stem cell is colonized during the culture of the pluripotent stem cell.
  • SNL 76/7 feeder cells are preferred because they can be generated.
  • the cell culture can efficiently remove the undifferentiated departure cells, so that the undifferentiated departure cells can be generated in the central part of the colony during the pluripotent stem cell culture. It is preferable to carry out under conditions.
  • undifferentiated cells can be efficiently generated in the central part of the colony by inhibiting and / or suppressing the migration of pluripotent stem cells.
  • the present disclosure provides a method for culturing pluripotent stem cells, culturing cells in the presence of a substance that can inhibit migration, and the presence of a substance that can inhibit cell-cell adhesion. It relates to a method comprising culturing cells under.
  • undifferentiated departure cells can be generated in the central part of colonies during pluripotent stem cell culture, thus efficiently removing undifferentiated departure cells. The effect that it is possible can be produced.
  • the present disclosure provides a method for removing undifferentiated deviation cells generated during or capable of developing stem cells having pluripotency, wherein cells are cultured in the presence of a substance capable of inhibiting migration. And culturing the cells in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • undifferentiated departure cells are removed from a colony of undifferentiated cells generated and deteriorated. , A colony of undifferentiated cells or a colony composed of undifferentiated cells.
  • the present disclosure provides a method of forming a colony composed of undifferentiated cells from a colony that has developed and deteriorated from undifferentiated cells, and the cells are cultured in the presence of a substance that can inhibit migration. And culturing the degraded colony in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • examples of the substance capable of inhibiting migration include a substance that suppresses / inhibits the activity of a substance related to the migration of pluripotent stem cells in one or a plurality of non-limiting embodiments.
  • the substance capable of inhibiting migration includes a migration inhibitor in one or a plurality of non-limiting embodiments.
  • the substance capable of inhibiting migration includes, but is not limited to, a Rac-1 inhibitor and the like in one or more embodiments.
  • the concentration of the “substance that can inhibit migration” present in the culture medium is not limited.
  • the undifferentiated departure cells are efficiently moved to the central part of the colony, and the undifferentiated departure cells are efficiently removed. From the viewpoint of, it is 50 ⁇ M or more, 100 ⁇ M or more, or 150 ⁇ M or more, and from the same viewpoint, it is 200 ⁇ M or less.
  • the substance that can inhibit migration may be added to the medium at the start of culture, or may be added at the time of medium exchange. In one or a plurality of non-limiting embodiments, the substance capable of inhibiting migration may be added to the medium at a stage where undifferentiated departure cells are not generated, or added to the medium after confirming the undifferentiated departure cells. Also good.
  • the cell culture is performed in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion, thereby automatically maintaining a closed space.
  • undifferentiated cells can be removed from the colony.
  • undifferentiated departure cells can be automatically removed from the colony even when a manual operation and / or confirmation, or a special device such as a robot is not used.
  • the colony formed further is a colony of an undifferentiated state cell, or an undifferentiated state. It can be made into the colony which consists of these cells.
  • an undifferentiated cell colony or a colony composed of undifferentiated cells is efficiently obtained in an automatic culture apparatus.
  • undifferentiated cells can be easily and efficiently mass-produced.
  • the present disclosure relates to a composition containing a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion (hereinafter, also referred to as “composition according to the present disclosure”).
  • composition according to the present disclosure a composition containing a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion
  • the “substance capable of inhibiting cell-cell adhesion” in the composition according to the present disclosure is as described above.
  • the composition concerning this indication can be used for the cultivation method concerning this indication, the removal method concerning this indication, the colony formation method concerning this indication, and / or the maintenance method concerning this indication. Therefore, the present disclosure, in another aspect, inhibits intercellular adhesion in the culture method according to the present disclosure, the removal method according to the present disclosure, the colony formation method according to the present disclosure, and / or the maintenance method according to the present disclosure.
  • the present disclosure relates to a kit (hereinafter, also referred to as “kit according to the present disclosure”) including a medium component for pluripotent stem cells and a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • kit according to the present disclosure includes a medium component for pluripotent stem cells and a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • the “substance capable of inhibiting cell-cell adhesion” in the kit according to the present disclosure is as described above.
  • the kit according to the present disclosure can be used for the culture method according to the present disclosure, the removal method according to the present disclosure, the colony formation method according to the present disclosure, and / or the maintenance method according to the present disclosure.
  • the medium component for stem cells having pluripotency is not particularly limited, and those conventionally used or developed in the future can be used.
  • the present disclosure further relates to one or more non-limiting embodiments below.
  • a method for culturing pluripotent stem cells comprising culturing cells in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • a method for maintaining an undifferentiated state of stem cells having pluripotency which comprises culturing cells in the presence of a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell.
  • the human pluripotent stem cell is a human iPS cell or a human ES cell.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is a substance having an E-cadherin function inhibitory activity.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is further a substance capable of binding to the cell surface.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is composed of two or three components selected from the group consisting of three hemagglutinin subcomponents HA1, HA2, and HA3 in the Clostridium botulinum neurotoxin complex.
  • the method according to [9] wherein the HA3 subcomponent of the complex is of A or B type Clostridium botulinum.
  • a composition for culturing pluripotent stem cells comprising a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • a composition for removing cells that have developed or have developed an undifferentiated state during the cultivation of pluripotent stem cells including a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • a composition for maintaining an undifferentiated state of pluripotent stem cells comprising a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • composition according to [15], wherein the human pluripotent stem cells are human iPS cells or human ES cells.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is a substance having an E-cadherin function inhibitory activity.
  • the composition according to [17], wherein the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is further a substance capable of binding to the cell surface.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is hemagglutinin in a neurotoxin complex of Clostridium botulinum.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is composed of two or three components selected from the group consisting of three hemagglutinin subcomponents HA1, HA2, and HA3 in the neurotoxin complex of Clostridium botulinum.
  • the composition according to [20], wherein the HA3 subcomponent of the complex is of type A or B botulinum.
  • a kit comprising a medium component for pluripotent stem cells and a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • the kit according to [24] which is used to remove cells that have been released from an undifferentiated state that may or may occur during culture of pluripotent stem cells.
  • the kit according to [24] for culturing pluripotent stem cells.
  • the kit according to [24] which is used to remove cells that have emerged from a pluripotent stem cell or that have escaped an undifferentiated state, which contains a substance capable of inhibiting cell-cell adhesion.
  • kits according to [28] wherein the human pluripotent stem cells are human iPS cells or human ES cells.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is a substance having an E-cadherin function inhibitory activity.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is further a substance capable of binding to the cell surface.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is hemagglutinin in a neurotoxin complex of Clostridium botulinum.
  • the substance capable of inhibiting cell-cell adhesion is composed of two or three components selected from the group consisting of three hemagglutinin subcomponents HA1, HA2, and HA3 in the neurotoxin complex of Clostridium botulinum.
  • the kit according to [33], wherein the HA3 subcomponent of the complex is of A or B type Clostridium botulinum.
  • the kit according to any one of [24] to [34] wherein the culture is subculture.
  • IPS cells were cultured according to the experimental schedule shown in FIG. First, iPS cells were seeded on feeder cells (day 0), and the medium was replaced with a maintenance medium every 24 hours. Three days later (day 3), HA was added, incubated for 24 hours, washed twice with PBS, and medium exchanged with maintenance medium (day 4). Thereafter, the medium was replaced with the maintenance medium every 24 hours until 9 days later (day 9). After the culture, the expression of Oct3 / 4 in the cultured cells was confirmed by immunocytostaining, and DAPI staining was performed.
  • the cells, medium, HA, and culture conditions used are as follows.
