JP5828359B2 - ラマン共鳴の機械的検出 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年６月３０日に提出された米国仮出願番号６１／５０３，４５７及び２０１１年７月１８日に提出された米国仮出願番号６１／５０８，９６５の利得を有し、参考としてここに組み込まれる。

本発明は主に顕微鏡に関する。特に、本発明は、ラマン効果のナノメートル規模の検出のための原子力顕微鏡（Ａｆ_ｍ；ａｔｏｍｉｃ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）の使用に関する。
政府の支援

本出願は、国立保健院により授与された承認ＨＧ−０４４３１及びＨＧ−０４５４９下の政府支援からなされた。政府はこの発明に対して所定の権利を有する。

ラマン効果（Ｒａｍａｎ ｅｆｆｅｃｔ）は、化学的顕微鏡において最も広く用いられる現象の一つである。去る８０年間、この効果は、ごく単色光を持つサンプルを照射し、微量（１０^９の一部）の周波数シフトした散乱光（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｓｈｉｆｔｅｄ ｓｃａｔｔｅｒｅｄ ｌｉｇｈｔ）を検出することによって測定された。一般のラマンセットアップは、高い拒否反応（ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）、低い挿入損失、長いパスフィルターを用いることで入射ポンプ光を拒否する。その後、高分解能分光計に結合された高感度検出器により分子振動スペクトルを記録する。ラマン効果を測定しながら光ビーム又はサンプルをスキャンすることで、ラマン信号の２次元（２Ｄ）マップを生成できる。しかし、効果が光により測定されることから、ラマンベースの顕微鏡の空間分解能は、使用される光の波長によって制限される。

ラマン顕微鏡の空間分解能を向上させるべく、ラマン測定は原子力顕微鏡と結合し、チップ増強ラマン散乱法（ＴＥＲＳ；ｔｉｐ−ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）と知られた技術を生み出せばよい。ＴＥＲＳにおいて、金属原子力顕微鏡（Ａｆ_ｍ）チップは、チップ近傍でサンプルを散乱させる増強した近接場光（ｎｅａｒ−ｆｉｅｌｄ ｌｉｇｈｔ）を生成するのに使用される。その後、散乱した光が遠隔場光学（ｆａｒ−ｆｉｅｌｄ ｏｐｔｉｃｓ）により分析され、散乱体積内から発生するラマン効果を測定する。ＴＥＲＳから、単一分子から発生するラマン効果及び約１０ｎｍの空間分解能が報告された。しかし、ＴＥＲＳにより獲得されたデータの品質は、よく制御されない方式で、チップ形状に非常に敏感に依存する。また、遠隔背景信号は大きすぎ、近接場散乱からの微細信号と干渉する。そのため、ＴＥＲＳは、潜在的な有用性にもかかわらず、広く採択されるどころではない。

関心のサンプル上でラマン効果を検出する原子力顕微鏡ベースの装置及び方法は、周波数ｖ_１の第１電磁波放射線及び周波数ｖ_２の第２電磁波放射線をプローブチップ上に放出する第１及び第２電磁波源を利用する。周波数ｖ_１及び周波数ｖ_２は、プローブチップ及び当該サンプル間にラマン力相互作用を誘発するプローブチップにより採用されたサンプル上にラマン効果を誘導するように選択される。その後、ラマン力相互作用によるプローブチップ上の振動が測定される。

本発明に係る原子力顕微鏡ベースの装置は、関心のサンプルを採用する（ｅｎｇａｇｉｎｇ）プローブチップと、第１及び第２電磁波源及びセンサーと、を備える。プローブチップは、プローブチップを振動させ得る構造に結合される。第１電磁波源は、周波数ｖ_１の第１電磁波放射線をプローブチップ上に放出するように構成され、第２電磁波源は、周波数ｖ_２の第２電磁波放射線をプローブチップ上に放出するように構成される。周波数ｖ_１及び周波数ｖ_２は、プローブチップ及びサンプル間にラマン力相互作用を誘発する、サンプル上のラマン効果を誘導するように選択される。センサーは、プローブチップ及びサンプル間のラマン力相互作用によるプローブチップの振動を測定するように構成される。

本発明の他の形態及び利点は、本発明の原理の例として示された添付の図面を参照して説明される下記の詳細な説明から明らかになるであろう。

本発明の実施例に係るラマン力顕微鏡（Ｒａｍａｎ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）のダイヤグラムである。 本発明の実施例に係るラマン力顕微鏡の概略図である。 ガラス上のクマシー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ）ブルー染料分子のトポグラフィー及びラマンイメージを示す図である。図３（ａ）は、１６２５ｃｍ^−１分子共鳴に同調された（ｖ_１−ｖ_２）を持つガラス上のクマシーブルー染料分子のトポグラフィーイメージを示す図であり、図３（ｂ）は、図３（ａ）に示したトポグラフィーイメージに対応する同時記録されたシミュレーションラマン力勾配（Ｒａｍａｎ ｆｏｒｃｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）イメージを示す図であり、図３（ｃ）は、１６２５ｃｍ^−１分子共鳴に同調されていない（ｖ_１−ｖ_２）を持つガラス上のクマシーブルー染料分子のトポグラフィーイメージを示す図であり、図３（ｄ）は、イメージコントラストを表していない図３（ｃ）に示したトポグラフィーイメージに対応する同時記録されたラマンイメージを示す図である。 商用のレニショー（Ｒｅｎｉｓｈａｗ）分光計を用いて記録され、クマシーブルー分子の厚い層を形成するラマンスペクトル（実線）と比較される１６２５ｃｍ^−１ラマン共鳴を用いて（ｖ_１−ｖ_２）を同調することによって得られた図３（ｂ）に示されたイメージの分子特性の上のプローブを持って記録されたラマンスペクトル（四角）の比較グラフである。 本発明の実施例によって関心のサンプルに対するラマン効果を検出する方法のプロセスフローである。

ここに一般的に記載され、添付の図面に示された実施例のコンポーネントは、様々な異なった構成として配置及び設計されてもよいことは容易に理解されるであろう。したがって、図面に示された様々な実施例に関する下記の詳細な説明は、本開示の範囲を制限するためのものではなく、単に様々な実施例を例示するものである。実施例の様々な形態が図面に提示されるが、図面は、特に指示されない限り、必ずしも一定の割合で描かれない。

