CN110564811A - 富集氧化核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种富集氧化核酸的方法。所示方法包括：将含有‑8‑oxo‑G或8‑oxo‑dG的核酸溶液在催化剂存在的条件下与具有叠氮基团的氨基化合物反应，将反应产物与含有二硫键的生物素的环辛炔衍生物发生环加成反应，得到生物素化的核酸；利用亲和素包被的固相载体富集所述生物素化的核酸。本发明所提供的方法对于含有8‑oxo‑dG的标准DNA以及含有8‑oxo‑G的标准RNA样本，其富集效率高达50％以上。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种富集氧化核酸的方法。
背景技术
机体在细胞中的线粒体、微粒体、质膜和胞质中的酶系统和非酶系统在代谢过程中，可以产生活性氧自由基。同时机体在受到外源化学物质和电离辐射等条件下也可能产生活性氧自由基。所述活性氧自由基可以氧化DNA或RNA中的碱基，形成羟基脱氧核苷或羟基核苷，其中8-羟基-2'-脱氧鸟苷(8-OH-dG或8-oxo-dG)和8-羟基鸟苷(8-OH-G或8-oxo-G)是主要的氧化产物。
8-oxo-dG可直接引起基因突变和癌基因表达。如Kuchino等报道：8-羟基脱氧鸟嘌呤具有同任何碱基配对的能力。脱氧鸟嘌呤的C8被羟基化后，脱氧鸟嘌呤同胞嘧啶特异性配对的能力丧失，导致DNA复制时碱基的错配，从而出现多种基因突变的形式。Wood等曾证实：在大肠杆菌中，8-氧代脱氧鸟苷具有诱导G—T置换的能力。Cheng等也报道：8_氧代脱氧鸟苷可以引起G—T和A—C置换。8-氧代脱氧鸟苷可以引起突变，ras基因激活的主要原因为点突变。Kamiya等证实：用人工合成的第12位密码子碱基G置换的原癌基因c-Ha-ras转染NTS3T3细胞，可使部分细胞发生恶性转化。在已知的大约20种DNA的加合物中，8-oxo-dG易于检出，且8-oxo-dG与基因突变明显相关，8-oxo-dG已成为研究最多的DNA碱基氧化损伤修复产物，成为研究DNA损伤修复最常用的生物学标志物(Biomarker)。
8-oxo-dG作为内源性或外源性因素对DNA氧化损伤作用的生物标志物，是一种极有前景的生物标志，通过8-oxo-dG的检测可以评估体内氧化损伤和修复的程度。氧化应激与DNA损伤的相互关系，对研究退行性疾病、衰老机制、癌发生机制、环境毒物与氧化应激的关系等具有重要意义，也可以用来评价抗氧化剂治疗DNA氧化损伤的效果。
目前8-oxo-dG的检测方法主要有32P后标记法、免疫荧光组织化学检测法、酶联免疫吸附(ELISA)法、高效液相色谱-电化学法、气质联用分析法和高效毛细管电泳等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富集氧化核酸的方法，该方法操作简单，易于实施。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明涉及一种富集氧化核酸的方法，包括：
将含有8-oxo-G或8-oxo-dG的核酸溶液在催化剂存在的条件下与具有叠氮基团的氨基化合物反应，将反应产物与含有二硫键的生物素的环辛炔衍生物发生环加成反应，得到生物素化的核酸；利用亲和素包被的固相载体富集所述生物素化的核酸。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明所提供的方法可以实现对于含有8-oxo-dG的DNA样本以及含有8-oxo-G的RNA样本的富集，其富集效率高达50％以上。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例的反应流程示意图。
具体实施方式
本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。
在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。
本发明涉及一种富集氧化核酸的方法，包括：
将含有8-oxo-G或8-oxo-dG的核酸溶液在催化剂存在的条件下与具有叠氮基团的氨基化合物反应，将反应产物与含有二硫键的生物素的环辛炔衍生物发生环加成反应，得到生物素化的核酸；利用亲和素包被的固相载体富集所述生物素化的核酸。
优选的，如上所述的富集氧化核酸的方法，所述环辛炔衍生物选自二氟化环辛炔(DIFO)、双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇(BCN)、氮杂二苯并环辛炔(DIBAC)、4-二苯并环辛炔醇(DIBO)、ADIBO或二苯基环辛炔(DBCO)中的任一种，或它们的衍生物中的任一种。
