WO2014069645A1 - ヌクレオシドアナログ誘導体およびその利用 - Google Patents

ヌクレオシドアナログ誘導体およびその利用 Download PDF

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WO2014069645A1
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adap
dna
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茂貴 佐々木
陽祐 谷口
慶太郎 深堀
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国立大学法人九州大学
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    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound and use thereof.
  • the present invention relates to a method for amplifying and detecting a damaged base site for specifying the occurrence position of oxidatively damaged base 8-oxo-dG generated in a genome, and can selectively recognize 8-oxo-dG in a DNA strand.
  • the present invention relates to a fluorescent probe.
  • 8-Oxo-deoxyguanosine (8-oxo-dG) is one of the DNA damaging bodies produced from deoxyguanosine (dG) or deoxyguanosine triphosphate (dGTP) depending on the reactive oxygen species in the living body, and is an aging, neurodegenerative disease or oxidative stress. The association is suggested.
  • Patent Document 1 Non-Patent Documents 1 and 2
  • Adap already developed by the present inventors is effective only when the location of 8-oxo-dG in DNA is specified.
  • techniques for sequencing DNA containing 8-oxo-dG or identifying the location of 8-oxo-dG have not been developed.
  • the detection of 8-oxo-dG in the telomeric region, which is a single-stranded DNA showed that the ability of Adap to discriminate between 8-oxo-dG and dG fell slightly.
  • 8-OxoG-clamp already developed by the present inventors can distinguish 8-G-dG and dG effectively in an organic solvent because the molecular recognition ability is mainly performed by hydrogen bonding. Recognition has not yet been achieved. At present, only antibodies can discriminate 8-oxo-dG in water.
  • an object of the present invention is to create a molecule capable of effectively distinguishing 8-oxo-dG and dG even when present in DNA.
  • Adap adenosine-1,3-diazaphenoxazine
  • Adap forms a very stable double-stranded DNA only when 8-oxo-dG is in a complementary position in the DNA, and even by specific fluorescence quenching, 8-apo-dG and dG in DNA The distinction was successful. Furthermore, by creating an OFF-to-ON probe using a strand exchange reaction, we have succeeded in developing a detection probe that emits fluorescence only when 8-oxo-dG is present in DNA.
  • the present invention is as follows (1) to (16).
  • R 1 is an oligodeoxynucleotide group 1 (ODN group 1)
  • R 2 is an oligodeoxynucleotide group 2 (ODN group 2).
  • the oligodeoxynucleotide according to (1) for detection of 8-oxodeoxyguanosine (8-oxo-dG).
  • (4) comprising a step of hybridizing the oligodeoxynucleotide according to any one of (1) to (3) to a target DNA containing 8-oxo-dG, wherein the oligodeoxynucleotide is at least 8 of the target DNA.
  • Detect target DNA containing 8-oxo-dG which contains an Adap nucleoside analog at a position complementary to oxo-dG, whereby the oligodeoxynucleotide selectively hybridizes to the target DNA Method.
  • the oligodeoxynucleotide (hereinafter referred to as the first oligodeoxynucleotide) according to (1), which is labeled on one side of the fluorescent substance or the quencher substance and consists of the base sequence A, and labeled on the other side of the fluorescent substance or the quencher substance
  • a second oligodeoxynucleotide (hereinafter referred to as a second oligodeoxynucleotide) comprising a natural nucleotide at a position complementary to the Adap nucleoside analog, comprising a base sequence B complementary to the base sequence A,
  • a double-stranded oligodeoxynucleotide probe comprising at least
  • R 3 is H, a 3′-hydroxyl-protecting group, or —P (OR 5 ) R 6 , wherein R 5 is a phosphate group-protecting group, and R 6 is A dialkylamino group in which two identical or different alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms are bonded on a nitrogen atom, and R 4 is H or a protecting group for a 5′-hydroxyl group.
  • R 3 is —P (OR 5 ) R 6 , wherein R 5 is a methyl group, a 2-cyanoethyl group or a 2-trimethylsilylethyl group, R 6 is a diisopropylamino group, 4.
  • R 7 is H or a 3′-hydroxyl protecting group
  • R 8 is represented by the following formula.
  • the present invention improves the recognition ability of Adap, which is an 8-oxo-dG recognition molecule in DNA, and identifies the location in the DNA sequence.
  • Adap which is an 8-oxo-dG recognition molecule in DNA
  • DAdapTP which is the triphosphate form of Adap
  • DAdapTP is incorporated into DNA by an enzyme only when 8-oxo-dG is present at a complementary position.
  • dC or dA is incorporated into the 8-oxo-dG partner, so that 8-oxo-dG sequence information is lost.
  • dAdapTP the position of 8-oxo-dG is lost. Information can be left in the DNA.
  • FIG. 1 (a) shows the sequences of a fluorescent (FAM) -labeled primer strand and template strand used to evaluate the incorporation of dAdapTP into the primer strand.
  • FIG. 1 (b) is a diagram showing the results of evaluating the incorporation of dAdapTP into the primer strand.
  • FIGS. 2 (a) and 2 (b) are diagrams showing changes in fluorescence spectra due to addition of TBDMS-protected 8-oxo-dG and dG in CHCl 3 to TBDMS-protected 2-amino Adap (3).
  • FIGS. 1 (a) shows the sequences of a fluorescent (FAM) -labeled primer strand and template strand used to evaluate the incorporation of dAdapTP into the primer strand.
  • FIG. 1 (b) is a diagram showing the results of evaluating the incorporation of dAdapTP into the primer strand.
  • FIGS. 4 (a) and 4 (b) are diagrams showing changes in the fluorescence spectrum due to the addition of TBDMS-protected 8-oxo-dG and dG in TEAA / CHCl 3 to TBDMS-protected 2-amino Adap (3).
  • FIGS. 4 (a) and 4 (b) show a 13 nPy, 5′-ctttct X ctccttt-3 ′ (SEQ ID NO: 1) 50 nM solution incorporating 2-amino Adap, dG at the Y position, and 8-oxo-dG.
  • FIGS. 6A and 6B are diagrams in which fluorescence quenching was measured by dropping a 30-mer ODN buffer solution into a 100 nM buffer solution containing 2-amino Adap (ODN3).
  • FIGS. 8 (a) and (b) show 8-oxo-dG in DNA extracted from cells treated with an aqueous solution of H 2 O 2 using a probe labeled with Cy5 or Cy3 and a compound of the present invention (dAdapTP). It is a figure which shows the detected result.
  • the present invention is a triphosphate that can be incorporated into a oligonucleotide as a novel Adap derivative by a polymerase.
  • the base sequence and the number of bases are not particularly limited unless otherwise specified, and the base sequence is the base sequence of the target nucleic acid as necessary.
  • the number of bases can be a number capable of hybridizing with the target nucleic acid.
  • nucleic acid refers to DNA or RNA unless otherwise specified. In the present invention, “nucleic acid” is preferably DNA unless otherwise specified.
  • an “oligodeoxynucleotide group (ODN group)” means an oligodeoxynucleotide moiety that is bound to or can be bound to an adjacent group at the 3 ′ end or 5 ′ end, unless otherwise specified. Point to.
  • both ODN group 1 and ODN group 2 have a phosphate group at the end, and the phosphate group has It may also be an oligodeoxynucleotide moiety that can bind to an adenosine-1,3-diazaphenoxazine (Adaposine-1, Adap) nucleoside analog moiety.
  • Adap oligodeoxynucleotide
  • ODN group 1 and ODN group 2 are each independently preferably 5 to 100 bases in length, and more preferably 10 to 30 bases in length.
  • ODN group 1 and ODN group 2 can be synthesized from the compound of the present invention, which is a DNA synthesis precursor, by an automatic nucleic acid synthesizer using the phosphoramidite method.
  • R 1 and / or R 2 are a hydroxyl-protecting group, they can be independently selected from the conventional hydroxyl-protecting groups.
  • Specific examples include TBDMS (sometimes referred to as TBS) (tert-butyldimethylsilyl) group, DMTr (4,4′-dimethoxytrityl) group, TBDPS (tert-butyldiphenylsilyl) group, TES (triethylsilyl) group Group, TIPS (triisopropylpropyl) group, DMES (dimethylethylsilyl) group, THP (tetrahydropyranyl) group, EE (ethoxyethyl) group, MOM (methoxymethyl) group, Bn (benzyl) group.
  • TBS tert-butyldimethylsilyl
  • DMTr 4,4′-dimethoxytrityl
  • TBDPS tert-butyldiphenylsilyl
  • the hydroxyl protecting group in R 1 and R 2 is preferably a TBDMS group, and when R 1 is —P (OR 3 ) R 4 , a particularly preferred example of R 2 is a DMTr group.
  • R 1 in formula (I) may be —P (OR 3 ) R 4 .
  • R 3 is a protecting group for a phosphoric acid group, and the protecting group for the phosphoric acid group can be appropriately selected from the protecting groups of the prior art as long as it is used in the boss-holamidite method. Specific examples are a methyl group, a 2-cyanoethyl group, and a 2-trimethylsilylethyl group.
  • R 4 is a dialkylamino group in which two identical or different alkyl groups having 1 to 6 carbon atoms are bonded to the nitrogen atom.
  • dialkylamino group are a diethylamino group, a diisopropylamino group, and a dimethylamino group.
  • Two alkyl groups may be bonded to each other to form a ring.
  • An example of this is the morpholin-1-yl group.
  • R 3 in formula (II) is —P (OR 5 ) R 6 is also synonymous with —P (OR 3 ) R 4 in R 1 in formula (I).
  • those of -P (OR 3 ) R 4 can be used as a DNA synthesis precursor.
  • the compounds of the present invention that are DNA synthesis precursors particularly preferred examples are as follows. belongs to.
  • 8-oxo-dG and dG are relatively distinguished when 8-oxoG-cLamp is incorporated at the end of double-stranded DNA. It has also been found that 8-oxoG-cLamp and 8-oxo-dG are maintained even when the benzyloxycarbonyl group is replaced with a 2-aminopyridin-6-yl group.
  • the advantage of this molecular design is that the 8-oxo-dG to be recognized targets a special conformation that can be taken in DNA. That is, in general, anti-conformation is preferred for dG in DNA, but 8-oxo-dG has a repulsion between the oxygen atom at the 8-position and the phosphate of the backbone, and can be in a syn-conformation.
  • Adap itself is expected to prioritize the anti-conformation, and this conformation expected the effective formation of multi-point hydrogen bonds with the syn-conformation 8-oxo-dG.
  • this conformation expected the effective formation of multi-point hydrogen bonds with the syn-conformation 8-oxo-dG.
  • anti-conformational dG in order for anti-conformational dG to form a complex with Adap, conversion to an unstable syn-conformation is required.
  • destabilization occurs due to electron repulsion between the 7th nitrogen atom of dG and the 1st nitrogen atom of Adap.
  • Adap is expected to have an advantageous interaction with 8-oxo-dG in DNA, whereas many adverse factors are expected with dG, and effective discrimination in DNA is achieved. It is considered a thing.
  • TBDMS protecting group of 5 was deprotected with TBAF to give 6 and reacted with DMTrCl in pyridine to protect the 5′-hydroxyl group, 2-cyanoethyl-N, N′-diisopropylchlorophosphoramidite (2- A ⁇ -phosphoramidite body (7), which is a DNA synthesis precursor, can be obtained by reaction with Cyanoethyl-N, N′-diisopropylchlorophosphodiamidite).
