WO2014033844A1 - 走査プローブ顕微鏡およびそれを用いた計測方法 - Google Patents

走査プローブ顕微鏡およびそれを用いた計測方法 Download PDF

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英 南部
山本　剛
小泉　英明
富博 橋詰
誠嗣 平家
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    • G01Q60/18—SNOM [Scanning Near-Field Optical Microscopy] or apparatus therefor, e.g. SNOM probes
    • G01Q60/22—Probes, their manufacture, or their related instrumentation, e.g. holders

Definitions

  • the present invention enhances physical information such as the orientation distribution of water molecules at the sample-culture solution interface in the culture solution, and the surface irregularities, potential distribution, composition distribution of molecules and proteins, and the array structure in the culture solution.
  • the present invention relates to a scanning probe microscope for measuring with spatial resolution.
  • Hydration phenomena such as biomolecules, biological tissues, and biological substrate materials are important when measuring, evaluating, and controlling biological reactions such as cell adhesion to the biological substrate material in the culture medium and subsequent extension / differentiation.
  • the hydration structure is formed from the interaction between the sample surface and water molecules and the interaction including hydrogen bonds between the water molecules at the sample-culture solution interface in the culture solution containing water as a main component. 3D structure is shown. It is considered that so-called biocompatibility typified by adhesion between the inner wall of an artificial blood vessel and erythrocytes is closely related to this hydration structure (for example, Non-Patent Document 1).
  • unevenness of the sample surface in the culture medium, potential distribution, composition distribution and arrangement structure of molecules and proteins, etc. are particularly important for biological reactions such as biomolecules, biological tissues, and biological substrate materials in the culture medium. It is a characteristic.
  • optical microscope, Raman spectroscopy, second harmonic method, sum frequency spectroscopy are methods for observing and measuring the sample-culture solution interface such as biomolecules, biological tissues, and biological substrate materials in the culture solution.
  • Nonlinear optical microscopes such as are used.
  • sum frequency spectroscopy can measure the arrangement of water molecules related to the hydration structure at the sample-culture liquid interface.
  • a non-linear optical microscope for example, in Patent Document 1, the interaction between a probe and a target is expressed by surface selectivity by water molecules, solvent molecules near the interface, or second harmonic light or sum frequency light by a labeling substance.
  • Non-linear optical methods are disclosed. However, the spatial resolution in these optical microscopes and nonlinear optical microscopes is greater than 100 nm, typically about 1 ⁇ m.
  • the scanning probe microscope is based on an atomic force microscope (AFM: Atomic Force Microscope).
  • AFM Atomic Force Microscope
  • the scanning Kelvin probe microscope which is an example of a scanning probe microscope, scans the probe surface on the sample surface while detecting the electrostatic field force acting between the cantilever with the conductive probe and the sample as the deflection of the cantilever. This is a technique for mapping the electrostatic field force distribution.
  • the probe also includes interatomic forces and the like, and the electrostatic field forces need to be separated from other interactions. For this purpose, first, the cantilever is vibrated, and the distance between the probe and the sample is adjusted so as to keep the vibration amplitude reduced by the atomic force acting when the probe and the sample are in contact with each other.
  • the position of the sample surface in the height direction is determined, and the electrostatic field force, which is a long-distance force, is detected from the phase change of the cantilever vibration in a state where the probe is separated from the sample surface by a certain distance therefrom (for example, Patent Document 2).
  • the probe is sometimes called a probe.
  • a scanning probe microscope can be expected to have a spatial resolution of about 1 nm for unevenness measurement, an electrostatic field, and a spatial resolution of about 10 nm for optical measurement.
  • the interaction region between the probe and the sample is limited to the diameter of the tip of the probe, it is generally difficult to realize a scanning probe microscope that uses a physical quantity with a weak signal like the nonlinear optical method. It is.
  • Patent Document 3 a uniform metal that efficiently induces surface-enhanced Raman scattering in a near-field microscope in which a probe is inserted into an evanescent field generated on a sample surface, and the scattered light is detected by scattering the evanescent field at the probe tip.
  • a near-field microscope probe in which particles are reproducibly coated is disclosed.
  • Non-Patent Document 2 light can be confined in the nanospace of the tip by irradiating light to a metal probe having a tip of nanometer diameter, and further, the molecule can be illuminated from the molecule as a nano light source. It has been shown that Raman scattered light can be detected with nano-spatial resolution. In particular, the localized plasmon polariton, which is a resonance phenomenon, is excited at the tip of the probe, so that the electric field intensity of light is enhanced and the scattering cross section of Raman scattering is effectively increased, thereby compensating for weak scattering ( It has been shown that a 15 nm spatial resolution is achieved.
  • a laser beam is focused on a sample to generate Raman scattered light, and the Raman scattered light is enhanced and scattered by a probe that is close or in contact with the sample, and a Raman spectrum is detected from the scattered light scattered.
  • An ultraviolet near-field optical microscope using a probe-enhanced Raman detection method is disclosed.
  • the excitation laser light is ultraviolet / deep ultraviolet laser light
  • the material at the tip of the probe is a metal having a dielectric constant of ⁇ 2 or less at the wavelength of the excitation laser.
  • vacuum evaporation is performed on the surface of a silicon probe. Therefore, an aluminum thin film having a thickness of about 25 nm and a metal particle diameter of 10 to 20 nm is preferred.
  • Patent Document 5 a near-field optical microscope that detects near-field light generated in the vicinity of a probe by light irradiation while scanning the sample with a probe (probe), the molecule adsorbed on the surface by the probe-sample distance is detected. It is disclosed that a change in minute vibration can be observed as a change in Raman scattering.
  • the light source is a laser such as He—Cd (wavelength 441 nm)
  • the probe is a probe on which 35 nm silver is deposited.
  • Patent Document 6 discloses a technique for holding the maximum value of an optical signal detected in synchronization with a laser in an optical probe microscope.
  • An object of the present invention is to measure the arrangement structure of water molecules related to the hydration structure at the interface between a sample and a culture solution such as a biomolecule, biological tissue, or biological substrate material in a culture solution with high spatial resolution.
  • An object of the present invention is to provide a scanning probe microscope that measures physical information such as unevenness on the surface of a sample, composition distribution of molecules and proteins, and an array structure in a medium or vacuum with high spatial resolution.
  • the scanning probe microscope of the present invention includes a probe, a sample holder on which a sample is placed, a vibrator that periodically displaces the position of the probe, and light in an area of the sample that is measured by the probe.
  • a scanning probe microscope comprising a light source of an incident pulsed laser, a detector for measuring the intensity of output light output from the sample by energy spectroscopy, a scanning mechanism for moving the sample holder, and a control device
  • the control device controls the relative distance between the probe and the sample, synchronizes the shortening of the distance between the probe and the sample and the irradiation of pulsed laser light, and optimizes the probe enhancement detection efficiency. It is characterized by doing.
