CN105051185A - 具有多能性(pluripotency)的干细胞的培养方法 - Google Patents
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Abstract
提供一种可以除去在具有多能性的干细胞的培养中的集落中产生的脱离未分化状态的细胞的方法。在一实施方式中涉及一种具有多能性的干细胞的培养方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。在其它实施方式中涉及一种除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可产生的脱离未分化状态的细胞的方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。在其它实施方式中涉及一种维持具有多能性的干细胞的未分化状态的方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。
Description
技术领域
本公开涉及一种具有多能性的干细胞的培养方法、除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可产生的脱离未分化状态的细胞的方法、维持具有多能性的干细胞的未分化状态的方法、这些方法中使用的组合物、及这些方法中使用的试剂盒。
背景技术
在大量培养人iPS细胞等多能性干细胞时,通过一系列的扩增培养(继代培养)的重复制备许多未分化的细胞。已知有在该一系列的培养中,从未分化状态脱离的细胞“脱未分化细胞”偶发地产生。
已知有该脱未分化细胞具有与未分化细胞大致同等分裂能力,且诱发从未分化细胞向脱未分化细胞的转换。即,脱未分化细胞产生时,其增殖速度超过未分化细胞的增殖速度,未分化细胞的增殖得到抑制。
脱未分化细胞的产生在不熟练的培养操作者的培养中较多地观察到。另外,已知有集落尺寸的过大或集落彼此的合并成为产生的一个原因。因此,通过低汇合下的继代、维持播种时的均匀性,可以某种程度上降低脱未分化细胞的产生频率。另外,利用近年来所开发的培养基,也某种程度上抑制脱未分化细胞的产生频率。但是,尽管如此,脱未分化细胞偶发地产生,在产生的情况下,除去含有脱未分化细胞的集落还是必须的。
为了维持未分化状态,含有脱未分化细胞的集落在继代时通过显微镜下的吸量管操作而慎重地被除去。模仿有这种集落除去的方法的装置、例如组合有利用观察装置和机器人操作的吸量管的装置也被开发。
另外,在专利文献1中,公开有:为了一边维持iPS细胞等多能性干细胞的未分化一边增殖,在活化素存在下将多能性干进行细胞培养。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特开2012-143229号公报
发明内容
发明所要解决的课题
如上所述,在人iPS细胞等多能性干细胞的继代培养中,容易引起脱未分化现象,未分化维持困难,在数次的继代后,许多iPS细胞集落引起脱未分化现象,可以成为含有脱离未分化状态的细胞的劣化集落。因此,慎重的培养及慎重的集落的挑选这样的繁琐的操作不可缺少。从促进干细胞产业的方面考虑点,也期望繁琐的操作少、即使没有熟练者也可以的、多能性干细胞的未分化维持方法。
本公开在一实施方式中,提供一种可以除去在具有多能性(“pluripotency”、以下同样)的干细胞的培养中的集落中产生的“脱离未分化状态的细胞”的方法。
用于解决课题的手段
本公开在一实施方式中涉及一种具有多能性的干细胞的培养方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。本公开在其它实施方式中涉及一种除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可产生的脱离未分化状态的细胞的方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。本公开在其它实施方式中涉及一种维持具有多能性的干细胞的未分化状态的方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。本公开在其它实施方式中涉及一种用于在本公开中所述的上述的方法中使用的、含有可阻碍细胞间粘接的物质的组合物。本公开在其它实施方式中涉及一种含有具有多能性的干细胞用的培养基成分和可阻碍细胞间粘接的物质的试剂盒。
发明效果
根据本公开,在一实施方式中,能够起到可以除去在具有多能性的干细胞的培养中的集落产生的“脱离未分化状态的细胞”的效果。
附图说明
图1是说明本公开的一实施方式中的、在具有多能性的干细胞的培养中的集落产生的“脱离未分化状态的细胞”通过可阻碍细胞间粘接的物质的添加而被除去的情形的图。
图2是说明本公开的一实施方式中的、在具有多能性的干细胞的培养中的集落产生的“脱离未分化状态的细胞”通过可阻碍细胞间粘接的物质的添加而被除去的情形的图。
图3是说明本公开的一实施方式中的、在具有多能性的干细胞的培养中的集落产生的“脱离未分化状态的细胞”通过可阻碍细胞间粘接的物质的添加而被除去的情形的图。
图4是说明本公开的一实施方式中的、在具有多能性的干细胞的培养中的集落上产生的“脱离未分化状态的细胞”通过可阻碍细胞间粘接的物质的添加而被除去的情形的图。
图5是说明实施例中进行的实验的程序表的图。