  • the CH 3 CN solution of (7) was incorporated into ODN (oligonucleotide oxytide) using a solid phase DNA synthesizer.
  • ODN oligonucleotide oxytide
  • the ODN synthesized in this way was used for the evaluation of 8-oxo-dG recognition ability in DNA (see Examples).
  • the oligodeoxynucleotide (Adap-containing ODN) represented by the formula (I) has the following functions. (1) A double strand and a complementary strand having 8-oxo-dG are formed at a position corresponding to Adap and stabilized (increase in melting temperature Tm). (2) It is possible to distinguish between dG and 8-oxo-dG in DNA. (3) Quench the fluorescent label during double strand formation. Based on such functions, the Adap-containing ODN of the present invention can be used for detection of 8-oxo-dG in nucleic acids.
  • the Adap-containing ODN recognizes 8-oxodG by multipoint hydrogen bonding and can be used as an artificial nucleic acid that can be detected by specific fluorescence quenching (Y. Taniguchi, R. Kawaguchi, S. Sasaki, (J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 7272-7275) can also be used to enhance fluorescence when a target sequence is detected (Y. Taniguchi, Y. Koga, K. Fukabori). R. Kawaguchi, S. Sasaki, Bioorg. Med. Chem. Lett. Ln press, Available on Line 4 November 2011).
  • the Adap-containing ODN (sometimes referred to as “first deoxyoligonucleotide”) labeled with one of the fluorescent substance or the quencher substance, and the base labeled with the other fluorescent substance or the quencher substance. It consists of a base sequence B complementary to sequence A, but can also be used as a double-stranded probe comprising at least a second oligodeoxynucleotide containing a natural nucleotide at a position complementary to an Adap nucleoside analog. .
  • a diagram illustrating this concept is shown below.
  • fluorescent substance refers to a substance that can emit fluorescence unless otherwise specified.
  • quencher substance refers to a substance that is an excitation energy absorber and has a function of suppressing fluorescence of a nearby fluorescent substance, unless otherwise specified.
  • a fluorescent substance and a quencher substance are used in combination.
  • This combination is not particularly limited as long as the desired effect can be exhibited, but can be selected with reference to a combination of a fluorescent substance and a quencher substance used in real-time PCR or the like.
  • Examples include FAM and IBFQ, FAM and TAMRA, TET and IBFQ, HEX and IBFQ, Cy5 and IBFQ, FAM and BHQ1 or 2, TET and BHQ1 or 2, HEX and BHQ1 or 2, MAXNHS ester and IBFQ, MAXNHS ester and BHQ1 or 2, Cy3 and IBRQ, Cy3 and BHQ2, TYE563 and IBRQ, TYE563 and BHQ2, TEX615 and IBRQ, TEX615 and BHQ2, Cy5 and IBRQ, Cy5 and BHQ2, HTY665 and TYE665 Esters, JOENHS esters and IBFQ, JOENHS esters and BH 1 or 2, TAMRANHS esters and IBRQ, TAMRANHS esters and BHQ2, ROXNHS esters and IBRQ, ROXNHS esters and BHQ2, Texas Red-XNHS esters and IBRQ, and Texas Red-XNHS ester and BHQ2
  • 8-oxo-dG in DNA generated in vivo is removed as a nucleoside by a repair enzyme, but some of the repair mechanism escapes mutation, which may cause disease. It is aged to lead to the occurrence of abnormal genes.
  • the present invention can be used to detect an oxidative mutation of guanine in a nucleic acid, and more specifically to detect 8-oxo-dG in DNA. Such detection is useful for the study of diseases or conditions associated with oxidative mutations of guanine in DNA.
  • the DNA to be detected can be DNA in a living cell or DNA contained in a sample derived from a living body.
  • detection method refers to a method for evaluating the presence and / or abundance of 8-oxo-dG as a target, unless otherwise specified.
  • the Sanger-Dideoxy method is a method of synthesizing a complementary strand DNA of a DNA (template DNA) whose base sequence is to be examined using a DNA synthase, and determining the base sequence of the original DNA by examining the base sequence. is there.
  • Adap's triphosphate The synthesis of Adap's triphosphate was summarized in Scheme 1. First, the 5′-position hydroxyl group of the Adap diol is protected with a dimethoxytrityl group, and then the 3′-position hydroxyl group is acetylated with acetic anhydride, and then the 5′-position DMTr group is deprotected with trichloroacetic acid. Obtainable.
  • 2-chloro-4-H-1,3,2-benzodioxaphospholin-4-one (2-Chloro-4-H-1,3,2-benzodiophorophorin-4-one) was added to the 5′-position hydroxyl group.
  • tributylammonium pyrophosphate Tributyl ammonium pyrophosphate
  • tributylamine Tributylamine
  • the solvent was distilled off under reduced pressure, 0.3 mL of water, 1.0 mL of ethanol and 0.033 mL of 3M NaCl aqueous solution were added to the residue, the supernatant was removed, and the residue was dissolved in water and purified by HPLC.
  • the solvent was freeze-dried, dissolved in water, and treated with Na ion exchange resin to obtain a pale yellow solution (6.5 mM, 0.0078 mmol, 16%).
  • the analysis results are shown below.
  • DAdapTP was incorporated into the primer strand at a rate of 79.0% when 8-oxo-dG was present at the complementary position of the template, and only 18.7% was incorporated when dG. From this, it was confirmed that dAdapTP becomes a substrate for the chain extension reaction by polymerase (Klenow Fragment) and is well incorporated into the DNA strand at the time of 8-oxo-dG.
  • the reaction was started by adding the same amount (5 ⁇ L) of dNTP (0.2 to 70 ⁇ M) that had been allowed to stand at 37 ° C. in advance. After 1 to 10 minutes, loading buffer (formamide, 0.1 M EDTA, bromophenol blue) ) To stop the reaction. Separation was performed on a 15% polyacrylamide gel, the fluorescence band of FAM was observed, the intensity was quantified, and the uptake amount was calculated.
  • loading buffer formamide, 0.1 M EDTA, bromophenol blue
  • Steady-State kinetics values were calculated by Hanes-Wool Plot using the enzyme amount and reaction time, and the value of the uptake portion of 1 to 20%. Vmax, Km, and each uptake efficiency (Efficiency (% min -1 M -1 ) was examined and the results are shown below.
  • Table 1 shows the results of evaluation of dAdapTP and dATP uptake efficiency using the primer strand (SEQ ID NO: 9) and template strand (SEQ ID NO: 10) shown below.
  • dAdapTP was shown to be taken in best when T is located at a complementary position, but the uptake efficiency with respect to T is slightly reduced compared to the dATP result. This is thought to be due to the fact that the phosphate bond formation reaction after recognition by the enzyme was delayed.
  • Table 2 shows the results of using the primer strand (SEQ ID NO: 9) shown below and the template strand (SEQ ID NO: 10) using Adap or dA.
  • Table 3 shows the results of evaluating the single-base insertion reaction after dAdapTP was incorporated using the primer strand (SEQ ID NO: 12) and template strand (SEQ ID NO: 10) shown below.
  • the Adap-dG pair cannot form a base pair well and is distorted in the structure. Occurs, suggesting that the elongation reaction is reduced.
  • AdapTP is effectively incorporated into 8-oxo-dG by distinguishing between complementary strands 8-oxo-dG and dG, and further incorporated Adap is effectively differentiated from oxodGTP and dG. It was confirmed that it was taken up by the enzyme.
  • Compound 3 was used for evaluation of molecular recognition in an organic solvent.
  • Compound 4 can be obtained by protecting the 2-position amino group with a Pac group and deprotecting the hydroxyl protecting group with TBFA.
  • the CH 3 CN solution of (5) was incorporated into ODN (oligonucleotide nucleotide) using a solid phase DNA synthesizer.
  • ODN oligonucleotide nucleotide
  • the ODN synthesized in this way was used for evaluation of 8-oxo-dG recognition ability in DNA.
  • reaction solution was diluted with AcOEt, washed successively with saturated aqueous NaHCO 3 solution and saturated brine, dried over Na 2 SO 4 , and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • This compound was azeotroped twice with pyridine, dissolved in 3.5 mL of dichloromethane, and cooled in an ice bath. Under an argon atmosphere, DIPEA (0.192 mL, 1.104 mmol) and 2-cyanoethyl-N, N′-diisopropylchlorophosphodiamidite (0.123 mL, 0.552 mmol) were added in this order and allowed to react for 1 hour.
  • reaction solution was diluted with AcOEt, washed successively with saturated aqueous NaHCO 3 solution and saturated brine, dried over Na 2 SO 4 , and the solvent was distilled off under reduced pressure.
  • ODN1 (13Pu): 5′-agagg X Xagaag-3 ′ (SEQ ID NO: 7), calcd: 4358.86, found: 4358.34 (M ⁇ H)
  • ODN2 (13Py): 5′-ctttct X ctcctt-3 ′ (SEQ ID NO: 1), calcd: 4095.67, found: 4096.78 (M ⁇ H)
  • ODN3 5′-ccctaacc X taacta-3 ′ (SEQ ID NO: 4), calcd: 4733.85, found: 4732.88 (M ⁇ H)
  • ODN4 5′-ccctaac X ctaacta-3 ′ (SEQ ID NO: 6), calcd: 4733.85, found: 4735.65 (M ⁇ H)
  • TBDMS-protected 2-amino Adap (3) showed changes in fluorescence spectrum due to titration of TBDMS-protected 8-oxo-dG and dG in CHCl 3 .
  • the results are shown in FIGS. 2 (a) and 2 (b) and FIGS. 3 (a) and 3 (b).
  • TBDMS-protected amino-Adap (3) has a stronger fluorescence quenching effect than when dG is added to TBDMS-protected 8-oxo-dG in CHCl 3. Was observed.
  • the TBDMS protected amino-Adap (3) was quenched to 33BD MTEAA / CHCl 3 adjusted to pH with TBDMS protected 8-oxo-dG equivalent to that in CHCl 3. The effect was shown. On the other hand, the ratio of quenching decreased for TBDMS-protected dG, suggesting that 2 amino-Adap is more strongly bound to 8-oxo-dG.
  • the 13 Pu buffer solution was dropped into 13 Py 50 nM buffer solution (100 mM NaCl, 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, 30 ° C.).
  • the 13Pu concentration in the solution was 0 or 50 nM.
  • the fluorescence intensity of 2-aminoAdap incorporated in the pyrimidine chain itself is weak, and when a Pu 8-oxo-dG chain is added, further quenching action is observed. It was done. On the other hand, when the PudG chain was added, recovery of fluorescence intensity was confirmed.
  • 2-amino-Adap is considered to be affected by surrounding bases in a single-stranded DNA composed of pyrimidine bases, forming a special structure and quenching the fluorescence of the phenoxazine ring.
  • the 13Py buffer solution was dropped into 13Pu 50nM buffer solution (100mM NaCl, 10mM sodium phosphate buffer, pH 7.0, 30 ° C).
  • the 13Py concentration in the solution was 0 or 50 nM.
  • the fluorescence of 2-amino-Adap incorporated into the purine chain shows sufficient intensity, and the fluorescence is completely obtained by adding an equal amount of Py 8-oxo-dG. Quenched. In addition, even when PydG was added, the fluorescence intensity hardly changed, indicating complete discrimination by fluorescence response.