优选的，所述氨基化合物为水溶性氨基化合物。
优选的，如上所述的富集氧化核酸的方法，所述具有叠氮基团的氨基化合物为具有叠氮基团的氨基糖苷类化合物、具有叠氮基团的精胺类化合物或具有叠氮基团的亚精胺类化合物中的任一种；
优选的，所述具有叠氮基团的氨基糖苷类化合物包括叠氮化卡那霉素，叠氮化丁胺卡那霉素。
优选的，所述具有叠氮基团的氨基糖苷类化合物在反应体系中的终浓度为10-1000μM；
还可以选择30μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM或900μM。
优选的，如上所述的富集氧化核酸的方法，所述固相微球载体包括四氧化三铁磁性纳米粒子、二氧化硅纳米球、琼脂糖微球、金纳米微球、聚丙烯酰胺纳米球中的任一种。
优选的，如上所述的富集氧化核酸的方法，所述核酸溶液中的核酸为DNA或RNA；
优选的，所述核酸溶液中核酸的浓度为10-10000ng/mL；
还可以选择30ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、300ng/mL、400ng/mL、500ng/mL、600ng/mL、700ng/mL、800ng/mL、900ng/mL、1000ng/mL、2000ng/mL、3000ng/mL、4000ng/mL、5000ng/mL、6000ng/mL、7000ng/mL、8000ng/mL或9000ng/mL。
优选的，所述DNA为全基因组DNA；
优选的，所述DNA为DNA片段；
优选的，所示RNA为总RNA；
优选的，所示RNA为信使RNA；
优选的，所述RNA为RNA片段。
优选的，如上所述的富集氧化核酸的方法，所述催化剂包括六氯铱(IV)酸盐和/或六氰合铁(III)酸盐。
优选的，所述催化剂在反应体系中的终浓度为10-1000μM；
还可以选择30μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM或900μM。
优选的，如上所述的富集氧化核酸的方法，所述偶联反应的温度为4℃～100℃；
还可以选择10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。
优选的，如上所述的富集氧化核酸的方法，在利用亲和素包被的固相载体富集所述生物素化的核酸后，所述方法还包括：
打断二硫键后对所述核酸进行检测。
优选的，如上所述的富集氧化核酸的方法，所述打断二硫键的方法为使用二硫苏糖醇与所述固相载体共振荡孵育。
优选的，所述二硫苏糖醇的浓度为10μM～1500μM；
还可以选择20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1000μM、1100μM、1200μM、1300μM、1400μM。
优选的，如上所述的富集氧化核酸的方法，所述检测的方法包括：
当所示核酸为DNA时，对所述核酸使用随机引物扩增得到扩增产物；
优选的，对所述扩增产物进行测序；
优选的，所述测序的方法包括一代测序、二代测序、三代测序。
除非另有限定，本发明使用的所有技术和科学术语具有与所公开的实施方案所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然与本发明所述的方法和材料类似或等同的方法和材料可用于本实施方式的实践或测试中，但下文仍然描述了合适的方法和材料。本发明提及的所有出版物、专利申请、专利以及其他参考文献通过引用全部内容结合于本文中。在冲突的情况下，本说明书(包括定义)将起支配作用。此外，材料、方法以及实施例仅仅是说明性的，而不旨在限制。实施方式的其他特征和优点将从以下详细的说明书和权利要求中变得明显。
为了促进理解本文描述的实施方式这一目的，将参考某些实施方式，并且将使用特定语言来描述这些实施方式。本文所使用的术语仅用于描述具体实施方式目的，而不旨在限制本公开的范围。
实施例1
将基因组DNA溶解到磷酸缓冲溶液中，使其浓度为10ng/mL，加入叠氮化亚精胺和六氰合铁(III)酸钾，使其浓度各为100μM，在37摄氏度的水浴中反应30分钟。
使用DNA纯化试剂盒(或乙醇沉淀法)提取反应体系中的反应产物，并溶于磷酸缓冲溶液中，加入DBCO-PEG-生物素，使其浓度为100μM，在37摄氏度的水浴中反应1小时；然后再次使用DNA纯化试剂盒(或乙醇沉淀法)纯化反应产物，使用链霉亲和素包被的磁珠富集DNA-生物素产物(根据商品化磁珠的使用方法操作)，然后将链接DNA的磁珠在50μM的二硫苏糖醇(DTT)(或巯基乙醇)水溶液中室温震荡2小时，得到含有8-oxo-dG的DNA片段，对其进行定量或测序。
实施例2