图6为将终浓度100nM的HA-1添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图7为将终浓度50nM的HA-1添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图8为将终浓度10nM的HA-1添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图9为将终浓度1nM的HA-1添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图10为将终浓度100nM的HA-2添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图11为将终浓度50nM的HA-2添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图12为将终浓度1nM的HA-2添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图13为将终浓度100nM的HA-2添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图14为将终浓度50nM的HA-3添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图15为将终浓度10nM的HA-3添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图16为将终浓度100、50、及10nM的HA-4添加于day3时的显微镜观察照片的一例。
图17为使用有MEF饲养细胞的具有多能性的干细胞的培养时的显微镜观察照片的一例。
图18为将Rac-1inhibitor添加于day3之后、将终浓度50nM的HA-1添加于day5时的显微镜观察照片的一例。
图19为具有多能性的干细胞的无饲养层培养时的显微镜观察照片的一例。
图20为使用有201B7株或454E-2株时的显微镜观察照片的一例で。
图21为说明实施例中进行的实验的程序表的图。
图22为表示继代培养时的未分化集落的比例的坐标图。
具体实施方式
本公开在一实施方式中,基于如下见解:将具有多能性的干细胞在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行培养时,可以除去在培养中的集落内已产生和/或将产生的脱离未分化状态的细胞。另外,本公开在一实施方式中,基于如下见解:在培养细胞中混合未分化细胞和脱离未分化状态的细胞的情况下,可阻碍细胞间粘接的物质可以将脱离未分化状态的细胞选择性地除去。
对本公开中的通过可阻碍细胞间粘接的物质的添加而除去在具有多能性的干细胞的培养中的集落产生的“脱离未分化状态的细胞”的没有限定的一个或多个实施方式基于图1进行说明。图1A表示在板上培养的未分化状态的细胞集落的中央部产生脱离未分化状态的细胞的状态。在该状态下在培养液中添加“可阻碍细胞间粘接的物质”时,开始除去脱离未分化状态的细胞(图1B),不久,脱离未分化的细胞从集落中央部消失(图1C)。其后,通过继续培养而未分化状态的细胞增殖,形成未分化状态的集落(图1D)。如同图所示,根据本公开,在没有限定的一个或多个实施方式中,可以将“脱离未分化状态的细胞”“如用橡皮擦擦掉那样”除掉。
在图1的实施方式中,脱离未分化状态的细胞被除去的机制如下地推定,但本公开可以不限定于这些机制而被解释。首先,可以认为,脱离未分化状态的细胞与未分化状态的细胞相比、细胞间粘接及对立足点的粘接弱、在细胞间容易形成间隙(图2A)。可以认为,通过在该细胞间的间隙中进入可阻碍细胞间粘接的物质,脱离未分化状态的细胞的细胞间粘接进一步消弱,产生形态变化,抑制细胞增殖(图2B)。另外,此时,可以认为,与培养面的立足点的细胞粘接变弱的脱离未分化状态的细胞浮游,通过细胞凋亡而被除掉(图2B)。随着周围的未分化状态的细胞增殖,脱离未分化状态的细胞被挤入中央部分(图2C),最终通过细胞凋亡而被排除(图2D)。
对本公开中的通过可阻碍细胞间粘接的物质的添加而除去在具有多能性的干细胞的培养中的集落产生的“脱离未分化状态的细胞”的没有限定的一个或多个实施方式基于图3进行说明。图3A表示在板上所培养的未分化状态的细胞集落。在该状态下在培养液中添加“可阻碍细胞间粘接的物质”时,即使在该集落中产生脱离未分化状态的细胞(图3B),也抑制脱离未分化状态的细胞的增殖,不久被除去(图3C)。其后,通过继续培养而继续形成未分化状态的集落(图3D)。
在图3的实施方式中,脱离未分化状态的细胞被除去的机制如下地推定,但本公开可以不限定于这些机制而被解释。可以认为,最初为未分化状态的细胞的集落,相互的细胞间粘接强(图4A)。在该集落中偶发地产生脱离未分化状态的细胞(图4B)。可以认为,脱离未分化状态的细胞与未分化状态的细胞相比,细胞间粘接弱,在细胞间容易形成间隙。可以认为,通过在该细胞间的间隙中进入可阻碍细胞间粘接的物质,进一步消弱脱离未分化状态的细胞的细胞间粘接,产生形态变化,抑制细胞增殖。另外,此时,可以认为,与培养面的细胞粘接消失的脱离未分化状态的细胞,在继续增殖的周围的未分化状态的细胞中被挤出,通过细胞凋亡而被除掉(图4C)。
因此,本公开在一实施方式中涉及一种具有多能性的干细胞的培养方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养(以下,也称为“本公开中所述的培养方法”。)。根据本公开中所述的培养方法,在一实施方式中,能够起到可以除去在具有多能性的干细胞的培养中的集落产生的“脱离未分化状态的细胞”的效果。
因此,本公开在其它实施方式中涉及一种除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可产生的脱离未分化状态的细胞的方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养(以下,也称为“本公开中所述的除去方法”。)。根据本公开中所述的培养方法、和/或本公开中所述的除去方法,在一实施方式中,可以从产生脱离未分化状态的细胞并劣化了的未分化状态的细胞的集落中除去脱离未分化状态的细胞,制成未分化状态的细胞的集落或由未分化状态的细胞构成的集落。