  • FIGS. 7 (a) and 7 (b) The results of measuring fluorescence quenching when using the ODN4 sequence are shown in FIGS. 7 (a) and 7 (b). ⁇ When ODN4 is used 5′-tagtagtag Z gttagggtttaggggttaggg-3 ′ (SEQ ID NO: 5) 3′-atcaatc X caatcccc-3 ′ (SEQ ID NO: 6)
  • ODN including 2-amino-Adap is affected by the target sequence, although identification based on the difference in melting temperature and 8-oxo-dG detection by fluorescence quenching are affected by the target sequence.
  • Adap and 2-amino-Adap properly, it is useful for detection of 8-oxo-dG in various sequences.
  • HeLa cells were cultured in a DMEM medium containing 10% FBS, 100 unit / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin at 37 ° C. in a 5% CO 2 environment.
  • the medium was changed to 80-90% confluent state alone or a medium containing 250, 500, or 1000 ⁇ M H 2 O 2 aqueous solution and treated at 37 ° C. for 30 minutes in a 5% CO 2 environment.
  • DNA extraction was performed with DNA Extractor (registered trademark) TIS Kit (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • Cy3-probe ccaatccccatacccaat-Cy3 (SEQ ID NO: 13)
  • Cy5-probe caatccccatacccaatcc-Cy5 (SEQ ID NO: 14)
  • Klenow exo- (New England Biolab, 1.0 unit) was added and reacted at 37 ° C. for 60 minutes in a total volume of 10 ⁇ L.
  • the reaction was stopped by loading buffer (95% formamide, 20 mM EDTA) and separated by running for 2 hours at 250 V with 15% denatured polyacrylamide gel.
  • the compounds of the present invention can almost accurately discriminate 8-oxo-dG and dG in DNA, studies on the relationship between diseases and 8-oxo-dG, particularly the generation of 8-oxo-dG It is useful for studying the relationship between position and disease, and for studying the activity of 8-oxo-dG repair enzyme.

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Abstract

　下記化合物を使用して、ＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧを検出するための解析技術を提供する［式（Ⅱ）中、Ｒ３は、Ｈ、３'－水酸基の保護基、オリゴデオキシヌクレオチド基１（ＯＤＮ基１）、－Ｐ（ＯＲ５）Ｒ６であり、ここでＲ５はリン酸基の保護基であり、Ｒ６は窒素原子上に炭素数１から６個の同一または異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基であり、Ｒ４は、Ｈ、５'－水酸基の保護基、または、オリゴデオキシヌクレオチド基２（ＯＤＮ基２）である。］。本発明の化合物は、核酸の酸化的変異の検出に有用である。

Description

ヌクレオシドアナログ誘導体およびその利用
　本発明は、新規化合物およびその利用に関する。特に、ゲノム中に発生する酸化損傷塩基８－ｏｘｏ－ｄＧの発生位置を特定するための損傷塩基部位の増幅と検出方法に関し、ＤＮＡ鎖中の８－ｏｘｏ－ｄＧを、選択的に認識可能な蛍光プローブに関する。
　８－ｏｘｏ－ｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ（８－ｏｘｏ－ｄＧ）は生体内で活性酸素種によってｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ（ｄＧ）またはｄｅｏｘｙｇｕａｎｏｓｉｎｅ　ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ（ｄＧＴＰ）より生成するＤＮＡ損傷体のひとつであり、老化、神経変性疾患または酸化ストレスとの関連が示唆されている。
　また、構造の変化からｃｙｔｏｓｉｎｅだけではなくａｄｅｎｏｓｉｎｅとの塩基対形成が可能になっており、このためトランスバージョン変異を誘発することも分かっている。８－ｏｘｏ－ｄＧの検出のために、現在、電気化学的方法、質量分析または抗体などを用いた検出方法が開発されている。
　しかしながら、８－ｏｘｏ－ｄＧのＤＮＡ中の存在箇所の特定は、疾患の予期のみならず治療へ繋がる事が期待されるが、存在箇所を特定する技術は開発されていない。
　本発明者らがすでに開発したＡｄａｐ（特許文献１、非特許文献１および２）はＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧの存在箇所が特定されている場合においてのみ有効である。しかしながら、８－ｏｘｏ－ｄＧを含むＤＮＡのシーケンシングまたは８－ｏｘｏ－ｄＧの存在箇所の特定技術は開発されていない。さらに、一本鎖ＤＮＡであるテロメア領域における８－ｏｘｏ－ｄＧの検出で、Ａｄａｐの８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧの識別能が若干ではあるが落ちる事が示された。
国際公開第２０１２／０７７８００号
Ｊ　Ａｍ　Ｃｈｅｍ　Ｓｏｃ．２０１１　Ｍａｙ　１８；１３３（１９）：７２７２－５．Ｅｐｕｂ　２０１１　Ａｐｒ　２７． Ｂｉｏｏｒｇ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｍ　Ｌｅｔｔ．２０１２　Ｊａｎ　１；２２（１）：５４３－６．Ｅｐｕｂ　２０１１　Ｎｏｖ　４．
　本発明者らがすでに開発した８－ｏｘｏＧ－ｃｌａｍｐは分子認識能が主に水素結合で行なわれているため有機溶媒中では効果的に８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧを識別できるが、水中での認識は未だ達成されていない。水中で８－ｏｘｏ－ｄＧを識別できるのは現在のところ抗体だけに限られている。
　ＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧの検出はさらに技術的に困難で実現されておらず、現状はＤＮＡをヌクレオシドまで酵素分解し、成分としての８－ｏｘｏ－ｄＧを検出することが一般的手法となっている。
　最近、８－ｏｘｏ－ｄＧとポリアミンとの特異的な化学反応性を用いて、ビオチン－アビジン融合ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅを組み合わせることによる、高感度な検出法が報告された。しかしながら、ＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧを酵素分解することなく、簡便に配列を特異的に検出する技術は開発されていない。
　従って、本発明は、ＤＮＡ中に存在する場合であっても、８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧとを効果的に識別できる分子を創製することを目的とする。
　本発明者らは、８－ｏｘｏ－ｄＧのＤＮＡ中での構造の変化に着目し、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）を基本骨格にして蛍光性の１，３－ジアザフェノキサジン（１，３－ｄｉａｚａｐｈｅｎｏｘａｄｉｎｅ）骨格を結合させた新規ヌクレオシドアナログ、アデノシン－１，３－ジアザフェノキサジン（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－１，３－ｄｉａｚａｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ、以下、Ａｄａｐと略称する）を開発した。
　ＡｄａｐはＤＮＡ中の相補的な位置に８－ｏｘｏ－ｄＧがある時にのみ、非常安定な２本鎖ＤＮＡを形成し、特異的な蛍光消光によっても、ＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧの区別に成功した。さらに、鎖交換反応を利用したＯＦＦ－ｔｏ－ＯＮプローブの作成により、ＤＮＡ中に８－ｏｘｏ－ｄＧが存在するときにのみ蛍光発光する検出プローブの開発に成功した。
　すなわち、本発明は、下記（１）～（１６）の通りである。
（１）以下の式（Ｉ）で表わされるアデノシン－１，３－ジアザフェノキサジンヌクレオシドアナログ含有オリゴデオキシヌクレオチド：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　式（Ｉ）中、Ｒ１は、オリゴデオキシヌクレオチド基１（ＯＤＮ基１）であり、
　Ｒ２は、オリゴデオキシヌクレオチド基２（ＯＤＮ基２）である。
（２）８－オキソデオキシグアノシン（８－ｏｘｏ－ｄＧ）検出のための（１）記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
（３）ラベルされた（１）記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
（４）（１）～（３）のいずれか１に記載のオリゴデオキシヌクレオチドを、８－ｏｘｏ－ｄＧを含有する標的ＤＮＡにハイブリダイズさせる工程を含み、該オリゴデオキシヌクレオチドは標的ＤＮＡの少なくとも８－ｏｘｏ－ｄＧに相補する位置にＡｄａｐヌクレオシドアナログを含有するものであり、それにより該オリゴデオキシヌクレオチドが該標的ＤＮＡに選択的にハイブリダイズする、８－ｏｘｏ－ｄＧを含有する標的ＤＮＡを検出する方法。
（５）蛍光物質またはクエンチャー物質の一方でラベルされ、塩基配列Ａからなる（１）に記載のオリゴデオキシヌクレオチド（以下、第１オリゴデオキシヌクレオチド）、および
　蛍光物質またはクエンチャー物質の他方でラベルされ、塩基配列Ａに相補的な塩基配列Ｂからなるが、Ａｄａｐヌクレオシドアナログに相補する位置に天然のヌクレオチドを含有する、第２のオリゴデオキシヌクレオチド（以下、第２オリゴデオキシヌクレオチド）、
を少なくとも備える、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドプローブ。
（６）前記第１オリゴデオキシヌクレオチドの５’末端が蛍光物質でラベルされ、前記第２オリゴデオキシヌクレオチドの３’末端がクエンチャー物質でラベルされている、（５）記載のプローブ。
