KR20150108365A

KR20150108365A - 다능성 (pluripotency) 을 갖는 줄기세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR20150108365A
Application number: KR1020157019207A
Authority: KR
Inventors: 마사히로 기노오카; 미혜 김; 유카코 후지나가; 요 스가와라
Original assignee: 고꾸리쯔 다이가꾸 호우징 오사까 다이가꾸
Priority date: 2012-12-28
Filing date: 2013-12-26
Publication date: 2015-09-25
Also published as: US9822344B2; CN105051185A; EP2940125A4; EP2940125B1; WO2014104207A1; EP2940125A1; US20150329831A1; CA2896689A1; AU2013367082A1; SG11201505155WA; JP6112514B2; JPWO2014104207A1; ZA201504388B; BR112015015466A2

Abstract

다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 발생하는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거할 수 있는 방법의 제공.
일 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 그 밖의 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 중에 발생한 또는 발생할 수 있는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 그 밖의 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

Description

다능성 (pluripotency) 을 갖는 줄기세포의 배양 방법 {METHOD FOR CULTURING PLURIPOTENT STEM CELLS}

본 개시는 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 방법, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 중에 발생한 또는 발생할 수 있는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거하는 방법, 다능성을 갖는 줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 방법, 이들 방법에 사용하는 조성물, 및 이들 방법에 사용하는 키트에 관한 것이다.

인간 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포를 대량 배양할 때에는, 일련의 증폭 배양 (계대 배양) 의 반복에 의해 다수의 미분화 세포를 조제한다. 이 일련의 배양에 있어서, 미분화 상태로부터 일탈한 세포“탈미분화 세포”가 우발적으로 발생하는 것이 알려져 있다.

이 탈미분화 세포는 미분화 세포와 거의 동등한 분열 능력을 가지면서, 또한 미분화 세포로부터 탈미분화 세포로의 전환을 유발하는 것이 알려져 있다. 즉, 탈미분화 세포가 발생하면, 그 증식 속도는 미분화 세포의 그것을 상회하여, 미분화 세포의 증식이 억제된다.

탈미분화 세포의 발생은 숙련되지 않은 배양 조작자에 의한 배양에서 많이 관찰된다. 또한, 콜로니 사이즈의 과대함이나 콜로니끼리의 합일이 발생의 한가지 원인으로 알려져 있다. 따라서, 낮은 컨플루언트에서의 계대, 파종시의 균일성 유지에 의해, 탈미분화 세포의 발생 빈도를 어느 정도 낮출 수 있다. 또한, 최근 개발된 배지에 의해서도, 탈미분화 세포의 발생 빈도가 어느 정도 억제되어 있다. 그러나, 그래도 탈미분화 세포는 우발적으로 발생하며, 발생한 경우에는 탈미분화 세포를 포함한 콜로니를 제거하는 것이 아직까지 필수적이다.

탈미분화 세포를 포함하는 콜로니는 미분화 상태를 유지하기 위해서 계대시에 현미경 하의 피펫팅 작업에 의해 신중하고 조심스럽게 제거된다. 이러한 콜로니 제거의 손기술을 모방한 장치, 예를 들어 관찰 장치와 로봇 핸들링에 의한 피펫팅을 조합한 장치도 개발되어 있다.

또한, 특허문헌 1 에는, iPS 세포 등의 다능성 줄기세포의 미분화를 유지하면서 증식시키기 위해, 액티빈 존재하에서 다능성 줄기세포를 배양하는 것을 개시한다.

일본 공개특허공보 2012-143229호

전술한 바와 같이, 인간 iPS 세포 등의 다능성 줄기세포의 계대 배양에서는 탈미분화 현상을 야기하기 쉬워 미분화 유지가 곤란하며, 여러 차례의 계대 후에는 다수의 iPS 세포 콜로니가 탈미분화 현상을 야기하여, 미분화 상태를 벗어난 세포를 포함하는 열화 콜로니가 될 수 있다. 따라서, 신중하고 조심스러운 배양 및 신중한 콜로니의 선별이라는 번잡한 조작이 불가결하게 된다. 줄기세포 산업을 촉진한다는 점에서도, 번잡한 조작이 적고, 숙련자가 아니라도 가능한 다능성 줄기세포의 미분화 유지 방법이 요망되고 있다.

본 개시는, 일 양태에 있어서, 다능성 ("pluripotency", 이하 동일) 을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 발생하는 「미분화 상태를 벗어난 세포」를 제거할 수 있는 방법을 제공한다.

본 개시는, 일 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 개시는, 그 밖의 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 중에 발생한 또는 발생할 수 있는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 개시는, 그 밖의 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 개시는, 그 밖의 양태에 있어서, 본 개시에 관련된 상기 방법에 사용하기 위한, 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 함유하는 조성물에 관한 것이다. 본 개시는, 그 밖의 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포용의 배지 성분과 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 포함하는 키트에 관한 것이다.

본 개시에 따르면, 일 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 발생하는 「미분화 상태를 벗어난 세포」를 제거할 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.

도 1 은, 본 개시의 일 실시형태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 발생한 「미분화 상태를 벗어난 세포」가 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 첨가에 의해 제거되는 모습을 설명하는 도면이다.
도 2 는, 본 개시의 일 실시형태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 발생한 「미분화 상태를 벗어난 세포」가 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 첨가에 의해 제거되는 모습을 설명하는 도면이다.
도 3 은, 본 개시의 일 실시형태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 발생하는 「미분화 상태를 벗어난 세포」가 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 첨가에 의해 제거되는 모습을 설명하는 도면이다.
도 4 는, 본 개시의 일 실시형태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 발생하는 「미분화 상태를 벗어난 세포」가 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 첨가에 의해 제거되는 모습을 설명하는 도면이다.
도 5 는 실시예에서 실시한 실험의 스케줄을 설명하는 도면이다.
도 6 은 종농도 100 nM 의 HA-1 을 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 7 은 종농도 50 nM 의 HA-1 을 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 8 은 종농도 10 nM 의 HA-1 을 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 9 는 종농도 1 nM 의 HA-1 을 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 10 은 종농도 100 nM 의 HA-2 를 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 11 은 종농도 50 nM 의 HA-2 를 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 12 는 종농도 1 nM 의 HA-2 를 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 13 은 종농도 100 nM 의 HA-2 를 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 14 는 종농도 50 nM 의 HA-3 을 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 15 는 종농도 10 nM 의 HA-3 을 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 16 은 종농도 100, 50, 및 10 nM 의 HA-4 를 day 3 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 17 은 MEF 피더 세포를 사용한 다능성을 갖는 줄기세포의 배양시의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 18 은 Rac-1 inhibitor 를 day 3 에 첨가한 후, 종농도 50 nM 의 HA-1 을 day 5 에 첨가했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 19 는 다능성을 갖는 줄기세포의 피더리스 배양시의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 20 은 201B7 주 또는 454E-2 주를 사용했을 때의 현미경 관찰 사진의 일례이다.
도 21 은 실시예에서 실시한 실험의 스케줄을 설명하는 도면이다.
도 22 는 계대 배양시의 미분화 콜로니의 비율을 나타내는 그래프이다.

