WO2013115682A2 - Метод видовой и штаммовой идентификации лактобацилл, основанный на использовании проксимального межгенного участка днк оперона f1f0 атф-синтазы - Google Patents
Метод видовой и штаммовой идентификации лактобацилл, основанный на использовании проксимального межгенного участка днк оперона f1f0 атф-синтазы Download PDFInfo
- Publication number
- WO2013115682A2 WO2013115682A2 PCT/RU2013/000028 RU2013000028W WO2013115682A2 WO 2013115682 A2 WO2013115682 A2 WO 2013115682A2 RU 2013000028 W RU2013000028 W RU 2013000028W WO 2013115682 A2 WO2013115682 A2 WO 2013115682A2
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- species
- lactobacilli
- strains
- pcr
- atp synthase
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Definitions
- the invention relates to biotechnology, in particular to medical microbiology, pharmacology and the food industry and can be used to identify species and strains of lactobacilli in various samples of human and animal microflora, in pharmaceutical preparations, in food products.
- Lactobacillus combines gram-positive, non-spore-forming, acid-resistant aero-tolerant or anaerobic microorganisms with a low GC DNA composition (below 54%). Lactobacilli are chemorganotrophs and grow on rich media, are catalase-negative and form lactic acid as the end product of carbohydrate metabolism. Currently, more than 140 species of lactobacilli have been identified (http://www.bacterio.cict.fr/l/lactobacillus.html); Due to the vastness of the genus, for the convenience of systematization, several phylogenetic groups are distinguished, each of which combines from several to two dozen species.
- lactobacilli The most numerous groups are L.brevis, L.buchneri, L.casei, L.delbrueckii, Lplantarum, L.reuteri, Lsalivarius, L.sakei (Felis G., Dellaglio F. Taxonomy of Lactobacilli and Bifidobacteria. Curr. Issues Intestinal Microbiol, 2007, 8, 44-61).
- the habitats of lactobacilli are extremely diverse: various plants, animal and human organisms, food. Lactobacilli have long been used for fermentation of products - dairy (yogurt, yogurt, cheese, sour cream), meat (sausages, cured meats, sausages), vegetable (fermented vegetables, silage).
- lactobacilli form an important part of the microbiota, are found in all habitats of microorganisms (genital tract, oral cavity, large and small intestines) and are obligatory representatives of the normal microflora of healthy people. Lactobacilli are widely used as probiotic drugs for the prevention and treatment of diarrhea and inflammatory diseases as well as as dietary supplements and functional food products for humans and animal feed additives (Lebeer S., Vanderleyden J., De Keersmaecker CJ Genes and molecules of Lactobacilli supporting probiotic action. Microbiol.Molec.Biol.Rev., 2008, 72, 4, 738-764).
- the listed properties do not belong to all representatives of the lactobacillus genus, they are species and strain specific (MacKenzie DA, Jeffers F., Parker ML, Vibert-Vallet A., Bogaerts RJ, Roos S., Walter J., Juge N. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology, 2010, 156, 3368-3378). The problem of quick and unambiguous species and strain identification of lactobacilli arises when studying the composition of human microbiota, when searching and long-term preservation of probiotic valuable strains, when comparing species and strains obtained in different laboratories, etc.
- tuf gene for the elution factor Tu
- recA gene for heat shock protein
- groA gene for the a subunit of RNA polymerase
- dnaK gene for heat shock protein 70 kDa
- NP nucleotide sequence
- NP fragments of several protein-coding genes (MLST) (Raftis E., Salvetti E., Torriani S., Felis GE, O'Toole PW Genomic diversity of Lactobacillus salivarius. Appl. Environment. Microbiol., 2011, 77, 3 954-965).
- the objective of the present invention is to provide a method of universal, cheap, fast and accurate molecular genetic identification of species and strains of lactobacilli, which can be used both to identify individual strains and to study the composition of microbiological communities in human microbiota, food chains and other ecosystems.
- the method is based on the use of a new genetic marker for the species and strain identification of lactobacilli - the intergenic region preceding the FIFO ATP synthase operon - and involves the formulation of the reaction of GPR with species-specific primers and the determination of the nucleotide sequence of this region.
- FIFO ATP synthase is the most important cell energy metabolism enzyme present in the cells of the vast majority of microorganisms.
- the enzyme consists of two main parts: the soluble F1 part, which catalyzes the synthesis (hydrolysis) of ATP, and the part immersed in the F0 membrane that provides proton transport through the membrane.
- the enzyme synthesizes ATP due to the energy of the transmembrane proton gradient, providing the cell with a universal source of energy (Capaldi RA, Aggeler R. Mechanism of the F (l) F (0) -type ATP synthase, a biological rotary motor. Trends Biochem Sci. 2002, 27, 3,154-60).
- the enzyme can carry out the reverse process of exporting protons from the cell using ATP energy; this maintains the stability of the intracellular pH.
- the genes of the enzyme subunits (there are 8 in lactobacilli) are combined into an operon.
- intergenic region 109-340 bp
- promoter and binding sites with transcription regulators Kullen MJ, TR tag Identification of pH-inducible, proton-translocating FlFO-ATPase (atpBEFHAGDC) operon of Lactobacillus acidophilus by different display : gene structure, cloning and characterization. Molec.MicrobioL, 1999, 33, 1152-1161.).
- Pairwise comparison of intergenic regions of different species gives for most of the sequences 33-50% identity, i.e. practically there is no similarity. For some pairs of species belonging to the same group, the percentage of identity is slightly higher, however, it does not exceed 91% (Table 2).