（７）（５）または（６）に記載のプローブを、８－ｏｘｏ－ｄＧを含有する標的ＤＮＡに供与する工程を含み、前記第１オリゴデオキシヌクレオチドは標的ＤＮＡの少なくとも８－ｏｘｏ－ｄＧを含有する一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、８－ｏｘｏ－ｄＧに相補する位置にＡｄａｐヌクレオシドアナログを含有するものであり、それにより前記第２オリゴデオキシヌクレオチドと該標的ＤＮＡの鎖交換反応が起こり、前記蛍光物質が発光する、８－ｏｘｏ－ｄＧを含有する標的ＤＮＡを検出する方法。
（８）下式（ＩＩ）で表わされる化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式（ＩＩ）中、Ｒ３は、Ｈ、３’－水酸基の保護基、または、－Ｐ（ＯＲ５）Ｒ６であり、ここでＲ５はリン酸基の保護基であり、Ｒ６は窒素原子上に炭素数１から６個の同一または異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基であり、Ｒ４は、Ｈ、または、５’－水酸基の保護基である。
（９）Ｒ３が－Ｐ（ＯＲ５）Ｒ６であり、このときＲ５がメチル基、２－シアノエチル基、または、２－トリメチルシリルエチル基であり、Ｒ６がジイソプロピルアミノ基であり、Ｒ４が５’－水酸基の保護基である（８）に記載の化合物。
（１０）Ｒ５が２－シアノエチル基であり、Ｒ４が４，４’－ジメトキシトリチル基である（９）に記載の化合物。
（１１）下式（ＩＩＩ）で表わされるアデノシン－１，３－ジアザフェノキサジンデオキシヌクレオチド化合物：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　式（ＩＩＩ）中、Ｒ７はＨ、または、３’－水酸基の保護基であり、
　Ｒ８は、下記式で表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（１２）ラベルされた（１１）に記載の化合物。
（１３）８－オキソデオキシグアノシン（８－ｏｘｏ－ｄＧ）検出のための（１１）に記載の化合物。
（１４）１または、複数の８－ｏｘｏ－ｄＧを含む標的ＤＮＡの塩基配列を、（１１）または（１２）の化合物を試薬として使用して決定することを含む、該標的ＤＮＡ上の８－ｏｘｏ－ｄＧの位置を決定する方法。
（１５）Ｓａｎｇｅｒ－ｄｉｄｅｏｘｙ法により前記塩基配列を決定する、（１４）に記載の方法。
（１６）ＰＣＲ法により前記塩基配列を決定する、（１４）に記載の方法。
　本発明は、ＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧ認識分子であるＡｄａｐの認識能の向上および、ＤＮＡ配列中の存在箇所の特定を行う。Ａｄａｐのトリリン酸体であるｄＡｄａｐＴＰは相補的な位置に８－ｏｘｏ－ｄＧがある時にのみ酵素によってＤＮＡ中に取り込まれる。
　これまでの技術では、８－ｏｘｏ－ｄＧの相手にｄＣまたはｄＡが取り込まれるため、８－ｏｘｏ－ｄＧの配列情報が失われてしまうが、ｄＡｄａｐＴＰを用いることで、８－ｏｘｏ－ｄＧの位置情報をＤＮＡ中に残すことが可能になる。
図１（ａ）は、ｄＡｄａｐＴＰのプライマー鎖への取り込みを評価するのに用いた蛍光（ＦＡＭ）標識したプライマー鎖とテンプレート鎖の配列を示す。図１（ｂ）は、ｄＡｄａｐＴＰのプライマー鎖への取り込みを評価した結果を示す図である。 図２（ａ）および（ｂ）は、ＴＢＤＭＳ保護２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐ（３）に対するＣＨＣｌ３中におけるＴＢＤＭＳ保護８－ｏｘｏ－ｄＧおよびｄＧの添加による蛍光スペクトルの変化を示す図である。 図３（ａ）および（ｂ）は、ＴＢＤＭＳ保護２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐ（３）に対するＴＥＡＡ／ＣＨＣｌ３中におけるＴＢＤＭＳ保護８－ｏｘｏ－ｄＧおよびｄＧの添加による蛍光スペクトルの変化を示した図である。 図４（ａ）および（ｂ）は、２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐを組み込んだ１３Ｐｙ、５’－ｃｔｔｔｃｔ　Ｘ　ｃｔｃｃｔｔ－３’（配列番号１）の５０ｎＭ溶液に、Ｙの位置にｄＧ、８－ｏｘｏ－ｄＧを組み込んだ１３Ｐｕ、３’－ｇａａａｇａ　Ｙ　ｇａｇｇａａ－５’（配列番号２）を添加して蛍光スペクトルの変化を測定した図である。 図５（ａ）および（ｂ）は、プリン鎖に２－ａｍｉｎｏＡｄａｐを組み込んだ１３Ｐｕを用いてピリミジン鎖１３Ｐｙ中の８－ｏｘｏ－ｄＧの検出を検討した。２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐを組み込んだ１３Ｐｕ、５’－ａａｇｇａｇ　Ｘ　ａｇａａａｇ－３’（配列番号７）の５０ｎＭ溶液にＹの位置にｄＧ、８－ｏｘｏ－ｄＧを組み込んだ１３Ｐｙ、３’－ｔｔｃｃｔｃ　Ｙ　ｔｃｔｔｔｃ－５’（配列番号８）を添加して蛍光スペクトルの変化を測定した図である。 図６（ａ）および（ｂ）は、２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐを含む（ＯＤＮ３）１００ｎＭ緩衝溶液中に３０ｍｅｒＯＤＮ緩衝溶液を滴下して蛍光消光を測定した図である。 図７（ａ）および（ｂ）は、２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐを含む（ＯＤＮ４）１００ｎＭ緩衝溶液中に３０ｍｅｒＯＤＮ緩衝溶液を滴下して蛍光消光を測定した図である。 図８（ａ）および（ｂ）は、Ｃｙ５またはＣｙ３で標識したプローブと本発明の化合物（ｄＡｄａｐＴＰ）を用いてＨ２Ｏ２水溶液により処理した細胞から抽出したＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧを検出した結果を示す図である。
　本発明は、これまでに未達成な技術であるＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧの存在場所の特定法を確立するために、新規Ａｄａｐ誘導体としてオリゴヌクレオチド中へポリメラーゼにより取り込み可能なトリリン酸体であるｄＡｄａｐＴＰの開発と、ＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧの識別能の向上を期待した２－アミノ－アデノシン－１，３－ジアザフェノキサジン［２－ａｍｉｎｏ－ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－１，３－ｄｉａｚａｐｈｅｎｏｘａｄｉｎｅ　（ａｍｉｎｏＡｄａｐ）］の開発を行った。
　本発明において「オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）」というときは、特に記載した場合を除き、その塩基配列および塩基数には特に制限はなく、必要に応じ、塩基配列は、標的とする核酸の塩基配列に対して相補的になるように設計され、塩基数は、標的核酸とハイブリダイズすることが可能な数とすることができる。
　本発明において「核酸」とは、特に記載した場合を除き、ＤＮＡまたはＲＮＡをいう。本発明において「核酸」とは、特に記載した場合を除き、ＤＮＡであることが好ましい。
　本発明において「オリゴデオキシヌクレオチド基（ＯＤＮ基）」とは、特に記載した場合を除き、３’末端または５’末端で隣接する基に結合しているか、または結合可能な、オリゴデオキシヌクレオチド部分を指す。
　式（Ｉ）がオリゴデオキシヌクレオチド（以下、Ａｄａｐ含有ＯＤＮということがある。）を表す場合、ＯＤＮ基１およびＯＤＮ基２はいずれも、リン酸基を末端に有し、かつ該リン酸基を介してアデノシン－１，３－ジアザフェノキサジン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ－１、３－ｄｉａｚａｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ、Ａｄａｐ）ヌクレオシドアナログ部分に結合可能な、オリゴデオキシヌクレオチド部分であってもよい。
　ＯＤＮ基１およびＯＤＮ基２は、それぞれ独立に、５～１００塩基長であることが好ましく、１０～３０塩基長であることがより好ましい。ＯＤＮ基１およびＯＤＮ基２は、ＤＮＡ合成前駆体である本発明の化合物から、ホスホロアミダイト法を用いて核酸自動合成機により、合成することができる。
　式（Ｉ）において、Ｒ１および／またはＲ２が、水酸基の保護基である場合、それぞれ独立して、従来技術の水酸基の保護基から適宜選択可能である。具体例は、ＴＢＤＭＳ（ＴＢＳと記載することもある）（ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）基、ＤＭＴｒ（４，４’－ジメトキシトリチル）基、ＴＢＤＰＳ（ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル）基、ＴＥＳ（トリエチルシリル）基、ＴＩＰＳ（トリイソプルピルシリル）基、ＤＭＥＳ（ジメチルエチルシリル）基、ＴＨＰ（テトラヒドロピラニル）基、ＥＥ（エトキシエチル）基、ＭＯＭ（メトキシメチル）基、Ｂｎ（ベンジル）基である。
　Ｒ１およびＲ２における水酸基の保護基は、好ましくはＴＢＤＭＳ基であり、Ｒ１が－Ｐ（ＯＲ３）Ｒ４であるとき、Ｒ２の特に好ましい例は、ＤＭＴｒ基である。
　式（Ｉ）のＲ１は、－Ｐ（ＯＲ３）Ｒ４であってもよい。このとき、Ｒ３はリン酸基の保護基であり、リン酸基の保護基としては、ボスホロアミダイト法に用いられるものであれば、従来技術の保護基から適宜選択可能である。具体例は、メチル基、２－シアノエチル基、２－トリメチルシリルエチル基である。またＲ１が－Ｐ（ＯＲ３）Ｒ４であるとき、Ｒ４は、窒素原子上に炭素数１～６個の同一または異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基である。
　ジアルキルアミノ基の好ましい例は、ジエチルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基である。２個のアルキル基は、互いに結合して環を形成していてもよい。この例は、モルホリン－１－イル基である。なお、式（ＩＩ）のＲ３が－Ｐ（ＯＲ５）Ｒ６の場合も、式（Ｉ）のＲ１の－Ｐ（ＯＲ３）Ｒ４と同義である。
　本発明の式（Ｉ）で表わされる化合物は、具体的には下記のものを包含する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　また、本発明の化合物のうち、－Ｐ（ＯＲ３）Ｒ４であるものはＤＮＡ合成前駆体として用いることができるが、ＤＮＡ合成前駆体である本発明の化合物のうち、特に好ましい例は下記のものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
本発明の化合物の機能・作用：
　これまでの本発明者らの研究結果に基づく重要な考察は、２本鎖ＤＮＡの配列の中央付近で８－ｏｘｏＧ－ｃＬａｍｐと８－ｏｘｏ－ｄＧが、下記に示すような錯体を形成するときには、相手ＤＮＡ鎖が障害となりベンジルオキシ基が望ましい構造をとりにくくなるということである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　このことは８－ｏｘｏＧ－ｃＬａｍｐが２本鎖ＤＮＡ末端に組み込まれた場合には比較的に８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧが区別されていることからも示された。また、ベンジロキシカルボニル基を２－アミノピリジン－６－イル基に置き換えても、８－ｏｘｏＧ－ｃＬａｍｐと８－ｏｘｏ－ｄＧが維持されるということを見出している。
　これらの情報から、蛍光団であり、かつｄＧとＷａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する１，３－ジアザフェノキサジン（１，３－ｄｉａｚａｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ）骨格をアデニン骨格と連結した分子アデノシン－１，３－ジアザフェノキサジン［ａｄｅｎｉｎｅ－ｄｉａｚａｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ（Ａｄａｐ）］を設計した（下記参照）。省略名は構造式を表す頭文字から命名した。
　この分子設計の有利な点は、認識すべき８－ｏｘｏ－ｄＧがＤＮＡ中でとりうる特別なコンフォーメーションを標的にしている点である。すなわち、一般にＤＮＡ中のｄＧはアンチ配座が優先するが、８－ｏｘｏ－ｄＧは８位の酸素原子とバックボーンのリン酸との反発がありシン配座もとることができる。
