WO2013163858A1

WO2013163858A1 - 一种脂肽及其衍生物、及其制备方法和应用

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Publication number: WO2013163858A1
Application number: PCT/CN2012/081556
Authority: WO
Inventors: 李冬青; 雷虎; 李红泉; 赖玉平
Original assignee: 华东师范大学
Priority date: 2012-05-04
Filing date: 2012-09-18
Publication date: 2013-11-07
Also published as: CN102659932A; CN102659932B

Abstract

本发明提供一种脂肽，其包括肽链和脂肪链，肽链和脂肪链通过肽键相连，其分子量为2848 Da，成线状，可以明显诱导防御素的表达，有效抑制金黄色葡萄球菌感染，从而预防或减少皮肤感染。本发明还公开了脂肽衍生物。本发明还公开所述脂舦及衍生物的制备方法及应用。

Description

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其是涉及一种提高宿主抗菌能力的脂舦及其衍生物、及其制备方法和应用。背景技术自 20世纪三四十年代青霉素问世以来，人钔又发现了头孢菌素类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类等诸多抗生素。抗生素在治疗人类微生物感染中发挥了重要的作用。但目前微生物耐药菌株越来越多，很多抗生素对微生物感染不再起到良好的治疗作用。因此寻找抗生素替代物成为人类越来越迫在眉睫的任务。

脂肽是由亲水的肽链和亲脂的脂肪酸链两部分组成，即由 10个左右的多肽和脂肪酸链形成环形或线性的脂肽。脂肽类物质主要源于微生物的次级代谢产物，其表现出多种生物活性。

1970年 Bemhekner和 Avigard就曾利用脂肽的抗虫特性将其作为杀虫剂使用（翟颖,吕爽。一种新型脂肽的抗菌活性研究.中国城乡企业卫生.2006,4(114): 19- 21 )。目前，脂肽类抗生素的研究引起人们的广泛关注。达托霉素（商品名： Cubisin ) 是第一个用于临床的脂肽类抗菌素，于 2003年获得美国 FDA批准上市，用于治疗由革兰氏阳性菌引起的并发性皮肤感染和结构性皮肤感染，包括耐 '甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA)及对万古霉素抗性的粪肠球菌 (VRE) , 先后在美国、德国、英国和荷兰上市。目前越来越多的脂肽类抗生素被发现，已经成为国内外生物医药研究的热点。

皮肤是人体对外界环境的第一道防线，在皮肤表面生存着各种各样的细菌。人们通常将人体皮肤表面的细菌分为 4个种类，它们分别为葡萄球菌、链球菌、丙酸菌和棒状衧菌四类。金黄色葡萄球菌属于葡萄球菌属，是一种有害菌，通常导致人体感染。金黄色葡萄球菌所引起的疾病，最常见的有三大类： ·是人体化脓性感染；二是医院内感染，通过污染的器械用品造成伤口化脓感染，注射部位化脓感染，或支气管炎、肺炎等症； ≡是食物中毒，由肠毒素引起。表皮葡萄球菌虽然也属于葡萄球菌属，但是它是一种皮肤共生菌，有文献报道表皮葡萄球菌的发酵液可以抑制金黄色葡萄球菌的感染（Lai % Cogen AL, Radek KA, et a!. Activation of TLR2 by a small molecule produced by Staphylococcus epidermidis increases antimicrobial defense against bacterial skin infections, ,) Invest Dermatol, 2010, 130(9): •2 —I—I ~ 1. 发明内容

本发明公开了一种脂肽及其衍生物，以及其制备方法和应用。该脂肽是从表皮葡萄球菌发酵液中提取获得，可以大量诱导皮肤角质形成细胞中防御素的表达，具有良好的抑制金黄色葡萄球菌感染的效果。

本发明的发明目的之一是提供一种脂肽，所述脂肽包括肽链和脂肪链，肽链和脂肪链通过肽键相连；其结构如式（1 ) 所示，成线状，分子量为 2848 Da;

SDTVnDATE

本发明的另一发明目的是提供一类脂肽衍生物，该脂肽衍生物在式（]—) 的基础上，由改变肽链或脂链的长度、亲水性或疏水性所得，所述脂肽衍生物包括肽链和脂肪链，肽链和脂肪链通过舦键相连，其结构如式（2)、（3)、（4)、（5)、 (6) 所示之任何一种；

0=C-CH2-CH2-CH3

NH VKWI 式 (2)；

0=C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3

N H

VKWI 式 (3)；

0=C-CH2-CH2-CH3

NH

IGDLVKWII 式（4);

NH VKWI 式 (5)；

0=C-CH2-CH2-CH3

NH

IISTIGDLVKWIIDTVIIDATE 式（6 其中，所述脂肽是提取自表皮葡萄球菌；所述表皮葡萄球菌包括表皮葡萄球菌 1457或表皮葡萄球菌 12228或表皮葡萄球菌 RP62A。