  • the control device reduces the amplitude of the periodic displacement of the probe position by the transducer, shortens the relative distance between the probe and the sample, and It is preferable to synchronize the shortening of the distance to the sample and the irradiation of the pulsed laser beam and optimize the probe enhancement detection efficiency.
  • the measuring method using the scanning probe microscope of the present invention includes a probe, a sample holder for placing a sample, a vibrator for periodically displacing the position of the probe, and the probe in the sample by the probe. Controls the relative position between the sample holder and the probe, a light source of a pulsed laser that makes light incident on the region to be measured, a detector that measures the intensity of output light output from the sample by energy spectroscopy
  • a measurement method using a scanning probe microscope including a scanning mechanism and a control device the amplitude of periodic displacement of the probe position by the transducer is reduced, and the relative distance between the probe and the sample is shortened.
  • the probe enhancement detection efficiency is optimized by synchronizing the shortening of the distance between the probe and the sample and the irradiation of the pulsed laser beam.
  • the present invention it is possible to measure the interaction between water and molecules at the interface between a biomolecule / biological tissue / biological substrate material and the culture medium in the culture medium with high spatial resolution. It is also possible to measure physical information such as the unevenness of the sample surface, the composition distribution of molecules and proteins, and the arrangement structure in the air, atmosphere, and vacuum with high spatial resolution.
  • a probe is arranged in near-field light (evanescent light) generated on a sample surface, and the electric field intensity of light near the sample surface is determined by the near-field light from the probe and the near-field light from the sample.
  • near-field light evanescent light
  • SHG sum frequency spectroscopy
  • SHG second harmonic method
  • other linear / nonlinear optical spectroscopy is used.
  • the probe enhancement effect strongly depends on the probe-sample distance
  • the probe enhancement effect can be optimized by measuring the detected light intensity that depends on the probe-sample distance. It is based on the new knowledge that there is.
  • FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a scanning probe microscope according to Embodiment 1 of the present invention.
  • the probe 1 is installed on the vibrator 2, and the relative position to the sample 3 is controlled by the vibrator 2.
  • the probe 1 is selected from a material that amplifies and concentrates near-field light intensity near the tip when placed in incident light.
  • Raman scattering such as Raman spectroscopy or sum frequency spectroscopy
  • metals such as gold, silver, copper, and aluminum, and compounds thereof, which can effectively use surface-enhanced Raman scattering, are used. .
  • a probe obtained by depositing a gold thin film with a thickness of 1 to 20 nm on a silicon probe is used as an effective probe candidate.
  • the vibrator 2 vibrates mainly in the vertical direction of the sample 3, the distance between the probe 1 and the sample 3 is controlled to 300 nm or less, and the natural frequency of the vibrator 2 is 200 kHz to 2 MHz is used.
  • a quartz crystal vibrator that expands and contracts in the longitudinal direction is used as the vibrator 2.
  • a tuning fork type crystal vibrator that is generally used in a scanning probe microscope such as an atomic force microscope, or vibration caused by a piezo element.
  • a vibrator in which a piezo element is arranged on a child or a cantilever can be used.
  • the number of photons contained in one pulse is 2.68 ⁇ 10 15 .
  • the pulse width of the pulsed laser is 20-30 ps.
  • the tip of the probe needs to be sufficiently close to the sample surface.
  • the Raman signal enhancement effect does not appear when the distance between the probe and the sample is 26.5 nm or more. Further, since it is shown that the enhancement effect increases exponentially when the distance is 26.5 nm or less, the distance between the surface of the probe 1 and the sample 3 shown in FIG. 1 is about 2 nm or less. Is desirable.
  • the distance between the surface of the probe 1 and the sample 3 is controlled and vibrated by the vibrator 2, but the vibration period is 200 kHz to 2 MHz, and is not necessarily synchronized with the oscillation period 50 Hz to 200 kHz of a general pulsed laser. .
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the probe-sample distance and the oscillation synchronization of the pulsed laser. As shown in FIG.
  • the probe vibrates at a probe-sample distance of about 0 to several tens of nanometers in a tapping mode.
  • the feedback is turned off and the probe is forcibly brought closer to the sample.
  • the pulsed laser is synchronized with the time 36 when the distance between the short needle and the sample becomes constant (about 2 nm or less) by AFM mode feedback. Thereafter, feedback of probe vibration is applied at time 37. Then, this operation is repeated.
  • Signal maximization by this synchronization is not limited to the probe-enhanced scanning sum-frequency microscope, but is also enhanced by the probe-enhanced scanning second harmonic microscope shown in the following examples, and a probe-enhanced scanning optical probe microscope based on other nonlinear optical characteristics But you can use it.
  • the probe 1 is vibrated in a direction perpendicular to the surface of the sample 3 by the vibrator 2 at a frequency near the natural frequency of the vibrator 2 (within about ⁇ 1% of the natural frequency). Due to the interaction (force) between the probe 1 and the sample 3, there is a phase difference between the voltage applied to the vibrator 2 and the actual vibration amplitude of the vibrator 2.
  • the phase difference in this embodiment From the phase difference between the AC voltage applied to the vibrator 2 and the current flowing into the vibrator 2, the interaction (force) between the probe and the sample is known, and the distance between the probe and the sample is known.
  • the scanning mechanism 31 scans the relative position between the sample 3 and the probe 1 in the direction perpendicular to the sample and the plane direction of the sample.
  • a force microscope A force microscope
  • the distance between the probe 1 and the sample 3 is generally close to a distance of 0 nm (contact) to 100 nm at the closest position, but the probe 1 can be embedded into the sample 3.
  • the scanning mechanism 31 scans the relative position between the sample 3 and the probe 1 in the vertical direction and the plane direction of the sample while reducing the vibration amplitude of the vibrator 2 by a certain amount.
  • the distance between the needle 1 and the sample 3 can be set to 0 nm at the closest position (tapping mode AFM).
  • the probe 1 is connected to a probe power source 5 by wiring 4, and an AC voltage and a DC voltage can be applied between the probe 1 and the sample 3.
  • the surface-treated polycarbonate is used as the sample 3, and the voltage applied between the probe 1 and the sample 3 is not used.
  • the sample holder 11 includes a culture solution inlet 12 and a culture solution recovery port 13 and can hold or replace the culture solution 14. Instead of the culture solution 14, water or a solvent can be used.
  • Reference numeral 17 denotes a culture solution supply / discharge mechanism, in which a new culture solution is supplied from the culture solution supply container 18 to the sample holder 11, and a used culture solution is discharged from the sample holder 11 to the culture solution discharge container 19. .
  • a pulsed laser beam or a plurality of pulsed laser beams that are input in synchronism are input in the vicinity of the region of the sample 3 where the probe 1 is close, and the intensity of the output light 24 is measured by the detector 25 with a filter.
  • a first pulse oscillation laser beam 22 which is a green pulse oscillation laser beam having a wavelength of 532 nm and a second pulse oscillation which is a variable infrared pulse oscillation laser beam having a wavelength of 2.3 to 10 microns.