本発明はその思想及び必須の特徴から逸脱することなく他の特定の形態に実施されてもよい。記載された実施例は、単に説明のためのもので、制約的なものとして見なされない。したがって、本発明の範囲は、詳細な説明ではなく添付の特許請求の範囲により定められる。特許請求の範囲の等価の意味及び範囲内における変化はいずれも本発明の範囲に含まれる。

本明細書全体を通じて、特徴、利点又はその類似の用語に対する参照は、本発明により実現できるあらゆる特徴及び利点が、本発明の任意の単一の実施例にあるということを暗示するものではない。むしろ、特徴及び利点を参照する用語は、実施例に関連して記載された特定の特徴、利点又は特性が、本発明の少なくとも一つの実施例に含まれるということを意味する。したがって、本明細書全体を通じて、特徴、利点及び類似の用語の説明は、必ずではないが、同一の実施例を参照できる。

また、記載された本発明の特徴、利点及び特徴は、一つ以上の実施例において任意の適切な方式で結合されてもよい。当業者は、記載された説明に照らし、一つ以上の特定の実施例における特定の特徴又は利点無しで本発明が実行され得るということが認識できる。他の例において、追加の特徴及び利点が、本発明の全ての実施例に存在しなくてもよい所定の実施例に認められてもよい。

本明細書にわたって、「一実施例」、「実施例」又はその類似の用語に対する参照は、指示された実施例と結合して記載された特定の特徴、構造又は特性が本発明の少なくとも一つの実施例に含まれるということを意味する。したがって、本明細書にわたって「一実施例において」、「実施例において」、及びその類似の用語はいずれも、必須ではないが、同一の実施例を参照できる。

図１及び図２を参照すると、本発明の実施例に係るラマン力顕微鏡（Ｒａｍａｎ ｆｏｒｃｅ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）が示されている。ラマン力顕微鏡は、ＴＥＲＳ（ｔｉｐ−ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｒａｍａｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を含む別の類似アプローチと比較して、ラマン効果を用いて増強した空間分解能を達成するＡｆ_ｍベースの顕微鏡である。

ラマン効果は、光子の非弾性散乱（ｉｎｅｌａｓｔｉｃ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）である。光子が原子又は分子から散乱する時、大部分の光子は不変エネルギー及び波長をもって弾性的に散乱する。しかし、散乱する光子の小さい部分が可変エネルギー及び波長をもって散乱するが、これがラマン効果の結果である。ラマン効果により生成される光子の散乱により、従来のラマンベースの顕微鏡は、強い光源を用いてサンプルを照射し、微小量の周波数シフトした散乱光を検出することによってラマン効果を検出する。しかし、ラマン力顕微鏡１００は、ラマン誘導散乱光子を検出するよりは、むしろラマン分子振動共鳴を機械的に検出することによって、全く新規且つ期待せぬ方式でラマン効果を検出する。以下でより詳しく説明されるように、ラマン力顕微鏡は、励起した振動分子、すなわち、関心のオブジェクト又はサンプル及び分子に非常に近接したカンチレバーナノメートル規模のプローブチップ間の光パラメトリックダウンコンバージョン（ｏｐｔｉｃａｌ ｐａｒａｍｅｔｒｉｃ ｄｏｗｎ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）によって力相互作用を生成する。その後、カンチレバープローブチップに対する力相互作用の機械的効果が測定されることで、分子に対するラマン効果を検出する。したがって、ラマン力顕微鏡は、ラマン効果により非弾性的に散乱する光を単純に検出する従来のラマンベースの顕微鏡に比べて、ラマン効果を検出する完全に異なるメカニズムを利用する。

パラメトリック力検出の理論は、簡略化した古典的モデルに依存することによって理解できる。まず、研究されるサンプル、例えば、分子種（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）がカンチレバー上のプローブチップ及び基板間の空間を占めると仮定する。プローブチップとサンプル間の電界がＥであるとすれば、プローブチップ上の力（Ｆ）は、下記の通りである。

（１）

ここで、Ａは任意の定数でありε_０は自由空間誘電率であり、Ｅ^２＝（Ｅ_０ｃｏｓ２πｖ_０ｔ＋Ｅ_１ｃｏｓ２πｖ_１ｔ＋Ｅ_２ｃｏｓ２πｖ_２ｔ）^２であり、Ｅ_０、Ｅ_１、Ｅ_２はそれぞれｖ_０、ｖ_１、ｖ_２においてビームの電界振幅であり、ｘ_ｏはサンプルの線形敏感性であり、

は非線形敏感性項であり、ｑは核振動座標であり、Ｑは核振動振幅であり、ｖ_Ｒはラマン共鳴周波数である。

カンチレバーが光周波数に応答できないから、下記の時間平均力＜Ｆ＞が式１から算出される。

（２）

式（２）の第１項は、単純にプローブチップ上に入射された平均パワーから起因する力であるが、第２項は、検出可能な機械的周波数にパラメトリックダウンコンバージョンされるラマン振動から起因する力である。Ｅ_０及びＥ_１がｆ_ｍにおいて逆位相で変調され、プローブチップにおいて一定のパワーを生成するように平衡（ｂａｌａｎｃｅ）を維持すると、式（２）の第１項は一定である。ラマン共鳴において、シミュレーション励起に対する条件である

の時、

によって与えられた第２項からの力が生成され、ここで、ｖ_１はポンプレーザー光の周波数であり、ｖ_２はシミュレーションレーザー光の周波数であり、ｖ_Ｒはラマン共鳴周波数である。

この項は、ｆ_ｍでオン及びオフ変調され、ラマン信号として検出可能である。背景のないラマン信号を検出する他の技術は、ｆ１でＥ_１を変調し、ｆ２でＥ_２を変調することで、