其中，所述脂肽在水相可以形成排油圈；薄层层析之后，用水显色形成白色条带，用茚三酮显色形成紫红色条带。

本发明的另一发明目的是提供一种脂肽的制备方法，将表皮葡萄球菌发酵，收集酸沉淀的表皮蔔萄球菌发酵液，经甲醇抽提，得到脂肽提取物，再经 HPLC纯化，得到所述脂肽。

具体步骤如下：

( 1 ) 表皮葡萄球菌发酵

① 取出表皮葡萄球菌 1457或表皮葡萄球菌 12228或表皮葡萄球菌 RP62A，划线于胰鷗大豆肉汤 (TSB ) 固体培养基上，培养至长出单菌落。

② 挑取单菌落接种于 TSB液体培养基中培养。

③ 将过夜培养的表皮葡萄球菌菌液按转接于 TSB液体培养基中发酵。

(2) 发酵液酸沉淀

① 将表皮蔔萄球菌发酵液离心。

② 将离心后的表皮葡萄球菌发酵液上清液 ]¾盐酸调节 ρίί, 静置过夜。

( 3 ) 甲醇抽提

① 将酸沉淀的表皮葡萄球菌发酵液上清离心，收集沉淀。

② 将沉淀置于甲醇中，放在搅拌器上搅拌抽提。

③ 将抽提过夜的甲醇溶液离心，收集上清。

④ 将甲醇抽提液在旋转蒸发仪上蒸千。收集沉淀，重新溶解于 PBS。

(4) HPLC纯化

将脂肽溶解后，利用分离型高压液相色谱仪 Agilent 1200和 C18柱，以含 TFA的水和 TFA 的乙腈为流动相梯度洗脱，收集各个洗脱峰，利用体外细胞实验检测各个洗脱峰诱导 beta-Ki 御素表达的能力；将具有诱导 beta-防御素表达活性的洗脱峰利 )¾一级质谱鉴定洗脱峰中物质的分子量，从而得到目的产物。

鉴定多肽序列：将目的产物在超高效液相色谱-四级衧飞行时间质谱联用仪（Waters, ACQUITY^TMUPLC&Q-'roF Premier, 上海交通大学提供）上进行二级质谱分析，根据二级质谱图算母离子解离的离子的大小，迸而推算出氨基酸的种类，该种方法也就是 de-novo测序，最终确定多肽的序列。

鉴定脂肪酸链序列：将脂肽充分千燥后，加入甲醇和浓硫酸，加热。旋转蒸发所有溶剂后，加入己垸抽提，最后经双蒸水洗涤。将己垸抽提液旋转蒸发。利用日本岛津 GCMS-QP2010 气质眹仪（上海交通大学提供）和 ¾>.l(0.25mm*0.25um*30m) 色谱柱，分析所得到的物质。根据气质联用分析结果，鉴定该脂肽中的脂肪酸序列。

本发明中，脂肪酸结合在多肽序列上的赖氨酸位点上所构成的脂肽及其衍生物才具有抗感染活性。通过合成脂肽并验证其活性，从而确定本发明脂肽及其衍生物的结构。

就目的产物的浓度测定，可通过 BCA™ Protein Quality Kit测定 PBS中脂肽提取物中的蛋白含量。

本发明的另一发明目的是提供脂肽衍生物的制备方法。该脂肽衍生物的多肽链的合成是通过固相合成方法合成的，该脂肽衍生物的脂肪酸通过邻苯二甲酰丁辛酯（BCP) 与 N-甲基吗啉（NMM ) 接在所述多肽链上。

本发明脂肽可以直接抑制痤疮丙酸杆菌的生长。

本发明还提供了所述脂趺及其衍生物在制备抗感染药物中的应用。

本发明还提供了所述脂肽及其衍生物在在制备抗金黄色蔔萄球菌感染药物中的应用。本发明还提供了所述脂肽及其衍生物在化妆用品、洗涤用品、保湿 ]¾品中作为添加剂的应用

本发明中，所述脂肽及其衍生物与 TLR2受体结合，激活 p38 MAPK信号通路，诱导角质形成细胞表达防御素。所述脂肽及其衍生物在刺激人体皮肤角质形成细胞后，细胞裂解液可抑制抗金黄色葡萄球菌的生长。脂肽及其衍生物诱导皮肤抗菌肽表达量的大大提高，而提高抗感染的能力。本发明脂肽在皮肤共生菌葡萄球菌发酵液中提取纯化获得。利用脂肽诱导防御素表达的机制，以激活 TLR2-p38 MAPK信号通路诱导防御素表达。

本发明对脂肽在动物体内、外的生物学活性进行了研究。

用不同浓度的脂肽刺激人原代角质形成细胞（NHEK), 发现与对照组相比，本发明脂肽处理组的具有抑制革兰氏阳性细菌生长的抗菌肽 beta-防御素的表达量被大量诱导表达，其中 hBD3 的表达上调 2000倍以上, liBD2 的表达也可以上调 100 倍以上，具有极显著性差异 (ρ<0·001 )。