因此,本公开在其它实施方式中涉及一种从产生脱离未分化状态的细胞并劣化的集落出发,形成由未分化状态的细胞构成的集落的方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下将所述劣化的集落进行培养(以下,也称为“本公开中所述的集落形成方法”。)。
另外,根据本公开中所述的培养方法、和/或本公开中所述的除去方法,在一实施方式中,可以培养未分化状态细胞或仅培养未分化状态细胞。因此,本公开在其它实施方式中涉及一种维持具有多能性的干细胞的未分化状态的方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养(以下,也称为“本公开中所述的维持方法”。)。
[具有多能性的干细胞]
在本公开中,具有多能性的干细胞在没有限定的一个或多个实施方式中为人多能性(pluripotent)干细胞。在本公开中,人多能性干细胞在没有限定的一个或多个实施方式中为人iPS细胞或人ES细胞。
[脱离未分化状态的细胞]
在本公开中,就脱离未分化状态的细胞而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,细胞的形态与未分化状态的细胞的形态不同,可以判别。在本公开中,“脱离未分化状态的细胞”有时也称为“脱未分化细胞”或“未分化脱离细胞”。在没有限定的一个或多个实施方式中,成为脱未分化细胞,可以通过未分化标记的消失来确认。所述未分化标记在没有限定的一个或多个实施方式中为Oct3/4、Nanog、SSEA-4、TRA-1-60。
[可阻碍细胞间粘接的物质]
在本公开中,可阻碍细胞间粘接的物质在没有限定的一个或多个实施方式中为具有E-钙粘蛋白(E-cadherin)的功能阻碍活性的物质。在本公开中,就可阻碍细胞间粘接的物质而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,从有效地除去脱未分化细胞的观点出发,除E-钙粘蛋白的功能阻碍活性之外,优选具有对细胞表面的结合能力。对所述细胞表面的结合能力在没有限定的一个或多个实施方式中为对具有多能性的干细胞的细胞表面的结合能力。
[HA]
在本公开中,可阻碍细胞间粘接的物质在没有限定的一个或多个实施方式中为肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的血凝素(HA)。在本公开中,就可阻碍细胞间粘接的物质而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,从有效地除去脱未分化细胞的观点出发,包含由选自由肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的3个血凝素亚组分HA1(HA33)、HA2(HA17)、及HA3(HA70)组成的组中的2种或3种成分构成的复合体或其复合体。另外,就可阻碍细胞间粘接的物质而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,从有效地除去脱未分化细胞的观点出发,包含由HA2(HA17)及HA3(HA70)构成的复合体或由3种成分构成的复合体或其复合体。就所述亚组分HA3(HA70)而言,在一个或多个实施方式中,从表达E-钙粘蛋白的功能阻碍活性的观点、及有效地除去脱未分化细胞的观点出发,优选为A型或B型的肉毒杆菌的成分。另外,亚组分HA1(HA33)及HA2(HA17)在没有限定的一个或多个实施方式中可以为A型、B型及C型的任一种肉毒杆菌的成分。就HA而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,各亚组分可以分别为重组体,也可以为天然型。
[可阻碍细胞间粘接的物质的存在下的细胞培养]
在本公开中,“可阻碍细胞间粘接的物质的存在下的细胞培养”可以采用目前所使用的和/或今后被开发的、具有多能性的干细胞的培养条件及培养培养基等,通过在该培养条件的培养基中使可阻碍细胞间粘接的物质存在而进行。在没有限定的一个或多个实施方式中,可以将可阻碍细胞间粘接的物质添加于培养中的培养培养基,或者可以使用预先添加有可阻碍细胞间粘接的物质的培养基进行培养。培养培养基、培养板等可以使用市售的培养培养基、培养板。
“可阻碍细胞间粘接的物质”可以在确认脱未分化细胞后添加于培养基,也可以在不产生脱未分化细胞的阶段添加于培养基。
存在于培养基的“可阻碍细胞间粘接的物质”的浓度在没有限定的一个或多个实施方式中为可以除去脱未分化细胞的实质的有效浓度,只要是本领域技术人员,就可以设定。就存在于培养基的“可阻碍细胞间粘接的物质”的浓度而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,从有效地除去脱未分化细胞的观点出发,可列举5nM以上、10nM以上、或15nM以上。从同样的观点出发,为200nM以下、150nM以下、或100nM以下。
作为使“可阻碍细胞间粘接的物质”存在于培养基的没有限定的一个或多个实施方式,既可以将以下的培养基交换作为分割点进行单次的给药,也可以为连续的给药,还可以为间断的给药。
在本公开中,细胞培养在没有限定的一个或多个实施方式中包含继代培养。根据本公开中所述的培养方法、和/或本公开中所述的除去方法,在一实施方式中,起到可以提高继代培养后形成的集落中的未分化集落(由未分化细胞形成,实质上不含有未分化脱离细胞的集落)的比例的效果。继代在没有限定的一个或多个实施方式中可以通过现有公知及今后被开发的技术来进行。