  • ⁇ cell ⁇ iPS cells Tic (Np 39) Feeder cells: SNL 76/7 (Np 5) mitomycin-c treated [medium] iPS cells: Repro Stem (trade name, manufactured by ReproCELL), 5 ng / mL FGF-2 Feeder cells: DMEM (7% FBS, 1% Penicillin-streptomycin solution) ⁇ container ⁇ 24-well plate (bottom area: 1.9 cm 2 / well, medium volume: 0.4 mL / well) [HA] As the HA complex sample, hemagglutinin HA-1 to HA-4 which are neurotoxin complex samples of Clostridium botulinum described in Table 1 below were used.
  • HA-1 and HA-2 are HA complex samples prepared separately, in which the subcomponents of HA1 to 3 are all B-type complexes.
  • HA-3 is a HA complex sample in which HA1 is C-type and HA2 and 3 are B-type.
  • HA-4 is a HA complex sample in which HA1 and 2 are B-type and HA3 is C-type.
  • Dilution of HA Two-stage dilution was performed in order to make the PBS concentration contained in the same dilution series the same. First, HA was serially diluted with PBS, and further diluted with a medium (Repro Stem).
  • days 3 to 5 were the same as when 100 nM was added. However, no undifferentiated cells were observed in day9.
  • FIGS. 10, 11 and 12 show microscopic observation photographs when HA-2 is added at 100 nM, 50 nM and 1 nM, respectively.
  • FIG. 10 the case where HA-2 was added at 100 nM was the same as the case where HA-1 was added at 100 nM (FIG. 6).
  • FIG. 11 the case where HA-2 was added at 50 nM was the same as the case where HA-1 was added at 50 nM (FIG. 7).
  • FIG. 12 the case where HA-2 was added with 1 nM was the same as the case where HA-1 was added with 1 nM (FIG. 9).
  • HA-1 and HA-2 are summarized in Table 2 below. As shown in Table 2, when HA-1 and HA-2 were added at 100 nM and 50 nM, the undifferentiated cells generated at the time of day 3 were reduced and / or disappeared.
  • FIG. 13 shows the results of observing the effect of HA-2 on the undifferentiated cells brought in at the time of passage. As shown in the figure, when HA-2 was added at 100 nM and treated for 24 hours, the undifferentiated cells gradually detached.
  • FIGS. 14 and 15 show microscopic observation photographs when HA-3 is added at 50 nM and 10 nM, respectively.
  • FIG. 16 shows microscopic observation photographs when HA-4 was added at 100 nM, 50 nM, and 10 nM. As shown in the figure, the area of de-differentiated cells that had occurred at the time of day 3 continued to expand. However, when HA-4 is 100 nM, the de-differentiated cell region may be reduced.
  • IPS cells were seeded on feeder cells, and the medium was replaced with a maintenance medium every 24 hours until 7 days later. After the culture, the expression of Oct3 / 4 in the cultured cells was confirmed by immunocytostaining, and DAPI staining was performed.
  • the used cells, medium, and culture conditions are as follows.
  • ⁇ cell ⁇ iPS cells Tic (Np 39)
  • Feeder cells MEF ⁇ Culture medium ⁇ iPS cells: Repro Stem (trade name, manufactured by ReproCELL), 5 ng / mL FGF-2
  • Feeder cells DMEM (7% FBS, 1% Penicillin-streptomycin solution) ⁇ container ⁇ 24-well plate (bottom area: 1.9 cm 2 / well, medium volume: 0.4 mL / well)
  • IN Cell Analyzer 2000 trade name, manufactured by GE Healthcare Biosciences
  • Rh-1 inhibitor trade name: NSC23766, manufactured by Calbiochem
  • a migration inhibitor was added 3 days after the start of culture (day 3). And observations were made.
  • the obtained microscope observation photograph is shown in FIG. [Rac-1 inhibitor preparation and addition method]
  • bFGF trade name, manufactured by ReproCELL, final concentration of 5 ng / ml was added to the iPS cells.
  • ⁇ cell ⁇ iPS cells Tic (Np 39)
  • Feeder cells MEF ⁇ Culture medium ⁇ iPS cells: Repro Stem (trade name, manufactured by ReproCELL), 5 ng / mL bFGF (trade name, manufactured by ReproCELL)
  • Feeder cells DMEM (10% FBS (GIBCO), 1% HEPES (Sigma), 1% Penicillin-streptomycin (NACALAI TESQUE)) ⁇ container ⁇ 24-well plate (bottom area: 1.9 cm 2 / well, medium volume: 0.4 mL / well) [Observation] In day3, day4, day5, day6, and day8, the cultured cells were observed with IN Cell Analyzer 2000 (trade name, manufactured by GE Healthcare Bioscience), and images were acquired. The obtained microscope observation photograph is shown in FIG.
  • ⁇ cell ⁇ iPS cells Tic (Np 39) ⁇ Culture medium ⁇ mTeSR (R) 1 medium (trade name, manufactured by STEMCELL Technologies) ⁇ container ⁇ 24-well plate (bottom area: 1.9 cm 2 / well, medium volume: 0.4 mL / well) [Culture conditions] 37 ° C, 5% CO 2 atmosphere [Observation] In day 6, the cultured cells were observed with IN Cell Analyzer 2000 (trade name, manufactured by GE Healthcare Bioscience), and images were acquired.
  • IN Cell Analyzer 2000 trade name, manufactured by GE Healthcare Bioscience
  • undifferentiated departure cells were generated at the outer edge (outside) of the colony as in the case of MEF feeder cells.
  • FIG. 19 is a microscopic observation photograph in the case where Rac-1 inhibitor is 150 ⁇ M.
  • Rac-1 inhibitor is 150 ⁇ M.
  • the colonies containing undifferentiated cells were reduced and / or disappeared when HA was added.
  • IPS cells were subcultured according to the experimental schedule shown in FIG. First, iPS cells were seeded on feeder cells (day 0), and the medium was replaced with a maintenance medium every 24 hours. Three days later (day 3), HA was added at 50 nM, incubated for 24 hours, washed twice with PBS, and replaced with a maintenance medium (day 4). Thereafter, the medium was replaced with the maintenance medium every 24 hours until 10 days later (day 10).
  • the cells were subcultured by a normal operation, and 3 days after the subculture (day 13), 50 nM HA was added, incubated for 24 hours, washed twice with PBS, and the medium was replaced with a maintenance medium (day 14). Thereafter, culture for 10 days, passage, addition of HA and culture (10 days) were performed. The expression of Oct3 / 4 in the cultured cells was confirmed by an immune cell staining method, and DAPI staining was performed.
  • the used cells, medium, and culture conditions are as follows. HA-1 was used as HA.
  • ⁇ cell ⁇ iPS cells Tic (Np 39) Feeder cells: SNL 76/7 (Np 5) mitomycin-c treated [medium] iPS cells: Repro Stem (trade name, manufactured by ReproCELL), 5 ng / mL FGF-2 Feeder cells: DMEM (7% FBS, 1% Penicillin-streptomycin solution) ⁇ container ⁇ 24-well plate (bottom area: 1.9 cm 2 / well, medium volume: 0.4 mL / well) [HA preparation and addition method] Dilution of HA: Two-stage dilution was performed in order to make the PBS concentration contained in the same dilution series the same.