본 개시는, 일 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포를 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 배양하면, 배양 중의 콜로니 내에 발생한 및/또는 발생하는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거할 수 있다는 지견에 근거한 것이다. 또한, 본 개시는, 일 양태에 있어서, 배양 세포 중에 미분화 세포와 미분화 상태를 벗어난 세포가 혼합되어 있는 경우에 있어서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 미분화 상태를 벗어난 세포를 선택적으로 제거할 수 있다는 지견에 근거한 것이다.

본 개시에 있어서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 첨가에 의해서 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 발생한 「미분화 상태를 벗어난 세포」를 제거하는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태를 도 1 에 기초하여 설명한다. 도 1A 는, 플레이트 상에서 배양되는 미분화 상태의 세포 콜로니의 중앙부에, 미분화 상태를 벗어난 세포가 발생한 상태를 나타낸다. 이 상태에서 배양액에 「세포간 접착을 저해 가능한 물질」을 첨가하면, 미분화 상태를 벗어난 세포가 제거되기 시작하고 (도 1B), 머지않아, 콜로니 중앙부로부터 미분화를 벗어난 세포가 소멸된다 (도 1C). 그 후 배양을 계속함으로써 미분화 상태의 세포가 증식하여, 미분화 상태의 콜로니가 형성된다 (도 1D). 동 도면에 나타내는 바와 같이, 본 개시에 따르면, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 「미분화 상태를 벗어난 세포」를 "지우개로 지우는 것처럼" 제거할 수 있다.

도 1 의 실시형태에 있어서 미분화 상태를 벗어난 세포가 제거되는 메카니즘은 다음과 같이 추정되지만, 본 개시는 이러한 메카니즘에 한정하여 해석되지 않아도 된다. 먼저, 미분화 상태를 벗어난 세포는, 미분화 상태의 세포보다도 세포간 접착 및 스캐폴드에 대한 접착이 약하여, 세포 사이에 갭이 생기기 쉬워지는 것으로 생각된다 (도 2A). 이 세포 사이의 갭에 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 침입해 들어감으로써, 미분화 상태를 벗어난 세포의 세포간 접착은 더욱 약해지고, 형태 변화가 생겨, 세포 증식이 억제되는 것으로 생각된다 (도 2B). 또한, 이 때, 배양면의 스캐폴드와의 세포 접착이 약해진 미분화 상태를 벗어난 세포는 부유하고, 아포토시스에 의해 제거되는 것으로 생각된다 (도 2B). 주위의 미분화 상태의 세포가 증식함에 따라서, 미분화 상태를 벗어난 세포는 중앙 부분으로 밀어 넣어지고 (도 2C), 최종적으로는 아포토시스에 의해 배제된다 (도 2D).

본 개시에 있어서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 첨가에 의해서 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 발생하는 「미분화 상태를 벗어난 세포」를 제거하는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태를 도 3 에 기초하여 설명한다. 도 3A 는 플레이트 상에서 배양되는 미분화 상태의 세포 콜로니를 나타낸다. 이 상태에서 배양액에 「세포간 접착을 저해 가능한 물질」을 첨가하면, 이 콜로니에 미분화 상태를 벗어난 세포가 발생하더라도 (도 3B), 미분화 상태를 벗어난 세포의 증식이 억제되고, 머지않아 제거된다 (도 3C). 그 후 배양을 계속함으로써 미분화 상태의 콜로니가 계속해서 형성된다 (도 3D).

도 3 의 실시형태에 있어서 미분화 상태를 벗어난 세포가 제거되는 메카니즘은 다음과 같이 추정되지만, 본 개시가 이들 메카니즘에 한정되어 해석되지 않아도 된다. 처음에는 미분화 상태의 세포의 콜로니로, 상호의 세포간 접착이 강한 것으로 생각된다 (도 4A). 이 콜로니에 우발적으로 미분화 상태를 벗어난 세포가 발생한다 (도 4B). 미분화 상태를 벗어난 세포는, 미분화 상태의 세포보다도 세포간 접착이 약하여, 세포 사이에 갭이 생기기 쉬워지는 것으로 생각된다. 이 세포 사이의 갭에 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 침입해 들어감으로써, 미분화 상태를 벗어난 세포의 세포간 접착은 더욱 약해지고, 형태 변화가 생겨, 세포 증식이 억제되는 것으로 생각된다. 또한, 이 때, 배양면과의 세포 접착이 없어진 미분화 상태를 벗어난 세포는, 증식을 계속하는 주위의 미분화 상태의 세포에게 밀려나, 아포토시스에 의해 제거되는 것으로 생각된다 (도 4C).

따라서, 본 개시는, 일 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법 (이하, 「본 개시에 관련된 배양 방법」이라고도 한다) 에 관한 것이다. 본 개시에 관련된 배양 방법에 의하면, 일 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 발생하는 「미분화 상태를 벗어난 세포」를 제거할 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.

따라서, 본 개시는, 그 밖의 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 중에 발생한 또는 발생할 수 있는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법 (이하, 「본 개시에 관련된 제거 방법」이라고도 한다) 에 관한 것이다. 본 개시에 관련된 배양 방법, 및/또는 본 개시에 관련된 제거 방법에 의하면, 일 양태에 있어서, 미분화 상태를 벗어난 세포가 발생하여 열화된 미분화 상태의 세포의 콜로니로부터 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거하여, 미분화 상태의 세포의 콜로니 또는 미분화 상태의 세포로 이루어지는 콜로니로 할 수 있다.

따라서, 본 개시는, 그 밖의 양태에 있어서, 미분화 상태를 벗어난 세포가 발생하여 열화된 콜로니로부터 미분화 상태의 세포로 이루어지는 콜로니를 형성하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 상기 열화된 콜로니를 배양하는 것을 포함하는 방법 (이하, 「본 개시에 관련된 콜로니 형성 방법」이라고도 한다) 에 관한 것이다.

또한, 본 개시에 관련된 배양 방법, 및/또는 본 개시에 관련된 제거 방법에 의하면, 일 양태에 있어서, 미분화 상태 세포 또는 미분화 상태 세포만을 배양할 수 있다. 따라서, 본 개시는, 그 밖의 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법 (이하, 「본 개시에 관련된 유지 방법」이라고도 한다) 에 관한 것이다.