在本公开中,细胞培养在没有限定的一个或多个实施方式中既可以为使用有饲养细胞的培养,也可以为无饲养层培养。饲养细胞在没有限定的一个或多个实施方式中,可列举MEF(MouseEmbryoFibroblast)细胞、SL10、及SNL76/7饲养细胞等。饲养细胞在没有限定的一个或多个实施方式中,在饲养细胞中,优选具有多能性的干细胞的游走速度比较缓慢的饲养细胞。就饲养细胞而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,从具有多能性的干细胞的游走比较缓慢、在具有多能性的干细胞的培养中的集落中可以使未分化脱离细胞在集落中央部产生的方面考虑,优选SNL76/7饲养细胞。
就细胞培养而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,从可以有效地除去未分化脱离细胞的方面考虑,优选可以在具有多能性的干细胞的培养中的集落中央部使未分化脱离细胞产生的条件下进行。在没有限定的一个或多个实施方式中,通过阻碍和/或抑制具有多能性的干细胞的游走,可以在集落中央部使未分化脱离细胞有效地产生。
在其它的一实施方式中,本公开涉及一种具有多能性的干细胞的培养方法,其包括在可阻碍游走的物质的存在下进行细胞培养,及在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。根据本实施方式中所述的培养方法,在一实施方式中,可以在具有多能性的干细胞的培养中的集落中方使未分化脱离细胞在集落中央部产生,因此,能够起到可以有效地除去未分化脱离细胞的效果。
在其它实施方式中,本公开涉及一种除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可产生的未分化脱离细胞的方法,其包括在可阻碍游走的物质的存在下进行细胞培养,以及在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。根据本实施方式中所述的培养方法、和/或本实施方式中所述的除去方法,在一实施方式中,可以从产生未分化脱离细胞并且劣化的未分化状态的细胞的集落中除去未分化脱离细胞,制成未分化状态的细胞的集落或由未分化状态的细胞构成的集落。
在其它实施方式中,本公开涉及一种从产生未分化脱离细胞并劣化的集落出发,形成由未分化状态的细胞构成的集落的方法,其包括在可阻碍游走的物质的存在下进行细胞培养,以及在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下将所述劣化的集落进行培养。
在本公开中,可阻碍游走的物质在没有限定的一个或多个实施方式中可列举抑制/阻碍与具有多能性的干细胞的游走相关的物质的活性的物质等。在本公开中,就可阻碍游走的物质而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,可列举游走抑制剂。就可阻碍游走的物质而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,可列举Rac-1抑制剂等。就存在于培养基的“可阻碍游走的物质”的浓度而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,从使未分化脱离细胞有效地移动至集落中央部、有效地除去未分化脱离细胞的观点出发,为50μM以上、100μM以上、或150μM以上,从同样的观点出发,为200μM以下。
就可阻碍游走的物质而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,既可以在培养开始时添加于培养基,也可以在培养基交换时添加。就可阻碍游走的物质而言,在没有限定的一个或多个实施方式中,既可以在不产生未分化脱离细胞的阶段添加于培养基,也可以在确认未分化脱离细胞后添加于培养基。
根据本公开中所述的培养方法、和/或本公开中所述的除去方法,通过在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养,在一实施方式中,可以一边维持封闭空间,一边自动地从集落中除去未分化脱离细胞。另外,在一实施方式中,即使在不使用人为的操作和/或确认、或机器人等特殊的装置等的情况下,也可以自动地从集落中除去未分化脱离细胞。另外,根据本公开中所述的培养方法、和/或本公开中所述的除去方法,在一实施方式中,进一步可以将所形成的集落自动地制成未分化状态的细胞的集落或由未分化状态的细胞构成的集落。
因此,通过使用本公开中所述的培养方法、和/或本公开中所述的除去方法,可以在自动培养装置中有效地得到未分化状态的细胞的集落或由未分化状态的细胞构成的集落,可以进一步简单且有效地大量生产未分化状态的细胞。
在其它实施方式中,本公开涉及一种含有可阻碍细胞间粘接的物质的组合物(以下,也称为“本公开中所述的组合物”。)。本公开中所述的组合物中的“可阻碍细胞间粘接的物质”如上所述。本公开中所述的组合物可用于本公开中所述的培养方法、本公开中所述的除去方法、本公开中所述的集落形成方法、和/或本公开中所述的维持方法。因此,在其它实施方式中,本公开涉及一种本公开中所述的培养方法、本公开中所述的除去方法、本公开中所述的集落形成方法、和/或本公开中所述的维持方法中的所述“可阻碍细胞间粘接的物质”的使用。
在其它实施方式中,本公开涉及一种含有具有多能性的干细胞用的培养基成分和可阻碍细胞间粘接的物质的试剂盒(以下,也称为“本公开中所述的试剂盒”。)。本公开中所述的试剂盒中的“可阻碍细胞间粘接的物质”如上所述。本公开中所述的试剂盒可用于本公开中所述的培养方法、本公开中所述的除去方法、本公开中所述的集落形成方法、和/或本公开中所述的维持方法。具有多能性的干细胞用的培养基成分没有特别限定,可以使用目前所使用的或今后被开发的物质。
本公开进一步涉及以下的没有限定的一个或多个实施方式。
[1]一种具有多能性的干细胞的培养方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。