  • a medium Repro Stem
  • bFGF final concentration 5 ng / ml

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Abstract

多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する未分化状態を脱した細胞を除去できる方法の提供。一態様において、多能性を有する幹細胞の培養方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。その他の態様において、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。その他の態様において、多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。

Description

多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養方法
　本開示は多能性を有する幹細胞の培養方法、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法、多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法、これらの方法に使用する組成物、及び、これらの方法に使用するキットに関する。
　ヒトｉＰＳ細胞などの多能性幹細胞を大量培養する際には、一連の増幅培養（継代培養）の繰り返しにより多くの未分化な細胞を調製する。この一連の培養において、未分化状態から逸脱した細胞“脱未分化細胞”が偶発的に発生することが知られている。
　この脱未分化細胞は、未分化細胞とほぼ同等の分裂能力を有し、かつ、未分化細胞から脱未分化細胞への転換を誘発することが知られている。すなわち、脱未分化細胞が発生すると、その増殖速度は未分化細胞のそれを上回り、未分化細胞の増殖が抑制される。
　脱未分化細胞の発生は、熟練してない培養操作者による培養で多く観察される。また、コロニーサイズの過大や、コロニー同士の合一が発生の一因であると知られている。よって、低コンフルエントでの継代、播種時の均一性維持により、脱未分化細胞の発生頻度をある程度下げることができる。また、近年の開発された培地によっても、脱未分化細胞の発生頻度がある程度抑制されている。しかしながら、それでも脱未分化細胞は偶発的に発生し、発生した場合には、脱未分化細胞を含むコロニーを除去することが未だ必須である。
　脱未分化細胞を含むコロニーは、未分化状態を維持するため、継代時に顕微鏡下のピペッティング作業により丁寧に除去される。このようなコロニー除去の手技を模した装置、例えば、観察装置とロボットハンドリングによるピペッティングを組み合せた装置も開発されている。
　また、特許文献１には、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の未分化を維持しつつ増殖させるために、アクチビン存在下で多能性幹細胞を培養することを開示する。
特開２０１２－１４３２２９号公報
　上述したとおり、ヒトｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞の継代培養では、脱未分化現象を引き起こしやすく、未分化維持が困難で、数回の継代後には多くのｉＰＳ細胞コロニーが脱未分化現象を引き起こし、未分化状態を脱した細胞を含む劣化コロニーとなりうる。よって、丁寧な培養、及び、丁寧なコロニーの選別という煩雑な操作が不可欠となる。幹細胞産業を促進する点からも、煩雑な操作が少なく、熟練者でなくても可能な、多能性幹細胞の未分化維持方法が望まれている。
　本開示は、一態様において、多能性（“pluripotency”、以下同様）を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する「未分化状態を脱した細胞」を除去できる方法を提供する。
　本開示は、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。本開示は、その他の態様において、本開示にかかる上述の方法に使用するための、細胞間接着を阻害可能な物質を含む組成物に関する。本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞用の培地成分と細胞間接着を阻害可能な物質とを含むキットに関する。
　本開示によれば、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する「未分化状態を脱した細胞」を除去できるという効果が奏されうる。
図１は、本開示の一実施形態における、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生した「未分化状態を脱した細胞」が、細胞間接着を阻害可能な物質の添加により除去される様子を説明する図である。 図２は、本開示の一実施形態における、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生した「未分化状態を脱した細胞」が、細胞間接着を阻害可能な物質の添加により除去される様子を説明する図である。 図３は、本開示の一実施形態における、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する「未分化状態を脱した細胞」が、細胞間接着を阻害可能な物質の添加により除去される様子を説明する図である。 図４は、本開示の一実施形態における、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する「未分化状態を脱した細胞」が、細胞間接着を阻害可能な物質の添加により除去される様子を説明する図である。 図５は、実施例で行った実験のスケジュールを説明する図である。 図６は、終濃度１００ｎＭのＨＡ－１をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図７は、終濃度５０ｎＭのＨＡ－１をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図８は、終濃度１０ｎＭのＨＡ－１をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図９は、終濃度１ｎＭのＨＡ－１をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図１０は、終濃度１００ｎＭのＨＡ－２をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図１１は、終濃度５０ｎＭのＨＡ－２をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図１２は、終濃度１ｎＭのＨＡ－２をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図１３は、終濃度１００ｎＭのＨＡ－２をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図１４は、終濃度５０ｎＭのＨＡ－３をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図１５は、終濃度１０ｎＭのＨＡ－３をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図１６は、終濃度１００、５０、及び１０ｎＭのＨＡ－４をｄａｙ３に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図１７は、ＭＥＦフィーダ細胞を用いた多能性を有する幹細胞の培養時の顕微鏡観察写真の一例である。 図１８は、Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒをｄａｙ３に添加した後、終濃度５０ｎＭのＨＡ－１をｄａｙ５に添加した時の顕微鏡観察写真の一例である。 図１９は、多能性を有する幹細胞のフィーダレス培養時の顕微鏡観察写真の一例である。 図２０は、２０１Ｂ７株又は４５４Ｅ－２株を用いた時の顕微鏡観察写真の一例である。 図２１は、実施例で行った実験のスケジュールを説明する図である。 図２２は、継代培養時の未分化コロニーの割合を示すグラフである。
　本開示は、一態様において、多能性を有する幹細胞を、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で培養すると、培養中のコロニー内に発生した及び／又は発生する未分化状態を脱した細胞を除去することができる、という知見に基づく。また、本開示は、一態様において、培養細胞中に未分化細胞と未分化状態を脱した細胞とが混合している場合において、細胞間接着を阻害可能な物質が、未分化状態を脱した細胞を選択的に除去できるという知見に基づく。
　本開示における、細胞間接着を阻害可能な物質の添加により、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生した「未分化状態を脱した細胞」を除去する、限定されない一又は複数の実施形態を、図１に基づき説明する。図１Ａは、プレート上で培養される未分化状態の細胞コロニーの中央部に、未分化状態を脱した細胞が発生した状態を示す。この状態で培養液に「細胞間接着を阻害可能な物質」を添加すると、未分化状態を脱した細胞が除去され始め（図１Ｂ）、やがて、コロニー中央部から未分化を脱した細胞が消滅する（図１Ｃ）。その後培養を続けることにより未分化状態の細胞が増殖し、未分化状態のコロニーが形成される（図１Ｄ）。同図に示すとおり、本開示によれば、限定されない一又は複数の実施形態において、「未分化状態を脱した細胞」を“消しゴムで消すように”取り除くことができる。