[다능성을 갖는 줄기세포]

본 개시에 있어서 다능성을 갖는 줄기세포는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 인간 다능성 (pluripotent) 줄기세포이다. 본 개시에 있어서 인간 다능성 줄기세포는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 인간 iPS 세포 또는 인간 ES 세포이다.

[미분화 상태를 벗어난 세포]

본 개시에 있어서 미분화 상태를 벗어난 세포란, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 세포의 형태가 미분화 상태의 세포의 그것과는 달리 판별이 가능하다. 본 개시에 있어서 「미분화 상태를 벗어난 세포」는 「탈미분화 세포」 또는 「미분화 일탈 세포」라고도 하는 경우가 있다. 탈미분화 세포가 된 것은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 미분화 마커의 소실로 확인할 수 있다. 상기 미분화 마커는 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, Oct3/4, Nanog, SSEA-4, TRA-1-60 이다.

[세포간 접착을 저해 가능한 물질]

본 개시에 있어서 세포간 접착을 저해 가능한 물질은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, E-카데린의 기능 저해 활성을 갖는 물질이다. 본 개시에 있어서 세포간 접착을 저해 가능한 물질은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 효율적으로 탈미분화 세포를 제거하는 관점에서, E-카데린의 기능 저해 활성에 추가하여 세포 표면에 대한 결합능을 갖는 것이 바람직하다. 상기 세포 표면에 대한 결합능은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 세포 표면에 대한 결합능이다.

[HA]

본 개시에 있어서 세포간 접착을 저해 가능한 물질은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 보툴리누스균 (Clostridium botulinum) 의 신경 독소 복합체에 있어서의 헤마글루티닌 (HA) 이다. 본 개시에 있어서 세포간 접착을 저해 가능한 물질은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 효율적으로 탈미분화 세포를 제거하는 관점에서, 보툴리누스균 (Clostridium botulinum) 의 신경 독소 복합체에 있어서의 3 개의 헤마글루티닌 서브컴포넌트 HA1 (HA33), HA2 (HA17), 및 HA3 (HA70) 으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 또는 3 성분으로 구성된 복합체 또는 그 복합체를 포함하는 것이다. 또한, 세포간 접착을 저해 가능한 물질은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 효율적으로 탈미분화 세포를 제거하는 관점에서, HA2 (HA17) 및 HA3 (HA70) 으로 구성되는 복합체 혹은 3 성분으로 구성되는 복합체 또는 그 복합체를 포함하는 것이다. 상기 서브컴포넌트 HA3 (HA70) 은, 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, E-카데린의 기능 저해 활성을 발현하는 관점 및 효율적으로 탈미분화 세포를 제거하는 관점에서, A 형 또는 B 형의 보툴리누스균의 것인 것이 바람직하다. 또한, 서브컴포넌트 HA1 (HA33) 및 HA2 (HA17) 는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, A 형, B 형, 및 C 형 중 어느 보툴리누스균의 것이어도 된다. HA 는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 각 서브컴포넌트는 각각 재조합체이어도 되고, 천연형이어도 된다.

[세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서의 세포 배양]

본 개시에 있어서 「세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서의 세포 배양」은 종래 사용되거나 및/또는 금후에 개발되는, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 조건 및 배양 배지 등을 채용할 수 있고, 그 배양 조건의 배지에 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 존재시킴으로써 실시할 수 있다. 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 배양 중의 배양 배지에 첨가해도 되고, 또는, 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 미리 첨가한 배지를 사용하여 배양시켜도 된다. 배양 배지, 배양 플레이트 등은 시판되는 것을 사용해도 된다.

「세포간 접착을 저해 가능한 물질」은 탈미분화 세포를 확인하고 나서 배지에 첨가해도 되고, 탈미분화 세포가 발생하지 않은 단계에서 배지에 첨가해도 된다.

배지에 존재시키는 「세포간 접착을 저해 가능한 물질」의 농도는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 탈미분화 세포를 제거할 수 있는 실질적인 유효 농도이고, 당업자라면 설정할 수 있다. 배지에 존재시키는 「세포간 접착을 저해 가능한 물질」의 농도는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 효율적으로 탈미분화 세포를 제거하는 관점에서 5 nM 이상, 10 nM 이상, 또는 15 nM 이상을 들 수 있다. 동일한 관점에서, 200 nM 이하, 150 nM 이하, 또는 100 nM 이하이다.

「세포간 접착을 저해 가능한 물질」을 배지에 존재시키는 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태로서, 다음 번 배지 교환을 단락으로 하여 1 회의 투여여도 되고, 연속되는 투여이어도 되며, 단속적인 투여여도 상관없다.

본 개시에 있어서 세포 배양은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 계대 배양을 포함한다. 본 개시에 관련된 배양 방법, 및/또는 본 개시에 관련된 제거 방법에 의하면, 일 양태에 있어서, 계대 배양 후에 형성되는 콜로니에 있어서의 미분화 콜로니 (미분화 세포로 형성되고, 미분화 일탈 세포를 실질적으로 포함하지 않는 콜로니) 의 비율을 향상시킬 수 있다는 효과를 나타낸다. 계대는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 종래 공지되거나 및 금후에 개발되는 수법에 의해 실시할 수 있다.

본 개시에 있어서 세포 배양은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 피더 세포를 사용한 배양이어도 되고, 피더리스 배양이어도 된다. 피더 세포는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, MEF (Mouse Embryo Fibroblast) 세포, SL10, 및 SNL 76/7 피더 세포 등을 들 수 있다. 피더 세포는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 피더 세포 중에서도 다능성을 갖는 줄기세포의 유주 속도가 비교적 느린 피더 세포가 바람직하다. 피더 세포는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 유주가 비교적 느리고, 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 미분화 일탈 세포를 콜로니 중앙부에 발생시킬 수 있다는 점에서 SNL 76/7 피더 세포가 바람직하다.

세포 배양은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 효율적으로 미분화 일탈 세포를 제거할 수 있는 점에서, 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니 중앙부에 미분화 일탈 세포를 발생시킬 수 있는 조건으로 실시하는 것이 바람직하다. 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 유주를 저해 및/또는 억제함으로써, 콜로니 중앙부에 미분화 일탈 세포를 효율적으로 발생시킬 수 있다.

본 개시는 그 밖의 일 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 방법으로서, 유주를 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포를 배양하는 것, 및 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 양태에 관련된 배양 방법에 의하면, 일 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포를 배양 중인 콜로니에 미분화 일탈 세포를 콜로니 중앙부에 발생시킬 수 있는 점에서, 효율적으로 미분화 일탈 세포를 제거할 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.