又は

となるようにするものである。ｖ_０での平衡光ビームは除去可能である。

ラマン力を生成し検出するために、ラマン力顕微鏡１００は原子力顕微鏡によく見られるコンポーネントを使用する。図示の実施例において、ラマン力顕微鏡はタッピングモード（ｔａｐｐｉｎｇ ｍｏｄｅ）Ａｆ_ｍ技術を利用する。しかし、他の実施例において、ラマン力顕微鏡は別のスキャニングプローブ顕微鏡技術を利用してもよい。図１及び図２に示すように、ラマン力顕微鏡は、ディザー（ｄｉｔｈｅｒ）圧電コンポーネント（図１の「ディザー圧電（Ｄｉｔｈｅｒ Ｐｉｅｚｏ）」）に接続されたカンチレバー１０４上のプローブチップ１０２を備える。ディザー圧電コンポーネントは、カンチレバーの共鳴周波数ｆ_０付近でカンチレバーを駆動し、カンチレバーがＰＺＴ湾曲ＸＹＺサンプルスキャナー上に位置するサンプル上で共鳴周波数で振動するようにするのに使用される。ここで使用されるように、共鳴周波数付近は、共鳴曲線の最大の半分において全体幅により定義される周波数の範囲内を意味する。サンプルスキャナーは、プローブチップに対してサンプルを移動させるメカニズムを備える。図示の実施例において、スキャナーメカニズムは、サンプルスキャナーを粗い（ｃｏａｒｓｅ）Ｘ、Ｙ及びＺ方向に移動させるように構成される。ここで使用されるように、Ｘ及びＹ方向は、サンプルスキャナーの上面に平行な直角方向であり、Ｚ方向は、サンプルスキャナーの上面に対して法線方向である。また、カンチレバーは、カンチレバーをＺ方向に移動させ得る高速Ｚ圧電コンポーネント（図１の「高速Ｚ」）及びカンチレバーをＸ及びＹ方向に移動させ得るオフセットステージメカニズムに接続される。しかし、他の実施例において、ラマン力顕微鏡は、カンチレバー及びサンプルスキャナーのいずれか一方のみが移動するか、又はカンチレバー及びサンプルスキャナーが一つ以上の方向への移動において制限されるように設計されてもよい。

ラマン力顕微鏡１００はさらに、レーザー及び位置感知検出器（ＰＳＤ；ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を備える。レーザー及びＰＳＤは、カンチレバー１０４上に光を放出し、ＰＳＤでカンチレバーから反射された光を受信するように配置される。図１で、レーザーからカンチレバーに光を反射させるように配置された反射エレメントが示されている。他の実施例では、ラマン力顕微鏡は反射エレメント無しでレーザーからの光がカンチレバーに到達するようにレーザーを位置させることによって反射エレメントを省いてもよい。また、図示してはいないが、ラマン力顕微鏡は、レーザーからカンチレバーに、又はカンチレバーからＰＳＤに光をフォーカシングしたり操作する一つ以上の光エレメントを備えてもよい。また、他の実施例において、レーザーは、電磁波放射線を放出する任意タイプの電磁波源であってもよく、ＰＳＤは、電磁波放射線を検出し、カンチレバーの位置変化、例えば、カンチレバーの振動を感知できる任意タイプのＰＳＤであってもよい。他の実施例において、レーザー及びＰＳＤは省かれ、カンチレバーの偏向（ｄｅｆｌｅｃｔｉｏｎ）はカンチレバー構造の一部である変形センサーから生成された電圧信号から測定されてもよい。

プローブチップ１０２及びサンプル間のラマン力相互作用を生成するために、ラマン力顕微鏡１００は、プローブチップ上の２個の同一線上の光ビーム、周波数ｖ_１のポンプビーム、周波数ｖ_２のシミュレーションビームをフォーカシングする少なくとも２個のレーザー及び周波数（ｖ_１−ｖ_２）で分子振動を效率的にシミュレーションするサンプル上の回折制限スポットを含む。原則として、ラマン力顕微鏡は、周波数ｖ_１で一つの固定レーザー及び所定の周波数範囲ｖ_２ｍｉｎ乃至ｖ_２ｍａｘにわたって放出できる一つの同調可能レーザーのみを必要とし、ここで、ｖ_２はこの範囲内にある。したがって、図１で、ラマン力顕微鏡は、周波数ｖ_１で光を放出する固定波長レーザー及び周波数範囲ｖ_２ｍｉｎ乃至ｖ_２ｍａｘにわたって光を放出できる可変波長レーザーを含むものと示される（注：波長は周波数の逆である）。しかし、同調可能レーザーが所望の全体周波数範囲を十分にカバーしないと、２個以上の固定レーザーが全体周波数範囲をカバーしたり周波数範囲を増加させるのに使用されてよい。図２に示す具現例において、ラマン力顕微鏡は、７７０ｎｍ乃至８５０ｎｍをカバーする同調可能レーザー、及びラマンモジュールに含まれる７０２ｎｍ及び７６４ｎｍにおける２個の固定レーザーを含む。ラマン力顕微鏡に含まれる固定レーザーの数に関係なく、固定レーザーの少なくとも一方はポンプレーザーとして動作し、同調可能レーザーはシミュレーションレーザーとして動作するはずである。他の実施例において、固定及び同調可能レーザーは、電磁波放射線を放出する任意のタイプの電磁波源であってもよい。

ラマン力顕微鏡１００は、図１及び図２で、「２ｘＤＡＣ」とラベリングされた信号生成器をさらに備える。信号生成器は、可変オン電圧（例えば、オン電圧は１Ｖ乃至５Ｖの範囲でよい）を持つ矩形波又はサイン波の変調信号ｆｍ１，ｆｍ２を生成するように構成される。ｆｍ１及びｆｍ２のオン電圧の大きさは、固定波長レーザー及び同調可能波長レーザーの出力パワーを決定する。図２に示す具現例において、２個の固定レーザーｆｍ１−１又はｆｍ１−２のいずれか一方は、スイッチにより選択される。より多くの固定波長レーザー、例えば、４個の固定波長レーザーを持つ具現例において、スイッチはｆｍ１−１、ｆｍ１−２、ｆｍ１−３又はｆｍ１−４のいずれか一つを選択するように構成される。

固定及び同調可能レーザーからの光は、偏光維持単一モード光ファイバーに結合される。結合されたビームの一部は、それぞれのレーザー光のパワーを測定するべく、図１及び２で「Ｄｅｔ３６Ａ」とラベリングされた高速フォトダイオードパワー検出器に向かう。Ｄｅｔ３６Ａの出力は、（図２のＰＣＩ−Ｃａｒｄ ＡＭＵ２．９上の入力Ｉｎ２を用いて）それぞれの変調周波数に「ロック（ｌｏｃｋ）」することによって、独立して２個のレーザー光のパワー密度を測定できる二重周波数ロックイン（ｌｏｃｋ−ｉｎ）増幅器に供給される。測定されたパワー強度は、ｆｍ１及びｆｍ２に対するオン電圧の大きさを増加又は減少させるのに用いられ、これにより、測定されたパワー強度は、同調可能レーザーの動作周波数が変わるに従って一定に維持される。