本发明脂肽刺激分离得到的 C57BL/6小鼠的角质形成细胞，发现脂肽可以显著性地诱导小鼠角质形成细胞中 beta-防御素 mBDs的表达。

在证明脂肽可以诱导人角质形成细胞产生防御素后，将 NHEK细胞用脂肽刺激 24小时后，收集细胞，超声波破碎，收集细胞裂解液上清。将 10μ_§的细胞裂解液与 10⁶CFLI的表皮葡萄球菌 1457、金黄色葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌以及大肠杆菌 DH5a共同孵育 3h (37°C )，然后梯度稀释，取 ΙΟμΙ点在固体平板上检测细胞裂解液对细菌的抑制作用。结果发现脂肽刺激 ΝΗΕΚ细胞后， ΝΉΕΚ裂解液可以抑制金黄色葡萄球菌的生长，但对表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌和大肠杯菌 DH5a的生长无影响。

在证明脂肽可以在体外增强角质形成细胞抑制金黄色葡萄球菌生长的能力之后，继续在小鼠上验证其作用。具体方法是：将 8周的小鼠背部毛发去除， 24小^后，皮间注射脂肽或 PBS , 脂肽剂量为 2mg/kg， 22小时后再-一次皮间注射脂肽， 2··3小时后，在相同位置注射 OD₆oo=0.7-0.8的金黄色葡萄球菌，金黄色葡萄球菌注射前与含 2% cyiodex beads的 P:BS等体积混合均匀。金黄色葡萄球菌的剂量为每只 ΙΟΟμΙ ( 1.75- 2xl0⁷CFU)。每天观察小鼠背部皮肤的感染情况并拍照。三天后取对照组和脂肽注射组小鼠感染部位的皮肤、肝脏、脾脏，组织匀浆后，梯度稀释检测感染部位细菌的数量。可见脂肽可以明显捭制金黄色葡萄球菌对小鼠皮趺的感染。脂肽注射组小鼠皮肤和肝脏中细菌含量显著低于 PBS注射组，脾脏中没有检测出明显的差异。

本发明的脂肽及其衍生物在诱导防御素表达中的应用。

研究在野生型（ ^+A)和？ 2^小鼠上检测脂肽抑制金黄色葡萄球菌感染的情况，发现在 Τίτ2敲除后小鼠不能再抵抗金黄色葡萄球菌的感染。

用本发明脂駄分别注射？7r2^4/+小鼠和 r2- 小鼠的耳朵，刺激 24h后，剪 T耳朵，提取 RNA,检测脂肽诱导 mBDs 表达的情况。发现本发明脂肽可以诱导 37r2^+A小鼠 mBD4的表达, 但是在 ΤΙΓΓ'- 小鼠中没有诱导 mBD4的表达。

用 PBS、脂肽、 SB2()2190(p38 MAPK inhibitor)、脂肽加 SB202190分别刺激 ΝΉΕΚ细胞发现，加入脂肽可以显著性的诱导 hBDs的表达。而加入了抑制剂之后則不能诱导 hBDs的表达。在小鼠角质形成细胞上我门重复出了相同的结果。将 2 ·2敲除后发现脂肽不能诱导 mBDs 的表达。

用 PBS、脂肽、 SB202190(p38 MAPK inhibitor)、脂肽加 SB202190分别刺激 NHEK细胞; 发现脂趺可以诱导 p38的磷酸化，而加入了抑制剂则不能诱导 p38的磷酸化。说明脂肽是通过激活 p38 MAP 信号通路来诱导防御素的表达。

本发明提供的可以诱导防御素表达、预防或减少皮肤感染的脂肽衍生物，通过化学方式合成该脂肽衍生物。然后用不同浓度的脂肽衍生物刺激人原代角质形成细胞（ΝΉΕΚ ) 细胞, 发现与对照组相比，脂肽衍生物都可以诱导人 β-防御素 2的表达。在合成的一系列衍生物中，如式 6所述脂肽衍生物诱导防御素最明显。与式 2、 3、 4、 5脂肽衍生物比较分析，发现多肽序列对脂肽诱导防御素表达非常重要，将多肽序列截短之后，即使保持脂肪酸链长短不变也显著降低脂肽诱导防御素表达的活性。跗图说明