- the similarity of the nucleotide sequences of the intergenic region of the listed species coincides with the similarity of species identified by other genetic markers, including the nucleotide sequence of the 16S RNA gene. This method allows you to separate related species L.rhamnosus and L.casei, but does not give differences for strains Lxasei and L.paracasei.
- lactobacilli which are most often found in the body of healthy people in the central region of Russia. These are the species Lcase / paracasei, L. rhamnosus, L.fermentum, L.plantarum.
- primers according to the nucleotide sequence not of the intergenic region itself, but of the genes surrounding it, preceding the operon of the gene and the first gene of the operon FIFO ATP synthase.
- the first operon gene in all the analyzed strains of lactobacilli is the gene of subunit A of the membrane complex F0 (atpB). The gene preceding the operon in L.casei and L.
- rhamnosus is the uracilphosphoribosyltransferase gene, in L.plantarum and L.fermentum the gene for the uracil transport protein.
- blatn algorithm http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
- Primers were designed by NP identical for all strains of this species. Characterization of the primers is given in the section “List of sequences for identification of species of lactobacilli”.
- the determination of the NP of the intergenic regions preceding the FIFO ATP synthase operon in lactobacilli revealed differences between the strains consisting in the replacement, deletion, or insertion of one, rarely more, nucleotides (Tables 1, 4). These differences can be used for typing strains, either on their own or in combination with other strain-specific markers.
- our proposed method for identifying lactobacilli allows us to determine not only species, but, in some cases, strain affiliation of lactobacilli.
- a culture of lactobacilli was grown on MPC medium (HiMedia, India) for 48 hours at 37 ° C under anaerobic conditions in a HiAnaerobicTM anaerostat (HiMedia, India).
- Bacterial mass from a cup can be suspended in a minimal volume of sterile water and 1 ⁇ l of the suspension can be used in the PCR reaction.
- Genomic DNA can also be used in the PCR reaction.
- cells from 20 ml of overnight culture are precipitated by centrifugation at 4000 g for 10 min, washed with 2 ml of buffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA-Hl, pH 8.0) and resuspended in 500 ⁇ l above the indicated buffer, then the suspension was transferred to a 2 ml centrifuge tube and 50 ⁇ l of chloroform was added. The mixture is vigorously shaken with a vortex (5 times for 10 seconds), 100 ⁇ l of lysozyme solution (60 mg / ml) is added and incubated for 30 min at 37 ° C.
- the mixture was incubated for 30 minutes at room temperature and centrifuged at 12000g for 20 minutes.
- the DNA precipitate is washed three times with 0.5 ml of 75% ethanol each in centrifugation for 5 minutes at 12000g and dissolved in 100 ⁇ l of water.
- Amplification of DNA is carried out using the Amplification kit of Dialat Ltd company on the Tertsik instrument (DNA technology).
- Composition of the PCR mixture (per 100 ⁇ l): 10 ⁇ l JhPCR buffer, 10 ⁇ l of a mixture of 2.5 mM IdNTPs, 4 ⁇ l of 50 mM MgCl 2 , 0.3 ⁇ g of genomic DNA and 0.8 ⁇ l of Taq polymerase enzyme.
- Oligonucleotide primers are added at a concentration of 20 pmol per 100 ⁇ l of the mixture.
- PCR reaction parameters 94 ° C for 5 min (cell lysis and denaturation of genomic DNA); then 30 cycles of amplification - 94 ° C - 20 sec (denaturation), 56 ° C for 20 sec (annealing of oligonucleotides), 72 ° C - 30 sec (completion of the DNA strand); final elongation of fragments at 72 ° C - 5 min.
- the results of the study are taken into account by analyzing the amplification products of the test samples by electrophoresis in 1% agarose gel. After amplification is completed, 1/5 of the volume of a 6X DNA Loading Dye solution (Fermentas) is added to the oil tubes after the amplification is completed, mixed, and 8 ⁇ l of the obtained sample is added to the wells of the agarose gel. Electrophoresis is carried out in a SE-2 horizontal electrophoresis chamber (Helikon Company) with an Elf-4 power source (DNA technology) at a voltage of 120 volts for 60 minutes.
- SE-2 horizontal electrophoresis chamber Helikon Company
- Elf-4 power source DNA technology
- the nucleotide sequence of the fragments was determined using a 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems, USA) using the BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) at the Scientific Research Institute of PChM FMBA of the Russian Federation.
- strain 24st and 2 ol were used in the PCR reaction as matrices with species-specific primers listed in the "List of sequences". PCR products for cells of strain 24st are found only with primers 5-6, and for cells of strain 2 pr - only with primers 7-8 (Fig. 1), therefore, strain 24st belongs to the species L. rhamnosus, strain 2pr to the species L .fermentum.
- strains Lrhamnosus 24st and Lfermentum 2pr were secreted from agarose, isolated and their nucleotide sequences were compared with the nucleotide sequence of strains from GenBank L. rhamnosus GG and L.fermentum IFO 3956, respectively. It was found that strain 24st differs from strain GG by replacing one nucleotide in the intergenic region preceding the FIFO ATP synthase operon (N 22 G— ”A); strain 24st for this indicator is identical to the HN001 strain from GenBank and a number of laboratory strains (Table 3). Strain 2pr differs from strain IFO 3956 by one deletion ( ⁇ ° 24 ⁇ A) and one nucleotide replacement ( ⁇ ° 98 G—> A) and is different from all the described L.fermentum strains.