ファイバーからの結合されたレーザー光は、手動の粗い（ｃｏａｒｓｅ）Ｚ変換（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）ステージ及び（図１及び２で「ＭＩＰＯＳ１００」とラベリングされた）微細ＰＺＴ制御Ｚフォーカスステージ上に装着された対物レンズを持つプローブチップ１０２の頂点の平面上にフォーカシングされる。逆対物レンズ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｓ）はまた、ＣＣＤカメラ（図１を参照）を用いて下部からプローブチップ及びサンプルを見るのに使用される。ＣＣＤカメラに光を提供するために、ラマン力顕微鏡１００は、ｚ変換器により制御される対物レンズを用いる光源（図１及び２の「パワーＬＥＤ」）を備える。

ラマン力顕微鏡１００により照射されるサンプルは、ＰＺＴ湾曲ＸＹＺサンプルスキャナー上に設けられたサンプルホルダー上に装着される。ＸＹＺサンプルスキャナーはＸＹ粗（ｃｏａｒｓｅ）移動ステージ上に装着され、サンプルの異なった領域をアクセスする。強いラマン力信号を生成するために、ポンプ及びシミュレーションレーザーがプローブチップの頂点にフォーカスされる間に、プローブチップ１０２はサンプルの表面に（約１ナノメートル）近接して留まる必要がある。サンプルがスキャニングされる間にプローブチップをサンプルの表面に近接して保持するために、原子力顕微鏡（Ａｆ_ｍ）に用いられる技術が採用される。Ａｆ_ｍにおいて、統合されたチップを持つマイクロ製造カンチレバーが力センサーとして使用される。カンチレバーは、よく定義された共鳴周波数ｆ_０及びｆ１を有し、周波数ｆ_０及びｆ１はそれぞれ、振動の第１及び第２モードである。矩形のカンチレバーに対して、周波数ｆ１はｆ_０の値よりも６倍ラフ（ｒｏｕｇｈ）である。プローブチップ１０２の頂点及びサンプル表面間に存在する力を測定するために、カンチレバー１０４が（図１のディザー（ｆ_０）を介して）駆動され、プローブチップがサンプル表面から遠ざかる間に数ナノメートル〜約１００ナノメートルの範囲にある振動振幅を持つ第１共鳴周波数の付近で振動する。カンチレバーの振動は、レーザーからのレーザー光をカンチレバーの後面に照射し、ＰＳＤで反射されたレーザー光をモニタすることによって測定される。ＰＳＤからの（図１でＴ−Ｂとラベリングされた）出力は、（図１でＰＣＩ−Ｃａｒｄ ＡＭＵ２．９へのＩｎ１入力を用いて）駆動周波数と同じ周波数にロックされたロックイン増幅器によりモニタされる。振動カンチレバーがサンプル表面に（数ナノメートルの距離に）さらに近づくように移動するにつれ、振動振幅は、チップとサンプル間のファンデルワールス力（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ ｆｏｒｃｅ）により減少するはずである。所望の振幅減少を設定することによって動作設定ポイントの確立ができる。サンプルがプローブチップに対してスキャンされるにつれ、振幅減少量は、サンプルの変化する表面トポグラフィーによってプローブチップ及びサンプル表面間の変化距離に従って変わるはずである（チップが表面に近いほど、振幅減少が増加する）。異なった（Ｘ，Ｙ）位置での振幅減少の値は、サンプルトポグラフィーを反映するだろう。

表面トポグラフィーをマップするより効率的な方法は、サンプルスキャナーが一定のチップ−サンプル距離を維持し、サンプルがスキャンされるにつれて一定の振幅減少を維持する必要があるＺ方向の調節量を記録することである。図示の具現例において、ラマン力顕微鏡１００は、２個のＺ変換メカニズムを用いて、サンプルスキャナーの一部である一つの低速Ｚ方向メカニズムは、大きいサンプルトポグラフィーを補償するように大きい範囲（例えば、〜２０ミクロン）を有し、プローブチップを移動させる高速Ｚ方向メカニズム（図１で「ＦａｓｔＺ」とラベリングされる）は、小さいサンプルトポグラフィーを補償するように小さい範囲（例えば、〜１ミクロン）を有する。このようなｚスキャナー移動の分離は、サンプルトポグラフィーの変化が大きくないとき、ラマン力顕微鏡がサンプルを高速でスキャン可能にする。したがって、ラマン力顕微鏡は、プローブチップ及びサンプル表面間の固定ナノメートル規模の距離を維持しながらサンプルトポグラフィーを測定し、良好なラマン力信号を得ることができる。ラマン力顕微鏡の様々なコンポーネントは、ＰＣＩ−Ｃａｒｄ ＡＭＵ２．９が設けられたコンピュータシステムと結合し、制御器（図２で「ＶＭＩ−ＨＳＣ５００」）により制御される。