图 1表示本发明实施例 1和 2中表皮葡萄球菌分离的脂肽薄层层析分析。

图 2表示本发明实施例 3脂肽高效液相色谱分析。

图 3表示本发明实施例 3脂肽的一级质谱分析。

图 4表示本发明实施例 3脂舦的一级质谱分析。

图 5表示本发明实施例 3脂肽的一级质谱分析。

图 6表示本发明实施例 3脂肽二级质谱结果。

图 7表示本发明脂肽抑制痤疮丙酸杼菌的生长

图 8A表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素的表达。

图 8B表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素的表达。

图 9A表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素抑制金黄色葡萄球菌的生长。

图 9B表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素不抑制表皮葡萄球菌的生长。

图 9C表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素不抑制痤疮丙酸杆菌的生长。

图 91)表示本发明脂肽诱导角质形成细胞防御素不抑制大肠衧菌的生长。

图 10表示本发明不同浓度脂肽诱导角质形成细胞防御素抑制金黄色葡萄球菌的生长。图 11A表示本发明脂肽对 ΝΉΕΚ细胞的毒性及增值的影响。

图 11B表示本发明脂肽对 NHEK细胞的毒性及增值的影响。

图 12A表示本发明脂肽裨制金黄色葡萄球菌对小鼠的感染。

图 12B表示本发明脂肽抑制金黄色葡萄球菌对小鼠的感染。

图 12C表示本发明脂肽在金黄色葡萄球菌感染后对小鼠体重的影响。

图 12D表示本发明脂肽抑制金黄色葡萄球菌对小鼠皮肤的感染。

图 12E表示本发明脂肽抑制金黄色葡萄球菌对小鼠肝脏的感染。

图 12F表示本发明脂肽对金黄色葡萄球菌对小鼠脾脏的影响。

图 13表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达。

图 14A表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达。

图 14B表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防銜素的表达。

图 14C表示本发明脂趺激活 TLR2诱导防掏素的表达。

图 14D表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达。

图 14E表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达。图 14F表示本发明脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达。

图 15A表示本发明脂肽通过激活 p38 MAPK信号通路诱导人 β -防掏素 2的表达。

图 15B表示本发明脂肽通过激活 p38 MAPK信号通路诱导人 β -防御素 3的表达。

图 16A表示本发明脂肽通过激活 p38 MAP 信号通路诱导小鼠 β ··防御素 4的表达。图 16B表示本发明脂趺通过激活 p38 MAPK信号通路诱导小鼠 β -防御素 4的表达。图 17A表示本发明脂肽衍生物诱导角质形成细胞防御素的表达。

图 17B表示本发明脂肽衍生物诱导角质形成细胞防御素的表达。

图 17C表示本发明脂肽衍生物诱导角质形成细胞防御素的表达。

图 17D表示本发明脂肽衍生物诱导角质形成细胞防銜素的表达。

图 17E表示本发明脂舦衍生物诱导角质形成细胞防御素的表达。

图 18A表示本发明脂肽衍生物对 ΝΉΕΚ细胞的毒性及其增殖的影响。

图 18B表示本发明脂肽衍生物对 ΝΗΕΚ细胞的毒性及其增殖的影响。

图 18C表示本发明脂肽衍生物对 ΝΉΕΚ细胞的毒性及其增殖的影响。

图 18D表示本发明脂肽衍生物对 ΝΗΕΚ细胞的毒性及其增殖的影响。

图 18E表示本发明脂肽衍生物对 ΝΗΕΚ细胞的毒性及其增殖的影响。

图 19A表示本发明含有脂肽衍生物的涂抹液诱导小鼠防御素的表达。

图 ₁₉Β表示本发明含有脂肽衍生物的涂抹液诱导小鼠防御素的表达。

图 20A表示 PBS的 I1PLC图。

图 20B表示脂肽的 HPLC图。

图 20C表示对照组小鼠皮趺中不含有脂肽衍生物。

图 20[)表示实验组小鼠皮肤吸收本发明涂抹液中含有的脂肽衍生物。

具体实施方法结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所 ^的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施俩 1 : 脂肽的分离纯化。

Smyth.'iliomas et al. Isolation and Analysis of Lipopeptides and High olecular Weight Biosurfec【ants, 2010。选用的菌种为表皮蔔萄球菌 1457。

( 1 ) 表皮葡萄球菌发酵 ① 于. ·80Ό取出保存的表皮葡萄球菌 1457，划线于胰酶大豆肉汤（TSB)固体培养基上， 37 ^!Ό , I6h, 至长出单菌落。

② 挑取单菌落接种于 20ml TSB液体培养基中培养， 37'C , 220q>m,16h。

③ 将过夜培养的表皮葡萄球菌菌液按 1%转接于 200mi TSB 液体培养基中发酵， 3TC , 220— rpm, 16h。

(2) 发酵液酸沉淀

① 将表皮葡萄球菌发酵液离心。〗000(kpm, 4。C , 20min。

② 将离心后的表皮葡萄球菌发酵液上清液用 6M盐酸调节至 ρΗ^.Ο, 静置过夜。

(3) 甲醇袖提

① 将酸沉淀的表皮葡萄球菌发酵液上清离心。 OOOOrpm, 4。C , 20min o 收集沉淀。

② 将沉淀置于甲醇中，放在搅拌器上搅拌抽提 16h，温度为 37Ό。

③ 将抽提过夜的甲醇溶液离心。 lOOOOipm, 4°C , 20min。收集上清。

④ 将甲醇抽提液在旋转蒸发仪上蒸干。收集沉淀，重新溶解于 PBS。

(4) HPLC纯化

将上述步骤获得的脂肽溶解后，利用分离型高压液相色谱仪 Agilent 1200和 C18柱，以含 0.1% TFA的水和 0.1% TFA的乙腈为流动相梯度洗脱，收集各个洗脱峰，得到目标产物。