  • the laser beam 23 is input in synchronization.
  • the output light 24 is input to the detector 25 with a filter, and the intensity of the sum frequency (sum frequency) of the frequency of the first pulsed laser light 22 and the frequency of the second pulsed laser light 23 is measured.
  • sum frequency spectroscopy can be performed.
  • the peak of the wave number 3200 Kaiser and the peak of the wave number 3400 Kaiser are compared, and the ratio of the orientation of the water molecules asymmetrically bonded to the tetrahedrally coordinated water molecules at the interface between the polycarbonate and the culture solution 14 is calculated. Discuss.
  • the probe When the AFM is configured and the probe 1 and the sample 3 are sufficiently close to each other, the probe is caused by the localized plasmon polariton being excited at the tip of the probe 1 and the electric field intensity of light being enhanced. Due to the enhancement effect, the intensity of the output light 24 of the sum frequency is dramatically enhanced (probe enhanced sum frequency spectroscopy). Furthermore, by measuring the intensity of the sum frequency output light 24 at a specific wave number while scanning a part of the surface of the sample 3 with the probe 1, the orientation of water molecules at the interface between the sample 3 and the culture solution 14 is measured. The spatial distribution can be mapped with high spatial resolution (probe enhanced scanning sum frequency microscope). In this embodiment, the sum frequency output light 24 is enhanced 10,000 times by the probe enhancement effect, and the spatial resolution of the scanning sum frequency microscope is 10 nm.
  • the probe enhancement effect occurs when the distance between the probe 1 and the sample 3 is 20 nm or less.
  • the probe 1 is microvibrated at a distance of about 1 nm by the vibrator 2 to measure the distance between the probe 1 and the sample 3 (probe-sample distance).
  • the controller 26 controls the scanning mechanism 31 to measure the output of the detector 25 with the filter while changing the closest position of the probe 1 and the sample 3.
  • FIG. 3A to 3C are plots showing the probe-sample distance dependence of the detector output measured by the scanning probe microscope of this example.
  • FIG. 3A shows a case where the distance between the probe 1 and the sample 3 is relatively large and there is no effect of enhancing the probe, and when the distance between the probe and the sample is large, the pulsed laser beam blocked by the probe 1 is small.
  • an output light maximum 41 according to a geometric condition in which the probe does not block light is shown. That is, since the light is blocked when the probe 1 approaches the sample 3, the output decreases as the probe approaches.
  • FIG. 3B shows a case where the distance between the probe 1 and the sample 3 is sufficiently close and has a probe enhancement effect.
  • the pulsed laser light blocked by the probe 1 is small, and the probe The output light maximum 41 is shown based on a geometric condition where the needle does not block light.
  • the output light maximum 42 due to the probe enhancement effect is shown.
  • Pulsed laser beam incident position, incident angle, output light angle, synchronization conditions of multiple pulsed laser beams, probe 1 material and shape, vibrator 2 vibration frequency and amplitude, vibrator 2 vibration and pulse oscillation The experimental parameters for changing the probe enhancement effect, such as the synchronization condition with the laser beam, may be set so as to optimize the output light maximum 42 due to the probe enhancement effect. Further, in FIG.
  • the detector output changes as shown in FIGS. 3A and 3B, and the size of the output light maximum 42 due to the probe enhancement effect changes.
  • the incident position of the pulsed laser beam, the incident angle, the output beam angle, the synchronization conditions of the plurality of pulsed laser beams, the material and shape of the probe 1, the transducer 2 What is necessary is just to adjust experimental parameters that change the probe enhancement effect, such as the frequency, amplitude, and the synchronization condition between the vibration of the vibrator 2 and the pulsed laser beam.
  • the scanning probe microscope of Example 1 can also be used inside a cell culture apparatus.
  • the sample holder 11, the vibrator 2, the scanning mechanism 31 and the like are provided inside the cell culture device 32, and the laser oscillators 27 and 28 and the detector 25 are arranged outside the culture device 32. .
  • the pulsed laser beams 22 and 23 and the output light 24 are irradiated or detected through the window 33.
  • the window material for example, optical glass, quartz glass, or the like that transmits these light in accordance with the wavelengths of the pulsed laser light and the output light can be used.
  • the interface evaluation of a semiconductor device for example, a PN junction interface
  • battery electrode-electrolysis It can also be used for measuring and evaluating liquid interfaces.
  • the electrode / electrolyte interface of the battery is the interface between the surface and the liquid molecule similar to the biomaterial / culture solution interface, and application is expected.
  • FIG. 5 shows a scanning probe microscope provided inside the semiconductor inspection apparatus 32, which does not include the liquid supply / discharge mechanism of FIG. 4, and the sample holder 11 does not have a structure for holding liquid. .
  • the probe-enhanced scanning optical probe microscope it is possible to detect with high sensitivity by using the light of the pulsed laser having a large number of photons contained per pulse width time.
  • the probe enhancement effect is optimized and high sensitivity is achieved. Can be detected.
  • FIG. 6 is a schematic configuration diagram of a scanning probe microscope according to the second embodiment of the present invention. A description will be given centering on differences from the scanning probe microscope of the first embodiment.
  • the sample 3 is installed on the upper surface of the prism 21.
  • the sample holder 11 is made of a ring-shaped shape having no bottom, or a material that is very thin at a portion in contact with the prism 21 and that transmits pulsed laser light well.
  • the sample 3 is limited to a material that is thin and that transmits a pulsed laser beam well.
  • the pulsed laser light that is input substantially perpendicularly to the cylindrical surface of the prism 21 or a plurality of pulsed laser beams that are input in synchronization are totally reflected on the upper surface of the prism or the sample surface and scattered as output light 24.
  • the intensity of the output light 24 is measured by the detector 25 with a filter.
  • a first pulse oscillation laser beam 22 which is a green pulse oscillation laser beam having a wavelength of 532 nm and a second pulse oscillation which is a variable infrared pulse oscillation laser beam having a wavelength of 2.3 to 10 microns.
  • the laser beam 23 is input in synchronization.
  • the output light 24 is input to the detector 25 with a filter, and the intensity of the sum frequency (sum frequency) of the frequency of the first pulsed laser light 22 and the frequency of the second pulsed laser light 23 is measured.
  • sum frequency spectroscopy can be performed.
  • the peak of the wave number 3200 Kaiser and the peak of the wave number 3400 Kaiser are compared, and the ratio of the orientation of the water molecules asymmetrically bonded to the tetrahedrally coordinated water molecules at the interface between the polycarbonate and the culture solution 14 is calculated. taking measurement.
  • a probe-enhanced scanning second harmonic microscope and a probe-enhanced scanning optical probe microscope with other linear / nonlinear optical characteristics are disclosed as an embodiment of the scanning probe microscope. This embodiment will be described with reference to FIG. 1 as in the first embodiment.