　図１の実施形態において未分化状態を脱した細胞が除去されるメカニズムは以下のように推定されるが、本開示はこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。まず、未分化状態を脱した細胞は、未分化状態の細胞よりも細胞間接着及び足場への接着が弱く、細胞間にギャップができやすくなると考えられる（図２Ａ）。この細胞間のギャップに細胞間接着を阻害可能な物質が入り込むことにより、未分化状態を脱した細胞の細胞間接着はさらに弱くされ、形態変化が生じ、細胞増殖が抑制されると考えられる（図２Ｂ）。また、このとき、培養面の足場との細胞接着が弱くなった未分化状態を脱した細胞は、浮遊し、アポトーシスにより取り除かれると考えられる（図２Ｂ）。周囲の未分化状態の細胞が増殖するにつれ、未分化状態を脱した細胞は中央部分に押し込まれ（図２Ｃ）、最終的にはアポトーシスにより排除される（図２Ｄ）。
　本開示における、細胞間接着を阻害可能な物質の添加により、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する「未分化状態を脱した細胞」を除去する、限定されない一又は複数の実施形態を、図３に基づき説明する。図３Ａは、プレート上で培養される未分化状態の細胞コロニーを示す。この状態で培養液に「細胞間接着を阻害可能な物質」を添加すると、このコロニーに未分化状態を脱した細胞が発生しても（図３Ｂ）、未分化状態を脱した細胞の増殖が抑制され、やがて、除去される（図３Ｃ）。その後培養を続けることにより未分化状態のコロニーが形成され続ける（図３Ｄ）。
　図３の実施形態において未分化状態を脱した細胞が除去されるメカニズムは以下のように推定されるが、本開示がこれらのメカニズムに限定して解釈されなくてもよい。最初は未分化状態の細胞のコロニーであり、相互の細胞間接着が強いと考えられる（図４Ａ）。このコロニーに偶発的に未分化状態を脱した細胞が発生する（図４Ｂ）。未分化状態を脱した細胞は、未分化状態の細胞よりも細胞間接着が弱く、細胞間にギャップができやすくなると考えられる。この細胞間のギャップに細胞間接着を阻害可能な物質が入り込むことにより、未分化状態を脱した細胞の細胞間接着はさらに弱くされ、形態変化が生じ、細胞増殖が抑制されると考えられる。また、このとき、培養面との細胞接着がなくなった未分化状態を脱した細胞は、増殖を続ける周囲の未分化状態の細胞に押し出され、アポトーシスにより取り除かれると考えられる（図４Ｃ）。
　よって、本開示は、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法（以下、「本開示にかかる培養方法」ともいう。）に関する。本開示にかかる培養方法によれば、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに発生する「未分化状態を脱した細胞」を除去できるという効果が奏されうる。
　したがって、本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法（以下、「本開示にかかる除去方法」ともいう。）に関する。本開示にかかる培養方法、及び／又は、本開示にかかる除去方法によれば、一態様において、未分化状態を脱した細胞が発生し劣化した未分化状態の細胞のコロニーから、未分化状態を脱した細胞を除去し、未分化状態の細胞のコロニー又は未分化状態の細胞からなるコロニーとすることができる。
　したがって、本開示は、その他の態様において、未分化状態を脱した細胞が発生し劣化したコロニーから未分化状態の細胞からなるコロニーを形成する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で前記劣化したコロニーを培養することを含む方法（以下、「本開示にかかるコロニー形成方法」ともいう。）に関する。
　また、本開示にかかる培養方法、及び／又は、本開示にかかる除去方法によれば、一態様において、未分化状態細胞又は未分化状態細胞のみを培養することができる。したがって、本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法（以下、「本開示にかかる維持方法」ともいう。）に関する。
　［多能性を有する幹細胞］
　本開示において、多能性を有する幹細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、ヒト多能性（pluripotent）幹細胞である。本開示において、ヒト多能性幹細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である。
　［未分化状態を脱した細胞］
　本開示において、未分化状態を脱した細胞とは、限定されない一又は複数の実施形態において、細胞の形態が未分化状態の細胞のそれとは異なり、判別可能である。本開示において「未分化状態を脱した細胞」は、「脱未分化細胞」又は「未分化逸脱細胞」とも言う場合がある。脱未分化細胞となったことは、限定されない一又は複数の実施形態において、未分化マーカーの消失で確認できる。前記未分化マーカーは、限定されない一又は複数の実施形態において、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０である。
　［細胞間接着を阻害可能な物質］
　本開示において、細胞間接着を阻害可能な物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、Ｅ－カドヘリンの機能阻害活性を有する物質である。本開示において、細胞間接着を阻害可能な物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、効率的に脱未分化細胞を除去する観点から、Ｅ－カドヘリンの機能阻害活性に加え、細胞表面への結合能を有することが好ましい。前記細胞表面への結合能は、限定されない一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞の細胞表面への結合能である。
　〔ＨＡ〕
　本開示において、細胞間接着を阻害可能な物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の神経毒素複合体におけるヘマグルチニン（ＨＡ）である。本開示において、細胞間接着を阻害可能な物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、効率的に脱未分化細胞を除去する観点から、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の神経毒素複合体における３つのヘマグルチニンサブコンポーネントＨＡ１（ＨＡ３３）、ＨＡ２（ＨＡ１７）、及び、ＨＡ３（ＨＡ７０）からなる群から選択される２又は３成分で構成される複合体又はその複合体を含むものである。また、細胞間接着を阻害可能な物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、効率的に脱未分化細胞を除去する観点から、ＨＡ２（ＨＡ１７）及びＨＡ３（ＨＡ７０）で構成される複合体若しくは３成分で構成される複合体又はその複合体を含むものである。前記サブコンポーネントＨＡ３（ＨＡ７０）は、一又は複数の実施形態において、Ｅ－カドヘリンの機能阻害活性を発現する観点、及び、効率的に脱未分化細胞を除去する観点から、Ａ型又はＢ型のボツリヌス菌のものであることが好ましい。また、サブコンポーネントＨＡ１（ＨＡ３３）及びＨＡ２（ＨＡ１７）は、限定されない一又は複数の実施形態において、Ａ型、Ｂ型、及びＣ型のいずれのボツリヌス菌のものであってもよい。ＨＡは、限定されない一又は複数の実施形態において、各サブコンポーネントは、それぞれ、リコンビナントであってもよく、天然型であってもよい。
　［細胞間接着を阻害可能な物質の存在下での細胞培養］
　本開示において、「細胞間接着を阻害可能な物質の存在下での細胞培養」は、従来用いられる及び／又は今後開発される、多能性を有する幹細胞の培養条件及び培養培地等を採用でき、該培養条件の培地に細胞間接着を阻害可能な物質を存在させることで行える。限定されない一又は複数の実施形態において、細胞間接着を阻害可能な物質を培養中の培養培地に添加してもよく、或いは、細胞間接着を阻害可能な物質を予め添加した培地を使用して培養してもよい。培養培地、培養プレート等は市販のものを使用してもよい。
　「細胞間接着を阻害可能な物質」は、脱未分化細胞を確認してから培地に添加してもよく、脱未分化細胞が発生しない段階で培地に添加してもよい。
　培地に存在させる「細胞間接着を阻害可能な物質」の濃度は、限定されない一又は複数の実施形態において、脱未分化細胞を除去できる実質的な有効濃度であり、当業者であれば設定できる。培地に存在させる「細胞間接着を阻害可能な物質」の濃度は、限定されない一又は複数の実施形態において、効率的に脱未分化細胞を除去する観点から、５ｎＭ以上、１０ｎＭ以上、又は１５ｎＭ以上が挙げられる。同様の観点から、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、又は１００ｎＭ以下である。
　「細胞間接着を阻害可能な物質」を培地に存在させる限定されない一又は複数の実施形態として、次の培地交換を区切りとして単回の投与でもよく、連続の投与でもよく、断続的な投与でもよい。