(5 ) 浓度测定

通过 BCA™ Protein Quality Kit 测定 PBS中脂肽提取物中的蛋白含量。

在上述表皮葡萄球菌发酵步骤中，本发明也可选用表皮葡萄球菌 12228、表皮葡萄球菌 RP62A或其他表皮葡萄球菌作为菌种，其他实验条件及步骤与上述相同。

实施例 2: 脂肽的鉴定。

将实施例 1分离的脂趺取 10μ:Ι点在薄层层析板上，点样位置是距离下边缘 1cm处。将层析板放在展层剂预饱和的层析缸内。展层剂为正丁醇：乙酸；水 =4:2:1。展层剂跑到距层析板上边缘 lcm处后停止层析。放在通风厨内晾千。然后将板放在水里面 5mi 之后在通风厨自然晾干。观察板上的脂肽的位置。完全晾干后在板上喷 0,25%的茚王酮，置于 60Ό烘箱内， lOmiti后观察板上的脂肽。实验结果如图 1所示，脂肽在水相形成排油圈，经薄层层析之后，用水显色产生白色条带， ]¾茚三酮显色在相对应的位置产生紫红色条带。

实施例 3: 脂肽 HPLC分析及分子量鉴定，多肽序列的鉴定

将实施例 1分离得到的脂肽上样到高压液相色谱分析仪 (上海中科新生命公司提供)上。以含 0.1% TFA的水和 0.1 % ΪΡΆ的乙腈为流动相梯度洗脱, 80mi 然后，将洗脱峰分别用多肽质谱分析分子量。经 HPLC分析，如图 2所示，得到三个主峰，出峰时间分别是 lOmin, 69min, 70min。经过多肽质谱分析，如图 3所示，出峰时间为 lOmin的峰表明有两种物质，其分子量分别是 1437和 1621。如图 4所示，出峰时间为 69min的峰表明有一种物质分子量为 2491。如图 5所示，出峰时间为 70min的峰对应的物质的分子量为 2848。

经如实施例 7所述的体外细胞实验检测，分子量为 2848的物质具有抗病原菌感染活性，即是实施例 1制备得到的脂肽。分子量为 1437、 1621或 2491的其他物质均不具有抗病原菌感染活性。

鉴定脂肽的多肽序列：将出峰时间为 70min的洗脱峰在超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱联用仪（Waters,ACQUITY' UPLC&Q-TOF Premiei;上海交通大学提供）上进行二级质谱分析，得到如图 6所示的二级质谱图，利用 de novo 测序，分析该脂肽的多肽序列为- DIISTIGDLVKWIIDTVIID ATE。

实施俩 4 鉴定脂肽中的脂肪酸链

1. 取 3mg实施例 1所得脂飲，充分干燥。

2. 加入 0.95ml甲醇和 0.05ml浓硫酸。 90°C加热 151ι。

3. 旋转蒸发千溶剂后，加入 1ml己垸抽提。

4. 加入 1ml双蒸水洗涤。将己烷抽提液转移至新的溶剂瓶内，旋转蒸发。

5. 气质眹分析脂肪酸序列。

利 ]¾日本岛津 GCMS- QP2010气质联用仪（上海交通大学提供）和 hp- l(0.25mm*().25um*30m) 色谱柱，分析上述步骤 4所得到的物质。根据气质联分析结果，经鉴定该脂肽中的脂肪酸序列为： CH₃-(CH₂)₁₉-COOHo

通过以上实施例 2、 3和 4确定实施例 1所得到的脂肽结构。经体外细胞实验表明，只有当该脂肽中的脂肪酸结合在多肽序列上的赖氨酸位点上的情况下，所构成的脂肽才具有抗感染活性。而当脂肪酸与多肽序列通过其他方式结合所构成的物质并不具有本发明的抗感染活性。实施例 5: 脂舦在抗病原微生物感染中的应 ]¾

将 10μ₈的实施例 1所得脂肽与 10⁶CFU的痤疮丙酸杆菌， 37Ό共孵育 3h,然后梯度稀释，取 ΙΟμΙ点在固体培养基平板上，与不含脂肽的对照组（PBS) 相比，发现该脂肽可以抑制痤疮丙酸杼菌的生长，实验结果如图 7所示，其中， **表示 ρ<0,01 , *表示 ρ<0,(〕5。

实施例 6 脂肽诱导人角质形成细胞防御素的表达。

用不同浓度的实施例 1所得脂趺刺激人角质形成细胞 (ΝΗΕΚ)细胞 24小时，然后提取细胞的总 RNA, 反转录成 cDNA后， real-time RTPCR检测 β --防御素 2 (hBD2)和 β -防御素 3

(WBD3) 的表达。实验结果表明，如图 8Α、图 8Β所示，脂肽诱导 ΝΗΕΚ表达大量 hBD2 和 hBD3, 与对照组（PBS组.，未加入脂肽，表达量设为 1 ) 相比，脂肽处理组 hBD3的表达量上调 2000倍以上， hBD2的表达量上调 100倍以上。

实施例 1 脂肽诱导角质形成细胞防御素抑制金黄色葡萄球菌的生长

将 NHEK细胞用实施例 1所得脂肽刺激 24小时后，收集细胞，超声波破碎，收集细胞裂解液上清。将 10μ_§的细胞裂解液与 10⁶CFU的表皮葡萄球菌】457、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 DH5a、痤疮丙酸杆菌共同孵育 3h ( 37°C ), 然后梯度稀释，取 ΙΟμΙ点在固体平板上检测细胞裂解液对细菌的抑制作用。实验结果表明，如图 9Α所示，与对照组（PBS组）相比， ΝΗΕΚ细胞受脂肽刺激之后，其裂解液可以明显捭制金黄色葡萄球菌的生长。如图 9Β , 图 9C、图 9D所示，与对照组（PBS组）相比， NHEK细胞受脂肽刺激之后，其裂解液对表皮葡萄球菌 ₁₄₅₇、痤疮丙酸杆菌、大肠杆菌 DH5a的生长无影响。