  • the first pulsed laser beam 22 that is an infrared pulsed laser beam having a wavelength of 1064 nm is input near the region of the sample 3 to which the probe 1 is close.
  • the output light 24 is input to the detector 25 with a filter, and the light intensity at a frequency twice the frequency of the first pulsed laser light 22 is measured.
  • a scanning second harmonic microscope can be constructed, and the nerve activity intensity of the nerve cell is determined. Can be mapped.
  • the probe enhancement effect can be optimized as in the first embodiment, and a probe enhanced scanning second harmonic microscope can be configured.
  • the first pulsed laser beam 22 that is a green pulsed laser beam having a wavelength of 532 nm is input in the vicinity of the region of the sample 3 close to the probe 1.
  • the output light 24 is input to the detector 25 with a filter, and the light intensity of the Raman scattered light is measured.
  • cultured hepatocytes as the sample 3 and measuring Raman scattering while measuring the unevenness of hepatocytes by AFM, it is possible to map the composition distribution of molecules and proteins in the hepatocytes.
  • the probe enhancement effect can be optimized similarly to the first embodiment, and a probe enhancement scanning Raman microscope can be configured.
  • the probe-enhanced scanning CARS microscope in this example uses coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS).
  • the first pulsed laser beam 22 (angular frequency ⁇ 1) having a different angular frequency and the second pulsed laser beam 23 (angular frequency ⁇ 2) are synchronized in the vicinity of the region of the sample 3 close to the probe 1.
  • the output light 24 is input to the detector 25 with a filter, and the light intensity of the CARS light is measured.
  • AFM By measuring the light intensity of the CARS light while measuring the unevenness of the sample 3 by AFM, it is possible to map the composition distribution of the sample 3 such as molecules and proteins.
  • the probe enhancement effect can be optimized as in the first embodiment, and a probe enhancement scanning CARS microscope can be configured.
  • FIG. 7 is a schematic configuration diagram showing an example of a sample holder and electrode portions used in the scanning probe microscope of the present invention.
  • a bipotentiostat 51 controlled by the control device 26 controls the probe electrode 52, the sample electrode 53, the working electrode 54, and the reference electrode 55.
  • the potential of the culture solution 14 is measured by the reference electrode 55, the voltage of the probe 1 with respect to the culture solution 14 is applied by the probe electrode 52, and the voltage of the sample 3 with respect to the culture solution 14 is applied by the sample electrode 53. .
  • the current flowing between the culture solution 14 and the reference electrode 55 is almost zero.
  • an electric current between the working electrode 54 and the sample electrode 53 is used.
  • a voltage is applied between the probe 1 and the sample 3
  • a voltage is applied between the probe electrode 52 and the sample electrode 53.
  • the voltage and current between the probe electrode 52 and the sample electrode 53 are used as the applied voltage and the tunnel current.
  • the charge injection electrode 56 is used.
  • the vibrator 2 is vibrated at a frequency near the natural frequency (within about ⁇ 1% of the natural frequency), and the probe 1 is vibrated in a direction perpendicular to the surface of the sample 3.
  • the interaction (force) between the probe 1 and the sample 3 can be found from the phase difference between the AC voltage applied to the vibrator 2 and the current flowing into the vibrator 2, and the distance between the probe and the sample can be found.