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской микробиологии, фармакологии и пищевой промышленности и может быть использовано для идентификации видов и штаммов лактобацилл в различных образцах микрофлоры человека и животных, в фармацевтических препаратах, в продуктах питания. Предлагаемый метод основан на использовании для видовой и штаммовой идентификации бактерий рода Lactobacillus нового генетического маркера - межгенного района, предшествующего оперону FIFO АТФ-синтазы. Он включает в себя постановку реакции ПЦР с видоспецифическими праймерами (видовая идентификация) и определение нуклеотидной последовательности данного района (штаммовая идентификация). Данный метод значительно проще метода, основанного на анализе гена 16S РНК: для L.casei, L.plantarum, L.fermentum, L.rhamnosus вид микроорганизмов может быть установлен по анализу результатов ПЦР в электрофорезе, без секвенирования продуктов ПЦР; в данном методе могут быть использованы микроколичества образцов бактерий, без выделения ДНК.
Description
Метод видовой и штаммовой идентификации лактобацилл, основанный на использовании проксимального межгенного участка ДНК оперона FIFO АТФ- синтазы
ОПИСАНИЕ
Область техники, к которой относится изобретение
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к медицинской микробиологии, фармакологии и пищевой промышленности и может быть использовано для идентификации видов и штаммов лактобацилл в различных образцах микрофлоры человека и животных, в фармацевтических препаратах, в продуктах питания.
Уровень техники
Род Lactobacillus объединяет грам-положительные не образующие споры кислотоустойчивые аэротолерантные или анаэробные микроорганизмы с низким GC- составом ДНК (ниже 54%). Лактобациллы являются хемоорганотрофами и растут на богатых средах, каталазонегативны и образуют молочную кислоту как конечный продукт метаболизма углеводов. В настоящее время идентифицировано более 140 видов лактобацилл (http://www.bacterio.cict.fr/l/lactobacillus.html); ввиду обширности рода для удобства систематизации выделяют несколько филогенетических групп, каждая из которых объединяет от нескольких до двух десятков видов. Наиболее многочисленны группы L.brevis, L.buchneri, L.casei, L.delbrueckii, Lplantarum, L.reuteri, Lsalivarius, L.sakei (Felis G., Dellaglio F. Taxonomy of Lactobacilli and Bifidobacteria. Curr. Issues Intestinal Microbiol, 2007, 8, 44-61). Места обитания лактобацилл чрезвычайно многообразны: различные растения, организмы животных и человека, продукты питания. Лактобациллы издавна используются для ферментации продуктов - молочных (простокваша, йогурты, сыры, сметана), мясных (колбасы, вяленое мясо, сосиски), растительных (квашение овощей, силосование). В организме человека лактобациллы составляют важную часть микробиоты, встречаются во всех местах обитания микроорганизмов (генитальном тракте, ротовой полости, толстом и тонком кишечнике) и являются обязательными представителями нормальной микрофлоры здоровых людей. Лактобациллы широко используются в качестве лекарственных пробиотических препаратов для профилактики и лечения диареи и воспалительных заболеваний а также
в качестве биологически активных добавок и продуктов функционального питания для человека и кормовых добавок для животных (Lebeer S., Vanderleyden J., De Keersmaecker C.J. Genes and molecules of Lactobacilli supporting probiotic action. Microbiol.Molec.Biol.Rev., 2008, 72, 4, 738-764). Обнаружена корреляция между состоянием пробиотического компонента микрофлоры человека и некоторыми заболеваниями человека (Larsen N., Vogensen F.K., van der Berg F.W.J., Nielesen D.S., Andreasen A.S., Pedersen B.K., Al-Soud W.A., Sorensen S.J., Yansen L.H., Jakobsen M. Gut microbiota in human adults with type 2 diabets differs from non-diabetic adults. PLoS ONE, 2010, 5, 2, e9085). Перечисленные свойства не принадлежат всем представителям рода лактобацилл, они являются видо- и штаммоспецифичными (MacKenzie D.A., Jeffers F., Parker M.L., Vibert-Vallet A., Bogaerts R.J., Roos S., Walter J., Juge N. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology, 2010, 156, 3368-3378). Проблема быстрой и однозначной видовой и штаммовой идентификации лактобацилл встает при изучении состава микробиоты человека, при поиске и длительном сохранении пробиотически ценных штаммов, при сравнении видов и штаммов, полученных в разных лабораториях и т.д.
Для начальной идентификации рода, филогенетической группы и вида Lactobacillus используют микробиологические и биохимические методы, однако они дают лишь предварительные сведения о систематическом положении данного микроорганизма и часто не позволяют отнести его к определенному виду. Для более точной идентификации микроорганизмов используют разнообразные молекулярно- генетические методы (Singh S., Goswami P., Singh R., Heller K.J. Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: a review. LWT - Food science and technologie, 2009, 42, 448-457; Ботина С.Г., Климина K.M., Коробан H.B., Амерханова A.M., Зинченко В.В., Даниленко В.Н. Реклассификация отечественных пробиотических культур бактерий рода Lactobacillus. Генетика, 2010, 46, 11, 1485-1492). Эти методы можно подразделить на несколько групп.
1. Методы, не связанные с ПЦР: анализ рестрикционных фрагментов хромосомной ДНК (RLFP); разделение суммарного белка клеток в SDS-PAGE электрофорезе; ДНК-ДНК гибридизация, в том числе с использованием чипов (comparative
genomic hybridization, CGH) (Markiewicz L.H., Biedrzycka E., Wasilewska E., Bielecka M. Rapid molecular identification and characteristics of Lactobacillus strains. Folia Microbiol, 2010, 55, 5 481-488).