结合实施例 5可见，脂肽本身可以抑制痤疮丙酸杯菌的生长，脂肽诱导 NHEK细胞后产生防御素，防御素抑制金黄色葡萄球菌的生长。

实施例 8: 不同浓度脂肽诱导角质形成细胞防御素抑制金黄色葡萄球菌的生长

分别用不同浓度的实施例 1所得脂肽刺激 NHEK细胞 24小时后，收集细胞，经超声波破碎，收集细胞裂解液上清。将 10μ_§的细胞裂解液与 10⁶CFU的金黄色葡萄球菌共同孵育 3h ( 37Ό ), 然后梯度稀释，取 ΙΟμΙ点在固体平板上检测细胞裂解液对金黄色蔔萄球菌的抑制作。如图 10所示，实验结果表明，用 2.5 g/mi 2i^g/mi脂肽刺激 NHEK细胞后，其裂解液可以明显抑制金黄色葡萄球菌的生长，但当脂肽浓度降低到 ig/ml以 ^, ΝΉΕΚ细胞裂解液则不能抑制金黄色葡萄球菌的生长。

实施例 9 脂肽对 NHEK细胞的毒性及增殖的影响。

分别用不同浓度的实施例 1所得脂肽刺激 NHEK细胞 24h后，取细胞上清用 LDH细胞毒性检测试剂盒检测脂肽对 NHEK的毒性。利用 MTT法检测脂肽对 ΝΉΕΚ细胞增殖的影响。如图 11A所示，实验结果表明，高浓度脂肽对 NHEK会产生毒性，毒性随着脂肽浓度的升高逐渐升高，低浓度脂肽对细胞没有毒性。如图 11B所示，高浓度（例如 15 g/ml或以上）的脂趺抑制 ΝΉΕΚ细胞的增殖，但低浓度（例如 1.25fig/m!或以下）的脂肽不抑制 NHEK细胞的增殖。

实施例 10: 脂肽抑制金黄色葡萄球菌对小鼠的感染。

将 8周的小鼠背部毛发脱去， 24小^后，皮间注射实施例〗所得脂肽或 PBS (对照组），脂肽剂量为 2mg/kg， 22小^†后再一次皮间注射脂肽， 2·3小时后，在相同位置注射

OD600-0.7-0.8的金黄色葡萄球菌。金黄色葡萄球菌注射前与含 2% cytodex beads的 PBS混合均匀。金黄色葡萄球菌的剂量为每只 ΙΟΟμΙ ( 1.75-2xl0⁷CFU 每天观察小鼠背部皮肤的感染情况并拍照。三天后取对照组和脂肽组小鼠感染部位的皮趺、肝脏、膊脏，组织匀浆后，梯度稀释检测感染部位细菌的数量。

如图 12A所示，分别用两组小鼠进行实验。与对照组的小鼠 1、小鼠 3相比较，脂肽组的小鼠 2、小鼠 4的皮肤感染的病灶面积明显小，可见脂肽明显抑制金黄色葡萄球菌对小鼠皮肤的感染。如图 12B所示，实验统计结果表明，与对照组相比较，脂肽明显有效地控制感染面积并抑制金黄色葡萄球菌对小鼠皮肤的感染。如图 12C所示，脂肽注射组的小鼠体重显著高于 PBS组。如图 121〕、图 12E所示，脂肽注射组的小鼠皮肤、肝脏细菌含量显著低于 PBS 注射组。如图 12F所示，脾脏中未检测出脂肽组与对照组之间的明显差异。

实施俩 11 : 脂肽激活 TLR2诱导防御素的表达

分别提取了 Π^2⁺'^/+小鼠和 r2- 小鼠的角质形成细胞，用实施例 1所得脂肽刺激 2411, 提取 RNA, real-time RT-PCR检测 mBD4的表达。如图 13所示，实验结果表明，脂肽可以诱导 Ϊ7Γ2^+/+小鼠角质形成细胞抗菌肽 m:BD4的表达，但是在 Tlrf 小鼠的角质形成细胞没有看到明显变化。

如实施例 6，在 27r2⁴ 小鼠和 nr2-^A 小鼠上分别注射 PBS (对照组）或实施倒 1所得脂肽，然后注射 OD_6(XF:0,6-0.8的金黄色葡萄球菌（1.75-2xl0⁷CFU ) ；!, 检測脂肽注射后小鼠抵抗金黄色葡萄球菌感染的能力。如图 14A、图 14C所示，实验结果表明，脂肽注射的 n ^+A 小鼠可以抵抗金黄色葡萄球菌的感染。