（ｖ_１−ｖ_２）＝ｖ_Ｒのとき、条件を満たすことによって、シミュレーションラマン散乱があれば、プローブチップ１０２の頂点及びサンプル表面間にラマン力が存在するはずであり、ここで、ｖ_１はポンプレーザー光の周波数であり、ｖ_２はシミュレーションレーザー光の周波数であり、ｖ_Ｒはラマン力周波数である。この力は、カンチレバーの駆動周波数ｆ_０で変調され、サンプルトポグラフィーから発生する力に加えられるだろう。しかし、駆動周波数でＰＳＤ出力を測定することによって、測定された力に対する２つの寄与（ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）を差別化する方法は仮想的に存在しない。ラマン力を独立して測定するべく、ラマン力顕微鏡１００は、プローブチップ及びサンプル間のラマン力が非線形であるという事実に着目し、異なった入力を「混合」する。したがって、ポンプレーザー及びシミュレーションレーザーが周波数ｆｍ１及びｆｍ２でそれぞれ変調され、両レーザービームがプローブチップの頂点上にフォーカシングされると、レーザービームが混合されてｆｍ１＋ｆｍ２及びｆｍ１−ｆｍ２でビームを生成する。プローブチップが周波数ｆ_０の付近で振動するから、ｆ_０を持つ２個のビームの混合は、次の周波数、すなわち、ｆ_０＋ｆｍ１＋ｆｍ２、ｆ_０−ｆｍ１−ｆｍ２、ｆ_０ ＋ｆｍ１−ｆｍ２及びｆ_０−ｆｍ１＋ｆｍ２でラマン力を生成するだろう。ラマン力はそれ以上駆動周波数ｆ_０に存在しない。原則として、動作を簡略化するべく、周波数ｆｍ１又はｆｍ２をゼロと同一に設定してもよいが、このような設定は、ラマン力の理解を一層難しくするイメージ力（ｉｍａｇｅ ｆｏｒｃｅ）の寄与を導入する（イメージ力は、２０１０年８月１０に提出された米国仮出願番号６１／４０１，４９５に記載されており、ここに参考として含まれる）。４個の混合周波数での力相互作用はＴ−Ｂ ＰＳＤ出力に存在するはずである。しかし、各周波数は共鳴周波数ｆ_０から離れているため、これら周波数での振動振幅は非常に小さく、通常、検出レベルを越えるだろう。しかし、４個の混合周波数のいずれか一方の値がカンチレバーの第２共鳴モードｆ１の上にあれば、ラマン力により発生する振動振幅は大きく増幅するはずである。ラマン力顕微鏡の動作において、周波数ｆｍ１及びｆｍ２の値は、４個の混合信号のいずれか一方の周波数が周波数ｆ１と実際に一致するように選択される。その後、二重周波数ロックイン増幅器が、チップ−サンプル距離を制御するフィードバックに対する駆動周波数ｆ_０及びラマン力信号を検出する第２共鳴周波数ｆ１付近で動作する。他の実施例で、カンチレバーは、カンチレバーの任意の一つの共鳴モードで駆動され、混合信号のいずれか一方は、上述した通り、カンチレバーの任意の他の共鳴モードで検出されてもよい。

カンチレバー１０４の第２共鳴周波数ｆ１のラマン力信号は、ＰＣＩ−Ｃａｒｄ ＡＭＵ２．９が設けられたコンピュータシステムでプロセシングされる。コンピュータシステムは、一つ以上のプロセッサー、メモリー、ディスプレイ、及び入力装置、例えば、キーボード及びマウスなどの、パーソナルコンピューターによく見られる多くのコンポーネントを備える。ラマン力信号は、サンプルの異なった位置で変わるラマン力を表すサンプルのイメージを生成するのに用いられる。カンチレバーの第１共鳴周波数ｆ_０の信号はまた、コンピュータシステムでプロセシングされてトポグラフィーイメージを生成する。

特定の具現例で、ラマン力顕微鏡は、剛性定数（ｓｔｉｆｆ_ｎｅｓｓ ｃｏｎｓｔａｎｔ）（ｋ＝３Ｎ／ｍ）及び第２機械的共鳴（ｆ_０＝６５ＫＨｚ）を持つカンチレバーを使用する。カンチレバーは、金メッキスキャニングプローブ顕微鏡チップ（１０ｎｍの公称半径）を含む。ポンプレーザー及びシミュレーションレーザーに加えて、ポンプビーム変調による力検出に対する任意のスプリアス（ｓｐｕｒｉｏｕｓ）効果を除去するために、他のレーザーが変調されることで、周波数ｆ_ｍで第１ポンプビーム変調とは１８０゜位相が異なる第３同一線上ポンプビーム（光周波数ｖ_０）を生成する。第３ビームの光パワーが調節されることから、サンプル表面に存在するパワーの合計変調成分はゼロである。さらに、光周波数ｖ_０が選択され、（ｖ_０−ｖ_２）はサンプルの任意のラマン共鳴外に位置する。この方式により、周波数ｆ_ｍで検出された任意の力変調は、単にシミュレーションラマン効果により確保される。周波数ｖ_０での第３ビームに対する必要性は、変調周波数ｆ１及びｆ２にてｖ_１及びｖ_２で２個のビームをそれぞれ変調し、ｆ_ｍ＝ｆ１＋ｆ２又はｆ_ｍ＝ｆ１−ｆ２とすることによって排除される。

この具現例で用いられる３個の同一線上レーザービームは、λ０（ｖ_０）＝６３３ｎｍ、λ１（ｖ_１）＝５９４．１ｎｍ、及びλ２（ｖ_２）＝６５６ｎｍである。これらのレーザービームは、ガラス顕微鏡カバースライドを用いてフォーカシングする油浸対物レンズ（ｏｉｌ ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ ｌｅｎｓ）（ＮＡ＝１．４５）を使って１０ｎｍ金メッキシリコンチップを照らすのに用いられる。フォーカシングされたレーザービームは、ガラススライド上のオブジェクトのラマン共振を励起させる。レーザー、電磁波又は他のエネルギー源が使用されるか否かによって、カンチレバープローブチップは、当業者に周知である他の適切な金属でコーティングされればよい。このような物質は、特別なものに制限されないが、ニッケルなどの強磁性金属の他、パラジウム、金、銀、銅などの貨幣金属（ｃｏｉｎａｇｅ ｍｅｔａｌ）を含む。他の実施例で、カンチレバーのチップはコーティングされなくてもよい。チップがサンプルに近づくにつれて、励起した分子は、プローブチップ上にポンプ変調周波数ｆ_ｍで変調される引力（ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ ｆｏｒｃｅ）及び力勾配（ｆｏｒｃｅ ｇｒａｄｉｅｎｔ）を生成する。力相互作用を一層向上させるべく、放射偏光子（ＡＲＣｏｐｔｉｘ）が対物レンズの入射瞳（ｅｎｔｒａｎｃｅ ｐｕｐｉｌ）で使用され、光電界振動がプローブチップの軸に沿うようにする。対物レンズの入射瞳における各ビームの光パワーは、名目上、略２００μＷに調節される。

他の実施例で、ラマンシフト（Ｒａｍａｎ ｓｈｉｆｔ）の広い範囲が測定される必要があるとき、周波数ｖ_１のポンプビーム及び周波数ｖ_２のシミュレーションビームが同調されてもよい。他の実施例で、電磁気又は磁気励起装置はポンプ及びシミュレーション信号を生成するのに使用されてもよい。より一般的な実施例において、分子振動をシミュレーションできる一つ以上のエネルギーソースが用いられてもよい。