2. Методы, основанные на реакции ПЦР (Saito S., Kobayashi M., Kimoto-Nira H., Aoki R., Mizumachi K., Miyata S., Yamamoto K., Ktagawa Y., Suzuki C. Intraspecies discrimination of Lactobacillus paraplantarum by PCR. FEMS Microbiology Letters, 2011,316, 70-76). Используются как случайные праймеры (RAPD), так и праймеры для повторяющихся последовательностей ДНК (REP-PCR, ERIC-PCR) и праймеры для определенных генов. В качестве таких генов чаще других используются гены 16S и 23 S рибосомальных РНК и спейсерные районы между ними,. Используются также некоторые белок-кодирующие гены: tuf ( ген фактора элогации Tu), recA, hsp60 (ген белка теплового шока), гроА (ген а- субъединицы РНК-полимеразы), dnaK (ген белка теплового шока 70 kDa) (Huang С.-Н., Lee F.-L. The dnaK gene as a molecular marker for the classification and discrimination of the Lactobacillus casei group. Antonie van Leeuwenhoek, 2011,99, 319-327), β-субъединицы FIFO-ΑΤΦ синтазы (Sievers M, Uermosi C, Fehlmann M, Krieger S. Cloning, sequence analysis and expression of the FlFO-ATPase beta- subunit from wine lactic acid bacteria. Syst Appl Microbiol., 2003, 26, 3, 350-6). Широко распространен метод, объединяющий анализ рестрикционных фрагментов и ПЦР - T.H.AFLP.
3. Методы, основанные на определении нуклеотидной последовательности (НП) ДНК: определение НП отдельных генов (или их фрагментов) рибосомальной РНК и белок-кодирующих генов, перечисленных в п.2; определение одиночных нуклеотидных замен в таких генах (SNP) (Huang С.-Н., Chang М.-Т., Huang М.-С, Lee F.-L. Rapid identification of Lactobacillus plantarum group using the SNaPshort minisequencing. Systematic and applied microbiology, 2011, 34, 586-589); одновременное определение НП фрагментов нескольких белок-кодирующих генов (MLST) (Raftis Е., Salvetti Е., Torriani S., Felis G.E., O'Toole P.W. Genomic diversity of Lactobacillus salivarius. Appl.Environ.Microbiol., 2011, 77, 3, 954-965). Для идентификации вида чаще используется ПЦР с родо- и видоспецифичными праймерами, созданными по генам и межгенным спейсерам рибосомальных и белок- кодирующих генов, с последующим анализом продуктов реакции в электрофорезе и
определением их НП. Для идентификации штаммовой принадлежности лактобацилл чаще используются рестрикционный анализ ДНК, ПЦР с неспецифическими праймерами (RAPD, REP-PCR, ERIC-PCR), определение НП ряда генов (MLST), гибридизация с чипами (CGH). Однако ни один из перечисленных методов не является универсальным, каждый имеет свои достоинства, недостатки, область применения и используется для анализа конкретных видов или групп видов и для решения конкретных задач. Считается, что для корректной идентификации вида и штамма следует использовать несколько молекулярных методов или несколько генов (Singh S., Goswami P., Singh R., Heller K.J. Application of molecular identification tools for Lactobacillus, with a focus on discrimination between closely related species: a review. LWT- Food science and technologie, 2009, 42, 448-457). Поэтому важно включение в молекулярно-генетическую идентификацию лактобацилл новых генов.
Наиболее близким к предлагаему нами подходу является метод, разработанный Markiewicz L.H., Biedrzycka Е., Wasilewska Е., Bielecka М. (Rapid molecular identification and characteristics of Lactobacillus strains, Folia Microbiol., 2010, 55, 5 481-488). Для идентификации видов предлагаются видоспецифичные праймеры, сделанные по нуклеотидной последовательности гена 16S РНК и примыкающего к нему межгенного района, а для идентификации штаммов - рестрикционный анализ с использованием пульс-электрофореза и метод ПЦР с неспецифическими праймерами (RAPD, REP-PCR). Т.е. идентификация вида и штамма проводилась различными методами (в нашем случае — одним). Методы, использованные авторами для идентификации штаммов, основаны на анализе многих фрагментов, получаемых при электрофорезе в агарозном геле. Они дают хорошие результаты при сравнении штаммов в одной лаборатории, однако трудно воспроизводимы и мало применимы для сравнения штаммов из разных лабораторий. Предлагаемый нами метод идентификации штаммов может быть использован для сравнения как конкретных штаммов, так и тех, чья нуклеотидная последовательность известна только из базы данных.
Раскрытие изобретения
Задачей настоящего изобретения является создание метода универсальной, дешевой, быстрой и точной молекулярно-генетической идентификации видов и штаммов лактобацилл, который может быть применен как для идентификации отдельных штаммов, так и для изучения состава микробиологических сообществ в
микробиоте человека, пищевых цепях и других экосистемах.