将含有8-oxo-dG的RNA样本溶解到磷酸缓冲溶液中，使其浓度为1000ng/mL，加入叠氮化卡那霉素和六氯铱(IV)酸钾，使其浓度各为1000μM，在37摄氏度的水浴中反应30分钟。
使用RNA纯化试剂盒(或异丙醇沉淀法)提取反应体系中的反应产物，并溶于磷酸缓冲溶液中，加入ADIBO-PEG-生物素，使其浓度为1000μM，在37摄氏度的水浴中反应4小时；然后再次使用DNA纯化试剂盒(或乙醇沉淀法)纯化反应产物，使用链霉亲和素包被的磁珠富集DNA-生物素产物(根据商品化磁珠的使用方法操作)，然后将链接RNA的磁珠在500μM的二硫苏糖醇(DTT)(或巯基乙醇)水溶液中室温震荡2小时，得到含有8-oxo-dG的RNA片段，对其进行定量或测序。
实施例3
将总RNA溶解到磷酸缓冲溶液中，使其浓度为500ng/mL，加入叠氮化丁胺卡那霉素和六氯铱(IV)酸钠，使其浓度各为700μM，在37摄氏度的水浴中反应30分钟。
使用RNA纯化试剂盒(或异丙醇沉淀法)提取反应体系中的反应产物，并溶于磷酸缓冲溶液中，加入DIFO-PEG-生物素，使其浓度为700μM，在37摄氏度的水浴中反应3小时；然后再次使用RNA纯化试剂盒(或乙醇沉淀法)纯化反应产物，使用链霉亲和素包被的磁珠富集RNA-生物素产物(根据商品化磁珠的使用方法操作)，然后将链接RNA的磁珠在120μM的二硫苏糖醇(DTT)(或巯基乙醇)水溶液中室温震荡2小时，得到含有8-oxo-dG的RNA片段，对其进行定量或测序。
实施例4
如图1所示：
将DNA(基因组DNA或合成的含有8-oxo-dG的标准DNA样本)溶解到磷酸缓冲溶液中，使其浓度为50ng/mL，加入叠氮化精胺(SP-N3)和六氰合铁(III)酸钠，使其浓度各为300μM，在37摄氏度的水浴中反应30分钟。
使用DNA纯化试剂盒(或乙醇沉淀法)提取反应体系中的反应产物，并溶于磷酸缓冲溶液中，加入二苯基环辛炔-PEG-生物素，使其浓度为300μM，在37摄氏度的水浴中反应2小时；然后再次使用DNA纯化试剂盒(或乙醇沉淀法)纯化反应产物，使用链霉亲和素包被的磁珠富集DNA-生物素产物(根据商品化磁珠的使用方法操作)，然后将链接DNA的磁珠在1000μM的二硫苏糖醇(DTT)(或巯基乙醇)水溶液中室温震荡2小时，得到含有8-oxo-dG的DNA片段，对其进行定量或测序。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种富集氧化核酸的方法，其特征在于，包括：
将含有8-oxo-G或8-oxo-dG的核酸溶液在催化剂存在的条件下与具有叠氮基团的氨基化合物反应，将反应产物与含有二硫键的生物素的环辛炔衍生物发生环加成反应，得到生物素化的核酸；利用亲和素包被的固相载体富集所述生物素化的核酸。
2.根据权利要求1所述的富集氧化核酸的方法，其特征在于，所述环辛炔衍生物选自DIFO、BCN、DIBAC、DIBO、ADIBO或DBCO中的任一种，或它们的衍生物中的任一种。
3.根据权利要求1所述的富集氧化核酸的方法，其特征在于，所述具有叠氮基团的氨基化合物为具有叠氮基团的氨基糖苷类化合物、具有叠氮基团的精胺类化合物或具有叠氮基团的亚精胺类化合物中的任一种；
优选的，所述具有叠氮基团的氨基糖苷类化合物包括叠氮化卡那霉素，叠氮化丁胺卡那霉素。
4.根据权利要求1所述的富集氧化核酸的方法，其特征在于，所述固相微球载体包括四氧化三铁磁性纳米粒子、二氧化硅纳米球、琼脂糖微球、金纳米微球、聚丙烯酰胺纳米球中的任一种。
5.根据权利要求1所述的富集氧化核酸的方法，其特征在于，所述核酸溶液中的核酸为DNA或RNA；
优选的，所述DNA为全基因组DNA；
优选的，所述RNA为总RNA；
优选的，所述RNA为信使RNA。
6.根据权利要求1所述的富集氧化核酸的方法，其特征在于，所述催化剂包括六氯铱(IV)酸盐和/或六氰合铁(III)酸盐。
7.根据权利要求1所述的富集氧化核酸的方法，其特征在于，所述偶联反应的温度为4℃～100℃。
8.根据权利要求1或7所述的富集氧化核酸的方法，其特征在于，在利用亲和素包被的固相载体富集所述生物素化的核酸后，所述方法还包括：
打断二硫键后对所述核酸进行检测。
9.根据权利要求8所述的富集氧化核酸的方法，其特征在于，所述打断二硫键的方法为使用二硫苏糖醇和/或巯基乙醇与所述固相载体共振荡孵育。
10.根据权利要求8所述的富集氧化核酸的方法，其特征在于，所述检测的方法包括：
当所述核酸为DNA时，对所述核酸使用随机引物扩增得到扩增产物；
优选的，对所述扩增产物进行测序；
优选的，所述测序的方法包括一代测序、二代测序、三代测序。
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