　Ａｄａｐ自身はアンチ配座が優先すると予想され、この配座でシン配座の８－ｏｘｏ－ｄＧと多点水素結合の効果的な形成を期待した。一方、アンチ配座のｄＧがＡｄａｐと錯体形成するためには、不安定なシン配座への変換が必要となる。さらにシン配座ｄＧとＡｄａｐの錯体ではこれまで考察したように、ｄＧの７位窒素原子とＡｄａｐの１位窒素原子との電子反発による不安定化が生じる。
　このようにＡｄａｐはＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧとは有利な相互作用が予想されるのに対して、ｄＧとは不利な要因が多く予想され、ＤＮＡ中における効果的な識別が達成されるものと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
本発明の化合物の製造方法：
　本発明の式（Ｉ）の化合物は、次のようにして製造することができる。
　ＡｄａｐおよびそのＤＮＡ合成前駆体の合成経路を下記のＳｃｈｅｍｅ１にまとめた。まず、５－ブロムウラシル（５－ｂｒｏｍｏｕｒａｃｉｌ）をＨＭＤＳ（１，１，１，３，３，３－Ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｄｉｓｉｌａｚａｎｅ）中で加熱還流したあと、ＨＭＤＳを留去し、残渣をＣＨ３ＣＮに溶解しヨウ化メチルと反応させ、１－ｍｅｔｈｙｌ－５－ｂｒｏｍｏｕｒａｃｉｌ（１）を得ることができる。
　これに２－ニトロレゾルシノール（２－ｎｉｔｒｏｒｅｓｏｒｃｉｎｏｌ）を還元して得られる２，６－ジヒドロキシアニリン（２，６－ｄｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｉｌｉｎｅ）と（１）をＰＰｈ３およびＣＣｌ４を用いる光延縮合条件にてカップリングさせ、（２）を得ることができる。引き続きＮ－Ｆｍｏｃ－２－ａｍｉｎｏｅｔｈａｎｏｌと（２）をＰＰｈ３とＤＩＡＤを用いる光延縮合条件で、（３）が得られる。
　（３）をアンモニアーメタノール溶液中室温にて反応させ閉環およびＦｍｏｃ基が脱保護された（４）を得ることができる。（４）と２’Ｏ－，５’Ｏ－ｄｉＴＢＤＭＳ－６－ｃｈｌｏｒｏａｄｅｎｏｓｉｎｅを１－ｐｒｏｐａｎｏｌ中ＤＩＰＥＡ共存下で過熱還流することによってプリン環で芳香族置換反応が起こり、ＴＭＤＭＳ保護された目的化合物Ａｄａｐ（５）を得ることができる。ＴＢＤＭＳ保護Ａｄａｐ（５）は有機溶媒中での分子認識の評価に用いた（実施例参照）。
　引き続き、５のＴＢＤＭＳ保護基をＴＢＡＦで脱保護し、６を得、ピリジン中でＤＭＴｒＣｌと反応させ、５’－水酸基の保護、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２－Ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ－Ｎ，Ｎ’－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅ）との反応により、ＤＮＡ合成前駆体であるβ－ホスホロアミダイト体（７）を得ることができる。
　（７）のＣＨ３ＣＮ溶液を、固相ＤＮＡ合成装置を用いてＯＤＮ（ｏｌｉｏｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に組み入れた。このようにして合成したＯＤＮをＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧ認識能の評価に用いた（実施例参照）。
　本発明の化合物の使用方法：
　式（Ｉ）で表わされるオリゴデオキシヌクレオチド（Ａｄａｐ含有ＯＤＮ）は、次のような機能を有する。
（１）Ａｄａｐに対応する位置に８－ｏｘｏ－ｄＧを有する相補鎖と二本鎖を形成し、安定化する（融解温度Ｔｍの上昇）。
（２）ＤＮＡ中のｄＧと８－ｏｘｏ－ｄＧとを識別できる。
（３）２本鎖形成の際に、蛍光標識を消光する。
　このような機能に基づき、本発明のＡｄａｐ含有ＯＤＮは、核酸中の８－ｏｘｏ－ｄＧの検出のために用いうる。
　Ａｄａｐ含有ＯＤＮは、多点型水素結合により８－ｏｘｏｄＧを認識し、さらには特異的蛍光消光作用による検出が可能な人工核酸として用いることができる（Ｙ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．Ｋａｗａｇｕｃｈｌ，Ｓ．Ｓａｓａｋｉ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１，１３３，７２７２－７２７５）のみならず、標的配列を検出した際に、蛍光を増強するように用いることもできる（Ｙ．Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｙ．Ｋｏｇａ，Ｋ．Ｆｕｋａｂｏｒｉ，Ｒ．Ｋａｗａｇｕｃｈｉ，Ｓ．Ｓａｓａｋｉ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．ｌｎ　ｐｒｅｓｓ，Ａｖａｉｌａｂｌｅ　ｏｎ　Ｌｉｎｅ　４　Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　２０１１）。
　より詳細には、蛍光物質またはクエンチャー物質の一方でラベルされた、Ａｄａｐ含有ＯＤＮ（「第１デオキシオリゴヌクレオチド」ということもある。）、および蛍光物質またはクエンチャー物質の他方でラベルされ、塩基配列Ａに相補的な塩基配列Ｂからなるが、Ａｄａｐヌクレオシドアナログに相補する位置に天然のヌクレオチドを含有する、第２オリゴデオキシヌクレオチドを少なくとも備える、二本鎖プローブ（ｄｕｐｌｅｘ　ｐｒｏｖｅ）として用いることもできる。この概念を示した図を、以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　本発明において「蛍光物質」とは、特に記載した場合を除き、蛍光を発することのできる物質をいう。
　本発明において「クエンチャー物質」とは、特に記載した場合を除き、励起エネルギー吸収剤であって、近くの蛍光物質の蛍光を抑制する機能を有する物質をいう。
　本発明の特定の態様においては、蛍光物質とクエンチャー物質とが組み合わせて使用される。この組み合わせは、目的の効果を発揮し得る限り特に制限はないが、リアルタイムＰＣＲ等で用いられている蛍光物質とクエンチャー物質との組み合わせを参考に、選択することができる。
　このような例としては、ＦＡＭおよびＩＢＦＱ、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡ、ＴＥＴおよびＩＢＦＱ、ＨＥＸおよびＩＢＦＱ、Ｃｙ５およびＩＢＦＱ、ＦＡＭおよびＢＨＱ１または２、ＴＥＴおよびＢＨＱ１または２、ＨＥＸおよびＢＨＱ１または２、ＭＡＸＮＨＳエステルおよびＩＢＦＱ、ＭＡＸＮＨＳエステルおよびＢＨＱ１または２、Ｃｙ３およびＩＢＲＱ、Ｃｙ３およびＢＨＱ２、ＴＹＥ５６３およびＩＢＲＱ、ＴＹＥ５６３およびＢＨＱ２、ＴＥＸ６１５およびＩＢＲＱ、ＴＥＸ６１５およびＢＨＱ２、Ｃｙ５およびＩＢＲＱ、Ｃｙ５およびＢＨＱ２、ＴＹＥ６６５およびＩＢＲＱ、ＴＹＥ６６５およびＢＨＱ２、ＦＡＭおよびＴＡＭＲＡＮＨＳエステル、ＪＯＥＮＨＳエステルおよびＩＢＦＱ、ＪＯＥＮＨＳエステルおよびＢＨＱ１または２、ＴＡＭＲＡＮＨＳエステルおよびＩＢＲＱ、ＴＡＭＲＡＮＨＳエステルおよびＢＨＱ２、ＲＯＸＮＨＳエステルおよびＩＢＲＱ、ＲＯＸＮＨＳエステルおよびＢＨＱ２、Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ－ＸＮＨＳエステルおよびＩＢＲＱ、並びにＴｅｘａｓ　Ｒｅｄ－ＸＮＨＳエステルおよびＢＨＱ２が挙げられる。
　これまで述べてきたように、生体内で生じたＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧは、修復酵素によってヌクレオシドとして除去されるが、修復機構を免れた一部が変異を引き起こし、ひいては疾患の原因となる異常遺伝子の発生につながるものと老えられている。
　本発明は、核酸中のグアニンの酸化的変異を検出するために、より詳細にはＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧを検出するために用いることができる。このような検出は、ＤＮＡ中のグアニンの酸化変異に関連した疾患または状態の研究のために有用である。
　ＤＮＡの酸化的変異、特にＤＮＡ中のグアニンの酸化変異に関連した疾患または状態には、老化、神経変性疾患、脳老化が含まれる。このような検出の対象となるＤＮＡは、生細胞中のＤＮＡ、または生体由来の試料に含まれるＤＮＡであり得る。
　本発明において「検出方法」とは、特に記載した場合を除き、対象である８－ｏｘｏ－ｄＧの有無および／または存在量を評価するための方法を指す。
　ＤＮＡの塩基配列を決定する方法としては、例えば、Ｓａｎｇｅｒ－Ｄｉｄｅｏｘｙ法が挙げられる。Ｓａｎｇｅｒ－Ｄｉｄｅｏｘｙ法とは、ＤＮＡ合成酵素を用いて、塩基配列を調べるＤＮＡ（テンプレートＤＮＡ）の相補鎖ＤＮＡを合成し、その塩基配列を調べることにより、元のＤＮＡの塩基配列を決定する方法である。
　以下に、実施例を挙げて発明をさらに詳細に説明するが、本発明の範囲はそれらに限定されるものではない。
　Ａｄａｐのトリリン酸体の合成をＳｃｈｅｍｅ１にまとめた。まず、Ａｄａｐのジオール体の５’位の水酸基をジメトキシトリチル基で保護、３’位の水酸基を無水酢酸でアセチル化した後に、５’位のＤＭＴｒ基をトリクロロ酢酸で脱保護する事で１を得ることができる。
　引き続き、５’位の水酸基に２－クロロ－４－Ｈ－１，３，２－ベンゾジオキサホスホリン－４－オン（２－Ｃｈｌｏｒｏ－４－Ｈ－１，３，２－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｎ－４－ｏｎｅ）を作用させ、トリブチルアンモニウムピロリン酸塩（Ｔｒｉｂｕｔｙｌ　ａｍｍｏｎｉｕｍ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とトリブチルアミン（Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ）を加えた後に、ヨウ素でリンを酸化し、アンモニア水で加水分解する事で、アセチル基の脱保護、Ａｄａｐのトリリン酸体であるｄＡｄａｐＴＰ（２）を得ることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
［化合物１の合成］
　Ａｄａｐのジオール体（４７．５ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（２ｍＬ）で共沸後、アルゴン気流下にて無水ピリジン（１ｍＬ）に溶解した。ＤＭＴｒＣｌ（６３．３ｍｇ、０．１８９ｍｍｏｌ）を加え室温にて１時間撹拌した。反応液を無水ピリジン（２ｍＬ）で希釈し０℃に冷却後、無水酢酸（２６μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）加えて２４時間撹拌した。
　溶媒を減圧留去し、残渣をメタノール（０．５ｍＬ）に溶解し、トリクロロ酢酸（３％　ＣＨ２Ｃｌ２溶液、１ｍＬ）を加え室温にて５分間撹拌した。反応液をＮａＨＣＯ３で中和後、溶媒を減圧留去し、残渣をカラムクロマトグラフィー（富士シリシアＦＬ６０Ｄ、ＣＨＣｌ３：ＭｅＯＨ＝１００：１→２０：１）にて精製し黄色カラメル状物質（４１．２ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、８０％）を得た。分析結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000017
［化合物２の合成］
　化合物１（２６．２ｍｇ、０．０４８ｍｍｏｌ）の無水ピリジン（０．２５ｍＬ）と無水ジオキサン（０．２５ｍＬ）溶液に、２－Ｃｈｌｏｒｏ－４－Ｈ－１，３，２－ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｏｓｐｈｏｒｉｎ－４－ｏｎｅ（１９．２ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）の無水ジオキサン溶液を０．４ｍＬ加え室温にて３０分間撹拌した。
　Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｍｏｎｉｕｍｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ（１９．２ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）の無水ジメチルホルムアミド溶液を０．２５ｍＬ加えてすぐに、Ｔｒｉｂｕｔｙｌａｍｉｎｅ（５７μＬ、０．２４ｍｍｏｌ）を加えて室温にてさらに３０分間撹拌した。
　１％のヨウ素のピリジン－水（９８／２）溶液を２ｍＬ加えて、室温にて５分間撹拌後、５％のＮａＨＳＯ４溶液を１．３ｍＬ加えて３０分間撹拌した。溶液を減圧下溶媒留去し残渣に２８％アンモニア水溶液を１５ｍＬ加えて１２時間室温にて撹拌した。
　溶液を減圧下溶媒留去し残渣に０．３ｍＬの水、１．０ｍＬのエタノール、０．０３３ｍＬの３Ｍ　ＮａＣｌ水溶液加えて上澄みを取り除き、水に溶解後ＨＰＬＣにて精製を行った。溶媒を凍結乾燥後、水に溶解しＮａイオン交換樹脂で処理し淡黄色溶液（６．５ｍＭ、０．００７８ｍｍｏｌ、１６％）を得た。分析結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000018
［ｄＡｄａｐＴＰのプライマー鎖への取り込み評価］
　蛍光標識（ＦＡＭ）したプライマー鎖（配列番号９）とテンプレート鎖（配列番号１０）（Ｘ＝８－ｏｘｏ－ｄＧまたはｄＧ）を緩衝液中（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ７．９）でアニーリングした後に、ｄＡｄａｐＴＰ、Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）を加えて緩衝液中（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ７．９）で反応させた（５０μＭ　ｄＡｄａｐＴＰ、０．１ｕｎｉｔ／μＬ　Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｅｘｏ（－）、１μＭ　ｄｕｐｌｅｘ　ＤＮＡ）。
　２分後、ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（ホルムアミド、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ、ブロモフェノールブルー）で反応を停止し１５％ポリアクリルアミドゲルで分離を行い、ＦＡＭの蛍光バンドを観測して強度の定量を行い取り込み量の算出を行った。その結果を図１（ａ）および（ｂ）に示す。
　ｄＡｄａｐＴＰはテンプレートの相補的な位置に８－ｏｘｏ－ｄＧがある時に７９．０％の割合でプライマー鎖に取り込まれ、ｄＧの時には１８．７％しか取り込まれなかった。この事から、ｄＡｄａｐＴＰはポリメラーゼ（Ｋｌｅｎｏｗ　Ｆｒａｇｍｅｎｔ）によって鎖伸長反応の基質となり、しかも８－ｏｘｏ－ｄＧの時に良くＤＮＡ鎖に取り込まれ事が確認された。
［Ｓｔｅａｄｙ－Ｓｔａｔｅ　ｋｉｎｅｔｉｃｓによるトリリン酸体の取り込み効率の評価］
　基本的な操作：蛍光標識（ＦＡＭ）したプライマー鎖（配列番号９、１１または１２）とテンプレート鎖（配列番号１０）を緩衝液中（５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ、ｐＨ７．９）でアニーリングした後に、Ｋｌｅｎｏｗ（ｅｘｏ－）（０．１～０．４ｕｎｉｔ）を加えて全量が５μＬで３７℃にて２分間インキュベーションした。
　あらかじめ３７℃にて静置しておいたｄＮＴＰ（０．２～７０μＭ）を同量（５μＬ）加えて反応を開始し、１～１０分後にｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ（ホルムアミド、０．１Ｍ　ＥＤＴＡ、ブロモフェノールブルー）で反応を停止した。１５％　ポリアクリルアミドゲルで分離を行い、ＦＡＭの蛍光バンドを観測して強度の定量を行い取り込み量の算出を行った。
　酵素量と反応時間を調整し１～２０％の取り込み部分の値を用いて、Ｓｔｅａｄｙ－Ｓｔａｔｅ　ｋｉｎｅｔｉｃｓの値をＨａｎｅｓ－Ｗｏｏｌｆ　Ｐｌｏｔにより算出し、Ｖｍａｘ、Ｋｍさらにはそれぞれの取り込み効率（Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（％ｍｉｎ－１Ｍ－１）を調べた。その結果を以下に示す。
１．ｄＡｄａｐＴＰとｄＡＴＰ取り込み効率評価
　下記に示すプライマー鎖（配列番号９）とテンプレート鎖（配列番号１０）を用いて、ｄＡｄａｐＴＰとｄＡＴＰの取り込み効率を評価した結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
　表１に示すように、ｄＡｄａｐＴＰは相補的な位置にＴがある時にもっとも良く取り込まれることが示されたが、ｄＡＴＰの結果と比べるとＴに対する取り込み効率は若干であるが減少している。これは酵素による認識の後のリン酸結合形成反応が遅くなった事が影響していると考えられる。
　ここで、注目すべき点はテンプレートに８－ｏｘｏ－ｄＧがある時のｄＡｄａｐＴＰまたはｄＡＴＰの取り込み効率がほとんど同じであることから、ｄＡｄａｐＴＰのフェノキサジン環が酵素反応おいて障害になっているにも関わらず、Ｋｍの値が小さい事から多点水素結合によるＡｄａｐ－８－ｏｘｏ－ｄＧ錯体の安定性が優位に寄与していると考えられる。
　さらに、８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧの取り込み効率から、ｄＡｄａｐＴＰはｄＡＴＰよりも効率的に８－ｏｘｏ－ｄＧに対して取り込まれることが明らかとなった。
２．テンプレート鎖にＡｄａｐまたはｄＡを用いた時の評価
　下記に示すプライマー鎖（配列番号９）およびＡｄａｐまたはｄＡを用いたテンプレート鎖（配列番号１０）を用いた結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
　表２に示すように、テンプレートにＡｄａｐがある場合にはｄＴＴＰと同等の効率でｏｘｏｄＧＴＰが取り込まれることが明らかとなった。この効率はテンプレートにｄＡがある時のｄＴＴＰの取り込み効率よりは劣るものの、ｏｘｏｄＧＴＰの取り込み効率とほぼ同等であることが示された。さらに、ｏｘｏｄＧＴＰとｄＧＴＰの取り込まれる効率を比較しても、Ａｄａｐをテンプレートした場合は、効率的にｏｘｏｄＧＴＰが取り込まれる事が示された。
・Ａｄａｐを組み込んだテンプレート（配列番号１０）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　Ｍａｓｓのデータ
３’－ｇｃｇｔａｔｔｇｇｇａｔｔｇｇＸａｔｔｇａｃａｇｃ－５’（Ｘ＝Ａｄａｐ）ｃａｌｃｄ．８０３０．３，ｆｏｕｎｄ　８０２８．５．（Ｍ－Ｈ）
３．ｄＡｄａｐＴＰが取り込まれた後の一塩基挿入反応評価
　下記に示すプライマー鎖（配列番号１１）とテンプレート鎖（配列番号１０）を用いて、ｄＡｄａｐＴＰが取り込まれた後の一塩基挿入反応を評価した結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
　下記に示すプライマー鎖（配列番号１２）とテンプレート鎖（配列番号１０）を用いて、ｄＡｄａｐＴＰが取り込まれた後の一塩基挿入反応を評価した結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　表３および表４に示すように、ｄＡｄａｐＴＰがプライマー鎖に取り込まれた後の塩基伸長反応は、天然型のＡと比べてほとんど変わらない効率で、次の塩基挿入反応が起こることが示された。この事は、ＤＮＡ中に組み込まれたＡｄａｐは天然のアデニン（Ａ）と同様の性質が有ることが明らかになった。
　さらに、ｄＡに比べてＡｄａｐ－ｏｘｏｄＧペアよりもＡｄａｐ－ｄＧペアの次の塩基の取り込まれる効率が大きく低下していることから、Ａｄａｐ－ｄＧペアは上手く塩基対を形成出来ないために構造に歪みが生じて、伸長反応が低下していることが示唆される。
・Ａｄａｐを組み込んだプライマー（配列番号１１）のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　Ｍａｓｓのデータ
５’－ＦＡＭ－ｃｇｃａｔａａｃｃｃｔａａｃｃＸ－３’（Ｘ＝Ａｄａｐ）ｃａｌｃｄ．５５７１．０，ｆｏｕｎｄ　５５７０．９．（Ｍ－Ｈ）
　このように、ｄＡｄａｐＴＰは相補鎖の８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧを区別して効果的に８－ｏｘｏ－ｄＧに対して取り込まれ、さらに取り込まれたＡｄａｐはｏｘｏｄＧＴＰとｄＧを区別して効果的にｏｘｏｄＧＴＰが酵素によって取り込まれる事が確認された。
［ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐの設計概念］
　Ａｄａｐは一本鎖ＤＮＡ領域であるテロメア配列を標的とした場合、８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧの若干ではあるが、その識別能の低下が観測された。そこで、Ａｄａｐのアデノシン骨格にアミノ基を導入することにより、ｄＧに対する不安定化効果を利用して、８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧの識別能の向上を期待した。
　２－アミノ－Ａｄａｐ（２－ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐ）の合成をＳｃｈｅｍｅ２にまとめた。まず、既知化合物である、２’デオキシグアノシンの３’位と５’位の水酸基をＴＢＤＭＳ基で、６位のカルボニル基を２，４，６－トリイソプロピルベンゼンスルホニル（ＴＰＳ）基で保護した化合物にフェノキサジン環部分の縮合を行い、水酸基をＴＢＤＭＳ基で保護した２ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐ（３）を得ることができる。
　化合物３は有機溶媒中での分子認識の評価に用いた。２位のアミノ基をＰａｃ基で保護、水酸基の保護基をＴＢＦＡで脱保護して化合物４を得ることができる。
　次いで、ピリジン中でＤＭＴｒＣｌと反応させ、５’－水酸基の保護、２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（２－Ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ－Ｎ，Ｎ’－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅ）との反応により、ＤＮＡ合成前駆体であるβ‐ホスホロアミダイト体（５）を得ることができる。
　（５）のＣＨ３ＣＮ溶液を、固相ＤＮＡ合成装置を用いてＯＤＮ（ｏｌｉｏｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）に組み入れた。このようにして合成したＯＤＮをＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧ認識能の評価に用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
［化合物３の合成］
　アルゴン気流下、フェノキサジン環（２０８．４５ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ）の無水１－プロパノール溶液（３．５ｍｌ）に２’デオキシグアノシン誘導体（１．０７ｇ、１．１４ｍｍｏｌ）およびジイソプロピルエチルアミン（０．１９９ｍｌ、１．１４ｍｍｏｌ）を加え、１００℃にて加熱還流した。
　１２時間後室温に戻し、飽和重曹水にて希釈後プロパノールを減圧下溶媒留去した。残った溶液に酢酸エチルおよび飽和重曹水を加え分液し、有機層を精製水、飽和食塩水にて洗浄、さらに芒硝乾燥し濃縮した。得られた茶色固体をカラムクロマトグラフィー（富士シリシア　ＮＨシリカゲル、８０ｍｌ、ヘキサン：酢酸エチル＝１０：１→１：１）にて精製し、蛍光性黄色粉末（５０２．５ｍｇ、８７．９％）を得た。分析結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000028
［化合物４の合成］
　アルゴン気流下、氷浴中で化合物３（３７５．５ｍｇ、０．５０ｍｍｏｌ）のピリジン（５．０ｍＬ）溶液に塩化フェノキシアセチル（０．１７２ｍＬ、１．２５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２４時間攪拌した。