この具現例に対する信号回復及びイメージング方式は、図１及び図２に示したラマン力顕微鏡におけると同一である。この具現例で、レーザー変調周波数（ｆ_ｍ＝３６０ＫＨｚ）が使用される。上側波帯（ｆ_０＋ｆ_ｍ＝４２５ＫＨｚ）における力勾配信号は、カンチレバーの第２機械的共鳴と一致するように選択され、ロックイン増幅器を用いて検出可能である。ロックインに対する基準は、後段にｆ_０＋ｆ_ｍに対する帯域通過フィルターがある二重平衡ミキサー（ｄｏｕｂｌｅ ｂａｌａｎｃｅｄ ｍｉｘｅｒ）でｆ_０及びｆ_ｍ駆動信号を混合することによって導出できる。

ラマン力顕微鏡に対する実験は、クマシーブルー染料を用いて行われた。４×１０−７ｍＭ染料分子の３０μＬドロップ（ｄｒｏｐ）はピペットにおいて清潔なガラス顕微鏡カバースライド上のエタンオール中に溶解して乾燥された。観察された最も小さいトポグラフィー部分が、図３（ａ）に示すように約１０ｎｍであるが、染料は、略２５ｎｍの平均寸法を持つ分子クラスターに合わせられる。図３（ａ）の上部右側コーナー上の１０ｎｍ部分は、クマシーブルー分子の推定高さに対応する５００ｐｍ未満の高さ変化を表すトポグラフィースキャンから単一分子となるものと推論される。この実験において、トポグラフィー及びラマンイメージが同時に記録された。図３（ａ）及び図３（ｂ）はそれぞれ、レーザー周波数ｖ_２が温度同調され、（ｖ_１−ｖ_２）がクマシーブルー分子の１６２５ｃｍ^−１振動モードと一致する時のトポグラフィー及びラマンイメージである。細部事項は、トポグラフィーイメージと比較してラマンイメージから見ることができる。図３（ｃ）及び図３（ｄ）は、小さい熱的ドリフトを除いては、ラマンイメージ内の情報は示さず、同一のトポグラフィー情報のみを示す当該振動モードと離れて同調された（ｖ_１−ｖ_２）により取られた当該イメージを示す。

図３（ｂ）で、分子クラスター内の個別分子は、図３（ａ）のトポグラフィーイメージでは分解されないが、ラマンイメージで明確に見える。図面は、ラマン力顕微鏡で撮影された１、２、３、４及び５個の分子のクラスターを表す。これらクラスター内の一部の分子は非常に明るく示されるが、その他は相対的に暗い。これらのコントラスト変化は、互いに異なった励起効率を起こす光励起の入射電界に対してクラスター内の様々な分子の異なった配向から発生すると見なされる。また、ラマンイメージ（５ｎｍ）における分解能は、トポグラフィーイメージ（１０ｎｍ）におけるそれよりも優れている。これは、ラマン力顕微鏡において励起ダイポール（ｄｉｐｏｌｅ）及び相互作用力フィールドが両方とも近接場相互作用であり、プローブチップの空間次元に限定されるからである。ラマン力顕微鏡の点拡散関数（ｐｏｉｎｔ ｓｐｒｅａｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）は、励起関数及び検出器関数の積により決定される。これは、励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）が近接場内にあるが、検出が遠隔場で行われるチップ向上ラマン分光学などの他のラマンイメージング方式と比較してより狭い点拡散関数を招く。この実験におけるラマン信号のＳ／Ｎは、１Ｈｚ帯域幅で３５ｄＢと推定された。

ラマン力顕微鏡のイメージング概念をより立証するために、ラマン特徴の一つ上のプローブが位置し、ｖ_２でレーザーを温度同調することによって、応答が（ｖ_１−ｖ_２）の関数として記録された。図４は、レニショー分光計を用いて獲得したスペクトル（実線）と比較して記録されたラマンスペクトル（四角形）を示す。スペクトルの分解能は、レニショー分光計の分解能と比較して２ｃｍ^−１であった。

他の実施例において、光生成過渡種（ｐｈｏｔｏｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ）の振動モードの時間分解測定は、マルチ光子セットアップを用いて行われてもよい。このセットアップにおいて、パルスレーザービームは、励起分子の緩和動力学（ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｄｙｎａｍｉｃｓ）を測定するのに使用される。一般に、周波数ｖ_２のパルスシミュレーションレーザーと結合された周波数ｖ_１のパルスポンプレーザーは、オブジェクトを励起するだろう。その後、オブジェクトを侵害する時間τにより遅れた周波数（ｖ_１＋ｆ_ｍ）及び周波数（ｖ_２＋ｆ_ｎ）でのパルスプローブビームセットが続く。（ｆ_ｍ−ｆ_ｎ）が選択され、（ｆ_０＋ｆ_ｍ−ｆ_ｎ）がカンチレバーの第２共鳴と一致することで、分子振動を（ｆ_０＋ｆ_ｍ−ｆ_ｎ）でのカンチレバーの検出可能な機械的振動に変換させる。ｆ_０は、カンチレバーの第１共鳴周波数である。パルス幅及び遅延τを適切に選択することによって１０−１４秒だけ短い期間で発生するプロセスを研究できる。

他の実施例において、（ｆ_ｍ−ｆ_ｎ）がｆ_０での第１カンチレバー共鳴応答内に位置するように選択され、カンチレバーの機械的振動がｆ_０付近で検出される。

他の実施例において、パルスプローブビームは周波数ｖ_１及び周波数ｖ_２にあり、それぞれ周波数ｆ_ｍ及びｆ_ｎで振幅変調されることから、（ｆ_０＋ｆ_ｍ−ｆ_ｎ）又は（ｆ_０＋ｆ_ｍ＋ｆ_ｎ）又は（ｆ_０−ｆ_ｍ−ｆ_ｎ）又は（ｆ_０−ｆ_ｍ＋ｆ_ｎ）が、カンチレバーの機械的振動が検出されるカンチレバーの第２共鳴と一致する。

他の実施例において、変調周波数ｆ_ｍ及びｆ_ｎが選択され、（ｆ_ｍ−ｆ_ｎ）は、ｆ_０で第１カンチレバー応答内にあり、カンチレバーの機械的振動がｆ_０付近で検出される。