Метод основан на использовании для видовой и штаммовой идентификации лактобацилл нового генетического маркера - межгенного района, предшествующего оперону FIFO АТФ синтазы - и включает в себя постановку реакции ГЩР с видоспецифическими праймерами и определение нуклеотидной последовательности данного района. FIFO АТФ синтаза - важнейший фермент энергетического метаболизма клетки, присутствующий в клетках подавляющего большинства микроорганизмов. Фермент состоит из двух основных частей: растворимой F1 части, катализирующей синтез (гидролиз) АТФ, и погруженной в мембрану F0 части, обеспечивающей транспорт протонов через мембрану. Фермент осуществляет синтез АТФ за счет энергии трансмембранного протонного градиента, обеспечивая клетку универсальным источником энергии (Capaldi R.A., Aggeler R. Mechanism of the F(l)F(0)-type ATP synthase, a biological rotary motor. Trends Biochem Sci. 2002, 27, 3,154-60). Для некоторых организмов - в том числе лактобацилл - показано, что фермент может осуществлять обратный процесс экспорта протонов из клетки, используя энергию АТФ; это поддерживает стабильность внутриклеточного значения рН. Гены субъединиц фермента (у лактобацилл их 8) объединены в оперон. Перед первым геном оперона находится межгенный район (109-340 пн), содержащий промотор и сайты связывания с регуляторами транскрипции (Kullen M.J, егтаттег T.R. Identification of pH-inducible, proton-translocating FlFO-ATPase (atpBEFHAGDC) operon of Lactobacillus acidophilus by different display: gene structure, cloning and characterization. Molec.MicrobioL, 1999, 33, 1152-1161.).
1. Биоинформатический анализ межгенного района, предшествующего оперону FIFO АТФ-синтазы у лактобацилл.
Используя имеющиеся в GenBank данные, мы выделили межгенные районы, предшествующие оперону FIFO АТФ-синтазы, у лактобацилл, чьи геномы полностью секвенированы и аннотированы (39 штаммов 19-ти видов; данные на 30.12.2011 г; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi; табл.1). Проведенный нами анализ показал, что нуклеотидные последовательности межгенного района перед опероном F0F1 АТФ-синтазы, включающего промотор, видоспеци финны. Попарное сравнение межгенных районов разных видов (алгоритм blatn, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) дает для большей части последовательностей 33-50% идентичности, т.е. практически
сходство отсутствует. Для некоторых пар видов, принадлежащих к одной группе, процент идентичности несколько больше, однако он не превышает 91% (табл.2). Сходство нуклеотидных последовательностей межгенного района перечисленных видов совпадает с родством видов, выявленном по другим генетическим маркерам, в том числе, и по нуклеотидной последовательности гена 16S РНК. Данный метод позволяет разделить близкие виды L.rhamnosus и L.casei, но не дает различий для штаммов Lxasei и L.paracasei.
Попарное сравнение межгенных районов разных штаммов одного вида {L.acidophilus, L.casei, L.delbrueckii, L.fermentum, L.gasserie, L.johnsonii, L.plantarun, L.salivariuas, Lrhamnosus) дает значительно большее сходство, 99-100% идентичности. Нуклеотидные последовательности межгенных районов штаммов одного вида отличаются на 1-3 нуклеотида. У видов L.acidophilus, L.reuteri, L.salivarius идентичность НП различных штаммов меньше и составляет 94-97%. У всех видов подобные различия штаммоспецифичны и могут быть генетическими маркерами штаммов (табл.1).
Таблица 1. Характеристика межгенного района, предшествующего оперону FIFO АТФ-синтазы, у аннотированных штаммов лактобацилл из GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/genom_table.cgi).
Вид лактобацилл Филоге- ГЦ- Величина Сравнение идентичности нетическая состав, межгенного нуклеотидной
группа % р-на перед последовательности с опероном аналогичным межгенным FIFO -АТФ- районом других штаммов синтазы, пн данного вида
L.acidophilus L.delbrueckii 34 122 L.acidophilus ATCC 4796 NCFM - 122/122=100%
L.acidophilus 30SC 115/122=94%
L.amylovorus L.delbrueckii 38 123
GRL 1112
Lbrevis ATCC 367 Lbrevis 46 208
L.buchnerie Lbuchneri 44 333
NRRL B-30929
L.casei BL23 Lxasei 46 302 L.casei Zhung - 302/302=100%
Lcasei LC2W - 302/302=100%
Lxasei
302/302=100%
Таблица 2. Попарное сравнение идентичности нуклеотидных последовательностей межгенных районов, предшествующих оперону FIFO АТФ-синтазы, у различных видов лактобацилл. Случаи, дающие более 50% идентичности.
Lhelveticus - L.acidophilus L.delbrueckii 85%
L.helveticus - L.delbrueckii L.delbrueckii 66%
Lhelveticus— L.johnsonii L.delbrueckii 64%
Lhelveticus- Lgasseri L.delbrueckii 65%
Ljohnsonii— L.delbrueckii L.delbrueckii 58%
Ljohnsonii-L. gasseri L.delbrueckii 91%
Lrhamnosus - L.casei Lcasei 88%
Lfermentum- L reuteri L.reuteri 54%
2.Конструирование праймеров для видоспецифичной ПЦР-идентификации межгенных районов, предшествующих оперону FIFO АТФ-синтазы лактобацилл.