　本開示において、細胞培養は、限定されない一又は複数の実施形態において、継代培養を含む。本開示にかかる培養方法、及び／又は、本開示にかかる除去方法によれば、一態様において、継代培養後に形成されるコロニーにおける未分化コロニー（未分化細胞で形成され、未分化逸脱細胞を実質的に含まないコロニー）の割合を向上できるという効果を奏する。継代は、限定されない一又は複数の実施形態において、従来公知及び今後開発される手法により行うことができる。
　本開示において、細胞培養は、限定されない一又は複数の実施形態において、フィーダ細胞を用いた培養であってもよいし、フィーダレス培養であってもよい。フィーダ細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、ＭＥＦ（Ｍｏｕｓｅ　Ｅｍｂｒｙｏ　Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）細胞、ＳＬ１０、及びＳＮＬ　７６／７フィーダ細胞等が挙げられる。フィーダ細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、フィーダ細胞の中でも、多能性を有する幹細胞の遊走速度が比較的ゆっくりなフィーダ細胞が好ましい。フィーダ細胞は、限定されない一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞の遊走が比較的ゆっくりであり、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに未分化逸脱細胞をコロニー中央部に発生させることができる点から、ＳＮＬ　７６／７フィーダ細胞が好ましい。
　細胞培養は、限定されない一又は複数の実施形態において、効率よく未分化逸脱細胞を除去できる点から、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニー中央部に未分化逸脱細胞を発生させることができる条件で行うことが好ましい。限定されない一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞の遊走を阻害及び／又は抑制することによって、コロニー中央部に未分化逸脱細胞を効率よく発生させることができる。
　本開示は、その他の一態様において、多能性を有する幹細胞の培養方法であって、遊走を阻害可能な物質の存在下で細胞を培養すること、及び細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。本態様にかかる培養方法によれば、一態様において、多能性を有する幹細胞の培養中のコロニーに未分化逸脱細胞をコロニー中央部に発生させることができることから、効率よく未分化逸脱細胞を除去できるという効果が奏されうる。
　本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化逸脱細胞を除去する方法であって、遊走を阻害可能な物質の存在下で細胞を培養すること、及び細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む方法に関する。本態様にかかる培養方法、及び／又は、本態様にかかる除去方法によれば、一態様において、未分化逸脱細胞が発生し劣化した未分化状態の細胞のコロニーから、未分化逸脱細胞を除去し、未分化状態の細胞のコロニー又は未分化状態の細胞からなるコロニーとすることができる。
　本開示は、その他の態様において、未分化逸脱細胞が発生し劣化したコロニーから未分化状態の細胞からなるコロニーを形成する方法であって、遊走を阻害可能な物質の存在下で細胞を培養すること、及び細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で前記劣化したコロニーを培養することを含む方法に関する。
　本開示において、遊走を阻害可能な物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、多能性を有する幹細胞の遊走に関連する物質の活性を抑制／阻害する物質等が挙げられる。本開示において、遊走を阻害可能な物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、遊走阻害剤が挙げられる。遊走を阻害可能な物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、Ｒａｃ－１阻害剤等が挙げられる。培地に存在させる「遊走を阻害可能な物質」の濃度は、限定されない一又は複数の実施形態において、未分化逸脱細胞を効率的にコロニー中央部に移動させ、未分化逸脱細胞を効率的に除去する観点から、５０μＭ以上、１００μＭ以上、又は１５０μＭ以上であり、同様の観点から、２００μＭ以下である。
　遊走を阻害可能な物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、培養開始時に培地に添加してもよいし、培地交換時に添加してもよい。遊走を阻害可能な物質は、限定されない一又は複数の実施形態において、未分化逸脱細胞が発生しない段階で培地に添加してもよいし、未分化逸脱細胞を確認してから培地に添加してもよい。
　本開示にかかる培養方法、及び／又は、本開示にかかる除去方法によれば、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することによって、一態様において、閉鎖空間を維持しながら自動的にコロニーから未分化逸脱細胞を除去できる。また、一態様において、人為的な操作及び／又は確認や、ロボット等の特殊な装置等を用いない場合であっても自動的にコロニーから未分化逸脱細胞を除去できる。また、本開示にかかる培養方法、及び／又は、本開示にかかる除去方法によれば、一態様において、さらには、形成されるコロニーを、自動的に未分化状態の細胞のコロニー又は未分化状態の細胞からなるコロニーとすることができる。
　したがって、本開示にかかる培養方法、及び／又は、本開示にかかる除去方法を用いることによって、自動培養装置において、未分化状態の細胞のコロニー又は未分化状態の細胞からなるコロニーを効率的に得ることができ、さらには未分化状態の細胞を簡単かつ効率よく大量生産することができる。
　本開示は、その他の態様において、細胞間接着を阻害可能な物質を含む組成物（以下、「本開示にかかる組成物」ともいう。）に関する。本開示にかかる組成物における「細胞間接着を阻害可能な物質」は、上述のとおりである。本開示にかかる組成物は、本開示にかかる培養方法、本開示にかかる除去方法、本開示にかかるコロニー形成方法、及び／又は本開示にかかる維持方法のために使用できる。したがって、本開示は、その他の態様において、本開示にかかる培養方法、本開示にかかる除去方法、本開示にかかるコロニー形成方法、及び／又は本開示にかかる維持方法における前記「細胞間接着を阻害可能な物質」の使用に関する。
　本開示は、その他の態様において、多能性を有する幹細胞用の培地成分と細胞間接着を阻害可能な物質とを含むキット（以下、「本開示にかかるキット」ともいう。）に関する。本開示にかかるキットにおける「細胞間接着を阻害可能な物質」は、上述のとおりである。本開示にかかるキットは、本開示にかかる培養方法、本開示にかかる除去方法、本開示にかかるコロニー形成方法、及び／又は本開示にかかる維持方法のために使用できる。多能性を有する幹細胞用の培地成分は、特に限定されず、従来使用される又は今後開発されるものを使用できる。
　本開示はさらに以下の限定されない一又は複数の実施形態に関する。
〔１〕　多能性を有する幹細胞の培養方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔２〕　多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔３〕　多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
〔４〕　多能性を有する幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、〔１〕から〔３〕のいずれかに記載の方法。
〔５〕　ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である、〔４〕記載の方法。
〔６〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、Ｅ－カドヘリンの機能阻害活性を有する物質である、〔１〕から〔５〕のいずれかに記載の方法。
〔７〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、さらに、細胞表面への結合能を有する物質である、〔６〕記載の方法。
〔８〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の神経毒素複合体におけるヘマグルチニン（ＨＡ）である、〔１〕から〔７〕のいずれかに記載の方法。
〔９〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の神経毒素複合体における３つのヘマグルチニンサブコンポーネントＨＡ１、ＨＡ２、及び、ＨＡ３からなる群から選択される２又は３成分で構成される複合体である、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の方法。