但是，如图 14B、图 14C所示，脂肽注射的 77r 2敲除小鼠 Tir ) 却不能抵抗金黄色葡萄球菌的感染。如图 14E、图 14F、图 14G所示，皮趺、肝脏、脾脏中的金黄色蔔萄球菌的数目没有显著性差异。可见脂舦是通过结合 ΠΓ 2来抵抗金黄色葡萄球菌的感染。

实施例 12: 脂肽通过激活 Ρ38 ΜΑΡΚ.信号通路诱导防御素的表达。

用 PBS、实施例 1所得脂肽、 SB202190(p38 MAPK抑制剂)、实施倒 1所得脂肽加 SB202190分别刺激 ΝΉΕΚ细胞，如图】 5A、图 15B所示，加入实施例 1所得脂舦可以显著性地诱导人 β防御素 - hBDs (liBD2 , liBD3) 的表达，而加入了抑制剂之后則不能诱导 hBDs 的表达。

分离小鼠的角质形成细胞, 用 PBS、实施例 1所得脂肽、 SB202190(.p38 MAPK抑制剂)、实施例 1所得脂肽加 SB202190分别刺激。实验结果如图 16 A、图 16B所示，实施例 1所得脂肽可以诱导小鼠角质形成细胞防御素的表达，加入 SB202190将 p38 MAPK信号通路抑制之后，实施例 1所得脂肽不能诱导小鼠角质形成细胞防御素的表达。说明脂肽诱导小鼠角质形成细胞产生防御素也是通过 p38 MAP 信号通路。

实施例 13: 脂肽衍生物诱导防御素的表达

在式（1 ) 的基础上，改变肽链或脂链的长度、实施俩 1所得脂肽亲水性或疏水性获得一系列不同结构的脂肽衍生物。委托吉尔生化（上海）有限公司合成不同结构的脂肽衍生物，其结构分别为式（2)、 ( 3)、 (4)、 (5)、 (6), 通过固相合成方法合成其中的肽链，通过邻苯二甲酰丁辛酯和 N-甲基吗琳合成其中的脂肪酸并接在该肽链上构成脂肽衍生物。用不同浓度的脂肽衍生物刺激人角质形成细胞细胞 24小时，然后提取细胞的总 RNA, 反转录成 cDNA后， reai-time RT PCR检测 β -防御素 2 (hBD2) 和 β ··防御素 3 (hBD3) 的表达。

实验结果表明，如图 17所示，脂肽衍生物都可以诱导 ί¾ΐ銜素 2的表达。图 17A为式（2) 所述脂肽衍生物诱导防銜素 2 (hBD2) 的表达结果；图 17B为式（3 ) 所述脂肽衍生物诱导 β ·防銜素 2 (hBD2)的表达结果；图 17C为式（4)所述脂肽衍生物诱导 β ··防御素 2 (hBD2) 的表达结果；图 17D为式（5) 所述脂肽衍生物分别诱导 β -防御素 2 (hBD2)、 β -防御素 3 (liBD3) 的表达结果；图 17E为式 (6) 所述脂肽衍生物分别诱导 β -防御素 2 (hBD2)、 β - 防御素 3 ChBD3) 的表达结果，认结果可以看出式（6)所述脂趺衍生物诱导防御素的效果最为明显，其中 6,4 μ Μ的式 (6) 脂肽衍生物可以使 hBD2表达上调 280倍， h:BD3表达上调 25倍，表达量显著提高。

实施例 14: 脂肽衍生物的细胞毒性以及其对角质形成细胞增殖的影响。

分别用不同浓度的如式（2)、式（3)、式（4)、式（5)、式（6) 所述脂肽衍生物刺激 NHE 细胞 24h后，取细胞上清用 LDH细胞毒性检测试剂盒检测脂肽对 NHEK的毒性。在细胞中加入 MTT, 检测脂肽衍生物对 NHEK细胞增殖的影响。结果如图 18所示。图 18A为式（2) 所述脂肽衍生物的结果；图 18B为式（3) 所述脂肽衍生物的结果；图 18C为式（4) 所述脂趺衍生物的结果；图 18D为式（5 ) 所述脂肽衍生物的结果；图】 8E为式（6) 所述脂肽衍生物的结果。实验结果表明，脂肽衍生物对 NHEK会产生轻微的毒性，毒性随着脂肽浓度的升高逐渐升高。高浓度的脂肽衍生物对 NHEK细胞的增殖也有轻微的抑制作用。但是这些毒性都在可接受的范围内。

实施例 15: 脂肽及其衍生物在化妆品、洗涤用品中的应用。

将式（6)所述脂肽衍生物（终浓度 lffig/mi)与 DMSO (终浓度 25% )、 1†油 (终浓度 25%) 混合均匀形成涂液。将 8周的小鼠背部毛发脱去， 24h后，涂抹混合液，作为脂肽组。 48h后取一部分小鼠组织抽提 RNA, 利 )¾ realtime RT-PCR检测小鼠 β -防御素 4和 β -防御素 14的表达。如图 19A, 图 19B所示，与对照组相比较，脂肽组可明显提高小鼠皮肤 β ··防銜素 4和 β—防御素 14的表达。但是由于小鼠个体之间差异太大，未表现显著性差异。