본 개시는 그 밖의 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 중에 발생한 또는 발생할 수 있는 미분화 일탈 세포를 제거하는 방법으로서, 유주를 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포를 배양하는 것, 및 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본 양태에 관련된 배양 방법, 및/또는 본 양태에 관련된 제거 방법에 의하면, 일 양태에 있어서, 미분화 일탈 세포가 발생하여 열화된 미분화 상태의 세포의 콜로니로부터 미분화 일탈 세포를 제거하여, 미분화 상태의 세포의 콜로니 또는 미분화 상태의 세포로 이루어지는 콜로니로 할 수 있다.

본 개시는 그 밖의 양태에 있어서, 미분화 일탈 세포가 발생하여 열화된 콜로니로부터 미분화 상태의 세포로 이루어지는 콜로니를 형성하는 방법으로서, 유주를 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포를 배양하는 것, 및 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 상기 열화된 콜로니를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 개시에 있어서 유주를 저해 가능한 물질은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포의 유주에 관련된 물질의 활성을 억제/저해하는 물질 등을 들 수 있다. 본 개시에 있어서 유주를 저해 가능한 물질은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 유주 저해제를 들 수 있다. 유주를 저해 가능한 물질은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, Rac-1 저해제 등을 들 수 있다. 배지에 존재시키는 「유주를 저해 가능한 물질」의 농도는, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 미분화 일탈 세포를 효율적으로 콜로니 중앙부로 이동시켜, 미분화 일탈 세포를 효율적으로 제거하는 관점에서, 50 μM 이상, 100 μM 이상, 또는 150 μM 이상이고, 동일한 관점에서 200 μM 이하이다.

유주를 저해 가능한 물질은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 배양 개시시에 배지에 첨가해도 되고, 배지 교환시에 첨가해도 된다. 유주를 저해 가능한 물질은, 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 있어서, 미분화 일탈 세포가 발생하지 않은 단계에서 배지에 첨가해도 되고, 미분화 일탈 세포를 확인하고 나서 배지에 첨가해도 된다.

본 개시에 관련된 배양 방법, 및/또는 본 개시에 관련된 제거 방법에 의하면, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양함으로써, 일 양태에 있어서, 폐쇄 공간을 유지하면서 자동적으로 콜로니로부터 미분화 일탈 세포를 제거할 수 있다. 또한, 일 양태에 있어서, 인위적인 조작 및/또는 확인이나 로봇 등의 특수한 장치 등을 사용하지 않은 경우라도 자동적으로 콜로니로부터 미분화 일탈 세포를 제거할 수 있다. 또한, 본 개시에 관련된 배양 방법, 및/또는 본 개시에 관련된 제거 방법에 의하면, 일 양태에 있어서, 나아가서는 형성되는 콜로니를 자동적으로 미분화 상태의 세포의 콜로니 또는 미분화 상태의 세포로 이루어지는 콜로니로 할 수 있다.

따라서, 본 개시에 관련된 배양 방법, 및/또는 본 개시에 관련된 제거 방법을 사용함으로써, 자동 배양 장치에 있어서, 미분화 상태의 세포의 콜로니 또는 미분화 상태의 세포로 이루어지는 콜로니를 효율적으로 얻을 수 있고, 나아가서는 미분화 상태의 세포를 간단하면서 또한 효율적으로 대량 생산할 수 있다.

본 개시, 그 밖의 양태에 있어서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 함유하는 조성물 (이하, 「본 개시에 관련된 조성물」이라고도 한다) 에 관한 것이다. 본 개시에 관련된 조성물에 있어서의 「세포간 접착을 저해 가능한 물질」은 전술한 바와 같다. 본 개시에 관련된 조성물은 본 개시에 관련된 배양 방법, 본 개시에 관련된 제거 방법, 본 개시에 관련된 콜로니 형성 방법, 및/또는 본 개시에 관련된 유지 방법을 위해서 사용할 수 있다. 따라서, 본 개시는 그 밖의 양태에 있어서, 본 개시에 관련된 배양 방법, 본 개시에 관련된 제거 방법, 본 개시에 관련된 콜로니 형성 방법, 및/또는 본 개시에 관련된 유지 방법에 있어서의 상기 「세포간 접착을 저해 가능한 물질」의 사용에 관한 것이다.

본 개시는 그 밖의 양태에 있어서, 다능성을 갖는 줄기세포용의 배지 성분과 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 포함하는 키트 (이하, 「본 개시에 관련된 키트」라고도 한다) 에 관한 것이다. 본 개시에 관련된 키트에 있어서의 「세포간 접착을 저해 가능한 물질」은 전술한 바와 같다. 본 개시에 관련된 키트는 본 개시에 관련된 배양 방법, 본 개시에 관련된 제거 방법, 본 개시에 관련된 콜로니 형성 방법, 및/또는 본 개시에 관련된 유지 방법을 위해서 사용할 수 있다. 다능성을 갖는 줄기세포용의 배지 성분은 특별히 한정되지 않고, 종래 사용되거나 또는 금후 개발되는 것을 사용할 수 있다.

본 개시는 또한 이하의 한정되지 않은 1 또는 복수의 실시형태에 관한 것이다.

[1] 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법.

[2] 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 중에 발생한 또는 발생할 수 있는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법.

[3] 다능성을 갖는 줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법.

[4] 다능성을 갖는 줄기세포가 인간 다능성 줄기세포인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[5] 인간 다능성 줄기세포가 인간 iPS 세포 또는 인간 ES 세포인, [4] 에 기재된 방법.

[6] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 E-카데린의 기능 저해 활성을 갖는 물질인, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[7] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 추가로 세포 표면에 대한 결합능을 갖는 물질인, [6] 에 기재된 방법.

[8] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 보툴리누스균 (Clostridium botulinum) 의 신경 독소 복합체에 있어서의 헤마글루티닌 (HA) 인, [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[9] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 보툴리누스균 (Clostridium botulinum) 의 신경 독소 복합체에 있어서의 3 개의 헤마글루티닌 서브컴포넌트 HA1, HA2, 및 HA3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 또는 3 성분으로 구성된 복합체인, [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[10] 상기 복합체의 HA3 서브컴포넌트는 A 형 또는 B 형의 보툴리누스균의 것인, [9] 에 기재된 방법.

[11] 배양이 계대 배양인, [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 방법.

[12] 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 함유하는, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양을 위한 조성물.

[13] 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 함유하는, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 중에 발생한 또는 발생할 수 있는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거하기 위한 조성물.

[14] 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 함유하는, 다능성을 갖는 줄기세포의 미분화 상태를 유지하기 위한 조성물.

[15] 다능성을 갖는 줄기세포가 인간 다능성 줄기세포인, [12] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재된 조성물.