[2]一种除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可产生的脱离未分化状态的细胞的方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。
[3]一种维持具有多能性的干细胞的未分化状态的方法,其包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。
[4]如[1]~[3]中任一项所述的方法,其中,具有多能性的干细胞为人多能性干细胞。
[5]如[4]所述的方法,其中,人多能性干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。
[6]如[1]~[5]中任一项所述的方法,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为具有E-钙粘蛋白的功能阻碍活性的物质。
[7]如[6]所述的方法,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为进一步具有对细胞表面的结合能力的物质。
[8]如[1]~[7]中任一项所述的方法,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的血凝素(HA)。
[9]如[1]~[8]中任一项所述的方法,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为由选自由肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的3个血凝素亚组分HA1、HA2、及HA3组成的组中的2种或3种成分构成的复合体。
[10]如[9]所述的方法,其中,所述复合体的HA3亚组分为A型或B型的肉毒杆菌的成分。
[11]如[1]~[10]中任一项所述的方法,其中,培养为继代培养。
[12]一种用于具有多能性的干细胞的培养的组合物,其含有可阻碍细胞间粘接的物质。
[13]一种用于除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可产生的脱离未分化状态的细胞的组合物,其含有可阻碍细胞间粘接的物质。
[14]一种用于维持具有多能性的干细胞的未分化状态的组合物,其含有可阻碍细胞间粘接的物质。
[15]如[12]~[14]中任一项所述的组合物,其中,具有多能性的干细胞为人多能性干细胞。
[16]如[15]所述的组合物,其中,人多能性干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。
[17]如[12]~[16]中任一项所述的组合物,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为具有E-钙粘蛋白的功能阻碍活性的物质。
[18]如[17]所述的组合物,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为进一步具有对细胞表面的结合能力的物质。
[19]如[12]~[18]中任一项所述的组合物,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的血凝素。
[20]如[12]~[19]中任一项所述的组合物,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为由选自由肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的3个血凝素亚组分HA1、HA2、及HA3组成的组中的2种或3种成分构成的复合体。
[21]如[20]所述的组合物,其中,所述复合体的HA3亚组分为A型或B型的肉毒杆菌的成分。
[22]如[12]~[21]中任一项所述的组合物,其中,培养为继代培养。
[23]一种用于[1]~[11]中任一项所述的方法的如[12]~[22]中任一项所述的组合物。
[24]一种试剂盒,其包含具有多能性的干细胞用的培养基成分和可阻碍细胞间粘接的物质。
[25]如[24]所述的试剂盒,其用于除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可产生的脱离未分化状态的细胞。
[26]如[24]所述的试剂盒,其用于具有多能性的干细胞的培养。
[27]如[24]所述的试剂盒,其用于除去在具有多能性的干细胞的培养中产生的或可产生的脱离未分化状态的细胞,其含有可阻碍细胞间粘接的物质。
[28]如[24]~[27]中任一项所述的试剂盒,其中,具有多能性的干细胞为人多能性干细胞。
[29]如[28]所述的试剂盒,其中,人多能性干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。
[30]如[24]~[29]中任一项所述的试剂盒,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为具有E-钙粘蛋白的功能阻碍活性的物质。
[31]如[30]所述的试剂盒,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为进一步具有对细胞表面的结合能力的物质。
[32]如[24]~[31]中任一项所述的试剂盒,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的血凝素。
[33]如[24]~[32]中任一项所述的试剂盒,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为由选自由肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的3个血凝素亚组分HA1、HA2、及HA3组成的组中的2种或3种成分构成的复合体。