检验小鼠皮肤吸收脂肽的情况。将经涂液涂抹的小鼠皮肤剪下，组织勾浆后，离心，取上清，在 Aigiem 1200高效液相色谱仪上检测皮肤对脂肽衍生物的吸收。结果如图 20所示：图 20A所示为单独 PBS (对照组）的 HPLC图，图 20B所示为脂肽衍生物组的 HPLC图，箭头所示位置为脂肽衍生物的出峰，出峰时间为 26.37nnin。在小鼠皮肤表面涂抹脂肽衍生物 48h之后，取皮肤匀浆后，离心取上清上样到 HPLC上，可以看到在 26.30min出现一与图 20B 相同的脂舦峰图，如图 20D所示。由于色谱柱温度、环境温度或机器本身的影响，同一种物质两次实验的保留时间可能会出现一定的漂移，图 20B与图 20D中脂肽衍生物保留时间相差 0.07min, 可以认定为同一物质。如图 20C所示，对照组在 26,37mii 左右没有出现与图 20B 相似的峰。可见小鼠皮肤可以吸收脂肽衍生物，进而诱导防御素的表达，抑制病原菌的感染。

将如式（1 )所示的脂肽（终浓度 lmg/ml) 与 DMSO (终浓度 25% )、甘油 (终浓度 25%) 混合均匀形成涂液，采用与上述相同的实验方法，得到的实验结果同上，表明涂抹如式（1 ) 所示的脂肽的小鼠，其皮肤可以吸收该脂肽， ϋ皮肤 β -防御素 4和 β -防御素 14的表达明显提高，捭制病原菌的感染。

Claims

权利要求书

1。一种脂肽，其特征在于，所述脂肽包括肽链和脂肪链，肽链和脂肪链通过肽键相连；其

2. —类脂肽衍生物，其特征在于，所述脂肽衍生物包括肽链和脂肪链，肽链和脂肪链通过肽键相连；其结构如式（2)、（3)、（4)、（5)、 (6) 所示之任何一种；

0=C-CH2-CH2-CH3

NH

VKWI ζ (2)；

0=C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH3

I

N H

VKWI

式 (3)；

0=C-CH2-CH2-CH3

NH

IGDLVKWII 式（4);

NH VKWI 式 (5 )；

0=C-CH2-CH2-CH3

NH

IISTIGDLVKWIIDTVIIDATE 式（6)'

3. 如权利要求 1 所述的脂肽，其特征在于，所述脂肽提取自表皮葡萄球菌；所述表皮葡萄球菌包括皮肤共生菌表皮葡萄球菌 1457或表皮葡萄球菌 12228或表皮葡萄球菌 RP62A。

4. 如权利要求 1所述脂肽的制备方法，其特征在于，将表皮葡萄球菌发酵，收集酸沉淀的表皮葡萄球菌发酵液的上清液，经甲醇抽提，得到脂肽提取物，再经 HPLC纯化，得到所述脂肽。

5. 如权利要求 4所述的制备方法，其特征在于，包括步骤：

( 1 ) 表皮葡萄球菌发酵

于- 80 °C冰箱取出保存的表皮葡萄球菌 1457或 12228或 RP62A活化后，转接于 200ml TSB 液体培养基中发酵， 37 °C , 220rpm， 16h;

(2) 发酵液酸沉淀

将表皮葡萄球菌发酵液离心；将发酵液的上清液) ¾ 6M盐酸调节至 ρΗ=2.0， 4Ό静置过夜；

(3) 甲醇抽提

将酸沉淀的表皮葡萄球菌发酵液上清离心；将沉淀置于甲醇中袖提；将抽提过夜的甲醇溶液离心，收集上清；将甲醇抽提液在旋转蒸发仪上蒸干，最后 ]¾油泵抽提，最终得到脂趺提取物；

(4) HPLC纯化

将脂肽提取物溶解后，利用分离型高压液相色谱仪 Agi】_entl200和 C18柱，以含 0.1% TFA 的水和 0.1% TFA的乙腈为流动相梯度洗脱，收集各个洗脱峰，通过一级质谱鉴定各个洗脱峰物质的分子量，从而得到目的产物。

6. 如权利要求 2所述脂肽衍生物的制备方法，其特征在于，所述脂肪酸通过邻苯二甲酰丁辛酯和 Ν··甲基吗啉接在所述肽链上，所述肽链是通过固相合成方法合成。

7. 如权利要求 1所述的脂肽，其特征在于，可以直接抑制痤疮丙酸杆菌的生长。

8. 如权利要求 1所述的脂肽或如权利要求 2所述的脂肽衍生物在制备抗感染药物中的应用。

9. 如权利要求 1所述的脂肽或如权利要求 2所述的脂肽衍生物在制备抗金黄色葡萄球菌感染的应用。

10.如权利要求 1所述的脂肽或如权利要求 2所述的脂肽衍生物在化妆用品、洗涤 )¾品、保湿用品中作为添加剂的应用。

11.如权利要求 8、 9或 10所述的应用，其特征在于，所述脂肽及其衍生物与 TLR2受体结合, 激活 p38 MAP 信号通路，诱导角质形成细胞表达防御素。