[16] 인간 다능성 줄기세포가 인간 iPS 세포 또는 인간 ES 세포인, [15] 에 기재된 조성물.

[17] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 E-카데린의 기능 저해 활성을 갖는 물질인, [12] 내지 [16] 중 어느 하나에 기재된 조성물.

[18] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 추가로 세포 표면에 대한 결합능을 갖는 물질인, [17] 에 기재된 조성물.

[19] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 보툴리누스균 (Clostridium botulinum) 의 신경 독소 복합체에 있어서의 헤마글루티닌인, [12] 내지 [18] 중 어느 하나에 기재된 조성물.

[20] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 보툴리누스균 (Clostridium botulinum) 의 신경 독소 복합체에 있어서의 3 개의 헤마글루티닌 서브컴포넌트 HA1, HA2, 및 HA3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 또는 3 성분으로 구성된 복합체인, [12] 내지 [19] 중 어느 하나에 기재된 조성물.

[21] 상기 복합체의 HA3 서브컴포넌트는 A 형 또는 B 형의 보툴리누스균의 것인, [20] 에 기재된 조성물.

[22] 배양이 계대 배양인, [12] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 조성물.

[23] [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 방법을 위한, [12] 내지 [22] 중 어느 하나에 기재된 조성물.

[24] 다능성을 갖는 줄기세포용의 배지 성분과, 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 포함하는 키트.

[25] 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 중에 발생하는 또는 발생할 수 있는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거하기 위한, [24] 에 기재된 키트.

[26] 다능성을 갖는 줄기세포의 배양을 위한, [24] 에 기재된 키트.

[27] 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 포함하는, 다능성을 갖는 줄기세포의 배양 중에 발생한 또는 발생할 수 있는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거하기 위한, [24] 에 기재된 키트.

[28] 다능성을 갖는 줄기세포가 인간 다능성 줄기세포인, [24] 내지 [27] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[29] 인간 다능성 줄기세포가 인간 iPS 세포 또는 인간 ES 세포인, [28] 에 기재된 키트.

[30] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 E-카데린의 기능 저해 활성을 갖는 물질인, [24] 내지 [29] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[31] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 추가로 세포 표면에 대한 결합능을 갖는 물질인, [30] 에 기재된 키트.

[32] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 보툴리누스균 (Clostridium botulinum) 의 신경 독소 복합체에 있어서의 헤마글루티닌인, [24] 내지 [31] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[33] 세포간 접착을 저해 가능한 물질이 보툴리누스균 (Clostridium botulinum) 의 신경 독소 복합체에 있어서의 3 개의 헤마글루티닌 서브컴포넌트 HA1, HA2, 및 HA3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 또는 3 성분으로 구성된 복합체인, [24] 내지 [32] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[34] 상기 복합체의 HA3 서브컴포넌트는 A 형 또는 B 형의 보툴리누스균의 것인, [33] 에 기재된 키트.

[35] 배양이 계대 배양인, [24] 내지 [34] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[36] [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 방법을 위한, [24] 내지 [35] 중 어느 하나에 기재된 키트.

[37] [1] 내지 [11] 중 어느 하나에 기재된 방법에 있어서의 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 사용.

실시예

이하에서 실시예에 의해 본 개시를 더욱 상세히 설명하는데, 이들은 예시적인 것으로서, 본 개시는 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.

[헤마글루티닌 (HA) 이 iPS 세포에 미치는 영향 (그 1)]

도 5 에 나타내는 실험 스케줄에 따라서 iPS 세포를 배양하였다. 먼저, 피더 세포 상에 iPS 세포를 파종하고 (day 0), 24 시간마다 유지 배지로 배지 교환하였다. 3 일 후 (day 3) 에 있어서 HA 를 첨가하여 24 시간 인큐베이트하고, PBS 로 2 번 세정하여 유지 배지로 배지 교환하였다 (day 4). 그 후, 9 일 후 (day 9) 까지 24 시간마다 유지 배지로 배지 교환하였다. 배양 후, 배양된 세포의 Oct3/4 의 발현을 면역 세포 염색법으로 확인하고, 또한 DAPI 염색을 실시하였다. 사용한 세포, 배지, HA, 및 배양 조건은 다음과 같다.

[세포]

iPS 세포 : Tic (Np 39)

피더 세포 : SNL 76/7 (Np 5) 미토마이신 c 처리를 마친 것

[배지]

iPS 세포 : Repro Stem (상품명, Repro CELL 사 제조), 5 ng/mL FGF-2

피더 세포 : DMEM (7 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-streptomycin solution)

[용기]

24 웰 플레이트 (바닥 면적 : 1.9 ㎠/웰, 배지량 : 0.4 mL/웰)

[HA]

HA 복합체 시료로서, 하기 표 1 에 기재된 보툴리누스균의 신경 독소 복합체 시료인 헤마글루티닌 HA-1 ∼ HA-4 를 사용하였다. 또, HA-1 및 HA-2 는 모두, HA1 ∼ 3 의 서브컴포넌트가 전부 B 형인 복합체로, 별개로 조제된 HA 복합체 시료이다. HA-3 은 HA1 이 C 형이고 HA2 및 3 이 B 형인 HA 복합체 시료이다. HA-4 는 HA1 및 2 가 B 형이고 HA3 이 C 형인 HA 복합체 시료이다.

[HA 조제·첨가 방법]

HA 의 희석 : 같은 희석 계열에 포함되는 PBS 농도를 동일하게 하기 위해, 2단계 희석을 실시하였다. 먼저, PBS 로 HA 를 단계 희석하고, 다시 배지 (Repro Stem) 를 사용하여 희석하였다. (종농도 : 100, 50, 10, 1 nM)

그리고 bFGF (종농도 5 ng/㎖) 를 추가하여, iPS 세포에 첨가하였다.

[배양 조건]

37 ℃, 5 ％ CO₂ 분위기하

iPS 세포의 계대 후, t = 72 h (day 3) 의 배지 교환에 있어서, HA-1 ∼ 4 를 각 농도로 첨가하여, 24 시간 배양하였다. 그 후, t = 96 h (day 4) 의 배지 교환에 있어서, HA 무첨가 배지로 교체하여, 배양을 계속하였다.

[관찰]

day 3, day 4, day 5, 및 day 9 에 있어서, IN Cell Analyzer 2000 (상품명, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조) 으로 배양 세포를 관찰하고 화상을 취득하였다. HA-1 을 100 nM, 50 nM, 10 nM, 및 1 nM 으로 첨가한 경우의 현미경 관찰 사진을 각각 도 6, 7, 8, 및 9 에 나타낸다.