他の実施例において、周波数ｖ_２のパルスレーザーは、上述の方式においてｖ_２のＣＷレーザーに取り替えられる。

他の実施例において、時間分解測定は、広い波数範囲（ｗｉｄｅ ｗａｖｅ ｎｕｍｂｅｒ ｒａｎｇｅ）にわたるラマンスペクトルを導出するのに用いられてもよい。検出されたカンチレバー振動信号は、ロックイン増幅器などの位相感知検出器（ｐｈａｓｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｏｒ）を用いてカンチレバー振動周波数（ｆ_０＋ｆ_ｍ−ｆ_ｎ）又は（ｆ_ｍ−ｆ_ｎ）において電子レファレンス（ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）と混合される。位相感知検出器の検出された出力電圧はＶ_ｓｉｇｃｏｓθであり、ここで、θは、電子レファレンス及び検出されたカンチレバー振動信号振幅（Ｖ_ｓｉｇ）間の位相差である。検出された出力のグラフは、時間遅延τの関数として記録される。このグラフのフーリエ変換は、粗測定に用いられるパルスの逆パルス幅である周波数範囲にわたって（ｖ_１−ｖ_２）に対するラマン周波数応答を算出する。

他の実施例において、プローブチップ及びオブジェクトは気密チャンバー（ａｉｒ−ｔｉｇｈｔ ｃｈａｍｂｅｒ）内に封止され、チャンバーは低い真空状態乃至高い真空状態に真空処理されたり、気体及び液体で埋められてもよい。中間の真空状態にあるチャンバーでは、カンチレバーの増加したＱにより、励起分子を検出するプローブの敏感度がより大きくなると期待される。他の実施例において、プローブチップ及びサンプルは、液体下のサンプルを研究するべく、開放液体コンテナにおいて液体で覆われてもよい。

他の実施例において、ラマン力顕微鏡のＡｆ_ｍは、ラマン効果がプローブにより検出される間に、オブジェクト表面をタッピングせず、非接触モードで動作するはずである。ラマン力顕微鏡がカンチレバー偏向測定に対する光検出方法を利用することがここでは記載されるが、当業者にとってピエゾ抵抗磁気感知（ｐｉｅｚｏ ｒｅｓｉｓｔｉｖｅ ｓｅｌｆ−ｓｅｎｓｉｎｇ）及びせん断力（ｓｈｅａｒ−ｆｏｒｃｅ）技術などの他のカンチレバー偏向方法が用いられもよいことが明らかであろう。

結論的にいうと、本発明に係るラマン力顕微鏡は、完全に異なるチャネルを通じて、すなわち、スキャニングプローブ顕微鏡内のラマン励起分子部分及びプローブチップ、例えば、メッキプローブチップ間の力勾配を測定することによってラマン効果が検出できるということを示す。チップからの光散乱に基づく無開口近接場顕微鏡は、蛍光発光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を通じたラマン効果を含む可視光から赤外線光へのナノスケールオブジェクトの撮影において大成功したが、信号が近接場相互作用の遠隔場光検出に基づくため、非常に弱い。ラマン力顕微鏡に用いられる検出アプローチは容易に拡張され、単一分子に対するポンププローブ実験を行えることと見なされ、ここで、これを用いて単一分子レベルで分子内及び分子間結合を測定し、分子内の立体配座変化（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅ）を追跡可能でなければならない。また、開示の方法は、原子分解能ラマン分光学及びイメージングを達成するように拡張されてもよい。さらに、周波数ｖ_１及びｖ_２は、多くの柔軟性を提供するアプリケーションの要求に応じてＩＲ乃至ＵＶ周波数範囲から選択されてもよい。

この例ではカンチレバーが使用されているが、同調フォーク（ｔｕｎｉｎｇ ｆｏｒｋ）又は当業者には公知である他の機械的共鳴器が使用されてもよい。また、上記の例ではレーザービームをオブジェクト／種上にフォーカシングするのに光レンズが使用されたが、他のエネルギーフィールドが使用される実施例では、電気ビームフォーカシング装置又はマイクロウエーブストリップラインなどの他のフォーカシング装置が使用されてもよいことが当業者には明らかであろう。さらに、レーザービームがサンプルの下部からチップ及びサンプル領域に向かうことが図示されているが、レーザービームはチップ及びサンプル領域の上面又は側面からチップ及びサンプル領域に向かってもよい。上部側面の照明のために、ナノセンサーからカンチレバーのＡｄｖａｎｃｅｄＴＥＣラインのような突出チップを持つカンチレバーが使用されてもよい。

本発明の実施例によって関心のサンプル上のラマン効果を検出する方法を、図５の流れ図を参照して説明する。ブロック５０２において、プローブチップがサンプル上に配置される。プローブチップは、プローブチップを振動させ得る構造に結合される。次に、ブロック５０４で、周波数ｖ_１の第１電磁波放射線及び周波数ｖ_２の第２電磁波放射線がプローブチップ上に放出される。周波数ｖ_１及び周波数ｖ_２は、プローブチップ及びサンプル間にラマン力相互作用を誘発するサンプル上のラマン効果を誘導するように選択される。次に、ブロック５０６において、プローブチップ及びサンプル間のラマン力相互作用によるプローブチップの振動が測定される。

ここでは各方法の動作が特定の順序で図示及び記載されているが、各方法の動作の順序が変更され、所定の動作が逆順に行われてもよく、所定の動作が少なくとも部分的に他の動作と同時に行われてもよい。他の実施例において、個別動作の命令又はサブ動作は間欠的及び／又は交互方式で具現されてもよい。

諸方法に対する動作の少なくとも一部は、コンピュータにより実行されるコンピュータ使用可能記憶媒体に記憶されたソフトウェア命令を用いて具現可能である。一例として、コンピュータプログラム製品の実施例は、コンピュータ上で実行される時、コンピュータがここに記載された通りに動作を行うようにするコンピュータ読み取り可能プログラムを記憶するコンピュータ使用可能記憶媒体を含む。

また、本発明の少なくとも一部の実施例は、コンピュータ又は任意の命令実行システムにより又はそれと結合して使用されるコンピュータ使用可能又はコンピュータ読み取り可能媒体からアクセス可能なコンピュータプログラム製品の形態を取ってもよい。本説明のために、コンピュータ使用可能又はコンピュータ読み取り可能媒体は、命令実行システム、装置又はデバイスにより又はそれと結合して使用されるプログラムを含んだり、記憶したり、伝達したり、伝播したり伝送したりできる任意の装置であってもよい。