Для создания видоспецифичных праймеров мы выбрали четыре вида лактобацилл, которые наиболее часто встречаются в организме здоровых людей центрального района России. Это виды Lcase/paracasei, L.rhamnosus, L.fermentum, L.plantarum. Мы сконструировали праймеры по нуклеотидной последовательности не самого межгенного района, а окружающих его генов, предшествующего оперону гена и первого гена оперона FIFO АТФ-синтазы. Первым геном оперона у всех проанализированных штаммов лактобацилл является ген субъединицы А мембранного комплекса F0 (atpB). Геном, предшествующим оперону, у L.casei и L.rhamnosus является ген урацилфосфорибозилтрансферазы, у L.plantarum и L.fermentum - ген урацил-транспортного белка. Как показали результаты биоинформативных исследований с использованием алгоритма blatn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) (см. «Перечень проследовательностей для идентификации видовой принадлежности лактобацилл») нуклеотидная последовательность этих генов, как и межгенного района, видоспецифична, однако могут встречаться отдельные нуклеотидные замены. Праймеры были сконструированы по НП, идентичной у всех штаммов данного вида. Характеристика праймеров приведена в разделе «Перечень последовательностей для идентификации видовой принадлежности лактобацилл». Биоинформативный анализ показал отсутствие значительной идентичности НП праймеров с НП хромосом других видов лактобацилл. В качестве материала для ПЦР-реакции могли быть использованы
как очищенная ДНК, так и отдельные колонии и пробы образцов, содержащих клетки исследуемого штамма; это значительно упрощает исследование. Праймеры были проверены при видовой идентификации более 70 штаммов различных лактобацилл. Продукты ПЦР образовывались и идентифицировались в электрофорезе в агарозном геле только с праймерами, свойственными данному виду. Если исследуемый штамм не принадлежал ни к одному из 4-х изучаемых видов лактобацилл, то ПЦР-продукты не обнаруживались ни с одним из праймеров. Если анализировалась смесь штаммов, то продукты ПЦР обнаруживались с праймерами, специфичными для всех компонентов смеси. Для всех проверенных штаммов результаты идентификации совпали с результатами идентификации по данным нуклеотидной последовательности гена 16S РНК.
З.Определение нуклеотидной последовательности межгенных районов, предшествующих оперону FIFO АТФ-синтазы, для штаммоспецифичной
идентификации лактобацилл.
Определение НП межгенных районов, предшествующих оперону FIFO АТФ-синтазы у лактобацилл, выявило различия между штаммами, заключающиеся в замене, делеции или вставке одного, реже большего числа нуклеотидов (табл.1, 4). Данные различия могут быть использованы для типирования штаммов - либо сами по себе, либо в сочетании с другими штаммоспецифическими маркерами.
Таблица 3. Нуклеотидные замены в межгенном районе перед опероном FIFO АТФ- синтазы у различных штаммов 4-х видов лактобацилл. Жирным шрифтом отмечены штаммы из GenBank, остальные штаммы - из лабораторной коллекции.
Вид лактобацилл Штамм Штамм сравнения Нуклеотидные
замены
L.rhamnosus LMS2-1 GG нет изменений
Lc705 нет изменений
АТСС 8530 нет изменений
CASL нет изменений
АТСС 21052 нет изменений
R0011 нет изменений
U101 нет изменений
421-2 нет изменений
32k нет изменений
Таким образом, предложенный нами способ идентификации лактобацилл позволяет определять не только видовую, но, в ряде случаев, и штаммовую
принадлежность лактобацилл. Кроме того, он значительно проще метода, основанного на анализе гена 16S РНК: для Lcasei, Lplantarum, L.fermentum, Lrhamnosus вид микроорганизмов может быть установлен по результатам ПЦР, без секвенирования продуктов ПЦР; в данном методе могут быть использованы микроколическва биомассы бактерий, без выделения ДНК. Метод позволяет разделять близкие виды L.casei - L.rhamnosus.
Осуществление изобретения
Культуру лактобацилл выращивают на среде МРС ("HiMedia", Индия) в течение 48 часов при 37°С при анаэробных условиях в анаэростате HiAnaerobicTM ("HiMedia", Индия). Бактериальная масса с чашки может быть суспендирована в минимальном объеме стерильной воды и 1 мкл суспезии может быть использован в реакции ПЦР.
В реакции ПЦР может быть использована и геномная ДНК. Для ее выделения клетки из 20 мл ночной культуры осаждают центрифугированием при 4000g в течение 10 мин, промывают 2мл буфера (10 мМ Трис-НС1, 10 мМ ЭДТА-^Ыаг, рН 8,0) и ресуспендируют в 500 мкл выше указанного буфера, затем суспензию переносят в 2-мл центрифужную пробирку и добавляют 50 мкл хлороформа. Смесь энергично встряхивают с помощью вортекса (5 раз по 10 сек), вносят 100 мкл раствора лизоцима (60 мг/мл) и инкубируют 30 мин при 37°С. Добавляют 6 мкл РНКазы А (10 мг/мл) и инкубируют еще 30 мин при 37°С. Далее к суспензии добавляют 200 мкл 10% SDS и 200 мкл 5М NaCl, осторожно перемешивают и инкубируют 16 ч при 65°С. Полученный лизат клеток остужают до комнатной температуры, добавляют 1 мл смеси фенол/хлороформ (1:1) и перемешивают путем переворачивания пробирки в течение 5 мин до состояния гомогенной эмульсии. Затем смесь центрифугируют при 12000g в течение 15 мин. Водную фазу, содержащую ДНК, отбирают в новую 1,5-мл пробирку и смешивают с 600 мкл изопропанола. Смесь инкубируют 30 мин при комнатной температуре и центрифугируют при 12000g в течение 20 мин. Осадок ДНК трижды промывают порциями по 0,5 мл 75% этанола с центрифугированием по 5 мин при 12000g и растворяют в 100 мкл воды.
Амплификацию ДНК проводят с использованием набора «Амплификация» фирмы «Dialat Ltd» на приборе «Терцик» («ДНК-технология»). Состав смеси для ПЦР (на 100 мкл): 10 мкл ЮхПЦР буфера, 10 мкл смеси 2,5mM IdNTPs, 4 мкл 50тМ MgCl2, 0,3 мкг геномной ДНК и 0,8 мкл фермента Taq-полимеразы. Олигонуклеотидные
праймеры добавляют в концентрации 20 пмоль на 100 мкл смеси.