　飽和重曹水を加え、ジクロロメタンで分液し、有機層を飽和食塩水にて洗浄、さらに芒硝乾燥し濃縮して黄色固体を得た。この固体をジエチルエーテルで洗浄し、蛍光性黄色固体（３８６．３ｍｇ、８８％）を得た。
　この化合物（２８５．８ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３．２ｍＬ）に溶解し、１Ｍ　ＴＢＡＦのＴＨＦ溶液（０．１１４ｍＬ）を加え、室温にて２時間攪拌後、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（富士シリシア　ＦＬ６０Ｄ、３０ｍｌ、クロロホルム：メタノール：＝１００：１→１０：１）にて精製し、蛍光性黄色粉末（２１５．１ｍｇ、６５％）を得た。分析結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000029
［化合物５の合成］
　化合物４（１９０．０ｍｇ）をｄｒｙピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）で３回共沸して乾燥したのちｐｙｒｉｄｉｎｅ（３ｍＬ）に溶解した。この溶液にＤＭＴｒＣｌ（１１８．６ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）を加え、室温にて２時間攪拌した。
　反応液をＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和食塩水の順番に洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（富士シリシア　ＦＬ６０Ｄ、４０ｍｌ、ＣＨＣｌ３：メタノール＝２０：０→２０：１）にて精製し黄色固体（１７８．４ｍｇ、６４．３％）を得た。
　この化合物をｐｙｒｉｄｉｎｅで２回共沸し、ジクロロメタン３．５ｍＬに溶解し、氷浴で冷却した。これにアルゴン雰囲気下、順番にＤＩＰＥＡ（０．１９２ｍＬ、１．１０４ｍｍｏｌ）と２－ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ－Ｎ，Ｎ’－ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｃｈｌｏｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｏｄｉａｍｉｄｉｔｅ（０．１２３ｍＬ、０．５５２ｍｍｏｌ）を加え、１時間反応させた。
　反応液をＡｃＯＥｔで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液、飽和食塩水の順番に洗浄しＮａ２ＳＯ４乾燥、溶媒を減圧留去した。残渣をカラムクロマトグラフィー（富士シリシア　ＦＬ６０Ｄ、４０ｍｌ、ＣＨＣｌ３：メタノール＝２０：０→２０：１）にて精製し淡黄色固体（１９０．４ｍｇ、８９．１％）を得た。分析結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000030
［２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐを組み込んだＤＮＡの合成］
　２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐは下記の配列のＸ部分に組み込んだ。１３塩基のＯＤＮはピリミジン塩基に挟まれた配列１３Ｐｙ（ＯＤＮ１）とプリン塩基に挟まれた１３Ｐｕ（ＯＤＮ２）を合成した。また、ヒトテロメア領域に相補的な配列ＯＤＮ３、ＯＤＮ４を合成した。
ＯＤＮ１（１３Ｐｕ）：５’－ａａｇｇａｇ　Ｘ　ａｇａａａｇ－３’（配列番号７），ｃａｌｃｄ：４３５８．８６，ｆｏｕｎｄ：４３５８．３４（Ｍ－Ｈ）
ＯＤＮ２（１３Ｐｙ）：５’－ｃｔｔｔｃｔ　Ｘ　ｃｔｃｃｔｔ－３’（配列番号１），ｃａｌｃｄ：４０９５．６７，ｆｏｕｎｄ：４０９６．７８（Ｍ－Ｈ）
ＯＤＮ３：５’－ｃｃｃｔａａｃｃ　Ｘ　ｔａａｃｔａ－３’（配列番号４），ｃａｌｃｄ：４７３３．８５，ｆｏｕｎｄ：４７３２．８８（Ｍ－Ｈ）
ＯＤＮ４：５’－ｃｃｃｔａａｃ　Ｘ　ｃｔａａｃｔａ－３’（配列番号６），ｃａｌｃｄ：４７３３．８５，ｆｏｕｎｄ：４７３５．６５（Ｍ－Ｈ）
［有機溶媒中での蛍光による分子認識評価］
　分子認識機能は、ＴＢＤＭＳ保護２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐ（３）のＣＨＣｌ３中または３３μＭ　ＴＥＡＡ／ＣＨＣｌ３中、１μＭ溶液中にＴＢＤＭＳ保護８－ｏｘｏ－ｄＧおよびｄＧのＣＨＣｌ３溶液を滴下し、蛍光スペクトルの変化を観測することにより評価した。
　ＴＢＤＭＳ保護２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐ（３）に対してＴＢＤＭＳ保護８－ｏｘｏ－ｄＧおよびｄＧのＣＨＣｌ３溶液の滴定による蛍光スペクトルの変化を示した。その結果を図２（ａ）および（ｂ）並びに図３（ａ）および（ｂ）に示す。
　図２（ａ）および（ｂ）に示すように、ＴＢＤＭＳ保護ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐ（３）は、ＣＨＣｌ３中でＴＢＤＭＳ保護８－ｏｘｏ－ｄＧに対してｄＧを添加したときよりも、強く蛍光消光効果が観測された。
　図３（ａ）および（ｂ）に示すように、ＴＢＤＭＳ保護ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐ（３）は、ｐＨを調製した３３μＭ　ＴＥＡＡ／ＣＨＣｌ３中でＴＢＤＭＳ保護８－ｏｘｏ－ｄＧにＣＨＣｌ３中と同等の消光作用を示した。一方、ＴＢＤＭＳ保護ｄＧに対しては消光の割合が減少したため、２ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐは８－ｏｘｏ－ｄＧに対してより強く結合していることが示唆された。
［２本鎖ＤＮＡの測定］
　１３ｐｙ－１３ｐｕ　２本鎖ＯＤＮを用いて同様の融解温度測定を行なった。融解温度は１～８μＭのＯＤＮ１３ｐｙとその相補鎖を含む緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ＝７．０）を用いて、１分あたり１℃温度を上昇させ２６０ｎｍにおける吸光度の変化を観測した。各濃度での融解温度のプロットから熱力学パラメーターを求めた。融解温度は２μＭ　ＯＤＮにおける実測値として表した。結果を表５および表６に示す。
５’－ｃｔｔｔｃｔ　Ｘ　ｃｔｃｃｔｔ－３’（配列番号１）
３’－ｇａａａｇａ　Ｙ　ｇａｇｇａａ－５’（配列番号２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　表５に示すように、１３Ｐｙ　ＯＤＮ　Ｘ部分に２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐ、１３Ｐｕ　ＯＤＮ　Ｙ部分に８－ｏｘｏ－ｄＧを組み込んだ配列では、ＸがＡｄａｐのときに比べてΔΔＧの減少が観測され、安定化効果が観測された。
　一方、ｄＧを組み込んだ配列では若干の安定化が観測されたが、その値は８－ｏｘｏ－ｄＧに対する方が大きく、２－ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐによる識別能の向上が確認された。
　一方、表６に示すように、１３Ｐｙ　ＯＤＮ　Ｘ部分に８－ｏｘｏｄＧ、１３Ｐｕ　ＯＤＮ　Ｙ部分に２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐを組み込んだ配列では、ＹがＡｄａｐのときに比べてほとんど変化は観測されなかったが、ｄＧを組み込んだ配列では若干の安定化が観測された。
　これらの事により、２－ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐによる識別能の向上には組み込んだ配列に影響を受けることが明らかとなった。
［ヒトテロメア配列における２本鎖ＤＮＡ融解温度の測定］
　１本鎖繰り返し配列（ヒトテロメア配列）とその相補的なＯＤＮ３、ＯＤＮ４を用いて融解温度測定を行なった。融解温度は１μＭの２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐを含んだプローブＯＤＮとその相補鎖を含む緩衝液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ＝７．０）を用いて、１分あたり１℃温度を上昇させ２６０ｎｍにおける吸光度の変化を観測した。ＯＤＮ３の結果を表７に、ＯＤＮ４の結果を表８に示す。
・ＯＤＮ３の配列を用いた場合
５’－ｔａｇｔａｇｔｔａ　Ｚ　ｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇ－３’（配列番号３）
３’－ａｔｃａａｔ　Ｘ　ｃｃａａｔｃｃｃ－５’（配列番号４）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
・ＯＤＮ４の配列を用いた場合
５’－ｔａｇｔａｇｔｔａｇ　Ｚ　ｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇ－３’（配列番号５）
３’－ａｔｃａａｔｃ　Ｘ　ｃａａｔｃｃｃ－５’（配列番号６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
　表７および表８に示すように、ＯＤＮ３、ＯＤＮ４のプローブでは、２－ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐを導入することで８－ｏｘｏ－ｄＧやｄＧに対する融解温度はＡｄａｐの時に比べると低下したが、ｄＧに対する減少の方が大きかったため、融解温度の差［ΔＴｍ＝Ｔｍ（８－ｏｘｏ－ｄＧ）－Ｔｍ（ｄＧ）］は大きくなり、８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧの識別能の向上が確認された。この効果は配列に影響を受け、ＯＤＮ４の方が顕著に表れた。
［蛍光応答によるＤＮＡ内８－ｏｘｏ－ｄＧの認識能の評価］
　ピリミジン鎖に２－ａｍｉｎｏＡｄａｐを組み込んだ１３Ｐｙを用いてプリン鎖１３Ｐｕ中の８－ｏｘｏ－ｄＧの検出を検討した。２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐを組み込んだ１３Ｐｙ、５’－ｃｔｔｔｃｔ　Ｘ　ｃｔｃｃｔｔ－３’（配列番号１）の５０ｎＭ溶液にＹの位置にｄＧ、８－ｏｘｏ－ｄＧを組み込んだ１３Ｐｕ、３’－ｇａａａｇａ　Ｙ　ｇａｇｇａａ－５’（配列番号２）を添加して蛍光スペクトルの変化を測定した。その結果を図４（ａ）および（ｂ）に示す。
　１３Ｐｙ　５０ｎＭ　緩衝溶液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．０、３０℃）に中に１３Ｐｕ緩衝溶液を滴下した。溶液中の１３Ｐｕ濃度は０または５０ｎＭとした。
　図４（ａ）および（ｂ）に示すように、ピリミジン鎖中に組み込んだ２－ａｍｉｎｏＡｄａｐの蛍光強度そのものは弱く、Ｐｕ　８－ｏｘｏ－ｄＧの鎖を加えた場合には、更に消光作用が観測された。一方、ＰｕｄＧの鎖を加えた場合には、蛍光強度の回復が確認された。２－ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐはピリミジン塩基で構成された一本鎖ＤＮＡ中で、周りの塩基より影響を受け、特殊な構造を形成しフェノキサジン環の蛍光が消光していると考えられる。
　次に、プリン鎖に２－ａｍｉｎｏＡｄａｐを組み込んだ１３Ｐｕを用いてピリミジン鎖１３Ｐｙ中の８－ｏｘｏ－ｄＧの検出を検討した。２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐを組み込んだ１３Ｐｕ、５’－ａａｇｇａｇ　Ｘ　ａｇａａａｇ－３’（配列番号７）の５０ｎＭ溶液にＹの位置にｄＧ、８－ｏｘｏ－ｄＧを組み込んだ１３Ｐｙ、３’－ｔｔｃｃｔｃ　Ｙ　ｔｃｔｔｔｃ－５’（配列番号８）を添加して蛍光スペクトルの変化を測定した。その結果を図５（ａ）および（ｂ）に示す。
　１３Ｐｕ　５０ｎＭ　緩衝溶液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．０、３０℃）に中に１３Ｐｙ緩衝溶液を滴下した。溶液中の１３Ｐｙ濃度は０または５０ｎＭとした。