〔１０〕　前記複合体のＨＡ３サブコンポーネントは、Ａ型又はＢ型のボツリヌス菌のものである、〔９〕記載の方法。
〔１１〕　培養が、継代培養である、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載の方法。
〔１２〕　細胞間接着を阻害可能な物質を含む、多能性を有する幹細胞の培養のための、組成物。
〔１３〕　細胞間接着を阻害可能な物質を含む、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去するための、組成物。
〔１４〕　細胞間接着を阻害可能な物質を含む、多能性を有する幹細胞の未分化状態を維持するための、組成物。
〔１５〕　多能性を有する幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、〔１２〕から〔１４〕のいずれかに記載の組成物。
〔１６〕　ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である、〔１５〕記載の組成物。
〔１７〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、Ｅ－カドヘリンの機能阻害活性を有する物質である、〔１２〕から〔１６〕のいずれかに記載の組成物。
〔１８〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、さらに、細胞表面への結合能を有する物質である、〔１７〕記載の組成物。
〔１９〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の神経毒素複合体におけるヘマグルチニンである、〔１２〕から〔１８〕のいずれかに記載の組成物。
〔２０〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の神経毒素複合体における３つのヘマグルチニンサブコンポーネントＨＡ１、ＨＡ２、及び、ＨＡ３からなる群から選択される２又は３成分で構成される複合体である、〔１２〕から〔１９〕のいずれかに記載の組成物。
〔２１〕　前記複合体のＨＡ３サブコンポーネントは、Ａ型又はＢ型のボツリヌス菌のものである、〔２０〕記載の組成物。
〔２２〕　培養が、継代培養である、〔１２〕から〔２１〕のいずれかに記載の組成物。
〔２３〕　〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の方法のための、〔１２〕から〔２２〕のいずれかに記載の組成物。
〔２４〕　多能性を有する幹細胞用の培地成分と、細胞間接着を阻害可能な物質とを含む、キット。
〔２５〕　多能性を有する幹細胞の培養中に発生する又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去するための、〔２４〕記載のキット。
〔２６〕　多能性を有する幹細胞の培養のための、〔２４〕記載のキット。
〔２７〕　細胞間接着を阻害可能な物質を含む、多能性を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去するための、〔２４〕記載のキット。
〔２８〕　多能性を有する幹細胞が、ヒト多能性幹細胞である、〔２４〕から〔２７〕のいずれかに記載のキット。
〔２９〕　ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である、〔２８〕記載のキット。
〔３０〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、Ｅ－カドヘリンの機能阻害活性を有する物質である、〔２４〕から〔２９〕のいずれかに記載のキット。
〔３１〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、さらに、細胞表面への結合能を有する物質である、〔３０〕記載のキット。
〔３２〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の神経毒素複合体におけるヘマグルチニンである、〔２４〕から〔３１〕のいずれかに記載のキット。
〔３３〕　細胞間接着を阻害可能な物質が、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の神経毒素複合体における３つのヘマグルチニンサブコンポーネントＨＡ１、ＨＡ２、及び、ＨＡ３からなる群から選択される２又は３成分で構成される複合体である、〔２４〕から〔３２〕のいずれかに記載のキット。
〔３４〕　前記複合体のＨＡ３サブコンポーネントは、Ａ型又はＢ型のボツリヌス菌のものである、〔３３〕記載のキット。
〔３５〕　培養が、継代培養である、〔２４〕から〔３４〕のいずれかに記載のキット。
〔３６〕　〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の方法のための、〔２４〕から〔３５〕のいずれかに記載のキット。
〔３７〕　〔１〕から〔１１〕のいずれかに記載の方法における細胞間接着を阻害可能な物質の使用。
　以下、実施例により本開示をさらに詳細に説明するが、これらは例示的なものであって、本開示はこれら実施例に制限されるものではない。
　［ヘマグルチニン（ＨＡ）がｉＰＳ細胞に及ぼす影響（その１）］
　図５に示す実験スケジュールに従ってｉＰＳ細胞を培養した。まず、フィーダ細胞上にｉＰＳ細胞を播種し（day 0）、２４時間ごとに維持培地で培地交換した。３日後（day 3）においてＨＡを添加し２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄して維持培地で培地交換した（day 4）。その後、９日後（day 9）まで２４時間ごとに維持培地で培地交換した。培養後、培養された細胞のＯｃｔ３／４の発現を免疫細胞染色法で確認し、また、ＤＡＰＩ染色を行った。使用した細胞、培地、ＨＡ、及び培養条件は以下のとおりである。
　〔細胞〕
　ｉＰＳ細胞：Ｔｉｃ（Ｎｐ　３９）
　フィーダ細胞：ＳＮＬ　７６／７（Ｎｐ　５）マイトマイシン－ｃ処理済み
　〔培地〕
　ｉＰＳ細胞：Ｒｅｐｒｏ　Ｓｔｅｍ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）、５ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－２
　フィーダ細胞：ＤＭＥＭ（７％ＦＢＳ，１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
　〔容器〕
　２４ウェルプレート（底面積：１．９ｃｍ2／ウェル、培地量：０．４ｍＬ／ウェル）
　〔ＨＡ〕
　ＨＡ複合体試料として、下記表１に記載のボツリヌス菌の神経毒素複合体試料であるヘマグルチニンＨＡ－１～ＨＡ－４を使用した。なお、ＨＡ－１及びＨＡ－２は、ともに、ＨＡ１～３のサブコンポーネントが全てＢ型の複合体であり、別個に調製されたＨＡ複合体試料である。ＨＡ－３は、ＨＡ１がＣ型でＨＡ２及び３がＢ型のＨＡ複合体試料である。ＨＡ－４は、ＨＡ１及び２がＢ型でＨＡ３がＣ型のＨＡ複合体試料である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　〔ＨＡ調製・添加方法〕
　ＨＡの希釈：同じ希釈系列に含まれるＰＢＳ濃度を同じにするため、２段階希釈を行った。まず、ＰＢＳでＨＡを段階希釈し、さらに、培地（Ｒｅｐｒｏ　Ｓｔｅｍ）を用いて希釈した。（終濃度：１００，５０，１０，１ｎＭ）
　さらにｂＦＧＦ（終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を加え、ｉＰＳ細胞に添加した。
　〔培養条件〕
　３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
　ｉＰＳ細胞の継代後、ｔ＝７２ｈ（day 3）の培地交換において、ＨＡ－１～４を各濃度で添加し、２４時間培養した。その後、ｔ＝９６ｈ（day 4）の培地交換において、ＨＡ無添加の培地に切り替え、培養を継続した。
　〔観察〕
　ｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ５、及びｄａｙ９において、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で培養細胞を観察し画像を取得した。ＨＡ－１を１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、及び、１ｎＭで添加した場合の顕微鏡観察写真をそれぞれ図６、７、８、及び９に示す。
　図６に示すとおり、ＨＡ－１を１００ｎＭ添加した場合、ｄａｙ３の時点で発生していた脱未分化細胞は、ｄａｙ４以降観察できなかった。ｄａｙ４では、細胞間に隙間ができ、細胞がやや長く伸びた形態となった。ｄａｙ５以降、隙間が埋まり、細胞の形態が小さくなり、細胞同士が密集した敷石状の形態となり、コロニーの拡大が起こった。ｄａｙ９において、ｄａｙ５以降に発生した脱未分化細胞を含む領域が見られた。
　図７に示すとおり、ＨＡ－１を５０ｎＭ添加した場合、ｄａｙ３～５では１００ｎＭ添加した場合と同様であった。ただし、ｄａｙ９において脱未分化細胞は見られなかった。
　図８に示すとおり、ＨＡ－１を１０ｎＭ添加した場合、ｄａｙ４では、ｄａｙ３の時点で発生していた脱未分化細胞が減少しているように見えた。しかし、ｄａｙ５で再び脱未分化細胞の拡大が起こった。以降、脱未分化細胞の領域は、拡大した。