[34]如[33]所述的试剂盒,其中,所述复合体的HA3亚组分为A型或B型的肉毒杆菌的成分。
[35]如[24]~[34]中任一项所述的试剂盒,其中,培养为继代培养。
[36]如[24]~[35]中任一项所述的试剂盒,其用于[1]~[11]中任一项所述的方法。
[37][1]~[11]中任一项所述的方法中的可阻碍细胞间粘接的物质的用途。
实施例
以下,通过实施例对本公开进一步详细地进行说明,但这些实施例为例示的实施例,本公开并不限制于这些实施例。
[血凝素(HA)给iPS细胞带来的影响(其1)]
按照图5所示的实验程序表培养iPS细胞。首先,在饲养细胞上播种iPS细胞(day0),每24小时以维持培养基进行培养基交换。3天后(day3),添加HA,培养24小时,用PBS清洗2次,以维持培养基进行培养基交换(day4)。其后,每24小时以维持培养基进行培养基交换至9天后(day9)。培养后,用免疫细胞染色法确认所培养的细胞的Oct3/4的表达,另外,进行DAPI染色。使用的细胞、培养基、HA、及培养条件如下所述。
[细胞]
iPS细胞:Tic(Np39)
饲养细胞:SNL76/7(Np5)丝裂霉素-c处理完毕
[培养基]
iPS细胞:ReproStem(商品名、ReproCELL社制)、5ng/mLFGF-2
饲养细胞:DMEM(7%FBS,1%Penicillin-streptomycinsolution)
[容器]
24孔板(底面积:1.9cm2/孔、培养基量:0.4mL/孔)
[HA]
作为HA复合体试样,使用作为下述表1中记载的肉毒杆菌的神经毒素复合体试样的血凝素HA-1~HA-4。予以说明,HA-1及HA-2同时HA1~3的亚组分全部为B型的复合体,为另行地制备的HA复合体试样。HA-3为HA1为C型、HA2及3为B型的HA复合体试样。HA-4为HA1及2为B型、HA3为C型的HA复合体试样。
[表1]
(表1)
[HA制备、添加方法]
HA的稀释:为了使相同的稀释系列中所含的PBS浓度相同,进行2阶段稀释。首先,用PBS对HA进行阶段稀释,进而,使用培养基(ReproStem)进行稀释。(终浓度:100、50、10、1nM)
进一步加入bFGF(终浓度5ng/ml),添加于iPS细胞。
[培养条件]
37℃、5%CO2氛围下
iPS细胞的继代后,在t=72h(day3)的培养基交换中,以各浓度添加HA-1~4,培养24小时。其后,在t=96h(day4)的培养基交换中,更换为HA无添加的培养基,继续进行培养。
[观察]
在day3、day4、day5及day9中,用INCellAnalyzer2000(商品名、GEHealthcare生物科学社制)观察培养细胞,取得图像。将以100nM、50nM、10nM、及1nM添加HA-1时的显微镜观察照片分别示于图6、7、8及9。
如图6所示,以100nM添加HA-1的情况下,在day3的时刻产生的脱未分化细胞在day4以后不能观察到。在day4,在细胞间形成隙间,细胞成为稍微长地伸展的形态。day5以后,填埋隙间,成为细胞的形态变小、细胞彼此密集的敷石状的形态,发生集落的扩大。在day9,看到含有在day5以后产生的脱未分化细胞的区域。
如图7所示,以50nM添加HA-1的情况下,在day3~5,与以100nM添加的情况同样。但是,在day9,没有看到脱未分化细胞。
如图8所示,以10nM添加HA-1的情况下,在day4,可见在day3的时刻产生的脱未分化细胞减少。但是,在day5再次引起脱未分化细胞的扩大。以后,脱未分化细胞的区域扩大。
如图9所示,以1nM添加HA-1的情况下,day3以后,在day3的时刻产生的脱未分化细胞的区域的扩大继续。没有看到细胞的形态变化或脱未分化细胞的减少。
将以100nM、50nM、及1nM添加HA-2时的显微镜观察照片分别示于图10、11及12。如图10所示,以100nM添加HA-2的情况下,与以100nM添加HA-1的情况(图6)同样。如图11所示,以50nM添加HA-2的情况下,与以50nM添加HA-1的情况(图7)同样。如图12所示,以1nM添加HA-2的情况下,与以1nM添加HA-1的情况(图9)同样。
将HA-1及HA-2的结果归纳于下述表2。如表2所示,以100nM及50nM添加HA-1及HA-2的情况下,在day3时刻产生的脱未分化细胞缩小和/或消失。
图13表示观察了相对于在继代时带入的脱未分化细胞的HA-2的影响的结果。如该图所示,以100nM添加HA-2并处理24小时时,脱未分化细胞缓慢地剥离。
将以50nM及10nM添加HA-3时的显微镜观察照片分别示于图14、及15。
如图14所示,以50nM添加HA-3的情况下,在day3的时刻产生的脱未分化细胞区域的扩大停止,day4以后,与脱未分化细胞的增殖同时,脱未分化细胞区域缩小。在day9,在集落的中心的一部分中残存脱未分化细胞。在day4,在iPS细胞间形成隙间,iPS细胞的形态成为稍微长地伸展的形态。day5以后,伴随iPS细胞的增殖,成为由细胞彼此密集的敷石状的形态的iPS细胞构成的集落。另一方面,发生饲养细胞的剥离。予以说明,以100nM添加HA-3的情况下,也可得到与以50nM添加HA-3的情况同样的结果。
如图15所示,以10nM添加HA-3的情况下,day3以后,脱未分化细胞的区域的扩大继续。不能观察细胞的形态变化、脱未分化细胞的减少、及饲养细胞的剥离。
将以100nM、50nM、及10nM添加HA-4时的显微镜观察照片示于图16。如同图所示,在day3的时刻产生的脱未分化细胞的区域的扩大继续。但是,HA-4为100nM的情况下,或许引起了脱未分化细胞区域的缩小。
将HA-3及HA-4的结果归纳于下述表2。
[表2]
(表2)