　図５（ａ）および（ｂ）に示すように、プリン鎖中に組み込んだ２－ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐの蛍光は十分な強度を示し、Ｐｙ　８－ｏｘｏ－ｄＧを等量加えることで、蛍光は完全に消光した。また、ＰｙｄＧを加えてもその蛍光強度はほとんど変化せず、蛍光応答による完全な区別を示した。
　次いで、ヒトテロメア配列中の８－ｏｘｏ－ｄＧの検出が可能かどうか３０ｍｅｒＤＮＡ基質、ＯＤＮ３、ＯＤＮ４を用いて検討した。２－ａｍｉｎｏ　Ａｄａｐを含むＯＤＮ（ＯＤＮ３、ＯＤＮ４）１００ｎＭ緩衝溶液（１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　ｓｏｄｉｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ７．０、３０℃）中に３０ｍｅｒＯＤＮ緩衝溶液を滴下した。３０ｍｅｒＯＤＮの濃度は、０または５０ｎＭとした。ＯＤＮ３の配列を用いた場合の蛍光消光を測定した結果を図６（ａ）および（ｂ）に示す。
・ＯＤＮ３の配列を用いた場合
５’－ｔａｇｔａｇｔｔａ　Ｚ　ｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇ－３’（配列番号３）
３’－ａｔｃａａｔ　Ｘ　ｃｃａａｔｃｃｃ－５’（配列番号４）
　図６（ａ）および（ｂ）に示すように、標的ＯＤＮ配列に８－ｏｘｏ－ｄＧが存在しても、明らかな蛍光消光は観測されなかった。
　ＯＤＮ４の配列を用いた場合の蛍光消光を測定した結果を図７（ａ）および（ｂ）に示す。
・ＯＤＮ４を用いた場合
５’－ｔａｇｔａｇｔｔａｇ　Ｚ　ｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇｔｔａｇｇｇ－３’（配列番号５）
３’－ａｔｃａａｔｃ　Ｘ　ｃａａｔｃｃｃ－３’（配列番号６）
　図７（ａ）および（ｂ）に示すように、標的ＯＤＮ配列に８－ｏｘｏ－ｄＧが存在すると、蛍光の消光が観測され、ｄＧが存在してもその作用は確認されなかった。
　以上の結果より、２－ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐを含むＯＤＮは、融解温度の差による識別や蛍光消光による８－ｏｘｏ－ｄＧ検出は標的配列により影響を受けるものの、一部の配列ではＡｄａｐの機能の向上が確認された。Ａｄａｐと２－ａｍｉｎｏ－Ａｄａｐを使い分けることにより、様々な配列での８－ｏｘｏ－ｄＧの検出のために、有用である。
［培養細胞を用いた評価］
　ＨｅＬａ細胞を１０％　ＦＢＳと１００ｕｎｉｔ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地にて、５％ＣＯ２環境下３７℃にて培養した。８０～９０％コンフルエント状態で培地のみ、または２５０、５００または１０００μＭのＨ２Ｏ２水溶液を含む培地に交換し、５％ＣＯ２環境下３７℃で３０分間処理した。
　１０％ＦＢＳを含む培地を加え洗浄後、トリプシン処理にて細胞を回収した。ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｏｒ（登録商標）　ＴＩＳ　Ｋｉｔ（和光純薬）にてＤＮＡの抽出を行った。
　Ｃｙ５またはＣｙ３で標識した下記プローブ（２．５ｐｍｏｌ）と細胞より抽出したＤＮＡ（１０μｇ）およびｄＡｄａｐＴＰを含む溶液（終濃度５０μＭ）を緩衝液中（終濃度５０ｍＭ　ＮａＣｌ、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１ｍＭ　ＤＴＴ　ｐＨ７．９）に加え、９０℃で５分間加熱し、ゆっくりと冷却してアニーリングさせた。
Ｃｙ３－プローブ：ｃｃａａｔｃｃｃａａｔｃｃｃａａｔ－Ｃｙ３（配列番号１３）
Ｃｙ５－プローブ：ｃａａｔｃｃｃａａｔｃｃｃａａｔｃｃ－Ｃｙ５（配列番号１４）
　Ｋｌｅｎｏｗ　ｅｘｏ－（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ社、１．０ｕｎｉｔ）を加えて全量１０μＬで３７℃にて６０分間反応させた。反応をＬｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（９５％　ホルムアミド、２０ｍＭ　ＥＤＴＡ）で止めて、１５％　ｄｅｎａｔｕｒｅｄ　ｐｏｌｙ　ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌで２５０Ｖ、２時間泳動することで分離した。ゲルをＬＡＳ４０００（ＦｕｊｉＦｉｌｍ社）にて撮影し、蛍光バンドを定量（ｎ＝３）した。その結果を図８（ａ）および（ｂ）に示す。
　図８（ａ）および（ｂ）に示すように、未処理の細胞（Ｈ２Ｏ２　０μＭ）に比べてＨ２Ｏ２水溶液で処理した細胞では、Ｈ２Ｏ２水溶液の濃度依存的に移動度の遅いバンド、すなわちＫｌｅｎｏｗ　ｅｘｏ－によりｄＡｄａｐＴＰがプローブに取り込まれたバンドが観測された。
　この結果から、テンプレートとなるＨｅＬａ細胞より抽出したＤＮＡ中に８－ｏｘｏ－ｄＧが存在していることが示唆され、また、異なる配列を有するプローブ（Ｃｙ３プローブ、Ｃｙ５プローブ）の増加量の違いによりＤＮＡの位置で８－ｏｘｏ－ｄＧ生成量が異なることが示された。以上のように、蛍光物質でラベルしたプローブと本発明の化合物により核酸中の８－ｏｘｏ－ｄＧを検出できることがわかった。
　本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお、本出願は、２０１２年１１月１日付けで出願された米国仮出願（６１／７２１，１６２号）に基づいており、その全体が引用により援用される。
　本発明の化合物は、ＤＮＡ中の８－ｏｘｏ－ｄＧとｄＧをほぼ正確に識別することが可能な事から、疾患と８－ｏｘｏ－ｄＧとの関連の研究、特に８－ｏｘｏ－ｄＧの発生位置と疾患との関係の研究、さらには８－ｏｘｏ－ｄＧ修復酵素の活性についての研究のために有用である。

Claims (16)

  1. 　以下の式（Ｉ）で表わされるアデノシン－１，３－ジアザフェノキサジンヌクレオシドアナログ含有オリゴデオキシヌクレオチド：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　式（Ｉ）中、Ｒ１は、オリゴデオキシヌクレオチド基１（ＯＤＮ基１）であり、
    　Ｒ２は、オリゴデオキシヌクレオチド基２（ＯＤＮ基２）である。
  2. 　８－オキソデオキシグアノシン（８－ｏｘｏ－ｄＧ）検出のための請求項１記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  3. 　ラベルされた請求項１記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
  4. 　請求項１～３のいずれか１項に記載のオリゴデオキシヌクレオチドを、８－ｏｘｏ－ｄＧを含有する標的ＤＮＡにハイブリダイズさせる工程を含み、該オリゴデオキシヌクレオチドは標的ＤＮＡの少なくとも８－ｏｘｏ－ｄＧに相補する位置にＡｄａｐヌクレオシドアナログを含有するものであり、それにより該オリゴデオキシヌクレオチドが該標的ＤＮＡに選択的にハイブリダイズする、８－ｏｘｏ－ｄＧを含有する標的ＤＮＡを検出する方法。
  5. 　蛍光物質またはクエンチャー物質の一方でラベルされ、塩基配列Ａからなる請求項１に記載のオリゴデオキシヌクレオチド（以下、第１オリゴデオキシヌクレオチド）、および
    　蛍光物質またはクエンチャー物質の他方でラベルされ、塩基配列Ａに相補的な塩基配列Ｂからなるが、Ａｄａｐヌクレオシドアナログに相補する位置に天然のヌクレオチドを含有する、第２のオリゴデオキシヌクレオチド（以下、第２オリゴデオキシヌクレオチド）、
    を少なくとも備える、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドプローブ。
  6. 　前記第１オリゴデオキシヌクレオチドの５’末端が蛍光物質でラベルされ、前記第２オリゴデオキシヌクレオチドの３’末端がクエンチャー物質でラベルされている、請求項５記載のプローブ。
  7. 　請求項５または６に記載のプローブを、８－ｏｘｏ－ｄＧを含有する標的ＤＮＡに供与する工程を含み、前記第１オリゴデオキシヌクレオチドは標的ＤＮＡの少なくとも８－ｏｘｏ－ｄＧを含有する一部の塩基配列に相補的な塩基配列を有するが、８－ｏｘｏ－ｄＧに相補する位置にＡｄａｐヌクレオシドアナログを含有するものであり、それにより前記第２オリゴデオキシヌクレオチドと該標的ＤＮＡの鎖交換反応が起こり、前記蛍光物質が発光する、８－ｏｘｏ－ｄＧを含有する標的ＤＮＡを検出する方法。
  8. 　下式（ＩＩ）で表わされる化合物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     　式（ＩＩ）中、Ｒ３は、Ｈ、３’－水酸基の保護基、または、－Ｐ（ＯＲ５）Ｒ６であり、ここでＲ５はリン酸基の保護基であり、Ｒ６は窒素原子上に炭素数１から６個の同一または異なるアルキル基が２個結合したジアルキルアミノ基であり、Ｒ４は、Ｈ、または、５’－水酸基の保護基である。
  9. 　Ｒ３が－Ｐ（ＯＲ５）Ｒ６であり、このときＲ５がメチル基、２－シアノエチル基、または、２－トリメチルシリルエチル基であり、Ｒ６がジイソプロピルアミノ基であり、Ｒ４が５’－水酸基の保護基である請求項８に記載の化合物。
  10. 　Ｒ５が２－シアノエチル基であり、Ｒ４が４，４’－ジメトキシトリチル基である請求項９に記載の化合物。
  11. 　下式（ＩＩＩ）で表わされるアデノシン－１，３－ジアザフェノキサジンデオキシヌクレオチド化合物：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     　式（ＩＩＩ）中、Ｒ７はＨ、または、３’－水酸基の保護基であり、Ｒ８は、下記式で表される。　
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  12. 　ラベルされた請求項１１記載の化合物。
  13. 　８－オキソデオキシグアノシン（８－ｏｘｏ－ｄＧ）検出のための請求項１１記載の化合物。
  14. 　１または、複数の８－ｏｘｏ－ｄＧを含む標的ＤＮＡの塩基配列を、請求項１１または１２の化合物を試薬として使用して決定することを含む、該標的ＤＮＡ上の８－ｏｘｏ－ｄＧの位置を決定する方法。
  15. 　Ｓａｎｇｅｒ－ｄｉｄｅｏｘｙ法により前記塩基配列を決定する、請求項１４記載の方法。
  16. 　ＰＣＲ法により前記塩基配列を決定する、請求項１４記載の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110564811A (zh) * 2018-08-21 2019-12-13 青岛大学 富集氧化核酸的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012077800A1 (ja) * 2010-12-10 2012-06-14 国立大学法人九州大学 新規ヌクレオシドアナログ及びその利用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012077800A1 (ja) * 2010-12-10 2012-06-14 国立大学法人九州大学 新規ヌクレオシドアナログ及びその利用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TANIGUCHI Y ET AL., BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, vol. 22, 4 November 2011 (2011-11-04), pages 543 - 546 *
TANIGUCHI Y ET AL., JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 133, 27 April 2011 (2011-04-27), pages 7272 - 7275 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110564811A (zh) * 2018-08-21 2019-12-13 青岛大学 富集氧化核酸的方法
CN110564811B (zh) * 2018-08-21 2023-07-04 青岛大学 富集氧化核酸的方法

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