Параметры ПЦР реакции: 94°С в течение 5 мин (лизис клеток и денатурация геномной ДНК); затем 30 циклов амплификации - 94°С - 20 сек (денатурация), 56°С в течение 20 сек (отжиг олигонуклеотидов), 72°С - 30 сек (достройка нити ДНК); финальная элонгация фрагментов при 72°С - 5 мин.
Результаты исследования учитывают путем анализа продуктов амплификации исследуемых образцов методом электрофореза в 1% агарозном геле. В пробирки с исследуемыми образцами после завершения амплификации вносят под масло 1/5 объема раствора 6Х DNA Loading Dye («Fermentas»), перемешивают и 8 мкл полученного образца вносят в лунки агарозного геля. Электрофорез проводят в камере для горизонтального электрофореза "SE-2" (Компания «Хеликон») с источником питания " Эльф-4 " («ДНК-технология») при напряжении 120 вольт в течение 60 мин. Результаты электрофореза учитывают в ультрафиолетовом свете с длинной волны 254 нм на трансиллюминаторе ТСР-20 МС («Vilber Lourmat», Франция). В качестве контроля размера полученного фрагмента используют ДНК маркер GeneRuler™ 100+ п.н. («Fermentas»).
Для определения нуклеотидной последовательности фрагменты ПЦР вырезают из геля и очищают от агарозы с помощью набора Fermentas К0691. Для этого добавляют Binding Buffer (на 100 мг агарозы - 100 мкл буфера); инкубируют гель в буфере 10-15 мин при 50-60°С до полного растворения геля; добавляют изопропанол (на 100 мг геля и 100 мкл буфера - 100 мкл изопропанола); помещают растворенный гель на колонку и откручивают 1 мин; промывают колонку 100 мкл Binding Buffer, затем 700 мкл Wash Buffer; откручивают пустую колонку еще раз 1 мин для полного удаления буфера и содержащегося в нем спирта; помещают колонку в чистую пробирку на 1,5 мл и смывают ДНК с колонки 20-50 мкл Elution Buffer.
Определение нуклеотидной последовательности фрагментов производилось на приборе 3730x1 DNA Analyzer (Applied Biosystems,USA) с использованием набора BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA) в НИИ ФХМ ФМБА РФ.
Примеры идентификации по настоящему изобретению.
1. Определение вида штаммов лактобацилл 24ст и 2пр.
Клетки штаммов 24ст и 2 пр были использованы в реакции ПЦР в качестве
матрицы с видоспецифичными праймерами, перечисленными в «Перечне последовательностей». Продукты ПЦР для клеток штамма 24ст обнаруживаются только с праймерами 5-6, а для клеток штамма 2 пр - только с праймерами 7-8 (рис.1), следовательно, штамм 24ст принадлежит к виду L.rhamnosus, штамм 2пр - к виду L.fermentum.
2.0пределение специфических штаммовых характеристик штаммов 24ст и 2 пр.
ПЦР-фрагменты штаммов Lrhamnosus 24ст и Lfermentum 2пр (см.рис.1) были вьщелены из агарозы, севенированы и их нуклеотидная последовательностей была сопоставлена с нуклеотидной последовательностью штаммов из GenBank L.rhamnosus GG и L.fermentum IFO 3956 соответственно. Установлено, что штамм 24ст отличается от штамма GG заменой одного нуклеотида в межгенном районе, предшествующем оперону FIFO АТФ- синтазы (N 22 G— » А); штамм 24ст по данному показателю идентичен штамму HN001 из GenBank и ряду лабораторных штаммов (табл.3). Штамм 2пр отличается от штамма IFO 3956 одной делецией (Ν°24 Δ А) и одной заменой нуклеотида (Ν° 98 G— > А) и отличен от всех описанных штаммов L.fermentum.
На Фиг.1 показан анализ в геле агарозы ПЦР-продуктов, полученных с видоспецифичными праймерами и клетками штаммов 24ст и 2пр. М— маркер мол.веса ДНК фрагментов с шагом ЮОпн.
Claims
1. Способ видовой идентификации лактобацилл основанный на использовании генетического маркера, отличающийся тем, что в качестве генетического маркера используют межгенный район, предшествующий оперону FIFO АТФ синтазы, и включает в себя постановку реакции ПЦР с видоспецифическими праймерами.
2. Способ видовой идентификации по п.1 отличающийся тем, что в процессе видовой идентификации лактобацилл L.casei/paracasei, L.fermentum, L.plantarum, L.rhamnosus используют реакцию ПЦР с видоспецифичными праймерами по гену субъединицы А оперона FIFO АТФ синтазы (atpB) и предшествующего ему гена
(урацилфосфорибозилтрансферазы у L.casei и L.rhamnosus; урацил транспортного белка у L.plantarum и L.fermentum).