도 6 에 나타내는 바와 같이, HA-1 을 100 nM 첨가한 경우, day 3 의 시점에서 발생되어 있던 탈미분화 세포는 day 4 이후 관찰할 수 없었다. day 4 에서는 세포 사이에 간극이 생겨, 세포가 약간 길게 늘어난 형태가 되었다. day 5 이후, 간극이 메워져 세포의 형태가 작아지고, 세포끼리 밀집된 부석 모양의 형태가 되며, 콜로니의 확대가 일어났다. day 9 에 있어서, day 5 이후에 발생된 탈미분화 세포를 포함하는 영역이 보였다.

도 7 에 나타내는 바와 같이, HA-1 을 50 nM 첨가한 경우, day 3 ∼ 5 에서는 100 nM 첨가한 경우와 동일하였다. 단, day 9 에 있어서 탈미분화 세포는 보이지 않았다.

도 8 에 나타내는 바와 같이, HA-1 을 10 nM 첨가한 경우, day 4 에서는, day 3 의 시점에서 발생되어 있던 탈미분화 세포가 감소되어 있는 것처럼 보였다. 그러나, day 5 에서 재차 탈미분화 세포의 확대가 일어났다. 이후, 탈미분화 세포의 영역은 확대되었다.

도 9 에 나타내는 바와 같이, HA-1 을 1 nM 첨가한 경우, day 3 이후, day 3 의 시점에서 발생되어 있던 탈미분화 세포의 영역의 확대가 계속되었다. 세포의 형태 변화나 탈미분화 세포의 감소는 보이지 않았다.

HA-2 를 100 nM, 50 nM, 및 1 nM 로 첨가한 경우의 현미경 관찰 사진을 각각 도 10, 11 및 12 에 나타낸다. 도 10 에 나타내는 바와 같이, HA-2 를 100 nM 첨가한 경우에는, HA-1 을 100 nM 첨가한 경우 (도 6) 와 동일하였다. 도 11 에 나타내는 바와 같이, HA-2 를 50 nM 첨가한 경우에는, HA-1 을 50 nM 첨가한 경우 (도 7) 와 동일하였다. 도 12 에 나타내는 바와 같이, HA-2 를 1 nM 첨가한 경우에는, HA-1 을 1 nM 첨가한 경우 (도 9) 와 동일하였다.

HA-1 및 HA-2 의 결과를 하기 표 2 에 정리한다. 표 2 에 나타내는 바와 같이, HA-1 및 HA-2 는 100 nM 및 50 nM 첨가한 경우, day 3 의 시점에서 발생되어 있던 탈미분화 세포가 축소 및/또는 소멸되었다.

도 13 에, 계대시에 도입된 탈미분화 세포에 대한 HA-2 의 영향을 관찰한 결과를 나타낸다. 동 도면에 나타내는 바와 같이, HA-2 를 100 nM 로 첨가하여 24 시간 처리하면, 탈미분화 세포가 서서히 박리되었다.

HA-3 을 50 nM, 및 10 nM 로 첨가한 경우의 현미경 관찰 사진을 각각 도 14, 및 15 에 나타낸다.

도 14 에 나타내는 바와 같이, HA-3 을 50 nM 첨가한 경우, day 3 의 시점에서 발생되어 있던 탈미분화 세포 영역의 확대가 멈추고, day 4 이후, 탈미분화 세포의 증식과 함께 탈미분화 세포 영역은 축소되어 갔다. day 9 에 있어서, 콜로니의 중심의 일부에 탈미분화 세포가 남았다. day 4 에 있어서, iPS 세포 사이에 간극이 생겨, iPS 세포의 모양이 약간 길게 늘어난 형태가 되었다. day 5 이후, iPS 세포의 증식에 수반하여, 세포끼리 밀집된 부석 모양의 형태의 iPS 세포로 구성된 콜로니가 되었다. 한편, 피더 세포의 박리가 일어났다. 또, HA-3 을 100 nM 첨가한 경우도, HA-3 을 50 nM 첨가한 경우와 동일한 결과가 얻어졌다.

도 15 에 나타내는 바와 같이, HA-3 을 10 nM 첨가한 경우, day 3 이후, 탈미분화 세포의 영역의 확대가 계속되었다. 세포의 형태 변화, 탈미분화 세포의 감소, 및 피더 세포의 박리는 관찰할 수 없었다.

HA-4 를 100 nM, 50 nM, 및 10 nM 로 첨가한 경우의 현미경 관찰 사진을 도 16 에 나타낸다. 동 도면에 나타내는 바와 같이, day 3 의 시점에서 발생되어 있던 탈미분화 세포의 영역의 확대가 계속되었다. 그러나, HA-4 가 100 nM 인 경우, 탈미분화 세포 영역의 축소가 일어나 있을지도 모른다.

HA-3 및 HA-4 의 결과를 하기 표 2 에 정리한다.

상기 표 2 에 나타내는 바와 같이, HA-1 및 HA-2 의 경우, HA-3 및 4 의 경우보다 효율적으로 탈미분화 세포의 영역이 축소 및 또는 소멸되었다. 또한, HA-3 의 경우, HA-4 의 경우보다 효율적으로 탈미분화 세포의 영역이 축소 및 또는 확대 억제되었다.

[피더 세포가 iPS 세포에 미치는 영향]

피더 세포 상에 iPS 세포를 파종하고, 7 일 후까지 24 시간마다 유지 배지로 배지 교환하였다. 배양 후, 배양된 세포의 Oct3/4 의 발현을 면역 세포 염색법으로 확인하고, 또한 DAPI 염색을 실시하였다. 사용한 세포, 배지, 및 배양 조건은 다음과 같다.

[세포]

iPS 세포 : Tic (Np 39)

피더 세포 : MEF

[배지]

iPS 세포 : Repro Stem (상품명, Repro CELL 사 제조), 5 ng/mL FGF-2

피더 세포 : DMEM (7 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-streptomycin solution)

[용기]

24 웰 플레이트 (바닥 면적 : 1.9 ㎠/웰, 배지량 : 0.4 mL/웰)

[배양 조건]

37 ℃, 5 ％ CO₂ 분위기하

[관찰]

day 3 및 day 7 에 있어서, IN Cell Analyzer 2000 (상품명, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조) 으로 배양 세포를 관찰하고 화상을 취득하였다. 얻어진 현미경 관찰 사진을 도 17 에 나타낸다.

도 17 에 나타내는 바와 같이, 미분화 일탈 세포는 콜로니의 외연부 (외측) 에 발생하였다.