如上述表2所示,HA-1及HA-2的情况下,与HA-3及4的情况相比,有效地缩小和/或消失脱未分化细胞的区域。另外,HA-3的情况下,与HA-4的情况相比,有效地缩小和/或扩大抑制脱未分化细胞的区域。
[饲养细胞给iPS细胞带来的影响]
在饲养细胞上播种iPS细胞,每24小时以维持培养基进行培养基交换至7天后。培养后,用免疫细胞染色法确认所培养的细胞的Oct3/4的表达,另外,进行DAPI染色。使用的细胞、培养基及培养条件如下所述。
[细胞]
iPS细胞:Tic(Np39)
饲养细胞:MEF
[培养基]
iPS细胞:ReproStem(商品名、ReproCELL社制)、5ng/mLFGF-2
饲养细胞:DMEM(7%FBS,1%Penicillin-streptomycinsolution)
[容器]
24孔板(底面积:1.9cm2/孔、培养基量:0.4mL/孔)
[培养条件]
37℃、5%CO2氛围下
[观察]
在day3及day7,用INCellAnalyzer2000(商品名、GEHealthcare生物科学社制)观察培养细胞,取得图像。将得到的显微镜观察照片示于图17。
如图17所示,未分化脱离细胞在集落的外缘部(外侧)产生。
接着,从培养开始至3天后(day3),添加作为游走抑制剂的Rac-1inhibitor(商品名:NSC23766、Calbiochem社制)50、100或150μM,除此之外,与上述同样地操作,进行细胞培养及观察。将得到的显微镜观察照片示于图17。
[Rac-1inhibitor制备、添加方法]
Rac-1inhibitor稀释:使用培养基(ReproStem)进行稀释(终浓度:50或100μM)。
进一步加入bFGF(商品名、ReproCELL社制、终浓度5ng/ml),添加于iPS细胞中。
如图17所示,在Rac-1inhibitor未添加的情况下,在集落外缘部产生的未分化脱离细胞通过添加作为游走抑制剂的Rac-1inhibitor而在集落中央部产生。可以通过阻碍细胞游走而使未分化脱离细胞在集落中央部产生。因此,可以通过阻碍细胞的游走而使未分化脱离细胞在集落中央部产生,由此暗示可以除去未分化脱离细胞。
使用SNL饲养细胞作为饲养细胞,从培养开始至3天后(day3)添加Rac-1inhibitor(50或100μM)并进行培养,结果,与Rac-1inhibitor未添加的情况同样地,在集落中央部产生未分化脱离细胞(datenotshown)。
[血凝素(HA)给iPS细胞带来的影响(其2)]
确认对通过Rac-1inhibitor诱导的未分化脱离细胞带来的HA的影响。首先,在饲养细胞上播种iPS细胞(day0),每24小时以维持培养基进行培养基交换。在3天后(day3)添加100μMRac-1inhibitor,培养24小时,用PBS清洗2次,以维持培养基进行培养基交换(day4)。在5天后(day5)添加HA-1,培养24小时,用PBS清洗2次,以维持培养基进行培养基交换(day6)。其后,每24小时以维持培养基进行培养基交换至8天后(day8)。培养后,用免疫细胞染色法确认所培养的细胞的Oct3/4的表达,另外,进行DAPI染色。使用的细胞、培养基及培养条件如下所述。Rac-1inhibitor及HA的制备及添加方法如上所述。
[细胞]
iPS细胞:Tic(Np39)
饲养细胞:MEF
[培养基]
iPS细胞:ReproStem(商品名、ReproCELL社制)、5ng/mLbFGF(商品名、ReproCELL社制)
饲养细胞:DMEM(10%FBS(GIBCO社制),1%HEPES(sigma社制)、1%Penicillin-streptomycin(NACALAITESQUE社制))
[容器]
24孔板(底面积:1.9cm2/孔、培养基量:0.4mL/孔)
[观察]
在day3、day4、day5、day6、及day8,用INCellAnalyzer2000(商品名、GEHealthcare生物科学社制)观察培养细胞,取得图像。将得到的显微镜观察照片示于图18。
作为对照,除不进行HA-1的添加之外,进行与上述同样的培养及观察。将得到的显微镜观察照片示于图18。
如图18所示,确认:通过Rac-1inhibitor的添加,在集落中心部产生的含有未分化脱离细胞的区域通过HA的添加而缩小和/或消失。
[无饲养层培养给iPS细胞带来的影响]
使用SynthemaxSurface(商品名、Corning社制)作为培养面,在其上播种iPS细胞,每24小时以维持培养基进行培养基交换至7天后。培养后,用免疫细胞染色法确认所培养的细胞的Oct3/4的表达,另外,进行DAPI染色。使用的细胞、培养基及培养条件如下所述。
[细胞]
iPS细胞:Tic(Np39)
[培养基]
mTeSR(R)1medium(商品名、STEMCELLTechnologies社制)
[容器]
24孔板(底面积:1.9cm2/孔、培养基量:0.4mL/孔)
[培养条件]
37℃、5%CO2氛围下
[观察]
在day6,用INCellAnalyzer2000(商品名、GEHealthcare生物科学社制)观察培养细胞,取得图像。
无饲养层培养的情况也与MEF饲养细胞同样地,未分化脱离细胞在集落的外缘部(外侧)产生。
接着,从培养开始至3天后(day3),以100或150μM添加Rac-1inhibitor,除此之外,与上述同样地操作,进行细胞培养及观察。将得到的显微镜观察照片示于图19。图19是Rac-1inhibitor为150μM时的显微镜观察照片。如图19所示,通过添加Rac-1inhibitor,可以在集落中央部产生未分化脱离细胞。由此暗示:无饲养层培养的情况也可以通过阻碍细胞游走而使未分化脱离细胞在集落中央部产生,由此可以除去未分化脱离细胞。
[血凝素(HA)给iPS细胞带来的影响(其3)]