　図９に示すとおり、ＨＡ－１を１ｎＭ添加した場合、ｄａｙ３以降、ｄａｙ３の時点で発生していた脱未分化細胞の領域の拡大が続いた。細胞の形態変化や脱未分化細胞の減少は、見られなかった。
　ＨＡ－２を１００ｎＭ、５０ｎＭ、及び、１ｎＭで添加した場合の顕微鏡観察写真をそれぞれ図１０、１１及び１２に示す。図１０に示すとおり、ＨＡ－２を１００ｎＭ添加の場合は、ＨＡ－１を１００ｎＭ添加の場合（図６）と同様であった。図１１に示すとおり、ＨＡ－２を５０ｎＭ添加の場合は、ＨＡ－１を５０ｎＭ添加の場合（図７）と同様であった。図１２に示すとおり、ＨＡ－２を１ｎＭ添加の場合は、ＨＡ－１を１ｎＭ添加の場合（図９）と同様であった。
　ＨＡ－１及びＨＡ－２の結果を下記表２にまとめる。表２に示すとおり、ＨＡ－１及びＨＡ－２は、１００ｎＭ及び５０ｎＭ添加した場合、ｄａｙ３の時点で発生していた脱未分化細胞が縮小及び／又は消滅した。
　図１３に、継代時に持ち込んだ脱未分化細胞に対するＨＡ－２の影響を観察した結果を示す。同図に示すとおり、ＨＡ－２を１００ｎＭで添加して２４時間処理すると、脱未分化細胞が徐々に剥離した。
　ＨＡ－３を５０ｎＭ、及び１０ｎＭで添加した場合の顕微鏡観察写真をそれぞれ図１４、及び１５に示す。
　図１４に示すとおり、ＨＡ－３を５０ｎＭ添加した場合、ｄａｙ３の時点で発生していた脱未分化細胞領域の拡大が止まり、ｄａｙ４以降、脱未分化細胞の増殖とともに脱未分化細胞領域は縮小していった。ｄａｙ９において、コロニーの中心の一部に脱未分化細胞が残った。ｄａｙ４において、ｉＰＳ細胞間に隙間ができ、ｉＰＳ細胞の形がやや長く伸びた形態となった。ｄａｙ５以降、ｉＰＳ細胞の増殖に伴い、細胞同士が密集した敷石状の形態のｉＰＳ細胞で構成されたコロニーとなった。一方で、フィーダ細胞の剥離が起こった。なお、ＨＡ－３を１００ｎＭ添加した場合も、ＨＡ－３を５０ｎＭ添加した場合と同様な結果がえられた。
　図１５に示すとおり、ＨＡ－３を１０ｎＭ添加した場合、ｄａｙ３以降、脱未分化細胞の領域の拡大が続いた。細胞の形態変化、脱未分化細胞の減少、及び、フィーダ細胞の剥離は観察できなかった。
　ＨＡ－４を１００ｎＭ、５０ｎＭ、及び、１０ｎＭで添加した場合の顕微鏡観察写真を図１６に示す。同図に示すとおり、ｄａｙ３の時点で発生していた脱未分化細胞の領域の拡大が続いた。しかし、ＨＡ－４が１００ｎＭの場合、脱未分化細胞領域の縮小が起きているかもしれない。
　ＨＡ－３及びＨＡ－４の結果を下記表２にまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　前記表２に示すとおり、ＨＡ－１及びＨＡ－２の場合、ＨＡ－３及び４の場合よりも効率よく脱未分化細胞の領域が縮小及び又は消滅した。また、ＨＡ－３の場合、ＨＡ－４の場合よりも効率よく脱未分化細胞の領域が縮小及び又は拡大抑制された。
　［フィーダ細胞がｉＰＳ細胞に及ぼす影響］
　フィーダ細胞上にｉＰＳ細胞を播種し、７日後まで２４時間ごとに維持培地で培地交換した。培養後、培養された細胞のＯｃｔ３／４の発現を免疫細胞染色法で確認し、また、ＤＡＰＩ染色を行った。使用した細胞、培地、及び培養条件は以下のとおりである。
　〔細胞〕
　ｉＰＳ細胞：Ｔｉｃ（Ｎｐ　３９）
　フィーダ細胞：ＭＥＦ
　〔培地〕
　ｉＰＳ細胞：Ｒｅｐｒｏ　Ｓｔｅｍ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）、５ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－２
　フィーダ細胞：ＤＭＥＭ（７％ＦＢＳ，１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
　〔容器〕
　２４ウェルプレート（底面積：１．９ｃｍ2／ウェル、培地量：０．４ｍＬ／ウェル）
　〔培養条件〕
　３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
　〔観察〕
　ｄａｙ３、及びｄａｙ７において、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で培養細胞を観察し画像を取得した。得られた顕微鏡観察写真を図１７に示す。
　図１７に示すように、未分化逸脱細胞はコロニーの外縁部（外側）に発生した。
　つぎに、培養開始から３日後（ｄａｙ３）に、遊走阻害剤であるＲａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（商品名：ＮＳＣ２３７６６、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製）を５０、１００又は１５０μＭ添加した以外は、上記と同様にして細胞培養及び観察を行った。得られた顕微鏡観察写真を図１７に示す。
　〔Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ調製・添加方法〕
　Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ希釈：培地（Ｒｅｐｒｏ　Ｓｔｅｍ）を用いて希釈した(終濃度：５０又は１００μＭ)。
　さらにｂＦＧＦ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製、終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を加え、ｉＰＳ細胞に添加した。
　図１７に示すように、Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ未添加の場合にはコロニー外縁部に発生した未分化逸脱細胞が、遊走阻害剤であるＲａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加することによってコロニー中央部に発生した。細胞遊走を阻害することによって未分化逸脱細胞をコロニー中央部に発生させることができた。よって、細胞の遊走を阻害することによって未分化逸脱細胞をコロニー中央部に発生させることができ、これにより未分化逸脱細胞を除去できることが示唆された。
　フィーダ細胞としてＳＮＬフィーダ細胞を用い、Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（５０又は１００μＭ）を培養開始から３日後（ｄａｙ３）に添加して培養を行ったところ、Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ未添加の場合と同様に、未分化逸脱細胞はコロニー中央部に発生した（date not shown）。
　［ヘマグルチニン（ＨＡ）がｉＰＳ細胞に及ぼす影響（その２）］
　Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒによって誘導された未分化逸脱細胞に及ぼすＨＡの影響を確認した。まず、フィーダ細胞上にｉＰＳ細胞を播種し（day 0）、２４時間ごとに維持培地で培地交換した。３日後（day 3）において１００μＭ　Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加し２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄して維持培地で培地交換した（day 4）。５日後（day 5）においてＨＡ－１を添加し２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄して維持培地で培地交換した（day 6）。その後、８日後（day 8）まで２４時間ごとに維持培地で培地交換した。培養後、培養された細胞のＯｃｔ３／４の発現を免疫細胞染色法で確認し、また、ＤＡＰＩ染色を行った。使用した細胞、培地、及び培養条件は以下のとおりである。Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ及びＨＡの調製及び添加方法は上述の通りとした。
　〔細胞〕
　ｉＰＳ細胞：Ｔｉｃ（Ｎｐ　３９）
　フィーダ細胞：ＭＥＦ
　〔培地〕
　ｉＰＳ細胞：Ｒｅｐｒｏ　Ｓｔｅｍ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）、５ｎｇ／ｍＬ　ｂＦＧＦ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）
　フィーダ細胞：ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯ社製），１％ＨＥＰＥＳ（ｓｉｇｍａ社製）、１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＮＡＣＡＬＡＩ　ＴＥＳＱＵＥ社製））
　〔容器〕
　２４ウェルプレート（底面積：１．９ｃｍ2／ウェル、培地量：０．４ｍＬ／ウェル）
　〔観察〕
　ｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ５、ｄａｙ６、及びｄａｙ８において、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で培養細胞を観察し画像を取得した。得られた顕微鏡観察写真を図１８に示す。
　ｃｏｎｔｒｏｌとして、ＨＡ－１の添加を行わなかった以外は、上記と同様の培養及び観察を行った。得られた顕微鏡観察写真を図１８に示す。
　図１８に示すとおり、Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒの添加によりコロニー中心部に発生していた未分化逸脱細胞を含む領域が、ＨＡの添加により、縮小及び／又は消滅したことが確認された。