3. Способ штаммовой идентификации лактобацилл, основанный на использовании генетического маркера, отличающийся тем, что в качестве генетического маркера используют межгенный район, предшествующий оперону FIFO АТФ синтазы, и включает в себя определение нуклеотидной последовательности данного района.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012103277 | 2012-02-01 | ||
| RU2012103277/10A RU2508406C2 (ru) | 2012-02-01 | 2012-02-01 | СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАЦИЛЛ L.casei/paracasei, L.fermentum, L.plantarum И L.rhamnosus |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2013115682A2 true WO2013115682A2 (ru) | 2013-08-08 |
| WO2013115682A3 WO2013115682A3 (ru) | 2013-12-27 |
Family
ID=48905996
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2013/000028 WO2013115682A2 (ru) | 2012-02-01 | 2013-01-15 | Метод видовой и штаммовой идентификации лактобацилл, основанный на использовании проксимального межгенного участка днк оперона f1f0 атф-синтазы |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2508406C2 (ru) |
| WO (1) | WO2013115682A2 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520518A (zh) * | 2016-10-14 | 2017-03-22 | 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种物种检疫鉴定中心的运行模式 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201505364D0 (en) * | 2015-03-27 | 2015-05-13 | Genetic Analysis As | Method for determining gastrointestinal tract dysbiosis |
| CN112029884B (zh) * | 2020-09-29 | 2022-05-10 | 广东省微生物研究所（广东省微生物分析检测中心） | 用于鉴定干酪乳杆菌类群的分子标记、检测引物和检测方法 |
| CN112813135B (zh) * | 2021-04-07 | 2022-03-29 | 河北一然生物科技股份有限公司 | 一种植物乳杆菌中混入干酪类菌株的检测方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2322666A3 (en) * | 1999-09-28 | 2011-08-10 | Geneohm Sciences Canada, Inc. | Highly conserved gene and its use to generate species-specific, genus-specific, family-specific, group-specific and universal nucleic acid probes for microorganisms. |
-
2012
- 2012-02-01 RU RU2012103277/10A patent/RU2508406C2/ru not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-01-15 WO PCT/RU2013/000028 patent/WO2013115682A2/ru active Application Filing
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MARCO VENTURA ET AL.: 'Bifidobacterium lactis DSM 10140: Identification of the atp (atpBEFHAGDC) Operon and Analysis of Its Genetic Structure, Characteristics, and Phylogeny.' APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY vol. 70, no. 5, May 2004, pages 3110 - 3121, XP055097763 * |
| TOCHILINA ANNA GEORGIEVNA: 'Biokhimicheskaya i molekulyarno-geneticheskaya identifikatsiya baktery roda Lactobacillus' NIZHNII NOVGOROD, 2009, AVTOREFERAT DISSERTATSII K.B.N. pages 1 - 25 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520518A (zh) * | 2016-10-14 | 2017-03-22 | 中山出入境检验检疫局检验检疫技术中心 | 一种物种检疫鉴定中心的运行模式 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2013115682A3 (ru) | 2013-12-27 |
| RU2508406C2 (ru) | 2014-02-27 |
| RU2012103277A (ru) | 2013-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Klaenhammer et al. | Selection and design of probiotics | |
| Felis et al. | Taxonomy of lactobacilli and bifidobacteria | |
| Abriouel et al. | Culture-independent analysis of the microbial composition of the African traditional fermented foods poto poto and dégué by using three different DNA extraction methods | |
| Matsuki et al. | Genus-and species-specific PCR primers for the detection and identification of bifidobacteria | |
| JP3368268B2 (ja) | ユニバーサルユーバクテリア核酸プローブ及び方法 | |
| JP3423597B2 (ja) | 細菌の同定方法 | |
| Sun et al. | Phylogenesis and evolution of lactic acid bacteria | |
| Skånseng et al. | Comparison of chicken gut colonisation by the pathogens Campylobacter jejuni and Clostridium perfringens by real-time quantitative PCR | |
| Vandamme et al. | Phylogenetics and systematics | |
| Kim et al. | Differentiation of Bifidobacterium species using partial RNA polymerase β-subunit (rpoB) gene sequences | |
| Kudo et al. | Lactobacillus delbrueckii subsp. sunkii subsp. nov., isolated from sunki, a traditional Japanese pickle | |
| Jarocki et al. | Genetic diversity of bile salt hydrolases among human intestinal bifidobacteria | |
| Li et al. | Association of mutation patterns in GyrA and ParC genes with quinolone resistance levels in lactic acid bacteria | |
| Adeyemo et al. | Molecular identification of Lactobacillus plantarum isolated from fermenting cereals | |
| RU2508406C2 (ru) | СПОСОБ ВИДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛАКТОБАЦИЛЛ L.casei/paracasei, L.fermentum, L.plantarum И L.rhamnosus | |
| Tafvizi et al. | Application of repetitive extragenic palindromic elements based on PCR in detection of genetic relationship of lactic acid bacteria species isolated from traditional fermented food products | |
| Averina et al. | Distribution of genes of toxin-antitoxin systems of mazEF and relBE families in bifidobacteria from human intestinal microbiota | |
| Jena et al. | Isolation and species delineation of genus Bifidobacterium using PCR-RFLP of partial hsp60 gene fragment | |
| Song et al. | Use of 16S–23S rRNA spacer-region (SR)-PCR for identification of intestinal Clostridia | |
| RU2526576C2 (ru) | Способ идентификации лактобацилл | |
| CN111073826B (zh) | 动物双歧杆菌a6耐酸应答机制研究 | |
| Shevtsov et al. | Identification of phenotypically and genotypically related Lactobacillus strains based on nucleotide sequence analysis of the groEL, rpoB, rplB, and 16S rRNA genes | |
| Vaugien et al. | Bifidobacteria identification based on 16S rRNA and pyruvate kinase partial gene sequence analysis | |
| Ben Belgacem et al. | Polyphasic taxonomic studies of lactic acid bacteria associated with Tunisian fermented meat based on the heterogeneity of the 16S–23S rRNA gene intergenic spacer region | |
| Zavaglia et al. | Characterization of Bifidobacterium strains using box primers |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 13743106 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A2 |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 13743106 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A2 |