使用以下的细胞1或2作为细胞,使用HA-1作为HA,将HA的添加浓度设为50nM,除此之外,在与血凝素(HA)给iPS细胞带来的影响(其1)相同的条件下进行培养及观察。将得到的显微镜观察照片分别示于图20。
[细胞1]
[细胞]
iPS细胞:201B7株
饲养细胞:SNL76/7细胞
[培养基]
iPS细胞:ReproStem(商品名、ReproCELL社制)
饲养细胞:DMEM(7%FBS,1%Penicillin-streptomycinsolution)
[细胞2]
[细胞]
iPS细胞:454E-2株
饲养细胞:SNL76/7细胞
[培养基]
iPS细胞:ReproStem(商品名、ReproCELL社制)
饲养细胞:DMEM(7%FBS,1%Penicillin-streptomycinsolution)
如图20所示,含有未分化脱离细胞的集落添加HA时,脱未分化细胞的区域缩小及或消失。
[血凝素(HA)给继代带来的影响]
按照图21所示的实验程序表将iPS细胞进行继代培养。首先,在饲养细胞上播种iPS细胞(day0),每24小时以维持培养基进行培养基交换。3天后(day3),以50nM添加HA并培养24小时,用PBS清洗2次,以维持培养基进行培养基交换(day4)。其后,每24小时以维持培养基进行培养基交换至10天后(day10)。培养后,通过通常的操作进行继代,从继代至3天后(day13),以50nM添加HA并培养24小时,用PBS清洗2次,以维持培养基进行培养基交换(day14)。其后,进行10天的培养、继代、HA的添加及培养(10天)。用免疫细胞染色法确认所培养的细胞的Oct3/4的表达,另外,进行DAPI染色。使用的细胞、培养基、及培养条件如下所述。作为HA,使用HA-1。
[细胞]
iPS细胞:Tic(Np39)
饲养细胞:SNL76/7(Np5)丝裂霉素-c处理完毕
[培养基]
iPS细胞:ReproStem(商品名、ReproCELL社制)、5ng/mLFGF-2
饲养细胞:DMEM(7%FBS,1%Penicillin-streptomycinsolution)
[容器]
24孔板(底面积:1.9cm2/孔、培养基量:0.4mL/孔)
[HA制备·添加方法]
HA的稀释:为了使相同的稀释系列中所含的PBS浓度为相同,进行2阶段稀释。首先,用PBS对HA进行阶段稀释,进而使用培养基(ReproStem)进行稀释。(终浓度:50nM)
进一步加入bFGF(终浓度5ng/ml),添加于iPS细胞。
[培养条件]
在37℃、5%CO2氛围下
iPS细胞的继代后,在t=72h(day3)的培养基交换中,以各浓度添加HA,培养24小时。其后,在t=96h(day4)的培养基交换中,更换为HA无添加的培养基,继续培养。
[观察]
在day3、day4、day10、day13、day14、day20、day23、day24及day30,用INCellAnalyzer2000(商品名、GEHealthcare生物科学社制)观察培养细胞,取得图像。另外,计测所形成的集落及未分化集落(由未分化细胞形成、不含有未分化脱离细胞的集落)的数,算出未分化集落的比例。将其结果示于图22。
作为比较例,除不添加HA之外,在相同的条件下进行继代培养。将其结果示于图22。
在图22中,白圆点表示添加有HA的体系,黑圆点表示未添加HA的体系。如图22所示,通过添加HA,与未添加HA的情况相比,在继代培养后所形成的未分化集落的比例增加。即,通过除去未分化脱离细胞,可以有效地形成未分化集落。
Claims (14)
1.一种具有多能性(pluripotency)的干细胞的培养方法,其中,包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。
2.一种除去在具有多能性(pluripotency)的干细胞的培养中产生的或可产生的脱离未分化状态的细胞的方法,其中,包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。
3.一种维持具有多能性(pluripotency)的干细胞的未分化状态的方法,其中,包括在可阻碍细胞间粘接的物质的存在下进行细胞培养。
4.如权利要求1~3中任一项所述的方法,其中,具有多能性的干细胞为人多能性(pluripotent)干细胞。
5.如权利要求4所述的方法,其中,人多能性干细胞为人iPS细胞或人ES细胞。
6.如权利要求1~5中任一项所述的方法,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为具有E-钙粘蛋白的功能阻碍活性的物质。
7.如权利要求6所述的方法,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为进一步具有对细胞表面的结合能力的物质。
8.如权利要求1~7中任一项所述的方法,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为肉毒杆菌(Clostridiumbotulinum)的神经毒素复合体中的血凝素(HA)。
9.如权利要求1~8中任一项所述的方法,其中,可阻碍细胞间粘接的物质为由选自由肉毒杆菌的神经毒素复合体中的3个血凝素亚组分HA1、HA2、及HA3组成的组中的2种或3种成分构成的复合体。
10.如权利要求9所述的方法,其中,所述复合体的HA3亚组分为A型或B型的肉毒杆菌的成分。
11.如权利要求1~10中任一项所述的方法,其中,培养为继代培养。
12.一种用于权利要求1~11中任一项所述的方法的组合物,其包含可阻碍细胞间粘接的物质。
13.一种试剂盒,其包含:
具有多能性的干细胞用的培养基成分,和
可阻碍细胞间粘接的物质。
14.如权利要求13所述的试剂盒,其中,其用于权利要求1~11中任一项所述的方法。
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