다음으로, 배양 개시로부터 3 일 후 (day 3) 에, 유주 저해제인 Rac-1 inhibitor (상품명 : NSC23766, Calbiochem 사 제조) 를 50, 100 또는 150 μM 첨가한 것 이외에는, 상기와 동일하게 하여 세포 배양 및 관찰을 실시하였다. 얻어진 현미경 관찰 사진을 도 17 에 나타낸다.

[Rac-1 inhibitor 조제·첨가 방법]

Rac-1 inhibitor 희석 : 배지 (Repro Stem) 를 사용하여 희석하였다 (종농도 : 50 또는 100 μM).

그리고 bFGF (상품명, Repro CELL 사 제조, 종농도 5 ng/㎖) 를 추가하여, iPS 세포에 첨가하였다.

도 17 에 나타내는 바와 같이, Rac-1 inhibitor 미첨가의 경우에는 콜로니 외연부에 발생한 미분화 일탈 세포가, 유주 저해제인 Rac-1 inhibitor 를 첨가함으로써 콜로니 중앙부에 발생하였다. 세포 유주를 저해함으로써 미분화 일탈 세포를 콜로니 중앙부에 발생시킬 수 있었다. 따라서, 세포의 유주를 저해함으로써 미분화 일탈 세포를 콜로니 중앙부에 발생시킬 수 있고, 이것에 의해 미분화 일탈 세포를 제거할 수 있음이 시사되었다.

피더 세포로서 SNL 피더 세포를 사용하고, Rac-1 inhibitor (50 또는 100 μM) 를 배양 개시로부터 3 일 후 (day 3) 에 첨가하여 배양을 실시한 결과, Rac-1 inhibitor 미첨가의 경우와 마찬가지로, 미분화 일탈 세포는 콜로니 중앙부에 발생하였다 (date not shown).

[헤마글루티닌 (HA) 이 iPS 세포에 미치는 영향 (그 2)]

Rac-1 inhibitor 에 의해서 유도된 미분화 일탈 세포에 미치는 HA 의 영향을 확인하였다. 먼저, 피더 세포 상에 iPS 세포를 파종하고 (day 0), 24 시간마다 유지 배지로 배지 교환하였다. 3 일 후 (day 3) 에 있어서 100 μM Rac-1 inhibitor 를 첨가하여 24 시간 인큐베이트하고, PBS 로 2 번 세정하여 유지 배지로 배지 교환하였다 (day 4). 5 일 후 (day 5) 에 있어서 HA-1 을 첨가하여 24 시간 인큐베이트하고, PBS 로 2 번 세정하여 유지 배지로 배지 교환하였다 (day 6). 그 후, 8 일 후 (day 8) 까지 24 시간마다 유지 배지로 배지 교환하였다. 배양 후, 배양된 세포의 Oct3/4 의 발현을 면역 세포 염색법으로 확인하고, 또한 DAPI 염색을 실시하였다. 사용한 세포, 배지, 및 배양 조건은 다음과 같다. Rac-1 inhibitor 및 HA 의 조제 및 첨가 방법은 전술한 바와 동일하게 하였다.

[세포]

iPS 세포 : Tic (Np 39)

피더 세포 : MEF

[배지]

iPS 세포 : Repro Stem (상품명, Repro CELL 사 제조), 5 ng/mL bFGF (상품명, Repro CELL 사 제조)

피더 세포 : DMEM (10 ％ FBS (GIBCO 사 제조), 1 ％ HEPES (sigma 사 제조), 1 ％ Penicillin-streptomycin (NACALAI TESQUE 사 제조))

[용기]

24 웰 플레이트 (바닥 면적 : 1.9 ㎠/웰, 배지량 : 0.4 mL/웰)

[관찰]

day 3, day 4, day 5, day6, 및 day 8 에 있어서, IN Cell Analyzer 2000 (상품명, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조) 으로 배양 세포를 관찰하고 화상을 취득하였다. 얻어진 현미경 관찰 사진을 도 18 에 나타낸다.

control 로서, HA-1 를 첨가하지 않은 것 이외에는, 상기와 동일한 배양 및 관찰을 실시하였다. 얻어진 현미경 관찰 사진을 도 18 에 나타낸다.

도 18 에 나타내는 바와 같이, Rac-1 inhibitor 의 첨가에 의해 콜로니 중심부에 발생되어 있던 미분화 일탈 세포를 포함하는 영역이, HA 의 첨가에 의해 축소 및/또는 소멸된 것이 확인되었다.

[피더리스 배양이 iPS 세포에 미치는 영향]

배양면으로서 Synthemax Surface (상품명, Corning 사 제조) 를 사용하고, 그 위에 iPS 세포를 파종하여, 7 일 후까지 24 시간마다 유지 배지로 배지 교환하였다. 배양 후, 배양된 세포의 Oct3/4 의 발현을 면역 세포 염색법으로 확인하고, 또한 DAPI 염색을 실시하였다. 사용한 세포, 배지, 및 배양 조건은 다음과 같다.

[세포]

iPS 세포 : Tic (Np 39)

[배지]

mTeSR(R)1 medium (상품명, STEMCELL Technologies 사 제조)

[용기]

24 웰 플레이트 (바닥 면적 : 1.9 ㎠/웰, 배지량 : 0.4 mL/웰)

[배양 조건]

37 ℃, 5 ％ CO₂ 분위기하

[관찰]

day 6 에 있어서, IN Cell Analyzer 2000 (상품명, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조) 으로 배양 세포를 관찰하고 화상을 취득하였다.

피더리스 배양의 경우도 MEF 피더 세포와 동일하게, 미분화 일탈 세포는 콜로니의 외연부 (외측) 에 발생하였다.

이어서, 배양 개시로부터 3 일 후 (day 3) 에, Rac-1 inhibitor 를 100 또는 150 μM 첨가한 것 이외에는, 상기와 동일하게 하여 세포 배양 및 관찰을 실시하였다. 얻어진 현미경 관찰 사진을 도 19 에 나타낸다. 도 19 는 Rac-1 inhibitor 가 150 μM 인 경우의 현미경 관찰 사진이다. 도 19 에 나타내는 바와 같이, Rac-1 inhibitor 를 첨가함으로써, 미분화 일탈 세포는 콜로니 중앙부에 발생시킬 수 있었다. 이로써, 피더리스 배양의 경우에도 세포 유주를 저해함으로써 미분화 일탈 세포를 콜로니 중앙부에 발생시킬 수 있고, 이것에 의해 미분화 일탈 세포를 제거할 수 있음이 시사되었다.

[헤마글루티닌 (HA) 이 iPS 세포에 미치는 영향 (그 3)]

세포로서 이하의 세포 1 또는 2 를 사용하고, HA 로서 HA-1 을 사용하고, HA 의 첨가 농도를 50 nM 로 한 것 이외에는, 헤마글루티닌 (HA) 이 iPS 세포에 미치는 영향 (그 1) 과 동일한 조건으로, 배양 및 관찰을 실시하였다. 얻어진 현미경 관찰 사진을 각각 도 20 에 나타낸다.