  • Probe vibration feedback off 36 Pulse oscillation laser oscillated in synchronization with vibration 37 Probe vibration feedback on 41 Probe light Output light maximum due to geometric conditions that do not obstruct the output 42 Output light maximum due to probe enhancement effect 51 Bipotentiostat 52 Probe electrode 53 Sample electrode 54 Working electrode 55 Reference electrode 56 Charge injection electrode

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Description

走査プローブ顕微鏡およびそれを用いた計測方法
　本発明は、培養液中の試料－培養液界面における水分子の配向分布、および、培養液中の試料表面の凹凸、電位分布、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などの物理情報を高空間分解能で計測する走査プローブ顕微鏡に関する。
　培養液中における生体基板材料への細胞の接着やその後の伸展・分化などの生体反応を計測・評価・制御する場合に、生体分子・生体組織・生体基板材料などの水和現象が重要である。このとき、水和構造は、水を主成分とする培養液中における試料－培養液界面において、試料表面と水分子の相互作用、および、水分子間での水素結合を含む相互作用から形成される三次元構造を示している。人工血管の内壁と赤血球との癒着などに代表されるいわゆる生体適合性は、この水和構造と密接に関連していると考えられている（例えば、非特許文献１）。さらに、培養液中の試料表面の凹凸、電位分布、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などは、培養液中における生体分子・生体組織・生体基板材料などの生体反応に関して、特に、重要な特性である。
　培養液中における生体分子・生体組織・生体基板材料などの試料－培養液界面を観察・計測する手法として、従来は、光学顕微鏡、および、ラマン分光法、第二高調波法、和周波分光法などの非線形光学顕微鏡が用いられている。特に、和周波分光法では、試料－培養液界面における水和構造に関する水分子の配列構造を計測できる。非線形光学顕微鏡としては、例えば、特許文献１では、プローブとターゲットとの間の相互作用を、界面付近の水分子、溶媒分子、または、標識物質による第二高調波光や和周波光による表面選択性の非線形光学法が開示されている。しかし、これらの光学顕微鏡、および、非線形光学顕微鏡における空間分解能は１００ｎｍよりも大きく、典型的には１μｍ程度である。
　一方、走査プローブ顕微鏡は、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ：Ａｔｏｍｉｃ Ｆｏｒｃｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を基礎としている。走査プローブ顕微鏡の一例である、走査ケルビンプローブ顕微鏡では、導電性探針を持ったカンチレバーと試料との間に働く静電場力をカンチレバーのたわみとして検出しながら、探針を試料表面上で走査することにより静電場力分布をマッピングする手法である。探針には静電場力以外に原子間力等も加わっており、静電場力を他の相互作用から分離する必要がある。そのために、まず、カンチレバーを振動させ、探針と試料の接触時に働く原子間力により減少する振動振幅を一定に保つように探針－試料間距離を調整する。これにより試料表面の高さ方向の位置が決定され、そこから一定の距離だけ探針を試料表面から離した状態で、カンチレバーの振動の位相変化から長距離力である静電場力を検出する（例えば、特許文献２）。走査プローブ顕微鏡では、探針をプローブと呼ぶことがある。
　走査プローブ顕微鏡では、一般的に、凹凸計測で１ｎｍ程度の空間分解能、静電場、および、光計測で１０ｎｍ程度の空間分解能が期待できる。しかし、探針と試料との相互作用領域が探針先端部の直径程度に限定されるために、特に、非線形光学法のようにシグナルが弱い物理量を用いる走査プローブ顕微鏡の実現は一般的に困難である。
　この弱いシグナルを補償してラマン分光法を走査プローブ顕微鏡で実現するために、探針による表面増強ラマン散乱を用いる探針増強ラマン検出法に関する文献が開示されている。特許文献３では、サンプル表面に発生させたエバネッセント場にプローブを挿入し、プローブ先端でエバネッセント場を散乱させて散乱光を検出する近接場顕微鏡において、表面増強ラマン散乱を効率良く誘起する均一な金属粒子を再現性よくコーティングした近接場顕微鏡用プローブが開示されている。
　非特許文献２では、先端がナノメートル径の金属探針に光を照射することで、その先端のナノ空間に光を閉じこめることができ、さらにナノ光源として分子を照明することで、分子からのラマン散乱光をナノ空間分解能で検出できることが示されている。特に、共鳴現象である局在プラズモンポラリトンが探針先端に励起されるので、光の電場強度が増強され、ラマン散乱の散乱断面積が実効的に増大することで、弱散乱性が補償され（探針増強ラマン検出法）、１５ｎｍの空間分解能が実現されると示されている。
　特許文献４では、試料にレーザー光を集光させてラマン散乱光を発生させ、近接または接触させた探針によりラマン散乱光を増強し散乱させて、散乱された散乱光からラマンスペクトルを検出する、探針増強ラマン検出法を用いた紫外近接場光学顕微鏡が開示されている。このとき、励起レーザー光は紫外・深紫外レーザー光であり、探針先端の材料は励起レーザーの波長で誘電率が－２以下である金属で、例えば、シリコン製の探針の表面に真空蒸着した、膜厚が約２５ｎｍで金属粒子直径が１０～２０ｎｍであるアルミニウム薄膜が好ましいとしている。
　特許文献５では、試料をプローブ（探針）で走査しつつ、光照射によりプローブ近傍に発生する近接場光を検出する近接場光学顕微鏡により、探針－試料間距離によって表面に吸着した分子の分振動の変化がラマン散乱の変化として観測可能であることが開示されている。このとき光源はＨｅ－Ｃｄ（波長４４１ｎｍ）等のレーザー等であり、探針は３５ｎｍの銀を蒸着したプローブが用いられている。
　特許文献６では、光プローブ顕微鏡において、レーザーに同期して検出される光信号の最大値をホールドする技術が開示されている。
　しかし、これらの文献において、第二高調波法や和周波分光法を用いた走査プローブ顕微鏡は開示されておらず、また、ラマン分光法による高空間分解能の走査プローブ顕微鏡も開示されていない。
特表２００４－５３０１０５号公報 特開２０１１－２７５８２号公報 特開２００６－７１４４８号公報 特開２０１０－２８６３９７号公報 特開２０１０－７１８７１号公報 特開２００２－３１０８８０号公報
北野博巳，源明誠、高分子、５８巻、２００９年、ｐ．７４ 井上康志　外、表面科学、２６巻、２００５年、ｐ．６６７
　本発明の目的は、培養液中における生体分子・生体組織・生体基板材料などの試料－培養液界面における水和構造に関する水分子の配列構造を高空間分解能で計測し、さらに、大気中，雰囲気中，真空中等でも試料表面の凹凸、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などの物理情報を高空間分解能で計測する走査プローブ顕微鏡を提供することにある。
　本願において開示される発明のうち代表的なものを挙げれば、次の通りである。
　本発明の走査プローブ顕微鏡は、探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡において、前記制御装置は、前記探針と前記試料との相対距離を制御し、前記探針と前記試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とするものである。
　本発明の走査プローブ顕微鏡において、前記制御装置は、前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化するものが好ましい。
　また、本発明の走査プローブ顕微鏡を用いた計測方法は、探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダと前記探針の相対位置を制御する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とするものである。
　本発明によれば、培養液中で生体分子・生体組織・生体基板材料などと培養液の界面における水や分子との相互作用を高空間分解能で計測することが可能となる。また、大気中，雰囲気中，真空中等でも試料表面の凹凸、分子やたんぱく質などの組成分布や配列構造などの物理情報を高空間分解能で計測することが可能となる。