コンピュータ使用可能又はコンピュータ読み取り可能媒体は、電子、磁気、光、電磁気、赤外線又は半導体システム（又は装置又はデバイス）又は電波媒体であってよい。コンピュータ読み取り可能媒体の例としては、半導体又はソリッドステートメモリー、磁気テープ、消去可能コンピュータディスケット、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリー（ＲＯＭ）、剛性磁気ディスク及び光ディスクを含む。現在の光ディスクの例としては、ＣＤ−ＲＯＭ（ｃｏｍｐａｃｔ ｄｉｓｋ ｗｉｔｈ ｒｅａｄ ｏｎｌｙ ｍｅｍｏｒｙ）、ＣＤ−Ｒ／Ｗ（ｃｏｍｐａｃｔ ｄｉｓｋ ｗｉｔｈ ｒｅａｄ／ｗｒｉｔｅ）及びＤＶＤ（ｄｉｇｉｔａｌ ｖｉｄｅｏ ｄｉｓｋ）を含む。

上記の説明において、様々な実施例の特定の細部事項が提供される。しかし、一部の実施例は、それら特定の細部事項よりも少ない細部事項で実行されてもよい。他の例において、所定の方法、手順、コンポーネント、構造及び／又は機能は、本発明の様々な実施例の簡略化及び明瞭化のためにより詳細には説明しない。

本発明の特定の実施例が記載及び図示されたが、本発明は、記載及び図示された部分の特定形態又は配置に制限されるものではない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びその同等物により定義される。

Claims (10)

1. 関心のサンプルを採用する（ｅｎｇａｇｉｎｇ）プローブチップであって、該プローブチップは前記プローブチップを振動させ得る構造に結合される、プローブチップと、
   第１及び第２電磁波源であって、前記第１電磁波源は、周波数ｖ_１の第１電磁波放射線を前記プローブチップ上に放出するように構成され、前記第２電磁波源は、周波数ｖ_２の第２電磁波放射線を前記プローブチップ上に放出するように構成され、前記周波数ｖ_１及び周波数ｖ_２は、前記プローブチップ及び前記サンプル間にラマン力相互作用を誘発するサンプル上のラマン効果を誘導するように選択される、第１及び第２電磁波源と、
   前記プローブチップ及び前記サンプル間のラマン力相互作用による前記プローブチップの振動を測定するように構成されるセンサーと、
   を備える、原子力顕微鏡ベースの装置。
2. 前記周波数ｖ_１及び周波数ｖ_２は、前記周波数ｖ_１及び周波数ｖ_２間の差がラマン共鳴周波数と同一となるように選択される、請求項１に記載の原子力顕微鏡ベースの装置。
3. 前記第１及び第２電磁波源のそれぞれは、固定波長レーザー及び同調可能レーザーのいずれか一つである、請求項１に記載の原子力顕微鏡ベースの装置。
4. 前記第１及び第２電磁波源はそれぞれ周波数ｆｍ１及びｆｍ２で変調されて混合周波数ｆ０＋ｆｍ１＋ｆｍ２、ｆ０−ｆｍ１−ｆｍ２、ｆ０＋ｆｍ１−ｆｍ２、及びｆ０−ｆｍ１＋ｆｍ２でラマン力を生成し、ここで、周波数ｆ０は、前記プローブチップを持つ構造の駆動周波数である、請求項１に記載の原子力顕微鏡ベースの装置。
5. 前記周波数ｆｍ１及びｆｍ２は、前記混合周波数ｆ０＋ｆｍ１＋ｆｍ２、ｆ０−ｆｍ１−ｆｍ２、ｆ０＋ｆｍ１−ｆｍ２、及びｆ０−ｆｍ１＋ｆｍ２のいずれか一つが、前記プローブチップを持つ構造の第２共鳴モード周波数ｆ１の付近にあるように選択される、請求項４に記載の原子力顕微鏡ベースの装置。
6. 関心のサンプルに対するラマン効果を検出する方法であって、
   プローブチップを前記サンプル上に配置する段階であって、前記プローブチップは、前記プローブチップを振動させ得る構造に結合される、段階と、
   周波数ｖ_１の第１電磁波放射線及び周波数ｖ_２の第２電磁波放射線を前記プローブチップ上に放出する段階であって、前記周波数ｖ_１及び周波数ｖ_２は、前記プローブチップ及び前記サンプル間にラマン力相互作用を誘発するサンプル上のラマン効果を誘導するように選択される、段階と、
   前記プローブチップ及び前記サンプル間のラマン力相互作用による前記プローブチップの振動を測定する段階と、
   を含む、方法。
7. 前記周波数ｖ_１及び周波数ｖ_２は、前記周波数ｖ_１及び周波数ｖ_２間の差がラマン共鳴周波数と同一となるように選択される、請求項６に記載の方法。
8. 周波数ｖ_１の第１電磁波放射線及び周波数ｖ_２の第２電磁波放射線は、固定波長レーザー及び同調可能レーザーの少なくとも一方から放出される、請求項６に記載の方法。
9. 周波数ｖ_１の第１電磁波放射線及び周波数ｖ_２の第２電磁波放射線はそれぞれ周波数ｆｍ１及びｆｍ２で変調されて混合周波数ｆ_０＋ｆｍ１＋ｆｍ２、ｆ_０−ｆｍ１−ｆｍ２、ｆ_０ ＋ｆｍ１−ｆｍ２、及びｆ_０−ｆｍ１＋ｆｍ２でラマン力を生成し、ここで、周波数ｆ_０は、前記プローブチップを持つ構造の駆動周波数である、請求項６に記載の方法。
10. 前記周波数ｆｍ１及びｆｍ２は、前記混合周波数ｆ_０＋ｆｍ１＋ｆｍ２、ｆ_０−ｆｍ１−ｆｍ２、ｆ_０ ＋ｆｍ１−ｆｍ２、及びｆ_０−ｆｍ１＋ｆｍ２のいずかれ一つが、前記プローブチップを持つ構造の第２共鳴モード周波数ｆ１の付近にあるように選択される、請求項９に記載の方法。