[세포 1]

[세포]

iPS 세포 : 201B7 주

피더 세포 : SNL76/7 세포

[배지]

iPS 세포 : Repro Stem (상품명, Repro CELL 사 제조)

피더 세포 : DMEM (7 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-streptomycin solution)

[세포 2〕

[세포]

iPS 세포 : 454E-2 주

피더 세포 : SNL76/7 세포

[배지]

iPS 세포 : Repro Stem (상품명, Repro CELL 사 제조)

피더 세포 : DMEM (7 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-streptomycin solution)

도 20 에 나타내는 바와 같이, 미분화 일탈 세포를 포함하는 콜로니는, HA 를 첨가하면, 탈미분화 세포의 영역이 축소 및 또는 소멸되었다.

[헤마글루티닌 (HA) 이 계대에 미치는 영향]

도 21 에 나타내는 실험 스케줄에 따라서 iPS 세포를 계대 배양하였다. 먼저, 피더 세포 상에 iPS 세포를 파종하고 (day 0), 24 시간마다 유지 배지로 배지 교환하였다. 3 일 후 (day 3) 에 있어서 HA 를 50 nM 첨가하여 24 시간 인큐베이트하고, PBS 로 2 번 세정하여 유지 배지로 배지 교환하였다 (day 4). 그 후, 10 일 후 (day 10) 까지 24 시간마다 유지 배지로 배지 교환하였다. 배양 후, 통상적인 조작으로 계대를 실시하고, 계대로부터 3 일 후 (day 13) 에 있어서 HA 를 50 nM 첨가하여 24 시간 인큐베이트하고, PBS 로 2 번 세정하여 유지 배지로 배지 교환하였다 (day 14). 그 후, 10 일간의 배양, 계대, HA 의 첨가 및 배양 (10 일간) 을 실시하였다. 배양된 세포의 Oct3/4 의 발현을 면역 세포 염색법으로 확인하고, 또한 DAPI 염색을 실시하였다. 사용한 세포, 배지, 및 배양 조건은 다음과 같다. HA 로는 HA-1 을 사용하였다.

[세포]

iPS 세포 : Tic (Np 39)

피더 세포 : SNL 76/7 (Np 5) 미토마이신 c 처리를 마친 것

[배지]

iPS 세포 : Repro Stem (상품명, Repro CELL 사 제조), 5 ng/mL FGF-2

피더 세포 : DMEM (7 ％ FBS, 1 ％ Penicillin-streptomycin solution)

[용기]

24 웰 플레이트 (바닥 면적 : 1.9 ㎠/웰, 배지량 : 0.4 mL/웰)

[HA 조제·첨가 방법]

HA 의 희석 : 같은 희석 계열에 포함되는 PBS 농도를 동일하게 하기 위해, 2단계 희석을 실시하였다. 먼저, PBS 로 HA 를 단계 희석하고, 다시 배지 (Repro Stem) 를 사용하여 희석하였다. (종농도 : 50 nM)

[배양 조건]

37 ℃, 5 ％ CO₂ 분위기하

iPS 세포의 계대 후, t = 72 h (day 3) 의 배지 교환에 있어서, HA 를 각 농도로 첨가하여, 24 시간 배양하였다. 그 후, t = 96 h (day 4) 의 배지 교환에 있어서, HA 무첨가 배지로 교체하여, 배양을 계속하였다.

[관찰]

day 3, day 4, day 10, day 13, day 14, day 20, day 23, day 24 및 day 30 에 있어서, IN Cell Analyzer 2000 (상품명, GE 헬스케어 바이오사이언스사 제조) 으로 배양 세포를 관찰하고 화상을 취득하였다. 또한, 형성된 콜로니 및 미분화 콜로니 (미분화 세포로 형성되고, 미분화 일탈 세포를 포함하지 않은 콜로니) 의 수를 계측하여, 미분화 콜로니의 비율을 산출하였다. 그 결과를 도 22 에 나타낸다.

비교예로서, HA 를 첨가하지 않은 것 이외에는 동일한 조건으로 계대 배양을 실시하였다. 그 결과를 도 22 에 나타낸다.

도 22 에 있어서, 흰 원이 HA 를 첨가한 계, 검은 원이 HA 를 첨가하지 않은 계를 나타낸다. 도 22 에 나타내는 바와 같이, HA 를 첨가함으로써, HA 를 첨가하지 않은 경우와 비교하여 계대 배양 후에 형성되는 미분화 콜로니의 비율이 증가하였다. 요컨대, 미분화 일탈 세포를 제거함으로써, 미분화 콜로니를 효율적으로 형성할 수 있었다.

Claims

다능성 (pluripotency) 을 갖는 줄기세포의 배양 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법.
다능성 (pluripotency) 을 갖는 줄기세포의 배양 중에 발생한 또는 발생할 수 있는 미분화 상태를 벗어난 세포를 제거하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법.
다능성 (pluripotency) 을 갖는 줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 방법으로서, 세포간 접착을 저해 가능한 물질의 존재하에서 세포 배양하는 것을 포함하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
다능성을 갖는 줄기세포가 인간 다능성 (pluripotent) 줄기세포인 방법.
제 4 항에 있어서,
인간 다능성 줄기세포가 인간 iPS 세포 또는 인간 ES 세포인 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포간 접착을 저해 가능한 물질이 E-카데린의 기능 저해 활성을 갖는 물질인 방법.
제 6 항에 있어서,
세포간 접착을 저해 가능한 물질이 추가로 세포 표면에 대한 결합능을 갖는 물질인 방법.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포간 접착을 저해 가능한 물질이 보툴리누스균 (Clostridium botulinum) 의 신경 독소 복합체에 있어서의 헤마글루티닌 (HA) 인 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
세포간 접착을 저해 가능한 물질이 보툴리누스균의 신경 독소 복합체에 있어서의 3 개의 헤마글루티닌 서브컴포넌트 HA1, HA2, 및 HA3 으로 이루어지는 군에서 선택되는 2 또는 3 성분으로 구성된 복합체인 방법.
제 9 항에 있어서,
상기 복합체의 HA3 서브컴포넌트는 A 형 또는 B 형의 보툴리누스균의 것인 방법.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
배양이 계대 배양인 방법.
세포간 접착을 저해 가능한 물질을 함유하는 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 위한 조성물.
다능성을 갖는 줄기세포용의 배지 성분과, 세포간 접착을 저해 가능한 물질을 포함하는 키트.
제 13 항에 있어서,
제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 위한 키트.