本発明の実施例１の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。 本発明の実施例１の走査プローブ顕微鏡の動作を説明する図である。 探針増強効果が無い場合の、検出器出力の探針－試料間距離依存を示すプロットである。 探針増強効果がある場合の、検出器出力の探針－試料間距離依存を示すプロットである。 探針の振動とパルス発振レーザー光の繰り返しを同期させて、探針増強効果を最適化した場合の、検出器出力の探針－試料間距離依存を示すプロットである。 本発明の実施例１の他の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。 本発明の実施例１の他の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。 本発明の実施例２の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。 本発明の実施例４の、試料ホルダおよび電極部分の一例を示す概略構成図である。
　本発明は、試料表面に生じた近接場光（エバネッセント光）中に探針を配置して、探針からの近接場光と試料からの近接場光とにより試料表面近傍の光の電場強度を増幅することにより微弱なシグナル光を補償する探針増強検出法による走査プローブ顕微鏡において、和周波分光法（ＳＦＧ）、第二高調波法（ＳＨＧ）やその他の線形・非線形光学分光法を用いるときに、探針増強効果が探針－試料間距離に強く依存するために、探針－試料間距離に依存する検出光強度を計測することにより、探針増強効果を最適化することが可能であるという新たな知見に基づくものである。
　本発明を、以下の実施例を用いて詳細に説明する。なお、発明を実施するための形態に記載され、本実施例に未記載の事項も本実施例に適用することができる。
　本実施例では、走査プローブ顕微鏡の一形態としての、探針増強走査和周波顕微鏡を開示する。図１は、本発明の実施例１の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。探針１は振動子２に設置され、試料３との相対位置は振動子２により制御される。探針１は、入射する光中に置かれたときに、先端近傍に近接場光強度が増幅・集中する材料が選択される。また、ラマン分光法や和周波分光法などのようにラマン散乱を用いる場合は、表面増強ラマン散乱を有効に用いることができる、金、銀、銅、アルミなどの金属やそれらの化合物が用いられる。シリコン探針に厚さ１～２０ｎｍの金薄膜を蒸着した探針は、有効な探針の候補として用いられる。また、本実施例においては、振動子２は主に試料３の垂直方向に振動し、探針１と試料３の距離は３００ｎｍ以下で制御され、また、振動子２の固有振動数は２００ｋＨｚ～２ＭＨｚが用いられる。本実施例では、振動子２として、長手方向に伸縮する水晶振動子が用いられるが、原子間力顕微鏡などの走査プローブ顕微鏡で一般的に用いられるチューニングフォーク型の水晶振動子、ピエゾ素子による振動子、カンチレバーにピエゾ素子を配置した振動子などを用いることができる。
　ＳＨＧ，ＳＦＧおよびその他の非線形光学現象は光強度の２乗に比例することが公知である。よって、探針増強走査和周波顕微鏡に於いても、連続発振レーザー（ＣＷレーザー）より、パルス当りの強度が強いパルス発振レーザーを使った方が圧倒的に信号検出は有利になる。例えば、探針増強ラマンに用いられている波長５３２ｎｍ，５０ｍＷのＣＷレーザーの１秒当たりの光子数は１．３４×１０１７個になる。それに対し、ＳＦＧには波長５３２ｎｍで０．１～１ｍＪのパルス発振レーザーが用いられる。１ｍＪの場合のパルス発振レーザーピーク出力を考えると１パルス当りに含まれる光子数は２．６８×１０１５個となる。ＳＦＧで用いる場合のパルス発振レーザーのパルス幅は２０－３０ｐｓである。このパルス幅（２０ｐｓ）時間当たりに含まれる先のＣＷレーザー中の光子数は２．７×１０６個となり、ＣＷレーザーに比べてパルス発振レーザーでは９桁以上光子数が多くなる。よって、ＳＨＧ，ＳＦＧ等の非線形光学特性のマッピングにはパルス発振レーザーを用いる方が圧倒的に有利となる。
　しかし、効率よくＳＦＧまたはＳＨＧ等の信号を検出するには探針先端が試料表面に充分近づいている必要がある。特許文献５によると探針と試料間距離が２６．５ｎｍ以上ではラマン信号の増強効果が現れないとされている。また、その距離が２６．５ｎｍ以下では増強効果が指数関数的に増大する事が示されているので、図１に示した探針１と試料３の表面間距離はおよそ２ｎｍ程度以下になることが望ましい。探針１と試料３の表面間距離は振動子２によって制御され振動しているが、その振動周期は２００ｋＨｚ～２ＭＨｚであり、一般的なパルス発振レーザーの発振周期５０Ｈｚ～２００ｋＨｚとは必ずしも同期しない。これを同期させる方法として、通常、フィードバックにより一定となっている探針振動のフィードバックをオフにし、強制的に探針１を試料３へ近づけその間に働く原子間力により、位相にずれが生じ探針の振幅が小さくなるが、この探針の振幅はＡＦＭ機構により常にモニター可能であるので、探針の振幅が１ｎｍ以下になるときにレーザーパルスが照射されるようにパルス発振レーザーに探針振動を同期させることで探針増強効果の最大化が実現できる。図２に、以上の探針－試料間距離とパルス発振レーザーの発振同期模式図を示す。図２に示すように、探針はタッピンングモードで探針－試料間距離０～数十ｎｍ程度間を振動している。時刻３５でフィードバックを切り、強制的に探針を試料に近づける。振幅が十分小さくなった時点でＡＦＭモードのフィードバックにより、短針－試料間距離が一定（２ｎｍ以下程度）になる時刻３６に同期させてパルス発振レーザーを同期させる。その後、時刻３７で探針振動のフィードバックをかける。そして、この動作を繰り返す。
　この同期による信号の最大化は探針増強走査和周波顕微鏡だけでなく、以下の実施例で示す探針増強走査第二高調波顕微鏡、および、その他の非線形光学特性による探針増強走査光プローブ顕微鏡でも使うことができる。
　振動子２により探針１は、振動子２の固有振動数近傍の周波数（固有振動数の±１％程度以内）で、試料３の表面に対して垂直方向に振動させられる。探針１と試料３との間の相互作用（力）により、振動子２に印加する電圧と振動子２の実際の振動振幅には位相差が生じるが、その位相差は、本実施例では、振動子２に印加する交流電圧と振動子２に流入する電流との位相差により、探針－試料間の相互作用（力）がわかり、探針－試料間距離がわかる。また、この位相差を一定にしながら、走査機構３１により試料３と探針１との相対位置を試料に垂直方向と試料の平面方向に走査することにより、走査プローブ顕微鏡の一方式である原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を構成でき、試料表面の凹凸が計測できる。探針１と試料３の距離は、一般的には、最近接位置で０ｎｍ（接触）から１００ｎｍの距離まで接近するが、探針１を試料３の内部までめり込ませることも可能である。また、振動子２の振動振幅が一定の量だけ減少するようにしながら、走査機構３１により試料３と探針１との相対位置を試料に垂直方向と試料の平面方向に走査することにより、探針１と試料３の距離を最近接位置で０ｎｍとすることもできる（タッピングモードＡＦＭ）。探針１は配線４により探針用電源５に接続され、探針１と試料３との間に交流電圧と直流電圧を印加することができる。本実施例では、試料３として、表面処理を行ったポリカーボネートを用い、また、探針１と試料３との間に印加する電圧は用いない。
　試料ホルダ１１は、培養液注入口１２と培養液回収口１３とを備え、培養液１４を、保持、または、交換できる。培養液１４のかわりに、水、または、溶媒を用いることもできる。符号１７は培養液供給排出機構を示しており、培養液供給容器１８から試料ホルダ１１に新しい培養液を供給し、また、試料ホルダ１１から培養液排出容器１９へ使用済みの培養液を排出する。
　探針１が近接する試料３の領域近傍にパルス発振レーザー光、または、同期して入力する複数のパルス発振レーザー光を入力し、フィルター付検出器２５で出力光２４の強度を計測する。本実施例では、波長５３２ｎｍの緑色パルス発振レーザー光である第一のパルス発振レーザー光２２と、波長が２．３～１０ミクロンで可変の赤外パルス発振レーザー光である、第二のパルス発振レーザー光２３を同期して入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、第一のパルス発振レーザー光２２の周波数と第二のパルス発振レーザー光２３の周波数との和の周波数（和周波）の強度を計測する。第二のパルス発振レーザー光２３の周波数に依存する和周波の出力光２４の強度を記録することにより和周波分光ができる。本実施例では、波数が３２００カイザーのピークと波数が３４００カイザーのピークを比較して、ポリカーボネートと培養液１４との界面における４面体配位した水分子と非対称結合した水分子の配向の割合を議論できる。
　ＡＦＭを構成して、探針１と試料３が十分に近接している場合には、局在プラズモンポラリトンが探針１の先端に励起され光の電場強度が増強されることに起因する探針増強効果により、和周波の出力光２４の強度が飛躍的に増強される（探針増強和周波分光法）。さらに、探針１により試料３の表面の一部を走査しながら特定の波数における和周波の出力光２４の強度を計測することにより、試料３と培養液１４との界面における水分子の配向の空間分布を高空間分解能でマッピングできる（探針増強走査和周波顕微鏡）。本実施例においては、探針増強効果により和周波の出力光２４は１００００倍に増強され、走査和周波顕微鏡の空間分解能は１０ｎｍとなる。