　［フィーダレス培養がｉＰＳ細胞に及ぼす影響］
　培養面としてＳｙｎｔｈｅｍａｘ　Ｓｕｒｆａｃｅ（商品名、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）を使用し、その上にｉＰＳ細胞を播種し、７日後まで２４時間ごとに維持培地で培地交換した。培養後、培養された細胞のＯｃｔ３／４の発現を免疫細胞染色法で確認し、また、ＤＡＰＩ染色を行った。使用した細胞、培地、及び培養条件は以下のとおりである。
　〔細胞〕
　ｉＰＳ細胞：Ｔｉｃ（Ｎｐ　３９）
　〔培地〕
　ｍＴｅＳＲ(R)１ｍｅｄｉｕｍ（商品名、ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
　〔容器〕
　２４ウェルプレート（底面積：１．９ｃｍ2／ウェル、培地量：０．４ｍＬ／ウェル）
　〔培養条件〕
　３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
　〔観察〕
　ｄａｙ６において、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で培養細胞を観察し画像を取得した。
　フィーダレス培養の場合もＭＥＦフィーダ細胞と同様に、未分化逸脱細胞はコロニーの外縁部（外側）に発生した。
　つぎに、培養開始から３日後（ｄａｙ３）に、Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを１００又は１５０μＭ添加した以外は、上記と同様にして細胞培養及び観察を行った。得られた顕微鏡観察写真を図１９に示す。図１９は、Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒが１５０μＭの場合の顕微鏡観察写真である。図１９に示すように、Ｒａｃ－１　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒを添加することによって、未分化逸脱細胞はコロニー中央部に発生させることができた。これにより、フィーダレス培養の場合も、細胞遊走を阻害することによって未分化逸脱細胞をコロニー中央部に発生させることができ、これにより未分化逸脱細胞を除去できることが示唆された。
　［ヘマグルチニン（ＨＡ）がｉＰＳ細胞に及ぼす影響（その３）］
　細胞として以下の細胞１又は２を使用し、ＨＡとしてＨＡ－１を使用し、ＨＡの添加濃度を５０ｎＭとした以外は、ヘマグルチニン（ＨＡ）がｉＰＳ細胞に及ぼす影響（その１）と同じ条件で、培養及び観察を行った。得られた顕微鏡観察写真をそれぞれ図２０に示す。
〔細胞１〕
　〔細胞〕
　ｉＰＳ細胞：２０１Ｂ７株
　フィーダ細胞：ＳＮＬ７６／７細胞
　〔培地〕
　ｉＰＳ細胞：Ｒｅｐｒｏ　Ｓｔｅｍ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）
　フィーダ細胞：ＤＭＥＭ（７％ＦＢＳ，１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
〔細胞２〕
　〔細胞〕
　ｉＰＳ細胞：４５４Ｅ－２株
　フィーダ細胞：ＳＮＬ７６／７細胞
　〔培地〕
　ｉＰＳ細胞：Ｒｅｐｒｏ　Ｓｔｅｍ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）
　フィーダ細胞：ＤＭＥＭ（７％ＦＢＳ，１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
　図２０に示すとおり、未分化逸脱細胞を含むコロニーは、ＨＡを添加すると、脱未分化細胞の領域が縮小及び又は消滅した。
　［ヘマグルチニン（ＨＡ）が継代に及ぼす影響］
　図２１に示す実験スケジュールに従ってｉＰＳ細胞を継代培養した。まず、フィーダ細胞上にｉＰＳ細胞を播種し（day 0）、２４時間ごとに維持培地で培地交換した。３日後（day 3）においてＨＡを５０ｎＭ添加し２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄して維持培地で培地交換した（day 4）。その後、１０日後（day 10）まで２４時間ごとに維持培地で培地交換した。培養後、通常の操作で継代を行い、継代から３日後（day 13）においてＨＡを５０ｎＭ添加し２４時間インキュベートし、ＰＢＳで２度洗浄して維持培地で培地交換した（day 14）。その後、１０日間の培養、継代、ＨＡの添加及び培養（１０日間）を行った。培養された細胞のＯｃｔ３／４の発現を免疫細胞染色法で確認し、また、ＤＡＰＩ染色を行った。使用した細胞、培地、及び培養条件は以下のとおりである。ＨＡとしては、ＨＡ－１を使用した。
　〔細胞〕
　ｉＰＳ細胞：Ｔｉｃ（Ｎｐ　３９）
　フィーダ細胞：ＳＮＬ　７６／７（Ｎｐ　５）マイトマイシン－ｃ処理済み
　〔培地〕
　ｉＰＳ細胞：Ｒｅｐｒｏ　Ｓｔｅｍ（商品名、ＲｅｐｒｏＣＥＬＬ社製）、５ｎｇ／ｍＬ　ＦＧＦ－２
　フィーダ細胞：ＤＭＥＭ（７％ＦＢＳ，１％Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ）
　〔容器〕
　２４ウェルプレート（底面積：１．９ｃｍ2／ウェル、培地量：０．４ｍＬ／ウェル）
　〔ＨＡ調製・添加方法〕
　ＨＡの希釈：同じ希釈系列に含まれるＰＢＳ濃度を同じにするため、２段階希釈を行った。まず、ＰＢＳでＨＡを段階希釈し、さらに、培地（Ｒｅｐｒｏ　Ｓｔｅｍ）を用いて希釈した。（終濃度：５０ｎＭ）
　さらにｂＦＧＦ（終濃度５ｎｇ／ｍｌ）を加え、ｉＰＳ細胞に添加した。
　〔培養条件〕
　３７℃、５％ＣＯ2雰囲気下
　ｉＰＳ細胞の継代後、ｔ＝７２ｈ（day 3）の培地交換において、ＨＡを各濃度で添加し、２４時間培養した。その後、ｔ＝９６ｈ（day 4）の培地交換において、ＨＡ無添加の培地に切り替え、培養を継続した。
　〔観察〕
　ｄａｙ３、ｄａｙ４、ｄａｙ１０、ｄａｙ１３、ｄａｙ１４、ｄａｙ２０、ｄａｙ２３、ｄａｙ２４及びｄａｙ３０において、ＩＮ　Ｃｅｌｌ　Ａｎａｌｙｚｅｒ　２０００（商品名、ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）で培養細胞を観察し画像を取得した。また、形成されたコロニー及び未分化コロニー（未分化細胞で形成され、未分化逸脱細胞を含まないコロニー）の数を計測し、未分化コロニーの割合を算出した。その結果を図２２に示す。
　比較例として、ＨＡを添加しない以外は、同じ条件で継代培養を行った。その結果を図２２に示す。
　図２２において、白丸がＨＡを添加した系、黒丸がＨＡを添加しなかった系を示す。図２２に示すように、ＨＡを添加することによって、ＨＡを添加しなかった場合と比較して継代培養後に形成される未分化コロニーの割合が増加した。つまり、未分化逸脱細胞を除去することにより、未分化コロニーを効率よく形成することができた。

Claims (14)

  1. 　多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
  2. 　多能性（pluripotency）を有する幹細胞の培養中に発生した又は発生しうる未分化状態を脱した細胞を除去する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
  3. 　多能性（pluripotency）を有する幹細胞の未分化状態を維持する方法であって、細胞間接着を阻害可能な物質の存在下で細胞培養することを含む、方法。
  4. 　多能性を有する幹細胞が、ヒト多能性（pluripotent）幹細胞である、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
  5. 　ヒト多能性幹細胞が、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞である、請求項４記載の方法。
  6. 　細胞間接着を阻害可能な物質が、Ｅ－カドヘリンの機能阻害活性を有する物質である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 　細胞間接着を阻害可能な物質が、さらに、細胞表面への結合能を有する物質である、請求項６記載の方法。
  8. 　細胞間接着を阻害可能な物質が、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）の神経毒素複合体におけるヘマグルチニン（ＨＡ）である、請求項１から７のいずれかに記載の方法。
  9. 　細胞間接着を阻害可能な物質が、ボツリヌス菌の神経毒素複合体における３つのヘマグルチニンサブコンポーネントＨＡ１、ＨＡ２、及び、ＨＡ３からなる群から選択される２又は３成分で構成される複合体である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
  10. 　前記複合体のＨＡ３サブコンポーネントは、Ａ型又はＢ型のボツリヌス菌のものである、請求項９記載の方法。
  11. 　培養が、継代培養である、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　細胞間接着を阻害可能な物質を含む、請求項１から１１のいずれかに記載の方法のための、組成物。
  13. 　多能性を有する幹細胞用の培地成分と、細胞間接着を阻害可能な物質とを含む、キット。
  14. 　請求項１から１１のいずれかに記載の方法のための、請求項１３記載のキット。
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