　ここで、本実施例の走査プローブ顕微鏡において、探針増強効果を最適化して検出器出力を最大に調整する手法を開示する。探針１、および、試料３の表面に生ずる近接場光（エバネッセント光）は、表面から距離が離れるに従い指数関数的に強度が減少する。したがって、探針増強効果は、探針１と試料３の距離が十分に近い場合だけに期待できる。本実施例においては、探針１と試料３の距離が２０ｎｍ以下であるときに探針増強効果が起こる。振動子２により探針１を１ｎｍ程度の距離で微小振動させ、探針１と試料３の距離（探針－試料間距離）を計測する。制御装置２６により、走査機構３１を制御して探針１と試料３の最近接位置を変化させながら、フィルター付検出器２５の出力を計測する。
　図３Ａ～Ｃは、本実施例の走査プローブ顕微鏡により測定された検出器出力の探針－試料間距離依存を示すプロットである。図３Ａは、探針１と試料３の距離が比較的離れていて探針増強効果が無い場合で、探針－試料間距離が大きいときに、探針１により遮られるパルス発振レーザー光が少なくなり、探針が光を遮らない幾何学的条件による出力光極大４１を示す。つまり、探針１が試料３に近づくと光が遮られるので、探針が近づくにつれて出力が小さくなる。図３Ｂは、探針１と試料３の距離が十分に近く探針増強効果がある場合で、探針－試料間距離が大きいときには、探針１により遮られるパルス発振レーザー光が少なくて、探針が光を遮らない幾何学的条件による出力光極大４１を示すが、探針－試料間距離が小さいときには、探針増強効果による出力光極大４２を示す。パルス発振レーザー光の入射位置、入射角度、出力光角度、複数のパルス発振レーザー光の同期条件、探針１の材料や形状、振動子２の振動数、振幅、振動子２の振動とパルス発振レーザー光との同期条件など、探針増強効果を変化させる実験パラメタは、探針増強効果による出力光極大４２を最適化するように設定すれば良い。さらに、図３Ｃでは、通常の測定モードとして、振動子２により探針１を振動させ、探針－試料間距離が最近接位置になったときに同期してパルス発振レーザー光を入射する場合に、探針１の振動とパルス発振レーザー光の繰り返しを同期させて、探針増強効果を最適化する場合を示している。この例は、一例として、パルス発振レーザー光の繰り返し周波数が、探針１の振動数の１／３の場合を示している。このとき、制御装置２６により、探針１の振動とフィルター付検出器２５の出力の振動の位相差を、適宜、設定する必要があるが、その位相差の値は、図３Ａ，Ｂで示す測定により設定することが本質的に重要である。探針と試料間の距離に応じて、検出器出力は図３Ａおよび図３Ｂのように変化し、さらに、探針増強効果による出力光極大４２の大きさが変化する。出力光極大４２の大きさが大きくなるように、パルス発振レーザー光の入射位置、入射角度、出力光角度、複数のパルス発振レーザー光の同期条件、探針１の材料や形状、振動子２の振動数、振幅、振動子２の振動とパルス発振レーザー光との同期条件など、探針増強効果を変化させる実験パラメタを調整すればよい。
　実施例１の走査プローブ顕微鏡は、細胞培養装置内部で使うこともできる。このときは図４に示すように、試料ホルダ１１，振動子２，走査機構３１などを細胞培養装置３２の内部に設け、レーザー発振器２７，２８および検出器２５は培養装置３２の外に配置する。そして、パルス発振レーザー光２２，２３及び出力光２４は窓３３を通して照射または検出される。窓材は、パルス発振レーザー光及び出力光それぞれの波長に合わせて、これらの光を透過する例えば光学ガラス，石英ガラス等を用いる事ができる。
　以上の実施例では主に生体分子・生体組織・生体基板材料と培養液との界面の計測・評価について述べたが、半導体デバイス（例えばＰ－Ｎ接合界面）の界面評価、電池の電極－電解液界面などの計測・評価にも用いることができる。特に、電池の電極－電解液界面は生体材料－培養液界面と同様の表面と液体分子の界面であり、応用が期待できる。電極－電解液界面の計測の場合は、図４と同様に電解液の供給排出機構があってもよいが、固体界面の評価のみに用いる場合は、図５に示すように液の供給排出機構は必要ない。図５は、走査プローブ顕微鏡を半導体検査装置３２の内部に設けたもので、図４の液の供給排出機構を備えておらず、また、試料ホルダ１１も、液を保持する構造を備えていない。
　本実施例によれば、探針増強走査光プローブ顕微鏡において、パルス幅時間当たりに含まれる光子数が多いパルス発振レーザーの光を用いることにより、高感度に検出することができる。また、探針と試料間の距離を短縮し、探針と試料間の距離が短縮したときにパルス発振レーザー光が照射されるようにしたことで、探針増強効果を最適化し、高感度に検出することができる。
　本実施例では、走査プローブ顕微鏡の一形態として、全反射法による探針増強走査和周波顕微鏡を開示する。図６は、本発明の実施例２の走査プローブ顕微鏡の概略構成図である。実施例１の走査プローブ顕微鏡と異なる部分を中心に説明する。本実施例においては、試料３はプリズム２１の上面に設置される。試料ホルダ１１は、底が無いリング状の形状、または、プリズム２１と接する部分の厚みが非常に薄く、かつ、パルス発振レーザー光を良く透過する材料を用いる。試料３は、厚みが薄く、かつ、パルス発振レーザー光を良く透過する材料に限定する。プリズム２１の円筒面にほぼ垂直に入力するパルス発振レーザー光、または、同期して入力する複数のパルス発振レーザー光は、プリズム上面、または、試料表面において全反射して、出力光２４として散乱される。フィルター付検出器２５で出力光２４の強度を計測する。本実施例では、波長５３２ｎｍの緑色パルス発振レーザー光である第一のパルス発振レーザー光２２と、波長が２．３～１０ミクロンで可変の赤外パルス発振レーザー光である、第二のパルス発振レーザー光２３を同期して入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、第一のパルス発振レーザー光２２の周波数と第二のパルス発振レーザー光２３の周波数との和の周波数（和周波）の強度を計測する。第二のパルス発振レーザー光２３の周波数に依存する和周波の出力光２４の強度を記録することにより和周波分光ができる。本実施例では、波数が３２００カイザーのピークと波数が３４００カイザーのピークを比較して、ポリカーボネートと培養液１４との界面における４面体配位した水分子と非対称結合した水分子の配向の割合を測定する。
　本実施例では、走査プローブ顕微鏡の一形態として、探針増強走査第二高調波顕微鏡、および、その他の線形・非線形光学特性による探針増強走査光プローブ顕微鏡を開示する。本実施例では、実施例１と同様に、図１を用いて説明する。
　本実施例における探針増強走査第二高調波顕微鏡では、探針１が近接する試料３の領域近傍に波長１０６４ｎｍの赤外パルス発振レーザー光である第一のパルス発振レーザー光２２を入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、第一のパルス発振レーザー光２２の周波数の２倍の周波数の光強度を計測する。試料３として、培養した神経細胞を用い、ＡＦＭにより神経細胞の凹凸を計測しながら、第二高調波強度をマッピングすることにより、走査第二高調波顕微鏡が構成でき、神経細胞の神経活動強度をマッピングできる。このとき、実施例１と同様に探針増強効果を最適化することができ、探針増強走査第二高調波顕微鏡が構成できる。
　本実施例における探針増強走査ラマン顕微鏡では、探針１が近接する試料３の領域近傍に波長５３２ｎｍの緑色パルス発振レーザー光である第一のパルス発振レーザー光２２を入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、ラマン散乱光の光強度を計測する。試料３として、培養した肝細胞を用い、ＡＦＭにより肝細胞の凹凸を計測しながら、ラマン散乱をしらべることにより、肝細胞中の分子やたんぱく質などの組成分布をマッピングできる。このとき、実施例１と同様に探針増強効果を最適化することができ、探針増強走査ラマン顕微鏡が構成できる。
　本実施例における探針増強走査ＣＡＲＳ顕微鏡では、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）を用いる。探針１が近接する試料３の領域近傍に角振動数が異なる第一のパルス発振レーザー光２２（角振動数ω１）と、第二のパルス発振レーザー光２３（角振動数ω２）を同期して入力する。出力光２４をフィルター付検出器２５に入力して、ＣＡＲＳ光の光強度を計測する。ＡＦＭにより試料３の凹凸を計測しながら、ＣＡＲＳ光の光強度をしらべることにより、試料３の分子やたんぱく質などの組成分布をマッピングできる。このとき、実施例１と同様に探針増強効果を最適化することができ、探針増強走査ＣＡＲＳ顕微鏡が構成できる。
　本実施例では、走査プローブ顕微鏡に用いる試料ホルダおよび電極部分の一例を開示する。
　図７は、本発明の走査プローブ顕微鏡に用いる、試料ホルダおよび電極部分の一例を示す概略構成図である。制御装置２６により制御するバイポテンショスタット５１は、探針電極５２、試料電極５３、作用電極５４、参照電極５５を制御する。培養液１４の電位を参照電極５５により計測して、培養液１４に対する探針１の電圧を探針電極５２により印加して、また、培養液１４に対する試料３の電圧を試料電極５３で印加する。このとき、培養液１４と参照電極５５の間に流れる電流はほとんど零である。培養液１４と試料３の間に電流を流し、例えば、化学反応を生じさせるためには、作用電極５４－試料電極５３間の電流を用いる。探針１と試料３の間に電圧を印加する場合は、探針電極５２と試料電極５３の間に電圧を印加する。本発明の実施例の走査プローブ顕微鏡において、走査トンネル顕微鏡を構成する場合は、探針電極５２と試料電極５３の間の電圧、および、電流を印加電圧、および、トンネル電流として用いる。また、試料３に電荷注入を行う場合には電荷注入電極５６を用いる。
　実施例１と同様に、振動子２を固有振動数近傍の周波数（固有振動数の±１％程度以内）で振動させ、試料３の表面に対して垂直方向に探針１を振動させる。振動子２に印加する交流電圧と振動子２に流入する電流との位相差により、探針１と試料３の間の相互作用（力）がわかり、探針－試料間距離がわかる。
　培養液中で生体分子・生体組織・生体基板材料と培養液との界面を計測・評価することが可能となり、また、培養基板、水浄化膜、培養細胞の評価に適用できる。さらに、半導体デバイスの界面や電池の電極－電解液界面などの物理情報の計測・評価に用いることができる。
１　探針
２　振動子
３　試料
４　配線
５　探針用電源
１１　試料ホルダ
１２　培養液注入口
１３　培養液回収口
１４　培養液（水、溶媒）
１５　培養液イン
１６　培養液アウト
１７　培養液供給排出機構
１８　培養液供給容器
１９　培養液排出容器
２１　プリズム
２２　第一のパルス発振レーザー光
２３　第二のパルス発振レーザー光
２４　出力光
２５　フィルター付検出器
２６　制御装置 
２７，２８　レーザー発振器
３１　走査機構
３２　細胞培養装置または半導体検査装置等
３３　窓
３５　探針振動のフィードバックオフ
３６　振動と同期して発振されるパルス発振レーザー
３７　探針振動のフィードバックオン
４１　探針が光を遮らない幾何学的条件による出力光極大
４２　探針増強効果による出力光極大
５１　バイポテンショスタット 
５２　探針電極 
５３　試料電極 
５４　作用電極 
５５　参照電極 
５６　電荷注入電極 

Claims (15)

  1. 　探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダを移動する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡において、
    　前記制御装置は、前記探針と前記試料との相対距離を制御し、前記探針と前記試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  2. 　請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記制御装置は、前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  3. 　請求項２記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記制御装置は、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させるために、探針振動のフィードバックをオフにし、強制的に前記探針を前記試料に近づけ、前記探針の振幅が小さくなった時点で前記パルス発振レーザー光が照射されるようにすることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  4. 　請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記試料表面に生じた近接場光中に前記探針を配置して、試料表面近傍の光の電場強度を増幅することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  5. 　請求項４記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記試料に対して、前記探針側からパルスレーザー光を入射させ、反射したパルスレーザー光を前記探針側で検出するようにしたことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  6. 　請求項４記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記探針と対向する位置に、上面に前記試料を設置するプリズムを設け、前記試料に対して、前記プリズム側からパルスレーザー光を入射させ、全反射したパルスレーザー光を前記プリズム側で検出するようにしたことを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  7. 　請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光は和周波光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  8. 　請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記出力光は前記パルスレーザー光の第二高調波であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  9. 　請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記出力光は前記パルスレーザー光のラマン散乱光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  10. 　請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記パルスレーザー光は、第一のパルスレーザー光と第二の波長可変パルスレーザー光であり、前記出力光はコヒーレントアンチストークスラマン散乱光であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  11. 　請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記試料ホルダは、培養液を保持・循環させる機能を有することを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  12. 　請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　少なくとも前記探針、前記振動子、前記試料ホルダおよび前記走査機構は、培養装置または検査装置内に設けられていることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  13. 　請求項１記載の走査プローブ顕微鏡において、
    　前記試料は、前記培養液中で培養される生体分子・生体細胞・生体組織などの生体材料であることを特徴とする走査プローブ顕微鏡。
  14. 　探針と、試料を載置する試料ホルダと、前記探針の位置を周期的に変位させる振動子と、前記試料において前記探針により計測される領域に光を入射するパルス発振型レーザーの光源と、前記試料から出力する出力光の強度をエネルギー分光して計測する検出器と、前記試料ホルダと前記探針の相対位置を制御する走査機構と、制御装置とを備える走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、
    　前記振動子による前記探針位置の周期的変位の振幅を減少させるとともに、前記探針と前記試料との相対距離を短縮し、前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させ、探針増強検出効率を最適化することを特徴とする走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法。
  15. 　請求項１４記載の走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法において、
    　前記探針と試料との距離の短縮とパルス発振レーザー光の照射とを同期させるために、探針振動のフィードバックをオフにするステップと、強制的に前記探針を前記試料に近づけるステップと、前記探針の振幅が小さくなった時点で前記パルス発振レーザー光を照射するステップを有することを特徴とする走査プローブ顕微鏡を用いる計測方法。
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